JPH10501681A

JPH10501681A - 核酸送達システムならびにその合成および使用方法

Info

Publication number: JPH10501681A
Application number: JP7521981A
Authority: JP
Inventors: ウェインエイ．マラスコ，; シ−イチェン，
Original assignee: ダナ−ファーバーキャンサーインスティチュート
Priority date: 1994-02-22
Filing date: 1995-02-21
Publication date: 1998-02-17
Also published as: AU1925195A; MX9603532A; US20040023902A1; WO1995022618A1; CA2183667A1; EP0745134A1; US7186697B2

Abstract

(57)【要約】核酸送達システムが記載される。この送達システムは、標的部分と核酸結合部分とを有する融合タンパク質、および融合タンパク質の核酸融合部分に結合された核酸配列を含む。標的部分は、抗体またはリガンドであり得る。細胞において所望の核酸配列を一時的にまたは安定に発現させるためのこの核酸送達システムの使用が開示されている。細胞を標的とし、そして所望の産物を送達するための送達システムの使用も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】核酸送達システムならびにその合成および使用方法近年、新しい治療形態である遺伝子治療が、嚢胞性線維症(CF)[Rosenfeld，M. A.ら，Cell 68: 143-155(1992);Rosenfeld，M.A.ら，Science 252:431-434(1991 )，Ferkol，Tら.,J.Clin.Invest．92: 2394-2400(1993)]、網膜芽腫のような腫瘍、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)のようなウイルスの感染により引き起こされる疾患（例えば、HIV-1感染）[Baltimore,D.，Nature 335，395-396(1988)]などを含む種々の疾病を処置するために提案されている。この治療形態では、細胞でその遺伝子が発現されるように、遺伝子が細胞に導入される。遺伝子は、ポジティブに細胞を増強し得る。例えば、消失タンパク質を供給し、免疫系を刺激する。または、この遺伝子はネガティブな様式で作用し得る。例えば、ウイルスのインヒビターを発現し、これによりHIV-1のようなウイルスの複製およびその結果の感染を阻害させ得る。アンチセンスRNA、リボザイム、および優性ネガティブ変異体(dominant-negative mutant)を含むいくつかのアプローチは、細胞レベルでのHIV-1感染を阻害し得ることが示されている[Hasseloff，J.ら，Nature 334: 5 85-591(1988); Von der Krol，A.R.ら，BioTechniques 6:958-976(1988); Malim ,M.H.ら，Cell 58:205-214(1989); Trono,D.ら，Cell 59:113-120(1989); Sulle nger,B.ら，Cell 63: 601-608(1990); Green,G.ら，Cell 58: 215-223(1989); B uonocore,L.ら，Nature 345: 625-628(1990)]。ヒト抗体（例えば、抗gp-120単鎖抗体）の細胞内送達および発現は、ウイルスの複製などを阻害し得る。例えば、抗gp120抗体は、HIV-1 エンベロープ糖タンパク質の成熟および機能を阻害する[Marasco，W.A.ら、1993年７月に出願されたPCT出願第PCT/US93/06735号]。しかし、これらの進歩にも関わらず、これらのストラテジーのいずれかを使用する悪性、疾患などを処置および防止するための遺伝子治療プロトコルの開発における主な障害は、所望の遺伝子を所望の標的細胞に効果的に導入するのに比較的効率の悪い手段であることである。マウスのレトロウイルスベクターが細胞に遺伝子を導入するために広範に使用されているにも関わらず、これらのベクターは無差別に多くの細胞型に感染し、そして所望の標的細胞に感染するのは限られている。さらに、レトロウイルスベクターは、潜在的に有害なウイルスDNAを治療的遺伝子と共に含んでいる。従って、これらのベクターは、例えば、AIDSのヒト遺伝子治療のための効率的な導入システムとして最適であり得ない[Miller，A .D.，Nature 357:455-460(1992); Eglitis，M.A.ら，Science 230: 395-1398(19 85); Dizerzak，E.A.ら，Nature 331: 35-41(1988)]。HIV感染細胞への特異的送達の問題を解決するために、遺伝子をHIV感受性細胞に特異的に導入し得る欠損H IVベクターが開発されている。[Poznansky，M.ら，J.Virol．65: 532-536(1991) ; Shimada，T.ら，J.Clin.Invest．88: 1043-1047(1991)]。しかし、このアプローチは全てのウイルスおよび悪性について実用的であり得るわけではない。さらに、低いとはいえ、欠損ベクターの組換えによる救済の理論的潜在性は、このベクターの使用を妨げ得る。組換え遺伝子の細胞への送達および発現はまた、リポソーム、リポフェクチン、およびリン酸カルシウム沈澱法を使用することによりインビトロまたはインビボのいずれかで達成される[Nicolau，C.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80: 1068- 1072(1983); Brigham，K.L.ら，Am.J.Med.Sci．298: 278-281(1989); Nabel，E. G.ら，Science 249: 1285-1288(1990); Benvenisty，N.ら，Proc.Natl.Acad.Sci .USA 83: 9551-9555（1986）Chen,S.-Y.ら，J.Virol．65: 5902-5909(1991)]。これらの方法は、遺伝子治療に関してレトロウイルスシステムよりもいくつかの利点を有する。適切なプロモーター因子を含むプラスミドDNA構築物は、レトロウイルスベクターよりも技術的により容易であり、かつ調製および試験するためにより時間を必要としない。プラスミドDNAは、感染性のレトロウイルスのDNAよりも大量調製により適している。プラスミドDNAはまた、レトロウイルスに基づくシステムで可能なサイズより大きなサイズのDNAセグメントの送達を可能にし得る。さらに別の利点は、プラスミドDNAがレトロウイルスベクターの有害な副作用（例えば、少ない割合の患者におけるウイルスの感染または癌）を排除し得ることである。しかし、これらの方法を使用してインビボで遺伝子を送達する可能性は、細胞特異性および効率を欠くことにより制限される。細胞特異的遺伝子導入の問題を克服する試みにおいて、WuおよびWu，J.Biol.C hem．262: 4429-4432(1987)は、化学的結合レセプター仲介遺伝子導入システムを提案した。このシステムは、レセプター仲介エンドサイトーシスを使用してDN A分子またはRNA分子を標的肝細胞また標的初代造血細胞に運ぶ。このシステムのストラテジーは、このような細胞がユニークなアシアロ糖タンパク質(asialglyc oprotein)レセプターを細胞表面に有するという事実に基づく。このレセプターはそのリガンドであるアシアロ糖タンパク質を結合し、そして取り込む。このタンパク質（リガンド）は、好ましくはポリL-リジンと結合しており、ポリL-リジンはDNAまたはRNAと結合して強力な静電相互作用により可溶性の複合体を形成し得る。このシステムは、細胞レベルで、ならびに動物研究において、遺伝子を標的肝細胞または標的初代造血細胞に導入すると報告されている[Wu，G.Y.ら，J.B io.Chem．263: 14621-14624(1988); Zenke,M.ら，Proc.Natl.Acad.Sci．87: 365 5-3659(1990); Wu，G.Y.ら，J.Biol.Chem．266: 14338-14342(1991); Curiel，D .T.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 8850-8854(1991); Wagner，E.ら，Proc.Na tl.Acad.Sci.USA 87: 3410-3414(1990); Curiel，D.T.ら，Human Gene Therapy 2:230-238(1992)]。しかし、この方法の全体としての効率は、比較的低いと報告されている。なぜなら、エンドサイトーシスは比較的効率が悪く、DNAはしばしばエンドソーム区画から出てしまい、そして最終的にはリソソーム内で分解される。従って、複数回の投与が必要であり、そしてこのシステムの抗原性が問題となり得る。さらに、この送達システムの合成は比較的時間がかかる。最初にポリ L-リジンをアシアロ糖タンパク質に結合させ、次いで続いて、リガンド−ポリリジン複合体を外因性DNAに結合させる。さらに、その代表的な適用においては、細胞に導入された外因性DNAは、安定的に染色体に取り込まれた様式では与えられない。従って、発現は一時的である。よって、反復投与がこの理由によっても必要である。しかし、述べたように、人工部分としてのポリリジン部分が抗原反応を引き起こし得、このシステムの反復利用の能力が制限される。提案されている別の治療形態は、既に発現されているタンパク質を標的細胞に送達することである。通常の癌治療の１形態においては、細胞変性因子または細胞傷害性因子を悪性細胞に、その細胞を殺傷するために導入する。しかし、健康な組織および細胞への損傷を最少にするように注意しなければならない。従って、ストラテジーは病的な細胞を特異的に標的とするように開発されている。イムノトキシンの使用は、このような治療の１方法である。イムノトキシンは、細胞傷害性因子の１クラスであり、モノクローナル抗体またはリガンドに結合しているトキシンタンパク質からなり、このタンパク質は、細胞表面の標的に特異的に結合する[Vitetta，E.S.ら，Science 238: 1098(1987); Pastan，I.，Cell 47: 641(1986); Pastan，I.ら，Science 254: 1173(1992)]。細胞への推定特異性および効率の潜在性により、この治療は癌および種々の疾患に対する治療に重要な役割を果たすと推定された。しかし、実際にはこのことはまだ分かっていない。むしろ、トキシンは抗原性の高いタンパク質である。これらのトキシンに対する中和抗体は、代表的には最初の曝露後２週間以内に誘起され、ほんの１回または２回の治療期間後にその有効性が激しく制限される。従って、免疫反応を抑制する免疫抑制剤の使用のようなストラテジーが提案されている。しかし、これは達成することが困難であるばかりでなく、治療の最終的な成果に有益ではあり得ない。なぜなら、その後、免疫系がその機能（例えば、感染、他の腫瘍細胞、および病原と戦う）を果たすことができないからである。従って、他の核酸送達システム（例えば、WuおよびWuの送達システム）よりも簡単に組み立てられ得る核酸送達因子を有することが望ましい。そのような送達システムが、化学結合プロセスで可能であるよりも容易に合成され得るならば、これもまた望ましい。核酸送達システムが、種々の標的細胞を特異的に標的とするための使用により容易に適合され得るならば、これもまた望ましい。送達システムが、多くの現在利用可能な送達システムよりも低い抗原性を有するならば、これもまた望ましい。例えば、そのような送達システムが、細胞傷害性因子（例えば、イムノトキシン）を、現在このようなシステムに付随する抗原性を有さずに細胞に送達するために使用され得るならば望ましい。このシステムが、ウイルスの送達システムで生じ得るような細胞の悪性の形質転換により、自身で疾患を引き起こす可能性を有さないならば、これもまた有益である。発明の要旨本発明者らは、現在、所望の標的細胞への効率の高い核酸送達システムを開発中である。このシステムは、例えば、トキシンタンパク質の必須部分をコードする遺伝子を送達するために使用され得る。核酸（DNAまたはRNAのいずれか）が融合タンパク質に結合される。融合タンパク質は、標的部分および核酸結合部分（例えば、DNA結合部分）からなる。例えば、標的部分は、好ましくは抗体、より好ましくは単鎖抗体、抗体のFab部分、または(Fab')₂セグメントであり得る。標的動物がヒトである場合、DNA結合部分は好ましくはヒトDNA結合部分（例えば、プロタミン）であるべきである。図面の簡単な説明図１は、本発明に従った核酸送達システムの使用の１実施態様の模式図である。図２は、融合タンパク質の発現ベクターの１実施態様の模式図である。それは、二シストロン性哺乳動物発現ベクターの模式図である。このベクターは、プロタミンタンパク質に融合させたHIV gp120タンパク質に対する抗体をコードする。図３は、発現したFab105−プロタミン融合タンパク質の放射性標識および免疫沈降を示すオートラジオグラフである。図４は、組換え融合タンパク質の精製およびSDS-PAGE分析を示す。図５は、精製融合タンパク質のHIV gp120に対する結合活性を示す。図６は、種々の濃度におけるFab105−プロタミン融合タンパク質のDNA結合活性を示すオートラジオグラフである。図７は、種々の濃度におけるFab105−プロタミン融合タンパク質のDNA結合活性を示すオートラジオグラフである。図８は、非感染細胞中およびHIV感染細胞中の両方における、Fab105複合体の結合能と比較したFab105-プロタミンDNA複合体のHIV gp120タンパク質に対する結合能を示すFACS分析である。図９は、PEAコード遺伝子およびこの遺伝子の部分的ドメインを含むように作られた２つのベクターを模式的に示すPEA触媒フラグメントの発現ベクターの模式図である。図10は、本発明の核酸送達システムの１つ、HIV感染細胞に対するFab105−プロタミン−トキシン発現因子の選択的細胞傷害性を示すグラフであり、そして細胞生存率を示す。図11は、HIV感染細胞に対するFab105−プロタミン−トキシン発現因子複合体の選択的細胞傷害性を示すグラフであり、そしてタンパク質阻害アッセイを示す。図12は、ADP-リボシル化活性により測定したFab105−プロタミン−トキシン発現因子複合体の選択的細胞傷害性を示す。発明の詳細な説明本発明者らは、本明細書中において新規の核酸送達システムを開示する。本システムは、所望の核酸配列を結合する融合タンパク質を含む。融合タンパク質は、標的部分および結合部分を含む。標的部分は、好ましくは標的細胞上の部位に特異的に結合するタンパク質である。例えば、これはリガンド特異的レセプター（例えば、線維芽細胞成長因子レセプター(FGF-R)）と、このレセプターに対する特異的FGF（例えば、塩基性FGF-Rに対する塩基性FGF）とに対するリガンドであり得る。あるいは、このタンパク質は、標的細胞に特異的な抗体であり得る。例えば、これはHIVエンベロープタンパク質に対する抗体、活性型レセプターの細胞外リガンド結合ドメインのような癌遺伝子決定因子（例えば、erbB、kit、fms、neu、ErbB2）に対する抗体などであり得る。これはまた、レセプターに対する抗体（例えば、GM-CSFレセプターに対する抗体）でもあり得る。好ましくは、標的部分は抗体である。さらにより好ましくは、この抗体は、抗体の結合配列を含有する単鎖抗体、(Fab')₂セグメント、または抗体のFabフラグメントである。さらに好ましくは、抗体は単鎖抗体または(Fab')₂セグメントである。選択される特定の標的部分は、本開示内容に基づいて実験的に決定され得、標的細胞に依存する。例えば、体細胞治療に関して、またはインビボにおける血管内標的のような容易にアクセス可能な細胞または組織に関して、標的部分の重要な特質は、親和性および選択性である。このような場合、標的部分としての単鎖抗体の使用が好ましい。しかし、標的細胞が容易にアクセス可能でない場合、例えば、細胞が大きな固形腫瘍塊の一部であり、血液の供給が乏しく、そして高間質圧を伴う場合、血清中半減期について考慮することはきわめて重要である。このような場合、完全な抗体および(Fab')₂セグメントが代表的に好ましい。好適な実施態様においては、結合部分が、IgG₁のような無傷な（intact）免疫グロブリンのカルボキシ末端に結合するように融合タンパク質を合成し得る。抗原反応を制限するために、細胞が標的とされる宿主動物を考慮して標的部分が好適に選択される。それゆえ、標的動物がマウスである場合は、好ましくはマウス抗体を使用するのに対し、標的動物がヒトである場合は、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体を使用する。融合タンパク質の第２の部分は、核酸結合部分（DNAまたはRNA結合部分のいずれか）からなる。好ましくは、DNAまたはRNAのいずれかを結合し得る部分を使用する。この結合部分は、DNAまたはRNAのいずれかを結合する標的動物由来の任意のタンパク質であり得る。例えば、これは、小さな塩基性DNA結合タンパク質であるプロタミンであり得、これは、動物のゲノムDNAを精子頭部の制限された容積内にパッケージングするために濃縮するのに役立つ[Warrant，R.W.ら、Nature 271:130-135(1978); Krawetz，S.A.ら、Genomics 5:639-645(1989)]。プロタミンの正電荷は、DNAのような核酸のリン酸塩のバックボーンの負電荷と強く相互反応し得、中性かつ安定なDNA-プロタミン複合体を生じる。この核酸は、目的によりDNAまたはRNAのいずれかであり得る。例えば、導入しようとする核酸は、細胞内での抗体、優性ネガティブ変異、アンチセンスRNA、リボザイム、または細胞傷害性因子を発現するために用いられ得る。例えば、細胞傷害性因子は、リシン、シュードモナスエキソトキシンＡ（PEA）の触媒フラグメントなどのようなきわめて強力な細菌性または植物性トキシンの一部であり得る。核酸は、細胞の一時的なまたは安定なトランスフェクションに使用され得る。例えば、核酸がトキシンをコードするDNAセグメントのような、細胞に対して致死的である因子をコードする場合は、一時的な発現で十分である。対照的に、核酸が抑制遺伝子（例えば、網膜芽腫）のような因子、または十分なレベルで発現されないタンパク質（例えば、アデノシンデアミナーゼ（ADA）［Belmont，J.W. ら、Mol．& Cell．Biol．8:5116-5125(1988); Palmer，T.D.ら、Proc．Natl．A cad．Sci USA: 1055-1059(1987)]、ウリジン二リン酸（UDP）-グルクロニルトランスフェラーゼ[Ponder K P.ら、Proc．Natl．Acad．Sci USA 88:1217-1221(199 1)]、またはインスリン）を発現する場合、細胞染色体への安定な組込みが所望され得る。安定な組込が所望されるこれらの場合において、核酸はDNAセグメントであり得、ここで所望の因子をコードする遺伝子は、細胞への組込みを促進するカセットへ挿入される。例えば、遺伝子を囲む組込みカセットは、レトロウイルス（すなわち、MMLV）の5'および3'LTR（末端反復配列）、ITR（逆位末端反復単位、すなわち、アデノ関連ウイルス）などであり得る。[例えば、Scherdin，U .ら、J．Virol．64:907-912(1990)；Stief，Aら、Nature 341:343-345(1989)；P hi-Van，L.ら、Mol．& Cell．Biol．10:2302-2307(1990)；Phi-Van，L.ら、The EMBO Journal 7:655-664(1988)を参照のこと]。このカセットは、標準的な技術により調製され得る。例えば、目的の遺伝子がLTR間またはITR間に挿入され得る場合の哺乳動物の発現ベクター。両末端で隣接するLTR領域またはITR領域、プロモーター/エンハンサー（好ましくは、間に挿入しようとする目的の遺伝子に対するポリリンカーを伴う）、さらに所望であれば、公知の技術を用いる本開示内容に基づく選択マーカーを含有するカセットを構築し得る。所望の核酸（例えば、目的の１つのまたは複数の遺伝子）を伴うこのカセットは、核酸セグメントである。標的部分は、標的細胞に対して、特異的に送達システムをもたらす。また、位置決定（localization）配列を用いて、目的の細胞部位へ、放出されたRNAまたはDNAを細胞内送達し得る。その後、標的細胞は、送達システムを取り込み得、このシステムは細胞に結合される。代表的に、この送達システムは、細胞上の特異的なレセプターに結合する。例えば、レセプターおよび抗原を含む細胞表面上の膜タンパク質は、レセプターに対するリガンドまたは抗体との相互作用後、レセプター仲介エンドサイトーシスにより、取り込まれ得る。[Dautry-Varsat，A.ら、Sci．Am．250:52-58(198 4)]。このエンドサイトーシスのプロセスは、本送達システムによって開発される。このプロセスは、取り込まれようとするときにDNAまたはRNAを損傷し得るため、発現させようとする核酸に対する強力なプロモーターを含有することが好ましい。同様に、目的の遺伝子の多数の反復を含有するセグメントを使用することが望ましい。また、エンドソームおよびリソソームを破壊する配列または部分も含有し得る。例えば、Cristiano，R.J.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:115 48-11552(1993)；Wagner，E.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6099-6103(19 92)；Cotten，M.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6094-6098(1992)。どのタイプの核酸セグメントを使用するかを決定する場合、当業者は、本明細書の見地から、発現されるタンパク質を考慮する。例えば、トキシンタンパク質を誘導する場合、その顕著な細胞傷害性のため、細胞を殺傷するためには、ほんのわずかの分子の発現しか必要としない。ADAの発現を伴うような他の場合では、より多量のタンパク質の発現が必要であり、そしてDNAカセットの一部としてのLTR、ITRの使用および/または複製-欠損アデノウイルスのようなリソソーム破壊因子の使用が用いられ得る。標的部分に対して選択される特定のタンパク質は、標的細胞に依存する。例えば、HIV感染細胞のような感染細胞を標的とする場合、HIV感染細胞を特異的に標的とするモノクローナル抗体を使用し得る。これは、エンベロープ糖タンパク質に対する抗体を含有する。15e、21h［Thali，M.ら、J．Virol．67:3978-3988(19 93)]、F105、176、および48dのようなHIV-1 gp120またはHIV-2 gp120に対する多くの既知の抗体のいずれかを使用し得る。核酸配列（例えば、抗体、デコイ配列などの細胞内発現に対する遺伝子）を予防的に送達することを所望する場合、このような細胞上に存在するレセプター（例えば、HIV感受性細胞に対するCD4レセプター）を標的とすることによって、高い感受性の細胞を標的とし得る。このような状況下では、タンパク質は、レセプターに優先的に結合するリガンド（例えば、CD4）であり得、そしてCD4レセプターに対する抗体のような、レセプターに対する抗体も同様に用いられる。標的部分を選択するためのストラテジーは、きわめて適応可能である。例えば、特定の腫瘍は、大量の特定の細胞表面レセプター（例えば、乳癌を伴うneu）、または特定のタンパク質の異常形態を有する細胞に頻繁に結合する。他の目的のレセプターとしては、インターロイキンおよびインターフェロンのようなリンホカインに対するレセプター（例えば、インターロイキン-２（IL-2 ）レセプター（IL-2R））が挙げられる。p55、IL-2Rα鎖はTacタンパク質とも呼ばれ、Agまたはマイトジェン活性化Ｔ細胞と結合するが、残りのＴ細胞には結合しない。これは、成人Ｔ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、およびホジキン病のようなリンパ腫（lymphoid cancer）の悪性細胞上で高レベルで発現される。抗T ac抗体はこのタンパク質に結合する。このような抗体のヒト化バージョンは公知であり、そしてQueen，C.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA:10029-10039(1989) ；Hakimi，J.ら、J．of Immun．151:1075-1085(1993)(Mikβ1（IL-2Rβ鎖に対するMab)；Kreitman，R.J.ら、J．of Immun．149:2810-2815(1992)；Hakimi，J.ら、J．of Immun．147:1352-1359(1991)に記載されている。これらの種々のタンパク質に対する抗体は公知であり、そして入手可能である。これらの抗体は、本明細書中に記載の一般的な手順に従い、そして所望の結合部位をコードする遺伝子を例示された遺伝子の代わりに用いることによって、このシステムにおける使用に容易に適合され得る。例えば、標的細胞がHIV感染細胞である場合、標的部分はHIVエンベロープ糖タンパク質を標的とし得る。このタンパク質に対する多くの抗体が使用され得る。例えば、F105抗体に基づく組換え抗体が公知の教示技術によって作製される。[Posner，M.R.ら、J．Immunol．1 46:4325-4332(1991)；Thali，M.ら、J．Virol．65:6188-6193(1991)；Marasco， W.A.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:7889-7893(1993)]。作製され得る他の抗体としては、15e、21h、17b、48dなどが挙げられる。抗体の発現用ベクターは、本明細書に記載のように作製され得る。例えば、抗体のFd部分（V_HおよびC_H）および例えば、F105抗体の軽鎖（例えば、κ鎖）の結合領域を発現する二シストロン性哺乳動物発現ベクターは、終止コドンを伴わないFdフラグメントを用い、そしてこのセグメントを標準的な技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR））により増幅することによって、構築され得る。上流プライマーは、好ましくは、動物の免疫グロブリンのリーダー配列に対応し、この動物由来の送達因子の細胞が使用されるべきであり（例えば、標的細胞は、アミノ酸１〜６のヒト免疫グロブリンを伴うヒト細胞である）、HindIII部位のような付加的な好都合なクローニング部位を伴う。下流プライマーは、重鎖定常領域のカルボキシ末端近くのアミノ酸に対応し得る。例えば、F105抗体に基づく抗体に関して、XbaI部位のような好都合なクローニング部位が挿入されたヒト重鎖 CHIドメインのアミノ酸226〜233。PCR反応は、標準的な手段に従って実施される。この手段により、融合タンパク質の標的部分をコードする遺伝子または遺伝子セグメントが調製される。上記のように、融合タンパク質の第２の部分は結合部分である。好ましくは、標的部分および結合部分の両方を発現する遺伝子セグメントを含有する単一のベクターを使用する。しかし、ベクター系を用いて、少なくとも２つのベクターで細胞を同時トランスフェクトし、そして融合タンパク質を発現する細胞を選択し得る。好ましくは、単一のベクターを使用する。好ましくは、標準的な手段によって、結合部分をコードする遺伝子または遺伝子セグメントに対する標的部分をコードする配列を結合する。例えば、ヒトプロタミンに対する遺伝子[Balhorn， J．of Cell．Biol．93:298-305(1982)]。他の核酸結合タンパク質は、GCN4、Fos 、およびJun（これらは、いくつかの塩基性残基、およびロイシンの７群反復（h eptad repeat）を含有する約30残基の隣接領域（２量体形成を仲介する「ロイシンジッパー」）からなる共通の構造モチーフを介しDNAに結合する）［Talanian ，R．V.ら、Science 249:769-771(1990)]；TFIIS核酸結合ドメイン（C末端残基2 31-280に見られる）[Qlan，X.ら、Nature 365:277-279(1993)]；リボ核タンパク質（RNP）ファミリー（ヒトFMRIのドメイン中に存在する）、酵母タンパク質HX 、ニワトリ遺伝子ビギリン（vigillin）の14個のドメイン、mer1、酵母タンパク質、細菌ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、およびリボソームタンパク質S3[Ash ley，C.T.ら、Science 262:563-566]；および熱ショックタンパク質の結合モチーフ[Rabindran，S.K.ら、Science 259:230-234(1993)]を包含する。標的細胞の宿主動物は、結合モチーフを有するどのタンパク質またはタンパク質フラグメントが用いられるかを決定するために使用される。例えば、ヒト宿主に関して、そしてヒトプロタミンの発現のために、既知のプラスミドpTZ 19R-HP1を使用し得る[Krawetz，S.A.ら、Genomics 5:639-645(1989)]。好ましくは、発現ベクターが、原核系および真核系において融合タンパク質の発現に使用され得るように、この遺伝子中のイントロンを欠失させる。PCR増幅は、標準的な手段により、実施される。例えば、アミノ末端からの配列に対応する上流プライマー（例えば、XbaIクローニング部位のような好都合な制限部位を伴うプロタミンタンパク質のアミノ酸１〜６に対応）、および第１エキソンのカルボキシ部分に対応する下流プライマー（例えば、第２エキソンの末端の5'アミノ酸（例えば第２エキソンのアミノ酸38〜40）に相補的な付加配列を伴うアミノ酸29〜37）を用いる。次に、アミノ末端に対応する上流プライマーと、カルボキシ末端の重複部分に対応する下流プライマーとを用いて、第２のPCR反応を実施し得る。例えば、第２エキソン中の41位〜終止コドンまでのアミノ酸の配列およびNotIのような付加的な好都合なクローニング部位を伴うアミノ酸31〜40に対応する配列を用いる。第１のPCR増幅されたDNAセグメントは、テンプレートとして使用し得る。好都合な制限部位を用いることによって、標準的な技術（例えば、アガロースゲル）を用いて精製するような公知の方法により、標的部分および結合部分を切断し得る。例えば、上記の例において、終止コドンを伴わないF105のPCR増幅されたFdは、H indIII/XbaIで切断され、そしてアガロースゲルにより精製され得る。PCR増幅されたプロタミンをコードする遺伝子は、イントロンを有さず、XbaI/NotIで切断され、そしてアガロースゲルから精製され得る。Fab105プラスミドは、HindIII/ NotIで切断され得、そしてDNAセグメントはアガロースゲルから精製され得る。次いで、HindIII/XbaI切断FdフラグメントおよびXbaI/NotI切断プロタミンフラグメントは、３片連結（three-piece ligation）によりF105を含有するプラスミドのHindIII/NotI部位にクローン化され得る。図２を参照のこと。それゆえ、得られる発現ベクターは、独立したプロモーター（例えば、CMVプロモーター）の制御下でFd-プロタミン融合遺伝子のカートリッジ（インフレーム）およびκ鎖の遺伝子を含有する。使用される特定のプロモーターは、融合タンパク質発現のための所望の細胞系に依存する。プロモーターは当業者に既知であり、そして本開示内容に基づいて容易に選択され得る。例えば、好ましいプロモーターとしては、CMV、SRα、RSV、MMLV LTR、SV40、およびHIV-1 5’LTRが挙げられる。この構築物は、DNA配列決定のような標準的な手段により容易に確認され得る。次いで、この発現ベクターは、細胞株を安定に形質転換するために用いられ得る。この細胞株は、原核細胞および真核細胞を包含する任意の所望の細胞株であり得る。好ましい細胞株は、COS細胞、腎細胞株（例えば、CHO）、ミエローマ細胞株（例えばSP/0、およびSP/2、HMMA2-11 TG10）を含む哺乳動物細胞、および昆虫細胞株（例えば、ショウジョウバエ）を包含する。好ましくは、抗原性を減少させるために、哺乳動物細胞株を用いる。より好ましくは、ミエローマ細胞を用いる。好ましい細胞は、SP/0、SP/2、Sp2/0-Ag14、X63Ag8.653、FO、NSI/1-Ag 4-1、NSO/1、FOX-NY、YB2/0、および1R983Fを包含する。細胞の形質転換は、任意の形質転換技術による形質転換であり得る。特定の場合ではDEAE-デキストラン技術による一過性の形質転換が許容されるが、細胞を安定に形質転換することが好ましい。従って、好ましくは、細胞を安定に形質転換する方法を用いる。例えば、この方法は、リン酸カルシウム沈澱法であり、その後、形質転換細胞株の選択（例えばG418選択）を行う。形質転換細胞株は培養され得、そして融合タンパク質は標準的な技術により回収される。例えば、Fd- プロタミンタンパク質およびF105のκ鎖は、発現され、COS形質転換Fab105プロタミン細胞の培養物中に分泌され、そして放射性標識および抗ヒトIgG抗体による免疫沈降により検出され得る。例えば、COSI細胞は、リポフェクチン（lipofectin）を用いて、標的部分−結合部分のカートリッジを含有する発現ベクターでトランスフェクトされ得る。ベクターは、ベクターpCMV-Fab105-プロタミンを包含する。次いで、トランスフェクト細胞は、10％ウシ胎児血清（FCS）を添加したDMEM中に２日間インキュベートされ得、選択培地（例えば、10％FCSおよび500μｇ G418を有するDMEM）と置き換えられ得る。これは、例えば、BRLから容易に入手可能である。G418耐性コロニーは、約２週間後に出現し、容易に選択され得る。次いで、コロニーは限界希釈でクローン化され得、放射性標識および免疫沈降、ELISA、ならびに免疫蛍光染色により、組換え融合タンパク質の発現について試験され得る。タンパク質は、標準的手段によりこれらの細胞に分泌および精製され得る。例えば、形質転換COS細胞は、10％ウシ胎児血清および500μg/mlのネオマイシンを添加したDMEM 培地を入れたフラスコ内で増殖され得る。コンフルエンス（confluence）に達した後、培養物は、FCSを含まない新鮮DMEMと２週間の間３日ごとに置き換えられ得る。回収した培養培地は、例えば、遠心分離（例えば、500rpmで４℃で20分間）により清澄化され得、次いで、例えば10,000ダルトンの分子量カットオフを備えたメンブレンフィルター（例えばAmicoコンセントレーター）を用いて濃縮され得る。次いで、濃縮培地は、抗ヒトIgGκ鎖モノクローナル抗体と結合させたアフィニティーカラム（例えば、Kirkegaard & Perry，Inc.により販売）にロードされ得る。アフィニティーカラムはPBSで洗浄され得、濃縮培養培地をロードされ得る。次いで、培地をカラムに通し、その後タンパク質が溶出物中に検出されなくなるまでPBS洗浄を行う。次いで、カラムは予備溶出緩衝液（例えば、1 0mM リン酸塩（pH8.0）で洗浄され、そして100mNグリシン（pH 2.4）でカラムから溶出する。タンパク質のピーク画分は、例えばBradfordタンパク質アッセイ（ Biolab）によるような標準的手段により検出され、一緒にプールされ、そして0. 2M NaClに対して透析される。好ましい実施態様では、細胞を無血清培地における増殖に適合させる。これは、当業者により行われ得る。例えば、容易にCOS細胞およびCHO細胞を適合させ得る。このことを行う際に、比較的純粋なFab-融合タンパク質が培地に分泌される。従って、精製手順はより簡便になる。精製融合タンパク質は、所望の核酸配列と組み合わされるように準備される。この所望の核酸配列としては、例えば、ポジティブ増強因子（potentiater）の配列（例えば、サイトカインの遺伝子、消失タンパク質または欠損タンパク質の遺伝子など）またはネガティブ増強因子の配列（例えば、トキシン、アンチセンスRNA、自殺遺伝子（例えばHSVチミジンキナーゼ（thymidiac kinase））、リボザイム、優性ネガティブ変異体など）が挙げられる。例えば、核酸がトキシンをコードする場合、好ましくは、トキシン遺伝子を改変して、それが非標的細胞に影響する可能性を最小限にするように取り計らう。これは、例えば、認識ドメインをコードするこれらの配列を削除するような、標準的な技術により行われ得る。トキシンは周知であり、そしてジフテリアトキシンおよびその部分切断型、シュードモナスエキソトキシンおよびその部分切断型、リシン／アブリン、ブロックリシン／アブリン、リシントキシンＡ鎖、リボソーム不活性化タンパク質などを包含する。これらのタンパク質は全て異なるドメインを有する。例えば、PEA をコードする遺伝子はいくつかのドメインを有する：ドメインＩは細胞認識を担う；ドメインIIはトキシン交差膜のトランスロケーションを担う；そしてドメインIIIは延長因子２のアデノシン二リン酸(ADP)リボシル化（これは実際に細胞死を担う段階である）を担う［Gary，G.L.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:26 45-2649(1984)；Allured，V.S.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:13220-1324 (1986)；Siegall，C.B.ら、J.Biol．Chem．264:14256-14261(1989)］。従って、例えばフレームシフト変異、終止配列の挿入、または欠失により、ドメインＩまたはドメインIIを発現できないようにこれらのドメインを改変することにより、近隣の細胞に影響するトキシンの能力を最小限にし得る。その後、当業者は標準的な技術を用いて、発現が所望される他のドメインまたはドメインの一部が用いられることを保証し得る。例えば、上述したように、PEAについてはドメインIIIのみが絶対的に必要とされる。しかし、本発明者らは、他のドメイン由来の部分配列を含むことにより、トキシンをより有効にすることを見出した。例えば、本発明者らは２つのPEA哺乳動物発現ベクターを調製した。これはドメインIII（成熟PEAアミノ酸残基405 位〜613位、pCMV-PEA IIIと称される）のみが発現されるベクター、ならびにドメインIIIおよびドメインIBの一部（アミノ酸385位〜613位の配列；pCMV-PEAIbI II）が発現されるベクターである。これらの配列は、標的細胞における発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結されるべきである。例えば、哺乳動物プロモーター（例えば、CMV、SRα、RSV、SV40、MMLV LTR、HIV-1 5'LTR）が好ましい。より好ましくは、CMV、HIV-1 5'LTR、RSV、およびSV40である。これらの遺伝子フラグメントによりコードされるトキシンタンパク質は、認識ドメインを欠失する。それらは周囲の細胞に対して非毒性であり、細胞内で発現されるときのみ毒性である。これらの発現ベクターは、簡潔なインビトロアッセイにより、いかに良好に細胞内で産物を発現するかを決定するために容易に試験され得る。例えば、これらのPEAトキシンフラグメントをコードするDNA配列の発現は、送達システムを用いて細胞を形質転換し、そして細胞の細胞傷害性を観察することにより試験され得る。本発明者らは、pCMV-PEIbIIIベクターは、ドメインIIIのみを発現するベクターより高いレベルのADP-リボシル化を示すことを見出した。従ってこのpCMV-PEIbIIIベクターを用いることが好ましい。図１は、本システムによる核酸送達システムの使用を示す模式図である。ここで、核酸配列は、トキシン発現因子DNAである。いくつかの場合では、イムノトキシンを用いる場合でさえ、耐性変異体が発達し得る。このような場合において、異なるトキシン遺伝子または異なるタイプの核酸セグメントを、融合タンパク質に結合している核酸カセットに容易に挿入し得る。従って、本システムにより、広範なDNAおよびRNAセグメントの生産および使用が可能になる。いくつかの好ましい実施態様では、核酸送達システムの混液が与えられる。このシステムでは、標的部分が標的細胞の数を広げるように変化され得るか、あるいは送達される核酸セグメントが標的細胞へ送達される産物のスペクトルを広げるように変化される。タンパク質がトキシンである場合、細胞における一過性発現のみが必要とされる。しかし、細胞を安定に形質転換することが所望される場合、遺伝子を、LTR またはITRを含有するカセット中にいずれかの側で配置し、安定な組み込みを促進する。あるいは、カセットはエピソームベクターであり得る。エピソームベクターとしては、例えば、エプスタインバーウイルスを含有するベクター、例えば、pEBV His A、B、およびC、pREP4、pREP7、pREP10が挙げられ、これらはInvitr ogen Corporationにより市販されている。組換え融合タンパク質は、標準的な技術により核酸セグメントと組み合わせられる。例えば、融合タンパク質は、所定の量の所望の核酸配列（DNAまたはRNAのいずれか）と、公知の手段（例えば、溶液（例えば、0.2M NaCl溶液）中における混合）により混合され得る。DNAまたはRNAは、プロタミンにより容易に結合される。その後、キャリアが、体細胞治療またはインビボでの使用のいずれかのために所望の細胞に与えられ得る。送達システムは、多くの手段のいずれかによって送達され得る。例えば、送達システムは、非経口注射（筋内（i.m.）、腹腔内（i.p.）、静脈内（j.v.）、または皮下（s.c.））、経口投与経路、または当業者に周知の他の投与経路により投与され得る。非経口投与が好ましい。用いられる量は、代表的には、約0.1mg〜約10mg/kg体重の範囲である。送達システムは、好ましくは、送達される単一または複数の核酸に基づいて、単位投与量剤型で処方される。例えば、経口投与のために用いられ得る固体用量剤型は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤を包含する。このような固体用量剤型では、活性成分（すなわち、標的部分）は、少なくとも１つの不活性キャリアと混合される。不活性キャリアとしては、スクロース、ラクトース、またはデンプンが挙げられる。このような用量剤型はまた、不活性希釈剤以外の添加物質を含有し得る。添加物質としては、例えば、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）が挙げられる。さらに、用量剤型は、カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、緩衝剤もまた含有し得る。錠剤、カプセル剤、および丸剤はまた経時放出コーティングもまた含有し得る。非経口投与のためには、用量剤型は、代表的には、滅菌した水溶液または非水性溶液、懸濁液、または乳濁液を、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルと併用して含有し得る。非水性溶媒またはビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油およびトウモロコシ油）、ゼラチン、および注射可能な有機エステル（例えばオレイン酸エチル）である。これらの用量剤型はまた、アジュバントを含有し得る。アジュバントとしては、例えば、保存剤、加湿剤、乳化剤、および分散剤が挙げられる。それらは、抗体を不活性化しないように注意が払われる限り、例えば細菌保持フィルターによる濾過、滅菌剤の組成物への取り込み、組成物の照射などにより滅菌され得る。それらはまた、使用前に滅菌水の媒体またはいくつかの他の滅菌注射媒体中で製造され得る。これらのピヒクルのさらなる例は、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを包含する。リポソームもまた、キャリアとして用いられ得る。等張性および化学的安定性を増強する物質のような添加剤（例えば、緩衝液および保存剤）もまた用いられ得る。このようなビヒクル内における活性成分の好ましい範囲は、約１mg/ml〜約10m g/mlの濃度である。より好ましくは、約３mg/ml〜約10mg/mlである。特定の実施態様におけるレセプター仲介遺伝子送達は比較的非効率的であり得るが、本遺伝子送達システムを利用することにより、より高い投与量での注入または繰り返し注入の使用から生じる抗原反応について案じる必要がない。これは、標的部分およびDNA結合部分が、それが注入される動物（例えば、ヒト）に由来するか、またはその動物と同様に作られるか（すなわち、ヒト化マウス抗体またはヒトに対する結合タンパク質を用いる）のいずれかであるように設計され得るからである。DNA自身は、弱免疫原性または非免疫原性である。従って、薬剤全体は、非免疫原性であるか、または弱免疫原性であるかのいずれかである。送達システムは、効率的に生成され得、そして高結合活性を有するように調整され得るので、繰り返し用いられ得る。さらに、上述したように、送達システムの効率を向上させるために本システムにおいて利用され得る方法がある。例えば、この方法は、核酸をその所望の標的に、より効率的に送達するために、核酸セグメントと結合した核標的配列のような標的配列を含み得る。標的配列は当該分野で公知であり、そして例えば、HIVg ag p17における25位と33位との間の核位置決定シグナル（配列番号１）（KKKYYK LK）を包含する。従って、この方法は、DNAをより有効に標的するために融合部分の一部として、標的配列を、好ましくはリポソーム内部に含み得る。本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。これらの実施例は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の限定として解釈されるわけではない。実施例二シストロン性哺乳動物細胞発現ベクター（pCMV-Fab105-プロタミン）を以下のように構築した。このベクターは、１つの発現カセット中にヒトプロタミンタンパク質に融合したF105のFdをコードするキメラ遺伝子、および別の発現カセット（図２）中にF105κ鎖コード遺伝子を含有する。 Fab105- プロタミン融合タンパク質のための哺乳動物発現ベクターの構築 pCMV-Fab105プラスミドを以下に記載のようにして構築した。このプラスミドは、F105ハイブリドーマ由来のFd遺伝子およびκ鎖遺伝子についての二シストロン性発現カセットを含有する。融合タンパク質発現ベクターを構築するために、終止コドンを含まないF105のFdフラグメントを、pCMV-Fab105をテンプレートとして用いてPCRにより増幅した。上流プライマー（配列番号２）（5'-TTTGAATTCA AGCTTACCATGGAACATCTGTGGTTC-3'）（付加的なHindIIIクローニング部位（Kabat ら、1987）を伴うアミノ酸１位から６位のヒト免疫グロブリンリーダー配列に対応する）、および下流プライマー（配列番号３）（5'-GGTACCGAATTCTCTAGAACAAG ATTTGGGCTC-3'）（付加的なXbaIクローニング部位を伴うヒト重鎖定常領域のアミノ酸226位から233位に対応する）をPCR増幅のために用いた。PCR反応は以前に記載のようにして実施した［Marascoら、J．of Clin．Invest．90:1467-1478（1 992）］。ヒトプロタミン遺伝子をプラスミドpTZ19R-HP1［Krawetz，S.A.ら、Genomics 5:639-645（1989）］から増幅した。このクローンにおけるプロタミン遺伝子中のイントロンを欠失させるために（同様に原核系における発現のために）、最初のPCR増幅を、上流プライマーP1（配列番号４）（この配列は、付加的なXbaIクローニング部位を伴う、プロタミンタンパク質のアミノ酸１位から６位の配列に対応する）、および下流プライマー（配列番号５）（この配列は、第２エキソンのアミノ酸38位から40位に相補的な付加配列を伴う、アミノ酸29位から37位に対応する）を用いて実施した。２回目のPCR反応を、上流プライマーP1および下流プライマー（配列番号６）（この配列は、第２エキソンのアミノ酸41位から終止コドンまでの配列および付加的なNotIクローニング部位を伴う、31位から40位のアミノ酸配列に対応する）を用いて実施した。最初のPCR増幅DNAをテンプレートとして用いた。二シストロン性融合タンパク質発現ベクターを構築するために、終止コドンを含まないF105のPCR増幅FdをHindIII/XbaIで切り出し、そしてアガロースゲルから精製した。イントロンを含まないPCRで増幅した完全プロタミンコード遺伝子をXbaI/NotIで切り出し、そしてアガロースゲルから精製した。pCMV-Fab105プラスミドをHindIII/NotIで切り出し、約7.0kdのDNAフラグメントをアガロースゲルから精製した。次いで、HindIII/XbaI切断FdフラグメントおよびXbaI/NotI切断プロタミンフラグメントをpCMV-Fab105のHindIII/NotI部位に三片連結によりクローン化した。得られた発現ベクター（pCMV-Fab105-プロタミンと称する）は、独立CMVプロモーターの制御下でFd-プロタミン融合遺伝子（インフレーム）およびκ鎖遺伝子を含有する。この構築物をDNA配列決定により確認した。 pCMV-Fab105ベクター中にクローン化したF105 FdおよびヒトプロタミンDNAフラグメントを図２に示す。得られた二シストロン性発現ベクター（pCMV-Fab105- プロタミン）は、Fd105-プロタミン融合タンパク質についての発現カセット、およびF105のκ鎖についての別のカセットを含有する。 DNAトランスフェクションおよびG418選択後、形質転換哺乳動物細胞株COS-Fab 105-プロタミンを生成させた。形質転換細胞株の構築形質転換細胞株を生成させるために、COS-1細胞を６ウエルプレート上で増殖させ、以前に記載のようにリポフェクチンを用いてpCMV-Fab-プロタミンでトランスフェクトした［Chen，S.-Y.ら、J．Virol．65:5902-5909（1991）］。トランスフェクト細胞を10％FCSを添加したDMEM中で２日間インキュベートし、そして選択培地(10％FCSおよび500μg/ml G418（BRL）を添加したDMEM)に置き換えた。G418耐性コロニーは、選択の２〜３週間後に出現した。このコロニーを限界希釈を用いてサブクローン化し、そして放射性標識および免疫沈降、ELISA、ならびに免疫蛍光染色により、組換え融合タンパク質の発現について、記載のように試験した［Marasco，W.A.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:7889（1993）］。Fd-プロタミンタンパク質およびF105のκ鎖は、放射性標識および抗ヒトIgG抗体を用いる免疫沈降により検出されるように、発現され、そしてCOS-Fab105-プロタミン細胞の培養培地中に分泌される。図３を参照のこと。融合タンパク質の精製形質転換COS細胞（COS-Fab105-プロタミン）を10％ウシ胎児血清（FCS）および500μg/mlのネオマイシンを添加したDMEM培地を入れたフラスコ内で増殖させた。コンフルエンスに達した後、細胞培養物を、FCSを添加しない新鮮DMEMに２週間の間３日ごとに置き換えた。回収した培養培地を5000rpm、４℃で20分間の遠心分離により清澄化し、次いで、10,000ダルトンの分子量カットオフのメンブレンフィルターを備えたAmicoコンセントレーターを用いて濃縮した。次いで、濃縮培地を、抗ヒトIgGκ鎖モノクローナル抗体と結合させたアフィニティーカラム（Kirkegaard & Perry，Inc.）にロードした。アフィニティーカラムの調製は、記載のようにして、２mgの精製モノクローナル抗体を１mlのプロテインＡ−セファロースCL-4B湿潤ビーズ（Pharmacia Inc． Uppsa1a，Sweden）と混合することにより行った。簡単に言えば、プロテインＡ- セファロース-4BビーズをPBSで洗浄し、次いでPBS中で４℃で一晩精製抗体と混合した。この混合物を10容量の0.2Mホウ酸ナトリウム（pH 9.0）で洗浄し、ジメチルピメリミデート（dimethypimelimidate）を添加し、最終濃度を20mMとした。混合物を振盪器（rocker）上で室温で30分間撹拌し、0.2Mエタノールアミン（ pH 8.0）で１回洗浄し、次いで振盪器上で、0.2Mエタノールアミン中で室温で２時間インキュベートした。最後の洗浄後、抗体と結合させたビーズを0.01％メルチオレートを有するPBS中で再懸濁した。アフィニティーカラムをPBSで洗浄し、濃縮培養培地をロードした。培地をカラムに通し、その後タンパク質が溶出物中に検出されなくなるまでPBS洗浄を行った。カラムを予備溶出緩衝液（10mM リン酸塩（pH8.0））で洗浄し、そしてpH 2.4で100mNグリシンでカラムから溶出した。タンパク質のピーク画分を、Bradf ordタンパク質アッセイ（Bio-Lab）により検出し、一緒にプールし、そして0.2M NaClに対して透析した。融合タンパク質のDNA結合部分を、DNAセルロースと放射性標識細胞の培養培地とのインキュベーションにより試験した。形質転換細胞株(COS-Fab105-プロタミン)を、pCMV-Fab105-プロタミンDNA[War rant,R.W.ら、Nature 271:130-135(1978)]を用いてトランスフェクションした後にG418(Gibco-BRL)選択を用いて生成した。COS-Fab105細胞株を以前に記載のように確立した[Warrant,R.W.，Nature 271，上記]。発現タンパク質を試験するために、形質転換細胞を４時間放射性標識し、そして抗ヒトIgG(Southern Biote ch)およびプロテインＡ-Sepharose 4Bビーズを用いてまたはDNAセルロース(Phar macia)を用いて沈澱し、そして以前に記載されるようにSDS-PAGEにより分析した [Chen,S.-Y.ら、J.Virol．65:5902-5909(1991)]。無血清培地中に、分泌されたF ab105-プロタミンを精製するために、COS-Fab105-プロタミン細胞の培養培地を清澄化し、濃縮し、そして抗ヒトIgGモノクローナル抗体を結合したプロテインＡ-Sepharose 4Bビーズのアフィニティーカラムにロードした。このカラムは、記載された方法[Winter,G.,ら、Nature 349:293-299(1992)]に従って調製した。カラム上の結合タンパク質を100mMグリシン(pH7.5)により溶出し、次いで濃縮し、そして0.20M NaCl溶液に対して透析した。ELISAのために、マイクロタイタープレートを組換えgp120(Americain Biotechnology Inc.)でコートし、そして公知の濃度のFab105またはFab105プロタミンタンパク質とともにインキュベートした後、アルカリホスファターゼ(Sigma)と結合した抗ヒトIgGとともにインキュベートした[Warrant,R,W.,ら、Nature 271，上記]。図３は、発現される融合タンパク質の放射性標識および免疫沈降を示す。形質転換細胞株(COS-Fab105-プロタミン)を上記のように生成した。６ウェルプレート上の細胞を、³⁵Sシステインで４時間連続的に放射性標識し、そして細胞の培養培地を、抗ヒトIgG抗体(Southrn Biotech)を用いた後にSepharose-プロテインＡによるか、またはDNAセルロース(Pharmacia)を用いるかのいずれかで沈澱した。サンプルを還元状態下でSDS-PAGEにより分析した。レーン１、抗ヒトIgGを用いて沈澱されたCOS-Fab105-プロタミン；レーン２、抗ヒトIgGおよびDNAセルロースを用いて沈澱されたCOSベクター；レーン３、DNAセルロースを用いて沈澱されたCOS-Fab105-プロタミン；レーン４およびレーン５、DNAセルロース(４)または抗ヒトIgG(５)を用いて沈澱されたCOS-Fab105。 DNAセルロースは、Fd-プロタミン融合タンパク質およびκ鎖を共沈澱したが、 Fab105フラグメントを沈澱しなかった。このことはFd-プロタミン融合タンパク質のDNA結合部分がそのDNA結合能力を維持しており、そして融合タンパク質が互いに会合されていることを示唆している。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、COS-Fab105-プロタミン細胞の培養培地中でHIV gp120に対する結合活性( 約0.1μg/ml/24時間)が検出されたが、ベクターを形質転換した細胞の培地においては、結合活性は観察されなかった。分泌された組換え融合タンパク質を、無血清培養培地から、抗ヒトIgG抗体κ 鎖モノクローナル抗体が結合したアフィニティーカラムを使用することにより精製した(図４)。カラムに結合した融合タンパク質を100mMグリシン(pH2.4)により溶出し、濃縮し、そして非還元条件下または還元条件下で以下のようにSDS-PAGE により分析した。図２に示すように、還元条件下で、Fd-プロタミン融合タンパク質およびκ鎖に対応する２つのバンドがゲル上に出現した。一方、非還元条件下では、大多数のタンパク質がより高分子側のバンドにシフトした。これは組立てられたFabフラグメントを表すようである。精製Fab105-プロタミンのgp120に対する特異的結合活性が、Fab105の特異的結合活性よりはわずかに低いものの、 ELISAにより検出された。図４は、組換え融合タンパク質の精製およびSDS-PAGE分析を示す。培養培地中のFab105-プロタミン融合タンパク質を、記載されるように抗ヒトI gGκ鎖モノクローナル抗体(Kirkegaard and Perry Lab)を結合したアフィニティーカラムを使用することにより精製した。カラムに結合したタンパク質を100mM グリシン(pH2.4)により溶出し、次いで濃縮し、そして0.20M NaCl溶液に対して透析した。精製タンパク質を、還元条件下または非還元条件下でSDS-PAGEにより分析した後、Coomassie blue染色した。レーンａ、還元条件下における100ng(左)の精製Fab105-プロタミン、レーンａ ’、還元条件下における10ng(右)の精製Fab105-プロタミン；レーンｂ、非還元条件下における100ngの精製Fab105-プロタミン。精製融合タンパク質のGp120に対する結合活性を図５に示す。組換えHIV-1 gp120(American Biotechnology，Inc.)でコートしたELISAプレートを、Fab105またはFab105-プロタミンタンパク質とともにインキュベートした後、アルカリホスファターゼ(Sigma)と結合したヒトIgGとともにインキュベートした。gp120に対する結合活性を、基質(Bio-Lab)とともにインキュベーションした後にOD₄₅₀で検出した。示されたデータは２回平行測定値の平均値である。レーンａ、10ng/mlのFab105またはFab105-プロタミン；レーンｂ、１ng/ml；レーンｃ、0.1ng/ml、およびレーン３、0.01ng/ml。各レーンの第１のカラムはFab-105 、一方、第２のカラムはFab-105-プロタミンである。これらの結果は、組立てられ、そして培養培地中へ分泌されるFab105-プロタミン融合タンパク質が、HIV-1 gp120に対する特異的結合活性を有していることを示す。 Fab105-プロタミンのDNA結合活性をゲルシフトアッセイ[Wagner,E.,ら、PNAS USA:89:6099-6103(1992)]により試験した。 DNA 結合アッセイ組換え融合タンパク質のDNA結合活性を分析するために、ゲルシフトアッセイを使用した。0.2N NaCl溶液中の精製融合タンパク質の上昇量を、0.2N NaCl溶液中の放射性標識されたまたは非標識のいずれかの所定量のDNAとともに混合した。³²P-dATP(Amersham)によるDNA放射性標識を、ニックトランスレーションキット(Promega)を使用して実施した。タンパク質-DNAの混合物を室温で30分間静置し、そして0.45μMのポアサイズのメンブレンに通して濾過し、DNA-タンパク質沈澱物を除去し、次いで１×TAE緩衝液中で電気泳動するために、1.0%アガロースゲルにロードした。DNA-トキシン発現因子の細胞傷害性を分析するために、融合タンパク質-DNA混合物を、細胞培養物に添加する前に正常生理食塩水に対して４℃で１晩透析した。 Fab105-プロタミンタンパク質のDNA結合活性を、図６に示す。 Fab105-プロタミンのDNA結合活性を、ゲル移動度シフトアッセイ[Wu,G.Y.ら、 J.Biol.Chem．262:4429-4432(1987)]により試験した。pCMV-Fab105-プロタミンのHindIII／XbaI切断DNAフラグメントを、ニックトランスレーションキット(Pha rmacia)を用いて³²P-dATPで放射性標識した。20ngの標識DNAを、各サンプルについて上昇量のFab105-プロタミンタンパク質とともに、0.20N NaCl溶液中でインキュベートした。コントロールとして、DNAをFab105タンパク質とともにインキュベートした。全プラスミドDNA pCMV-Fab105-プロタミン(各サンプル0.2μg)もまた、上昇量のpCMV-Fab105-プロタミンタンパク質とともに、0.20N NaCl中でインキュベートした(図７を参照のこと)。サンプルを、0.8%アガロースゲル上の電気泳動により分析した。オートラジオグラフィーのために、ゲルを乾燥し、そしてＸ線フィルム上に曝露した。図６：レーン１、DNA(５μg)のみ；レーン２〜４、DNA(５μg)と0.5ng Fab-プロタミン(２)；DNA(５μg)と1.0ng Fab-プロタミン (３)；DNA(５μg)と10ng Fab-プロタミン(4)；レーン５、コントロールとしてDN A(５μg)/10ng Fab105。図７、レーン１、DNA(0.2μg)のみ；レーン２、DNA(0.2 μg)/2.0μg Fab105コントロール；レーン３〜６、DNA(0.2μg)と0.1μg Fab-プロタミン(３)；DNA(0.2μg)と0.2μg Fab-プロタミン(４)；DNA(0.2μg)と0.4μ g Fab-プロタミン(５)；DNA(0.2μg)と0.6μg Fab-プロタミン(６)、レーン７、 Fab105-プロタミンのみ(0.6μg)；およびレーン８、DNA(0.2μg)と0.6μgのFab1 05-プロタミン(ゲルにロードする前にフェノール抽出)。図６および図７に示すように、放射性標識したDNAフラグメントまたは全プラスミドDNAと混合した融合タンパク質の量が増加すると、アガロースゲル中に移動するDNAフラグメントまたは全プラスミドDNAの量は減少し、そしてアガロースゲルに入ったDNAはよりゆっくりと移動した。一方、Fab105タンパク質とともにインキュベートしたDNAは、アガロースゲル中でその移動度の顕著な変化を示さなかった。DNAと結合後の細胞表面上のgp120に対する融合タンパク質の結合活性を、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)によりさらに試験した。 Fab105-プロタミン-DNA複合体の細胞表面上のGP120に対する結合能力を図８に示す。 HIV感染Jurkat細胞または疑似感染Jurkat細胞を、Fab105またはFab-プロタミンタンパク質-DNA複合体とともにインキュベートした後、Fitcと結合した抗ヒト IgG Fab[Pastan,Iら、Science 254:1173(1992)]とともにインキュベートした。次いで、細胞表面上の蛍光染色をFACSにより解析した。 DNA移動度シフトアッセイを記載[Wu,G.Y.ら、J.Biol.Chem．262:4429(1987)； Wagner.E.ら、Proc.Natul.Acad.Sci．USA 89:6099(1992)]のように実施した。上昇量の精製融合タンパク質を、0.2M NaCl溶液中で所定量のDNAと混合した。電気泳動のために0.8%アガロースゲルにロードする前に、混合物を室温で30分間静置し、次いで0.45μMメンブレン(Millipore)に通して濾過した。細胞表面上の、 gp120に対する融合タンパク質-DNA複合体の結合能力を検出するために、１μgの精製Fab105-プロタミンを、100μlの0.2N NaCl中、30分間、0.5μgのpCMV-Fab10 5プラスミドDNAと混合し、そして混合物を1:20に0.9%N NaCl溶液で希釈し、そしてHIV-1感染Jurkat細胞または非感染Jurkat細胞とともにインキュベートした後、抗ヒトIgG-Fitc結合体とともにインキュベートした。Fab105フラグメントをコントロールとして使用した。次いで、蛍光染色物をFACSにより解析した。図８に示すように、Fab105またはFab105-プロタミン-DNA複合体のいずれかと反応したHIV-1感染細胞は、ポジティブな染色を示したが、複合体とともにインキュベートした非感染の細胞は、ネガティブな染色を示した。結合抗体と直接インキュベートした感染細胞もまた、ネガティブな染色を示した(示さず)。従って、DNA分子と結合した後も、Fab105-プロタミン融合タンパク質は、gp120に対する結合活性を維持する。コード遺伝子配列と機能との関係に関する知識が蓄積されているので、哺乳動物トキシンの発現ベクターを構築するために、PEAのコード遺伝子を選択した[Ga ry,G.L.ら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 81，上記；Allured,V.S.ら、Proc.Natl.A cad.Sci．USA 83，上記；Siegall,C.B.ら、J.Biol,Chem．264，上記]。PEAはいくつかの機能ドメインを有する：ドメインＩは、細胞認識を担う：ドメインIIは、トキシン交差膜のトランスロケーションを担う；およびドメインIIIは、延長因子２のアデノシン二リン酸(ADP)-リボシル化（実際に細胞死を担う段階）を担う[Allured,V.S.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 83，上記;Siegall,C.B.ら、J.Biol. Chem．264，上記]。２つのPEA哺乳動物発現ベクターを設計し、そしてドメインI II(405位〜613位の成熟PEAアミノ酸残基)のみ(pCMV-PEAIII)またはドメインIII および部分的なドメインIb配列(385位〜613位のアミノ酸)のみ(pCMV-PEAIb-III) が、CMVおよびT7プロモーターの制御下に置かれるように構築した。トキシン発現ベクターの構築 PEAコード遺伝子を含有するプラスミドpJH8(ATCC寄託番号67208を有する)を、アメリカンタイプカルチャーコレクション，12301 Parklawn Drive，Rockville ，MD 20852から得た。PEAコードドメインの概略図については図９を参照のこと。 PEA触媒フラグメントをコードするDNA配列をpJH8 DNAをテンプレートとして用いるPCR増幅により得た。pCMV-PEIIIと名付けたトキシン発現因子を構築するために、さらなるHindIII部位および開始コドンならびにそれに続く成熟PEAの405位〜411位アミノ酸に相補的な配列を含有する上流プライマー(P1(配列番号７)5'TT TAAGCTTATGGGCGACGTCAGCTTCAGCACC-3')、およびさらなるXbaI部位が続くPEAのアミノ酸609位〜終止コドンに相補的な配列を含有する下流プライマー(P-2(配列番号８)5'-TTTTCTAGATTACTTCAGGTCCTCCGG-3')を使用してPEAのドメインIIIを増幅した。トキシン発現因子pCMV-PEIbIIIを構築するために、PEAの365位〜372位アミノ酸に対応する上流プライマー(配列番号９)(P3-5'-TTTAAGCTTATGCCGACGTGGTG AGCCTG-3')、および下流プライマーP-2を使用して、部分的ドメインIbおよびドメインIIIを増幅した。増幅DNAフラグメントをGeneclean Kits（Bio 101 Inc.) で精製し、HindIII／XbaIで消化し、そしてCMVプロモーターの制御下、pRc/CMV 発現ベクター(Invitrogen)へクローン化した。得られた構築物をDNA配列決定により確認した。これらの構築物は、認識ドメインを有さない発現されるトキシンフラグメントが、それらが細胞内で発現されない限り、周辺の細胞に対して非毒性であることを確実にした。ベクターから発現されるトキシンフラグメントを検出するために、最初に、プラスミドpCMV-PEAIIIまたはpCMV-PEAIbIII(図９を参照のこと)を、 T7プロモーターの制御下で遺伝子の転写のためにT7 DNAポリメラーゼを誘導的に発現するBL21(DE3)発現細菌宿主(Novagen)へ形質転換した。誘導の後、ADP-リボシル化活性が形質転換細菌から検出された(示さず)。トキシン発現因子をリポフェクチンを使用して[Chen,S.-Y.ら、J.Viol．65:5902-5909(1991)]、哺乳動物細胞(COS-1およびHeLa)へトランスフェクトした場合、トキシンフラグメントが産生され、そしてトランスフェクトされた細胞に対する細胞傷害性が観察された( 示さず)。pCMV-PEIIIよりも高いレベルのADPリボシル化活性を示したpCMV-PEIbI IIベクターをさらなる実験に使用した。 Fab105-プロタミンがトキシン発現因子を標的細胞に移すための遺伝子キャリアとして機能し得るかどうかを研究するために、精製Fab105-プロタミン融合タンパク質を、pCMV-PEAIbIIIプラスミドDNAとともに２：１の比(力価により決定される)で、0.2N NaCl溶液中でインキュベートし、融合タンパク質-DNA複合体を形成した(図10〜12を参照のこと)。gp120に対する抗体を用いた免疫蛍光染色により、95%以上ポジティブを示したHIV-1感染Jurkatリンパ球を標的細胞として使用した。標的細胞を、Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体と、単独のトキシン発現因子、または単独のFab105プロタミンタンパク質とともにインキュベートした。コントロールとして、正常なリンパ球もまたこれらの分子とともにインキュベートした。48時間のインキュベーション後、培養細胞の細胞生存率(図1 0)、タンパク質合成(図11)、およびADPリボシル化活性(図12)を試験した。 Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体のHIV感染細胞に対する選択的細胞傷害性を図10〜12に示す。 Jurkat細胞をHIV-1ウイルス感染させ、感染後10日目に、細胞の表面gp120発現を免疫蛍光染色により試験した。95%のgp120ポジティブ(0.5×10⁶)を有する細胞を、DNA-融合タンパク質複合体、または単独の融合タンパク質、または単独のDN Aとともに37℃で48時間インキュベートした。図10は、Trypan Blue染色により試験された培養物中の細胞生存率を示す。生存細胞のパーセンテージを二回平行測定から算出した。図11は、タンパク質阻害アッセイを示す。細胞(0.5×10⁶)をロイシンを含まない培地に置き換え(Allured,V.S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 83:1320(1986)； Pastan,I.ら、Cell 47:641(1986)；Siegall,C.B.ら、J.Biol.Chem．264:14256(1 989)を参照のこと、そして４μci ³H-ロイシンとともに添加した(４時間）。細胞を3,000rpmで５分間遠心分離し、そしてシンチレーションカウントのために溶解した。図12は、培養細胞のADPリボシル化活性の検出を示す[Collier,R.J.ら、J.Biol .Chem.246:1496(1971)]。細胞(１×10⁶)を遠心分離によりペレット化し、そして 4M 尿素溶液に溶解した。次いで、溶解物の上清をADPリボシル化アッセイに供し、そしてPEAタンパク質(Gibco-BRL)をポジティブコントロールとして使用した。サンプルの平均シンチレーションカウントを、２回平行測定からの算出として示す。図10〜12においてレーンａ：Fab-プロタミン-トキシン発現因子複合体(10μg Fab105-プロタミン／５μg発現因子DNA、10：５μg)とともにインキュベートした正常なJurkat細胞；レーンｂ〜ｅ：単独のFab-プロタミンとともにインキュベートしたHIV感染Jurkat細胞(ｂ)；単独のトキシン発現因子DNAとともにインキュベートしたHIV感染Jurkat細胞(ｃ)；Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体(10：５μg)とともにインキュベートしたHIV感染Jurkat細胞(ｄ)；Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体(５：2.5μg)とともにインキュベートしたHIV 感染Jurkat細胞(ｅ)；レーンｆ：1.0ngの尿素変性PEAコントロールのADPリボシル化活性。図10〜12に示すように、Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体とともに 48時間インキュベーションした後、HIV-1感染細胞は、細胞生存率(＜1.5%)およびタンパク質合成能力(＜0.2%)が顕著に減少した；一方、トキシン発現因子または単独のFab105-プロタミンとともにインキュベートした細胞は、細胞生存率およびタンパク質合成能力がわずかに減少したのみであった。さらに、非感染のリンパ球は、Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体とともにインキュベーションした後に、細胞生存率およびタンパク質合成能力の顕著な減少を示さなかった。HIV感染細胞に対する観察された選択的細胞傷害性は、発現されるトキシンフラグメントに由来するADPリボシル化活性の結果であるべきである。なぜなら、1.0ngのPEAタンパク質にほぼ等しいADPリボシル化活性が、複合体とともにインキュベートしたHIV感染細胞(１×10⁶)の溶解物から検出されたからである。従って、Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体は、組織培養物において、HI V-1感染細胞を選択的に傷害した。ヒト癌および他の疾患の処置における有効な因子としてのイムノトキシンの主要な傷害は、異種の抗体および異種のトキシンに応答する宿主抗体である。[Bye rs,V.S.ら、Immunol．65:329(1988)；Durrant,L.G.ら、Clin.Exp.Immunol.75:25 8(1989)；Pai,L.H.ら、J.Clin.Oncol．9:2095-2103(1991)]。ヒト化マウスまたはヒト抗体の使用は、標的部分の問題を解決し得る[Rybak,S.M.ら、Proc.Natl.A cad.Sci．USA 89:3165-3169(1992)]、しかし高い免疫原性トキシン部分については問題は以前として残されたままである。本研究において、本発明者らは、抗gp 120 Fab105-プロタミン融合タンパク質が、レセプター仲介エンドサイトーシスによりトキシン-発現因子プラスミドDNAを、HIV-1感染細胞へ送達するための遺伝子キャリアとして作用し得、標的細胞の選択的殺傷が生じることを示す。トキシン分子の顕著な効力は、レセプター介在遺伝子送達の低い有効性を補い[W u,G.Y.ら、J.Biol.Chem．262:4429-4432(1987)；Wagner,E.ら、PNAS USA 89:609 9-6103(1992)]、効果的に治療学的目標を達成する。抗体分子またはリガンド(標的部分)および二機能の融合タンパク質のDNA結合部分がヒト起源であり得、そしてトキシン発現因子DNAは、免疫原性が非常に弱いかまたは非免疫原性であるため、全体のタンパク質-トキシン発現因子複合体は弱い免疫原性である。それゆえ、これらの複合体は、顕著な抗体応答の発達を有さないで患者に繰り返し投与され得るべきである。さらに、遺伝子キャリアとしての二機能性の組換え融合タンパク質もまた、化学的に連結された融合タンパク質にわたって、効率的な産生、およびより良好と思われる結合活性のような利点を有する[Wu,G.Y.ら、J.Biol .Chem．262:4429-4432(1987)；Wagner,E.ら、PNAS USA 89:6099-6103(1992)]。要約すると、本明細書中で「ステルスイムノトキシン(stealth immunotoxin)」と呼ばれるイムノトキシンのこの遺伝子治療形態は、癌、および他の疾患の処置のために現在記載されているイムノトキシンよりも、顕著な利点を有する。さらに、抗gp120 Fab105-プロタミン-トキシン発現因子複合体は、HIV-1感染細胞に対して選択的毒性を有し、これはまたAIDS処置のための新規な治療剤を表す。本明細書において記載される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される。先述の開示の利益を与えられた当業者が、本発明の概念から逸脱することなく多くのその他の使用およびその改変をなし得、ならびに本明細書において記載される特定の実施態様からの変更を成し得ることは明白であり、そして本発明は添付の請求の範囲および精神によってのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チェン，シ−イアメリカ合衆国マサチューセッツ 02146，ブルックリン，レアー，セントポールストリート 229

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸送達システムであって、 (1)標的細胞上の部位に特異的に結合する標的部分と、 (2)核酸セグメントに結合する結合部分と、を含む融合タンパク質、および目的の核酸配列を含む該核酸セグメントを含む、核酸送達システム。２．前記標的部分が抗体である、請求項１に記載の核酸送達システム。３．前記抗体がウイルスエンベロープタンパク質、細胞レセプター、または活性型レセプターの細胞外ドメインに対する抗体である、請求項２に記載の核酸送達システム。４．前記抗体が単鎖抗体、抗体のFab部分、または(Fab')₂セグメントである、請求項２に記載の核酸送達システム。５．前記結合部分がタンパク質またはタンパク質の核酸結合ドメインであり、そして該結合部分が前記標的部分のカルボキシ部分に融合されている、請求項１に記載の核酸送達システム。６．前記結合部分が、GCN4、Fos、Jun、TFIIS、FMRI、酵母タンパク質HX、ビギリン、Mer1、細菌ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、リボソームタンパク質S3、および熱ショックタンパク質からなる群より選択されたタンパク質に存在する核酸結合ドメインの群から選択される、タンパク質の核酸ドメインである、請求項５に記載の核酸送達システム。７．前記結合部分がタンパク質プロタミンである、請求項５に記載の核酸送達システム。８．前記目的の核酸配列が、抗体、優性ネガティブ変異体、アンチセンスRNA、リボザイム、または細胞傷害性因子をコードする、請求項１に記載の核酸送達システム。９．前記核酸セグメントが、前記目的の核酸配列中に、隣接する５’および３’ 末端反復配列(LTR)領域または逆位末端反復(ITR)領域、所望の遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含む、請求項１に記載の核酸送達システム。１０．融合タンパク質と核酸セグメントとを含む核酸送達システムであって、ここで、該融合タンパク質の一部が細胞上の所望の部位に選択的に結合する抗体を含み、そして該融合タンパク質の他の部分が該核酸セグメントに結合し得るプロタミンタンパク質を含む、核酸送達システム。１１．前記核酸セグメントがサイトトキシン遺伝子または細胞傷害性タンパク質をコードするそのフラグメントに対応するDNA配列である、請求項１０に記載の核酸送達システム。１２．前記核酸セグメントが少なくともシュードモナスエキソトキシンＡのドメインIIIをコードする、請求項１１に記載の核酸送達システム。１３．標的細胞を形質転換する方法であって、該方法が、有効量の請求項１に記載の核酸送達システムを標的細胞を含む培地に添加する工程、および該核酸送達システムの核酸配列が該細胞を形質転換するまで待つ工程を含む、方法。１４．核酸送達システムを調製する方法であって、該方法が、細胞を、作動可能にプロモーターに連結された請求項１に記載の融合タンパク質をコードするDNA セグメントを含むベクターで形質転換する工程、該細胞をインキュベートする工程、そして発現された該融合タンパク質を収集する工程を含む、方法。１５．核酸送達システムを使用する方法であって、該方法が、有効量の請求項１に記載の核酸送達システムを標的細胞を含有する血清に投与する工程、そして該核酸送達システムが該標的細胞と接触するまで待つ工程を含む、方法。１６．核酸送達システムを使用する方法であって、該方法が、有効量の請求項１０に記載の核酸送達システムを標的細胞を含有する血清に投与する工程、そして該核酸送達システムが該標的細胞と接触するまで待つ工程を含む、方法。