JPH10501681A - 核酸送達システムならびにその合成および使用方法 - Google Patents

核酸送達システムならびにその合成および使用方法

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JPH10501681A JP7521981A JP52198195A JPH10501681A JP H10501681 A JPH10501681 A JP H10501681A JP 7521981 A JP7521981 A JP 7521981A JP 52198195 A JP52198195 A JP 52198195A JP H10501681 A JPH10501681 A JP H10501681A
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Abstract

(57)【要約】 核酸送達システムが記載される。この送達システムは、標的部分と核酸結合部分とを有する融合タンパク質、および融合タンパク質の核酸融合部分に結合された核酸配列を含む。標的部分は、抗体またはリガンドであり得る。細胞において所望の核酸配列を一時的にまたは安定に発現させるためのこの核酸送達システムの使用が開示されている。細胞を標的とし、そして所望の産物を送達するための送達システムの使用も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸送達システムならびにその合成および使用方法 近年、新しい治療形態である遺伝子治療が、嚢胞性線維症(CF)[Rosenfeld，M. A.ら，Cell 68: 143-155(1992);Rosenfeld，M.A.ら，Science 252:431-434(1991 )，Ferkol，Tら.,J.Clin.Invest．92: 2394-2400(1993)]、網膜芽腫のような腫 瘍、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)のようなウイルスの感染により引き起こされる 疾患（例えば、HIV-1感染）[Baltimore,D.，Nature 335，395-396(1988)]などを 含む種々の疾病を処置するために提案されている。この治療形態では、細胞でそ の遺伝子が発現されるように、遺伝子が細胞に導入される。遺伝子は、ポジティ ブに細胞を増強し得る。例えば、消失タンパク質を供給し、免疫系を刺激する。 または、この遺伝子はネガティブな様式で作用し得る。例えば、ウイルスのイン ヒビターを発現し、これによりHIV-1のようなウイルスの複製およびその結果の 感染を阻害させ得る。アンチセンスRNA、リボザイム、および優性ネガティブ変 異体(dominant-negative mutant)を含むいくつかのアプローチは、細胞レベルで のHIV-1感染を阻害し得ることが示されている[Hasseloff，J.ら，Nature 334: 5 85-591(1988); Von der Krol，A.R.ら，BioTechniques 6:958-976(1988); Malim ,M.H.ら，Cell 58:205-214(1989); Trono,D.ら，Cell 59:113-120(1989); Sulle nger,B.ら，Cell 63: 601-608(1990); Green,G.ら，Cell 58: 215-223(1989); B uonocore,L.ら，Nature 345: 625-628(1990)]。ヒト抗体（例えば、抗gp-120単 鎖抗体）の細胞内送達および発現は、ウイルスの複製などを阻害し得る。例えば 、抗gp120抗体は、HIV-1 エンベロープ糖タンパク質の成熟および機能を阻害す る[Marasco，W.A.ら、1993年７月に出願されたPCT出願第PCT/US93/06735号]。 しかし、これらの進歩にも関わらず、これらのストラテジーのいずれかを使用 する悪性、疾患などを処置および防止するための遺伝子治療プロトコルの開発に おける主な障害は、所望の遺伝子を所望の標的細胞に効果的に導入するのに比較 的効率の悪い手段であることである。マウスのレトロウイルスベクターが細胞に 遺伝子を導入するために広範に使用されているにも関わらず、これらのベクター は無差別に多くの細胞型に感染し、そして所望の標的細胞に感染するのは限られ ている。さらに、レトロウイルスベクターは、潜在的に有害なウイルスDNAを治 療的遺伝子と共に含んでいる。従って、これらのベクターは、例えば、AIDSのヒ ト遺伝子治療のための効率的な導入システムとして最適であり得ない[Miller，A .D.，Nature 357:455-460(1992); Eglitis，M.A.ら，Science 230: 395-1398(19 85); Dizerzak，E.A.ら，Nature 331: 35-41(1988)]。HIV感染細胞への特異的送 達の問題を解決するために、遺伝子をHIV感受性細胞に特異的に導入し得る欠損H IVベクターが開発されている。[Poznansky，M.ら，J.Virol．65: 532-536(1991) ; Shimada，T.ら，J.Clin.Invest．88: 1043-1047(1991)]。しかし、このアプロ ーチは全てのウイルスおよび悪性について実用的であり得るわけではない。さら に、低いとはいえ、欠損ベクターの組換えによる救済の理論的潜在性は、このベ クターの使用を妨げ得る。 組換え遺伝子の細胞への送達および発現はまた、リポソーム、リポフェクチン 、およびリン酸カルシウム沈澱法を使用することによりインビトロまたはインビ ボのいずれかで達成される[Nicolau，C.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80: 1068- 1072(1983); Brigham，K.L.ら，Am.J.Med.Sci．298: 278-281(1989); Nabel，E. G.ら，Science 249: 1285-1288(1990); Benvenisty，N.ら，Proc.Natl.Acad.Sci .USA 83: 9551-9555（1986）Chen,S.-Y.ら，J.Virol．65: 5902-5909(1991)]。 これらの方法は、遺伝子治療に関してレトロウイルスシステムよりもいくつかの 利点を有する。適切なプロモーター因子を含むプラスミドDNA構築物は、レトロ ウイルスベクターよりも技術的により容易であり、かつ調製および試験するため により時間を必要としない。プラスミドDNAは、感染性のレトロウイルスのDNAよ りも大量調製により適している。プラスミドDNAはまた、レトロウイルスに基づ くシステムで可能なサイズより大きなサイズのDNAセグメントの送達を可能にし 得る。さらに別の利点は、プラスミドDNAがレトロウイルスベクターの有害な副 作用（例えば、少ない割合の患者におけるウイルスの感染または癌）を排除し得 ることである。しかし、これらの方法を使用してインビボで遺伝子を送達する可 能性は、細胞特異性および効率を欠くことにより制限される。 細胞特異的遺伝子導入の問題を克服する試みにおいて、WuおよびWu，J.Biol.C hem．262: 4429-4432(1987)は、化学的結合レセプター仲介遺伝子導入システム を提案した。このシステムは、レセプター仲介エンドサイトーシスを使用してDN A分子またはRNA分子を標的肝細胞また標的初代造血細胞に運ぶ。このシステムの ストラテジーは、このような細胞がユニークなアシアロ糖タンパク質(asialglyc oprotein)レセプターを細胞表面に有するという事実に基づく。このレセプター はそのリガンドであるアシアロ糖タンパク質を結合し、そして取り込む。このタ ンパク質（リガンド）は、好ましくはポリL-リジンと結合しており、ポリL-リジ ンはDNAまたはRNAと結合して強力な静電相互作用により可溶性の複合体を形成し 得る。このシステムは、細胞レベルで、ならびに動物研究において、遺伝子を標 的肝細胞または標的初代造血細胞に導入すると報告されている[Wu，G.Y.ら，J.B io.Chem．263: 14621-14624(1988); Zenke,M.ら，Proc.Natl.Acad.Sci．87: 365 5-3659(1990); Wu，G.Y.ら，J.Biol.Chem．266: 14338-14342(1991); Curiel，D .T.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 8850-8854(1991); Wagner，E.ら，Proc.Na tl.Acad.Sci.USA 87: 3410-3414(1990); Curiel，D.T.ら，Human Gene Therapy 2:230-238(1992)]。しかし、この方法の全体としての効率は、比較的低いと報告 されている。なぜなら、エンドサイトーシスは比較的効率が悪く、DNAはしばし ばエンドソーム区画から出てしまい、そして最終的にはリソソーム内で分解され る。従って、複数回の投与が必要であり、そしてこのシステムの抗原性が問題と なり得る。さらに、この送達システムの合成は比較的時間がかかる。最初にポリ L-リジンをアシアロ糖タンパク質に結合させ、次いで続いて、リガンド−ポリリ ジン複合体を外因性DNAに結合させる。さらに、その代表的な適用においては、 細胞に導入された外因性DNAは、安定的に染色体に取り込まれた様式では与えら れない。従って、発現は一時的である。よって、反復投与がこの理由によっても 必要である。しかし、述べたように、人工部分としてのポリリジン部分が抗原反 応を引き起こし得、このシステムの反復利用の能力が制限される。 提案されている別の治療形態は、既に発現されているタンパク質を標的細胞に 送達することである。通常の癌治療の１形態においては、細胞変性因子または細 胞傷害性因子を悪性細胞に、その細胞を殺傷するために導入する。しかし、健康 な組織および細胞への損傷を最少にするように注意しなければならない。従って 、ストラテジーは病的な細胞を特異的に標的とするように開発されている。イム ノトキシンの使用は、このような治療の１方法である。イムノトキシンは、細胞 傷害性因子の１クラスであり、モノクローナル抗体またはリガンドに結合してい るトキシンタンパク質からなり、このタンパク質は、細胞表面の標的に特異的に 結合する[Vitetta，E.S.ら，Science 238: 1098(1987); Pastan，I.，Cell 47: 641(1986); Pastan，I.ら，Science 254: 1173(1992)]。細胞への推定特異性お よび効率の潜在性により、この治療は癌および種々の疾患に対する治療に重要な 役割を果たすと推定された。しかし、実際にはこのことはまだ分かっていない。 むしろ、トキシンは抗原性の高いタンパク質である。これらのトキシンに対する 中和抗体は、代表的には最初の曝露後２週間以内に誘起され、ほんの１回または ２回の治療期間後にその有効性が激しく制限される。従って、免疫反応を抑制す る免疫抑制剤の使用のようなストラテジーが提案されている。しかし、これは達 成することが困難であるばかりでなく、治療の最終的な成果に有益ではあり得な い。なぜなら、その後、免疫系がその機能（例えば、感染、他の腫瘍細胞、およ び病原と戦う）を果たすことができないからである。 従って、他の核酸送達システム（例えば、WuおよびWuの送達システム）よりも 簡単に組み立てられ得る核酸送達因子を有することが望ましい。 そのような送達システムが、化学結合プロセスで可能であるよりも容易に合成 され得るならば、これもまた望ましい。 核酸送達システムが、種々の標的細胞を特異的に標的とするための使用により 容易に適合され得るならば、これもまた望ましい。 送達システムが、多くの現在利用可能な送達システムよりも低い抗原性を有す るならば、これもまた望ましい。例えば、そのような送達システムが、細胞傷害 性因子（例えば、イムノトキシン）を、現在このようなシステムに付随する抗原 性を有さずに細胞に送達するために使用され得るならば望ましい。 このシステムが、ウイルスの送達システムで生じ得るような細胞の悪性の形質 転換により、自身で疾患を引き起こす可能性を有さないならば、これもまた有益 である。 発明の要旨 本発明者らは、現在、所望の標的細胞への効率の高い核酸送達システムを開発 中である。このシステムは、例えば、トキシンタンパク質の必須部分をコードす る遺伝子を送達するために使用され得る。核酸（DNAまたはRNAのいずれか）が融 合タンパク質に結合される。融合タンパク質は、標的部分および核酸結合部分（ 例えば、DNA結合部分）からなる。例えば、標的部分は、好ましくは抗体、より 好ましくは単鎖抗体、抗体のFab部分、または(Fab')2セグメントであり得る。標 的動物がヒトである場合、DNA結合部分は好ましくはヒトDNA結合部分（例えば、 プロタミン）であるべきである。 図面の簡単な説明 図１は、本発明に従った核酸送達システムの使用の１実施態様の模式図である 。 図２は、融合タンパク質の発現ベクターの１実施態様の模式図である。それは 、二シストロン性哺乳動物発現ベクターの模式図である。このベクターは、プロ タミンタンパク質に融合させたHIV gp120タンパク質に対する抗体をコードする 。 図３は、発現したFab105−プロタミン融合タンパク質の放射性標識および免疫 沈降を示すオートラジオグラフである。 図４は、組換え融合タンパク質の精製およびSDS-PAGE分析を示す。 図５は、精製融合タンパク質のHIV gp120に対する結合活性を示す。 図６は、種々の濃度におけるFab105−プロタミン融合タンパク質のDNA結合活 性を示すオートラジオグラフである。 図７は、種々の濃度におけるFab105−プロタミン融合タンパク質のDNA結合活 性を示すオートラジオグラフである。 図８は、非感染細胞中およびHIV感染細胞中の両方における、Fab105複合体の 結合能と比較したFab105-プロタミンDNA複合体のHIV gp120タンパク質に対する 結合能を示すFACS分析である。 図９は、PEAコード遺伝子およびこの遺伝子の部分的ドメインを含むように作 られた２つのベクターを模式的に示すPEA触媒フラグメントの発現ベクターの模 式図である。 図10は、本発明の核酸送達システムの１つ、HIV感染細胞に対するFab105−プ ロタミン−トキシン発現因子の選択的細胞傷害性を示すグラフであり、そして細 胞生存率を示す。 図11は、HIV感染細胞に対するFab105−プロタミン−トキシン発現因子複合体 の選択的細胞傷害性を示すグラフであり、そしてタンパク質阻害アッセイを示す 。 図12は、ADP-リボシル化活性により測定したFab105−プロタミン−トキシン発 現因子複合体の選択的細胞傷害性を示す。 発明の詳細な説明 本発明者らは、本明細書中において新規の核酸送達システムを開示する。本シ ステムは、所望の核酸配列を結合する融合タンパク質を含む。 融合タンパク質は、標的部分および結合部分を含む。標的部分は、好ましくは 標的細胞上の部位に特異的に結合するタンパク質である。例えば、これはリガン ド特異的レセプター（例えば、線維芽細胞成長因子レセプター(FGF-R)）と、こ のレセプターに対する特異的FGF（例えば、塩基性FGF-Rに対する塩基性FGF）と に対するリガンドであり得る。あるいは、このタンパク質は、標的細胞に特異的 な抗体であり得る。例えば、これはHIVエンベロープタンパク質に対する抗体、 活性型レセプターの細胞外リガンド結合ドメインのような癌遺伝子決定因子（例 えば、erbB、kit、fms、neu、ErbB2）に対する抗体などであり得る。これはまた 、レセプターに対する抗体（例えば、GM-CSFレセプターに対する抗体）でもあり 得る。好ましくは、標的部分は抗体である。さらにより好ましくは、この抗体は 、抗体の結合配列を含有する単鎖抗体、(Fab')2セグメント、または抗体のFabフ ラグメントである。さらに好ましくは、抗体は単鎖抗体または(Fab')2セグメン トである。 選択される特定の標的部分は、本開示内容に基づいて実験的に決定され得、標 的細胞に依存する。例えば、体細胞治療に関して、またはインビボにおける血管 内標的のような容易にアクセス可能な細胞または組織に関して、標的部分の重要 な特質は、親和性および選択性である。このような場合、標的部分としての単鎖 抗体の使用が好ましい。しかし、標的細胞が容易にアクセス可能でない場合、例 えば、細胞が大きな固形腫瘍塊の一部であり、血液の供給が乏しく、そして高間 質圧を伴う場合、血清中半減期について考慮することはきわめて重要である。こ のような場合、完全な抗体および(Fab')2セグメントが代表的に好ましい。好適 な実施態様においては、結合部分が、IgG1のような無傷な（intact）免疫グロブ リンのカルボキシ末端に結合するように融合タンパク質を合成し得る。 抗原反応を制限するために、細胞が標的とされる宿主動物を考慮して標的部分 が好適に選択される。それゆえ、標的動物がマウスである場合は、好ましくはマ ウス抗体を使用するのに対し、標的動物がヒトである場合は、好ましくはヒト抗 体またはヒト化抗体を使用する。 融合タンパク質の第２の部分は、核酸結合部分（DNAまたはRNA結合部分のいず れか）からなる。好ましくは、DNAまたはRNAのいずれかを結合し得る部分を使用 する。この結合部分は、DNAまたはRNAのいずれかを結合する標的動物由来の任意 のタンパク質であり得る。例えば、これは、小さな塩基性DNA結合タンパク質で あるプロタミンであり得、これは、動物のゲノムDNAを精子頭部の制限された容 積内にパッケージングするために濃縮するのに役立つ[Warrant，R.W.ら、Nature 271:130-135(1978); Krawetz，S.A.ら、Genomics 5:639-645(1989)]。プロタミ ンの正電荷は、DNAのような核酸のリン酸塩のバックボーンの負電荷と強く相互 反応し得、中性かつ安定なDNA-プロタミン複合体を生じる。この核酸は、目的に よりDNAまたはRNAのいずれかであり得る。例えば、導入しようとする核酸は、細 胞内での抗体、優性ネガティブ変異、アンチセンスRNA、リボザイム、または細 胞傷害性因子を発現するために用いられ得る。例えば、細胞傷害性因子は、リシ ン、シュードモナスエキソトキシンＡ（PEA）の触媒フラグメントなどのような きわめて強力な細菌性または植物性トキシンの一部であり得る。 核酸は、細胞の一時的なまたは安定なトランスフェクションに使用され得る。 例えば、核酸がトキシンをコードするDNAセグメントのような、細胞に対して致 死的である因子をコードする場合は、一時的な発現で十分である。対照的に、核 酸が抑制遺伝子（例えば、網膜芽腫）のような因子、または十分なレベルで発現 されないタンパク質（例えば、アデノシンデアミナーゼ（ADA）［Belmont，J.W. ら、Mol．& Cell．Biol．8:5116-5125(1988); Palmer，T.D.ら、Proc．Natl．A cad．Sci USA: 1055-1059(1987)]、ウリジン二リン酸（UDP）-グルクロニルトラ ンスフェラーゼ[Ponder K P.ら、Proc．Natl．Acad．Sci USA 88:1217-1221(199 1)]、またはインスリン）を発現する場合、細胞染色体への安定な組込みが所望 され得る。安定な組込が所望されるこれらの場合において、核酸はDNAセグメン トであり得、ここで所望の因子をコードする遺伝子は、細胞への組込みを促進す るカセットへ挿入される。例えば、遺伝子を囲む組込みカセットは、レトロウイ ルス（すなわち、MMLV）の5'および3'LTR（末端反復配列）、ITR（逆位末端反復 単位、すなわち、アデノ関連ウイルス）などであり得る。[例えば、Scherdin，U .ら、J．Virol．64:907-912(1990)；Stief，Aら、Nature 341:343-345(1989)；P hi-Van，L.ら、Mol．& Cell．Biol．10:2302-2307(1990)；Phi-Van，L.ら、The EMBO Journal 7:655-664(1988)を参照のこと]。このカセットは、標準的な技術 により調製され得る。例えば、目的の遺伝子がLTR間またはITR間に挿入され得る 場合の哺乳動物の発現ベクター。両末端で隣接するLTR領域またはITR領域、プロ モーター/エンハンサー（好ましくは、間に挿入しようとする目的の遺伝子に対 するポリリンカーを伴う）、さらに所望であれば、公知の技術を用いる本開示内 容に基づく選択マーカーを含有するカセットを構築し得る。所望の核酸（例えば 、目的の１つのまたは複数の遺伝子）を伴うこのカセットは、核酸セグメントで ある。 標的部分は、標的細胞に対して、特異的に送達システムをもたらす。 また、位置決定（localization）配列を用いて、目的の細胞部位へ、放出され たRNAまたはDNAを細胞内送達し得る。 その後、標的細胞は、送達システムを取り込み得、このシステムは細胞に結合 される。代表的に、この送達システムは、細胞上の特異的なレセプターに結合す る。 例えば、レセプターおよび抗原を含む細胞表面上の膜タンパク質は、レセプタ ーに対するリガンドまたは抗体との相互作用後、レセプター仲介エンドサイトー シスにより、取り込まれ得る。[Dautry-Varsat，A.ら、Sci．Am．250:52-58(198 4)]。このエンドサイトーシスのプロセスは、本送達システムによって開発され る。このプロセスは、取り込まれようとするときにDNAまたはRNAを損傷し得るた め、発現させようとする核酸に対する強力なプロモーターを含有することが好ま しい。同様に、目的の遺伝子の多数の反復を含有するセグメントを使用すること が望ましい。また、エンドソームおよびリソソームを破壊する配列または部分も 含有し得る。例えば、Cristiano，R.J.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:115 48-11552(1993)；Wagner，E.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6099-6103(19 92)；Cotten，M.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6094-6098(1992)。 どのタイプの核酸セグメントを使用するかを決定する場合、当業者は、本明細 書の見地から、発現されるタンパク質を考慮する。例えば、トキシンタンパク質 を誘導する場合、その顕著な細胞傷害性のため、細胞を殺傷するためには、ほん のわずかの分子の発現しか必要としない。ADAの発現を伴うような他の場合では 、より多量のタンパク質の発現が必要であり、そしてDNAカセットの一部として のLTR、ITRの使用および/または複製-欠損アデノウイルスのようなリソソーム破 壊因子の使用が用いられ得る。 標的部分に対して選択される特定のタンパク質は、標的細胞に依存する。例え ば、HIV感染細胞のような感染細胞を標的とする場合、HIV感染細胞を特異的に標 的とするモノクローナル抗体を使用し得る。これは、エンベロープ糖タンパク質 に対する抗体を含有する。15e、21h［Thali，M.ら、J．Virol．67:3978-3988(19 93)]、F105、176、および48dのようなHIV-1 gp120またはHIV-2 gp120に対する多 くの既知の抗体のいずれかを使用し得る。核酸配列（例えば、抗体、デコイ配列 などの細胞内発現に対する遺伝子）を予防的に送達することを所望する場合、こ のような細胞上に存在するレセプター（例えば、HIV感受性細胞に対するCD4レセ プター）を標的とすることによって、高い感受性の細胞を標的とし得る。このよ うな状況下では、タンパク質は、レセプターに優先的に結合するリガンド（例え ば、CD4）であり得、そしてCD4レセプターに対する抗体のような、レセプターに 対する抗体も同様に用いられる。 標的部分を選択するためのストラテジーは、きわめて適応可能である。例えば 、特定の腫瘍は、大量の特定の細胞表面レセプター（例えば、乳癌を伴うneu） 、または特定のタンパク質の異常形態を有する細胞に頻繁に結合する。 他の目的のレセプターとしては、インターロイキンおよびインターフェロンの ようなリンホカインに対するレセプター（例えば、インターロイキン-２（IL-2 ）レセプター（IL-2R））が挙げられる。p55、IL-2Rα鎖はTacタンパク質とも呼 ばれ、Agまたはマイトジェン活性化Ｔ細胞と結合するが、残りのＴ細胞には結合 しない。これは、成人Ｔ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、およびホジキン病の ようなリンパ腫（lymphoid cancer）の悪性細胞上で高レベルで発現される。抗T ac抗体はこのタンパク質に結合する。このような抗体のヒト化バージョンは公知 であり、そしてQueen，C.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA:10029-10039(1989) ；Hakimi，J.ら、J．of Immun．151:1075-1085(1993)(Mikβ1（IL-2Rβ鎖に対す るMab)；Kreitman，R.J.ら、J．of Immun．149:2810-2815(1992)；Hakimi，J.ら 、J．of Immun．147:1352-1359(1991)に記載されている。 これらの種々のタンパク質に対する抗体は公知であり、そして入手可能である 。これらの抗体は、本明細書中に記載の一般的な手順に従い、そして所望の結合 部位をコードする遺伝子を例示された遺伝子の代わりに用いることによって、こ のシステムにおける使用に容易に適合され得る。例えば、標的細胞がHIV感染細 胞である場合、標的部分はHIVエンベロープ糖タンパク質を標的とし得る。この タンパク質に対する多くの抗体が使用され得る。例えば、F105抗体に基づく組換 え抗体が公知の教示技術によって作製される。[Posner，M.R.ら、J．Immunol．1 46:4325-4332(1991)；Thali，M.ら、J．Virol．65:6188-6193(1991)；Marasco， W.A.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:7889-7893(1993)]。作製され得る他の 抗体としては、15e、21h、17b、48dなどが挙げられる。 抗体の発現用ベクターは、本明細書に記載のように作製され得る。例えば、抗 体のFd部分（VHおよびCH）および例えば、F105抗体の軽鎖（例えば、κ鎖）の結 合領域を発現する二シストロン性哺乳動物発現ベクターは、終止コドンを伴わな いFdフラグメントを用い、そしてこのセグメントを標準的な技術（例えば、ポリ メラーゼ連鎖反応（PCR））により増幅することによって、構築され得る。上流 プライマーは、好ましくは、動物の免疫グロブリンのリーダー配列に対応し、こ の動物由来の送達因子の細胞が使用されるべきであり（例えば、標的細胞は、ア ミノ酸１〜６のヒト免疫グロブリンを伴うヒト細胞である）、HindIII部位のよ うな付加的な好都合なクローニング部位を伴う。下流プライマーは、重鎖定常領 域のカルボキシ末端近くのアミノ酸に対応し得る。例えば、F105抗体に基づく抗 体に関して、XbaI部位のような好都合なクローニング部位が挿入されたヒト重鎖 CHIドメインのアミノ酸226〜233。PCR反応は、標準的な手段に従って実施される 。この手段により、融合タンパク質の標的部分をコードする遺伝子または遺伝子 セグメントが調製される。 上記のように、融合タンパク質の第２の部分は結合部分である。好ましくは、 標的部分および結合部分の両方を発現する遺伝子セグメントを含有する単一のベ クターを使用する。しかし、ベクター系を用いて、少なくとも２つのベクターで 細胞を同時トランスフェクトし、そして融合タンパク質を発現する細胞を選択し 得る。好ましくは、単一のベクターを使用する。好ましくは、標準的な手段によ って、結合部分をコードする遺伝子または遺伝子セグメントに対する標的部分を コードする配列を結合する。例えば、ヒトプロタミンに対する遺伝子[Balhorn， J．of Cell．Biol．93:298-305(1982)]。他の核酸結合タンパク質は、GCN4、Fos 、およびJun（これらは、いくつかの塩基性残基、およびロイシンの７群反復（h eptad repeat）を含有する約30残基の隣接領域（２量体形成を仲介する「ロイシ ンジッパー」）からなる共通の構造モチーフを介しDNAに結合する）［Talanian ，R．V.ら、Science 249:769-771(1990)]；TFIIS核酸結合ドメイン（C末端残基2 31-280に見られる）[Qlan，X.ら、Nature 365:277-279(1993)]；リボ核タンパク 質（RNP）ファミリー（ヒトFMRIのドメイン中に存在する）、酵母タンパク質HX 、ニワトリ遺伝子ビギリン（vigillin）の14個のドメイン、mer1、酵母タンパク 質、細菌ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、およびリボソームタンパク質S3[Ash ley，C.T.ら、Science 262:563-566]；および熱ショックタンパク質の結合モチ ーフ[Rabindran，S.K.ら、Science 259:230-234(1993)]を包含する。標的細胞の 宿主動物は、結合モチーフを有するどのタンパク質またはタンパク質フラグメン トが用いられるかを決定するために使用される。例えば、ヒト宿主に関して、そ してヒトプロタミンの発現のために、既知のプラスミドpTZ 19R-HP1を使用し得 る[Krawetz，S.A.ら、Genomics 5:639-645(1989)]。好ましくは、発現ベクター が、原核系および真核系において融合タンパク質の発現に使用され得るように、 この遺伝子中のイントロンを欠失させる。PCR増幅は、標準的な手段によ り、実施される。例えば、アミノ末端からの配列に対応する上流プライマー（例 えば、XbaIクローニング部位のような好都合な制限部位を伴うプロタミンタンパ ク質のアミノ酸１〜６に対応）、および第１エキソンのカルボキシ部分に対応す る下流プライマー（例えば、第２エキソンの末端の5'アミノ酸（例えば第２エキ ソンのアミノ酸38〜40）に相補的な付加配列を伴うアミノ酸29〜37）を用いる。 次に、アミノ末端に対応する上流プライマーと、カルボキシ末端の重複部分に対 応する下流プライマーとを用いて、第２のPCR反応を実施し得る。例えば、第２ エキソン中の41位〜終止コドンまでのアミノ酸の配列およびNotIのような付加的 な好都合なクローニング部位を伴うアミノ酸31〜40に対応する配列を用いる。第 １のPCR増幅されたDNAセグメントは、テンプレートとして使用し得る。好都合な 制限部位を用いることによって、標準的な技術（例えば、アガロースゲル）を用 いて精製するような公知の方法により、標的部分および結合部分を切断し得る。 例えば、上記の例において、終止コドンを伴わないF105のPCR増幅されたFdは、H indIII/XbaIで切断され、そしてアガロースゲルにより精製され得る。PCR増幅さ れたプロタミンをコードする遺伝子は、イントロンを有さず、XbaI/NotIで切断 され、そしてアガロースゲルから精製され得る。Fab105プラスミドは、HindIII/ NotIで切断され得、そしてDNAセグメントはアガロースゲルから精製され得る。 次いで、HindIII/XbaI切断FdフラグメントおよびXbaI/NotI切断プロタミンフラ グメントは、３片連結（three-piece ligation）によりF105を含有するプラスミ ドのHindIII/NotI部位にクローン化され得る。図２を参照のこと。それゆえ、得 られる発現ベクターは、独立したプロモーター（例えば、CMVプロモーター）の 制御下でFd-プロタミン融合遺伝子のカートリッジ（インフレーム）およびκ鎖 の遺伝子を含有する。使用される特定のプロモーターは、融合タンパク質発現の ための所望の細胞系に依存する。プロモーターは当業者に既知であり、そして本 開示内容に基づいて容易に選択され得る。例えば、好ましいプロモーターとして は、CMV、SRα、RSV、MMLV LTR、SV40、およびHIV-1 5’LTRが挙げられる。 この構築物は、DNA配列決定のような標準的な手段により容易に確認され得る 。 次いで、この発現ベクターは、細胞株を安定に形質転換するために用いられ得 る。この細胞株は、原核細胞および真核細胞を包含する任意の所望の細胞株であ り得る。好ましい細胞株は、COS細胞、腎細胞株（例えば、CHO）、ミエローマ細 胞株（例えばSP/0、およびSP/2、HMMA2-11 TG10）を含む哺乳動物細胞、および 昆虫細胞株（例えば、ショウジョウバエ）を包含する。好ましくは、抗原性を減 少させるために、哺乳動物細胞株を用いる。より好ましくは、ミエローマ細胞を 用いる。好ましい細胞は、SP/0、SP/2、Sp2/0-Ag14、X63Ag8.653、FO、NSI/1-Ag 4-1、NSO/1、FOX-NY、YB2/0、および1R983Fを包含する。 細胞の形質転換は、任意の形質転換技術による形質転換であり得る。特定の場 合ではDEAE-デキストラン技術による一過性の形質転換が許容されるが、細胞を 安定に形質転換することが好ましい。従って、好ましくは、細胞を安定に形質転 換する方法を用いる。例えば、この方法は、リン酸カルシウム沈澱法であり、そ の後、形質転換細胞株の選択（例えばG418選択）を行う。形質転換細胞株は培養 され得、そして融合タンパク質は標準的な技術により回収される。例えば、Fd- プロタミンタンパク質およびF105のκ鎖は、発現され、COS形質転換Fab105プロ タミン細胞の培養物中に分泌され、そして放射性標識および抗ヒトIgG抗体によ る免疫沈降により検出され得る。 例えば、COSI細胞は、リポフェクチン（lipofectin）を用いて、標的部分−結 合部分のカートリッジを含有する発現ベクターでトランスフェクトされ得る。ベ クターは、ベクターpCMV-Fab105-プロタミンを包含する。次いで、トランスフェ クト細胞は、10％ウシ胎児血清（FCS）を添加したDMEM中に２日間インキュベー トされ得、選択培地（例えば、10％FCSおよび500μｇ G418を有するDMEM）と置 き換えられ得る。これは、例えば、BRLから容易に入手可能である。G418耐性コ ロニーは、約２週間後に出現し、容易に選択され得る。次いで、コロニーは限界 希釈でクローン化され得、放射性標識および免疫沈降、ELISA、ならびに免疫蛍 光染色により、組換え融合タンパク質の発現について試験され得る。タンパク質 は、標準的手段によりこれらの細胞に分泌および精製され得る。例えば、形質転 換COS細胞は、10％ウシ胎児血清および500μg/mlのネオマイシンを添加したDMEM 培地を入れたフラスコ内で増殖され得る。コンフルエンス（confluence）に達し た後、培養物は、FCSを含まない新鮮DMEMと２週間の間３日ごとに置き換えられ 得る。回収した培養培地は、例えば、遠心分離（例えば、500rpmで４℃で20分 間）により清澄化され得、次いで、例えば10,000ダルトンの分子量カットオフを 備えたメンブレンフィルター（例えばAmicoコンセントレーター）を用いて濃縮 され得る。次いで、濃縮培地は、抗ヒトIgGκ鎖モノクローナル抗体と結合させ たアフィニティーカラム（例えば、Kirkegaard & Perry，Inc.により販売）にロ ードされ得る。アフィニティーカラムはPBSで洗浄され得、濃縮培養培地をロー ドされ得る。次いで、培地をカラムに通し、その後タンパク質が溶出物中に検出 されなくなるまでPBS洗浄を行う。次いで、カラムは予備溶出緩衝液（例えば、1 0mM リン酸塩（pH8.0）で洗浄され、そして100mNグリシン（pH 2.4）でカラムか ら溶出する。タンパク質のピーク画分は、例えばBradfordタンパク質アッセイ（ Biolab）によるような標準的手段により検出され、一緒にプールされ、そして0. 2M NaClに対して透析される。 好ましい実施態様では、細胞を無血清培地における増殖に適合させる。これは 、当業者により行われ得る。例えば、容易にCOS細胞およびCHO細胞を適合させ得 る。このことを行う際に、比較的純粋なFab-融合タンパク質が培地に分泌される 。従って、精製手順はより簡便になる。 精製融合タンパク質は、所望の核酸配列と組み合わされるように準備される。 この所望の核酸配列としては、例えば、ポジティブ増強因子（potentiater）の 配列（例えば、サイトカインの遺伝子、消失タンパク質または欠損タンパク質の 遺伝子など）またはネガティブ増強因子の配列（例えば、トキシン、アンチセン スRNA、自殺遺伝子（例えばHSVチミジンキナーゼ（thymidiac kinase））、リボ ザイム、優性ネガティブ変異体など）が挙げられる。例えば、核酸がトキシンを コードする場合、好ましくは、トキシン遺伝子を改変して、それが非標的細胞に 影響する可能性を最小限にするように取り計らう。これは、例えば、認識ドメイ ンをコードするこれらの配列を削除するような、標準的な技術により行われ得る 。トキシンは周知であり、そしてジフテリアトキシンおよびその部分切断型、シ ュードモナスエキソトキシンおよびその部分切断型、リシン／アブリン、ブロッ クリシン／アブリン、リシントキシンＡ鎖、リボソーム不活性化タンパク質など を包含する。これらのタンパク質は全て異なるドメインを有する。例えば、PEA をコードする遺伝子はいくつかのドメインを有する：ドメインＩは細胞認識を担 う；ドメインIIはトキシン交差膜のトランスロケーションを担う；そしてドメイ ンIIIは延長因子２のアデノシン二リン酸(ADP)リボシル化（これは実際に細胞死 を担う段階である）を担う［Gary，G.L.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:26 45-2649(1984)；Allured，V.S.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:13220-1324 (1986)；Siegall，C.B.ら、J.Biol．Chem．264:14256-14261(1989)］。従って、 例えばフレームシフト変異、終止配列の挿入、または欠失により、ドメインＩま たはドメインIIを発現できないようにこれらのドメインを改変することにより、 近隣の細胞に影響するトキシンの能力を最小限にし得る。その後、当業者は標準 的な技術を用いて、発現が所望される他のドメインまたはドメインの一部が用い られることを保証し得る。 例えば、上述したように、PEAについてはドメインIIIのみが絶対的に必要とさ れる。しかし、本発明者らは、他のドメイン由来の部分配列を含むことにより、 トキシンをより有効にすることを見出した。例えば、本発明者らは２つのPEA哺 乳動物発現ベクターを調製した。これはドメインIII（成熟PEAアミノ酸残基405 位〜613位、pCMV-PEA IIIと称される）のみが発現されるベクター、ならびにド メインIIIおよびドメインIBの一部（アミノ酸385位〜613位の配列；pCMV-PEAIbI II）が発現されるベクターである。これらの配列は、標的細胞における発現を可 能にするプロモーターに作動可能に連結されるべきである。例えば、哺乳動物プ ロモーター（例えば、CMV、SRα、RSV、SV40、MMLV LTR、HIV-1 5'LTR）が好ま しい。より好ましくは、CMV、HIV-1 5'LTR、RSV、およびSV40である。これらの 遺伝子フラグメントによりコードされるトキシンタンパク質は、認識ドメインを 欠失する。それらは周囲の細胞に対して非毒性であり、細胞内で発現されるとき のみ毒性である。これらの発現ベクターは、簡潔なインビトロアッセイにより、 いかに良好に細胞内で産物を発現するかを決定するために容易に試験され得る。 例えば、これらのPEAトキシンフラグメントをコードするDNA配列の発現は、送達 システムを用いて細胞を形質転換し、そして細胞の細胞傷害性を観察することに より試験され得る。本発明者らは、pCMV-PEIbIIIベクターは、ドメインIIIのみ を発現するベクターより高いレベルのADP-リボシル化を示すことを見出した。従 ってこのpCMV-PEIbIIIベクターを用いることが好ましい。 図１は、本システムによる核酸送達システムの使用を示す模式図である。ここ で、核酸配列は、トキシン発現因子DNAである。 いくつかの場合では、イムノトキシンを用いる場合でさえ、耐性変異体が発達 し得る。このような場合において、異なるトキシン遺伝子または異なるタイプの 核酸セグメントを、融合タンパク質に結合している核酸カセットに容易に挿入し 得る。従って、本システムにより、広範なDNAおよびRNAセグメントの生産および 使用が可能になる。 いくつかの好ましい実施態様では、核酸送達システムの混液が与えられる。こ のシステムでは、標的部分が標的細胞の数を広げるように変化され得るか、ある いは送達される核酸セグメントが標的細胞へ送達される産物のスペクトルを広げ るように変化される。 タンパク質がトキシンである場合、細胞における一過性発現のみが必要とされ る。しかし、細胞を安定に形質転換することが所望される場合、遺伝子を、LTR またはITRを含有するカセット中にいずれかの側で配置し、安定な組み込みを促 進する。あるいは、カセットはエピソームベクターであり得る。エピソームベク ターとしては、例えば、エプスタインバーウイルスを含有するベクター、例えば 、pEBV His A、B、およびC、pREP4、pREP7、pREP10が挙げられ、これらはInvitr ogen Corporationにより市販されている。 組換え融合タンパク質は、標準的な技術により核酸セグメントと組み合わせら れる。例えば、融合タンパク質は、所定の量の所望の核酸配列（DNAまたはRNAの いずれか）と、公知の手段（例えば、溶液（例えば、0.2M NaCl溶液）中におけ る混合）により混合され得る。DNAまたはRNAは、プロタミンにより容易に結合さ れる。その後、キャリアが、体細胞治療またはインビボでの使用のいずれかのた めに所望の細胞に与えられ得る。 送達システムは、多くの手段のいずれかによって送達され得る。例えば、送達 システムは、非経口注射（筋内（i.m.）、腹腔内（i.p.）、静脈内（j.v.）、ま たは皮下（s.c.））、経口投与経路、または当業者に周知の他の投与経路により 投与され得る。非経口投与が好ましい。 用いられる量は、代表的には、約0.1mg〜約10mg/kg体重の範囲である。送達シ ステムは、好ましくは、送達される単一または複数の核酸に基づいて、単位投与 量剤型で処方される。 例えば、経口投与のために用いられ得る固体用量剤型は、カプセル剤、錠剤、 丸剤、散剤、および顆粒剤を包含する。このような固体用量剤型では、活性成分 （すなわち、標的部分）は、少なくとも１つの不活性キャリアと混合される。不 活性キャリアとしては、スクロース、ラクトース、またはデンプンが挙げられる 。このような用量剤型はまた、不活性希釈剤以外の添加物質を含有し得る。添加 物質としては、例えば、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）が挙げら れる。さらに、用量剤型は、カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、緩衝剤もま た含有し得る。錠剤、カプセル剤、および丸剤はまた経時放出コーティングもま た含有し得る。 非経口投与のためには、用量剤型は、代表的には、滅菌した水溶液または非水 性溶液、懸濁液、または乳濁液を、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルと併用し て含有し得る。非水性溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリ エチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油およびトウモロコシ油）、ゼラ チン、および注射可能な有機エステル（例えばオレイン酸エチル）である。これ らの用量剤型はまた、アジュバントを含有し得る。アジュバントとしては、例え ば、保存剤、加湿剤、乳化剤、および分散剤が挙げられる。それらは、抗体を不 活性化しないように注意が払われる限り、例えば細菌保持フィルターによる濾過 、滅菌剤の組成物への取り込み、組成物の照射などにより滅菌され得る。それら はまた、使用前に滅菌水の媒体またはいくつかの他の滅菌注射媒体中で製造され 得る。これらのピヒクルのさらなる例は、生理食塩水、リンゲル溶液、デキスト ロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを包含する。リポソームもまた、キ ャリアとして用いられ得る。等張性および化学的安定性を増強する物質のような 添加剤（例えば、緩衝液および保存剤）もまた用いられ得る。 このようなビヒクル内における活性成分の好ましい範囲は、約１mg/ml〜約10m g/mlの濃度である。より好ましくは、約３mg/ml〜約10mg/mlである。 特定の実施態様におけるレセプター仲介遺伝子送達は比較的非効率的であり得 るが、本遺伝子送達システムを利用することにより、より高い投与量での注入ま たは繰り返し注入の使用から生じる抗原反応について案じる必要がない。これは 、標的部分およびDNA結合部分が、それが注入される動物（例えば、ヒト）に由 来するか、またはその動物と同様に作られるか（すなわち、ヒト化マウス抗体ま たはヒトに対する結合タンパク質を用いる）のいずれかであるように設計され得 るからである。DNA自身は、弱免疫原性または非免疫原性である。従って、薬剤 全体は、非免疫原性であるか、または弱免疫原性であるかのいずれかである。送 達システムは、効率的に生成され得、そして高結合活性を有するように調整され 得るので、繰り返し用いられ得る。 さらに、上述したように、送達システムの効率を向上させるために本システム において利用され得る方法がある。例えば、この方法は、核酸をその所望の標的 に、より効率的に送達するために、核酸セグメントと結合した核標的配列のよう な標的配列を含み得る。標的配列は当該分野で公知であり、そして例えば、HIVg ag p17における25位と33位との間の核位置決定シグナル（配列番号１）（KKKYYK LK）を包含する。従って、この方法は、DNAをより有効に標的するために融合部 分の一部として、標的配列を、好ましくはリポソーム内部に含み得る。 本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。これらの実施例は、本発 明の理解を助けるために提供され、本発明の限定として解釈されるわけではない 。 実施例 二シストロン性哺乳動物細胞発現ベクター（pCMV-Fab105-プロタミン）を以下 のように構築した。このベクターは、１つの発現カセット中にヒトプロタミンタ ンパク質に融合したF105のFdをコードするキメラ遺伝子、および別の発現カセッ ト（図２）中にF105κ鎖コード遺伝子を含有する。 Fab105- プロタミン融合タンパク質のための哺乳動物発現ベクターの構築 pCMV-Fab105プラスミドを以下に記載のようにして構築した。このプラスミド は、F105ハイブリドーマ由来のFd遺伝子およびκ鎖遺伝子についての二シストロ ン性発現カセットを含有する。融合タンパク質発現ベクターを構築するために、 終止コドンを含まないF105のFdフラグメントを、pCMV-Fab105をテンプレートと して用いてPCRにより増幅した。上流プライマー（配列番号２）（5'-TTTGAATTCA AGCTTACCATGGAACATCTGTGGTTC-3'）（付加的なHindIIIクローニング部位（Kabat ら、1987）を伴うアミノ酸１位から６位のヒト免疫グロブリンリーダー配列に対 応する）、および下流プライマー（配列番号３）（5'-GGTACCGAATTCTCTAGAACAAG ATTTGGGCTC-3'）（付加的なXbaIクローニング部位を伴うヒト重鎖定常領域のア ミノ酸226位から233位に対応する）をPCR増幅のために用いた。PCR反応は以前に 記載のようにして実施した［Marascoら、J．of Clin．Invest．90:1467-1478（1 992）］。 ヒトプロタミン遺伝子をプラスミドpTZ19R-HP1［Krawetz，S.A.ら、Genomics 5:639-645（1989）］から増幅した。このクローンにおけるプロタミン遺伝子中 のイントロンを欠失させるために（同様に原核系における発現のために）、最初 のPCR増幅を、上流プライマーP1（配列番号４） （この配列は、付加的なXbaIクローニング部位を伴う、プロタミンタンパク質の アミノ酸１位から６位の配列に対応する）、および下流プライマー（配列番号５ ） （この配列は、第２エキソンのアミノ酸38位から40位に相補的な付加配列を伴う 、アミノ酸29位から37位に対応する）を用いて実施した。２回目のPCR反応を、 上流プライマーP1および下流プライマー（配列番号６） （この配列は、第２エキソンのアミノ酸41位から終止コドンまでの配列および付 加的なNotIクローニング部位を伴う、31位から40位のアミノ酸配列に対応する） を用いて実施した。最初のPCR増幅DNAをテンプレートとして用いた。 二シストロン性融合タンパク質発現ベクターを構築するために、終止コドンを 含まないF105のPCR増幅FdをHindIII/XbaIで切り出し、そしてアガロースゲルか ら精製した。イントロンを含まないPCRで増幅した完全プロタミンコード遺伝子 をXbaI/NotIで切り出し、そしてアガロースゲルから精製した。pCMV-Fab105プラ スミドをHindIII/NotIで切り出し、約7.0kdのDNAフラグメントをアガロースゲル から精製した。次いで、HindIII/XbaI切断FdフラグメントおよびXbaI/NotI切断 プロタミンフラグメントをpCMV-Fab105のHindIII/NotI部位に三片連結によりク ローン化した。得られた発現ベクター（pCMV-Fab105-プロタミンと称する）は、 独立CMVプロモーターの制御下でFd-プロタミン融合遺伝子（インフレーム）およ びκ鎖遺伝子を含有する。この構築物をDNA配列決定により確認した。 pCMV-Fab105ベクター中にクローン化したF105 FdおよびヒトプロタミンDNAフ ラグメントを図２に示す。得られた二シストロン性発現ベクター（pCMV-Fab105- プロタミン）は、Fd105-プロタミン融合タンパク質についての発現カセット、お よびF105のκ鎖についての別のカセットを含有する。 DNAトランスフェクションおよびG418選択後、形質転換哺乳動物細胞株COS-Fab 105-プロタミンを生成させた。 形質転換細胞株の構築 形質転換細胞株を生成させるために、COS-1細胞を６ウエルプレート上で増殖 させ、以前に記載のようにリポフェクチンを用いてpCMV-Fab-プロタミンでトラ ンスフェクトした［Chen，S.-Y.ら、J．Virol．65:5902-5909（1991）］。トラ ンスフェクト細胞を10％FCSを添加したDMEM中で２日間インキュベートし、そし て選択培地(10％FCSおよび500μg/ml G418（BRL）を添加したDMEM)に置き換えた 。G418耐性コロニーは、選択の２〜３週間後に出現した。このコロニーを限界希 釈を用いてサブクローン化し、そして放射性標識および免疫沈降、ELISA、なら びに免疫蛍光染色により、組換え融合タンパク質の発現について、記載のように 試験した［Marasco，W.A.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:7889（1993）］ 。Fd-プロタミンタンパク質およびF105のκ鎖は、放射性標識および抗ヒトIgG抗 体を用いる免疫沈降により検出されるように、発現され、そしてCOS-Fab105-プ ロタミン細胞の培養培地中に分泌される。図３を参照のこと。 融合タンパク質の精製 形質転換COS細胞（COS-Fab105-プロタミン）を10％ウシ胎児血清（FCS）およ び500μg/mlのネオマイシンを添加したDMEM培地を入れたフラスコ内で増殖させ た。コンフルエンスに達した後、細胞培養物を、FCSを添加しない新鮮DMEMに２ 週間の間３日ごとに置き換えた。回収した培養培地を5000rpm、４℃で20分間の 遠心分離により清澄化し、次いで、10,000ダルトンの分子量カットオフのメンブ レンフィルターを備えたAmicoコンセントレーターを用いて濃縮した。次いで、 濃縮培地を、抗ヒトIgGκ鎖モノクローナル抗体と結合させたアフィニティーカ ラム（Kirkegaard & Perry，Inc.）にロードした。 アフィニティーカラムの調製は、記載のようにして、２mgの精製モノクローナ ル抗体を１mlのプロテインＡ−セファロースCL-4B湿潤ビーズ（Pharmacia Inc． Uppsa1a，Sweden）と混合することにより行った。簡単に言えば、プロテインＡ- セファロース-4BビーズをPBSで洗浄し、次いでPBS中で４℃で一晩精製抗体と混 合した。この混合物を10容量の0.2Mホウ酸ナトリウム（pH 9.0）で洗浄し、ジメ チルピメリミデート（dimethypimelimidate）を添加し、最終濃度を20mMとした 。混合物を振盪器（rocker）上で室温で30分間撹拌し、0.2Mエタノールアミン（ pH 8.0）で１回洗浄し、次いで振盪器上で、0.2Mエタノールアミン中で室温で２ 時間インキュベートした。最後の洗浄後、抗体と結合させたビーズを0.01％メル チオレートを有するPBS中で再懸濁した。 アフィニティーカラムをPBSで洗浄し、濃縮培養培地をロードした。培地をカ ラムに通し、その後タンパク質が溶出物中に検出されなくなるまでPBS洗浄を行 った。カラムを予備溶出緩衝液（10mM リン酸塩（pH8.0））で洗浄し、そしてpH 2.4で100mNグリシンでカラムから溶出した。タンパク質のピーク画分を、Bradf ordタンパク質アッセイ（Bio-Lab）により検出し、一緒にプールし、そして0.2M NaClに対して透析した。融合タンパク質のDNA結合部分を、DNAセルロースと放 射性標識細胞の培養培地とのインキュベーションにより試験した。 形質転換細胞株(COS-Fab105-プロタミン)を、pCMV-Fab105-プロタミンDNA[War rant,R.W.ら、Nature 271:130-135(1978)]を用いてトランスフェクションした後 にG418(Gibco-BRL)選択を用いて生成した。COS-Fab105細胞株を以前に記載の ように確立した[Warrant,R.W.，Nature 271，上記]。発現タンパク質を試験する ために、形質転換細胞を４時間放射性標識し、そして抗ヒトIgG(Southern Biote ch)およびプロテインＡ-Sepharose 4Bビーズを用いてまたはDNAセルロース(Phar macia)を用いて沈澱し、そして以前に記載されるようにSDS-PAGEにより分析した [Chen,S.-Y.ら、J.Virol．65:5902-5909(1991)]。無血清培地中に、分泌されたF ab105-プロタミンを精製するために、COS-Fab105-プロタミン細胞の培養培地を 清澄化し、濃縮し、そして抗ヒトIgGモノクローナル抗体を結合したプロテイン Ａ-Sepharose 4Bビーズのアフィニティーカラムにロードした。このカラムは、 記載された方法[Winter,G.,ら、Nature 349:293-299(1992)]に従って調製した。 カラム上の結合タンパク質を100mMグリシン(pH7.5)により溶出し、次いで濃縮し 、そして0.20M NaCl溶液に対して透析した。ELISAのために、マイクロタイター プレートを組換えgp120(Americain Biotechnology Inc.)でコートし、そして公 知の濃度のFab105またはFab105プロタミンタンパク質とともにインキュベートし た後、アルカリホスファターゼ(Sigma)と結合した抗ヒトIgGとともにインキュベ ートした[Warrant,R,W.,ら、Nature 271，上記]。 図３は、発現される融合タンパク質の放射性標識および免疫沈降を示す。形質 転換細胞株(COS-Fab105-プロタミン)を上記のように生成した。６ウェルプレー ト上の細胞を、35Sシステインで４時間連続的に放射性標識し、そして細胞の培 養培地を、抗ヒトIgG抗体(Southrn Biotech)を用いた後にSepharose-プロテイン Ａによるか、またはDNAセルロース(Pharmacia)を用いるかのいずれかで沈澱した 。サンプルを還元状態下でSDS-PAGEにより分析した。レーン１、抗ヒトIgGを用 いて沈澱されたCOS-Fab105-プロタミン；レーン２、抗ヒトIgGおよびDNAセルロ ースを用いて沈澱されたCOSベクター；レーン３、DNAセルロースを用いて沈澱さ れたCOS-Fab105-プロタミン；レーン４およびレーン５、DNAセルロース(４)また は抗ヒトIgG(５)を用いて沈澱されたCOS-Fab105。 DNAセルロースは、Fd-プロタミン融合タンパク質およびκ鎖を共沈澱したが、 Fab105フラグメントを沈澱しなかった。このことはFd-プロタミン融合タンパク 質のDNA結合部分がそのDNA結合能力を維持しており、そして融合タンパク質が互 いに会合されていることを示唆している。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)に より、COS-Fab105-プロタミン細胞の培養培地中でHIV gp120に対する結合活性( 約0.1μg/ml/24時間)が検出されたが、ベクターを形質転換した細胞の培地にお いては、結合活性は観察されなかった。 分泌された組換え融合タンパク質を、無血清培養培地から、抗ヒトIgG抗体κ 鎖モノクローナル抗体が結合したアフィニティーカラムを使用することにより精 製した(図４)。カラムに結合した融合タンパク質を100mMグリシン(pH2.4)により 溶出し、濃縮し、そして非還元条件下または還元条件下で以下のようにSDS-PAGE により分析した。図２に示すように、還元条件下で、Fd-プロタミン融合タンパ ク質およびκ鎖に対応する２つのバンドがゲル上に出現した。一方、非還元条件 下では、大多数のタンパク質がより高分子側のバンドにシフトした。これは組立 てられたFabフラグメントを表すようである。精製Fab105-プロタミンのgp120に 対する特異的結合活性が、Fab105の特異的結合活性よりはわずかに低いものの、 ELISAにより検出された。 図４は、組換え融合タンパク質の精製およびSDS-PAGE分析を示す。 培養培地中のFab105-プロタミン融合タンパク質を、記載されるように抗ヒトI gGκ鎖モノクローナル抗体(Kirkegaard and Perry Lab)を結合したアフィニティ ーカラムを使用することにより精製した。カラムに結合したタンパク質を100mM グリシン(pH2.4)により溶出し、次いで濃縮し、そして0.20M NaCl溶液に対して 透析した。精製タンパク質を、還元条件下または非還元条件下でSDS-PAGEにより 分析した後、Coomassie blue染色した。 レーンａ、還元条件下における100ng(左)の精製Fab105-プロタミン、レーンａ ’、還元条件下における10ng(右)の精製Fab105-プロタミン；レーンｂ、非還元 条件下における100ngの精製Fab105-プロタミン。 精製融合タンパク質のGp120に対する結合活性を図５に示す。 組換えHIV-1 gp120(American Biotechnology，Inc.)でコートしたELISAプレー トを、Fab105またはFab105-プロタミンタンパク質とともにインキュベートした 後、アルカリホスファターゼ(Sigma)と結合したヒトIgGとともにインキュベート した。gp120に対する結合活性を、基質(Bio-Lab)とともにインキュベーションし た後にOD450で検出した。示されたデータは２回平行測定値の平均値である。レ ー ンａ、10ng/mlのFab105またはFab105-プロタミン；レーンｂ、１ng/ml；レーン ｃ、0.1ng/ml、およびレーン３、0.01ng/ml。各レーンの第１のカラムはFab-105 、一方、第２のカラムはFab-105-プロタミンである。 これらの結果は、組立てられ、そして培養培地中へ分泌されるFab105-プロタ ミン融合タンパク質が、HIV-1 gp120に対する特異的結合活性を有していること を示す。 Fab105-プロタミンのDNA結合活性をゲルシフトアッセイ[Wagner,E.,ら、PNAS USA:89:6099-6103(1992)]により試験した。 DNA 結合アッセイ 組換え融合タンパク質のDNA結合活性を分析するために、ゲルシフトアッセイ を使用した。0.2N NaCl溶液中の精製融合タンパク質の上昇量を、0.2N NaCl溶液 中の放射性標識されたまたは非標識のいずれかの所定量のDNAとともに混合した 。32P-dATP(Amersham)によるDNA放射性標識を、ニックトランスレーションキッ ト(Promega)を使用して実施した。タンパク質-DNAの混合物を室温で30分間静置 し、そして0.45μMのポアサイズのメンブレンに通して濾過し、DNA-タンパク質 沈澱物を除去し、次いで１×TAE緩衝液中で電気泳動するために、1.0%アガロー スゲルにロードした。DNA-トキシン発現因子の細胞傷害性を分析するために、融 合タンパク質-DNA混合物を、細胞培養物に添加する前に正常生理食塩水に対して ４℃で１晩透析した。 Fab105-プロタミンタンパク質のDNA結合活性を、図６に示す。 Fab105-プロタミンのDNA結合活性を、ゲル移動度シフトアッセイ[Wu,G.Y.ら、 J.Biol.Chem．262:4429-4432(1987)]により試験した。pCMV-Fab105-プロタミン のHindIII／XbaI切断DNAフラグメントを、ニックトランスレーションキット(Pha rmacia)を用いて32P-dATPで放射性標識した。20ngの標識DNAを、各サンプルにつ いて上昇量のFab105-プロタミンタンパク質とともに、0.20N NaCl溶液中でイン キュベートした。コントロールとして、DNAをFab105タンパク質とともにインキ ュベートした。全プラスミドDNA pCMV-Fab105-プロタミン(各サンプル0.2μg)も また、上昇量のpCMV-Fab105-プロタミンタンパク質とともに、0.20N NaCl中でイ ンキュベートした(図７を参照のこと)。サンプルを、0.8%アガロースゲル上の電 気泳動により分析した。オートラジオグラフィーのために、ゲルを乾燥し、そし てＸ線フィルム上に曝露した。図６：レーン１、DNA(５μg)のみ；レーン２〜４ 、DNA(５μg)と0.5ng Fab-プロタミン(２)；DNA(５μg)と1.0ng Fab-プロタミン (３)；DNA(５μg)と10ng Fab-プロタミン(4)；レーン５、コントロールとしてDN A(５μg)/10ng Fab105。図７、レーン１、DNA(0.2μg)のみ；レーン２、DNA(0.2 μg)/2.0μg Fab105コントロール；レーン３〜６、DNA(0.2μg)と0.1μg Fab-プ ロタミン(３)；DNA(0.2μg)と0.2μg Fab-プロタミン(４)；DNA(0.2μg)と0.4μ g Fab-プロタミン(５)；DNA(0.2μg)と0.6μg Fab-プロタミン(６)、レーン７、 Fab105-プロタミンのみ(0.6μg)；およびレーン８、DNA(0.2μg)と0.6μgのFab1 05-プロタミン(ゲルにロードする前にフェノール抽出)。 図６および図７に示すように、放射性標識したDNAフラグメントまたは全プラ スミドDNAと混合した融合タンパク質の量が増加すると、アガロースゲル中に移 動するDNAフラグメントまたは全プラスミドDNAの量は減少し、そしてアガロース ゲルに入ったDNAはよりゆっくりと移動した。一方、Fab105タンパク質とともに インキュベートしたDNAは、アガロースゲル中でその移動度の顕著な変化を示さ なかった。DNAと結合後の細胞表面上のgp120に対する融合タンパク質の結合活性 を、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)によりさらに試験した。 Fab105-プロタミン-DNA複合体の細胞表面上のGP120に対する結合能力を図８に 示す。 HIV感染Jurkat細胞または疑似感染Jurkat細胞を、Fab105またはFab-プロタミ ンタンパク質-DNA複合体とともにインキュベートした後、Fitcと結合した抗ヒト IgG Fab[Pastan,Iら、Science 254:1173(1992)]とともにインキュベートした。 次いで、細胞表面上の蛍光染色をFACSにより解析した。 DNA移動度シフトアッセイを記載[Wu,G.Y.ら、J.Biol.Chem．262:4429(1987)； Wagner.E.ら、Proc.Natul.Acad.Sci．USA 89:6099(1992)]のように実施した。上 昇量の精製融合タンパク質を、0.2M NaCl溶液中で所定量のDNAと混合した。電気 泳動のために0.8%アガロースゲルにロードする前に、混合物を室温で30分間静置 し、次いで0.45μMメンブレン(Millipore)に通して濾過した。細胞表面上の、 gp120に対する融合タンパク質-DNA複合体の結合能力を検出するために、１μgの 精製Fab105-プロタミンを、100μlの0.2N NaCl中、30分間、0.5μgのpCMV-Fab10 5プラスミドDNAと混合し、そして混合物を1:20に0.9%N NaCl溶液で希釈し、そし てHIV-1感染Jurkat細胞または非感染Jurkat細胞とともにインキュベートした後 、抗ヒトIgG-Fitc結合体とともにインキュベートした。Fab105フラグメントをコ ントロールとして使用した。次いで、蛍光染色物をFACSにより解析した。 図８に示すように、Fab105またはFab105-プロタミン-DNA複合体のいずれかと 反応したHIV-1感染細胞は、ポジティブな染色を示したが、複合体とともにイン キュベートした非感染の細胞は、ネガティブな染色を示した。結合抗体と直接イ ンキュベートした感染細胞もまた、ネガティブな染色を示した(示さず)。従って 、DNA分子と結合した後も、Fab105-プロタミン融合タンパク質は、gp120に対す る結合活性を維持する。 コード遺伝子配列と機能との関係に関する知識が蓄積されているので、哺乳動 物トキシンの発現ベクターを構築するために、PEAのコード遺伝子を選択した[Ga ry,G.L.ら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 81，上記；Allured,V.S.ら、Proc.Natl.A cad.Sci．USA 83，上記；Siegall,C.B.ら、J.Biol,Chem．264，上記]。PEAはい くつかの機能ドメインを有する：ドメインＩは、細胞認識を担う：ドメインIIは 、トキシン交差膜のトランスロケーションを担う；およびドメインIIIは、延長 因子２のアデノシン二リン酸(ADP)-リボシル化（実際に細胞死を担う段階）を担 う[Allured,V.S.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 83，上記;Siegall,C.B.ら、J.Biol. Chem．264，上記]。２つのPEA哺乳動物発現ベクターを設計し、そしてドメインI II(405位〜613位の成熟PEAアミノ酸残基)のみ(pCMV-PEAIII)またはドメインIII および部分的なドメインIb配列(385位〜613位のアミノ酸)のみ(pCMV-PEAIb-III) が、CMVおよびT7プロモーターの制御下に置かれるように構築した。 トキシン発現ベクターの構築 PEAコード遺伝子を含有するプラスミドpJH8(ATCC寄託番号67208を有する)を、 アメリカンタイプカルチャーコレクション，12301 Parklawn Drive，Rockville ，MD 20852から得た。PEAコードドメインの概略図については図９を参照のこと 。 PEA触媒フラグメントをコードするDNA配列をpJH8 DNAをテンプレートとして用い るPCR増幅により得た。pCMV-PEIIIと名付けたトキシン発現因子を構築するため に、さらなるHindIII部位および開始コドンならびにそれに続く成熟PEAの405位 〜411位アミノ酸に相補的な配列を含有する上流プライマー(P1(配列番号７)5'TT TAAGCTTATGGGCGACGTCAGCTTCAGCACC-3')、およびさらなるXbaI部位が続くPEAのア ミノ酸609位〜終止コドンに相補的な配列を含有する下流プライマー(P-2(配列番 号８)5'-TTTTCTAGATTACTTCAGGTCCTCCGG-3')を使用してPEAのドメインIIIを増幅 した。トキシン発現因子pCMV-PEIbIIIを構築するために、PEAの365位〜372位ア ミノ酸に対応する上流プライマー(配列番号９)(P3-5'-TTTAAGCTTATGCCGACGTGGTG AGCCTG-3')、および下流プライマーP-2を使用して、部分的ドメインIbおよびド メインIIIを増幅した。増幅DNAフラグメントをGeneclean Kits（Bio 101 Inc.) で精製し、HindIII／XbaIで消化し、そしてCMVプロモーターの制御下、pRc/CMV 発現ベクター(Invitrogen)へクローン化した。得られた構築物をDNA配列決定に より確認した。 これらの構築物は、認識ドメインを有さない発現されるトキシンフラグメント が、それらが細胞内で発現されない限り、周辺の細胞に対して非毒性であること を確実にした。ベクターから発現されるトキシンフラグメントを検出するために 、最初に、プラスミドpCMV-PEAIIIまたはpCMV-PEAIbIII(図９を参照のこと)を、 T7プロモーターの制御下で遺伝子の転写のためにT7 DNAポリメラーゼを誘導的に 発現するBL21(DE3)発現細菌宿主(Novagen)へ形質転換した。誘導の後、ADP-リボ シル化活性が形質転換細菌から検出された(示さず)。トキシン発現因子をリポフ ェクチンを使用して[Chen,S.-Y.ら、J.Viol．65:5902-5909(1991)]、哺乳動物細 胞(COS-1およびHeLa)へトランスフェクトした場合、トキシンフラグメントが産 生され、そしてトランスフェクトされた細胞に対する細胞傷害性が観察された( 示さず)。pCMV-PEIIIよりも高いレベルのADPリボシル化活性を示したpCMV-PEIbI IIベクターをさらなる実験に使用した。 Fab105-プロタミンがトキシン発現因子を標的細胞に移すための遺伝子キャリ アとして機能し得るかどうかを研究するために、精製Fab105-プロタミン融合タ ンパク質を、pCMV-PEAIbIIIプラスミドDNAとともに２：１の比(力価により決定 される)で、0.2N NaCl溶液中でインキュベートし、融合タンパク質-DNA複合体を 形成した(図10〜12を参照のこと)。gp120に対する抗体を用いた免疫蛍光染色に より、95%以上ポジティブを示したHIV-1感染Jurkatリンパ球を標的細胞として使 用した。標的細胞を、Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体と、単独のト キシン発現因子、または単独のFab105プロタミンタンパク質とともにインキュベ ートした。コントロールとして、正常なリンパ球もまたこれらの分子とともにイ ンキュベートした。48時間のインキュベーション後、培養細胞の細胞生存率(図1 0)、タンパク質合成(図11)、およびADPリボシル化活性(図12)を試験した。 Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体のHIV感染細胞に対する選択的細 胞傷害性を図10〜12に示す。 Jurkat細胞をHIV-1ウイルス感染させ、感染後10日目に、細胞の表面gp120発現 を免疫蛍光染色により試験した。95%のgp120ポジティブ(0.5×106)を有する細胞 を、DNA-融合タンパク質複合体、または単独の融合タンパク質、または単独のDN Aとともに37℃で48時間インキュベートした。 図10は、Trypan Blue染色により試験された培養物中の細胞生存率を示す。 生存細胞のパーセンテージを二回平行測定から算出した。 図11は、タンパク質阻害アッセイを示す。細胞(0.5×106)をロイシンを含まな い培地に置き換え(Allured,V.S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 83:1320(1986)； Pastan,I.ら、Cell 47:641(1986)；Siegall,C.B.ら、J.Biol.Chem．264:14256(1 989)を参照のこと、そして４μci 3H-ロイシンとともに添加した(４時間）。細 胞を3,000rpmで５分間遠心分離し、そしてシンチレーションカウントのために溶 解した。 図12は、培養細胞のADPリボシル化活性の検出を示す[Collier,R.J.ら、J.Biol .Chem.246:1496(1971)]。細胞(１×106)を遠心分離によりペレット化し、そして 4M 尿素溶液に溶解した。次いで、溶解物の上清をADPリボシル化アッセイに供し 、そしてPEAタンパク質(Gibco-BRL)をポジティブコントロールとして使用した。 サンプルの平均シンチレーションカウントを、２回平行測定からの算出として示 す。 図10〜12においてレーンａ：Fab-プロタミン-トキシン発現因子複合体(10μg Fab105-プロタミン／５μg発現因子DNA、10：５μg)とともにインキュベートし た正常なJurkat細胞；レーンｂ〜ｅ：単独のFab-プロタミンとともにインキュベ ートしたHIV感染Jurkat細胞(ｂ)；単独のトキシン発現因子DNAとともにインキュ ベートしたHIV感染Jurkat細胞(ｃ)；Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合 体(10：５μg)とともにインキュベートしたHIV感染Jurkat細胞(ｄ)；Fab105-プ ロタミン-トキシン発現因子複合体(５：2.5μg)とともにインキュベートしたHIV 感染Jurkat細胞(ｅ)；レーンｆ：1.0ngの尿素変性PEAコントロールのADPリボシ ル化活性。 図10〜12に示すように、Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体とともに 48時間インキュベーションした後、HIV-1感染細胞は、細胞生存率(＜1.5%)およ びタンパク質合成能力(＜0.2%)が顕著に減少した；一方、トキシン発現因子また は単独のFab105-プロタミンとともにインキュベートした細胞は、細胞生存率お よびタンパク質合成能力がわずかに減少したのみであった。さらに、非感染のリ ンパ球は、Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体とともにインキュベーシ ョンした後に、細胞生存率およびタンパク質合成能力の顕著な減少を示さなかっ た。HIV感染細胞に対する観察された選択的細胞傷害性は、発現されるトキシン フラグメントに由来するADPリボシル化活性の結果であるべきである。なぜなら 、1.0ngのPEAタンパク質にほぼ等しいADPリボシル化活性が、複合体とともにイ ンキュベートしたHIV感染細胞(１×106)の溶解物から検出されたからである。従 って、Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体は、組織培養物において、HI V-1感染細胞を選択的に傷害した。 ヒト癌および他の疾患の処置における有効な因子としてのイムノトキシンの主 要な傷害は、異種の抗体および異種のトキシンに応答する宿主抗体である。[Bye rs,V.S.ら、Immunol．65:329(1988)；Durrant,L.G.ら、Clin.Exp.Immunol.75:25 8(1989)；Pai,L.H.ら、J.Clin.Oncol．9:2095-2103(1991)]。ヒト化マウスまた はヒト抗体の使用は、標的部分の問題を解決し得る[Rybak,S.M.ら、Proc.Natl.A cad.Sci．USA 89:3165-3169(1992)]、しかし高い免疫原性トキシン部分について は問題は以前として残されたままである。本研究において、本発明者らは、抗gp 120 Fab105-プロタミン融合タンパク質が、レセプター仲介エンドサイトー シスによりトキシン-発現因子プラスミドDNAを、HIV-1感染細胞へ送達するため の遺伝子キャリアとして作用し得、標的細胞の選択的殺傷が生じることを示す。 トキシン分子の顕著な効力は、レセプター介在遺伝子送達の低い有効性を補い[W u,G.Y.ら、J.Biol.Chem．262:4429-4432(1987)；Wagner,E.ら、PNAS USA 89:609 9-6103(1992)]、効果的に治療学的目標を達成する。抗体分子またはリガンド(標 的部分)および二機能の融合タンパク質のDNA結合部分がヒト起源であり得、そし てトキシン発現因子DNAは、免疫原性が非常に弱いかまたは非免疫原性であるた め、全体のタンパク質-トキシン発現因子複合体は弱い免疫原性である。それゆ え、これらの複合体は、顕著な抗体応答の発達を有さないで患者に繰り返し投与 され得るべきである。さらに、遺伝子キャリアとしての二機能性の組換え融合タ ンパク質もまた、化学的に連結された融合タンパク質にわたって、効率的な産生 、およびより良好と思われる結合活性のような利点を有する[Wu,G.Y.ら、J.Biol .Chem．262:4429-4432(1987)；Wagner,E.ら、PNAS USA 89:6099-6103(1992)]。 要約すると、本明細書中で「ステルスイムノトキシン(stealth immunotoxin)」と 呼ばれるイムノトキシンのこの遺伝子治療形態は、癌、および他の疾患の処置の ために現在記載されているイムノトキシンよりも、顕著な利点を有する。さらに 、抗gp120 Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体は、HIV-1感染細胞に対 して選択的毒性を有し、これはまたAIDS処置のための新規な治療剤を表す。 本明細書において記載される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用 される。 先述の開示の利益を与えられた当業者が、本発明の概念から逸脱することなく 多くのその他の使用およびその改変をなし得、ならびに本明細書において記載さ れる特定の実施態様からの変更を成し得ることは明白であり、そして本発明は添 付の請求の範囲および精神によってのみ限定されるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 チェン， シ−イ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02146， ブルックリン，レアー， セン ト ポール ストリート 229

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．核酸送達システムであって、 (1)標的細胞上の部位に特異的に結合する標的部分と、 (2)核酸セグメントに結合する結合部分と、 を含む融合タンパク質、および 目的の核酸配列を含む該核酸セグメント を含む、核酸送達システム。 ２．前記標的部分が抗体である、請求項１に記載の核酸送達システム。 ３．前記抗体がウイルスエンベロープタンパク質、細胞レセプター、または活性 型レセプターの細胞外ドメインに対する抗体である、請求項２に記載の核酸送達 システム。 ４．前記抗体が単鎖抗体、抗体のFab部分、または(Fab')2セグメントである、請 求項２に記載の核酸送達システム。 ５．前記結合部分がタンパク質またはタンパク質の核酸結合ドメインであり、そ して該結合部分が前記標的部分のカルボキシ部分に融合されている、請求項１に 記載の核酸送達システム。 ６．前記結合部分が、GCN4、Fos、Jun、TFIIS、FMRI、酵母タンパク質HX、ビギ リン、Mer1、細菌ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、リボソームタンパク質S3、 および熱ショックタンパク質からなる群より選択されたタンパク質に存在する核 酸結合ドメインの群から選択される、タンパク質の核酸ドメインである、請求項 ５に記載の核酸送達システム。 ７．前記結合部分がタンパク質プロタミンである、請求項５に記載の核酸送達シ ステム。 ８．前記目的の核酸配列が、抗体、優性ネガティブ変異体、アンチセンスRNA、 リボザイム、または細胞傷害性因子をコードする、請求項１に記載の核酸送達シ ステム。 ９．前記核酸セグメントが、前記目的の核酸配列中に、隣接する５’および３’ 末端反復配列(LTR)領域または逆位末端反復(ITR)領域、所望の遺伝子に作動可能 に連結したプロモーターを含む、請求項１に記載の核酸送達システム。 １０．融合タンパク質と核酸セグメントとを含む核酸送達システムであって、こ こで、該融合タンパク質の一部が細胞上の所望の部位に選択的に結合する抗体を 含み、そして該融合タンパク質の他の部分が該核酸セグメントに結合し得るプロ タミンタンパク質を含む、核酸送達システム。 １１．前記核酸セグメントがサイトトキシン遺伝子または細胞傷害性タンパク質 をコードするそのフラグメントに対応するDNA配列である、請求項１０に記載の 核酸送達システム。 １２．前記核酸セグメントが少なくともシュードモナスエキソトキシンＡのドメ インIIIをコードする、請求項１１に記載の核酸送達システム。 １３．標的細胞を形質転換する方法であって、該方法が、有効量の請求項１に記 載の核酸送達システムを標的細胞を含む培地に添加する工程、および該核酸送達 システムの核酸配列が該細胞を形質転換するまで待つ工程を含む、方法。 １４．核酸送達システムを調製する方法であって、該方法が、細胞を、作動可能 にプロモーターに連結された請求項１に記載の融合タンパク質をコードするDNA セグメントを含むベクターで形質転換する工程、該細胞をインキュベートする工 程、そして発現された該融合タンパク質を収集する工程を含む、方法。 １５．核酸送達システムを使用する方法であって、該方法が、有効量の請求項１ に記載の核酸送達システムを標的細胞を含有する血清に投与する工程、そして該 核酸送達システムが該標的細胞と接触するまで待つ工程を含む、方法。 １６．核酸送達システムを使用する方法であって、該方法が、有効量の請求項１ ０に記載の核酸送達システムを標的細胞を含有する血清に投与する工程、そして 該核酸送達システムが該標的細胞と接触するまで待つ工程を含む、方法。
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