JPH10501697A - インターロイキン−５特異的組換え抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ドナー抗体由来のＨ鎖および／またはＬ鎖の抗原結合残基を含有する効果的な抗IL-5組換え抗体分子。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン−５特異的組換え抗体 本発明は、組換え抗体分子(RAM)に関し、特に、ヒトインターロイキン−５(hI L-5)に対して特異性を有するヒト化抗体分子(HAM)、上記組換え抗体のＨ鎖およ びＬ鎖可変ドメインをコードする核酸、組換えDNA技術を用いて上記抗体を産生 する方法、および組換え抗体の治療的使用に関する。 本明細書中では、用語「組換え抗体分子」(RAM)は、組換えDNA技術の使用を伴 う方法により産生される抗体を記載するために用いられる。用語「ヒト化抗体分 子」(HAM)は、ヒト免疫グロブリンに由来する分子を記載するために用いられる 。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメイン、または可変ド メインにおいて適切なフレームワーク領域に付加された１つ以上の相補性決定領 域(CDR)のいずれかを含有し得る。略語「MAb」は、モノクローナル抗体を示すた めに用いられる。 用語「組換え抗体分子」は、完全な免疫グロブリン分子のみでなく抗原結合免 疫グロブリンフラグメント（例えば、Fv、Fab、およびF(ab')₂フラグメント）な らびにそれらの任意の誘導体（例えば、単鎖Fvフラグメント）も包含する。 天然の免疫グロブリンが、アッセイ、診断、および制限された範囲内の治療に 用いられている。治療における免疫グロブリンの使用は、治療剤としての使用可 能性のある大部分の抗体が齧歯動物脾臓細胞と齧歯動物ミエローマ細胞との融合 物により産生されるMAbであるために妨げられている。従って、これらのMAbは、 本質的に齧歯動物タンパク質である。ヒトにおけるこれらのMAbの治療剤として の使用は、HAMA（ヒト抗マウス抗体）応答と呼ばれる、望ましくない免疫応答を 誘起し得る。ヒトにおける齧歯動物MAbの治療剤としての使用は、ヒト被験体がM Abに対して免疫学的応答を高め、これによりその有効性を完全に取り除くか、ま たは少なくとも減少させるかのいずれかであるという事実により本質的に制限さ れる。 このような非ヒトMAbの抗原特性を減少させるための多くの技術が開発されて いる。これらの技術は一般に、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするDNA配列 を操作するために組換えDNA技術の使用を伴う。これらの方法は一般に、「ヒト 化」技術と呼ばれる。 MAbをヒト化する初期の方法は、キメラ抗体の産生を伴う。ここで、１つの抗 体の完全な可変ドメインを含有する抗原結合部位は、別の抗体に由来する定常領 域に融合される。このようなキメラ化手順を実行する方法は、EP 0120694(Cellt ech Limited)およびEP 0125023(Genentech Inc.およびCity of Hope)に記載され ている。しかし、ヒト化キメラ抗体は、かなりの部分の非ヒトアミノ酸配列を依 然として含有し、そして特に長期にわたって投与される場合に、依然として何ら かのHAMA応答を惹起し得る[Begentら，Br.J.Cancer，62，487(1990)]。 別のアプローチはEP-A-0239400(Winter)に記載されており、組換えDNA技術を 用いるヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域へのマウスMAb の相補性決定領域(CDR)の付加を伴う。それぞれのＨ鎖およびＬ鎖可変ドメイン には、３つのCDR(CDR1、CDR2、およびCDR3)が存在する。このようなCDR付加ヒト 化抗体は、それらの含有する非ヒトアミノ酸配列の割合がより少ないという点か らみて、ヒト化キメラ抗体よりもHAMA応答をより誘起しないようである。Riechm annら[Nature，332 323-324(1988)]において、CDR単独の転移は、Kabat[Sequenc es of Proteins of Immunological Interest、米国厚生省、NIH、USA(1987)]に より明らかにされたように、CDR付加産物に満足な抗原結合活性を提供するのに 十分でなかった。Riechmannらは、CDRの外側、特にCDR1に隣接するループの中の 多くの残基を変えることが必要であることを見出した。しかし、得られた最善の CDR付加抗体の結合親和性は、依然として元のMAbの結合親和性よりも顕著に低か った。 WO 91/09967において、Adairらは、CDR付加抗体のＨ鎖およびＬ鎖を記載し、 そしてドナー残基のヒエラルキー(hierarchy)を決定した。 WO 93/16184において、Chouらは、ヒトインターロイキン-5に対するヒト化モ ノクローナル抗体の設計、クローニング、および発現を記載した。動物抗体のヒ ト化のためのヒトフレームワークとして用いられるヒト抗体配列を選択するため の方法が示唆され、この方法は、同一性百分率、配列のアンビギュイティー(amb iguity)、および同様のPIN領域スペーシングについて、ヒト可変ドメイン配列と 、ヒト化される動物MAbの可変ドメイン配列とを比較する工程を包含する。PIN領 域スペーシングは、ドメイン内ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基間の 残基数として定義される。これらの特徴の最善の組み合わせを有するヒト抗体が 選択される。ヒト化のために選択されるべき動物MAbの可変ドメイン残基がどれ であるかを決定する方法もまた、示唆される。この方法は、動物モノクローナル 抗体の潜在的な最小の残基（CDR構造ループならびにCDR構造ループを支持および ／または方向付けするために必要な残基を含有する残基）および最大の残基（Ka batのCDR、CDR構造ループ、CDR構造ループを支持および／または方向付けするた めに必要な残基、およびCDR構造ループの約10Åの中にあり、かつ約５Ųまたは それより大きい水溶媒接近可能表面を有する残基を含有する残基）を決定する工 程を包含する。さらに、コンピューターによるモデル化が、全ての可能な組換え 抗体で行われる。この抗体は、最小の残基および最大の残基が挿入されているヒ ト抗体フレームワーク配列を含有する。最小の残基および最大の残基が、動物モ ノクローナル抗体の構造に最も近いコンピューターモデル構造を有する組換え抗 体を作出する組み合わせに基づいて、選択される。得られたヒト化抗IL-5抗体は 、hIL-5分子に対するその親和性をかなりの量で失ったようである。 hIL-5分子に対する改善された親和性を有するヒト化抗体分子を提供すること が本発明の目的である。 従って、本発明は、ヒトIL-5に親和性を有し、かつヒトIL-5に対する親和性を 有するドナー抗体のＨ鎖およびＬ鎖の可変ドメインに由来する抗原結合領域を含 有するRAMを提供し、RAMは、ドナー抗体の結合親和性と類似の結合親和性を有す る。 本発明のRAMは、任意の適切なドナー抗IL-5抗体に由来する抗原結合領域を含 有し得る。代表的には、ドナー抗IL-5抗体は、齧歯動物MAbである。好ましくは 、ドナー抗体は、MAb 39D10である。 MAb 39D10のＨ鎖およびＬ鎖の可変ドメインを、以下で図１および図２を参照 して特に記載する。 本発明の好ましい１つの局面によれば、本発明のRAMは、混成Ｈ鎖および相補 的なＬ鎖を含有する、ヒトIL-5抗原に対して親和性を有する抗IL-5抗体分子であ る。上記混成Ｈ鎖は、主にアクセプター抗体Ｈ鎖のフレームワーク残基およびド ナー抗体Ｈ鎖の抗原結合残基を含有する可変ドメインを有する。上記ドナー抗体 は、ヒトIL-5に対して親和性を有する。ここで、上記混成Ｈ鎖は、少なくとも31 位〜35位、50位〜65位、および95位〜102位（Kabatの番号付けシステムに従う） [Kabatら，Sequences of Proteins of Immunological Interest、第Ｉ巻、第５ 版、1991、米国厚生省、国立衛生研究所]にドナー残基を含有する。 好ましくは、混成Ｈ鎖フレームワークは、23位、24位、27位〜30位、37位、49 位、73位、および76位〜78位に、または24位、27位〜30位、37位、49位、73位、 76位、および78位にドナー残基をさらに含有する。 本発明の第２の好ましい局面によれば、混成Ｌ鎖および相補的なＨ鎖を含有す る、ヒトIL-5抗原に対して親和性を有する抗IL-5抗体分子が提供される。上記混 成Ｌ鎖は、主にアクセプター抗体Ｌ鎖のフレームワーク残基およびドナー抗体Ｌ 鎖の抗原結合残基を含有する可変ドメインを有する。上記ドナー抗体は、ヒトIL -5に対して親和性を有する。ここで、上記混成Ｌ鎖は、少なくとも24位〜34位、 50位〜56位、および89位〜97位（Kabatの番号付けシステムに従う）にドナー残 基を含有する。 好ましくは、混成Ｌ鎖フレームワークは、22位、68位、および71位に、または 68位および71位にドナー残基をさらに含有する。 本発明の第３の好ましい局面によれば、本発明の第１の局面に記載の混成Ｈ鎖 および本発明の第２の局面に記載の混成Ｌ鎖を含有する、ヒトIL-5抗原に対して 親和性を有する抗IL-5抗体分子が提供される。 好ましくは、本発明のそれぞれのRAMは、ヒトIL-5に対して10^-9Ｍを超える大 きさの親和定数を有する。 本発明が、一般に抗IL-5 RAMの産生に広範に適用できるということが認識され る。従って、ドナー抗体は、任意の動物に由来する任意の抗IL-5抗体であり得る 。アクセプター抗体は、同じ種の動物に由来し得、そして同じ抗体クラスまたは サブクラスであり得る。しかし、より通常には、ドナー抗体およびアクセプター 抗体は、異なる種の動物に由来する。代表的には、ドナー抗IL-5抗体は、非ヒト 抗 体（例えば、齧歯動物MAb）であり、アクセプター抗体は、ヒト抗体である。 任意の適切なアクセプター可変フレームワーク配列は、抗原結合領域が由来す るドナー抗体のクラスまたはタイプを考慮して用いられ得る。好ましくは、用い られるアクセプターフレームワークのタイプは、ドナー抗体のクラスまたはタイ プと同一または類似のクラスまたはタイプである。便宜的には、選択されるフレ ームワークは、ドナー抗体に最も相同性を有する。好ましくは、ヒトIII群γ生 殖系列フレームワークが混成Ｈ鎖に用いられ、そしてヒトＩ群κ生殖系列フレー ムワークが混成Ｌ鎖に用いられる。 本発明のRAMの定常領域ドメインは、計画される抗体機能、特に、必要とされ 得るエフェクター機能を考慮して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、 ヒトのIgA、IgE、IgG、またはIgMドメインであり得る。特に、ヒト化抗体分子が 治療的使用を意図される場合、および抗体エフェクター機能が必要とされる場合 、IgGヒト定常領域ドメイン、とりわけ、IgG1およびIgG3イソタイプのヒト定常 領域ドメインが用いられ得る。あるいは、ヒト化抗体分子が治療目的を意図され る場合、および抗体エフェクター機能が、（例えば、特異的に結合してヒトIL-5 の生物学的活性を中和するために）必要とされない場合、IgG2およびIgG4イソタ イプが用いられ得る。改変されたヒト定常領域ドメインはまた、１つ以上のアミ ノ酸残基が、特定のエフェクター機能を変化させるために改変または欠失されて いる場合に、用いられ得る。好ましくは、RAMの定常領域ドメインは、ヒトIgG4 である。 本出願中で上記または他のいずれかに記載の残基の名称は、Kabatの番号付け[ Kabatら，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第Ｉ巻，第５版 ，1991，米国厚生省、国立衛生研究所]に従って番号付けされている。従って、 残基の名称は、アミノ酸残基の一次番号付けと必ずしも直接対応するわけではな い。実際の一次アミノ酸配列は、Kabatの番号付けよりも少ない、または付加的 なアミノ酸を含有し得、これは、基本的な可変ドメイン構造の短縮または基本的 な可変ドメイン構造への挿入に対応する。 また、本発明の抗IL-5抗体分子は、それらをエフェクターまたはレポーター分 子に結合させたものであり得る。あるいは、組換えDNA技術の手順は、免疫グロ ブリン分子を産生するために用いられ得、ここで、完全な免疫グロブリンのFcフ ラグメントまたはCH3ドメインは、機能的非免疫グロブリンタンパク質（例えば 、酵素、サイトカイン、成長因子、または毒素分子）により置換されているか、 またはペプチド結合によりそれらに結合している。 従って、抗体分子の残りの部分は、免疫グロブリンに由来する配列のみを含有 する必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の一部をコードするDNA配列を 、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子のアミノ酸配列をコードする DNA配列と融合した遺伝子が、構築され得る。 本発明のさらなる局面は、混成Ｈ鎖および混成Ｌ鎖をコードするDNA配列を包 含する。このDNA配列を含有するクローニングベクターおよび発現ベクター、こ のDNA配列で形質転換した宿主細胞、および形質転換した宿主細胞中でこのDNA配 列を発現する工程を包含する抗体分子を産生する方法もまた、本発明のさらなる 局面である。 ベクターを構築し得る一般的方法、トランスフェクション法、および培養法は 、当該分野で周知であり、そして本発明の部分を構成するものではない。 抗IL-5ドナーアミノ酸配列をコードするDNA配列は、当該分野で周知の方法に より得られ得る（例えば、国際特許出願第WO 93/16184号を参照のこと）。例え ば、抗IL-5コード配列は、適切なハイブリドーマ細胞株（例えば、39D10細胞株 ）からゲノミッククローニングまたはcDNAクローニングにより得られ得る。ポジ ティブクローンは、必要なＨ鎖およびＬ鎖のための適切なプローブを用いてスク リーニングされ得る。また、PCRクローニングも用いられ得る。 アクセプターアミノ酸配列をコードするDNAは、任意の適切な方法により得ら れ得る。例えば、好ましいヒトアクセプターフレームワーク（例えば、ヒトのＩ 群Ｌ鎖およびヒトのIII群Ｈ鎖）をコードするDNA配列は、当業者に広範に利用さ れる。 分子生物学の標準的な技術は、所望のDNA配列を調製するために用いられ得る 。この配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、完全にまたは部分的に合 成され得る。部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術も、適 切に用いられ得る。例えば、Jonesら[Nature，321，522(1986)]に記載のような オ リゴヌクレオチド特異的合成(oligonucleotide directed synthesis)が、用いら れ得る。また、既存の可変領域のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発が、例えば 、Verhoeyenら[Science，239，1534-1536(1988)]に記載のように用いられ得る。 また、T4 DNAポリメラーゼを用いてのギャップのあるオリゴヌクレオチドの酵素 的充填が、例えば、Queenら[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，10029-10033(1989) およびWO 90/07861]に記載のように用いられ得る。 任意の適切な宿主細胞およびベクター系が、RAMをコードするDNA配列の発現に 用いられ得る。好ましくは、真核（例えば、哺乳動物）宿主細胞発現系が用いら れる。特に、適切な哺乳動物宿主細胞は、CHO細胞、ならびにミエローマまたは ハイブリドーマ細胞株を包含する。 従って、本発明のさらなる局面によれば、以下の工程を包含する、抗IL-5 RAM を産生するための方法が提供される： (a)第１の発現ベクターにおいて、本発明の第１の好ましい局面により定義され るような混成Ｈ鎖をコードするDNA配列を有する第１のオペロンを産生する工程 ； (b)随意に、第１または第２の発現ベクターにおいて、本発明の第２の好ましい 局面により定義されるような混成Ｌ鎖であり得る相補的なＬ鎖をコードするDNA 配列を有する第２のオペロンを産生する工程； (c)該ベクターまたはいずれかのベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工 程；および (d)トランスフェクトした細胞株を培養してRAMを産生する工程。 あるいは、この方法は、混成Ｌ鎖および相補的なＨ鎖をコードする配列の使用 を包含し得る。 Ｈ鎖およびＬ鎖の両方を含有するRAMの産生のために、細胞株が２つのベクタ ーでトランスフェクトされ得る。第１のベクターは、混成または相補的なＨ鎖を コードするオペロンを含有し得、そして第２のベクターは、混成または相補的な Ｌ鎖をコードするオペロンを含有し得る。好ましくは、ベクターは、各ポリペプ チド鎖が等しく発現されることを可能な限り確実にするために、コード配列およ び選択マーカーに関する範囲を除いて同一である。好ましい別の方法においては 、 単一のベクターが用いられ得、このベクターは、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方をコード する配列を含有する。 Ｈ鎖およびＬ鎖の両方のコード配列におけるDNAは、cDNAまたはゲノムDNA、あ るいはその両方を含有し得る。 本発明はまた、RAMを含有する治療用組成物および診断用組成物、ならびに治 療および診断におけるこのような組成物の使用を包含する。 従って、さらなる局面において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤、希釈 剤、またはキャリアと組み合わせて、本発明の上記の局面によるRAMを含有する 治療用組成物および診断用組成物を提供する。 これらの組成物は、例えば、抗体全体、単鎖Fvフラグメント、または抗体フラ グメント（例えば、FabまたはFvフラグメント）として、本発明のRAMを用いて調 製され得る。このような組成物は、IL-5ブロック効果またはIL-5拮抗効果を有し 、そしてIL-5活性を抑制するために用いられ得る。 本発明による組成物は、任意の適切な経路により投与するために従来の実施に 従って処方され得、そして一般に、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、または筋 肉内経路により投与するためには液体形態で[例えば、無菌の生理的に受容可能 な緩衝液中のRAMの溶液]；鼻経路または頬内経路により投与するためにはスプレ ーの形態で；または移植のために適切な形態であり得る。 本発明はまた、治療方法または診断方法を提供する。これらの方法は、ヒトま たは動物被験体に、本発明の上記の局面によるRAMの有効量、好ましくは0.1〜10 mg/kg体重を投与する工程を包含する。正確な投薬量および総用量は、RAMの意図 される使用ならびに処置される患者の年齢および状態に従って変化する。RAMは 、単回用量として、またはある期間にわたって連続的に投与され得る。投薬は、 適切に反復され得る。 本発明の上記の局面によるRAMが、抗IL-5抗体（例えば、39D10）が用いられて いるかまたは将来用いられ得る、任意の治療的使用に用いられ得る。 IL-5は好酸球の一次アクティベーターであり、そして抗体によるこのサイトカ インの機能のブロッキングは、特定のアレルギー性疾患に関連する好酸球増加を 防ぐかまたは軽減することが示されている。従って、本発明のRAMは、この目的 で用いられ得、特に、喘息の処置において有用であり得る。ここで、喘息肺にお ける好酸球の蓄積および活性化を防ぎ、その結果、気管支の炎症および気道が狭 くなるのを軽減することが期待され得る。喘息の処置に使用するために、本発明 のRAMは、有利には、例えば、鼻経路により投与するためにスプレーとして処方 された単鎖Fvフラグメントであり得る。 本発明に従って抗IL-5抗体分子を得るための好ましいプロトコルを以下に示す 。このプロトコルは、本明細書中の既に記載および定義したような本発明の概要 に対し、権利を侵すことなく与えられる。 ヒトIL-5に対して惹起された39D10ラットモノクローナル抗体が、ドナー抗体 として用いられる。39D10のＨ鎖およびＬ鎖の可変ドメインは、以前にクローン 化されており(WO 93/16184)、そしてこれらのドメインのヌクレオチド配列およ び推定アミノ酸配列を図１および図２に示す。適切なアクセプターＨ鎖およびＬ 鎖可変ドメインが、決定されなければならず、それによりアミノ酸配列が知られ る。次いで、RAMがアクセプター配列の基礎から始めて設計される。 １．CDR 第１の工程では、ドナー残基がCDRにおいてアクセプター残基に対して置換さ れる。この目的のために、CDRは、好ましくは以下のように定義される： 次いで、ドナー残基がフレームワークにおいてアクセプター残基に対して置換 される位置が、まず第１にＨ鎖に関して、続いてＬ鎖に関してという順で選択さ れる。 ２．Ｈ鎖 2.1 ドナー残基は、Ｈ鎖の24位、27位〜30位、37位、49位、73位、76位、およ び78位の全てか、または23位、24位、27位〜30位、37位、49位、73位、および76 位〜78位の全てのいずれかで用いられる。 ３．Ｌ鎖 3.1 ドナー残基は、22位、68位、および71位の全てか、または68位および71位 の全てかのいずれかで用いられる。 本発明は、ドナー抗体の結合親和性と実質的に等しい結合親和性を有する組換 え抗IL-5抗体分子に関する。本発明は、ここで、添付の図面を参照して、単に例 示のために記載される。ここにおいて： 図１ 39D10Ｈ鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す； 図２ 39D10Ｌ鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す； 図３ 39D10Ｈ鎖可変ドメインフレームワーク領域とヒトIII群Ｈ鎖のコンセン サス配列のＨ鎖可変ドメインフレームワーク領域との整列を示す； 図４ 39D10Ｌ鎖可変ドメインフレームワーク領域とヒトＩ群Ｌ鎖のコンセン サス配列のＬ鎖可変ドメインフレームワーク領域との整列を示す； 図５ CDR付加した抗IL-5Ｌ鎖であるCTIL-5-gL6のヌクレオチド配列およびア ミノ酸配列を示す； 図６ CDR付加した抗IL-5Ｈ鎖であるCTIL-5-10gHのヌクレオチド配列およびア ミノ酸配列を示す； 図７ プラスミドpMR14の地図を示す； 図８ プラスミドpMR15.1の地図を示す； 図９ キメラ39D10抗体およびCTIL-5-10gH＼-gL6抗体の親和定数および会合速 度および解離速度を示す； 図10 抗体のパネルによるTF1アッセイにおけるIL-5の中和のグラフを示す； 図11 ラット39D10、キメラ39D10抗体、およびCTIL-5-10gH/gL6抗体について の競合アッセイの結果を示す；そして 図12 サル好酸球増加症に対するCTIL-5-10gH/gL6の効果を示す。実施例 １．材料および方法 39D10は、ヒトIL-5に対して誘起されるラットモノクローナル抗体である。39D 10のＨ鎖およびＬ鎖の可変ドメインの遺伝子は、以前にクローン化されており(W O 93/16184)、そしてこれらのドメインのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列 を図１および図２に示す。39D10Ｈ鎖の可変ドメインのクローニングに用いられ た戦略のために、フレームワーク領域の最初の５個のアミノ酸が未知である。し かし、抗体YTH34.5HL、Riechmannら[Nature，332，323-327(1988)]由来のフレー ムワーク１のリーダー配列および最初の５個のアミノ酸を含有するＨ鎖が入手可 能であった。 ２．分子生物学的手順 用いた分子生物学的手順は、Maniatisら[Molecular Cloning: A Laboratory M anual，第２版，第１巻〜第３巻，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) ]に記載されるようであった。 ３．組換えＨ鎖および組換えＬ鎖遺伝子の構築 Ｈ鎖 Ｈ鎖Vh領域を、オリゴヌクレオチドR3601およびR2155を用いてPCRにより生成 した。これらの配列は、以下のようである： 反応混合液(100μl)は、10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl、50mM KCl、0.01 ％ w/v ゼラチン、0.25mMの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、0.1μg 39D1 0 Ｈ鎖DNA、６pmolのR3601およびR2155、ならびに0.25単位のTaqポリメラーゼを 含有した。反応混合液を94℃にて５分間加熱し、次いで94℃１分間、55℃１分間 、および72℃１分間をサイクルさせた。30サイクル後、反応液を等容量のフェノ ール／クロロホルム（１：１ v/v）で抽出し、次いでクロロホルムで抽出した 後、2.5容量のエタノールを添加することにより沈澱させた。PCR産物を適切な緩 衝液に溶解し、HindIIIおよびApaIで消化し、アガロースゲルで精製し、そして ベクターpMR14（図７）（このベクターもまた、HindIIIおよびApaIで消化した） に連結した。E.coli LM1035に形質転換した後、コロニーを一晩増殖させ、そし てプラスミドDNAをVhの挿入について分析した。プラスミドpARH1217中のVh領域 のヌクレオチド配列を図１に示す。Ｌ鎖 V1 Ｌ鎖遺伝子を、WO 93/16184に記載のように、オリゴヌクレオチドR3585お よびR3597でのPCRにより元のV1からクローン化して生成した。これらの配列は、 以下のようである： PCRを、上記のように行った。PCR産物を酵素BstBIおよびSplIで消化し、そし て精製後、予め同じ酵素で消化したpMR15.1（図８）に連結した。 E.coli LM1035の形質転換後、V1挿入物を有するプラスミド(pARH1215)を含有 したコロニーを同定した。V1挿入物のヌクレオチド配列を図２に示す。39D10 のCDR付加 Ｌ鎖 39D10のCDRループのための最も適切なヒトアクセプターフレームワークを決定 するために、39D10のフレームワーク１〜３のアミノ酸配列を、公知のヒトκＬ 鎖のアミノ酸配列と比較した。39D10は、ヒトＩ群Ｌ鎖に最も相同であることが 見出された。これに基づいて、CDR付加のためにヒトＩ群生殖系列のフレームワ ークを用いることを決定した。これらの配列の間の相同性を図３に示す。39D10 のフレームワーク４領域と公知のヒトＩ群Ｌ鎖との間のコンセンサス配列との間 の相同性もまた示す。39D10における、ヒトのコンセンサス配列とは異なる残基 に下線を付す。これらの残基が抗原結合に対してなし得る寄与を分析し、そして ２つの遺伝子をCDR付加Ｌ鎖について構築した。これらは、CTIL-5-gL5およびCTI L-5-gL6であり、ここでは、CDR残基と同様に、残基22、68、および71、または残 基68および71のいずれかもまた、それぞれ、39D10に由来した。CTIL-5-gL6のヌ クレオチド配列およびアミノ酸配列を図５に示す。Ｈ鎖 39D10のＨ鎖のCDR付加を、Ｌ鎖について記載のように行った。39D10のフレー ムワーク領域は、ヒトIII群抗体のフレームワーク領域に最も相同であることが 見出された。その結果、ヒトIII群生殖系列遺伝子のフレームワークのコンセン サス配列を、39D10Ｈ鎖のCDRを受け入れるために用いた。先述のように、ヒトII I群のフレームワーク４領域に対するコンセンサス配列もまた、選択した。これ らの配列の比較を図４に示し、39D10においてヒトのコンセンサス配列とは異な る残基に下線を付す。 抗原結合に影響し得る39D10におけるフレームワーク残基の分析を行い、そし てこれに基づいて２つの遺伝子（CTIL-5-9gHおよびCTIL-5-10gH）を、構築した 。ここで、残基23位、24位、27位〜30位、37位、49位、73位、76位〜78位、ある いは残基24位、27位〜30位、37位、49位、73位、76位および78位はいずれも、そ れぞれ、39D10に由来した。CTIL-5-10gHのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列 を図６に示す。抗IL-5抗体の発現および生物学的活性 キメラ（ラット／ヒト）39D10およびCDR付加39D10を、チャイニーズハムスタ ー卵巣(CHO)細胞に同時トランスフェクション後のＨ鎖およびＬ鎖対の一時的な 発現により生物学的に評価するために、リン酸カルシウム沈澱を用いて産生した 。 トランスフェクションの１日前に、セミコンフルエンスに達したCHO-L761h細 胞(Cockettら，Nucl.Acids.Res.，19，319-325，1991)のフラスコをトリプシン 処理し、細胞数を計数し、そしてそれぞれ10⁷細胞をT75フラスコに入れた。翌日 、培養培地をトランスフェクションの３時間前に変えた。トランスフェクション のために、それぞれ50μgのＨ鎖発現ベクターおよびＬ鎖発現ベクターを含有す る1.25mlの0.25M CaCl₂を1.25mlの２×HBS（１リットルの水中16.36g NaCl、1 1.9g HEPESおよび0.4g Na₂HPO₄、pHをNaOHで7.1に調整する）と混合することに より、リン酸カルシウム沈澱を調製し、そして直ちに細胞の培地に添加した。CO₂ インキュベーター中、37℃にて３時間の後、培地および沈澱を取り除き、そし てリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中の15％グリセロールを15ml添加することによ り、１分間、細胞に衝撃を与えた。グリセロールを取り除き、細胞をPBSで１回 洗浄し、そして10mM 酪酸ナトリウムを含有する25mlの培地中で48〜96時間イン キュベートした。抗体をプロテインＡ−Sepharoseに結合させ、そしてそこから の溶出により培養培地から精製した。抗体濃度を、ヒトIg ELISA（以下を参照の こと）を用いて測定した。ELISA 抗体発現を、Ｈ鎖遺伝子およびＬ鎖遺伝子の対をCHO細胞にトランスフェクト し、そして３日間のインキュベーション後、培養培地中に蓄積した抗体の量をEL ISAにより測定することにより評価した。 ELISAのために、Nunc ELISAプレートを、４℃にて一晩、コート緩衝液（15mM 炭酸ナトリウム、35mM 炭酸水素ナトリウム(pH6.9)）中、５μg/mlでポリクロー ナルヤギ抗ヒトFcフラグメント特異的抗体(Jackson Immunoresearch，コード番 号109-006-098)のF(ab')₂フラグメントを用いてコートした。非コート抗体を、 蒸留水で５回洗浄することにより除去した。定量されるサンプルおよび精製スタ ンダードを、結合緩衝液（0.1M Tris-HCl(pH7.0)、0.1M NaCl、0.2％v/v Tween 20、0.2％ w/v Hammersten カゼイン）中に約１μg/mlに希釈した。サンプルを 、マイクロタイターウェルにおいて２倍希釈で滴定して各ウェル0.1mlの最終容 量とし、そしてプレートを室温にて１時間、振盪しながらインキュベートした。 最初のインキュベーション工程の後、プレートを蒸留水で10回洗浄し、次いで、 0.1mlの結合緩衝液中700倍希釈のマウスモノクローナル抗ヒトκ（クローンGD12 ）ペルオキシダーゼ結合抗体（The Binding Site、コード番号MP135）とともに 、以前のように１時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、そして基質 溶液（0.1ml）を各ウェルに添加した。基質溶液は、10mlの0.1M 酢酸ナトリウム ／クエン酸ナトリウム（pH6.0）中に150μlのN,N,N,N-テトラメチルベンジジン( DM SO中10mg/ml）、150μl過酸化水素（30％溶液）を含有した。プレートを、630nm での吸光度がトップスタンダードに対して約1.0となるまで、５〜10分間発色さ せた。630nmでの吸光度を、プレート読み取り機を用いて測定し、そして滴定曲 線をスタンダードの滴定曲線と比較してサンプルの濃度を決定した。抗IL-5抗体に対する親和定数の決定 キメラ抗IL-5抗体とCDR付加抗IL-5抗体との親和性を生物特異的相互作用分析( BIA)を用いて決定した。抗体をＨ鎖遺伝子およびＬ鎖遺伝子の組み合わせでトラ ンスフェクションすることによりCHO細胞において産生し、そしてプロテインＡ Sepharoseで培養上清から精製した。親和性の測定のために、ポリクローナル抗 ヒトFc抗体をPharmacia Biosensorチップ（12150相対応答単位、RU）に結合させ 、これを用いて10mM HEPES、0.15M NaCl、3.4mM EDTA(pH7.4)中、５μg/mlでチ ップを通過した抗IL-5を捕獲した。各ランで捕獲された抗IL-5の量は、約1600RU であった。次いで、組換えヒトIL-5を、上記緩衝液中で種々の濃度（0.6〜５μg /ml）でSensorchipに通過させた。各ラン後に、Sensorchipを100mM HClおよび10 0mMオルトリン酸で浄化し、結合したIL-5および抗体を除去した。生成したセン サーグラム(sensorgram)をBIAcore machineで入手可能な動力学ソフトウェアを 用いて分析した。 ２つの抗体（キメラ39D10およびCTIL-5-10gH/-gL6）の親和定数ならびに会合 速度および解離速度の値を決定した。結果を図９に示す。キメラ39D10がヒトIL- 5に極めて高い親和性を有し、そしてこの値がCTIL-5-10gH/-gL6においても再現 されることが示された。インビトロバイオアッセイにおける抗IL-5抗体の活性 TF1細胞を用いるインビトロでのバイオアッセイにおいて、種々のCDR付加抗体 の活性をキメラ39D10の活性と比較した。TF1は、増殖のためにGM-CSFを必要とす る赤白血病細胞株である。GM-CSFは、IL-5で置換され得るが、この例では、細胞 は生存するのみで増殖しない。しかし、生存のためのIL-5への依存は、TF1細胞 が種々の抗IL-5抗体の活性を比較するためのバイオアッセイに用いられ得るこ とを意味する。 抗IL-5抗体による中和を、一定量のIL-5（２ng/ml）および種々の量の抗体を 用いて、96平底プレート中で１ウェルあたり５×10⁴細胞とともに３日間インキ ュベートして測定した。最後の４時間は、細胞を500μg/mlトリアゾリルブルー( MIT)の存在下で培養する。この色素は、生存細胞中のミトコンドリアの酵素によ り紫色の不溶型に転換される。不溶性の物質は、100μlの50％ジメチルホルムア ミド、20％ SDS(pH4.7)の添加後に一晩インキュベートすることにより溶解され 、そして取り込まれた色素量を分光測光法で決定した。抗体の存在下で残存する 生物活性のあるIL-5のレベルを、IL-5濃度に関連する色素の取り込みの標準曲線 から推定した。 種々の組み合わせのＨ鎖およびＬ鎖の活性を、TF1バイオアッセイを用いて評 価した。結果を図10に示す。CDR付加Ｈ鎖およびＬ鎖の全ての組み合わせがキメ ラ39D10に等力である抗体を産生することが示され得る。これらの結果は、Ｌ鎖 の残基22だけでなく、Ｈ鎖の残基23または78も、最適な結合のために39D10特異 的である必要がないことを示す。従って、より少ない39D10特異的残基の組み合 わせはCTIL-5-10gH/-gL6である。競合アッセイにおける抗IL-5抗体の活性 組換えヒトIL-5を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中、１μg/mlに希釈し、そ して100μlのアリコートをマイクロタイタープレート(Costar Amine Binding pl ate)に添加し、そして４℃にて一晩インキュベートした。プレートを、0.5％ Tw een 20を含有するPBSで３回洗浄し、そして何らかの残存する活性部位を、PBS中 の２％ウシ血清アルブミン(BSA)で30分間ブロックした。次いで、プレートを吸 引し、そして叩いて乾燥させた。親のラット抗体(39D10)の相対結合活性をキメ ラ抗体および付加抗体と比較するために、PBS/１％ BSA中で各抗IL-5抗体の系列 希釈を調製し、そして50μlを２連のウェルにするために添加して、その直後に5 0μlの39D10−ビオチン結合物を0.125μg/mlで添加した。アッセイを撹拌しなが ら室温で２時間インキュベートし、次いでPBSで２回洗浄した。ストレプトアビ ジンに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ（１μg/ml）を全てのウェルに添加 し、そしてさらに30分間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、そして10 0μlのテトラメチルベンジジン(TMB)基質を添加した。発色を630nm（参照490nm ）で読み取り、そしてOD(630-490)をlog(10)抗体濃度に対してプロットした。 ラット39D10、キメラ39D10、およびCTIL-5-10gH/gL6の活性を、上記競合アッ セイにて比較した場合、図11に示す結果が得られた。３つの抗体は全て、IL-5へ の結合に対してビオチン化39D10と同等に十分に競合した。これは、39D10のCDR ループがヒトフレームワークに首尾良く移動されたことを示す。サル好酸球増加症に対する抗IL-5抗体の効果 抗IL-5抗体（CTIL-5-10gH/gL6）を、喘息症状をモデル化したサルの系（Mause r,P.J.ら，Ann.Rev.Respir.Dis.,印刷中，を参照のこと）で試験した。Ascaris でチャレンジする１時間前に応答性のサルに投与した場合、CTIL-5-10gH/gL6は 、0.3mg/kg(静脈内投与)の用量で肺洗浄好酸球増加症を75％阻害する。このセッ トのサルは、ヒスタミンに過剰応答しない。従って、過剰応答に対するCTIL-5-1 0gH/gL6の効果を決定し得なかった。この単回投量の３ヶ月後、Ascarisのチャレ ンジに応答する好酸球の蓄積は、依然として75％阻害される。 アレルギーマウスでは、CTIL-5-10gH/gL6は、１mg/kg(腹腔内投与)で肺の好酸 球増加症を阻害する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アスウェル，ディルジート シング イギリス国 エスエル１ ４イーエヌ バ ークシャー，スロー，バス ロード 216

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトIL-5抗原に対して親和性を有し、かつヒトIL-5に対して親和性を有する ドナー抗体のＨ鎖および／またはＬ鎖の可変ドメインに由来する抗原結合領域を 含有するRAMであって、該RAMは、該ドナー抗体の結合親和性に類似の結合親和性 を有する、RAM。 ２．混成Ｈ鎖および相補的なＬ鎖を含有する抗IL-5抗体分子であって、該混成Ｈ 鎖が、アクセプター抗体Ｈ鎖のフレームワーク残基およびドナー抗体Ｈ鎖抗原結 合残基を優先的に含有する可変ドメインを有し、該ドナー抗体が、ヒトIL-5に対 して親和性を有し、ここで、該混成Ｈ鎖が、少なくとも31位〜35位、50位〜65位 、および95位〜102位（Kabatの番号付けシステムに従う）のドナー残基を含有す る、請求項１に記載の抗IL-5抗体分子。 ３．前記混成Ｈ鎖におけるアミノ酸残基24、27〜30、37、49、73、76、および78 が、付加的なドナー残基である、請求項２に記載の抗体分子。 ４．前記混成Ｈ鎖におけるアミノ酸残基23、24、27〜30、37、49、73、および76 〜78が、付加的なドナー残基である、請求項２に記載の抗体分子。 ５．混成Ｌ鎖および相補的なＨ鎖を含有する抗IL-5抗体分子であって、該混成Ｌ 鎖が、アクセプター抗体Ｌ鎖のフレームワーク残基およびドナー抗体Ｌ鎖抗原結 合残基を優先的に含有する可変ドメインを有し、該ドナー抗体が、ヒトIL-5に対 して親和性を有し、ここで、該混成Ｌ鎖が、少なくとも24位〜34位、50位〜56位 、および89位〜97位（Kabatの番号付けシステムに従う）のドナー残基を含有し 、そしてここで該抗IL-5抗体分子が、ドナー抗体の結合親和性に類似の結合親和 性を有する、請求項１に記載の抗IL-5抗体分子。 ６．前記混成Ｌ鎖におけるアミノ酸残基68および71が、付加的なドナー残基であ る、請求項５に記載の抗体分子。 ７．前記混成Ｌ鎖におけるアミノ酸残基22、68および71が、付加的なドナー残基 である、請求項５に記載の抗体分子。 ８．請求項２〜４のいずれかに記載の混成Ｈ鎖および請求項５〜７のいずれかに 記載の混成Ｌ鎖を詰め込む、ヒトIL-5に対して親和性を有する抗IL-5抗体分子。 ９．ヒトアクセプター残基および非ヒトのドナー残基を優先的に含有する、請求 項２〜８のいずれかに記載の抗体分子。 １０．前記混成Ｈ鎖および前記混成Ｌ鎖の前記アクセプター残基が、それぞれヒ トIII群Ｈ鎖残基およびヒトＩ群Ｌ鎖残基であり、そして該混成Ｈ鎖および該混 成Ｌ鎖の前記ドナー残基が、それぞれラット39D10のＨ鎖残基およびＬ鎖残基で ある、請求項２〜９のいずれかに記載の抗体分子。 １１．請求項２〜１０のいずれかに記載の抗体の混成Ｈ鎖または混成Ｌ鎖をコー ドするDNA配列。 １２．請求項１１に記載のDNA配列を含有する、クローニングベクターまたは発 現ベクター。 １３．請求項１１に記載のDNA配列で形質転換した宿主細胞。 １４．形質転換した宿主細胞において請求項１１に記載の少なくとも１つのDNA 配列を発現する工程を包含する、抗IL-5抗体の産生のためのプロセス。 １５．抗IL-5抗体分子を産生するためのプロセスであって、 (a)発現ベクターにおいて請求項２〜４のいずれかに記載の混成Ｈ鎖をコード するDNA配列を有するオペロンを産生する工程； (b)必要に応じて、発現ベクターにおいて請求項５〜７のいずれかに記載の混 成Ｌ鎖であり得る相補的なＬ鎖をコードするDNA配列を有するオペロンを産生す る工程； (c)該ベクターまたは各ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程；お よび (d)トランスフェクトした細胞株を培養して該抗体産物を産生させる工程； を包含する、プロセス。 １６．請求項１５に記載の抗IL-5抗体分子を産生するためのプロセスであって、 前記DNA配列が、それぞれ混成Ｌ鎖および相補的なＨ鎖をコードする、プロセス 。 １７．薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、請 求項１〜１０のいずれかに記載の抗体分子を含有する、治療組成物または診断組 成物。 １８．ヒトまたは動物被験体に対して請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体分 子の有効量を投与する工程を包含する、治療方法または診断方法。