WO2002070552A2 - POLYPEPTIDE EINES HDM2-PROTEIN SPEZIFISCHEN MURINEN Α/β T-ZELL REZEPTORS, DIESE KODIERENDE NUKLEINSÜREN UND DEREN VERWENDUNG - Google Patents

POLYPEPTIDE EINES HDM2-PROTEIN SPEZIFISCHEN MURINEN Α/β T-ZELL REZEPTORS, DIESE KODIERENDE NUKLEINSÜREN UND DEREN VERWENDUNG Download PDF

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Matthias Theobald
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the invention relates to polypeptides of the murine ⁇ / ⁇ T cell receptor which mediates an hdm2 protein-specific T-cell response, these nucleic acids coding therefor and their use in the therapy, diagnosis and / or prevention of diseases associated with the hdm2 protein.
  • T lymphocytes The characteristic T cell line marker is the T cell antigen receptor (TZR).
  • TCR T cell antigen receptor
  • the ⁇ / ß-TZR is the most important functionally, because it is expressed in over 95% of all T cells and mediates the supporting immune response.
  • ⁇ / ⁇ -T cells can be divided into two different overlapping populations: a subgroup that carries the CD4 marker and mainly supports the immune response (T H ) and a subgroup that carries the CD8 marker and essentially cytotopic xic is (Tc).
  • CD8 + T cells recognize antigens in association with MHC class I molecules. Such antigens can include tumor-specific or tumor-associated peptide antigens. After recognition of the peptide antigens, the cell in question is killed by the T cell lysing the target cell and / or inducing apoptosis of these target cells or releasing cytokines (eg IL-2, IFN- ⁇ ).
  • cytokines eg IL-2, IFN- ⁇
  • TAA tumor-associated peptide antigens
  • mdm2 human homologue of the "mouse double minute 2" proto-antigen
  • hdm2 human mdm2
  • haematological neoplasms malignant haematological system diseases
  • Oligopeptides of the hdm2 protein can be presented in the context of MHC class I molecules on the cell surface and represent attractive target structures for CD8-positive T cells.
  • the extent of the T cell response runs in a defined kinetic window (Kersh et al., 1998).
  • T cell receptors The prerequisite for the development of immunotherapeutic methods for the treatment of malignant tumor diseases is the identification of oncoprotein-specific T cell receptors.
  • T cell receptors T cells with antigen specificity in general and tumor reactivity in particular can be provided under certain conditions with the aim that the T cells bring about the remission and eradication of a specific tumor.
  • Methods described for identifying high-affinity peptide-specific TCRs include the “phage” or “yeast display” methodology (Holler et al., 1999) or a tetramer-dependent “TCR display” methodology (Kessels et al. , 2000).
  • WO 97/32603 generally describes a method for the production of recombinant T lymphocytes that express specific T cell receptors directed against tumor tissue, whereby an HLA transgenic mouse (in this case HLA-A2) is immunized with tumor-associated antigen, so as to cause the production of cytotoxic T lymphocytes, the specific Express T-cell receptors on their surface:
  • Tumor-associated antigens are peptides of various genes, such as Her-2 / neu, Ras, p53, tyrosinase, MART, gplOO, MAGE, BAGE and MUC-1 b esch rubbed.
  • the nucleotide sequence which contains at least one variable region of the ⁇ and ⁇ chain of the corresponding non-human T cell receptor is then isolated and used in the form of various molecular-biologically modified genetic (including “humanized”) TZR constructs describes WO 97/32603 fusion proteins of variable regions of TZR with the ⁇ region of CD3 or CD8 or CD 16, as well as the use of flexible linkers of the amino acid sequence (GGGGS) 3 .
  • the present invention is therefore based on the object of making available the murine genes of the T cell receptors ⁇ -TZR and ⁇ -TZR directed against the hdm2 protein. These have the effect that cells expressing hdm2 protein are recognized by CD8-positive T cells, cytokines are released, and T cell-induced lysis and / or apoptosis of tumor or leukemia cells is brought about.
  • this object is achieved by the polypeptide of the murine ⁇ / ⁇ T cell receptor mediating an hdm2 protein-specific T cell response according to SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 or functional variants or parts thereof or nucleic acids encoding them, functional variants or parts of them solved.
  • the genes were introduced as wild type (WT) or modified constructs retrovirally into human peripheral blood lymphocytes (PBLs) and the HLA-restricted antigen recognition was functionally checked by CD8-mediated cytotoxic lysis of various cell lines in the 51 chromium release test.
  • the genes of the hdm2-specific TZR according to the invention do not belong to the hitherto known suitable targets for the diagnosis - such as the indication - and / or the treatment - such as the modulation - of diseases related to hdm2 protein or for the identification of pharmacologically active substances, so that completely new therapeutic approaches result from this invention.
  • Another aspect of the invention relates to a fusion protein comprising the polypeptide according to the invention or functional variants or parts thereof or nucleic acids encoding it, functional variants or parts thereof.
  • the fusion protein can be characterized in that it comprises the ⁇ region of CD3 or CD8 or CD 16 or parts thereof, in particular the ⁇ region of human CD3 or CD8 or CD 16 or parts thereof.
  • a fusion protein according to the invention which comprises a flexible linker (Whitlow et al., "An improved linker for single-chain Fv with reduced aggregation and enhanced proteolytic stability", Prot. Engin. 6 (8), pp. 989-995, 1993), in particular a linker of the amino acid sequence (GGGGS) 3.
  • the fusion protein according to the invention can comprise the ⁇ chain of the CD3 complex or ITAM motifs of the ⁇ chain or parts thereof, in particular the ⁇ chain of human CD3 or parts thereof
  • the fusion protein can further be characterized in that it comprises CD8 ⁇ or the Lck binding motif of CD8 ⁇ or parts thereof, in particular human CD8 ⁇ .
  • the fusion protein according to the invention can furthermore be a chimeric partially or completely humanized ⁇ and / or ⁇ TZR chain, in particular according to SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 4.
  • Another aspect of the invention relates to a fusion protein in which it is a single chain T-cell receptor, in particular according to SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 6.
  • the fusion protein according to the invention can also be characterized in that it is an ⁇ / ⁇ -TCR linked to other functional components acts, in particular according to SEQ ID No. 7 or SEQ ID No. 8.
  • Another object of the invention is a method for producing a fusion protein according to the invention for the diagnosis and / or treatment of diseases associated with hdm2 protein or for the identification of pharmacologically active substances, e.g. in a suitable host cell in which a nucleic acid according to the invention is used.
  • Fusion proteins are produced here which contain the polypeptides according to the invention described above, the fusion proteins themselves already having the function of a polypeptide of the invention or the specific one only after the fusion portion has been split off Function is active. Above all, this includes fusion proteins with a proportion of approximately 1-200, preferably approximately 1-150, in particular approximately 1-100, especially approximately 1-50 foreign amino acids. Examples of such peptide sequences are prokaryotic peptide sequences which e.g. B. can be derived from the galactosidase of E. coli. Furthermore, viral peptide sequences, such as, for example, from bacteriophage Ml 3, can also be used in order to generate fusion proteins for the "phage display" method known to the person skilled in the art.
  • a further polypeptide can be added to purify the proteins according to the invention.
  • Protein tags according to the invention allow, for example, high affinity absorption to a matrix, stringent washing with suitable buffers without eluting the complex to any appreciable extent, and then targeted elution of the absorbed complex.
  • Examples of the protein tags known to the person skilled in the art are a (His) 6 tag, a Myc tag, a FLAG tag, a Strep tag, a Strep tag II, a hemagglutinin tag, glutathione transferase (GST) - tag, intein with an affinity chitin binding tag or maltose binding protein (MBP) tag.
  • These protein tags can be located at the N-, C-terminal and / or internally.
  • all of the polypeptides according to the invention or parts thereof may have been produced under cell-free conditions, e.g. B. by synthesis or by in v tro translation.
  • all or part of the polypeptide can be synthesized using classic synthesis (Merrifield technique).
  • Parts of the polypeptides according to the invention are particularly suitable for obtaining antisera, with the aid of which suitable gene expression banks can be searched in order to arrive at further functional variants of the polypeptide according to the invention.
  • the invention also relates to polypeptides which are derivatives of an antibody with specificity for hdm2-81-88 peptide, in particular presented in the context of HLA-A2.1.
  • the invention comprises retro-inverse peptides or pseudopeptides according to the polypeptide sequence of SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8 or functional variants or parts thereof. These peptides have -NH-CO bonds instead of the -CO-NH peptide bonds.
  • a nucleic acid according to the invention which comprises a DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid) or p-NA (pyranosyl nucleic acid).
  • the nucleic acid can be characterized in that the sequence of the nucleic acid has at least one intron and / or a polyA sequence. It can also be in the form of its antisense sequence.
  • a double-stranded DNA is generally preferred for the expression of the gene in question, the DNA region coding for the polypeptide being particularly preferred.
  • This area begins with the first start codon (ATG) lying in a Kozak consensus sequence (Kozak, 1987, Nucleic. Acids Res. 15: 8125-48) until the next stop codon (TAG, TGA or TAA), the is in the same reading frame as the ATG.
  • ATG first start codon
  • TGA Nucleic. Acids Res. 15: 8125-48
  • TAA next stop codon
  • Another use of the nucleic acid sequences according to the invention is the construction of anti-sense oligonucleotides (Zheng and Kemeny, 1995, Clin. Exp. Immunol. 100: 380-2) and / or ribozymes (Amarzguioui, et al. 1998, Cell. Mol Life Sci.
  • oligonucleotides With anti-sense oligonucleotides, the stability of the nucleic acid according to the invention can be reduced and / or the translation of the nucleic acid according to the invention can be inhibited. For example, the expression of the corresponding genes in cells can be reduced both in vivo and in vitro. Oligonucleotides can therefore be used as therapeutic agents.
  • This strategy is also suitable, for example, for skin, epidermal and dermal cells, in particular if the antisense oligonucleotides are complexed with liposomes (Smyth et al., 1997, J. Invest. Dermatol. 108: 523-6; White et al. , 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 699-705).
  • a single-stranded DNA or RNA is preferred for use as a probe or as an "antisense" oligonucleotide.
  • nucleic acid according to the invention can be chemically determined using the protein sequences described in SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8 using the genetic code z. B. can be synthesized by the phosphotriester method (see, for example, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Revievs, 90, 543-584).
  • oligonucleotides are rapidly degraded by endo- or exonucleases, in particular by DNases and RNases occurring in the cell. It is therefore advantageous to modify the nucleic acid in order to stabilize it against degradation so that a high concentration of the nucleic acid is maintained in the cell over a long period of time (WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98 / 37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116). Typically, such stabilization can be obtained by introducing one or more internucleotide phosphor groups or by introducing one or more non-phosphor internucleotides.
  • Suitable modified internucleotides are summarized in Uhlmann and Peymann (1990 Chem. Rev. 90, 544) (WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98/37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116).
  • Modified internucleotide phosphate residues and / or non-phosphorus bridges in a nucleic acid which can be used in one of the uses according to the invention contain, for example, methylphosphonate, phosphorothioate, phosphoramidate, phosphorodithioate, phosphate ester, while non-phosphorus internucleotide analogs, for example siloxane bridges, carbonate bridges , Carboxymethyl ester, acetamidate bridges and / or thioether bridges. It is also intended that this modification improve the shelf life of a pharmaceutical composition that can be used in one of the uses of the invention.
  • Another aspect of the present invention relates to a vector, preferably in the form of a plasmid, shuttle vector, phagemid, cosmid, expression vector, adenoviral vector, retroviral vector (Miller, et al. "Improved retroviral vectors for gene transfer and expression", BioTechniques Vol. 7, No. 9, p 980, 1989) and / or gene therapy-effective vector which contains a nucleic acid according to the invention.
  • a vector preferably in the form of a plasmid, shuttle vector, phagemid, cosmid, expression vector, adenoviral vector, retroviral vector (Miller, et al. "Improved retroviral vectors for gene transfer and expression", BioTechniques Vol. 7, No. 9, p 980, 1989) and / or gene therapy-effective vector which contains a nucleic acid according to the invention.
  • the nucleic acid according to the invention can preferably be contained in a vector in an expression vector or a gene therapy vector.
  • the gene-therapeutic vector T cell preferably contains specific regulatory sequences which are functionally linked to the nucleic acid according to the invention.
  • the expression vectors can be prokaryotic or eukaryotic expression vectors. Examples of prokaryotic expression vectors for expression in E. coli are, for example, the vectors pGEM or pUC derivatives and for eukaryotic expression vectors for expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. the vectors p426Met25 or p426GALl (Mumberg et al. (1994) Nucl.
  • Bac lovirus vectors as disclosed in EP-B1-0 127 839 or EP-B1-0 549 721, and for expression in mammalian cells z.
  • the expression vectors also contain suitable promoters for the respective host cell, e.g. B. the trp promoter for expression in E. coli (see e.g. EP-B1-0 154 133), the Met 25, GAL 1 or ADH2 promoter for expression in yeasts (Radorel et al. (1983 ), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682; Mumberg, supra), the baculovirus polyhedrin promoter for expression in insect cells (see, for example, 13. EP-B1-0 127 839).
  • promoters are suitable for expression in mammalian cells, which allow constitutive, regulatable, tissue-specific, cell cycle-specific or metabolically specific expression in eukaryotic cells.
  • Controllable elements according to the present invention are promoters, activator sequences, enhancers, silencers and / or repressor sequences.
  • suitable regulatable elements which enable constitutive expression in eukaryotes are promoters which are recognized by the RNA polymerase III or viral promoters, CMV enhancers, CMV promoters, CMV-LTR hybrids, SV40 promoters or LTR promoters, e.g. B. from MMTV (mouse mammary tumor virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232) and other viral promoter and activator sequences derived from, for example, HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV or HIV.
  • regulatable element which enables regulatable expression in eukaryotes is the tetracycline operator in combination with a corresponding repressor (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
  • regulatable elements which enable cell cycle-specific expression in eukaryotes are promoters of the following genes: cdc25, cyclin A, cyclin E, cdc2, E2F, B-myb or DHFR (Zwicker J. and Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6).
  • regulatable elements which enable metabolically specific expression in eukaryotes are promoters which are regulated by hypoxia, by glucose deficiency, by phosphate concentration or by heat shock.
  • the vector of the invention can be used to transfect a host cell, which is preferably a T cell.
  • a host cell is particularly preferred which is characterized in that it expresses a polypeptide or fusion protein according to the invention on its surface.
  • the nucleic acid can be present as a plasmid, as part of a viral or non-viral vector or particle.
  • viral vectors or particles baculoviruses, vaccinia viruses, retroviruses, adenoviruses, adenoas-associated viruses and herpes viruses.
  • non-viral carriers virosomes, liposomes, cationic lipids or poly-lysine-conjugated DNA.
  • virus vectors for example adevirus vectors or retroviral vectors (Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al., 1998, Mol. Cell. 2: 549-58; Weijtens et al. "A retroviral vector system, 'STITCH'; in combination with an optimized single chain antibody chimeric receptor gene structure allows efficient gene transduction and expression in human T-lymphocytes", Gene Therapy (1998) 5,1995-1203) ,
  • a preferred mechanism for expression of the polypeptides according to the invention in vivo is viral gene transfer, in particular with the aid of retroviral particles. These are preferably used to provide corresponding target cells, preferably T-lymphocytes, of the patient ex vivo with the genes or nucleotide sequences coding for the inventive polypeptides by transduction. The target cells can then be reinfused into the patient in the sense of an adoptive cell transfer in order to take over tumorizide and / or immunomodulating effector functions with the de novo inserted specificity.
  • the viral vectors frequently used for the transfer of genes are predominantly retroviral, lentiviral, adenoviral and adeno-associated viral vectors. These are circular nucleotide sequences derived from natural viruses, in which at least the viral structural protein-encoding genes are exchanged for the construct to be transferred.
  • Retroviral vector systems create the prerequisites for long-term expression of the transgene through the stable but non-directional integration into the host genome. Younger generation vectors have no irrelevant and potentially immunogenic proteins, furthermore there is no pre-existing immunity of the recipient against the vector.
  • Retroviruses contain an RNA genome that is packaged in a lipid shell that consists of parts of the host cell membrane and virus proteins. To express viral genes, the RNA genome is reverse transcribed and integrated with the enzyme integrase in the target cell DNA. This can then be transcribed and translated by the infected cell, creating viral components that combine to form retroviruses. RNS is only then inserted into the newly created viruses.
  • the retrovirus genome has three essential genes: gag, which codes for viral structural proteins, so-called group-specific antigens, pol for enzymes such as reverse transcriptase and integrase, and env for the envelope protein, which is responsible for the binding of the host-specific receptor.
  • gag codes for viral structural proteins
  • group-specific antigens pol for enzymes such as reverse transcriptase and integrase
  • env for the envelope protein, which is responsible for the binding of the host-specific receptor.
  • packaging cell lines which have been additionally equipped with the gag / pol-coding genes and express them "in trans” and thus complement the formation of replication-incompetent (ie gag / pol-deleted) transgenic virus particles.
  • An alternative is the cotransfection of the essential virus genes, whereby only the vector containing the transgene carries the packaging signal.
  • the separation of these genes on the one hand enables any combination of the gal / pol reading frame with e «v reading frames obtained from different strains, which results in pseudotypes with changed host tropism, and on the other hand the formation replication-competent viruses within packaging cells can be drastically reduced.
  • the coat protein derived from "gibbon ape leukemia virus” (GALV), which is used in the "stitch” or “bullet” vector system, is able to transduce human cells and is established in the packaging cell line PG13 with an amphotropic host region (Miller et al., 1991)
  • the security is increased by selective deletion of non-essential virus sequences to prevent homologous recombination and thus the production of replication-competent particles.
  • New, non-viral vectors consist of autonomous, self-integrating DNA sequences, the transposons, which are e.g. liposomal transfection were introduced into the host cell and were successfully used for the first time to express human transgenes in mammalian cells (Yant et al., 2000).
  • Vectors with gene therapy effects can also be obtained by complexing the nucleic acid according to the invention with liposomes, since a very high transfection efficiency, in particular of skin cells, can be achieved with this (Alexander and Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2279 -85).
  • Excipients that increase the transfer of nucleic acids into the cell can be, for example, proteins or peptides that are bound to DNA or synthetic peptide-DNA molecules that enable the transport of the nucleic acid into the nucleus of the cell (Schwartz et al. ( 1999) Gene Therapy 6, 282; Branden et al. (1999) Nature Biotech. 17, 784).
  • Auxiliaries also include molecules that enable the release of nucleic acids into the cytoplasm of the cell (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem. 8, 213) or for example liposomes (Uhlmann and Peymann (1990) supra).
  • Another particularly suitable form of gene therapy vectors can be obtained by applying the nucleic acid according to the invention to gold particles and shooting them into tissue, preferably into the skin, or cells using the so-called “gene gun” (Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112: 775-81).
  • the part of the nucleic acid which codes for the polypeptide has one or more non-coding sequences including intron sequences, preferably between the promoter and the start codon of the polypeptide, and / or a polyA sequence , in particular the naturally occurring polyA sequence or an SV40 virus polyA sequence, especially at the 3 'end of the gene, since this can stabilize the mRNA (Jackson, RJ (1993) Cell 74, 9-14 and Palmiter, RD et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 478-482).
  • Another object of the present invention is a host cell, in particular a T cell, which is transformed with a vector according to the invention or another gene construct according to the invention.
  • Host cells can be both prokaryotic and eukaryotic cells, examples of prokaryotic host cells are E. coli and Saccharomyces cerevisiae or insect cells for eukaryotic cells.
  • a particularly preferred transformed host cell is a transgenic T precursor cell or a stem cell, which is characterized in that it comprises a gene construct according to the invention or an expression cassette according to the invention.
  • Methods for transforming or transducing host cells and / or stem cells are well known to those skilled in the art and include, for example, electroporation or microinjection.
  • a particularly preferred transformed host cell is a patient's own T cell which, after removal, is transfected with a gene construct according to the invention.
  • Host cells according to the invention can in particular be obtained by removing one or more cells, preferably T cells, in particular CD8 + T cells, from the patient, which are then transfected or transduced ex vivo with one or more genetic constructs according to the invention in order to to obtain host cells according to the invention.
  • the specific T cells generated ex vivo can then be re-implanted in the patient.
  • the process is thus similar to that in Darcy et al. ("Redirected perforin-dependent lysis of colon carcinoma by ex vivo genetically engineered CTL" J. Immunol., 2000. 164: 3705-3712) described methods using scFv anti-CEA receptor transduced ZTL, perforin and ⁇ -IFN.
  • Another aspect of the invention relates to a method for identifying hdm2 protein-specific antigens, which is characterized in that hdm2-presenting tumor cells or fractions thereof are brought together with a host cell according to the invention under conditions in which the tumor cells or fractions thereof are only lysed when the tumor presents the hdm2 protein-specific antigen for which the expressed polypeptide or fusion protein is specific.
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing an antibody, preferably a polyclonal or monoclonal antibody for diagnosing and monitoring diseases associated with hdm2 protein or for identifying pharmacologically active substances, in which an antibody-producing organism with a polypeptide according to the invention or functional equivalents thereof or parts thereof are immunized with at least 6 amino acids, preferably with at least 8 amino acids, in particular with at least 12 amino acids, or are vaccinated with a nucleic acid encoding a polypeptide according to the invention.
  • the method is carried out according to methods generally known to the person skilled in the art by immunizing a mammal, for example a rabbit, with the polypeptide according to the invention or the parts thereof, optionally in the presence of e.g. B. incomplete Freund's adjuvant and / or aluminum hydroxide gels (see e.g. Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349).
  • B. incomplete Freund's adjuvant and / or aluminum hydroxide gels see e.g. Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349.
  • the polyclonal antibodies produced in the animal due to an immunological reaction can then be easily isolated from the blood by generally known methods and z. B. clean over column chromatography.
  • Monoclonal antibodies can be produced, for example, by the known method from Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299
  • Another object of the present invention is an antibody for the diagnosis and / or treatment of diseases associated with hdm2 protein or for the identification of pharmacologically active substances, which is directed against a polypeptide according to the invention and reacts specifically with the polypeptides according to the invention, the above-mentioned parts of the polypeptide are either themselves immunogenic or by coupling to suitable carriers, such as. B. bovine serum albumin can be increased in their immunogenicity.
  • This antibody is either polyclonal or monoclonal, a monoclonal antibody is preferred.
  • the term antibody also means genetically engineered and, where appropriate, modified antibodies or antigen-binding parts thereof, such as, for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, multifunctional antibodies, monovalent or oligovalent antibodies, bi- or oligo-specific antibodies, Single-stranded antibodies, F (ab) or F (ab) 2 fragments (see, for example, EP-B1-0 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213, WO 98/24884).
  • the antibodies of the invention can be used to diagnose and / or treat with hdm2 protein associated diseases or for the identification of pharmacologically active substances.
  • the present invention further relates to a method for producing a medicament for the treatment of diseases associated with hdm2 protein, characterized in that at least one nucleic acid, at least one polypeptide, at least one host cell or at least one antibody according to one of the preceding claims together with suitable additional and auxiliary materials is combined.
  • the present invention further relates to a medicament produced by this method for the treatment of diseases associated with hdm2 protein which contains at least one nucleic acid, at least one polypeptide or at least one antibody according to the present invention, optionally together with suitable additives and auxiliaries.
  • the invention further relates to the use of this medicament for the treatment of diseases associated with hdm2 protein.
  • the therapy of diseases associated with hdm2 protein can be carried out in a conventional manner, for example by infusions or injections, which contain the medicaments according to the invention.
  • the medicaments according to the invention can furthermore optionally be administered in the form of liposome complexes or gold particle complexes.
  • Treatment by means of the medicaments according to the invention can, however, also take place via oral dosage forms, such as tablets or capsules, via the mucous membranes, for example the nose or the oral cavity, or in the form of disposers implanted under the skin.
  • TTS are known for example from EP 0 944 398 AI, EP 0 916 336 AI, EP 0 889 723 AI or EP 0 852 493 AI.
  • the (poly) peptides according to the invention and their derivatives can also be used for the active and / or passive immunization of patients with diseases, in particular tumor diseases, which are associated with hdm2, in order to achieve the induction, generation and increase of hdm-specific ZTL and specifically kill the tumor and leukemia cells of the patients concerned.
  • diseases include, for example, solid tumor diseases, lymphohematopoietic neoplasms, malignant hematological diseases, also in the form of multiple myeloma (or plastocytoma), histiocytic lymphoma and a CML blast spurt.
  • one or more cells are removed from the patient and are then transduced or transfected ex vivo with one or more genetic constructs according to the invention.
  • the specific T cells generated ex vivo can then be re-implanted in the patient.
  • the process is thus similar to that in Darcy et al. ("Redirected perforin-dependent lysis of colon carcinoma by ex vivo genetically engineered CTL" J. Immunol., 2000, 164: 3705-3712) described immunotherapeutic methods in colon carcinomas using scFv anti-CEA receptor-transduced CTL, perforin and ⁇ -IFN.
  • the present invention further relates to a method for producing a test for finding functional interactors in connection with diseases associated with hdm2 protein, which is characterized in that at least one nucleic acid, at least one polypeptide or at least one antibody according to the invention together with suitable additives and Auxiliary materials are combined.
  • the term "functional interactors" within the meaning of the present invention is to be understood as meaning all those molecules, compounds and / or compositions and substance mixtures which are suitable for use with the nucleic acids, polypeptides or antibodies according to the invention, optionally together with suitable additives and auxiliaries Can interact.
  • Possible interactors are simple chemical organic or inorganic molecules or compounds, but can also include peptides, proteins or complexes thereof.
  • the functional interactors can influence the function (s) of the nucleic acids, polypeptides or antibodies in vivo or in vitro or can only bind to the nucleic acids, polypeptides or antibodies according to the invention or have other interactions with them covalently or non-covalently.
  • the invention further comprises a test according to the invention for identifying functional interactors in connection with diseases associated with hdm2 protein, which contains at least one nucleic acid, at least one polypeptide or at least one antibody according to the present invention, optionally together with suitable additives and auxiliaries.
  • a test according to the invention for identifying functional interactors in connection with diseases associated with hdm2 protein, which contains at least one nucleic acid, at least one polypeptide or at least one antibody according to the present invention, optionally together with suitable additives and auxiliaries.
  • the pathological behavior of the cells can be mimicked in vitro and substances can be sought that match normal behavior restore the cells and have therapeutic potential.
  • this test system can be used for the screening of substances which inhibit an interaction between the polypeptide according to the invention and a functional interactor.
  • the present invention also relates to a medicament for the indication and therapy of diseases associated with hdm2 protein, which contains a nucleic acid or a polypeptide according to the invention and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries, and a method for producing such a medicament for the treatment of hdm2 protein-associated diseases, in which a nucleic acid or a polypeptide according to the invention is formulated with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Suitable therapeutic agents and / or prophylactic agents are in particular vaccines, recombinant particles or injections or infusion solutions which contain as active ingredient (a) the TCR receptor according to the invention polypeptide and / or its derivatives and / or (b) a nucleic acid according to the invention and / or ( c) T lymphocytes produced in vitro or ex vivo, which contain a TZR specifically directed against hdm2.
  • a drug and / or recombinant particle which contains the nucleic acid according to the invention in naked form or in the form of one of the gene therapy-active vectors described above or in a form complexed with liposomes or gold particles is particularly suitable for gene therapy use in humans.
  • the pharmaceutical carrier is, for example, a physiological buffer solution, preferably with a pH of approximately 6.0-8.0, preferably approximately 6.8-7.8. In particular of approximately 7.4 and / or an osmolarity of approximately 200-400 milliosmol / liter, preferably of approximately 290-310 milliosmol / liter.
  • the pharmaceutical carrier can contain suitable stabilizers, such as e.g. B. nuclease inhibitors, preferably complexing agents such as EDTA and / or other auxiliaries known to those skilled in the art.
  • the invention further relates to a method for producing a polypeptide for the diagnosis and / or treatment of diseases associated with hdm2 protein or for the identification of pharmacologically active substances in a suitable host cell, which is characterized in that a nucleic acid according to the invention is appropriately expressed.
  • the polypeptide is thus produced, for example, by expression of the nucleic acid according to the invention in a suitable expression system, as already described above, using methods which are generally known to the person skilled in the art.
  • Suitable host cells are, for example, the E. coli strains DHS, HB101 or BL21, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae, insect cell lines, eg. B. from Spodoptera frugiperda, or the animal cells COS, Vero, 293, HaCaT, and HeLa, all of which are commonly available.
  • a diagnostic agent according to the invention for monitoring therapy contains the polypeptide according to the invention or the immunologically active parts thereof described in more detail above.
  • the polypeptide or parts thereof which are preferably attached to a solid phase, e.g. B. from nitrocellulose or nylon, can for example with the body fluid to be examined, for. As blood, are brought into contact in vitro in order to be able to react with autoimmune antibodies, for example.
  • the antibody-peptide complex can then be detected, for example, using labeled anti-human IgG or anti-human IgM antibodies.
  • the label is, for example, an enzyme, such as peroxidase, that catalyzes a color reaction. The presence and the amount of autoimmune antibodies present can thus be easily and quickly detected via the color reaction.
  • Another diagnostic agent for therapy monitoring contains the antibodies according to the invention themselves.
  • a tissue sample can be easily and quickly examined to determine whether the relevant polypeptide is present in an increased amount, thereby indicating that there is an hdm2 protein to get related diseases.
  • the antibodies according to the invention are labeled, for example, with an enzyme, as already described above. The specific antibody-peptide complex can thus be detected easily and just as quickly via an enzymatic color reaction.
  • Another diagnostic agent according to the invention comprises a probe, preferably a DNA probe, and / or primer.
  • a probe preferably a DNA probe, and / or primer.
  • DNA or RNA fragments with a length of approx. 100-1000 nucleotides, preferably with a length of approx. 200-500 nucleotides, in particular with a length of approx. 300-400 nucleotides, the sequence of which from the polypeptides are suitable can be derived according to SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8 of the sequence listing.
  • the derived nucleic acid sequences can be used to synthesize oligonucleotides which are suitable as primers for a polymerase chain reaction.
  • Suitable fragments are, for example, DNA fragments with a length of approx. 10-100 nucleotides, preferably with a length of approx. 15 to 50 nucleotides, in particular with a length of 20-30 nucleotides, whose sequence from the polypeptides according to SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8 of the sequence listing.
  • coding nucleic acid refers to a DNA sequence that codes for an isolatable bioactive polypeptide according to the invention or a precursor.
  • the polypeptide can be encoded by a full-length sequence or any part of the coding sequence, as long as the specific, for example enzymatic, activity is retained.
  • the term “functional variants” denotes all DNA sequences that are complementary to a DNA sequence that hybridize to a derived reference sequence or parts thereof, in particular the hypervariable V (D) JC region, under stringent conditions have similar or identical activity to the corresponding polypeptide according to the invention.
  • Stringent hybridization conditions are to be understood as those conditions in which hybridization takes place at 60 ° C. in 2.5 ⁇ SSC buffer, followed by several washing steps at 37 ° C. in a lower buffer concentration and remains stable.
  • the term “functional variants” in the sense of the present invention means polypeptides that are functionally related to the polypeptides according to the invention, ie. H. Have structural features of the polypeptides.
  • Examples of functional variants are the corresponding polypeptides, which are derived from organisms other than the mouse, that is to say humans, or, preferably, from non-human mammals such as, for. B. monkeys, pigs and rats.
  • Other examples of functional variants are polypeptides which are encoded by different alleles of the gene, in different individuals or in different organs of an organism.
  • Functional TCR variants which recognize the identical epitope of the hdm2 polypeptide and which trigger a specific T cell response are in particular also covered by the present invention.
  • this also includes polypeptides which have a sequence homology, in particular a sequence identity, of approximately 70%, preferably approximately 80%, in particular approximately 90%, in particular approximately 95% of the polypeptide with the amino acid sequence according to one of the SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 8 and / or to DNA sequences derived from the peptide sequences.
  • sequence homology in particular a sequence identity
  • these also include additions, inversions, substitutions, deletions, insertions or chemical / physical modifications and / or exchanges or parts of the polypeptide in the range from about 1-60, preferably from about 1-30, in particular from about 1-15, especially from about 1-5 amino acids.
  • the first amino acid methionine may be absent without significantly changing the function of the polypeptide.
  • SEQ ID No. 1 polypeptide of the wild-type mouse mouse ⁇ TZR (muv ⁇ -muc ⁇ )
  • SEQ ID No. 2 polypeptide of the wild-type mouse mouse ßTZR (muvß-mucß)
  • SEQ ID No. 3 polypeptide of a chimeric partially humanized TZR gene (muv ⁇ -huc ⁇ )
  • SEQ ID No. 4 polypeptide of a chimeric partially humanized TZR gene (muvß-hucß)
  • SEQ ID No. 5 polypeptide of a single chain TZR muv ⁇ -Li-muv ⁇ -mucß
  • SEQ ID No. 6 polypeptide of a single chain TZR muvß-Li-muvß-muc ⁇
  • SEQ ID No. 7 polypeptide of a double chain TZR in fusion with human CD3 ⁇ chain muv ⁇ -huc ⁇ -huCD3 ⁇ ,
  • SEQ ID No. 8 polypeptide of a double chain TZR in fusion with human CD3 ⁇ chain muvß-hucß-huCD3 ⁇ ,
  • SEQ. ID No. 20 Primer for_NcoI_aTCR_5b; phosphorylated at the 5 'end,
  • SEQ. ID No. 22 Primer for_NcoI_bTCR_5b; phosphorylated at the 5 'end,
  • SEQ. ID No. 34 Primer T7_rev, SEQ. ID No. 35 primer rev_hZeta_BamHI_4, SEQ. ID No. 36 primer rev_huca-hu_tm_Zeta, SEQ. ID No. 37 primer rev_hucb-hu_tm_Zeta, SEQ. ID no. 38: polynucleotide of the wild-type mouse ⁇ TZR gene (muv ⁇ -muc ⁇ ) from SEQ ID no.
  • SEQ. ID no. 39 polynucleotide of the wild-type mouse mouse ßTZR (muvß-mucß) from SEQ ID no.
  • SEQ. ID No. 40 Polynucleotide of the chimeric partially humanized TZR gene (muv ⁇ -huc ⁇ ) from SEQ ID No. 3
  • SEQ. ID No. 41 Polynucleotide of the chimeric partially humanized TZR gene (muvß-hucß) from SEQ ID No. 4
  • SEQ. ID No. 42 polynucleotide of the single-chain TZR muv ⁇ -Li-muvß-mucß from SEQ ID No.
  • SEQ. ID no. 43 polynucleotide of the single chain TCR muvß-Li-muv ⁇ -muc ⁇ from SEQ ID no.
  • SEQ. ID No. 44 polynucleotide of the double chain TZR in fusion with human CD3 ⁇ chain muv ⁇ -huc ⁇ -huCD3 ⁇ from SEQ ID No. 7; and SEQ. ID No. 45: polynucleotide of the double chain TZR in fusion with human CD3 ⁇ chain muvß-hucß-huCD3 ⁇ from SEQ ID No. 8.
  • Figure 1 shows a FACS analysis (see 1.4) using a Vß6-specific FITC-labeled antibody (Pharmingen). Both the murine T cell line and the resulting clone 3 were checked.
  • Anti-TCR V ⁇ 2 - FITC (BD) served as the isotype control, and the anti-pan ßTZR - FITC - antibody (BD) as positive control.
  • the influenza matrix protein-specific T cell clone 58 served as a negative control.
  • FIG. 2 shows a v6-specific antibody blockade of the murine T cell clone 3 in the cytotoxic 51 chromium release test (see 1.4).
  • the blockade was evaluated depending on the dose.
  • An anti-V ⁇ 3.2 antibody (BD) and, on the other hand, the p53 - 264-272-specific T cell clone 46 which served as a negative control served as negative control recognizing p53 peptide was cross-checked.
  • the target cell was the TAP-deficient cell line T2, which was loaded exogenously with 10 "8 M peptide.
  • FIG. 3 shows examples of the design of hdm2-specific constructs at the DNA level (see 2.), where muV ⁇ / ⁇ murine variable ⁇ / ⁇ gene segment; muC ⁇ / ß murine constant ⁇ / ß gene segment; huC ⁇ / ß human constant ⁇ / ß gene segment; TM: gene segment coding for transmembrane; Li: gene segment coding for (GGGGS) 3 motif and HuCD3 ⁇ human CD3 ⁇ chain gene segment. The restriction sites relevant for the cloning are indicated.
  • FIG. 4 shows the same examples of the design of hdm2-specific constructs at the protein level (see 2.), where muV ⁇ / ⁇ murine variable ⁇ / ⁇ domain; muC ⁇ / ⁇ murine constant ⁇ / ⁇ domain; huC ⁇ / ß human constant ⁇ / ß domain; SP: murine wild-type signal peptide; TM: transmembrane; Li Linker with (GGGGS) motif and hu ⁇ : humane CD3 ⁇ chain with 3 consecutive IT AM motifs means. The numbers derived from the bacterial clones are given for the individual chains.
  • FIG. 5 shows the polylinker of the construct muv ⁇ -Li-muvß-mucß (see 2.3).
  • the polylinker was ultimately inserted into the resulting construct via Kpn I and Dra III.
  • Figure 6 shows the polylinker of the construct muvß-Li-muv ⁇ -muc ⁇ (see 2.3).
  • the polylinker was ultimately inserted into the resulting construct via Sca I and Bsg I.
  • Figure 7 shows the fusion site of the chimeric double chain TZR in fusion to the human CD3 ⁇ chain muv ⁇ -huc ⁇ -huCD3 ⁇ (see 2.4).
  • the extracytosolic cysteine which dimerizes via a disulfide bridge, is given with a position relative to the starting methionine.
  • Figure 8 shows the fusion site of the chimeric double chain TZR in fusion to the human CD3 ⁇ chain muvß-hucß-huCD3 ⁇ (see 2.4).
  • the extracytosolic cysteine which dimerizes via a disulfide bridge, is given with a position relative to the starting methionine.
  • FIG. 9 shows the "fluorescence activated cell sorting" (FACS) analysis of the constructs described under 2.) after retroviral transduction. Examples of average transduction efficiencies for OKT3-activated PBL cultures are shown 6 days after transduction. on. These are in the range of 10-25% of the inserted CD3 + lymphocytes. A transfection / transduction approach with the empty retroviral vector pBullet served as a negative control.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • FIG. 10 to 12 show peptide titrations (see 3.4.1) wherein T2 target cells were loaded exogenously with the hdm2-81-88 peptide in a concentration series of 1 * 10 " M to 1 * 10 " M.
  • the murine T cell clone 3 hdm2-81-88 (synonym: P2) of the huCD8 x A2K b - transgenic mouse served as a reference.
  • the 51 chromium release tests shown were carried out with transduced PBLs, which were enriched for vß6-directed magnetic cell sorting (Miltenyi-Biotec) to over 90% vß6 + T cells.
  • nfTCR non-functional single chain T cell receptor
  • FIGS. 13 to 15 show the detection of malignantly transformed Zeil lines.
  • the target cells chosen were HLA-A2 + .
  • the murine T cell clone 3 hdm2- 81-88 (synonym: P2) of the huCD8 x A2K b - transgenic mouse served as reference.
  • the 51 chromium release tests shown were carried out with transduced PBLs which were enriched for vß6-directed magnetic cell sorting (Miltenyi-Biotec) to over 90% vß6 + T cells.
  • nfTCR non-functional single chain T cell receptor
  • the genes of the T cell receptors ⁇ TZR and ßTZR from a double-transgenic mouse huCD8 x A2K b were prepared, which mediate a HLA-A2.1 restricted and hdm2 protein / 81-88 peptide-specific T cell response .
  • the genes obtained were retrovirally introduced as wild type (WT) or modified constructs into human peripheral blood lymphocytes (PBLs) and the HLA-restricted antigen recognition was functionally checked by CD8-mediated cytotoxic lysis of various cell lines in the 51 chromium release test. 1.) Obtaining the genes coding for the ⁇ and ⁇ chains of the T cell receptors 1.1) Preparation of the cytoplasmic RNA
  • the cytoplasmic RNA was isolated in order to selectively separate the still unprocessed, intron-containing RNA, DNA fragments and ribosomal RNA, which are mainly located in the cell nucleus, and to achieve an enrichment of the desired "messenger" RNA.
  • the protocol and materials largely correspond with small modifications to the "Rneasy Mini Kit” from QIAGEN: for one preparation, an average of 50 * 10 6 murine cells of the hdm2 / 81-88 - specific T cell clone 3 from the culture dishes of a "24- well plate "combined and washed in RPMI 1640 (Biowhittaker) serum-free.
  • the cells were aliquoted under RNase-free conditions to 12.5 * 10 6 cells per incubation tube and incubated in cell membrane lysis buffer (4 ° C.-cooled) for 20 min on ice:
  • the mildly solubilized and aliquoted cells were centrifuged at 300 g / 2 '(minutes) / 4 ° C and the supernatant was removed. 600 ⁇ l of a ⁇ -mercaptoethanol (MSH) -containing (1.45 mM) “RLT” buffer was added, mixed well and 430 ⁇ l of 96% ETOH were added with mixing. The solution per aliquot was placed on a silica minispin column and centrifuged for 15 "(seconds) at 10,000 rpm (revolutions per minute) in an Eppendorf table joint.
  • MSH ⁇ -mercaptoethanol
  • the TZR-encoding RNA had to be specifically rewritten and amplified in DNA before it could be cloned.
  • the RT-PCR was used methodically, which is implemented in the "Titan One Tube RT-PCR System” kit from Röche (1888 382).
  • the "one-step protocol” was chosen, in which the reverse transcription is followed by the polymerase chain reaction without further intervention.
  • the enzymes used were AMV - reverse transcriptase and a mixture of Thermus Aquaticus / Pwo - thermostable polymerase ("Expand TM High fidelity" enzyme mix), which were used in a universal reaction buffer.
  • An artificial gene segment that codes for a murine TCR signal peptide should originally be connected upstream of synthetic oligonucleotides to ensure that the protein synthesized in vivo is directed into the lumen of the endoplasmic reticulum.
  • a primer (rev_bTCR_c4; SeqlD No. 10) which reverses within the constant gene segment was chosen in order to account for the additional variance of the two possible c-gene segments (c-ßl or c-ß2) of the ß-chain, which have some base differences at their 3rd Have 'end to escape.
  • the oligonucleotides of the "nested PCR” also had sequences of the restriction sites for EcoRI or Ascl at its 5 'end.
  • the primer hybridizing in the forward direction (for_ ⁇ co_bTCR_v5; SeqlD No. 11) of the nested "PCR” was congruent in the sequence of the v gene segment with the degenerate RT-PCR primer, whereas the primer hybridizing in the reverse direction complementary to the c gene segment (rev_Asc_bTCR_c6; No. 12) was more than 120 bases offset inwards relative to the reverse 1st primer of the TZR reading frame, so that it is exactly a "3'- located nested PCR ".
  • the complete c gene segment was determined using a reverse degenerate primer (rev_Asc_bTCR_c2; SeqlD No. 14 ) to detect the two potentially possible cßl / cß2 gene segments and a primer (for_Eco_bTCR_c2; SeqlD No.
  • the pipetting scheme and the PCR protocol of the RT-PCR basically corresponded to the method described by the Röche company.
  • the subsequent "nested PCR” was carried out analogously, with the components RNase inhibitor and DTT being replaced by autoclaved water. Instead of the 2 ⁇ l R ⁇ A (0.1-1 ⁇ g) 2 ⁇ l of the amplificate of the RT-PCR was used.
  • the technical requirements of the PCR device made it possible to simultaneously test different hybridization temperatures in the second step of the classic PCR cycle in a temperature gradient from 35 ° C - 55 ° C at intervals for 5 selected temperatures of 36 ° C, 39 ° C, 44 ° C, 52 ° C and 56 ° C. For the higher temperatures of 44-56 ° C singular bands of the desired length could be achieved, the intensity of which was increased by the 2nd PCR and were sufficient to be inserted in vectors.
  • the sequencing of 8 bacterial clones resulted in some randomized base changes based on the error rate of the Expand TM enzyme mix, which was comparable to other polymerases.
  • the selected clones also all carried the sequence information for the signal peptide and a short region of the non-codogenic, 5'-untranslated region of less than 100 bases, so that it could be assumed that the v gene segment-specific degenerate primer was one recognized similar sequence upstream and provided the additional sequence of the wild-type signal peptide.
  • RACE-PCR was the strategy leading to the goal: the degenerate oligonucleotide designed analogously to the approach described above produced only the codogenic sequence of one due to a reading frame shift in the CDR3 loop of non-functional T cell receptor.
  • the allele exclusion is not valid to the same extent as for the ß-chain of the TZR.
  • the RACE technology is established in the system of the same name from Röche (1 734 792) and must be supplemented with ⁇ TZR gene-specific oligonucleotides: for this purpose, the 5'-localized variance is part of the "5'-RACE-PCR" of the codogenic sequence by generating a known, short adenine oligonucleotide sequence at the 3 'end of the reverse transcribed cDNA sequence by means of the terminal transferase, which subsequently acts as a recognition sequence for a 5' localized PCR primer ,
  • the reverse PCR primers lie within the invariant sequence that codes for the constant domain.
  • the primer rev_Asc_aTCR_cl (SeqlD No.
  • the PCR primers had to be such that the singular Ncol site was in the overlap area of the amplified gene sections.
  • the truncated PCR amplicon containing the v ⁇ gene segment was cloned via 5'Saä and 3 'Ascl in p ⁇ EB193 (New England Biolabs), whereas the constant gene segment was inserted into EcoN and Ascl in pN ⁇ B193.
  • the amplificates were cloned classically (J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning.
  • the multi-step protocol is largely based on the commercial protocol with the aid of a programmable PCR device: the reverse transcription, the transferase reaction and the subsequent 2-step "nested PCR” were carried out in the "MasterCycler” PCR device from Eppendorf.
  • the gradient technology was used in the hybridization step for the temperatures 39 ° C, 44 ° C, 52 ° C and 56 ° C.
  • the R / w polymerase (Stratagene) was chosen because at this point it was considered to be the enzyme with the lowest error incorporation rate.
  • the 1st PCR already showed a weak band of the expected size of 0.9 kB in the Entire temperature spectrum, the intensities of which could be amplified by the subsequent PCR and, in addition, "primer dimers" which occurred could be thinned out.
  • the amplificate was shortened by 70 bp according to the theoretical position of the offset hybridizing primers.
  • a double band of 100 bp in length difference appeared in the agarose gel, which indicated the presence of the functional and the non-functional ⁇ chain.
  • the bands were cut out together in the preparative gel in order to record both amplificates in the subsequent cloning. 7 clones were found which encoded a functional reading frame and had identical sequences.
  • An influenza matrix protein (FluMl 58-66) specific T cell clone served as a negative control.
  • FACS analysis Figure 1 using a Vß6-specific FITC-labeled antibody (Pharmingen). Both the murine T cell line and the resulting clone 3 were checked.
  • FITC-labeled antibody was used as a positive control, which recognizes the ß-chain portion independently of the subfamily.
  • the retroviral vector pBullet a functional derivative of pStitch (Weijtens et al., 1998) belongs to the so-called splice vectors, in which the transgene clones in the same sequence context relative to the splice acceptor and donor elements SA and SD must be like the env gene to ensure maximum expression.
  • an Ncol interface within the start codon "ccATGg" is designed using appropriate primers. This changed the 2nd amino acid of Lys for both wild-type chains ⁇ TZR and ßTZR Glu or Asn according to Asp.
  • the singular BamRI interface was selected at the 3 'end of the reading frame.
  • the restriction enzymes and modifying enzymes were obtained from New England Biolabs (NEB).
  • thermostable polymerase was mostly the native or cloned R / w DNA polymerase (Pyrococcus furiosus, Stratagene) or the R / 5c DNA polymerase (Pyrococcus sp., Life Technologies)
  • the gene segments could be amplified and cloned directly via primers which contained the sequences for Ncol (for_ ⁇ coI_aTCR_4, SeqlD No. 19; for_NcoI_bTCR_4, SeqlD No. 21) ,
  • the murine constant domains should be exchanged for the corresponding human domains in such a way that these domains are completely recorded in their immunoglobulin-like folding structure.
  • the complete variable domains were also to be recorded in order not to cause any impairment of the CDR3 loop which was almost carboxyterminal in this domain.
  • the fusion had to take place in such a way that the transition generated as little as possible an anteoantigen that could lead to an unwanted immune reaction.
  • the positions are relative in a range of up to 8 amino acids behind the last consensus motif "GxG", which closes the CDR3 loop heavily preserved. This area is completed by a highly conserved sequence of up to 11 amino acids.
  • the murine sequences then begin to deviate from the human sequences, highly conserved for each species.
  • the central area lies in the extended loop that connects the variable domain with the constant one (see criterion a)).
  • the chimerization should be carried out within a highly conserved amino acid (AS) triplet sequence.
  • the highly conserved triplet sequence consisted of "QNP" (base 400-408 relative to the start codon of the murine ⁇ TZR). Position 407-415 was followed by a singular / wNI interface that could be used for the fusion: the 3'-offset position of the AlwNl meant that instead of the aspartate conserved in human sequences, the glutamate conserved in murine sequences was present. This conservative amino acid exchange was considered to be less immunogenic and therefore tolerable.
  • the chimeric, highly conserved region was I 133 -QNPEPAVYQLR 144 in which R 144 represents the first human-specific amino acid. I is at the ninth position behind the consensus motif "GxG" that closes the CDR3 loop.
  • the cloning strategy was to ligate the LMP-agarose-isolated EcoRI / / wNI-cut v ⁇ segments with the AlwNl / BamHl-digested c ⁇ -PCR amplicons, to recut the mixed ligation products with EcoRI and BamRl and to prepare the prepared ligation product to clone potentially correct fragment length into the expression vector pcDNA3.1 (-) (Invitrogen).
  • An asymmetric test digest resulted in the clones with the desired sequence of the ligation starting materials.
  • the human constant gene segments c ⁇ and cß were isolated from the human leukemia cell line Jurkat by classic RT-PCR, as implemented as part of the Roche kit described above, with subsequent "nested” PCR.
  • the .4 / wNI interface (T to A; see table below) had to be generated with the aid of mutagenic PCR primers at 2 positions secondly, compatibility with the murine sequence is established (c according to a; see table below), since the middle 3 positions of the / wNI interface may be degenerate:
  • the -4 / wNI cleavage site that occurs naturally in the murine sequence is shown in bold, the 3 ′ offset cutting position is underlined.
  • the degenerate triplet is in lower case.
  • the base exchanges required for the human “primer” to maintain a mouse sequence-compatible / wNI interface are shown in bold.
  • the 5 ′ initial base of the mutagenic primer is in italics.
  • the resulting chimeric AS sequence is shown in bold (see text); the highly preserved AS triplet is also underlined.
  • the c ⁇ -fragment was amplified by means of a “nested” PCR.
  • the mutations were placed in the “nested” primer (for_hucaTCR_AlwNI_3; SeqlD No. 27), whereas the RT-PCR primer (for_hucaTCR_2; SeqlD No. 25) was still the same matched human wild-type sequence.
  • the reverse “nested” primer rev_hucaTCR_BamHI_l (SeqlD No. 28) had both the stop codon and the clonable R ⁇ mHI interface, whereas the reverse RT-PCR primer (rev_hucaTCR_2; SeqlD No. 26) had the 3 'lying non-codogenic region recognized.
  • vß fragment was cut with EcoRI and isolated from an LMP gel, the cß-PCR amplificate was blunt-ended as an additionally enzymatically phosphorylated (T4 polynucleotide kinase, N ⁇ B) final BamHl fragment used in the ligation.
  • the mixed ligation products were cut with EcoRI / BamHl and the fragment with the potentially correct fragment length was cloned in pcDNA3.1 (-).
  • An asymmetric test digest gave the clones with the desired sequence and orientation of the ligation starting materials.
  • the est YI interface that occurs naturally in the murine sequence is shown in bold, the 5 'offset cutting position which generates 5' overhangs is underlined.
  • the 5 'initial and phosphorylated base "T" of the human "nested" primer, which supplements the last base of BstYl in the chimeric construct, is in italics.
  • the resulting chimeric AS sequence is shown in bold (see text); the highly preserved AS triplet is also underlined.
  • the chimeric, highly conserved region was E-DLN in which N represents the first human-specific amino acid.
  • E 133 is in seventh position behind the conserved "GxG" motif that completes the CDR3 loop.
  • Single chain TCRs consist of the fusion of the variable domains v ⁇ with vß and an added constant domain c ⁇ or cß (Eshar et al., 1993).
  • the advantage of such constructs lies in the defined 1: 1 stoichiometry of the two variable domains in one construct and the defined reactivity due to the heterogeneous pairing of endogenous and exogenous double chain TZRs that can be excluded.
  • the variable domains were connected via a flexible polylinker of a redundant (GGGGS) 3 motif.
  • the ends of the synthetic oligonucleotide harbored unique interfaces with which the carboxy-terminal end of one variable domain, located behind the essential CDR3 loop, could be linked to the beginning of the other variable domain, behind the sequence encoding the signal peptide.
  • five criteria were considered: a) The polylinker had to be long enough to connect the ends of the variable ends. For this purpose, murine TZR crystal structures with an MHC-H-2K b specificity were consulted. b) the polylinker had to connect the ends in such a way that on the one hand it did not impair the specificity of the CDR3 loop, on the other hand it sufficiently eliminated the signal peptide of the downstream variable domain while maintaining its functional structure.
  • amino acid sequences of the respective variable domain were included in the polylinker for the case in which the singular interfaces were not ideal.
  • the polylinker had to be flexible on the one hand, which should be accomplished with the help of a sterically favorable sequence of glycine residues, and on the other hand be sufficiently soluble to avoid aggregate formation and precipitation: the hydroxyl group of the serine residue forms hydrogen bonds with solvating water molecules and forms local dipoles.
  • the codogenic triplets for the glycine residues were varied ("GGC” and "GGA”).
  • the polylinker had to have the same internal singular interfaces as the wild type sequences in order to cut open the intermediates in a 2-step cloning process and to add the almost complete wild type sequences 3'-terminally via these singular interfaces.
  • the chimeric intermediate was cut open with DrllllBamHl and the ßTZR coding sequence, which had lost its signal peptide coding sequence via a DrallllBamHl digest, was cloned into it.
  • the first glycine of the polylinker was at position 6 relative to the amino-terminal gly of the "GxG" consensus motif in v ⁇ , the last serine of the polylinker, connected by arginine due to an intermediate blunt-ended ligation, before position Asp 22 of the vß domain.
  • muvß-Li-muv ⁇ -muc ⁇ (SeqlD No. 43; FIG.
  • the singular interface Sc 1 behind the last consensus motif "GxG" of the variable vß domain and Bsgl became the restriction interface terminating the signal peptide coding sequence chosen in the v ⁇ domain.
  • the hybridized, double-stranded oligonucleotide was cut on both sides with Sc ⁇ l and cloned between the vß-coding and cß-coding sequence of the wild-type ßTZR. Thereafter, the chimeric intermediate was cut open with BsgllBamHl and the sequence coding for the ⁇ TZR which was via a had lost its sequence encoding the signal peptide.
  • the first glycine of the polylinker was at position 6 relative to the amino-terminal gly of the "GxG" consensus motif in v ⁇ , the last serine of the polylinker before position Val 24 of the v ⁇ -domain.
  • the signal transduction of the double chain TZRs should be optimized.
  • the respective double chain ⁇ / ßTZRs were fused to the almost complete CD3 ⁇ subunit of the CD3 complex.
  • this fusion brings about an efficient and CD3-independent coupling of the TZR to the effectors Lck 56 and ZAP-70 located upstream and downstream in the cascade.
  • a modified ligation-PCR-based technique was established, with the help of which one could generate any fusions for the production of chimeric proteins, regardless of singular interfaces, and the specificity of the PCR amplificates obtained was significantly increased in comparison to a conventional ligation-PCR.
  • the genetic fusion is defined via a reverse, chimeric primer (rev_huca-hu_tm_Zeta, SeqlD No. 36, FIG. 7; rev_hucb-hu_tm_Zeta; SeqlD No. 37, FIG. 8), which is linked to a forward primer (T7_for; SeqlD No.
  • the fusion point was fixed on the disulfide-bridging cysteines: this caused the TZRs to lose their cytoplasmic sequence, the transmembrane and a short range of extracytoplasmic amino acids to the dimerizing cysteine, the human D chain also lost a short extraycytoplasmic section, but should exclusive of hers Coding cystine-forming cysteines for the transmembrane and cytosolic region including the three bivalent "ITAM" motifs.
  • the reverse chimeric primer codes for the 3'-terminally located 21 bases of the respective partially humanized TZR and for the 5'-terminally lying 21 bases of the human CD3 ⁇ chain (FIG. 7).
  • the chimeric constructs are humanized from the constant domain.
  • PBLs Human Peripheral Blood Lymphocytes
  • a functional derivative of the pStitch system (Weijtens et al., 1999) was used for transduction of human peripheral T lymphocytes.
  • the retroviral genes required for packaging are encoded via individual plasmids by cotransfection of the packaging cell line 293T (Soneoka et al., 1995): pHit60 encodes the gag-pol structure and polymerase genes from the Moloney murine leukemia virus ( MoMuLV), pColt-Galv for the env - envelope protein of the "gibbon ape leukemia virus", which is able to bind to the Na + - / phosphate synporter pit of human cells and thus to transduce the latter.
  • the chimeric virus particles thus have an amphotropic pseudotype and can transduce various mammalian cells, except for the mouse.
  • the isolated bacterial clones of the T cell receptor genes cloned into the pStitch derivative were purified via plasmid preparations which promise removal of residual endotoxins (Qiagen, product 12362) and adjusted to 1 ⁇ g / ⁇ l.
  • the DNA was transiently introduced into the packaging cell line 293 T via the calcium phosphate precipitation (GiboBRL-Life Technologies, product 18306-019). Up to 80 ⁇ g DNA are used in the context of the WT or modified double chain T cell receptors ⁇ TZR and ßTZR: 20 ⁇ g ⁇ TZR construct 20 ⁇ g ßTZR - construct 20 ⁇ g pColt-Galv 20 ⁇ g pHit 60
  • DMEM / H modified DMEM medium
  • the 293T cells were seeded onto 0.9 * 10 6 cells per T25 bottle and transfection batch in 5 ml DMEM / H. 4 h before the transfection, the medium was replaced by fresh DMEM-H (3 ml) warmed to room temperature (RT).
  • the transfection was carried out according to the regulation of the commercial protocol (Life Technologies). 1 ml of the transfection batch was pipetted into the respective bottle with careful dropping.
  • the DNA-Ca 3 (PO 4 ) 2 precipitate should be deposited on the adherent cells in finely divided form.
  • PBLs peripheral blood lymphocytes
  • the plates were incubated in an incubator at 37 ° C and 5% CO2.
  • the activated PBLs from the respective wells of a 24well plate were combined and counted.
  • Adherent monocytes were discarded.
  • the cells are centrifuged off (1500 ⁇ m, 5 min, RT) and taken up in a concentration of 2.5 * 10 6 cells / ml in fresh huRPMI-P and returned to the incubator.
  • the medium was previously adjusted to 400 U / ml IL-2 (Chiron) and 5 ⁇ g / ml polybrene (Sigma).
  • each transfection batch was trypsinized in succession 6 h after changing the medium: for this purpose, each T25 was washed with 3 ml HBSS (Life Technologies), incubated with 1 ml trypsin-EDTA (Life Technologies) for a maximum of 5 minutes, the dissolved cells were taken up quantitatively and placed in 4 ml of huRPMI P (RT) added dropwise with stirring.
  • the 293 T cells are irradiated with 2500 rad. These are centrifuged off (1500 ⁇ m, 5 min, RT) and resuspended in 4 ml of fresh, adjusted huRPMI-P, supplemented with 400U / ml IL-2 and 5 ⁇ g / ml polybrene. 1 ml of the adjusted PBLs was added to the mixture and the mixture (0.5 * 10 6 PBLs / ml) was incubated for three days in an incubator (37 ° C., 5% CO2).
  • the constructs described under 2. were analyzed after retroviral transduction in "fluorescence activated cell sorting" (FACS). For this purpose, 0.25 * 10 6 cells were saturated with fluorophore-labeled antibodies: the heterologously expressed ß-chain was detected with anti-vß6-FITC (BD); the entirety of the T cells via the marker anti-CD3-PC5 (Coulter-Beckman) (FIG. 9). A sample transduced with the empty pStitch derivative served as a negative control.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • the expression could be reproduced in several donors HLA-A2 - positive T cells.
  • the cytosolic expressed green fluorescent protein (eGFP, cloned from eGFP-NI from Clontech) served as an external standard and showed that the comparably weak transduction efficiency as an expression of the percentage detection of successfully transduced T cells was a methodological problem and not an intrinsic problem TZR transgene is.
  • vß6 antibodies In order to enrich the successfully transduced T cells, they were sorted in the magnetic field using magnetically labeled vß6 antibodies (according to the Miltenyi-Biotec regulation). For this purpose, a magnetically marked antibody was used which recognizes the rat IgG portion of the v6-specific antibodies (Miltenyi-Biotec "Goat anti-rat IgG MicroBeads", product 485-01). Enrichments of v6-positive CD3 + T cells of over 90% could be achieved.
  • the transduced T cells were checked for their cytotoxic specificity in a classic 5 I chromium release test.
  • target cells were labeled radioactively by the incooration of 51 chromium. If the retrovirally modified effector cells recognized the target cell in a peptide-specific manner, the latter were driven into apoptosis by the effector functions of the T cell and killed by lysis. The extent of the released chromium nuclide makes a statement about the effectiveness of the cell recognition and lysis. The effectiveness was tested over a wide range of the ratio of effector cells to target cells (E: T).
  • the target cells were:
  • T2 human TAP-deficient cell line that could be loaded exogenously with any peptide.
  • the specific peptide was hdm2-81-88, an irrelevant control peptide was derived from the influenza matrix protein FluMl.
  • Saos-2/6 Transfectant of the human Saos-2 cell line, which expresses hdm2 and processes endogenously.
  • Saos2 / 143 Transfectant of the human Saos-2 cell line, which carries the p53 mutant Val 143 Ala.
  • the p53 mutant positively regulates the expression of hdm2 JY: EBV-transformed LCL-B cell line UocBl 1, EU-3: pre-B cell leukemia IM-9: plasmocytoma
  • the cell line T2 was loaded exogenously with the hdm2-81-88 peptide in a concentration series from 1 * 10 " M to 1 * 10 " M.
  • a peptide-specific and dose-dependent cytotoxic T-cell response could be observed for both muv ⁇ -muc ⁇ / muvß-mucß (2.1) and muv ⁇ -huc ⁇ / muvß-hucß (2.2).
  • T 20: 1.
  • the murine hdm2-81-88 peptide-specific T cell clone 3 served as a positive control.
  • the cell lines described above could be lysed specifically for peptides. Some of the pre-B cell leukaemias could be lysed 100% in the case of WT chains with high E: T's. As in the case of peptide titration, the wild-type chains (2.1) showed a higher lysis efficiency compared to the partially humanized, chimeric chains (2.2). A non-functional single-chain T cell receptor acted as a negative control, which was expressed and enrichable according to 3.3.1), but had no lysis activity. The murine hdm2-81-88 peptide-specific T cell clone 3 served as a positive control.

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Abstract

Die Erfindung stellt Polypeptide eines eine hdm2-Protein-spezifische T-Zell Antowort vermittelnden murinen alpha / beta T-Zell Rezeptors oder funktioneller Varianten oder Teile davon oder diese kodierende Nukleinsäuren, funktionelle Varianten oder Teile davon zur Verfügung. Dises bewirken, dass hdm2-Protein-exprimierende Zellen von T-Zellen, die mit jenen Genen ausgestattet wurden, erkannt werden, Zytokine ausgeschüttet werden, und eine Z-Zell-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumor-oder Leukämiezellen herbeigeführt wird.

Description

Polypeptide eines hdm2-Protein spezifischen murinen α/ß T-Zell Rezeptors, diese kodierende Nukleinsäuren und deren Verwendung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Polypeptide des eine hdm2-Protein-spezifische T-Zell Antwort vermittelnden murinen α/ß T-Zell Rezeptors, diese kodierende Nukleinsäuren und deren Verwendung bei der Therapie, Diagnose und/oder Prävention von mit dem hdm2 -Protein assoziierten Erkrankungen.
Die Antigenerkennung durch T-Lymphozyten (TZL) ist entscheidend für die Erzeugung und Regulierung einer effektiven Immunantwort. Der charakteristische T-Zelllinien-Marker ist der T-Zell-Antigen-Rezeptor (TZR). Es gibt zwei definierte Typen von TZR: Einer ist ein Hete- rodimer von zwei Disulfid-verbundenen Polypeptiden (α und ß); der andere ist zwar strukturell ähnlich, besteht jedoch aus γ- und δ-Polypeptiden. Beide Rezeptoren sind mit einem Set von fünf Polypeptiden, dem CD3 -Komplex assoziiert und bilden so zusammen den T-Zell Rezeptor-Komplex (TZR-CD3-Komplex). Der α/ß-TZR ist der funktioneil bedeutendste, da er in über 95% aller T-Zellen exprimiert wird und die tragende Immunantwort vermittelt.
α/ß-T-Zellen können in zwei verschiedene sich überschneidende Populationen unterteilt werden: Eine Untergruppe, die den CD4-Marker trägt und hauptsächlich die Immunantwort unterstützt (TH) und eine Untergruppe, die den CD8-Marker trägt und im wesentlichen zytoto- xisch ist (Tc). CD8+-T-Zellen erkennen Antigene in Assoziation mit MHC-Klasse-I- Molekülen. Solche Antigene können unter anderem tumorspezifische oder tumorassoziierte Peptidantigene sein. Nach Erkennung der Peptidantigene wird die betreffende Zelle abgetötet, indem die T-Zelle die Zielzelle lysiert und/oder Apoptose dieser Zielzellen induziert oder Zytokine (z.B. IL-2, IFN-γ) freisetzt.
Unter den tumorassoziierten Peptidantigenen (TAA), die im Kontext von MHC-Klasse-I- Molekülen auf der Oberfläche von Tumorzellen präsentiert werden, sind die sogenannten „universellen" TAA von besonderem Interesse. Diese TAA leiten sich überwiegend von zellulären Proteinen ab, die in normalen Zellen schwach exprimiert und in Tumorzellen überex- primiert werden. Zu diesen Proteinen gehört unter anderem das humane Homolog des „Mouse-Double-Minute-2" Proto-Antigens (mdm2), das sogenannte „humane mdm2" oder abgekürzt „hdm2" Proto-Onkoprotein (Roth et al. 1998), das nicht nur in einer Reihe solider Tumore, sondern auch bei den hämatologischen Neoplasien (malignen hämatologischen Systemerkrankungen) AML, ALL und CLL überexprimiert wird (Zhou et al, 2000).
Oligopeptide des hdm2-Proteins können im Kontext mit MHC-Klasse-I-Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert werden und repräsentieren attraktive Zielstrukturen für CD8- positive T-Zellen. Das Ausmaß der T-Zell Antwort verläuft hierbei in einem definierten kinetischen Fenster (Kersh et al., 1998). Der Komplex aus Peptid-MHC und TZR-CD3 multimeri- siert, um eine effiziente Signaltransduktion zu bewirken, wobei die genaue Stöchiometrie und das Ausmaß der Oligomerisierung noch umstritten ist.
Voraussetzung für die Entwicklung immuntherapeutischer Verfahren zur Behandlung von bösartigen Tumorerkrankungen ist die Identifizierung von Onkoprotein-spezifischen T-Zell Rezeptoren. Mit solchen T-Zell Rezeptoren können unter bestimmten Voraussetzungen T- Zellen mit Antigen-Spezifität im allgemeinen und Tumorreaktivtät im besonderen versehen werden mit dem Ziel, daß die T-Zellen die Remission und die Eradikation eines bestimmten Tumors herbeifuhren. Beschriebene Methoden zur Identifizierung von hochaffinen Peptid- spezifischen TZRs beinhalten die „phage-,, oder „yeast-display" -Methodik (Holler et al., 1999) bzw. eine Tetramer-abhängige „TCR display" -Methodik (Kessels et al., 2000).
Aus Theobald et al. („Targeting p53 as a general tumor antigen", P.N.A.S. USA 92, pp. 11993-11997, 1995) ist die Herstellung von p53-spezifischen zytotoxischen T-Zellen nach der Injektion von Peptiden aus der Sequenz von p53 bekannt. Mittels dieser T-Zelllinien konnte anschließend eine Auswahl von menschlichen Tumorzellen lysiert werden. Die Isolierung von Genen spezifischer T-Zell Rezeptoren der gegen p53 gerichteten lyrischen T-Zellen wird nicht beschrieben. Die WO 97/32603 beschreibt allgemein ein Verfahren zur Herstellung von re- kombinanten T-Lymphozyten, die gegen Tumorgewebe gerichtete spezifische T-Zell Rezeptoren exprimieren. Dabei wird eine HLA-transgene Maus (in diesem Fall HLA-A2) mit tu- mor-assoziiertem Antigen immunisiert, um so die Produktion von zytotoxischen T- Lymphozyten zu bewirken, die spezifische T-Zell Rezeptoren auf ihrer Oberfläche exprimieren. Als tumorassoziierte Antigene werden Peptide verschiedener Gene, wie Her-2/neu, Ras, p53, Tyrosinase, MART, gplOO, MAGE, BAGE und MUC-1 beschrieben. Aus den Her-2/neu spezifischen T-Lymphozyten wird dann die Nukleotidsequenz, die mindestens eine variable Region der α- und ß-Kette des entsprechenden nicht menschlichen T-Zell Rezeptors enthält isoliert und in Form verschiedener molekularbiologisch modifizierter genetischer (u.a. „humanisierter") TZR-Konstrukte verwendet. So beschreibt die WO 97/32603 Fusionsproteine von variablen Regionen von TZR mit der ζ-Region von CD3 oder CD8 oder CD 16, sowie die Verwendung von flexiblen Linker der Aminosäuresequenz (GGGGS)3.
Clay et al. („Efficient transfer of a tumor antigen-reactive TCR to human peripheral blood lymphocytes confers anti-tumor reactivity"; J. Immunology, 1999, 163: 507-513) beschreiben die Isolierung von Genen der α-TZR und ß-TZR Ketten eines MART-1 spezifischen TZR und dessen Expression in humanen peripheren Blut-Lymphocyten (PBLs). Die TZR sind gegen die Aminosäuren 25-35 von MART-1 gerichtet. Weiterhin wird die Lyse von verschiedenen metastatischen Melanomzelllinien und ein retrovirales Vektorsystem unter Verwendung von IRES-Elementen beschrieben.
Darcy et al. („Redirected perforin-dependent lysis of colon carcinoma by ex vivo genetically engineered CTL" J. Immunol., 2000, 164:3705-3712) beschreiben ein immunotherapeutisches Verfahren für Colon-Karzinome unter der Verwendung von scFv anti-CEA Rezeptor transdu- zierten ZTL, Perforin und γ-IFN. Das chimäre spezifische Rezeptorkonstrukt wird über einen retroviralen Vektor in primäre Maus-T-Lymphocyten transduziert. Diese Zellen wurden in Mäuse injiziert, die vorher mit Colon-Karzinomzelllinien beimpft waren.
Weijtens et al. („A retroviral vector System ,'STITCH'; in combination with an optimized Single chain antibody chimeric receptor gene structure allows efficient gene transduction and expression in human T-lymphocytes", Gene Therapy (1998) 5,1995-1203) und Willemsen et al. „Grafting primary human T lymphocytes with cancer-specific single chain and two chain TCR" Gene Therapy, 2000 7, 1369-1377) beschreiben retrovirale Vektorsysteme zur Trans- duktion von Genen in aktivierte T-Lymphozyten. Dieses System wird verwendet, um die Expression von Antikörper-basierten chimären Rezeptoren in der Membran von T-Zellen zu bewirken. Diese T-Zellen können dann gegen spezifische Krebszellen eingesetzt werden. Die Wirksamkeit des retroviralen Vektorsystems wird anhand der spezifischen Erkennung und Zytolyse von Nierenzellkarzinomen beschrieben. Ähnlich beschreiben Eshar. et al. („Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the γ or ζ subunits of the immunoglobulin and T-cell re- ceptors" P.N.A.S. USA, 90, pp. 720-724, 1993) die Herstellung von tumorspezifischen Lym- phozyten und ihre Verwendung in der Immuntherapie auf der Basis von Chimären, welche die variablen Regionen eines Antikörpers (scFV's) mit der konstanten Region des T-Zell Rezeptors umfassen (sogenannte „single-chain TCR" (scTCR)). Diese chimären Gene konnten auf der Oberfläche von zytolytischen T-Zell-Hybridomen exprimiert werden und bewirkten die Ausschüttung von Interleukin-2 nach Kontakt mit dem Antigen.
Ein spezifisch gegen hdm2 gerichteter TZR und dessen Verwendung wird jedoch durch die oben genannten Publikationen sowie in der übrigen Literatur weder erwähnt noch nahegelegt.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die murinen Gene der gegen das hdm2-Protein gerichteten T-Zell Rezeptoren α-TZR und ß-TZR zur Verfügung zu stellen. Diese bewirken, daß hdm2-Protein-exprimierende Zellen von CD8-positiven T-Zellen erkannt werden, Zytokine ausgeschüttet werden, und eine T-Zell-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumor- oder Leukämiezellen herbeigeführt wird.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch das Polypeptid des eine hdm2-Protein- spezifische T-Zell Antwort vermittelnden murinen α/ß T-Zell Rezeptors gemäß SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder funktioneller Varianten oder Teile davon oder dieses kodierende Nukleinsäuren, funktioneile Varianten oder Teile davon gelöst.
Aus einer doppelt-A2.1-transgenen Maus [huCD8α/ß x A2.1/Kb]Fι in C57BL/6 genetischer Hintergrund wurden die Gene des eine hdm2-Protein-spezifische T-Zell Antwort vermittelnden murinen α/ß T-Zell Rezeptors isoliert, die eine HLA-A2.1 restringierte und gegen das Peptid der Aminosäuren 81-88 des hdm2-Proteins gerichtete spezifische T-Zell- Antwort vermitteln. Die Polypeptide dieses TZR waren bisher unbekannt. Die Gene wurden als Wildtyp (WT) oder modifizierte Konstrukte retroviral in humane periphere Blut-Lymphocyten (PBLs) eingeschleust und die HLA-restringierte Antigen-Erkennung funktioneil durch CD8- vermittelte zyto toxische Lyse verschiedener Zeil-Linien im 51 Chrom-Freisetzungstest überprüft. Die erfindungsgemäßen Gene des hdm2-spezifischen TZR gehören nicht zu den bisher bekannten geeigneten Zielen für die Diagnose - wie beispielsweise der Indikation - und/oder der Behandlung - wie beispielsweise der Modulation - von mit hdm2-Protein in Zusammenhang stehenden Erkrankungen oder für die Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, so daß sich aus dieser Erfindung völlig neue Therapieansätze ergeben. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Fusionsprotein, umfassend das erfindungsgemäße Polypeptid oder funktionelle Varianten oder Teile davon oder dieses kodierende Nukleinsäuren, funktionelle Varianten oder Teile davon.
Das Fusionsprotein kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es die ζ-Region von CD3 oder CD8 oder CD 16 oder Teile davon umfaßt, insbesondere die ζ-Region von humanem CD3 oder CD8 oder CD 16 oder Teile davon. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, das einen flexiblen Linker umfaßt (Whitlow et al., „An improved linker for single-chain Fv with reduced aggregation and enhanced proteolytic stability", Prot. Engin. 6(8), pp. 989-995, 1993), insbesondere einen Linker der Aminosäuresequenz (GGGGS)3. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Fusionsprotein die ζ-Kette des CD3 -Komplexes oder ITAM-Motive der ζ- Kette oder Teile davon umfassen, insbesondere die ζ-Kette von humanem CD3 oder Teile davon. Das Fusionsprotein kann weiterhin dadurch gekennzeichnet sein, daß es CD8α oder das Lck-Bindungsmotiv von CD8α umfaßt oder Teile davon, insbesondere von humanem CD8α.
Bei dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein kann es sich weiterhin um eine chimäre partiell oder vollständig humanisierte α und/oder ß TZR-Kette handeln, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Fusionsprotein, bei dem es sich um einen Einzelketten T-Zell Rezeptor handelt, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann aber auch dadurch gekennzeichnet sein, daß es sich um einen an andere funktionelle Komponenten gekoppelten α/ß- TZR handelt, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins zur Diagnose und/oder Behandlung vom mit hdm2-Protein in Zusammenhang stehenden Erkrankungen oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, z.B. in einer geeigneten Wirtszelle, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure verwendet wird.
Hergestellt werden hierbei Fusionsproteine, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten, wobei die Fusionsproteine selbst bereits die Funktion eines Polypep- tids der Erfindung aufweisen oder erst nach Abspaltung des Fusionsanteils die spezifische Funktion aktiv ist. Vor allem zählen hierzu Fusionsproteine mit einem Anteil von ca. 1-200, vorzugsweise ca. 1-150, insbesondere ca. 1-100, vor allem ca. 1-50 fremden Aminosäuren. Beispiele solcher Peptidsequenzen sind prokaryotische Peptidsequenzen, die z. B. aus der Galactosidase von E. coli abgeleitet sein können. Weiterhin können auch virale Peptidsequenzen, wie zum Beispiel vom Bakteriophagen Ml 3 verwendet werden, um so Fusionsproteine für das dem Fachmann bekannte "phage display"- Verfahren zu erzeugen.
Zur Aufreinigung der erfindungsgemäßen Proteine kann ein weiteres/weiterer Polypep- tid("tag") angefügt sein. Erfindungsgemäße Protein-tags erlauben beispielsweise die hochaffine Absorption an eine Matrix, stringentes Waschen mit geeigneten Puffern, ohne den Komplex in nennenswertem Maße zu eluieren und anschließend die gezielte Elution des absorbierten Komplexes. Beispiele der dem Fachmann bekannten Protein-tags sind ein (His)6-tag, ein Myc-tag, ein FLAG-tag, ein Strep-tag, ein Strep-tag II, ein Hämagglutinin-tag, Glutathion-Transferase (GST)-tag, Intein mit einem Affinitäts-Chitin-Bindungs-tag oder Maltose-bindendes Protein (MBP)-tag. Diese Protein-tags können sich N-, C-terminal und/oder intern befinden.
Neben den aus Zellen isolierten natürlichen Polypeptiden können alle erfindungsgemäßen Polypeptide oder deren Teile unter zellfreien Bedingungen hergestellt worden sein, z. B. durch Synthese oder durch in v tro-Translation. So kann das gesamte Polypeptid oder Teile davon zum Beispiel mit Hilfe der klassischen Synthese (Merrifield-Technik) synthetisiert werden. Teile der erfindungsgemäßen Polypeptide eignen sich insbesondere zur Gewinnung von Antiseren, mit deren Hilfe geeignete Genexpressionsbanken durchsucht werden können, um so zu weiteren funktioneilen Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids zu gelangen.
Die Erfindung betrifft auch Polypeptide, die Derivate eines Antikörpers mit Spezifität für hdm2-81-88 Peptid, insbesondere präsentiert im Kontext von HLA-A2.1 sind.
Weiterhin umfaßt die Erfindung retro-inverse Peptide oder Pseudopeptide gemäß der Poly- peptidsequenz der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 8 oder funktionelle Varianten oder Teile davon. Diese Peptide weisen anstelle der -CO-NH-Peptidbindungen -NH-CO-Bindungen auf.
Die Aufgabe der Erfindung wird weiterhin durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure gelöst, die eine DNA, RNA, PNA (Peptide nucleic acid) oder p-NA (Pyranosyl nucleic acid), vor- zugsweise eine DNA, insbesondere eine doppelsträngige DNA ist mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 24 Nukleotiden ist. Die Nukleinsäure kann dadurch gekennzeichnet sein, daß die Sequenz der Nukleinsäure mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist. Sie kann auch in Form ihrer antisense-Sequenz vorliegen.
Für die Expression des betreffenden Gens ist im allgemeinen eine doppelsträngige DNA bevorzugt, wobei der für das Polypeptid kodierende DNA-Bereich besonders bevorzugt ist. Dieser Bereich beginnt mit dem ersten in einer Kozak Konsensus Sequenz (Kozak, 1987, Nucleic. Acids Res. 15:8125-48) liegenden Start-Codon (ATG) bis zum nächsten Stop-Codon (TAG, TGA bzw. TAA), das im gleichen Leseraster zum ATG liegt. Eine weitere Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen ist die Konstruktion von anti-sense Oli- gonukleotiden (Zheng und Kemeny, 1995, Clin. Exp. Immunol. 100:380-2) und/oder Ribozymen (Amarzguioui, et al. 1998, Cell. Mol. Life Sei. 54:1175-202; Vaish, et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26:5237-42; Persidis, 1997, Nat. Biotechnol. 15:921-2). Mit anti-sense Oligonukleotiden kann man die Stabilität der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verringern und/oder die Translation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure inhibieren. So kann beispielsweise die Expression der entsprechenden Gene in Zellen sowohl in vivo als auch in vitro verringert werden. Oligonukleotide können sich daher als Therapeutikum eignen. Diese Strategie eignet sich beispielsweise auch für Haut, epidermale und dermale Zellen, insbesondere, wenn die antisense Oligonukleotide mit Liposomen komplexiert werden (Smyth et al., 1997, J. In- vest. Dermatol. 108:523-6; White et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112:699-705). Für die Verwendung als Sonde oder als "antisense" Oligonukleotid ist eine einzelsträngige DNA oder RNA bevorzugt.
Neben den aus Zellen isolierten natürliche Nukleinsäuren können alle erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder deren Teile auch synthetisch hergestellt worden sein. Weiterhin kann zur Durchführung der Erfindung eine Nukleinsäure verwendet werden, die synthetisch hergestellt worden ist. So kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure beispielsweise chemisch anhand der in den SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 8 beschriebenen Proteinsequenzen unter Heranziehen des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (siehe z. B. Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Revievs, 90, 543-584). Oligonukleotide werden in der Regel schnell durch Endo- oder Exonukleasen, insbesondere durch in der Zelle vorkommende DNasen und RNasen, abgebaut. Deshalb ist es vorteilhaft, die Nukleinsäure zu modifizieren, um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, so daß über einen langen Zeitraum eine hohe Konzentration der Nukleinsäure in der Zelle beibehalten wird (WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98/37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116). Typischerweise kann eine solche Stabilisierung durch die Einführung von einer oder mehrerer Internukleotid-Phosphorgruppen oder durch die Einfuhrung einer oder mehrerer Nicht- Phosphor-Internukleotide, erhalten werden.
Geeignete modifizierte Internukleotide sind in Uhlmann und Peymann (1990 Chem. Rev. 90, 544) zusammengefaßt (WO 95/11910; Macadam et al., 1998, WO 98/37240; Reese et al., 1997, WO 97/29116). Modifizierte Internukleotid-Phosphatreste und/oder Nicht- Phosphorbrücken in einer Nukleinsäure, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden können, enthalten zum Beispiel Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphoramidat, Phosphorodithioat, Phophatester, während Nicht-Phosphor-Internukleotid- Analoge, beispielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetami- datbrücken und/oder Thioetherbrücken enthalten. Es ist auch beabsichtigt, daß diese Modifizierung die Haltbarkeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendungen eingesetzt werden kann, verbessert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, vorzugsweise in Form eines Plasmids, Shuttle Vektors, Phagemids, Cosmids, Expressionsvektors, adenoviralen Vektors, retroviralen Vektors (Miller, et al. „Improved retroviral vectors for gene transfer and expression", BioTechniques Vol. 7, No. 9, p 980, 1989) und/oder gentherapeutisch wirksamen Vektors, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.
So kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem Vektor vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor enthalten sein. Vorzugsweise enthält der gentherapeutisch wirksame Vektor T-Zell spezifische regulatorische Sequenzen, die funktioneil mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verbunden sind. Die Expressionsvektoren können prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z.B. die Vektoren pGEM oder pUC- Derivate und für eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GALl (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), für die Expression in Insektenzellen z. B. Bac lovirus- Vektoren wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind.
Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirtszelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (siehe z. B. EP-B1-0 154 133), den Met 25, GAL 1 oder ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Rüssel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682; Mumberg, supra), den Baculovirus-Polyhedrin- Promotor für die Expression in Insektenzellen (siehe z. 13. EP-B1-0 127 839). Für die Expression in Säugetierzellen sind beispielsweise Promotoren geeignet, die eine konstitutive, regulierbare, gewebsspezifische, zellzyklusspezifische oder metabolischspezifische Expression in eukaryotischen Zellen erlauben. Regulierbare Elemente gemäß der vorliegenden Erfindung sind Promotoren, Aktivatorsequenzen, Enhancer, Silencer und/oder Repressorsequen- zen. Beispiel für geeignete regulierbare Elemente, die konstitutive Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die von der RNA Polymerase III erkannt werden oder virale Promotoren, CMV-Enhancer, CMV-Promotor, CMV-LTR-Hybride, SV40 Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232) und weitere virale Promotor- und Aktivatorsequenzen, abgeleitet aus beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV oder HIV. Ein Beispiel für ein regulierbares Element, das eine regulierbare Expression in Eukaryonten ermöglicht, ist der Tetracycli- noperator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
Beispiele für regulierbare Elemente, die T-Zell spezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in diesen Zelltypen exprimiert werden.
Beispiele für regulierbare Elemente, die zellzyklusspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren folgender Gene: cdc25, Cyclin A, Cyclin E, cdc2, E2F, B-myb oder DHFR (Zwicker J. und Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6). Beispiele für regulierbare Elemente, die metabolischspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glukosemangel, durch Phosphatkonzentration oder durch Hitzeschock reguliert werden. Der erfindungsgemäße Vektor kann zur Transfektion einer Wirtszelle verwendet werden, bei der es sich bevorzugterweise um eine T-Zelle handelt. Besonders bevorzugt ist eine Wirtszelle, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie auf ihrer Oberfläche ein erfindungsgemäßes Poly- peptid oder Fusionsprotein exprimiert.
Um die Einführung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und damit die Expression des Polypeptids in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transduktion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die Nukleinsäure als Plasmid, als Teil eines viralen oder nicht-viralen Vektors oder Partikels vorliegen. Als virale Vektoren oder Partikel eignen sich hierbei besonders: Baculoviren, Vakziniaviren, Retroviren, Adenoviren, adenoas- soziierte Viren und Herpesviren. Als nicht-virale Träger eignen sich hierbei besonders: Viro- somen, Liposomen, kationische Lipide, oder poly-Lysin konjugierte DNA.
Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, beispielsweise Ade- novirusvektoren oder retrovirale Vektoren (Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al., 1998, Mol. Cell. 2: 549-58; Weijtens et al. „A retroviral vector System ,'STITCH'; in combination with an optimized single chain antibody chimeric receptor gene structure allows efficient gene transduction and expression in human T-lymphocytes", Gene Therapy (1998) 5,1995-1203).
Ein bevorzugter Mechanismus, erfindungsgemäße Polypeptide in vivo zur Expression zu bringen, ist der virale Gen-Transfer, insbesondere mit Hilfe retroviraler Partikel. Diese werden vorzugsweise genutzt, entsprechende Zielzellen, vorzugsweise T-Lymphozyten, des Patienten ex vivo mit den für erfindungsgemäße Polypeptide kodierenden Genen oder Nukleo- tidsequenzen durch Transduktion zu versehen. Die Zielzellen können daraufhin im Sinne eines adoptiven Zelltransfers wieder in den Patienten reinfundiert werden, um mit der de novo eingefügten Spezifität tumorizide und/oder immunmodulierende Effektorfunktionen zu übernehmen. Jüngst wurden auf diesem Wege sehr gute gentherapeutische Erfolge in der Behandlung der durch Immuninkompetenz gekennzeichneten SCID-Xl- Krankheit bei Neugeborenen erzielt, in dem hämatologische Vorläuferzellen mit einem analogen intakten Transgen einer in den Kindern vorkommenden nicht-funktionellen mutierten Variante des γ- Kettengens, das für die Differenzierung in die verschiedenen Effektorzellen des adaptiven Immunsystems essentiell ist, retroviral versehen wurden (Cavazzana-Calvo et al., 2000). Weiterhin besteht die Möglichkeit den Gentransfer in vivo durchzuführen, einerseits durch präferentiell stereotaktische Injektion der infektiösen Partikel, andererseits durch direkte Applikation von Viren-produzierenden Zellen (Oldfield, et al. Hum. Gen. Ther., 1993, 4:39-69).
Die zum Transfer von Genen häufig eingesetzten viralen Vektoren sind nach heutigem Stand der Technik vorwiegend retrovirale, lentivirale, adenovirale und adeno-assoziierte virale Vektoren. Diese sind von natürlichen Viren abgeleitete zirkuläre Nukleotidsequenzen, in denen zumindest die viralen Strukturprotein-kodierenden Gene durch das zu transferierende Konstrukt ausgetauscht werden.
Retrovirale Vektorsysteme schaffen die Voraussetzung für eine langhaltende Expression des Transgens durch die stabile, aber ungerichtete Integration in das Wirtsgenom. Vektoren der jüngeren Generation besitzen keine irrelevanten und potentiell immunogenen Proteine, des weiteren gibt es keine vorbestehende Immunität des Empfängers gegenüber dem Vektor. Re- troviren enthalten ein RNA-Genom, das in eine LipidhüUe verpackt ist, die aus Teilen der Wirtszellmembran und Virusproteinen besteht. Zur Expression viraler Gene wird das RNS- Genom revers transkribiert und mit dem Enzym Integrase in die Zielzell-DNS integriert. Diese kann daraufhin von der infizierten Zelle transkribiert und translatiert werden, wodurch virale Bestandteile entstehen, die sich zu Retroviren zusammenfügen. RNS wird ausschließlich dann in die neu entstandenen Viren eingefügt. Das Genom der Retroviren besitzt drei essentielle Gene: gag, das für virale Strukturproteine, sogenannte gruppenspezifische Antigene kodiert, pol für Enzyme wie Reverse Transkriptase und Integrase und env für das Hüllprotein („envelope"), das für die Bindung des wirtsspezifischen Rezeptors verantwortlich ist. Die Produktion der replikationsinkompetenten Viren findet nach Transfektion in sogenannten Verpackungszelllinien statt, die zusätzlich mit den gag/pol-kodierenden Genen ausgestattet wurden und diese „in trans" exprimieren und somit die Ausbildung replikationsinkompetenter (d.h. gag/pol-deletierter) transgener Viruspartikel komplementieren. Eine Alternative ist die Cotransfektion der essentiellen Virusgene, wobei nur der das Transgen enthaltende Vektor das Verpackungssignal trägt.
Die Separation dieser Gene ermöglicht einerseits die beliebige Kombination des gal/pol- Leserahmens mit aus verschiedenen Stämmen gewonnenen e«v-Leserahmen, wodurch Pseu- dotypen mit verändertem Wirtstropismus entstehen, andererseits kann dadurch die Bildung replikationskompetenter Viren innerhalb von Verpackungszellen drastisch reduziert werden. Das aus „gibbon ape leukemia virus" (GALV) abgeleitete Hüllprotein, das im „stitch" bzw. „bullet" -Vektorsystem Verwendung findet, ist in der Lage humane Zellen zu transduzieren und ist in der Verpackungszelllinie PG13 mit amphotropen Wirtsbereich etabliert (Miller et al., 1991). Zusätzlich wird die Sicherheit durch selektive Deletion von nicht-essentiellen Virussequenzen zur Verhinderung einer homologen Rekombination und somit der Produktion replikationskompetenter Partikel erhöht.
Neue, nicht-virale Vektoren bestehen aus autonomen, sich selbst-integrierenden DNS- Sequenzen, den Transposonen, die durch z.B. liposomale Transfektion in die Wirtszelle ein- geschleußt werden und erstmals erfolgreich zur Expression humaner Transgene in Säugerzellen eingesetzt wurden (Yant et al., 2000).
Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert, da damit eine sehr hohe Transfekti- onseffizienz, insbesondere von Hautzellen, erreicht werden kann (Alexander und Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2279-85). Hilfsstoffe, die den Transfer von Nukleinsäuren in die Zelle erhöhen, können beispielsweise Proteine oder Peptide, die an DNA gebunden sind oder synthetische Peptid-DNA-Moleküle, die den Transport der Nukleinsäure in den Kern der Zelle ermöglichen, sein (Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6, 282; Branden et al. (1999) Nature Biotech. 17, 784). Hilfsstoffe umfassen auch Moleküle, die die Freisetzung von Nukleinsäuren in das Cytoplasma der Zelle ermöglichen (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem. 8, 213) oder beispielsweise Liposomen (Uhl- mann und Peymann (1990) supra). Eine andere besonders geeignete Form von gentherapeutischen Vektoren läßt sich dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure auf Goldpartikeln aufbringt und diese mit Hilfe der sogenannten "Gene Gun" in Gewebe, bevorzugt in die Haut, oder Zellen schießt (Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112:775-81).
Für die gentherapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist es auch von Vorteil, wenn der Teil der Nukleinsäure, der für das Polypeptid kodiert, ein oder mehrere nicht kodierende Sequenzen einschließlich Intronsequenzen, vorzugsweise zwischen Promotor und dem Startcodon des Polypeptids, und/oder eine polyA-Sequenz, insbesondere die natürlich vorkommende polyA-Sequenz oder eine SV40 Virus polyA-Sequenz, vor allem am 3 '- Ende des Gens enthält, da hierdurch eine Stabilisierung der mRNA erreicht werden kann (Jackson, R. J. (1993) Cell 74, 9-14 und Palmiter, R. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 478-482).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, insbesondere eine T- Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder einem anderen erfindungsgemäßen Genkonstrukt transformiert ist. Wirtszellen können sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen sein, Beispiele für prokaryotische Wirtszellen sind E. coli und für eukaryotische Zellen Saccharomyces cerevisiae oder Insektenzellen.
Ein besonders bevorzugte transformierte Wirtszelle ist eine transgene T- Vorläuferzelle oder eine Stammzelle, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette umfaßt. Verfahren zur Transformation oder Transduktion von Wirtszellen und/oder Stammzellen sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen zum Beispiel Elektroporation oder Mikroinjektion. Eine besonders bevorzugte transformierte Wirtszelle ist eine patienteneigene T-Zelle, die nach der Entnahme mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt transfiziert wird. Erfindungsgemäße Wirtszellen können insbesondere dadurch erhalten werden, daß dem Patienten eine oder mehrere Zellen, bevorzugterweise T-Zellen, insbesondere CD8+-T-Zellen entnommen werden, die dann ex vivo mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen genetischen Konstrukten transfiziert oder transdu- ziert werden, um so erfindungsgemäße Wirtszellen zu erhalten. Die ex vivo generierten spezifischen T-Zellen können dann anschließend in den Patienten reimplantiert werden. Das Verfahren ähnelt somit dem bei Darcy et al. („Redirected perforin-dependent lysis of colon carcinoma by ex vivo genetically engineered CTL" J. Immunol., 2000. 164:3705-3712) beschriebenen Verfahren unter der Verwendung von scFv anti-CEA Rezeptor transduzierten ZTL, Perforin und γ-IFN.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von hdm2- Protein-spezifischen Antigenen das dadurch gekennzeichnet ist, daß hdm2-präsentierende Tumorzellen oder Fraktionen davon mit einer erfindungsgemäßen Wirtszelle unter Bedingungen zusammengebracht werden, bei denen die Tumorzellen oder Fraktionen davon nur dann lysiert werden, wenn der Tumor das hdm2-Protein-spezifische Antigen präsentiert, für welches das exprimierte Polypeptid oder Fusionsprotein spezifisch ist. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, vorzugsweise eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers zur Diagnose und Monitoring von mit hdm2-Protein assoziierten Erkrankungen oder zur Identifizierung von pharma- kologisch aktiven Substanzen, bei dem ein Antikörper produzierender Organismus mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder funktionelle Äquivalente davon oder Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren immunisiert oder mit einer ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierenden Nukleinsäure vakziniert wird.
Das Verfahren erfolgt nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielsweise eines Kaninchens, mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder den genannten Teilen davon, gegebenenfalls in Anwesenheit von z. B. inkomplettem Freundschen Adjuvans und/oder Aluminiumhydroxidgelen (siehe z. B. Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349). Die im Tier aufgrund einer immunologischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschließend nach allgemein bekannten Methoden leicht aus dem Blut isolieren und z. B. über Säulenchromatographie reinigen. Monoklonale Antikörper können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299) hergestellt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper zur Diagnose und/oder Behandlung von mit hdm2-Protein assoziierten Erkrankungen oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, der gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet ist und mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden spezifisch reagiert, wobei die oben genannten Teile des Polypeptids entweder selbst immunogen sind oder durch Kopplung an geeignete Träger, wie z. B. bovines Serumalbumin in ihrer Immunogenität gesteigert werden können. Dieser Antikörper ist entweder polyklonal oder monoklonal, bevorzugt ist ein mono- klonaler Antikörper. Unter dem Begriff Antikörper versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung auch gentechnisch hergestellte und gegebenenfalls modifizierte Antikörper bzw. anti- genbindende Teile davon, wie z.B. chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunk- tionelle Antikörper, monovalente bzw. oligovalente Antikörper, bi- oder oligospezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper, F(ab)- oder F(ab)2-Fragmente (siehe z.B. EP-B1-0 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213, WO 98/24884). Die erfindungsgemäßen Antikörper können zur Diagnose und/oder Behandlung von mit hdm2-Protein assoziierten Erkrankungen oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von mit hdm2 -Protein assoziierten Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid, mindestens eine Wirtszelle oder mindestens ein Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein nach diesem Verfahren hergestelltes Arzneimittel zur Behandlung von mit hdm2 -Protein assoziierten Erkrankungen, das mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung dieses Arzneimittels zur Behandlung von mit hdm2 -Protein assoziierten Erkrankungen.
Die Therapie der von mit hdm2-Protein assoziierten Erkrankungen kann auf herkömmliche Weise, z.B. durch Infusionen oder Injektionen erfolgen, die die erfindungsgemäßen Arzneimittel enthalten. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel kann weiterhin gegebenenfalls in Form von Liposomenkomplexen bzw. Goldpartikelkomplexen erfolgen. Die Behandlung mittels der erfindungsgemäßen Arzneimittel kann aber auch über orale Dosierungsformen, wie z.B. Tabletten oder Kapseln, über die Schleimhäute, zum Beispiel der Nase oder der Mundhöhle, oder in Form von unter die Haut implantierten Dispositorien erfolgen. TTS sind zum Beispiel aus den EP 0 944 398 AI, EP 0 916 336 AI, EP 0 889 723 AI oder EP 0 852 493 AI bekannt. Die erfindungsgemäßen (Poly)peptide und deren Derivate können auch zur aktiven und/oder passiven Immunisierung von Patienten mit Erkrankungen, insbesondere Tumorerkrankungen, die mit hdm2 in Zusammenhang stehen, eingesetzt werden, um die Induktion, Erzeugung und Zunahme vom hdm-spezifischen ZTL zu erreichen und die Tumor- und Leukämiezellen der betreffenden Patienten spezifisch abzutöten. Solche Erkrankungen umfassen zum Beispiel solide Tumorerkrankungen, lymphohämatopoetische Neopla- sien, maligne hämatologische Erkrankungen, auch in Form eines multiplen Myeloms (oder Plastozytoms), eines histiozytischen Lymphoms und eines CML-Blastenschubs. Bei einer besonders bevorzugten Art der Behandlung wird dem Patienten eine oder mehrere Zellen, bevorzugterweise T-Zellen, insbesondere CD8 -T-Zellen entnommen, die dann ex vivo mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen genetischen Konstrukten transduziert oder transfiziert werden. Die ex vivo generierten spezifischen T-Zellen können dann anschließend in den Patienten re-implantiert werden. Das Verfahren ähnelt somit dem bei Darcy et al. („Redirected perforin-dependent lysis of colon carcinoma by ex vivo genetically engineered CTL" J. Immunol., 2000, 164:3705-3712) beschriebenen immunotherapeutischen Verfahren bei Colon-Karzinomen unter der Verwendung von scFv anti-CEA Rezeptor transduzierten ZTL, Perforin und γ-IFN.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Tests zur Auffindung funktioneller Interaktoren in Zusammenhang mit hdm2-Protein assoziierten Erkrankungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antikörper gemäß der Erfindung zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.
Unter dem Begriff "funktionelle Interaktoren" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind alle diejenigen Moleküle, Verbindungen und/oder Zusammensetzungen und Stoffgemische zu verstehen, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Polypeptiden oder Antikörpern, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, unter geeigneten Bedingungen in Wechselwirkung treten können. Mögliche Interaktoren sind einfache chemische organische oder anorganische Moleküle oder Verbindungen, können aber auch Peptide, Proteine oder Komplexe davon umfassen. Die funktioneilen Interaktoren können aufgrund ihrer Wechselwirkung die Funktion(en) der Nukleinsäuren, Polypeptide oder Antikörper in vivo oder in vitro beeinflussen oder auch nur an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Polypeptide oder Antikörper binden oder mit ihnen andere Wechselwirkungen kovalenter oder nicht- kovalenter Weise eingehen.
Die Erfindung umfaßt weiterhin einen erfindungsgemäß hergestellten Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren in Zusammenhang von mit hdm2-Protein assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält. Oft kann so das pathologische Verhalten der Zellen in vitro nachgeahmt werden und es können Substanzen gesucht werden, die das normale Verhalten der Zellen wieder herstellen und die ein therapeutisches Potential besitzen. Zudem läßt sich dieses Testsystem zum Screening von Substanzen ausnutzen, die eine Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einem funktionellen Interaktor inhibieren.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel zur Indikation und Therapie von mit hdm2 -Protein assoziierten Erkrankungen, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Arzneimittels zur Behandlung von mit hdm2 -Protein assoziierten Erkrankungen, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert wird.
Als Therapeutika und/oder Prophylaktika kommen insbesondere Impfstoffe, rekombinante Partikel oder Injektionen oder Infusionslösungen in Betracht, die als Wirkstoff (a) das erfindungsgemäße TZR-Rezeptor Polypeptid und/oder seine Derivate und/oder (b) eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten und/oder (c) in vitro oder ex vivo erzeugte T- Lymphozyten, die einen spezifisch gegen hdm2 gerichteten TZR enthalten.
Für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein Arzneimittel und/oder rekombinanter Partikel geeignet, das die erfindungsgemäße Nukleinsäure in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen bzw. Goldpartikeln komplexierter Form enthält. Der pharmazeutische Träger ist beispielsweise eine physiologische Pufferlösung, vorzugsweise mit einem pH von ca. 6,0-8,0, vorzugsweise von ca. 6,8-7,8. Insbesondere von ca. 7,4 und/oder einer Osmolarität von ca. 200-400 milliosmol/Liter, vorzugsweise von ca. 290-310 milliosmol/Liter. Zusätzlich kann der pharmazeutische Träger geeignete Stabilisatoren, wie z. B. Nukleaseinhibitoren, vorzugsweise Komplexbildner wie EDTA und/oder andere dem Fachmann bekannte Hilfsstoffe enthalten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypep- tids zur Diagnose und/oder Behandlung von mit hdm2 -Protein in Zusammenhang stehenden Erkrankungen oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen in einer geeigneten Wirtszelle, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine erfindungsgemäße Nukleinsäure auf geeignete Weise exprimiert wird. Das Polypeptid wird so beispielsweise durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einem geeigneten Expressionssystem, wie oben bereits beschrieben, nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden hergestellt. Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DHS, HB101 oder BL21, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, In- sektenzellinien, z. B. von Spodoptera frugiperda, oder die tierischen Zellen COS, Vero, 293, HaCaT, und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind.
Ein erfindungsgemäßes Diagnostikum zur Therapie-Überwachung enthält das erfindungsgemäße Polypeptid bzw. die oben näher beschriebenen immunologisch wirksamen Teile davon. Das Polypeptid bzw. Teile davon, die vorzugsweise an eine Festphase, z. B. aus Nitrocellulo- se oder Nylon, gebunden sind, können beispielsweise mit der zu untersuchenden Körperflüssigkeit, z. B. Blut, in vitro in Berührung gebracht werden, um so beispielsweise mit Autoimmunantikörpern reagieren zu können. Der Antiköφer-Peptid-Komplex kann anschließend beispielsweise anhand markierter anti-Human-IgG- oder anti-Human-IgM-Antiköφer nachgewiesen werden. Bei der Markierung handelt es sich beispielsweise um ein Enzym, wie Per- oxidase, das eine Farbreaktion katalysiert. Die Anwesenheit und die Menge an anwesenden Autoimmunantiköφern kann somit über die Farbreaktion leicht und schnell nachgewiesen werden.
Ein anderes Diagnostikum zur Therapie-Überwachung enthält die erfindungsgemäßen Anti- köφer selbst. Mit Hilfe dieser Antiköφer kann beispielsweise eine Gewebeprobe leicht und schnell dahingehend untersucht werden, ob das betreffende Polypeptid in einer erhöhten Menge vorhanden ist, um dadurch einen Hinweis auf mit hdm2-Protein in Zusammenhang stehende Erkrankungen zu erhalten. In diesem Fall sind die erfindungsgemäßen Antiköφer beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrieben, markiert. Der spezifische Antiköφer-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und ebenso schnell über eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen werden.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Diagnostikum umfaßt eine Sonde, vorzugsweise eine DNA- Sonde, und/oder Primer. Dies eröffnet eine weitere Möglichkeit, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, zum Beispiel durch die Isolierung aus einer geeigneten Genbank anhand einer geeigneten Sonde zu erhalten (siehe z. B. J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A La- boratory Manual 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY Kapitel 8 Seite 8.1 bis 8.81, Kapitel 9 Seite 9.47 bis 9.58 und Kapitel 10 Seite 10.1 bis 10.67).
Als Sonde eignen sich beispielsweise DNA- oder RNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 100-1000 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 200-500 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von ca. 300-400 Nukleotiden deren Sequenz aus den Polypeptiden gemäß den SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 8 des Sequenzprotokolls abgeleitet werden kann.
Alternativ können anhand der abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen Oligonukleotide synthetisiert werden, die sich als Primer für eine Polymerase Kettenreaktion eignen. Als Primer eignen sich beispielsweise DNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 10-100 Nukleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 15 bis 50 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von 20-30 Nukleotiden deren Sequenz aus den Polypeptiden gemäß den SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 8 des Sequenzprotokolls abgeleitet werden kann.
Der Begriff "kodierende Nukleinsäure" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die für ein isolierbares bioaktives erfindungsgemäßes Polypeptid oder einen Vorläufer kodiert. Das Polypeptid kann durch eine Sequenz in voller Länge oder jeden Teil der kodierenden Sequenz kodiert werden, solange die spezifische, beispielsweise enzymatische Aktivität erhalten bleibt.
Es ist bekannt, daß kleine Veränderungen in der Sequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren vorhanden sein können, zum Beispiel durch die Degenerierung des genetischen Codes, oder daß nicht translatierte Sequenzen am 5' und/oder 3 '-Ende der Nukleinsäure angehängt sein können, ohne daß dessen Aktivität wesentlich verändert wird. Diese Erfindung umfaßt deshalb auch sogenannte "funktionelle Varianten" der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.
Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komplementär zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit einer abgeleiteten Referenzsequenz oder Teilen davon, insbesondere der hypervariablen V(D)JC-Region, hybridisieren und eine zu dem entsprechenden erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche oder identische Aktivität aufweisen. Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.
Unter dem Begriff "funktionelle Varianten" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man Polypeptide, die funktionell mit dem erfindungsgemäßen Polypeptiden verwandt sind, d. h. Strukturmerkmale der Polypeptide aufweisen. Beispiele funktioneller Varianten sind die entsprechenden Polypeptide, die aus anderen Organismen als der Maus, also dem Menschen, bzw., vorzugsweise aus nicht-menschlichen Säugetieren wie z. B. Affen, Schweinen und Ratten stammen. Andere Beispiele funktioneller Varianten sind Polypeptide, die durch unterschiedliche Allele des Gens, in verschiedenen Individuen oder in verschiedenen Organen eines Organismus kodiert werden. Von der vorliegenden Erfindung werden insbesondere auch funktionelle TZR- Varianten erfaßt, die das identische Epitop des hdm2-Polypeptids erkennen und eine spezifische T-Zell Antwort auslösen.
Im weiteren Sinne versteht man darunter auch Polypeptide, die eine Sequenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität, von ca. 70%, vorzugsweise ca. 80%, insbesondere ca. 90%, vor allem ca. 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 8 und/oder zu anhand der Peptidsequenzen abgeleiteten DNA Sequenzen aufweisen. Darunter zählen auch Additionen, Inversionen, Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder chemische/physikalische Modifikationen und/oder Austausche oder Teile des Polypeptids im Bereich von ca. 1-60, vorzugsweise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-5 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Methionin fehlen, ohne daß die Funktion des Polypeptids wesentlich verändert wird.
Die Erfindung soll nun weiter anhand der beigefügten Beispiele und Figuren erläutert werden, ohne durch diese eingeschränkt zu werden. Es zeigt:
SEQ ID Nr. 1 : Polypeptid des Wildtyp-Gen Maus αTZR (muvα-mucα), SEQ ID Nr. 2: Polypeptid des Wildtyp-Gen Maus ßTZR (muvß-mucß),
SEQ ID Nr. 3 : Polypeptid eines chimären partiell humanisiertes TZR-Gens (muvα-hucα), SEQ ID Nr. 4: Polypeptid eines chimären partiell humanisiertes TZR-Gens (muvß-hucß), SEQ ID Nr. 5: Polypeptid eines Einzelketten-TZR muvα-Li-muvß-mucß, SEQ ID Nr. 6: Polypeptid eines Einzelketten-TZR muvß-Li-muvα-mucα,
SEQ ID Nr. 7: Polypeptid eines Doppelketten-TZR in Fusion mit humaner CD3ζ- Kette muvα-hucα-huCD3ζ,
SEQ ID Nr. 8: Polypeptid eines Doppelketten-TZR in Fusion mit humaner CD3ζ- Kette muvß-hucß-huCD3ζ,
SEQ ID Nr. 9: Primer for_bTCR_v4,
SEQ. ID Nr. 10: Primer rev_bTCR_c4,
SEQ. ID Nr. 11 : Primer for_Eco_bTCR_v5,
SEQ. ID Nr. 12: Primer rev_Asc_bTCR_c6,
SEQ. ID Nr. 13: Primer for_Eco_bTCR_c2,
SEQ. ID Nr. 14: Primer rev_Asc_bTCR_c2,
SEQ. ID Nr. 15: Primer rev_Asc_aTCR_cl,
SEQ. ID Nr. 16: Primer rev_aTCR_c5,
SEQ. ID Nr. 17: Primer rev_Asc_aTCR_c4,
SEQ. ID Nr. 18: Primer for_Eco_aTCR_c6,
SEQ. ID Nr. 19: Primer for_NcoI_aTCR_4,
SEQ. ID Nr. 20: Primer for_NcoI_aTCR_5b; am 5'-Ende phosphoryliert,
SEQ. ID Nr. 21 : Primer for_NcoI_bTCR_4,
SEQ. ID Nr. 22: Primer for_NcoI_bTCR_5b; am 5'-Ende phosphoryliert,
SEQ. ID Nr. 23: Primer rev_aTCR_BamHI_l,
SEQ. ID Nr. 24: Primer rev_bTCR_BamHI_l ,
SEQ. ID Nr. 25: Primer for_hucaTCR_2,
SEQ. ID Nr. 26: Primer rey_hucaTCR_2,
SEQ. ID Nr. 27: Primer for_hucaTCR_AlwNI_3,
SEQ. ID Nr. 28: Primer rev_hucaTCR_BamHI_l,
SEQ. ID Nr. 29: Primer for_hucbTCR_3,
SEQ. ID Nr. 30: Primer rev_hucbTCR_2,
SEQ. ID Nr. 31 : Primer for_hucbTCR_4; am 5'-Ende phosphoryliert,
SEQ. ID Nr. 32: Primer rev_hucbTCR_BamHI_l ,
SEQ. ID Nr. 33: Primer T7_for,
SEQ. ID Nr. 34: Primer T7_rev, SEQ. ID Nr. 35 Primer rev_hZeta_BamHI_4, SEQ. ID Nr. 36 Primer rev_huca-hu_tm_Zeta, SEQ. ID Nr. 37 Primer rev_hucb-hu_tm_Zeta, SEQ. ID Nr. 38: Polynukleotid des Wildtyp-Gen Maus αTZR (muvα-mucα) aus SEQ ID Nr.
1, SEQ. ID Nr. 39: Polynukleotid des Wildtyp-Gen Maus ßTZR (muvß-mucß) aus SEQ ID Nr.
2, SEQ. ID Nr. 40: Polynukleotid des chimären partiell humanisiertes TZR-Gens (muvα-hucα) aus SEQ ID Nr. 3, SEQ. ID Nr. 41 : Polynukleotid des chimären partiell humanisiertes TZR-Gens (muvß-hucß) aus SEQ ID Nr. 4, SEQ. ID Nr. 42: Polynukleotid des Einzelketten-TZR muvα-Li-muvß-mucß aus SEQ ID Nr.
5, SEQ. ID Nr. 43: Polynukleotid des Einzelketten-TZR muvß-Li-muvα-mucα aus SEQ ID Nr.
6, SEQ. ID Nr. 44: Polynukleotid des Doppelketten-TZR in Fusion mit humaner CD3ζ- Kette muvα-hucα-huCD3ζ aus SEQ ID Nr. 7; und SEQ. ID Nr. 45: Polynukleotid des Doppelketten-TZR in Fusion mit humaner CD3ζ- Kette muvß-hucß-huCD3ζ aus SEQ ID Nr. 8.
In den Primersequenzen bedeuten Y = C / T; R = A / G; V = A / C / G; W = A / C / T
Figur 1 zeigt eine FACS-Analyse (siehe 1.4) mittels eines vß6-spezifischen FITC-markierten Antiköφers (Pharmingen). Es wurde sowohl die murine T-Zell-Linie als auch der daraus entstandene Klon 3 übeφriift. Als Isotyp-Kontrolle diente anti-TCR Vα2 - FITC (BD), als Positiv-Kontrolle der anti-pan ßTZR - FITC - Antiköφer (BD). Als Negativ-Kontrolle diente der Influenza-Matrixprotein-spezifische T-Zell-Klon 58.
Figur 2 zeigt eine vß6-spezifische Antiköφer-Blockade des murinen T-Zell-Klons 3 im cytotoxischen 51 Chrom-Freisetzungstest (siehe 1.4). Die Blockade wurde dosisabhängig eva- luiert. Als Negativ-Kontrolle diente zum einen ein anti-Vα3.2 - Antiköφer (BD) und zum anderen der p53 - 264-272 - spezifische T-Zell-Klon 46, der gegenüber dessen eigenes zu erkennendes p53-Peptid gegengeprüft wurde. Als Zielzelle fungierte die TAP-defiziente Zelllinie T2, die exogen mit 10"8 M Peptid beladen wurde.
Figur 3 zeigt Beispiele des Design hdm2-spezifischer Konstrukte auf DNS-Ebene (siehe 2.), wobei muV α/ß murines variables α/ß Gensegment; muC α/ß murines konstantes α/ß Gensegment; huC α/ß humanes konstantes α/ß Gensegment; TM: Gensegment für Transmembrane kodierend; Li: Gensegment für (GGGGS)3-Motiv kodierend und HuCD3ζ humanes CD3ζ-Ketten Gensegment bedeutet. Die für die Klonierung relevanten Restriktions- Schnittstellen sind angegeben.
Figur 4 zeigt dieselben Beispiele des Design hdm2-spezifischer Konstrukte auf Protein-Ebene (siehe 2.), wobei muV α/ß murine variable α/ß-Domäne; muC α/ß murine konstante α/ß- Domäne; huC α/ß humane konstante α/ß-Domäne; SP: murines Wildtyp-Signalpeptid; TM: Transmembrane; Li Linker mit (GGGGS) - Motiv und huζ: humane CD3ζ-Kette mit 3 konsekutiven IT AM - Motiven bedeutet. Die aus den bakteriellen Klonen abgeleiteten Nummern sind für die individuellen Ketten angegeben.
Figur 5 zeigt den Polylinker des Konstrukts muvα-Li-muvß-mucß (siehe 2.3). Der Polylinker ist letztlich über Kpn I und Dra III in das resultierende Konstrukt eingesetzt worden.
Figur 6 zeigt den Polylinker des Konstrukts muvß-Li-muvα-mucα (siehe 2.3). Der Polylinker ist letztlich über Sca I und Bsg I in das resultierende Konstrukt eingesetzt worden.
Figur 7 zeigt die Fusionsstelle des chimären Doppelketten-TZR in Fusion zur humanen CD3ζ-Kette muvα-hucα-huCD3ζ (siehe 2.4). Das extracytosolische, über eine Disulfidbrük- ke dimerisierende Cystein ist mit relativer Position zum Start-Methionin angegeben.
Figur 8 zeigt die Fusionsstelle des chimären Doppelketten-TZR in Fusion zur humanen CD3ζ-Kette muvß-hucß-huCD3ζ (siehe 2.4). Das extracytosolische, über eine Disulfldbrücke dimerisierende Cystein ist mit relativer Position zum Start-Methionin angegeben.
Figur 9 zeigt die "fluorescence activated cell sorting" (FACS) Analyse der unter 2.) beschriebenen Konstrukte nach retroviraler Transduktion. Dargestellt sind Beispiele durchschnittlicher Transduktions-Effizienzen für OKT3 -aktivierte PBL-Kulturen 6 Tage nach Transdukti- on. Diese liegen im Bereich von 10-25% der eingestezten CD3+-Lymphozyten. Als Negativ- Kontrolle diente ein Transfektions-/Transduktions - Ansatz mit dem leeren retroviralen Vektor pBullet.
Figuren 10 bis 12 zeigen Peptid-Titrationen (siehe 3.4.1) wobei T2-Zielzellen exogen mit dem hdm2-81-88-Peptid in einer Konzentrationsreihe von 1*10" M bis 1*10" M beladen wurden. Als Referenz fungierte der murine T-Zell-Klon 3 hdm2-81-88 (Synonym: P2) der huCD8 x A2Kb - transgenen Maus. Die gezeigten 51 Chrom-Freisetzungstests wurden mit transduzierten PBLs durchgeführt, die über vß6-gerichtete magnetische Zeil-Sortierung (Miltenyi-Biotec) auf über 90% vß6+-T-Zellen angereichert wurden. Figur 10: als Negativ-Kontrolle diente ein Konstrukt eines nicht-funktionellen Einzelketten-T-Zell-Rezeptors (nfTCR), das sich zwar vergleichbar gut auf der Oberfläche der T-Zellen exprimieren ließ und dadurch auch über magnetische Zeil-Sortierung anreicherbar war, aber keine Funktionalität im CTL-Test bewies. Figur 11 : Peptid-Titration des murinen heterodimeren Wildtyp-Konstruktes muTZR/8-18. Figur 12: Peptid-Titration des chimären heterodimeren Konstruktes huTZR/ 10-29.
Figuren 13 bis 15 zeigen die Erkennung von maligne transformierten Zeil-Linien. Die gewählten Zielzellen waren HLA-A2+. Als Referenz fungierte der murine T-Zell-Klon 3 hdm2- 81-88 (Synonym: P2) der huCD8 x A2Kb - transgenen Maus. Die gezeigten 51Chrom- Freisetzungstests wurden mit transduzierten PBLs durchgeführt, die über vß6-gerichtete magnetische Zeil-Sortierung (Miltenyi-Biotec) auf über 90% vß6+-T-Zellen angereichert wurden. Figur 13: als Negativ-Kontrolle diente ein Konstrukt eines nicht-funktionellen Einzelketten-T-Zell-Rezeptors (nfTCR), das sich zwar vergleichbar gut auf der Oberfläche der T- Zellen exprimieren ließ und dadurch auch über magnetische Zeil-Sortierung anreicherbar war, aber keine Funktionalität im CTL-Test bewies. Figur 14: murine heterodimere Wildtyp- Konstrukt muTZR/8-18. Figur 15: chimäre heterodimere Konstrukt huTZR/10-29.
Beispiele
Es wurden die Gene der T-Zell-Rezeptoren αTZR und ßTZR aus einer doppelt-transgenen Maus huCD8 x A2Kb präpariert, die eine HLA-A2.1 restringierte und hdm2-Protein / 81-88 Peptid-spezifische T-Zell-Antwort vermitteln. Die erhaltenen Gene wurden als Wildtyp (WT) oder modifizierte Konstrukte retroviral in humane periphere Blut-Lymphozyten (PBLs) eingeschleust und die HLA-restringierte Antigen-Erkennung funktionell durch CD8-vermittelte cytotoxische Lyse verschiedener Zeil-Linien im 51 Chrom-Freisetzungstest übeφriift. 1.) Gewinnung der für die α- und ß-Ketten der T-Zell-Rezeptoren kodierenden Gene 1.1) Präparation der cytoplasmatischen RNS
Die cytoplasmatische RNS wurde isoliert, um zum einen gezielt die noch unprozessierte, Intron-haltige RNS, DNS-Bruchstücke als auch ribosomale RNS, die vorwiegend im Zellkern lokalisiert sind, abzutrennen und eine Anreicherung der gewünschten "messenger"-RNS zu erzielen. Protokoll und Materialien entsprechen weitgehend mit kleinen Modifikationen dem "Rneasy Mini Kit" der Firma QIAGEN: für eine Präparation wurden durchschnittlich 50* 106 murine Zellen des hdm2/81-88 - spezifischen T-Zell-Klons 3 aus den Kulturschalen einer "24- well-Platte" vereint und in RPMI 1640 (Biowhittaker) serumfrei gewaschen. Die Zellen wurden unter RNase-freien Bedingungen zu je 12,5* 106 Zellen pro Inkubationsröhrchen aliquo- tiert und im Zellmembranlyse-Puffer (4°C-gekühlt) für 20 min auf Eis inkubiert:
Zellmembranlyse-Puffer:
50 mM Tris-HCl/ pH 8.0
140 mM NaCl
1,5 mM MgCl2
0,5 % Nonidet P40 (Röche 1 332 473)
1000 Einh. Rnase-Inhibitor / ml ZML-P (Röche 799 017)
1 mM DTT
Für diesen Puffer wie alle weiteren wäßrigen Lösungen, die angesetzt werden mußten, wurde DEPC-behandeltes und doppelt-autoklaviertes deionisiertes (MilliQ von Millipore) Wasser benutzt.
Die weiteren Schritte erfolgten gemäß einem dem Fachmann geläufigen Verfahren mit Hilfe des QIAGEN-ProtokoUs unter Rnase-freien Bedingungen bei Raumtemperatur und werden kurz beschrieben:
Die milde solubilisierten und aliquotierten Zellen wurden bei 300g / 2' (Minuten) / 4°C zentri- fugiert und der Überstand abgenommen. Es wurden 600 μl eines ß-Mercaptoethanol- (MSH) haltigen (1.45 mM) "RLT"-Puffers hinzugesetzt, gut gemischt und 430 μl 96% ETOH unter Mischen hinzugesetzt. Es wurde die Lösung je Aliquot auf eine Silika-Minispin-Säule gegeben und für 15" (Sekunden) bei 10.000 Upm (Umdrehungen pro Minute) in einer Eppendorf- Tischfuge zentrifugiert. Es erfolte jeweils ein Wasch in 700 μl "RW1 " sowie in 500 μl 77%- ETOH-haltigen "RPE"-Puffer. Abschließend wurden 500 μl des identischen "RPE"-Puffers hinzugegeben und die Säule für 2' bei 14.000 Upm maximal getrocknet. Die Elution der RNS erfolgte mit 54 μl Rnase-freiem Wasser bei 10.000 Upm für 2'. Die Ausbeuten lagen bei 30 μg RNS pro 12,5* 106 murinen T-Zellen. Die RNS wurde zu 6 μg / 10 μl bei -20°C weggefro- ren.
1.2) Amplifikation des ß-Ketten-Gens mittels gekoppelter RT-PCR
Die TZR-kodierende RNS mußte spezifisch in DNS umgeschrieben und amplifiziert werden, bevor diese kloniert werden konnte. Hierzu wurde methodisch die RT-PCR herangezogen, die im gleichnamigen Kit "Titan One Tube RT-PCR-System" der Firma Röche (1888 382) implementiert ist. Es wurde das "Ein-Schritt-Protokoll" gewählt, bei dem die Reverse Transkription ohne weitere Intervention von der Polymerase-Kettenreaktion gefolgt wird. Bei den verwendeten Enzymen handelte es sich um die AMV - Reverse Transkriptase und ein Gemisch der Thermus Aquaticus / Pwo - thermostabilen Polymerase ("Expand™ High fidelity" Enzym-Mix), die in einem universalen Reaktionspuffer zum Einsatz kamen. Da die Transkriptionsrate der TZR-Gene und aufgrund der Varianz der TZR-Gene die Konservierung der für die variablen Domänen kodierenden Gensequenzen gering ist, schloß sich eine "nested PCR" (Polymerase-Kettenreaktion) an, um die Spezifität und die Signalstärke der amplifi- zierten DNS zu erhöhen. Die Variabilität des v-Gensegmentes, dessen Subfamilienzugehörig- keit a priori nicht vorhergesagt werden konnte, wurde mit einem degenerierten Primer (for_bTCR_v4; SeqlD Nr. 9) versucht zu erfassen, der einer Basensequenz für die ersten konservierten Aminosäuren nach dem Signalpeptid kodierend entsprach. Ein artifizielles Gensegment, das für ein murines TZR-Signalpeptid kodiert, sollte ursprünglich über synthetische Oligonukleotide vorgeschaltet werden, um eine Direktion des in vivo synthetisierten Proteins in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums zu gewährleisten. Es wurde ein innerhalb des konstanten Gensegmentes revers hybridisierender Primer (rev_bTCR_c4; SeqlD Nr. 10) gewählt, um der zusätzlichen Varianz der beiden möglichen c-Gensegmente (c- ßl oder c-ß2) der ß-Kette, die einige Basenunterschiede an deren 3'-Ende aufweisen, zu entgehen. Die Oligonukleotide der "nested PCR" besaßen neben der TZR-Komplementarität zusätzlich an dessen 5 '-Ende Sequenzen der Restriktionsschnittstellen für EcoRI bzw. Ascl. Der in Vorwärtsrichtung hybridisierende Primer (for_Εco_bTCR_v5; SeqlD Nr. 11) der nested "PCR" war in der Sequenz des v-Gensegmentes deckungsgleich zum degenerierten RT-PCR - Primer, wohingegen der zum c-Gensegment komplementäre in Rückwärtsrichtung hybridisierende Primer (rev_Asc_bTCR_c6; SeqlD Nr. 12) mehr als 120 Basen relativ zum reversen 1. Primer des TZR-Leserahmens einwärts versetzt lag, so daß es sich genau um eine "3'- located nested PCR" handelte. Hierdurch wurde die Spezifität der PCR erhöht, da in 2 unabhängigen PCR-Schritten an 2 unterschiedlichen Orten ein sequenzspezifisches Erkennungsereignis stattgefunden haben muß. Das komplette c-Gensegment wurde mittels eines reversen degenerierten Primers (rev_Asc_bTCR_c2; SeqlD Nr. 14) zum Erfassen der beiden potentiell möglichen cßl-/cß2-Gensegmente und eines in Leserichtung entsprechenden Primers (for_Eco_bTCR_c2; SeqlD Nr. 13) des cß -Gensegmentes über RT-PCR ohne nachgeschaltete "nested PCR" erfaßt und kloniert. Im Überlappungsbereich der beiden Amplifikate im cß- Bereich befand sich eine singuläre Ncol-Schnittstelle, mittels derer das trunkierte vß-/cß- und das vollständige cß-Gensegment in einer anschließenden Subklonierung zusammengefügt werden konnten.
Das Pipettierschema und das PCR-Protokoll der RT-PCR entsprach prinzipiell dem durch die Firma Röche beschriebenen Verfahren. Die anschließende "nested PCR" erfolgte analog unter Ersatz der Komponenten Rnase-Inhibitor und DTT durch autoklaviertes Wasser. Statt der 2 μl RΝA ( 0,1 -1 μg) wurde 2 μl des Amplifikats der RT-PCR eingesetzt. Die technischen Voraussetzungen des PCR-Geräts ermöglichten den simultanen Test verschiedener Hybridisie- rungstemperaturen im 2. Schritt des klassischen PCR-Zyklus in einem Temperaturgradienten von 35°C - 55°C in Intervallen für 5 ausgesuchte Temperaturen von 36°C, 39°C, 44°C, 52°C und 56°C. Für die höheren Temperaturen von 44-56°C konnten singuläre Banden der gewünschten Länge erzielt werden, dessen Intensität durch die 2. PCR verstärkt wurden und ausreichend waren, um in Vektoren inseriert zu werden.
Die Sequenzierung von 8 bakteriellen Klonen ergab einige randomisierte Basenaustausche, die auf der zu anderen Polymerasen vergleichbar hohen Fehlerrate des Expand™ - Enzym- Mixes beruhten. Die gewählten Klone trugen zudem alle die Sequenzinformation für das Si- gnalpeptid und einen kurzen Bereich des nicht-kodogenen, 5'-untranslatierten Bereiches von weniger als 100 Basen, so daß davon ausgegangen werden konnte, daß der v-Gensegment- spezifische degenerierte Primer eine ähnliche Sequenz flußaufwärts erkannte und die zusätzliche Sequenz des Wildtyp-Signalpeptids lieferte.
1.3) Amplifϊkation des α-Ketten-Gens mittels RACE-PCR
Für die Sequenzermittlung der α-Kette war die RACE-PCR die zum Ziel führende Strategie: das analog dem oben beschriebenen Ansatz konzipierte degenerierte Oligonukleotid erbrachte ausschließlich die kodogene Sequenz eines aufgrund einer Leserasterverschiebung in der CDR3-Schleife nicht-funktionellen T-Zell-Rezeptors. Die allele Exklusion ist nicht in dem selben Maße valid wie für die ß-Kette des TZR. Die RACE-Technologie ist im gleichnamigen System der Firma Röche (1 734 792) etabliert und muß mit αTZR-Gen-spezifischen Oligonu- kleotiden ergänzt werden: hierzu wird im Rahmen der "5'-RACE-PCR" die 5'-lokalisierte Varianz der kodogenen Sequenz umgangen, indem eine bekannte, kurze Adenin- Oligonukleotid-Sequenz am 3'-Ende der revers transskribierten cDNS-Sequenz mittels der terminalen Transferase generiert wird, die in Folge als Erkennungssequenz für einen in Leserichtung 5'-lokalisierten PCR-Primer fungiert. Die reversen PCR-Primer liegen innerhalb der invarianten Sequenz, die für die konstante Domäne kodiert. Für die reverse Transkription wurde der Primer rev_Asc_aTCR_cl (SeqlD Nr. 15) verwendet, der zusammen mit for_Eco_aTCR_c6 (SeqlD Nr. 18) auch zur Amplifikation via RT-PCR des Volllängen cα- Segmentes verwendet wurde. Es wurde das Konzept einer konsekutiven 2-Schritt-"nested PCR" mit Hilfe der Primeφaare "Oligo d(T)-Ankeφrimer" (Komponente des RACE-PCR- Kits) / rev_aTCR_c5 (SeqlD Nr. 16) und "PCR Ankeφrimer" (Komponente des RACE- PCR-Kits) / rev_Asc_aTCR_c4 (SeqlD Nr. 17) verfolgt, so daß auch hier die Subklonierung der vollständigen Sequenz, die für die konstante Domäne kodiert, sich anschloß. Die PCR- Primer mußten so liegen, daß im Überlappungsbereich der amplifizierten Genabschnitte die singuläre Ncol-Schnittstelle lag. Die trunkierte, das vα-Gensegment-enthaltende PCR- Amplifikat wurde über 5'Saä und 3' -Ascl in pΝEB193 (New England Biolabs) kloniert, wohingegen das konstante Gensegment über EcoRI und Ascl in pNΕB193 inseriert wurde. Die Amplifikate wurden klassisch kloniert (J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A Labo- ratory Manual 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) mittels der Reinigung über LMP-Gele und Phenol/Chloroform-Extraktion, bevor diese restriktionsenzyma- tisch verdaut und die Enden mit Hilfe des "High Pure PCR Product Purification Kit" (Röche, 1 732 668) abgetrennt wurden.
Das Mehrschrittprotokoll lehnt sich weitgehend an das kommerzielle Protokoll an unter Zuhilfenahme eines programmierbaren PCR-Gerätes: die reverse Transkription, die Transferase- Reaktion und die anschließende 2-Schritt "nested PCR" sind im PCR-Gerät "MasterCycler" der Firma Eppendorf durchgeführt worden. Im Rahmen der spezifischen α-Ketten- Amplifikation kam die Gradiententechnologie im Hybridisierungsschritt für die Temperaturen 39°C, 44°C, 52°C und 56°C zur Anwendung. Es wurde die R/w-Polymerase (Stratagene) gewählt, da zu diesem Zeitpunkt dieses als das Enzym mit der geringsten Fehlereinbaurate galt. Die 1.PCR ergab bereits eine schwache Bande der zu erwartenden Größe von 0.9 kB im ge- samten Temperaturspektrum, deren Intensitäten durch die nachfolgende PCR verstärkt werden konnten und zudem auftretende "Primer-Dimer" herausverdünnt werden konnten. In der abschließenden PCR ergab sich eine Verkürzung des Amplifikates um 70 Bp gemäß der theoretischen Lage der versetzt hybridisierenden Primer. Im Agarose-Gel zeichnete sich eine Doppelbande von 100 Bp Längendifferenz ab, die auf das Vorhandensein der funktionellen und der nicht-funktionellen α-Kette hinwies. Die Banden wurden gemeinsam im präparativen Gel ausgeschnitten, um beide Amplifikate in der anschließenden Klonierung zu erfassen. Es wurden 7 Klone gefunden, die für einen funktionellen Leserahmen kodierten und identische Sequenzen besaßen.
1.4) Überprüfung der gefundenen Subfamilienzugehörigkeiten
Die Existenz eines vß6- bzw. vαlO-Gensegmentes in dem murinen hdm2-Protein / 81-88 spezifischen T-Zell-Klon 3 wurde auf verschiedenen Wegen verifiziert:
a) RT PCR mittels eines vß6-spezifischen Primers bzw. eines vαlO-spezifischen Primers. Die RNS wurde zuvor aus dem murinen hdm2-P2 spezifischen T-Zell-Klon 3 gereinigt, indem die spezifischen T-Zellen über anti-huCD8 magnetisch markierte Antiköφer von den murinen "feeder"-Zellen getrennt wurden. Als Negativ-Kontrolle diente ein Influenza- Matrixprotein-(FluMl 58-66) spezifischer T-Zell-Klon. b) FACS-Analyse (Figur 1) mittels eines vß6-spezifischen FITC-markierten Antiköφers (Pharmingen). Es wurde sowohl die murine T-Zell-Linie als auch der daraus entstandene Klon 3 übeφrüft. Als Positiv-Kontrolle diente ein FITC-markierter Antiköφer, der den ß- Ketten-Anteil subfamilienunabhängig erkennt. c) vß6-spezifische Antiköφer-Blockade des murinen T-Zell-Klons 3 im cytotoxischen 1 Chrom-Freisetzungstest (Figur 2).
2.) Beispiele des Design hdm2-spezifischer Konstrukte (Figur 3 [SEQ ID Nrn 38-45] und 4 [SEQ ID Nrn 1-8])
Der retrovirale Vektor pBullet, ein funktionelles Derivat von pStitch (Weijtens et al., 1998) gehört zu den sogenannten Spleiß- Vektoren, in denen das Transgen im selben Sequenzen- Kontext relativ zu den Spleiß-Akkzeptor- und Donor-Elementen SA und SD kloniert werden muß wie das env-Gen, um eine maximale Expression zu gewährleisten. Hierzu wird über entsprechende Primer eine Ncol-Schnittstelle innerhalb des Startcodons "ccATGg" konzipiert. Dies veränderte für beide Wildtyp-Ketten αTZR und ßTZR die 2. Aminosäure von Lys nach Glu bzw. Asn nach Asp. Am 3'-Ende der Leserahmen wurde die singuläre BamRl- Schnittstelle gewählt. Die Restriktionsenzyme und modifizierenden Enzyme wurden von New England Biolabs (NEB) bezogen. Bei der thermostabilen Polymerase handelte es sich zumeist um die native oder klonierte R/w-DNS-Polymerase (Pyrococcus furiosus, Stratagene) oder um die R/5c-DNS-Polymerase (Pyrococcus sp., Life Technologies)
2.1) Klonierung der murinen Wildtyp-Gene αTZR (muvα-mucα; SeqlD Nrn. 1-38) und ßTZR (muvß-mucß; Seq ID Nrn. 2-39)
Für den Fall, daß die Ncol-Schnittstelle nicht intern existierte (partiell humanisierte Ketten), konnten die Gensegmente direkt über Primer amplifiziert und kloniert werden, die die Sequenzen für Ncol enthielten (for_ΝcoI_aTCR_4, SeqlD Nr. 19; for_NcoI_bTCR_4, SeqlD Nr. 21).
Da die Ncol-Schnittstelle für die Wildtyp-Ketten im Gensegment für die konstanten Domänen vorkam, wurden die kodogenen Leserahmen über Oligonukleotide (for_ΝcoI_aTCR_5b, SeqlD Nr. 20; for_NcoI_bTCR_5b, SeqlD Nr. 22) amplifiziert, die 5'-terminal derart verkürzte, stumpfendige Ncol-Schnittstellen besaßen, so daß diese nach stumpfendigem Auffüllen Ncol-geschnittener Vektor-DΝS mit Hilfe der T4-DΝS -Polymerase mit letzteren zu vollständigen Ncol-Schnittstellen komplementierten. rev_aTCR_BamHI (SeqlD Νr. 23) und rev_bTCR_BamHI_l (SeqlD Νr. 24) wurden als abschließender reverser Primer für alle murinen Doppelketten- und Einzelketten-Konstrukte benutzt.
2.2) Generierung der chimären, partiell humanisierten TZR-Gene hu αTZR (muvα- hucα; SeqlD Νr. 40) und hu ßTZR (muvß-hucß; SeqlD Νr. 41)
Für eine funktionelle Chimärisierung der murinen TZRs sollten 2 Kriterien erfüllt werden: a) die murinen konstanten Domänen sollten derart gegen die entsprechenden humanen Domänen ausgetauscht werden, so daß diese Domänen in ihrer Immunglobulin-ähnlichen Faltungsstruktur vollständig erfaßt werden. Ebenso waren die vollständigen variablen Domänen zu erfassen, um keine Beeinträchtigung der in dieser Domäne nahezu car- boxyterminal liegenden CDR3 -Schleife zu verursachen. b) Die Fusion hatte derart zu erfolgen, daß der Übergang möglichst kein Νeoantigen generierte, das zu einer ungewollten Immunreaktion führen könnte. Im Fall von b) ergaben sich im allgemeinen für beide Ketten im Vergleich humaner mit muri- ner Sequenzen folgende Eigenschaften: in einem Bereich von bis zu 8 Aminosäuren hinter dem letzten Konsensusmotiv "GxG", das die CDR3-Schleife abschließt, sind die Positionen relativ stark konserviert. Dieser Bereich wird durch eine hochkonservierte Sequenz von bis zu 11 Aminosäuren abgeschlossen. Hiernach beginnen die murinen von den humanen Sequenzen, für jede Spezies hoch konserviert, abzuweichen. Der zentrale Bereich liegt in der ausgedehnten Schleife, die die variable Domäne mit der konstanten verbindet (siehe Kriterium a)). Im Idealfall war die Chimärisierung innerhalb einer hoch konservierten Aminosäure (AS)- Triplett-Sequenz vorzunehmen.
Im Fall des αTZR bestand die hochkonservierte Triplettsequenz aus "Q-N-P" (Base 400-408 relativ zum Startcodon des murinen αTZR). An Position 407-415 schloß sich eine singuläre /wNI-Schnittstelle an, die zur Fusion genutzt werden konnte: die 3'-versetzte Lage der AlwNl bedingte, daß statt des in humanen Sequenzen konservierten Aspartats das in murinen Sequenzen konservierte Glutamat vorlag. Dieser konservative Aminosäureaustausch wurde als wenig immunogen und damit tolerabel erachtet. Der chimäre, hoch-konservierte Bereich lautete Il33-Q-N-P-E-P-A-V-Y-Q-L-R144 in dem R144 die erste humanspezifische Aminosäure darstellt. I befindet sich an der neunten Position hinter dem die CDR3 -Schleife abschließenden Konsensusmotiv "GxG".
Die Klonierungsstrategie sah vor, die LMP-Agarose-isolierten EcoRI/ /wNI-geschnittenen vα-Segmente mit den AlwNl/BamHl- verdauten cα-PCR-Amplifikaten zu ligieren, die gemischten Ligationsprodukte mit EcoRI und BamRl nachzuschneiden und das präparierte Li- gationsprodukt der potentiell korrekten Fragmentlänge in den Εxpressionsvektor pcDNA3.1(- ) (Invitrogen) zu klonieren. Ein asymmetrischer Testverdau ergab die Klone mit der gewünschten Abfolge der Ligationsedukte.
Die humanen konstanten Gensegmente cα bzw cß wurden durch klassische RT-PCR, wie sie als Bestandteil des oben beschriebenen Roche-Kits implementiert ist, mit anschließender "nested" PCR aus der humanen Leukämie-Zelllinie Jurkat isoliert.
Im Fall des humanen cα- Gensegmentes mußte mit Hilfe mutagener PCR-Primer an 2 Positionen zum einen die .4/wNI-Schnittstelle (T nach A; s. Tabelle unten) generiert werden und zum anderen die Kompatibilität zur murinen Sequenz hergestellt werden (c nach a; s. Tabelle unten), da die mittleren 3 Positionen der /wNI-Schnittstelle degeneriert sein dürfen:
Figure imgf000033_0001
Die in der murinen Sequenz natürlich vorkommende -4/wNI-Schnittstelle ist fett dargestellt, die 3 '-versetzte Schnittposition ist unterstrichen. Das degenerierte Triplett ist klein geschrieben. Die erforderlichen Basenaustausche für den humanen „Primer" zur Beibehaltung einer Maussequenz-kompatiblen /wNI-Schnittstelle sind fett dargestellt. Die 5 '-initiale Base des mutagenen Primers ist kursiv. Die resultierende chimäre AS-Sequenz ist fett dargestellt (s. Text); das hoch-konservierte AS-Triplett ist zudem unterstrichen.
Die Amplifikation des cα-Fragmentes erfolgte über eine „nested" PCR. Die Mutationen wurden in den „nested" Primer (for_hucaTCR_AlwNI_3; SeqlD Nr. 27) gelegt, wohingegen der RT-PCR - Primer (for_hucaTCR_2; SeqlD Nr. 25) noch der humanen Wildtyp-Sequenz entsprach. Der reverse „nested" Primer rev_hucaTCR_BamHI_l (SeqlD Nr. 28) besaß sowohl das Stopcodon als auch die klonierbare RαmHI-Schnittstelle, wohingegen der reverse RT-PCR-Primer (rev_hucaTCR_2; SeqlD Nr. 26) den 3 '-liegenden nicht-kodogenen Bereich erkannte.
Im Fall des ßTZR kam ebenso das "nested" PCR-Prinzip gekoppelt an eine stumpfendige Li- gation zur Anwendung (SeqlD Nrn. 29-32). Die hoch-konservierte Triplettsequenz bestand aus "E-D-L" (Base 400-408 relativ zum Startcodon des murinen ßTZR). Deckungsgleich befand sich eine das variable Gensegment umfassende und singuläre BstYl- Schnittstelle (Base 402-407). Ein für das humane konstante Domänen-Gensegment spezifischer Primer (for_hucbTCR_4; SeqlD Nr. 31) sollte über sein 5'-terminales Ende, das mit einem phos- phorylierten „T" die letzte Base der potentiell palindromen Erkennungssequenz von BstYl darstellt, das mit ÄstYI-verdaute (produziert überhängende 5 '-Enden, die mit der T4-DNS- Polymerase komplementär unter Zugabe von dNTP's aufgefüllt und nicht abgedaut werden) und stumpfendig aufgefüllte 3 '-Ende des murinen variablen Domänen-Gensegmentes komplementieren, so daß der richtige Leserahmenkontext erhalten blieb. Das vß-Fragment wurde mit EcoRI nachgeschnitten und aus einem LMP-Gel isoliert, das cß-PCR-Amplifikat wurde als zusätzlich enzymatisch phosphoryliertes (T4-Polynukleotid-Kinase, NΕB) einseitig stump- fendiges BamHl - Fragment in der Ligation eingesetzt. Die gemischten Ligationsprodukte wurden mit EcoRI / BamHl nachgeschnitten und das Fragment mit der potentiell richtigen Fragmentlänge in pcDNA3.1(-) kloniert. Ein asymmetrischer Testverdau ergab die Klone mit der gewünschten Abfolge und Orientierung der Ligationsedukte.
Figure imgf000034_0001
Die in der murinen Sequenz natürlich vorkommende ÄstYI-Schnittstelle ist fett dargestellt, die 5 '-versetzte Schnittposition, die 5 '-Überhänge generiert, ist unterstrichen. Die 5 '-initiale und phosphorylierte Base „T" des humanen „nested" Primers, die die letzte Base von BstYl im chimären Konstrukt ergänzt, ist kursiv. Die resultierende chimäre AS-Sequenz ist fett dargestellt (s. Text); das hoch-konservierte AS-Triplett ist zudem unterstrichen.
Der chimäre hoch-konservierte Bereich lautete E -D-L-N in dem N die erste human- spezifische Aminosäure darstellt. E133 befindet sich an der siebten Position hinter dem konservierten "GxG"-Motiv, das die CDR3-Schleife abschließt.
2.3) Generierung der Einzelketten-TZRs muvα-Li-muvß-muccß(SeqID Nr. 42) und muvß-Li-muvα-muccα(SeqID Nr. 43)
Einzelketten-TZRs bestehen aus der Fusion der variablen Domänen vα mit vß und einer angefügten konstanten Domäne cα oder cß (Eshar et al., 1993). Der Vorteil solcher Konstrukte liegt in der definierten 1 : 1 -Stöchiometrie der beiden variablen Domänen in einem Konstrukt und der definierten Reaktivität aufgrund der auszuschließenden heterogenen Paarung endogener mit exogener Doppelketten-TZRs. Die variablen Domänen wurden über einen flexiblen Polylinker eines redundanten (GGGGS)3-Motivs verbunden. Die Enden des synthetischen Oligonukleotids beherbergten singuläre Schnittstellen, mit denen das carboxyterminale Ende der einen variablen Domäne, hinter der essentiellen CDR3-Schleife gelegen, mit dem Anfang der anderen variablen Domäne, hinter der Sequenz, die für das signalpeptid kodiert, liegend verknüpft werden konnten. Kozeptionell wurden fünf Kriterien beachtet: a) der Polylinker mußte lang genug sein, um die Enden der variablen Enden zu verbinden. Hierzu wurden murine TZR-Kristallstrukturen einer MHC-H-2Kb-Spezifität zu Rate gezogen. b) der Polylinker hatte die Enden derart zu verbinden, so daß dieser zum einen die Spezifität der CDR3-Schleife nicht beeinträchtigte, zum anderen das Signalpeptid der nachgeschalteten variablen Domäne hinreichend eliminierte unter Beibehaltung ihrer funktionellen Struktur. Um dies zu bewerkstelligen, wurden in dem Polylinker Aminosäure-Sequenzen der jeweiligen variablen Domäne mit aufgenommen für den Fall, in dem die singulären Schnittstellen nicht ideal lagen. c) Der Polylinker mußte zum einen flexibel sein, was mit Hilfe einer sterisch begünstigenden Aneinanderreihung von Glycin-Resten bewerkstelligt werden sollte, zum anderen hinreichend löslich sein, um Aggregatbildung und Präzipitation zu vermeiden: die Hydroxyl- Gruppe des Serin-Restes bildet Wasserstoff-Brücken mit solvatisierenden Wasser- Molekülen aus und bildet lokale Dipole. d) um die Transkription im richtigen Leserahmen nicht zu beeinträchtigen, wurden die kodo- genen Tripletts für die Glycin-Reste variiert ("GGC" und "GGA"). e) der Polylinker mußte dieselben internen singulären Schnittstellen besitzen wie die Wildtypsequenzen, um in einem 2-Schritt-Klonierungsverfahren die Zwischenprodukte aufzuschneiden und die nahezu vollständigen Wildtypsequenzen über diese singulären Schnittstellen 3'-terminal anzufügen.
Unter diesen Voraussetzungen war es möglich zwei Orientierungen der variablen Domäne zuzulassen :
Im Fall des Konstruktes muvα-Li-muvß-mucß (SeqlD Nr. 42; Figur 5) wurde die singuläre Schnittstelle Kpnl hinter dem letzten Konsensus-Motiv "GxG" der variablen vα-Domäne und Drälll als die die Signalpeptid kodierende Sequenz abschließende Restriktionsschnittstelle in der vß-Domäne gewählt. In einem ersten Schritt wurde das hybridisierte, doppelsträngige Oligonukleotid beidseitig mit Kpnl geschnitten und zwischen die vα-kodierende und cα- kodierende Sequenz des Wildtyp-αTZR kloniert. Hiernach wurde das chimäre Zwischenprodukt mit DrάllllBamHl aufgeschnitten und die die ßTZR-kodierende Sequenz, die über einen DrallllBamHl- Verdau ihre die Signalpeptid-kodierende Sequenz verloren hatte, hineinklo- niert. Das erste Glycin des Polylinkers lag an Position 6 relativ zum aminoterminalen Gly des "GxG"-Konsensus-Motivs in vα, das letzte Serin des Polylinkers, aufgrund einer zwischengeschalteten stumpfendigen Ligation über ein Arginin verbunden, vor Position Asp22 der vß- Domäne. Im Fall des Konstruktes muvß-Li-muvα-mucα (SeqlD Nr. 43; Figur 6) wurde die singuläre Schnittstelle Sc l hinter dem letzten Konsensus-Motiv "GxG" der variablen vß-Domäne und Bsgl als die die Signalpeptid kodierende Sequenz abschließende Restriktionsschnittstelle in der vα-Domäne gewählt. In einem ersten Schritt wurde das hybridisierte, doppelsträngige Oligonukleotid beidseitig mit Scαl geschnitten und zwischen die vß-kodierende und cß- kodierende Sequenz des Wildtyp-ßTZR kloniert. Hiernach wurde das chimäre Zwischenprodukt mit BsgllBamHl aufgeschnitten und die die αTZR-kodierende Sequenz, die über einen
Figure imgf000036_0001
ihre die Signalpeptid-kodierende Sequenz verloren hatte, hineinkloniert. Das erste Glycin des Polylinkers lag an Position 6 relativ zum aminoterminalen Gly des "GxG"-Konsensus-Motivs in vß, das letzte Serin des Polylinkers vor Position Val24 der vα- Domäne.
2.4) Generierung der Doppelketten-TZRs in Fusion zur humanen CD3ζ-Kette muvα- hucα-huCD3ζ (SeqlD Nr. 44; Figur 7) und muvß-hucß-huCD3ζ (SeqlD Nr. 45; Figur 8)
Die Signaltransduktion der Doppelketten-TZRs sollte optimiert werden. Hierzu fusionierte man die jeweiligen Doppelketten-α/ßTZRs an die nahezu vollständige CD3ζ-Untereinheit des CD3 -Komplexes. Diese Fusion bewerkstelligt gemäß verschiedener Publikationen (Eshar et al., 1994) eine effiziente und CD3 -unabhängige Kopplung des TZR an die in der Kaskade flußaufwärts bzw. flußabwärts liegenden Effektoren Lck56 bzw. ZAP-70.
Es wurde eine modifizierte Ligations-PCR-basierende Technik etabliert, mit deren Hilfe man unabhängig von singulären Schnittstellen beliebige Fusionen zur Herstellung chimärer Proteine erzeugen konnte und die Spezifität der erhaltenen PCR-Amplifikate deutlich erhöht wurde im Vergleich zu einer konventionellen Ligations-PCR. Die genetische Fusion wird über einen reversen, chimären Primer (rev_huca-hu_tm_Zeta, SeqlD Nr. 36, Figur 7; rev_hucb- hu_tm_Zeta; SeqlD Nr. 37, Figur 8) definiert, der mit einem Vorwärts-Primer (T7_for; SeqlD Nr. 33) als PCR-Amplifikat den "Mega-Primer" produziert: in einem ersten, konventionellen Ligations-PCR-Schritt wird für den 5'-liegenden Fusionspartner ein "Megaprimer" generiert, der zudem als Sequenzanhängsel eine kurze für den 3 '-liegenden Fusionspartner spezifische Sequenz trägt. Um die Spezifität der PCR-Signale deutlich zu erhöhen, werden bereits in der ersten PCR Primer verwendet, die außerhalb des kodogenen, chimären Amplifi- kates an den vorgelegten „Templates" hybridisieren (T7_for; T7_rev; SeqlD Nr. 33, 34), um dann in der zweiten PCR inwärts-liegende ("nested") Primer zu verwenden. In dieser liefert der Mega-Primer zusammen mit einem auf den 3 '-liegenden Fusionspartner hybridisierenden reversen "nested" Primer (rev_hZeta_BamHI_4; SeqlD Nr. 35) ein Zwischenprodukt, das mit einem dritten, am 5'-Ende "nested" liegenden Vorwärts-Primer (for_aTCR_NcoI_5b; for_bTCR_NcoI_5b; SeqlD Nr.s 20, 22) ein an den Enden getrimmtes PCR-Amplifikat liefert.
Der Fusionspunkt wurde auf die die Disulfidbrücken-bildenden Cysteine festgelegt: hierdurch verloren die TZRs ihre cytoplasmatische Sequenz, die Transmembrane und einen kurzen Bereich extracytoplasmatisch liegender Aminosäuren bis zum dimerisierenden Cystein, die humane D -Kette verlor ebenso einen kurzen extraycytoplasmatischen Abschnitt, sollte aber exklusive ihres Cystin-bildenden Cysteins für den transmembranen und cytosolischen Bereich inkusive der drei bivalenten "ITAM"-Motive kodieren. Der reverse chimäre Primer kodiert für die 3'-terminal liegenden 21 Basen des jeweiligen partiell humanisierten TZR und für die 5'-terminal liegenden 21 Basen der humanen CD3ζ-Kette (Figur 7). Die chimären Konstrukte sind von der konstanten Domäne an humanisiert.
3.) Transduktion humaner peripherer Blut Lymphozyten (PBLs)
Zur Transduktion humaner peripherer T-Lymphozyten wurde ein funktionelles Derivat des pStitch-Systems (Weijtens et al., 1999), verwendet. Die zur Veφackung notwendigen retroviralen Gene werden über individuelle Plasmide im Wege einer Cotransfektion der Veφak- kungszellinie 293T kodiert (Soneoka et al., 1995): pHit60 kodiert für die gag-pol - Struktur- und Polymerase - Gene aus dem Moloney murinen Leukämie Virus (MoMuLV), pColt-Galv für das env - Hüllprotein des "gibbon ape leukemia virus", das imstande ist, an den Na+- /Phosphat-Synporter Pit humaner Zellen zu binden und damit letztere zu transduzieren. Die chimären Viruspartikel besitzen somit einen amphotropen Pseudotyp und können verschiedene Säugerzellen, außer Maus, transduzieren.
3.1) Transfektion der Verpackungszelllinie 293T
Die isolierten bakteriellen Klone der in das pStitch-Derivat klonierten T-Zell-Rezeptor-Gene wurden über Plasmid-Präparationen, die eine Entfernung residueller Endotoxine versprechen (Qiagen, Produkt 12362), gereinigt und zu 1 μg/μl eingestellt. Die DNS wurde über die Cal- ciumphosphat-Präzipitation transient in die Veφackungszelllinie 293 T eingeführt (GiboBRL- Life Technologies, Produkt 18306-019). Hierbei werden im Rahmen der WT- oder modifizierten Doppelketten-T-Zell-Rezeptoren αTZR und ßTZR bis zu 80 μg DNS eingesetzt: 20 μg αTZR - Konstrukt 20 μg ßTZR - Konstrukt 20 μg pColt-Galv 20 μg pHit 60
Im Fall der Einzelketten-TZRs werden 60 μg DNS eingesetzt. 293T wurde in einem modifizierten DMEM-Medium (DMEM/H) kultiviert:
DMEM, 4,5% Glukose (BioWhittaker)
10% hitzeinaktiviertes FKS
2mM Glutamin lx Penicillin/Streptomycin lx nicht-essentielle Aminosäuren
25 mM HEPES
Am Vortag der Transfektion wurden die Zellen 293T auf 0,9*106 Zellen pro T25-Flasche und Transfektionsansatz in 5ml DMEM/H ausgesät. 4 h vor Transfektion wurde das Medium gegen frisches, auf Raumtemperatur (RT) erwärmtes DMEM-H (3ml) ersetzt. Die Transfektion erfolgte laut Vorschrift des kommerziellen Protokolls (Life Technologies). 1ml des Transfek- tionsansatzes wurde zu der jeweiligen Flasche unter vorsichtigem Hinzutropfen pipettiert. Das DNS-Ca3(PO4)2-Präzipität sollte fein verteilt sich auf den adhärenten Zellen niederlegen.
Am darauffolgenden Morgen wurde das Medium gegen frisches, auf RT erwärmtes DMEM/H ausgetauscht. 6 h später erfolgte die Kokultivierung mit den aktivierten PBLs .
3.2) Transduktion der aktivierten PBLs
3.2.1) Aktivierung peripherer Blut-Lymphozyten (PBLs)
3 Tage vor der angesetzten Kokultivierung wurden fikollisierte PBLs zu 2*106 Zellen/ml in huRPMI-P jeweils in 2ml einer 24well-Platte (Zellgewebe-behandelte Oberflächen) ausgesät. Die Aktivierung erfolgte über den kreuz-vernetzenden Antiköφer OKT-3 (Orthoclone- Diagnostics) zu 20 ng/ml.
huRPMI-P:
RPMI 1640 (2mM Glutamin) ohne Phosphat (Life Tee, 11877-032 ) 10 % humanes, hitzeinaktiviertes AB-Serum (HLA-A2.1 seropositiv) 25 mMHEPES 1 x Penicillin/Streptomycin (Life Tee.)
Die Platten wurden in einem Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
3.2.2) Kokultivierung
Zur Kokultivierung wurden die aktivierten PBLs aus den jeweiligen Vertiefungen einer 24well-Platte vereinigt und gezählt. Adhärente Monozyten wurden verworfen. Die Zellen werden abzentrifugiert (1500 φm, 5 min, RT) und in einer Konzentration von 2,5* 106 Zellen/ml in frischem huRPMI-P aufgenommen und in den Brutschrank zurückgestellt. Das Medium wurde zuvor zu 400 U/ml IL-2 (Chiron) und 5 μg/ml Polybren (Sigma) eingestellt.
Jeder Transfektionsansatz wurde 6h nach Medium Wechsel nacheinander trypsiniert: hierzu wurde jede T25 mit 3ml HBSS (Life Technologies) gewaschen, mit 1 ml Trypsin-EDTA (Life Technologies) für maximal 5 Minuten inkubiert, die gelösten Zellen quantitativ aufgenommen und in 4ml vorgelegtes huRPMI-P (RT) unter Rühren getropft. Die 293 T Zellen werden mit 2500 rad bestrahlt. Diese werden abzentrifugiert (1500 φm, 5 min, RT) und in 4 ml frisches, eingestelltes huRPMI-P, mit 400U/ml IL-2 und 5 μg/ml Polybren supplementiert, resuspendiert. Zu dem Ansatz wurde 1 ml der eingestellten PBLs gegeben und der Ansatz (0,5* 106 PBLs/ml) für drei Tage im Brutschrank (37°C, 5% CO2) inkubiert.
Am Tag 3 nach Kokultivierung wurden die suspendierten PBLs abgenommen und in frischem, mit IL-2 (400 U/ml) supplementiertem Medium huRPMI-P zu 0,5* 106 Zellen/ml resuspendiert. 3 Tage später erfolgte ein neuerlicher Split in frisches Medium. In diesen 7 Tagen wurde maximal expandiert bis zum Übergang auf T75-Flaschen. Diese Zellen konnten direkt in einer immunologischen Anfärbung (FACS-Analsyse; Kap. 3.3, Figur 9) oder in einem klassischen 51 Chrom-Freisetzungstest (Kap. 3.4, Figuren 10-15) eingesetzt werden.
3.3) Beispiele der FACS-Analyse
Die unter 2.) beschriebenen Konstrukte wurden nach retroviraler Transduktion im "fluo- rescence activated cell sorting" (FACS) analysiert. Hierzu wurden 0,25* 106 Zellen sättigend mit Fluorophor-markierten Antiköφern gefärbt: die heterolog exprimierte ß-Kette wurde mit anti-vß6-FITC (BD) nachgewiesen; die Gesamtheit der T-Zellen über den Marker anti-CD3- PC5 (Coulter-Beckman) (Figur 9). Als Negativ-Kontrolle diente eine mit dem leeren pStitch-Derivat transduzierte Probe. Der Wildtyp muvα-mucα/muvß-mucß (2.1) sowie die chimären Konstrukte muvα-hucα/muvß- hucß (2.2) erzielten Transduktionseffizienzen im Bereich von 10-25%) 6 Tage nach Kokultivierung. Die Expression konnte in mehreren Donoren HLA-A2 - positiver T-Zellen reproduziert werden. Das cytosolisch exprimierte Grün-fluoreszierende Protein (eGFP, umkloniert aus eGFP-Nl der Firma Clontech) diente als externer Standard und zeigte auf, daß die vergleichbar schwache Transduktionseffizienz als Ausdruck des prozentualen Nachweises erfolgreich transduzierter T-Zellen ein methodisches Problem und kein intrinsisches Problem der TZR-Transgene ist.
3.3.1) Anreicherung vß6-positiver T-Zellen über magnetische Sortierung
Um die erfolgreich transduzierten T-Zellen anzureichern, wurden diese über magnetisch markierte vß6-Antiköφer im magnetischen Feld sortiert (laut Vorschrift Miltenyi-Biotec). Hierzu wurde ein magnetisch markierter Antiköφer verwendet, der den Ratten IgG-Anteil der vß6- spezifischen Antiköφer erkennt (Miltenyi-Biotec "Goat anti-rat IgG MicroBeads", Produkt 485-01). Es konnten Anreicherungen vß6-positiver CD3+ - T-Zellen von über 90% erreicht werden.
3.4) Cytolytische Aktivität der transduzierten T-Zellen
Die transduzierten T-Zellen wurden in einem klassischen 5 I Chrom-Freisetzungstest auf ihre zytotoxische Spezifität hin übeφriift. In diesem System wurden Zielzellen radioaktiv durch Inkoφoration von 51 Chrom markiert. Erkannten die retroviral modifizierten Effektorzellen die Zielzelle peptidspezifisch, wurden letztere durch die Effektorfunktionen der T-Zelle in die Apoptose getrieben und durch Lyse getötet. Das Ausmaß des freigesetzten Chrom-Nuklids trifft eine Aussage über die Effektivität der Zeil-Erkennung und Lyse. Die Effektivität wurde über einen weiten Bereich des Verhältnisses eingesetzter Effektor-Zellen zu Zielzellen (E:T) getestet. Als Referenz diente der murine hdm2-81-88 peptidspezifische T-Zell-Klon 3, aus dem die T-Zell-Rezeptor-Gene isoliert wurden. Als Zielzellen dienten:
T2: humane TAP-defiziente Zelllinie die exogen mit beliebigem Peptid zu beladen war. Das spezifische Peptid war hdm2-81-88, ein irrelevantes Kontroll-Peptid entstammte dem Influenza-Matrixprotein FluMl . Saos-2/6: Transfektante der humanen Saos-2 -Zelllinie, die hdm2 exprimiert und endogen prozessiert.
Saos2/143: Transfektante der humanen Saos-2-Zelllinie, die die p53-Mutante Val143Ala trägt. Die p53-Mutante reguliert die Expression von hdm2 in positiver Weise JY: EBV-transformierte LCL-B-Zelllinie UocBl 1, EU-3: pre-B-Zell-Leukämie IM-9: Plasmocytom
3.4.1) Peptid-Titration (Figuren 10-12)
Die Zelllinie T2 wurde exogen mit dem hdm2-81-88-Peptid in einer Konzentrationsreihe von 1* 10" M bis 1*10" M beladen. Es konnte sowohl für muvα-mucα/muvß-mucß (2.1) als auch muvα-hucα/muvß-hucß (2.2) eine Peptid-spezifische und Dosis-abhängige cytotoxische T- Zell- Antwort beobachtet werden. Für die beiden Konstrukte lagen bei E:T =20:1 die halbmaximalen Lysen im subnanomolaren Bereich eingesetzten Peptids. Als Negativ-Kontrolle fungierte ein nicht-funktioneller Einzel-Ketten T-Zell-Rezeptor, der zwar exprimiert und laut
3.3.1) anreicherbar war, aber keine Lysis-Aktivität aufwies. Als Positiv-Kontrolle diente der murine hdm2-81-88 peptidspezifische T-Zell-Klon 3.
3.4.2) Erkennung von maligne transformierten Zeil-Linien (Figuren 13-15)
Die oben beschribenen Zelllinien konnten Peptid-spezifisch lysiert werden. Einige der pre-B- Zell-Leukämien konnten im Fall der WT-Ketten bei hohen E:T's zu 100 % lysiert werden. Ebenso wie im Fall der Peptid-Titration zeigten die Wildtyp-Ketten (2.1) eine höhere Lysis- Effizienz im Vergleich zu den partiell humanisierten, chimären Ketten (2.2). Als Negativ- Kontrolle fungierte ein nicht-funktioneller Einzel-Ketten T-Zell-Rezeptor, der zwar exprimiert und laut 3.3.1) anreicherbar war, aber keine Lysis-Aktivität aufwies. Als Positiv- Kontrolle diente der murine hdm2-81-88 peptidspezifische T-Zell-Klon 3.

Claims

Patentansprüche
1. Polypeptid eines eine hdm2-Protein-spezifische T-Zell Antwort vermittelnden murinen α/ß T-Zell Rezeptors gemäß SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder funktioneller Varianten oder Teile davon oder dieses kodierende Nukleinsäuren, funktionelle Varianten oder Teile davon.
2. Fusionsprotein, umfassend ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder funktionelle Varianten oder Teile davon oder dieses kodierende Nukleinsäuren, funktionelle Varianten oder Teile davon.
3. Fusionsprotein nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die ζ-Region von CD3 und/oder CD8, CD 16 oder Teile davon umfaßt, insbesondere die ζ-Region von humanem CD3 und/oder CD8, CD 16 oder Teile davon.
4. Fusionsprotein nach Anspruch 2 oder 3, weiterhin einen flexiblen Linker umfassend, insbesondere einen Linker der Aminosäuresequenz (GGGGS)3.
5. Fusionsprotein nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein chimäres, zumindest partiell humanisiertes Fusionsprotein handelt, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4.
6. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Einzelketten T-Zell Rezeptor handelt, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6.
7. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Doppelketten T-Zell Rezeptor handelt, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8.
8. α- oder ß-Kette eines T-Zell-Rezeptors, der die Antigen-Erkennungssequenz eines für die Aminosäuren 81-88 des Proteins hdm2 oder eines Komplexes von hdm2 81-88 und HLA- A2 spezifischen Antiköφers umfaßt.
9. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid synthetisch hergestellt worden ist.
10. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, insbesondere eine doppelsträngige DNA mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 18 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 24 Nukleotiden ist.
11. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz der Nukleinsäure mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist.
12. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1, 2, 10 oder 11 in Form ihrer komplementären „antisense"-Sequenz.
13. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure synthetisch hergestellt worden ist.
14. Vektor, vorzugsweise in Form eines Plasmids, Shuttle Vektors, Phagemids, Cosmids, Expressionsvektors, retroviralen Vektors adenoviralen Vektors oder Partikels und/oder gentherapeutisch wirksamen Vektors, umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 10 bis 13.
15. Wirtszelle, transfiziert mit einem Vektor oder infiziert oder transduziert mit einem Partikel gemäß Anspruch 14.
16. Wirtszelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine T-Zelle oder eine T-Zell- Vorläuferzelle oder eine Stammzelle handelt.
17. Wirtszelle nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß auf ihrer Oberfläche ein Polypeptid oder Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 exprimiert wird.
18. Verfahren zur Identifizierung von hdm2-Protein-spezifischen Antigenen, dadurch gekennzeichnet, daß hdm2 -präsentierende Tumorzellen oder Fraktionen davon mit einer Wirtszelle gemäß Anspruch 17 unter Bedingungen zusammengebracht werden, bei denen die Tumorzellen oder Fraktionen davon nur dann lysiert werden, wenn der Tumor das hdm2- Protein-spezifische Antigen präsentiert, für welches das exprimierte Polypetid oder Fusionsprotein spezifisch ist.
19. Verfahren zur Herstellung eines gegen ein Polypeptid, Fusionsprotein oder eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 gerichteten Antiköφers, vorzugsweise eines polyklonalen oder monoklonalen Antiköφers zur Diagnose, Behandlung und/oder Überwachung der Behandlung von mit hdm2-Protein assoziierten Erkrankungen und/oder zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antiköφer produzierender Organismus mit einem Polypeptid oder funktionelle Äquivalente davon oder Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 12 Aminosäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 immunisiert bzw. mit diesen kodierenden Nukleinsäuren vakziniert wird.
20. Antiköφer, hergestellt gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 gerichtet ist.
21. Rekombinanter Antiköφer, dadurch gekennzeichnet, daß er die Antigen- Erkennungssequenz der α- oder ß-Kette eines für die Aminosäuren 81-88 des Proteins hdm2 oder eines Komplexes von hdm 2 81-88 und HLA-A2 spezifischen T-Zell- Rezeptors umfaßt.
22. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von mit hdm2-Protein assoziierten Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid, mindestens eine Wirtszelle oder mindestens ein Antiköφer nach einem der vorgenannten Ansprüche zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.
23. Arzneimittel zur Behandlung von mit hdm2-Protein assoziierten Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid, mindestens eine Wirtszelle oder mindestens einen Antiköφer nach einem der vorgenannten Ansprüche, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält.
24. Verwendung eines Arzneimittels nach Anspruch 23 zur Behandlung von mit hdm2- Protein assoziierten Erkrankungen.
25. Verfahren zur Herstellung eines Tests zur Auffindung funktioneller Interaktoren in Zusammenhang mit hdm2 -Protein assoziierten Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens ein Antiköφer nach einem der vorgenannten Ansprüche zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird.
26. Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren in Zusammenhang mit hdm2 -Protein assoziierten Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Nukleinsäure, mindestens ein Polypeptid oder mindestens einen Antiköφer nach einem der vorgenannten Ansprüche, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält.
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