JPH10501976A - ハイブリダイゼーションアッセイを用いて同時に行う真正細菌分類群の検出、単離および区別 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、サンプル中の少なくとも１つの微生物の検出および同定のための、若しくは数個の微生物の同時検出のための方法であって、以下の工程：(i)必要なら、サンプル中に存在するポリ核酸を放出させ、単離または濃縮する工程；(ii)必要なら、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域若しくはその一部を少なくとも１つの適切なプライマー対を用いて増幅する工程；(iii)工程(i)若しくは(ii)のポリ核酸を、表１ａに示した少なくとも１つの、好ましくは１以上のスペーサープローブ若しくはその等価物と、適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、および／または図１〜１０３に示した任意のスペーサー配列から誘導された分類群特異的プローブと、同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、ハイブリダイズさせる工程；(iv)適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、用いられる各々のプローブによって工程(iii)で形成されたハイブリッドを検出する工程；(v)工程(iv)で得られた特徴的なハイブリダイゼーションシグナルからサンプル中に存在する微生物を同定する工程、を包含する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ハイブリダイゼーションアッセイを用いて同時に行う真正細菌分類群の 検出、単離および区別 本発明は、ハイブリダイゼーション手法による生物学的サンプル中の真正細菌 生物の特異的な検出に用いるための、１６Ｓリボゾームリボ核酸（ｒＲＮＡ）遺 伝子と２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子との間のスペーサー領域由来の核酸プローブ、な らびに生物学的サンプル中の真正細菌生物の上記領域の増幅に用いるための核酸 プライマーに関する。本発明はまた新規なスペーサー領域配列に関し、これらの 配列から上記プローブ若しくはプライマーが誘導され得る。 ポリメラーゼ連鎖反応およびいくつかの他の核酸増幅技術の出現により、全て の種類の生物学的サンプル中の微生物の分析におけるＤＮＡプローブ技術の影響 は増大しつつある。もしも妥当な増幅および／または検出システムが用いられる 場合に、より特異的でありそして潜在的により感度が高ければ、このＤＮＡプロ ーブアプローチは最終的には従来の単離技術に取って代わるかもしれない。 核酸に基づくテストの信頼性は、用いられるプローブおよび／またはプライマ ーの感度と特異性とに実質的に依存する。したがって、このタイプのアッセイの 第一歩は、目的の生物群に対して独特な核酸配列を同定することである。 文献に記載された、および／または市販の核酸に基づくテストの大部分は、生 物学的サンプル中のただ１つの特定の生物の検出を目的としている。通常、ほと んどの生物学的サンプルは、非常に多くの種類の臨床的に関連した微生物を含み 得るので、存在する可能性のある全ての関連した生物を検出するためには数多く の別々のアッセイが行われなければならない。こ のアプローチは、非常に経費が高く、困難であり、時間がかかる。その結果、ほ とんどの基礎分析研究室において、特定のサンプルについて実際に行われるテス トの数は、最も関連のある数種の生物の検出に制限される。したがって、多数の 異なる生物を迅速、容易、かつ同時に検出することを可能にするシステムを利用 することは非常に便利であろう。同じアッセイにおいてスクリーニングされる生 物が多いほど、この手順は対費用効果がよりよい。 初期に刊行された論文で提唱されたように、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子との間に位置するスペーサー領域はまた、内部転写スペーサー(i nternal transcribed spacer：ＩＴＳ)ともいわれ、細菌起源の病原体の検出の ためのプローブの開発にとって有利な標的領域である（国際出願第ＷＯ９１／１ ６４５４号；Rossau et al.,1992；ＥＰ−Ａ−０３９５２９２）。 それらの最もよく理解されている利点の一つは、多くの種類の細菌分類群に独 特な配列が、細菌ゲノムの非常に限られた領域に見いだされ得るということであ る。この特徴により、特定のタイプの生物学的サンプル中に存在する可能性のあ る一連の生物の同時検出を可能にする「プローブパネル」の有利な設計が可能に なる。さらに、ある程度普遍的に保存された核酸配列、より特定するとそれぞれ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３’部分および２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５’部分に位 置する配列、によって近接されているので、ほとんど全てのスペーサーは限られ た増幅プライマーセットによって同時に増幅され得る。あるいは、特定のプライ マーセットはスペーサー配列自身から誘導され、それにより種特異的若しくは群 特異的増幅が可能になる。 １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域は、ほとんど全ての真正細菌 生物のゲノム内に１つまたは複数のコピーで存在する比較的短い（約２００〜１ ０００塩基対）ＤＮＡ伸張部である。もしも１つの細菌のゲノムに複数のコピー が存在する場合、これらのコピーは、同一であるか（いくつかのNeisseria種で 最もよく起きる）または相互に異なるか（E.coliの場合）のいずれかであり得る 。この違いは、いくつかのヌクレオチドに限られ得るが、無視できない長さの欠 失および挿入も存在し得る。 現在まで、スペーサープローブは限られた数の生物について記載され、公的に 利用できるようになっているだけであり、それらの多くは国際出願第ＷＯ９１／ １６４５４号に開示されている。上記のように、病原体のパネルを同時に検出す ることが可能であることは非常に利点があることである：例えば、同じタイプの 生物学的サンプル中に存在する可能性のある病原体のパネル若しくは同じタイプ の疾患の兆候を引き起こす可能性のある病原体のパネル（これらは、臨床的およ び／または生化学的に区別することが困難である）、あるいは同じ分類群に属す る生物のパネルである。異なるパネルをできるだけ完全に作成するため、スペー サー領域内に位置し、そして少なくとも以下の細菌群若しくは種の同定を可能に するさらなるプローブ若しくはプローブのセットが必要とされている： - Mycobacterium 種 - Listeria 種 - Chlamydia 種 - Acinetobacter 種 - Mycoplasma 種 - Straptococcus 種 - Staphylococcus 種 - Salmonella 種 - Brucella 種 - Yersinia 種 - Pseudomonas 種 これらのさらなるスペーサープローブは、それらが、同じハイブリダイゼーシ ョンおよび洗浄条件下で、少なくとも１つの他のプローブと一緒に同時に用いら れ、特定の生物のパネルの検出を可能にするように細部まで正確に設計されるこ とが必要である。 したがって、本発明の目的は、プローブ若しくはプローブのセットを選択する ことである。これらは１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域を標的として有 し、そして少なくとも１つ、好ましくは１つ以上の上記の微生物の検出および同 定を可能にする。このプローブ若しくはプローブセットは、それらが、少なくと も１つの他のプローブ、好ましくはやはり１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー 領域を起源とするプローブと、同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で 組み合わせられて、サンプル中のいくつかの微生物の同時検出をおそらく可能に するように選択される。 上記のスペーサープローブ若しくはプローブセットの選択において用いられる 選択方法を提供することもまた、本発明の目的である。 サンプル中の少なくとも１つの微生物の検出および同定のための、若しくはサ ンプル中のいくつかの微生物の同時検出および同定のための、迅速かつ信頼性の あるハイブリダイゼーション方法を提供することもまた、本発明の目的である。 特定のタイプのサンプルに存在しそうな一連の微生物を、同時に検出し同定す ることを可能にするハイブリダイゼーション方法を提供することは、本発明のよ り特定の目的である。 気道由来のサンプル中の微生物の同時検出が可能なプローブ若しくはプローブ のセットを提供することは、本発明のより特定の目的である。 脳脊髄液由来のサンプル中の微生物の同時検出が可能なプローブ若しくはプロ ーブのセットを提供することは、本発明のもう一つのより特定の目 的である。 尿生殖器管由来のサンプル中の微生物の同時検出が可能なプローブ若しくはプ ローブのセットを提供することは、本発明のさらに別のより特定の目的である。 患者の胃腸管から採取したサンプル中の微生物の同時検出が可能なプローブ若 しくはプローブのセットを提供することは、本発明のさらに別のより特定の目的 である。 食物起源のサンプル若しくは環境サンプル中の微生物の同時検出が可能なプロ ーブ若しくはプローブのセットを提供することは、本発明のさらに別のより特定 の目的である。 サンプル中の特定の分類群、若しくは特定の一連の分類群を検出し同定する方 法提供することは、本発明のさらなる目的である。この分類群は完全な属か、属 の中の亜群か、種か、さらに種の中のサブタイプ（亜種、血清型（serovars）、 シーケバール（sequevars）、生理学的性状型(biovars)…）のいずれかである。 Mycobacterium種および亜種、より特定すると、M.tuberculosis複合株、MAIS 複合体由来の Mycobacterium 株、M.avium およびM.paratuberculosis、M.intra cellulare およびM.intracellulare様株、M.scrofulaceum 、M.kansasii 、M.che lonae 、M.gordonae 、M.ulcerans 、M.genavense 、M.xenopi 、M.simiae 、M.fortuitum 、M.malmoense、M.celatum、およびM.haemophilumの検出用プローブ 若しくはプローブセットを提供することは本発明のさらに特定の目的である。 Mycoplasma株、より特定するとM.pneumoniaeおよびM.genitaliumの検出用プロ ーブ若しくはプローブセットを提供することもまた本発明の目的である。 Pseudomonas株、より特定するとP.aeruginosaの検出用プローブ若しくはプロ ーブセットを提供することもまた本発明の目的である。 Staphylococcus種、より特定するとS.aureusおよびS.epidermidisの検出用プ ローブ若しくはプローブセットを提供することもまた本発明の目的である。 Acinetobacter株、より特定するとA.baumaniiの検出用プローブ若しくはプロ ーブセットを提供することもまた本発明の目的である。 Listeria株、より特定するとListeria monocytogenesの検出用プローブ若しく はプローブセットを提供することもまた本発明の目的である。 Brucella株の検出用プローブ若しくはプローブセットを提供することもまた本 発明の目的である。 Salmonella株の検出用プローブ若しくはプローブセットを提供することもまた 本発明の目的である。 Chlamydia株、より特定するとC.trachomatisおよびC.psittaciの検出用プロー ブ若しくはプローブセットを提供することもまた本発明の目的である。 Streptococcus株の検出用プローブ若しくはプローブセットを提供することも また本発明の目的である。 Yersinia enterolitica株の検出用プローブ若しくはプローブセットを提供す ることもまた本発明の目的である。 特定の生物の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域の特異的な増幅を可能 にするプライマーを提供することも本発明の目的である。より特定すると、Myco bacterium 、Chlamydia、Listeria、BrucellaおよびYersinia enterolitica株の スペーサー領域の特異的な増幅のためのプライマーを提供することが本発明の目 的である。 １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域の新規な配列（この配列から有用な スペーサープローブ若しくはプライマーを誘導し得る）を提供することも本発明 の目的である。 上記のプローブおよび／またはプライマーが用いられる、サンプル中の少なく とも１つの生物を検出するためのキットを提供することも本発明の目的である。 いくつかの上記の生物のスペーサー配列についてはすでに文献若しくは公的に 利用可能なデータバンクで公開されていることに注意されたい。 しかし、本発明で開示されたスペーサー領域配列（図１〜１０３）は新規であ り、それらが、先行文献ですでにスペーサー配列が記載された種と同じ種を起源 とする場合には、それらはすでに記載された配列とはある程度異なっていること が明確にされるべきである。 さらに、特定の生物のパネル、すなわち共通の分類群に属する生物、若しくは 同じタイプのサンプルに存在する可能性のある生物のパネル、の検出および同定 を可能にする特異的プローブおよびプローブセットを、スペーサー領域に関する 配列データの蓄積から選択することが本発明の第１の目的である。 この選択手順は、通常理論的な部分と実験的な部分とからなる。第１に、異な るスペーサー配列は、「最も近縁のもの(closest neighbour)」のスペーサー配 列と、あるいは同じサンプルに存在しそうなほかの微生物のスペーサー配列と整 合性がある必要がある。このことにはもちろん実施例に記載したようにスペーサ ー配列の配列決定が必要である。この整合性から多様な領域が定義され、そこか ら所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブが、当業者に公知のガイ ドラインに沿って設計され、以下のように、より詳細に特定される。 第２に、設計されたプローブは実験的にテストされ、それらの有用性について 、特定のハイブリダイゼーション条件下でおよび／または他のプローブと組み合 わせて、評価される必要がある。実験的テストは当業者に公知の任意のハイブリ ダイゼーション法にしたがって行うことができるが、同一条件下で異なるプロー ブを同時にテストするための好ましいアッセイは、リバースハイブリダイゼーシ ョンアッセイである。本発明において同時に用いられる異なるプローブのリバー スハイブリダイゼーションの特別な形式は、以下に記載するようなＬｉＰＡ（ラ インプローブアッセイ）である。 実験的テストの際に、プローブが標的核酸にハイブリダイズするとき予期し得 ないハイブリダイゼーションの挙動が示される場合があるが、そのときは特定の プローブの適合が必要とされるかもしれない。 さらに、プローブの特異性および感度が、検出されるべき分類群に属する株も 別の分類群に属する株もどちらも大きなコレクションで試験される必要がある。 スペーサー領域のゲノムの不均一性により、あるいは同じ生物内で異なる配列を 有する多数のスペーサー配列の存在により、よりよい感度および／または特異性 を得るために、別の株のスペーサー領域の配列決定をするか、あるいは同じ株の 別のスペーサー領域の配列決定をして新しい配列のデータによってプローブを再 設計することが必要であることがよくある（例えば、実施例３参照）。いくつか の場合には、同じ生物についていくつかのプローブを用いることが必要であるか 若しくは望ましいかもしれない（実施例２および７参照）。また、スペーサー領 域の配列決定では、いくつかの生物は予期しない関連性（非関連性）を示すこと もあり、それらは古典的な分類学的基準に反した株の分類の修正につながり得る （実施例２および７）。 結局、プローブ選択手順の実験的部分は不可欠であり、理論的な部分と相補的 なものである。プローブ設計は、特にリバースハイブリダイゼーションの固定さ れた条件（各プローブについて同じ条件）下では、簡単ではなく、プローブはそ れらがリバースハイブリダイゼーション形式において用いられ得る前に細部まで 正確に評価されなければならない。したがって、プローブは公知の遺伝子配列か ら理論的な基礎に基づいて必ずしも簡単に誘導され得るわけではない。 所望の特性を有するプローブを設計するには以下の有用なガイドラインにした がってもよい。 本明細書中に記載されるようなハイブリダイゼーション反応の範囲と特異性は 多くの因子に影響されるので、これらの１以上の因子の操作が特定のプローブの 正確な感度と特異性、すなわち、それがその標的と完全に相補的であるか否か、 を決定する。本明細書中でさらに説明される種々のアッセイ条件の重要性と効果 は、当業者には公知である。 第１に、［プローブ：標的］核酸ハイブリッドの安定性は、アッセイ条件と適 合するように選択されるべきである。これは、長いＡＴリッチな配列を除くこと によって、ハイブリッドをＧ：Ｃ塩基対で終結させることによって、および適切 なＴｍを有するプローブを設計することによって達成することができる。プロー ブの始点と終点は、長さとＧＣ％によって、最終アッセイが行われる温度より約 ２〜１０℃高いＴｍとなるように選択されるべきである。プローブの塩基組成は 、ＡＴ塩基対に比べて、ＧＣ塩基対の方がさらなる水素結合により、より一層の 熱安定性を示すので、重要である。したがって、ＧＣ含量の高い相補的核酸を含 むハイブリダイゼーションは高温でも安定であろう。 プローブが用いられる条件（例えばイオン強度およびインキュベーショ ン温度のような）もまたプローブの構築において考慮されるべきである。ハイブ リダイゼーションが、反応混合物のイオン強度が増加するにつれて増加すること 、およびハイブリッドの熱安定性がイオン強度の増加につれて増加することは公 知である。一方、ホルムアミド、尿素、ＤＭＳＯおよびアルコールのような化学 的試薬は水素結合を破壊し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増 大させる。そのような試薬による水素結合の不安定化はＴｍを非常に低下させる ことができる。一般に、長さが約１０〜５０塩基の合成オリゴヌクレオチドプロ ーブにとって最適なハイブリダイゼーションは、与えられた二本鎖の融解温度よ り約５℃低い温度で起きる。最適温度より低い温度でのインキュベーションはミ スマッチ塩基配列のハイブリダイズを可能にし、したがって特異性が低下する結 果となり得る。 ストリンジェンシーの高い条件下でのみハイブリダイズするプローブがあるの が望ましい。高いストリンジェンシ一条件下では、相補性の高い核酸ハイブリッ ドのみが形成される。十分な程度の相補性がないハイブリッドは形成されない。 したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成する二 本の核酸鎖の間に必要とされる相補性の大きさを決定する。ストリンジェンシー は、標的核酸と形成されたハイブリッドと非標的核酸と形成されたハイブリッド との間の安定性の差を最大化するように選択される。本発明のいくつかの実施例 では、例えば、高度に関連した生物を分別する必要がある場合には、ただ１つの 塩基対変化を検出する必要もあり得る。そのような場合には、非常に高いストリ ンジェンシーの条件が必要とされる。 第２に、プローブは［プローブ：非標的］核酸ハイブリッドの安定性を最小化 するように配置されるべきである。これは、非標的生物に対して完 全に相補的な長さを最小化することにより、非標的配列に対して相同なＧＣリッ チな領域を除くことにより、そしてできるだけ多くの不安定化ミスマッチが広が るようにプローブを配置することにより達成することができる。プローブ配列が 特定のタイプの生物のみを検出するのに有用であるかどうかは、［プローブ：標 的］ハイブリッドと［プローブ：非標的］ハイブリッドとの間の熱安定性の違い に大きく依存する。プローブの設計においては、これらのＴｍ値の差はできるだ け大きくあるべきである（例えば、少なくとも２℃、好ましくは５℃）。 標的核酸配列の長さ、および、したがってプローブ配列の長さもまた重要であ り得る。ある場合には、特定の領域からの位置も長さも多様ないくつかの配列が あり、これらは所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブを生じる。 別の場合には、ある配列は、塩基がただ一つ異なる別の配列より著しく良好であ り得る。完全には相補的でない核酸をハイブリダイズさせることは可能であるが 、通常、完全に相補的な塩基配列の最も長い伸張部がハイブリッドの安定性を主 に決定する。異なる長さと塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブを用い得るが 、本発明で好ましいオリゴヌクレオチドプローブは長さが約１０〜５０塩基であ り、標的核酸に対して十分に相同性があるものである。 第３に、ハイブリダイゼーションに対して阻害的な強固な内部構造を形成する ことが知られている標的ＤＮＡ若しくはＲＮＡ内の領域は好ましくない。同様に 、広範な自己相補性を有するプローブも除かれるべきである。上述のように、ハ イブリダイゼーションは、水素結合した二本鎖を形成する２つの相補的な一本鎖 核酸の会合である。この２本の鎖のうち一方が全体的に若しくは部分的にハイブ リッドに含まれるなら、それは新しいハイブリッドの形成に参与することはでき ないということを暗に示している。 十分な自己相補性がある場合には、１つのタイプのプローブ分子内で形成される 分子内および分子間ハイブリッドもあり得る。そのような構造は細心のプローブ 設計により排除され得る。目的の配列の実質的な部分が一本鎖となるようにプロ ーブを設計することにより、ハイブリダイゼーションの効率および範囲は大いに 増大し得る。このタイプの相互作用を探索するためにコンピュータープログラム を利用することができる。しかし、特定の例では、このタイプの相互作用を排除 することは必ずしも可能ではない。 本発明のプローブは、同時ハイブリダイゼーションにセットで用いられ得るよ うに、同じハイブリダイゼーション条件下で最適なパフォーマンスを達成するよ うに設計される。このことは、これらのプローブの有用性を高度に増大させ、結 果として時間と労働を著しく節約する。明らかに他のハイブリダイゼーション条 件が好ましい場合には、それに応じて全てのプローブを、その末端でいくつかの ヌクレオチドを付加するか若しくは欠失させることにより適合させるべきである 。このような付随した適合化は実質的に同じ結果を生じる、すなわち、個々のプ ローブは決められた標的とそれでもなお特異的にハイブリダイズするということ が理解されるべきである。ＮＡＳＢＡシステムの場合のように、増幅された材料 が天然のＲＮＡであってＤＮＡでない場合には、そのような適合化もまた必要で あり得る。 ハイブリダイゼーション条件は、培地中の成分の性質および濃度、ならびにハ イブリッドが形成され洗浄される温度のような、いくつかのパラメーターに応じ てモニターすることができる。 ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、プローブの配列（その核酸組成、 種類、および長さ）に応じた上限値に制限される。本発明において記載されるプ ローブのハイブリダイゼーションおよび洗浄の最高温度は、 実施例の項で記載される特定のハイブリダイゼーションおよび洗浄培地において は、４０℃〜６０℃、より好ましくは４５℃〜５５℃の範囲である。より高い温 度では、二本鎖形成（＝ハイブリッドの形成）は、プローブと標的との間に形成 されたハイブリッドの解離（若しくは変性）と競合する。 本発明の好ましいハイブリダイゼーション培地は、３×ＳＳＣおよび２０％ホ ルムアミドを含有し、ハイブリダイゼーション温度は４５℃〜５５℃の範囲であ り得、好ましいハイブリダイゼーション温度は５０℃である。好ましい洗浄培地 は３×ＳＳＣおよび２０％ホルムアミドを含有し、好ましい洗浄温度は好ましい ハイブリダイゼーション温度と同じ、すなわち、好ましくは４５℃〜５５℃、最 も好ましくは５０℃である。 しかし、改変が誘導される場合、それがプローブにおいてでも培地においてで も、必要な特異性を得るためにプローブが用いられ得る温度は、以下の参考文献 に記載されたような、既知の関係にしたがって変化させるベきである： Hames B and Higgins S(eds.).Nucleic acidhybridization A practical appro ach, IRL Press, Oxford，U.K.,1985。 １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域から誘導され、そして本発明により 記載された選択された核酸プローブを表１ａに列挙する（SEQ ID NO(配列番号) １〜６４、１７５〜１９１、１９３〜２０１および２１０〜２１２）。実施例の 項で記載するように、いくつかのこれらのプローブは他に比べて良好な感度およ び／または特異性を示し、それゆえ、その良好なプローブを生物学的サンプル中 の目的の生物を検出する方法において選択的に使用する。しかし、特定の適用（ 例えば、疫学、亜株タイプ分け）に対しては特異性がより少ないかおよび／また は感度がより低いプローブを含むプローブセットが非常に有益であるということ もあり得る （実施例７参照）。 以下の定義は、本発明の下記に詳述する異なる実施態様において用いられる用 語および表現を説明するのに役立つ。 用語「スペーサー」は、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ内部転写スペーサー領域を 指す略語である。 用語「プローブ」は、検出されるべき標的配列とハイブリダイズするのに十分 に相補的である配列を有する一本鎖配列特異的オリゴヌクレオチドをいう。 より特別な用語「スペーサープローブ」は、上記で定義したように、検出され るべき生物（若しくは生物群）のスペーサー領域に位置する標的配列とハイブリ ダイズするのに十分に相補的である配列を有するプローブをいう。 好ましくは、上記プローブは検出されるべき標的配列の完全な相補物と７０％ 、８０％、９０％若しくは９５％以上相同である。これらの標的配列はゲノムＤ ＮＡ若しくは前駆体ＲＮＡ、またはそれらの増幅されたもののいずれかである。 好ましくは、これらのプローブは、約５〜５０ヌクレオチドの長さであり、よ り好ましくは約１０〜２５ヌクレオチドの長さである。本発明に用いられるヌク レオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、およびイノシンの ような改変ヌクレオチド、そのハイブリダイゼーション特性を実質的に変えない 改変された基を有するヌクレオチドであってもよい。さらに、以下に特定する任 意のプローブは、そのままで、若しくはそれらの相補型で、あるいはそれらのＲ ＮＡ型（その場合ＴはＵで置き換わる）で用いられ得るということは当業者には 明らかである。 本発明のプローブは、対応するヌクレオチド配列を含む挿入物を有する 組換えプラスミドをクローニングすることにより形成され得る。もし必要なら、 この対応するヌクレオチド配列をクローン化されたプラスミドから適切なヌクレ アーゼを用いて切り出し、それらを、例えば、分子量によって分画することによ り、回収する。本発明のプローブはまた化学的に、例えば、従来のホスホトリエ ステル法により、合成することもできる。 本明細書中で用いられる用語「相補的」核酸は、その核酸配列がお互いに完全 に塩基対形成した二重らせんを形成することを意味する。 本出願で用いられる用語「相同な」は、同一と同義である：これは、例えば、 ８０％相同であるといわれるポリ核酸は、配列を並べたとき同じ位置で８０％同 一の塩基対を示すということを意味する。 用語「ポリ核酸」は、少なくとも１０、２０、３０、４０、若しくは５０個の 隣接したヌクレオチドを含む二本鎖若しくは一本鎖のｃＤＮＡ若しくはゲノムＤ ＮＡまたはＲＮＡに対応する。長さが１００ヌクレオチドより少ないポリ核酸は しばしばオリゴヌクレオチドともいわれる。一本鎖ポリ核酸配列は、本発明にお いては常に５'末端から３'末端で示される。 用語「最も近縁のもの」は、ＤＮＡホモロジーから見て最も近接して関連して いることが知られているか若しくは期待され、目的の生物から区別されなければ ならない分類群を意味する。 「所望のハイブリダイゼーション特性」という表現は、プローブがそのために 設計された生物由来のＤＮＡ若しくはＲＮＡとのみハイブリダイズし、他の生物 由来のＤＮＡ若しくはＲＮＡ（同じサンプル中に存在しがちな最も近縁のもの若 しくは生物）とはハイブリダイズしないことを意味する。実際には、これは、ハ イブリダイゼーションシグナルの強さが、そのためにプローブが設計された生物 由来の標的ＤＮＡ若しくはＲＮＡを非標的配列と比べると、少なくとも２倍、３ 倍、４倍、５倍、１０倍若しくは それ以上であることを意味する。 これらの所望のハイブリダイゼーション特性は、後に本テキストでいわゆる「 特異的ハイブリダイゼーション」といわれるものに相当する。 「分類群特異的ハイブリダイゼーション」若しくは「分類群特異的プローブ」 という表現は、そのプローブが、そのためにそれが設計された分類群由来のＤＮ Ａ若しくはＲＮＡとのみハイブリダイズし、他の分類群由来のＤＮＡ若しくはＲ ＮＡとはハイブリダイズしないことを意味する。 用語「分類群」は、完全な属若しくは属内の亜群、種若しくはさらに種内のサ ブタイプ（亜種、血清型、シーケバール(sequevars)、生理学的性状型…）を指 すことができる。 用語「特異的増幅」若しくは「特異的プライマー」は、そのプライマーが、そ のためにそれが設計された生物からのスペーサー領域のみを増幅し、他の生物か らのそれは増幅しないという事実をいう。 用語「感度」は偽陰性の数をいう：すなわち、検出されるべき１００株のうち １株を数え損なった場合、そのテストは（１００−１／１００）％＝９９％の感 度を示す。 用語「特異性」は、偽陽性の数をいう：すなわち、検出した１００株のうち２ 株が、そのためにテストが設定されなかった生物に属すると考えられる場合、そ のテストの特異性は(１００−２／１００)％＝９８％である。 「好ましい」として選択されたプローブは８０％以上、好ましくは９０％以上 、そして最も好ましくは９５％以上の感度および特異性を示す。 用語「プライマー」は、コピーされる核酸鎖に相補的なプライマー伸張産物の 合成を開始するポイントとして作用し得る一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列 をいう。プライマーの長さおよび配列は、それらが伸張産物 の合成を開始することを可能にするようなものでなければならない。好ましくは このプライマーは約５〜５０ヌクレオチドの長さである。特定の長さおよび配列 は、必要とされるＤＮＡ若しくはＲＮＡ標的の複雑さ、ならびに温度およびイオ ン強度のようなプライマーを使用する条件に依存する。増幅プライマーは、適切 な増幅を保証する対応する鋳型配列に完全にマッチする必要はないという事実は 、文献に詳細に記載されている(Kwok et al.,1990)。 用いられる増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ：Saiki et al.,1988) 、リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ；Landgren et al.,1988; Wu & Wallace,1989; Bara ny,1991)、核酸配列に基づく増幅(ＮＡＳＢＡ；Guatelli et al.,1990; Compton ,1991)、転写に基づく増幅システム(ＴＡＳ；Kwoh et al.,1989)、鎖置換増幅( ＳＤＡ；Duck,1990; Walker et al.,1992)若しくはＱβレプリカーゼによる増幅 (Lizardi et al.,1988; Lomeli et al.,1989)若しくは当業者に公知の核酸分子 を増幅する任意の適切な方法のいずれかであり得る。 プライマー若しくはプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドはまたヌク レオチドアナログ、例えば、ホスホロチオエート(Matsukura et al.,1987)、ア ルキルホスホロチオエート(Miller et al.,1979)若しくはペプチド核酸(Nielsen et al.,1991; Nielsen et al.,1993)を含んでもよく、あるいは挿入物質(Assel ine et al.,1984)を含んでもよい。 本発明の元のＤＮＡ配列に導入される他の変更若しくは改変のほとんどについ ては、これらの変更は、その下でオリゴヌクレオチドを用いて必要な特異性およ び感度を得る条件に関して、適合化を必要とする。しかし、ハイブリダイゼーシ ョンの最終的な結果は、改変しなかったオリゴヌクレ オチドによって得られる結果と実質的に同じであろう。 これら改変の導入は、特性（例えば、ハイブリダイゼーションキネティクス、 ハイブリッド形成の可逆性、オリゴヌクレオチドの生物学的安定性など）に陽性 に影響を与えるために有利であり得る。 用語「固体支持体」は、オリゴヌクレオチドプローブがそのハイブリダイゼー ション特性を保持し、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドのレベルが低 く保たれる限り、それが結合し得る任意の基材をいう。通常、この固体基材はマ イクロタイタープレート、メンブラン（例えば、ナイロン若しくはニトロセルロ ース）またはマイクロスフェア（ビーズ）である。メンブランへの適用若しくは 固定の前に、固定を容易にし、若しくはハイブリダイゼーション効率を改善する ために、核酸プローブを改変することは好都合であり得る。そのような改変はホ モポリマーテーリング、異なる反応基との結合（例えば、脂肪族基、ＮＨ₂基、 ＳＨ基、カルボキシル基）、またはビオチン、ハプテン、若しくはタンパク質と の結合を含む。 用語「ラベルした」とはラベルした核酸の使用をいう。ラベル化は、増幅のポ リメラーゼ工程の間に組み込まれたラベルしたヌクレオチドの使用によって（例 えば、Saiki et al.,(1988)若しくはBej et al.(1990)によって例示されている ）、またはラベルしたプライマーの使用により、あるいは当業者に公知の任意の 他の方法により、行われてもよい。ラベルの性質はアイソトープ性（³²Ｐ、³⁵Ｓ など）であっても非アイソトープ性（ビオチン、ジゴキシゲニンなど）であって もよい。 「サンプル」は、感染したヒト（若しくは動物）、若しくは培養後のもの（濃 縮物）のいずれかから直接採取した任意の生物学的物質でもよいし、あるいは食 物または飼料から採取したサンプルでもよい。生物学的物質は、例えば、任意の 種類の喀出物、気管支洗浄物(broncheolavages)、血液、 皮膚組織、生検材料、リンパ球血液培養物質、コロニーなどでもよい。上記のサ ンプルは当該分野で公知の任意の技術によって調製若しくは抽出し得る。 これらのサンプル中の「標的」物質は、検出されるべき生物（＝標的生物）の ゲノムＤＮＡ若しくは前駆体ＲＮＡ、あるいは上で説明したそれらの増幅物のい ずれでもよい。より詳細には、標的物質の核酸配列は標的生物のスペーサー領域 に局在する。 標的物質の検出および同定は、文献に記載され、当業者に現在公知の多くの電 気泳動法、ハイブリダイゼーション法、若しくは配列決定法の１つを用いること によって行われ得る。しかし、生物学的サンプル中に存在する可能性のある核酸 を同時に検出する非常に簡便で有利な技術は、ラインプローブアッセイ技術であ る。このラインプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）は、メンブランストリップを用い るリバースハイブリダイゼーション形式(Saiki et al.,1989)であって、そのメ ンブラン上に、いくつかのオリゴヌクレオチドプローブ（ネガティブコントロー ルオリゴヌクレオチドおよびポジティブコントロールオリゴヌクレオチドを含む ）を平行なラインとして簡便に載せることができる。 このＬｉＰＡ技術は、Stuyver et al.,(1993)および国際出願第ＷＯ９４／１ ２６７０号に記載されたように、非常に迅速で使用者にやさしいハイブリダイゼ ーションテストを提供する。結果は増幅の開始後４時間以内に読むことができる 。増幅の間に、通常、非アイソトープ性ラベルが増幅産物に組み込まれ、その後 、アルカリ変性させ、増幅産物をメンブラン上のプローブと接触させ、ハイブリ ダイゼーションを約１〜１．５時間行う。結果として、形成されたハイブリッド は酵素的手法で検出され、目に見える紫−褐色沈殿物となる。このＬｉＰＡ形式 は、市販の走査機器と完 全に適合性であり、したがって、結果を自動的に判定することが可能である。こ れらの全ての利点によりＬｉＰＡ形式は機械的操作の設定で使用されやすくなっ ている。 このＬｉＰＡ形式は、種レベルの病原体の同定および検出に有利な道具である ばかりでなく、より高度な若しくは低い分類上のレベルにも有利である。例えば 、ＬｉＰＡストリップ上のプローブ配置は、それらが完全な属（例えば、Neisse ria 、Listeriaなど）を検出し得るか、属内の亜群（例えば、Mycobacterium avi um -intracellulare-scrofulaceum 複合体中の亜群）を同定し得るか、あるいは、 ある場合には、種内のサブタイプ（亜種、血清型、シーケバール(sequevar)、生 理学的性状型など、臨床上関連しているものは何でも）さえも検出し得る様な方 法で選択される。 多くのプローブ数によって同時にハイブリダイゼーション結果を生じる能力は ＬｉＰＡ技術の際だった恩典である。多くの場合、特定の組み合わせのプローブ によって得られる情報の量は、単一のプローブアッセイを用いることによって得 られるデータに数で勝る。したがって、メンブランストリップ上のプローブの選 択は極度に重要である。なぜなら、最適化されたプローブのセットは可能な限り 最大の情報を生じるからである。このことは、本明細書中でより特定して例示す る。 異なるプローブを１ストリップ上で併用し得るという事実は、検出される生物 群の標的領域における配列異質性による感度の欠除に好都合に対応する可能性を 提供する。この異質性によって、２以上のプローブが特定の群の全ての生物を陽 性に同定するために必要とされ得る。これらのプローブはメンブランストリップ の異なる位置に載せられ得、結果は、これらのプローブの少なくとも１つが陽性 の場合、陽性として解釈される。あるいは、これらのプローブは、同じ位置に混 合物として載せられ、それにより ストリップ上のラインの数を減少させることになる。このように減少させること は、ストリップをより簡明にするために、若しくは１枚のストリップ上に載せる プローブの総数を増やすことができるようにするために、便利である。もう１つ の別のアプローチは、その実用的な利点の観点から、２つ（またはそれ以上）の 異なるプローブ（＝縮重したプローブ）の配列を有するオリゴヌクレオチドの合 成であり、次いでそれらにさらに手を加えて１オリゴヌクレオチド分子としてス トリップ上に載せることができる。このアプローチはＬｉＰＡストリップの操作 手順を著しく単純化する。例えば、ＡとＢというヌクレオチド配列を有するプロ ーブはどちらも、分類群Ｘの全ての株を検出するために必要とされる。後者の場 合、ヌクレオチド配列ＡＢを有するプローブを合成し得る。このプローブはプロ ーブＡとＢとを合わせた特性を有するであろう。 上記の性質により、ＬｉＰＡシステムは、いくつかの生物がサンプル中で同時 に検出される必要がある場合のハイブリダイゼーション法の好ましい形式と考え られ得る。さらに、実施例の項で記載するように、このＬｉＰＡシステムは、理 論的に設計されたプローブの実験的評価および選択のための好ましい形式である 。 しかし、他の任意のハイブリダイゼーションアッセイ（それにより同じハイブ リダイゼーションおよび洗浄条件下で異なるプローブが用いられる）も、上記の 検出および／または選択方法として用いられ得ることは明確にされるべきである 。例えば、標的核酸を固体支持体に固定して異なるプローブの混合物を用い、全 てを別々にラベルすると、その標的にハイブリダイズしたそれぞれのプローブに ついて異なる検出シグナルを得ることも可能であり得る。 一例として、サンプル中の１以上の生物を検出するためにしたがうべき ＬｉＰＡ形式を用いる手順の概要を下記に記す： −最初に、サンプル中の検出すべき生物の核酸を増幅および／またはハイブリダ イゼーションに利用できるようにする。 −２番目に、もしあれば、その核酸を、１つの若しくは別の標的増幅システムで 以下のように増幅する。通常、増幅は次のハイブリダイゼーションシグナルを高 めるために必要とされる。しかし、いくつかのサンプル若しくはいくつかの生物 では増幅は不要である。形成されたハイブリッドの検出について、高感度のシグ ナル増幅システムが用いられる場合には、そのとおりであり得る。 −３番目に、変性工程の後、最終的にサンプル中に存在する核酸若しくは得られ た増幅産物を、その上に目的の生物の検出を可能にする１以上のＤＮＡプローブ を固定したＬｉＰＡストリップと接触させハイブリダイゼーションを進行させる 。 −最後に、洗浄工程を行った後、最終的に、ハイブリッドを簡便で適合性のある 検出システムを用いて検出する。ハイブリダイゼーションシグナル若しくは観察 したパターンから、その特定の生物学的サンプル中のスクリーニングされた１つ 若しくはいくつかの生物の存在若しくは不在を推定し得る。 用いた増幅システムは、必要とされる特定の適用に応じてほぼ汎用である。 ｒＲＮＡスペーサーの保存された近接領域（１６Ｓ遺伝子および２３Ｓ遺伝子 ）内に位置するユニバーサルプライマーの使用により、ほとんどの、そうでなけ れば全ての真正細菌起源の生物のスペーサー領域が増幅される。同じ結果は、普 遍性を低下させた異なるプライマーセットの組み合わせ（複合増幅(multiplex a mplification)）、すなわち、２以上のプライ マーセットを１つの同じ反応混合物中で同時に用いる増幅手法）を用いることに よって得られ得る。 いくつかの適用については、サンプル中の全ての生物ではなく、より特定の、 予め決めた分類群を増幅することが適切である。これは、スペーサーの近接遺伝 子の保存度の低い部分の中（例えば、マイコバクテリアのスペーサー領域の増幅 のためのＭＹＣＰ１−５）あるいはスペーサーそれ自体の中（例えば、それぞれListeria 種、Brucella種、Chlamydia trachomatis、およびYersinia enterocoli tica のスペーサー領域の特異的増幅のためのLis-P1-P7、BRU-P1-4、CHTR-P1-2、 およびYEC-P1-2）のいずれかに位置する特定のプライマーを用いて達成され得る 。 したがって、本発明は、サンプル中の少なくとも１つの微生物の検出および同 定方法、若しくはいくつかの微生物を同時に検出する方法であって、 以下の工程： (i)必要なら、サンプル中の検出されるべき微生物からポリ核酸を放出させ、単 離および／または濃縮する工程； (ii)必要なら、検出されるべき微生物由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサ ー領域若しくはその一部を少なくとも１つの適切なプライマー対を用いて増幅す る工程； (iii)工程(i)若しくは(ii)のポリ核酸を、少なくとも２つのプローブを含むプロ ーブのセットと、同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下でハイブリダイ ズさせる工程、ここで、上記プローブは表１ａの配列若しくはその等価物から選 択されるか、および／または図１〜１０３に示した任意のスペーサー配列から誘 導された分類群特異的プローブから選択され、上記分類群特異的プローブは、表 １ａの少なくとも１つのプローブと同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件 下でハイブリダイズし得るように 選択される； (iv)工程(iii)で形成されたハイブリッドを検出する工程； (v)工程(iv)で得られた特異なハイブリダイゼーションシグナルからサンプル中 に存在する微生物を同定する工程 を包含する方法を提供する。 表１ａに記載したプローブは、全て、それらが５０℃のハイブリダイゼーショ ンおよび洗浄温度で、３×ＳＳＣおよび２０％ホルムアミドという好ましいハイ ブリダイゼーションおよび洗浄培地中で所望のハイブリダイゼーション特性を示 すような方法で選択された。 プローブの「等価物」という用語はまた、「変種」若しくは「ホモログ」若し くは「自明な誘導体」とも呼ばれ、その等価物が、対応する改変されていないプ ローブ配列と同じＲＮＡ若しくはＤＮＡ標的とハイブリダイズする限り、１つま たはいくつかのヌクレオチドの任意のそれらの末端への付加若しくはそれからの 除去のいずれかにより、またはその配列内の１以上のヌクレオチドの変更により 、あるいはその両方の組み合わせにより、表１に特定された任意のプローブと配 列が異なるプローブをいう。上記等価物は、対応する改変されていないプローブ 配列と、少なくとも７５％の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、最も好ま しくは８５％以上の相同性を共有している。プローブの等価物を用いる場合、対 応する改変していないプローブと同じ特異性を得るためにハイブリダイゼーショ ン条件を改変することが必要であることを銘記すべきである。結局、本発明の目 的は、同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で働くプローブのセットを 用いることなので、もとの改変されていないプローブと同じセットに属する他の プローブの配列にしたがって改変することもまた必要であろう。これらの改変は 、当業者に公知の原則、例えば、Hames B and Higgins S(Eds):Nucleic acid hybridization．Practicalapproach．IR L Press.Oxford,UK,1985 に記載された原則にしたがって行うことができる。 本発明はまた、分類群特異的プローブをその分類群のスペーサー領域配列から 選択する方法を提供し、それらのプローブは、それらが統一されたハイブリダイ ゼーションおよび洗浄条件下で所望のハイブリダイゼーション特性を示すように 選択される。 用語「統一された」条件は、これらの条件が異なる分類群の検出を可能にする 異なるプローブに対しても同一であることを意味する。 好ましくは、本発明は、最終的に２つの微生物を同時に検出する上記の方法を 提供する。 好ましい実施態様においては、工程(iii)に記載されたプローブのセットは、 表１ａの配列から選択された少なくとも２つのプローブ若しくはその等価物を含 む。 別の実施態様においては、工程(iii)に記載されたプローブのセットは、表１ ａの配列から選択された少なくとも１つのプローブ若しくはその等価物、および 図１〜１０３に示された任意のスペーサー配列から誘導された少なくとも１つの 分類群特異的プローブを含む。 さらに別の実施態様においては、工程(iii)に記載されたプローブのセットは 、図１〜１０３に示された任意のスペーサー配列から誘導された少なくとも２つ の分類群特異的プローブを含む。 本発明はまた上記の方法であって、工程(iii)で特定されたプローブを少なく とも１つの別のプローブ、好ましくはやはり１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサ ー領域由来のプローブと組み合わせて、同じサンプル中に存在しがちな異なる病 原体細菌の同時検出を可能にする方法を提供する。 生物学的サンプル中に存在する臨床上関連のある生物は、サンプルの起源に依 存して著しく変化し得る。最も一般的な病原体細菌は以下のものであり、喀出サ ンプル、若しくは気道起源のサンプルに見いだされ得る： - Moraxella catarrhalis - Streptococcus pneumomiae - Haemophilus influenzae - Pseudomonas aeruginosa - Mycoplasma pneumomiae - Acinetobacter 種 - Mycobacterium 種 - Staphylococcus aureus - Legionella pneumophila ほとんど、そうでなければ全てのこれらの生物の検出を可能にするスペーサー プローブを有するＬｉＰＡストリップは、上に説明した理由により非常に利点が ある 明らかに、これは他の生物学的サンプル、例えば、脳脊髄液、尿生殖器管サン プル、胃腸管サンプル、血液、尿、食品、土壌、などにも適応する。例えば、脳 脊髄液の好ましいパネルは、以下の生物の検出および分別を可能にするプローブ の組み合わせを含む： - Neisseria meningitidis - Streptococcus pneumoniae - Streptococcus agalactiae - Listeria monocytogenes - Mycobacterium tuberculosis いくつかの上記の生物については、スペーサープローブはすでに以前の特許出 願（ＷＯ９１／１６４５４）において設計されている。サンプル中に存在する可 能性のあるほとんどの病原体を一回のテストで検出し得るために、本発明のプロ ーブはＷＯ９１／１６４５４のプローブの少なくとも １つ、若しくはＷＯ９１／１６４５４において特定されたそれらの自明な誘導体 と組み合わせてもよい。明確化のため、これらのプローブを以下に挙げる： したがって、本発明は上記の方法を提供し、ここで前記のサンプルは気道由来 であり、そして工程(iii)で定義したプローブのセットは以下のスペーサープロ ーブ： そして、より好ましくは以下のスペーサープローブ： から選択される少なくとも１つのプローブ若しくはそのプローブの等価物を含む か、 および／またはこのプローブのセットは、上記サンプル中の検出されるべき微生 物の１つに対応するスペーサー領域配列から誘導された少なくとも１つの分類群 特異的プローブを含み、上記スペーサー領域配列はSEQ ID NO７６〜１０６、１ ５７〜１７４、１２４、１２５、１１１〜１１５、１３９〜１４４、若しくは１ ２６〜１３０によって示される任意の配列から選択され、上記プローブ若しくは 等価物は以下の生物の少なくとも１つを検出する任意のプローブと組み合わせて 用いてもよい：Haemophilus influenzae、Streptococcus pneumoniae、Moraxell a catarrhalis、若しくはBordetella pertussis。 上記の本発明のプローブは、Mycobacterium種（SEQ ID NO１〜３３および１７ ５〜１９１）、Pseudomonas aeruginosa（SEQ ID NO３４〜３８）、Mycoplasma 種（SEQ ID NO４９〜５２）、Staphylococcus aureus （SEQ ID NO５３〜５６） 、およびAcinetobacter baumanii（SEQ ID NO５７および５８）の検出のために 設計される。 好ましくは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ若しくは それ以上の上記プローブを同時に用いる。 本発明はまた、上記の方法に関し、ここで、上記のサンプルは脳脊髄液から取 り出され、そして工程(iii)で定義したプローブのセットは、以下のスペーサー プローブ： そして、より好ましくは以下のスペーサープローブ： から選択される少なくとも１つのプローブ若しくはこのプローブの等価物を含む か、 および／またはこのプローブのセットは、上記サンプル中の検出されるべき微生 物の１つに対応するスペーサー領域配列から誘導された少なくとも１つの分類群 特異的プローブを含み、上記スペーサー領域配列はSEQ ID NO１１６、１１８〜 １２１、若しくは２１３〜２１５によって示される任意の配列から選択され、上 記プローブ若しくは等価物は以下の生物の少なくとも１つを検出する任意のプロ ーブと組み合わせて用いてもよい：Neisseia meningitidis 、Haemophilus infl uenzae 、若しくはStreptococcus pneumoniae。 上記の本発明のプローブは、Mycobacterium種、より特定するとMycobacterium tuberculosis（SEQ ID NO１〜５）、およびListeria種、より特定するとLister ia monocytogenes（SEQ ID NO３９〜４２）の検出のために設計される。 好ましくは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ若しくは それ以上の上記プローブを同時に用いる。 本発明はまた、上記の方法に関し、ここで、上記のサンプルは尿生殖器管から 採取され、そして工程(iii)で記載したプローブのセットは、以下のスペーサー プローブ： から選択される少なくとも１つのプローブ若しくは該プローブの等価物を含むか 、 および／またはこのプローブのセットは、上記サンプル中の検出されるべき微生 物の１つに対応するスペーサー領域配列から誘導された少なくとも１つの分類群 特異的プローブを含み、上記スペーサー領域配列はSEQ ID NO１２２、１２３、 １９７、１２４若しくは１２５によって示される任意の配列から選択され、上記 プローブ若しくは等価物は以下の生物の少なくとも１つを検出する任意のプロー ブと組み合わせて用いてもよい：Neisseria gonorrhoeae 、Haemophilus ducreyi 若しくはStreptococcus agalac tiae 。 上記の本発明のプローブは、Chlamydia種（SEQ ID NO４５〜４８および２０１ ）、およびMycoplasma種（SEQ ID NO５１および５２）の検出のために設計され る。 好ましくは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ若しくは７つの上記プ ローブを同時に用いる。 本発明はまた、上記の方法に関し、ここで、上記のサンプルは食物から採取さ れ、そして工程(iii)で定義したプローブのセットは、以下のスペーサープロー ブ： そして、より好ましくは以下のスペーサープローブ： から選択される少なくとも１つのプローブ若しくは該プローブの等価物を含むか 、 および／またはこのプローブのセットは、上記サンプル中の検出されるべき微生 物の１つに対応するスペーサー領域配列から誘導された少なくとも１つの分類群 特異的プローブを含み、上記スペーサー領域配列はSEQ ID NO１１６、１１８〜 １２１、２１３〜２１５、１３９〜１４４、１３１、１３２、１５４、１３３〜 １３８、１９５若しくは１９６によって示される任意の配列から選択され、上記 プローブ若しくは等価物はCampylobacter種の株を検出する任意のプローブと組 み合わせて用いてもよい。 上記の本発明のプローブは、Listeria種（SEQ ID NO３９〜４４）Staphylococ cus 種（SEQ ID NO５３〜５６）、Brucella種（SEQ ID NO５９、６０、１９３お よび１９４）、Salmonella種（SEQ ID NO６１〜６４）およびYersinia enteroco litica （SEQ ID NO１９８〜２００）の検出のために設計される。 好ましくは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ若しくは それ以上の上記プローブを同時に用いる。 本発明はまた、上記の方法に関し、ここで、上記のサンプルは患者の胃腸管か ら採取され、そして工程(iii)で定義したプローブのセットは、以下のスペーサ ープローブ： そして、より好ましくは以下のスペーサープローブ： から選択される少なくとも１つのプローブ若しくは該プローブの等価物を含むが 、 および／またはこのプローブのセットは、上記サンプル中の検出されるべき微生 物の１つに対応するスペーサー領域配列から誘導された少なくとも １つの分類群特異的プローブを含み、上記スペーサー領域配列はSEQ ID NO１３ ３〜１３８若しくは１９５〜１９６によって示される任意の配列から選択され、 上記プローブ若しくは等価物はCampylobacter種を検出する任意のプローブと組 み合わせて用いてもよい。 上記の本発明のプローブは、Salmonella種（SEQ ID NO６１〜６４）およびYer sinia enterocolitica（SEQ ID NO１９８〜２００）の検出のために設計される 。 好ましくは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、若しくは７つの上記 プローブを同時に用いる。 本発明はまた、特定の細菌分類群のために選択されたプローブ若しくはその等 価物の用途に関し、上記分類群は、完全な属、若しくは属内の亜群、種、若しく はさらに種内のサブタイプのいずれかである。 したがって、本発明は、サンプル中の１以上のMycobacterium種および亜種を 検出しそして同定する上記のような方法を提供する。ここで、工程(iii)は下記 のプローブ： そして、より好ましくは以下の制限されたグループのスペーサープローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO７６〜１１０若しくは１５７〜１７４から誘導した任 意のプローブであって、Mycobacterium種と特異的にハイブリダイズするプロー ブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO７６〜１１０および１５７〜１７４で示される配列は新規である。 好ましくは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ若しくは それ以上の上記プローブを同時に用いる。 上記のように、好ましい制限されたプローブのセットは、８０％以上の、好ま しくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の感度および特異性を、実施例の 項で記載する特定のハイブリダイゼーション条件下で示すプローブである。 １つの特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMycobact erium tuberculosis複合体を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで 、工程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO７６から誘導した任意のプローブであって、M.tubercu losis 複合体と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる 工程を包含する。M.tuberculosis複合体は、M.tuberculosis 、M.bovis 、M.bov is BCG、M.africanumおよびM.microti株を含む。 SEQ ID NO７６に示す配列は新規である。 好ましくは、少なくとも２つ若しくは３つの上記プローブを同時に用いる。 別の特定の実施態様においては、本発明は、ＭＡＩＳ複合体由来の１以上のMy cobacterium 株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工程(iii) は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO７７〜１００若しくは１０８〜１１０から誘導した任 意のプローブであって、ＭＡＩＳ複合体由来の株と特異的にハイブリダイズする プローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する。本発明において定義される MAIS複合体は、M.avium、M.intracellulareおよびM.scrofulaceumおよび上記の 種に非常に近接して関連し、別の定義されたMycobacterium種にははっきりとは 属していない全ての株を含む。後者の群の株は本発明では「ＭＩＣ株」(M.intra cellulare 複合体)と定義する。 好ましくは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ若しくは それ以上の上記プローブを同時に用いる。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のM.av ium およびM.paratuberculosis株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、 ここで、工程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO７７および７８から誘導した任意のプローブであって 、M.avium若しくはM.paratuberculosisと特異的にハイブリダイズするプローブ と、ハイブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO７７および７８に示す配列は新規である。 好ましくは、この実施態様は両プローブを組み合わせて用いる。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium intracellulare株およびＭＩＣ株を検出しそして同定する上記の方法 を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、 ８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若 しくは９９から誘導した任意のプローブであって、Mycobacterium intracellula re 株およびＭＩＣ株と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズ させる工程を包含する。 SEQ ID NO７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、 ８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９に 示した配列は新規である 好ましくは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ若しくは それ以上の上記プローブを同時に用いる。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium intracellulare株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここ で、工程(iii)は少なくとも下記のプローブ： 若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO８９から誘導した任意のプローブであって、M.intrace llulare 株と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工 程を包含する。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium scrofulaceum株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで 、工程(iii)は少なくとも下記のプローブ： 若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO１００から誘導した任意のプローブであって、M.scrof ulaceum と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程 を包含する。 SEQ ID NO100に示した配列は新規である。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium kansasii株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工 程(iii)は下記のプローブ： そして、より好ましくは： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO１０１、１６７、１６８若しくは１６９から誘導した 任意のプローブであって、M.kansasiiと特異的にハイブリダイズするプローブと 、ハイブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO１０１、１６７、１６８および１６９に示した配列は新規である。 好ましくは、少なくとも２つ、３つ若しくは４つの上記プローブを同時に用い る。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium chelonae株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工 程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO１０２、１０３、若しくは１７４から誘導した任意の プローブであって、M.chelonaeと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイ ブリダイズさせる工程を包含する。他の好ましい実施態様にしたがって、これら の３つのプローブを組み合わせて用いる。 SEQ ID NO１０２、１０３、および１７４に示した配列は新規である。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上 のMycobacterium gordonae株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここ で、工程(iii)は下記のプローブ： そして、より好ましくは： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO１０４、１０５、若しくは１０６から誘導した任意の プローブであって、M.gordonaeと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイ ブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO１０４〜１０６に示した配列は新規である。 好ましくは、少なくとも２つ若しくは３つの上記プローブを同時に用いる。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium ulcerans株若しくはMycobacterium marinum株を検出しそして同定す る上記の方法を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： 若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO１５７から誘導した任意のプローブであって、M.ulcer ans およびM.marinumと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズ させる工程を包含する。 SEQ ID NO１５７に示した配列は新規である。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium genavense株を検出しそして同定する上記の方法を提 供し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO１５８、１５９、１６０、１６１若しくは１６２から 誘導した任意のプローブであって、M.genavenseと特異的にハイブリダイズする プローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO１５８〜１６２に示した配列は新規である。 実施例に記載するように、M.genavense は、狭義の(sensustrictu)M.genavens e およびM.simiae様と呼ばれる非常に関連のある群を含む。前者の株の群は、MGV -ICG-1 プローブで特異的に検出され得るが、一方後者の群は、MGV-ICG-3 プロ ーブと特異的にハイブリダイズする。MGV-ICG-2プローブはどちらの群も検出す る。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium xenopi株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工程 (iii)は下記のプローブ： 若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO１６３から誘導した任意のプローブであって、M.xenop i と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含 する。 SEQ ID NO １６３に示した配列は新規である。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium simiae株を検出しそして同定する上記の方法を提供 し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： 若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １６４若しくは１６５から誘導した任意のプローブで あって、M.simiaeと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさ せる工程を包含する。 SEQ ID NO １６４若しくは１６５に示した配列は新規である。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium fortuitum株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、 工程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、またはSEQ ID NO １６６か ら誘導した任意のプローブであって、M.fortuitumと特異的にハイブリダイズす るプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO １６６に示した配列は新規である。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium celatum株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工 程(iii)は下記のプローブ： 若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １７０から誘導した任意のプローブであって、M.cela tum と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包 含する。 SEQ ID NO １７０に示した配列は新規である。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium haemophilum株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで 、工程(iii)は下記のプローブ： 若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １７１、１７２若しくは１７３から誘導した任意のプ ローブであって、M.haemophilumと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハ イブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO １７１〜１７３に示した配列は新規である。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium malmoense株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、 工程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １０７から誘導した任意のプローブであって、M.malm oense と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を 包含する。 SEQ ID NO １０７に示した配列は新規である。 さらに別の特定の実施態様においては、本発明は、サンプル中の１以上のMyco bacterium 株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工程(iii)は 下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、ハイブリダイズさせ る工程を包含する。 好ましい実施態様によれば、両プローブを組み合わせて用いる。 本発明はまた、サンプル中の１以上のMycoplasma株を検出しそして同定する上 記の方法を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １２４若しくは１２５から誘導した任意のプローブで あって、Mycoplasma種と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイ ズさせる工程を包含する。 好ましくは少なくとも２つ、３つ、若しくは４つの上記プローブを同時に用い る。 より特定すると、本発明は、サンプル中の１以上のMycoplasma pneumoniae株 を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプロ ーブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １２５から誘導した任意のプローブであって、Mycopl asma pneumoniaeと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさ せる工程を包含する。好ましい実施態様によれば、これらの両プローブを組み合 わせて用いる。 SEQ ID NO １２５に示した配列は新規である。 別の実施態様において、本発明は、サンプル中の１以上のMycoplasma genital ium 株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工程(iii)は少なく とも下記のプローブ： 若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １２４から誘導した任意のプローブであって、Mycopl asma genitaliumと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさ せる工程を包含する。 SEQ ID NO １２４に示した配列は新規である。 本発明は、サンプル中の１以上のPseudomonas株を検出しそして同定する上記 の方法を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １１１、１１２、１１３、１１４若しくは１１５から 誘導した任意のプローブであって、Pseudomonas株と特異的にハイブリダイズす るプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO １１１〜１１５に示した配列は新規である。 好ましくは上記のプローブの少なくとも２つ、３つ、若しくは４つを同時に用 いる。 より特定すると、本発明は、サンプル中の１以上のPseudomonas aeruginosa 株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工程(iii) は下記のプローブ： そして、より好ましくは以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １１１から誘導した任意のプローブであって、Pseudo monas aeruginosaと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさ せる工程を包含する。 SEQ ID NO １１１に示した配列は新規である。 好ましくは上記のプローブの少なくとも２つ、３つ、４つ若しくは５つを同時 に用いる。 本発明は、サンプル中の１以上のStaphylococcus種を検出しそして同定する上 記の方法を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １３９、１４０、１４１、１４２、１４３若しくは１ ４４から誘導した任意のプローブであって、Staphylococcus種と特異的にハイブ リダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO １３９〜１４４に示した配列は新規である。 好ましくは上記のプローブの少なくとも２つ、３つ、若しくは４つを同時に用 いる。 より特定すると、本発明は、サンプル中の１以上のStaphylococcus aureus株 を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプロ ーブ： の少なくとも１つ、好ましくは両方、若しくは上記プローブの等価物と、および ／またはSEQ ID NO １３９、１４０、１４１、１４２、若しくは１４３から誘導 した任意のプローブであって、Staphylococcus aureusと特異的にハイブリダイ ズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する。好ましい実施態様に よれば、これらの両プローブを組み合わせて用いる。 別の特定の実施態様において、本発明は、サンプル中の１以上のStaphylococc us epidermidis株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工程(i ii)はSEQ ID NO １４４から誘導した任意のプローブであって、Staphylococcus epidermidis との特異的なハイブリダイズを引き起こすプローブと、ハイブリダ イズさせる工程を包含する。 本発明は、サンプル中の１以上のAcinetobacter株を検出しそして同定する上 記の方法を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １２６、１２７、１２８、１２９若しくは１３０から 誘導した任意のプローブであって、Acinetobacter種と特異的にハイブリダイズ するプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する。好ましい実施態様によ れば、これら両プローブを組み合わせて用いる。 SEQ ID NO １２６〜１３０に示した配列は新規である。 より特定すると、本発明は、サンプル中の１以上のAcinetobacter baumanii株 を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプロ ーブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １２６から誘導した任意のプローブであって、Acinet obacter baumaniiと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさ せる工程を包含する。好ましい実施態様によれば、これら両プローブを組み合わ せて用いる。 本発明はまた、サンプル中の１以上のListeria株を検出しそして同定する上記 の方法を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： そして、最も好ましくは以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １１６、１１８、１１９、１２０、１２１、２１３、 ２１４若しくは２１５から誘導した任意のプローブであって、Listeria種と特異 的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する。 実施例の項に記載するように、Listeria種は、狭義の(sensustrictu)Listerla 種および「Listeria様生物」と呼ばれる非常に関連のある群を含む。後者の群は 、LISP-ICG-1 プローブによって特異的に認識される。 SEQ ID NO １１６、１１８〜１２１、および２１３〜２１５に示した配列は新 規である。 好ましくは上記のプローブの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つ を同時に用いる。 より特定すると、本発明はまた、サンプル中の１以上のListeria monocytogen es 株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、 工程(iii)は下記のプローブ： そして、最も好ましくは以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １２０から誘導した任意のプローブであって、Lister ia monocytogenesと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさ せる工程を包含する。 好ましくは上記のプローブの少なくとも２つ若しくは３つを同時に用いる。 本発明はまた、サンプル中の１以上のBrucella株を検出しそして同定する上記 の方法を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： そして、最も好ましくは以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １３１、１３２、若しくは１５４から誘導した任意の プローブであって、Brucella株と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイ ブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO １３１、１３２および１５４に示した配列は新規である。 本発明はまた、サンプル中の１以上のSalmonella株を検出しそして同定する上 記の方法を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： そして、最も好ましくは以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １３３、１３４、１３５、１３６、１３７若しくは１ ３８から誘導した任意のプローブであって、Salmonella株と特異的にハイブリダ イズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO １３３〜１３８に示した配列は新規である。 好ましくは上記のプローブの少なくとも２つ、３つ若しくは４つを同時に用い る。 本発明はまた、サンプル中の１以上のChlamydia株を検出しそして同定する上 記の方法に関し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １２２、１２３若しくは１９７から誘導した任意のプ ローブであって、Chlamydia株と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイ ブリダイズさせる工程を包含する。 好ましくは上記のプローブの少なくとも２つ、３つ、４つ若しくは５つを同時 に用いる。 より特定すると、本発明はまた、サンプル中の１以上のChlamydia trachomati s を検出しそして同定する上記の方法に関し、ここで、工程(iii)は下記のプロー ブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １２３若しくは１９７から誘導した任意のプローブで あって、Chlamydia trachomatisと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハ イブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO １２３および１９７に示した配列は新規である。 好ましくは上記のプローブの少なくとも２つ、３つ、若しくは４つを同時に用 いる。 別の特定の実施態様において、本発明は、サンプル中の１以上のChlamydia ps ittaci 株を検出しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工程(iii)は少 なくとも下記のプローブ： 若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １２２から誘導した任意のプローブであって、Chlamy dia psittaciと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる 工程を包含する。 SEQ ID NO １２２に示した配列は新規である。 本発明は、サンプル中の１以上のStreptococcus株を検出しそして同定する上 記の方法を提供し、ここで、工程(iii)はSEQ ID NO １４５、１４６、１４７、 １４８、１４９、１５０、１５１、１５２、若しくは１５３から誘導した任意の プローブであって、Streptococcus株若しくはこれらのプローブの等価物と、特 異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO １４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５ ２若しくは１５３に示した配列は新規である。 本発明はまた、サンプル中の１以上のYersinia enterocolitica株を検出しそ して同定する上記の方法を提供し、ここで、工程(iii)は下記のプローブ： の少なくとも１つ若しくは上記プローブの等価物と、 および／またはSEQ ID NO １９５若しくは１９６から誘導した任意のプローブで あって、Yersinia enterocoliticaと特異的にハイブリダイズするプローブと、 ハイブリダイズさせる工程を包含する。 SEQ ID NO １９５および１９６に示した配列は新規である。 いくつかの場合においては、サンプル中に存在する全ての生物ではなく、関連 があると考えられるより特定の分類群のみを増幅することが有利である。このよ うな場合には、本発明は、これらの予め決めた分類群のみのためのスペーサー領 域の特異的な増幅を可能にするプライマーを提供する。 したがって、本発明は、サンプル中のChlamydia trachomatisを特異的に検出 しそして同定する上記の方法を提供し、ここで、工程(ii)は、 下記のプライマー： の少なくとも１つ若しくはそれらプライマーの等価物を用いる、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域若しくはその一部の増幅を包含し、前記等価物は、そ の等価物がChlamydia trachomatis由来のスペーサー領域若しくはその一部をな お特異的に増幅するものであって、１以上のヌクレオチドの変化により上記プラ イマーとは配列が異なっている。 好ましくは両プライマーを用いる。 本発明はまた、サンプル中のListeria種を特異的に検出しそして同定する上記 の方法を提供し、ここで、工程(ii)は、下記のプライマー： の少なくとも１つ若しくはそれらプライマーの等価物を用いる、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域若しくはその一部の増幅を包含し、前記等価物は、そ の等価物がListeria種由来のスペーサー領域若しくはその一部をなお特異的に増 幅するものであって、１以上のヌクレオチドの変化により上記プライマーとは配 列が異なっている。 本発明はまた、サンプル中のMycobacterium種を特異的に検出しそして同定す る上記の方法を提供し、ここで、工程(ii)は、下記のプライマー： の少なくとも１つ若しくはそれらプライマーの等価物を用いる、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域若しくはその一部の増幅を包含し、前記等価物は、そ の等価物がMycobacterium種由来のスペーサー領域若しくはその一部をなお特異 的に増幅するものであって、１以上のヌクレオチドの変化により上記プライマー とは配列が異なっている。 本発明はまた、サンプル中のBrucella種を特異的に検出しそして同定する上記 の方法を提供し、ここで、工程(ii)は、下記のプライマー： の少なくとも１つ若しくはそれらプライマーの等価物を用いる、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域若しくはその一部の増幅を包含し、前記等価物は、そ の等価物がBrucella種由来のスペーサー領域若しくはその一部をなお特異的に増 幅するものであって、１以上のヌクレオチドの変化により上記プライマーとは配 列が異なっている。 本発明はまた、サンプル中のYersinia enterocolitica種を特異的に検出しそ して同定する上記の方法を提供し、ここで、工程(ii)は、下記のプライマー： の少なくとも１つ若しくはそれらプライマーの等価物を用いる、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域若しくはその一部の増幅を包含し、前記等価物は、そ の等価物がYersinia enterocolitica種由来のスペーサー領域若しくはその一部 をなお特異的に増幅するものであって、１以上のヌクレオチドの変化により上記 プライマーとは配列が異なっている。 本発明はまた、上記に定義された少なくとも１つのプローブおよび／またはプ ライマーを含む組成物を提供する。 前記組成物は、プローブ若しくはプライマーのための当該分野で公知の任意の 担体、支持体、ラベル若しくは希釈物、より特定すると、用語の定義で詳述した 任意のラベル若しくは支持体を含んでもよい。 本発明は、より特定すると、上記で定義した単離されたプローブおよびプライ マーに関し、さらに特定すると、表１ａに特定された任意のプローブ若しくは表 １ｂに特定された任意のプライマーに関する。 別の実施態様によれば、本発明はまた、上記で定義され、そして図１〜１０３ に記載された新規なスペーサー領域配列(SEQ ID NO ７６〜１５４、SEQ ID NO １５７〜１７４、SEQ ID NO １９５〜１９７およびSEQ ID NO ２１３〜２１５) に関する。 別の実施態様において、本発明は、上で定義した任意のプローブを含むリバー スハイブリダイゼーション法を提供する。ここで、このプローブは固体支持体の 既知の場所、より好ましくは、メンブランストリップ上に固定されている。 さらに別の実施態様において、本発明は、サンプル中の、少なくとも１つの微 生物を検出しそして同定するための、若しくはいくつかの微生物を同時に検出し そして同定するための、以下の成分を含むキットを提供する： （ｉ）適切なら、インターシストロニックな１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサ ー領域若しくはその一部の増幅を可能にする少なくとも１つの適切なプライマー 対； （ｉｉ）上で定義した少なくとも１つのプローブ； （ｉｉｉ）前記プローブとサンプル中のポリ核酸またはそれらの増幅産物とのハ イブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液、若しくは緩衝液を作成するのに 必要な成分、； （ｉｖ）適切な洗浄条件下での形成されたハイブリッドの洗浄を可能にする溶液 、若しくはその溶液を作成する成分； （ｖ）適切なら、前記のハイブリダイゼーションの結果得られたハイブリッドを 検出する手段。 図面の説明 図１：Mycobacterium tuberculosis H37RV株ATCC 27294 由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 76)を示す。 図２：Mycobacterium avium ATCC 151.769(ITG4991)由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲ ＮＡスペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 77)を示す。 図３：Mycobacterium paratuberculosis 316F株および 2E株由来の１６Ｓ−２３ Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 78)を示す。 図４：Mycobacterium ITG 5513 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 79)を示す。 図５：Mycobacterium ITG 8695株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 80)を示す。 図６：Mycobacterium ITG 8708株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡス ペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 81)を示す。 図７：Mycobacterium ITG 8715 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 82)を示す。 図８：Mycobacterium ITG 8054 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 83)を示す。 図９：Mycobacterium ITG 8737 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 84)を示す。 図10：Mycobacterium ITG 8743 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 85)を示す。 図11：Mycobacterium ITG 8745 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 86)を示す。 図12：Mycobacterium ITG 8748 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 87)を示す。 図13：Mycobacterium ITG 8752株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 88)を示す。 図14：Mycobacterium intracellulare serovar 12 ITG 5915 由来の１６Ｓ−２ ３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 89)を示す。 図15：Mycobacterium lufu ITG 4755 由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサ ー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 90)を示す。 図16：Mycobacterium ITG 5922 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 91)を示す。 図17：Mycobacterium ITG 1329 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 92)を示す。 図18：Mycobacterium ITG 1812 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡス ペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 93)を示す。 図19：Mycobacterium ITG 5280 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 94)を示す。 図20：Mycobacterium ITG 5620 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 95)を示す。 図21：Mycobacterium ITG 5765 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 96)を示す。 図22：Mycobacterium ITG 7395 株由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 97)を示す。 図23：Mycobacterium ITG 8738 由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 98)を示す。 図24：Mycobacterium ITG 926 由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 99)を示す。 図25：Mycobacterium scrofulaceum ITG 4988 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー 領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 100)を示す。 図26：Mycobacterium kansasii ATCC 22478(=ITG4987)由来の１６Ｓ−２３Ｓス ペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 101)を示す。 図27：Mycobacterium chelonae abcessus ITG 4975由来の１６Ｓ−２３Ｓスペー サー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 102)を示す。 図28：Mycobacterium chelonae chelonae ITG 9855由来の１６Ｓ−２３Ｓスペー サー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 103)を示す。 図29：Mycobacterium gordonae ITG 7703 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 104)を示す。 図30：Mycobacterium gordonae ITG 7836 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 105)を示す。 図31：Mycobacterium gordonae ITG 8059 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 106)を示す。 図32：Mycobacterium malmoense ITG 4842およびITG 4832 由来の１６Ｓ−２３ Ｓスペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 107)を示す。 図33：Mycobacterium 8757株由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤＮＡ配列 (SEQ ID NO 108)を示す。 図34：Mycobacterium ITG 8723 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤＮＡ 配列(SEQ ID NO 109)を示す。 図35：Mycobacterium ITG 8724 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤＮＡ 配列(SEQ ID NO 110)を示す。 図36：Pseudomonas aeruginosa UZG 5669 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 111)を示す。 図37：Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG 1225 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペー サー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 112)を示す。 図38：Pseudomonas stutzeri LMG 2333 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の ＤＮＡ配列(SEQ ID NO 113)を示す。 図39：Pseudomonas alcaligenes LMG 1224 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 114)を示す。 図40：Pseudomonas putida LMG 2232 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤ ＮＡ配列(SEQ ID NO 115)を示す。 図41：Listeria ivanovii CIP 7842 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤ ＮＡ配列(SEQ ID NO 117)を示す。 図42：Listeria monocytogenes由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤＮＡ配 列(SEQ ID NO 116)を示す。 図43：Listeria seeligeri serovar 4A nr.4268 由来の１６Ｓ− ２３Ｓスペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 118)を示す。 図44：Listeria ivanovii CIP 7842の長いスペーサー領域の部分配列由来の１６ Ｓ−２３Ｓの大きなスペーサー領域の部分ＤＮＡ配列(SEQ ID NO 119)を示す。 図45：Listeria monocytogenes IHE serovar 4B由来の１６Ｓ−２３Ｓの大きな スペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 120)を示す。 図46：Listeria seeligeri serovar 4A nr.4268 由来の１６Ｓ−２３Ｓの大きな スペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 121)を示す。 図47：Chlamydia psittaci 6BC由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤＮＡ配 列(SEQ ID NO 122)を示す。 図48：Chlamydia trachomatis由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤＮＡ配 列(SEQ ID NO 123)を示す。 図49：Mycoplasma genitalium (U.Gobel)由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 124)を示す。 図50：Mycoplasma pneumoniae ATCC 29432 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 125)を示す。 図51：Acinetobacter baumanii LMG 1041 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 126)を示す。 図52：Acinetobacter calcoaceticus LMG 1046 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサ ー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 127)を示す。 図53：Acinetobacter haemolyticus LMG 996 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー 領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 128)を示す。 図54：Acinetobacter johnsonii LMG 999 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 129)を示す。 図55：Acinetobacter junii LMG 998 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペー サー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 130)を示す。 図56：Brucella melitensis NIDO Biovar １由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 131)を示す。 図57：Brucella suis NIDO Biovar １由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤ ＮＡ配列(SEQ ID NO 132)を示す。 図58：Salmonella dublin由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の１つのＤＮＡ 配列(SEQ ID NO 133)を示す。 図59：Salmonella dublin由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の１つのＤＮＡ 配列(SEQ ID NO 134)を示す。 図60：Salmonella enteritidis由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の１つのＤ ＮＡ配列(SEQ ID NO 135)を示す。 図61：Salmonella enteritidis由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の１つのＤ ＮＡ配列(SEQ ID NO 136)を示す。 図62：Salmonella typhimurium由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の１つのＤ ＮＡ配列(SEQ ID NO 137)を示す。 図63：Salmonella typhimurium由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の１つのＤ ＮＡ配列(SEQ ID NO 138)を示す。 図64：Staphylococcus aureus UZG 572株８由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域の１つのＤＮＡ配列(SEQ ID NO 139)を示す。 図65：Staphylococcus aureus UZG 6289 株由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域の１つのＤＮＡ配列(SEQ ID NO 140)を示す。 図66：Staphylococcus aureus UZG 6289 株由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域の１つのＤＮＡ配列(SEQ ID NO 141)を示す。 図67：Staphylococcus aureus UZG 6289 株由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域の１つのＤＮＡ配列(SEQ ID NO 142)を示す。 図68：Staphylococcus aureus UZG 6289 株由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域の１つのＤＮＡ配列(SEQ ID NO 143)を示す。 図69：Staphylococcus epidermidis UZG CNS41 株由来の１６Ｓ−２３Ｓスペー サー領域の１つのＤＮＡ配列(SEQ ID NO 144)を示す。 図70：Streptococcus mitis UZG 2465 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の ＤＮＡ配列(SEQ ID NO 145)を示す。 図71：Streptococcus pyogenes UZG 3671 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 146)を示す。 図72：Streptococcus sanguis UZG 1042 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 147)を示す。 図73：Streptococcus saprophyticus UZG CNS46 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサ ー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 148)を示す。 図74：Streptococcus species UZG 536(84)由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 149)を示す。 図75：Streptococcus species UZG 4341 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 150)を示す。 図76：Streptococcus species UZG 457(44B)由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 151)を示す。 図77：Streptococcus species UZG 97A由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の ＤＮＡ配列(SEQ ID NO 152)を示す。 図78：Streptococcus species UZG 483(76)由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 153)を示す。 図79：Brucella abortus NIDO Tulya biovar 3 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサ ー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 154)を示す。 図80：Mycobacterium ulcerans ITG 1837およびMycobacterium marinum ITG 7732 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID N O 157)を示す。 図81：Mycobacterium genavense ITG 8777 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 158)を示す。 図82：Mycobacterium genavense ITG 92-742 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー 領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 159)を示す。 図83：Mycobacterium genavense ITG 9500 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 160)を示す。 図84：Mycobacterium simiae様 ITG 7379 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 161)を示す。 図85：Mycobacterium simiae様 ITG 9745由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 162)を示す。 図86：Mycobacterium xenopi ITG 4986 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の ＤＮＡ配列(SEQ ID NO 163)を示す。 図87：Mycobacterium simiae A ITG 4485 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 164)を示す。 図88：Mycobacterium simiae B ITG 4484 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 165)を示す。 図89：Mycobacterium fortuitum ITG 4304 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 166)を示す。 図90：Mycobacterium kansasii ITG 6328 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 167)を示す。 図91：Mycobacterium kansasii ITG 8698 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域 のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 168)を示す。 図92：Mycobacterium kansasii ITG 8973 由来の１６Ｓ−２３Ｓス ペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 169)を示す。 図93：Mycobacterium celatum ITG 94-123 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 170)を示す。 図94：Mycobacterium haemophilum ITG 776 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 171)を示す。 図95：Mycobacterium haemophilum ITG 778 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領 域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 172)を示す。 図96：Mycobacterium haemophilum ITG 3071 由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー 領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 173)を示す。 図97：Mycobacterium chelonae ITG 94-330 およびITG 94-379 由来の１６Ｓ− ２３Ｓスペーサー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 174)を示す。 図98：Yersinia enterocolitica P95 株由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の ＤＮＡ配列(SEQ ID NO 195)を示す。 図99：Yersinia enterocolitica P95 株由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の ＤＮＡ配列(SEQ ID NO 196)を示す。 図100：Chlamydia trachomatis SSDZ 94 M 1961 株由来の１６Ｓ−２３Ｓスペー サー領域のＤＮＡ配列(SEQ ID NO 197)を示す。 図101：Listeria様MB 405 単離体由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤＮＡ 配列(SEQ ID NO 213)を示す。 図102：Listeria様MB 405 単離体由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤＮＡ 配列(SEQ ID NO 214)を示す。 図103：Listeria様MB 405 単離体由来の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域のＤＮＡ 配列(SEQ ID NO 215)を示す。 表の説明 表１ａ：１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域を起源とする新規プ ローブのリスト 表１ｂ：スペーサー領域若しくはその一部の分類群特異的増幅に用いられる可能 性のあるプライマーのリスト。 表２：Pseudomonasについてのハイブリダイゼーションの結果。 表３：マイコバクテリアの株タイプについて得られた異なるプローブパターン。 表４：ＬｉＰＡでテストしたマイコバクテリア株。 表５：Listeria(プローブLMO1,2、LSE1、LIV1、LIS1)についてのハイブリダイゼ ーションの結果。 表６：Listeria(プローブLMO3、LIS1)についてのハイブリダイゼーションの結果 。 表７：Chlamydiaについてのハイブリダイゼーションの結果。 表８：新規なマイコバクテリアのプローブとハイブリダイゼーションの結果 表９：Brucellaについてのハイブリダイゼーションの結果。 表１０：Staphylococcusについてのハイブリダイゼーションの結果。 実施例１：Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosaは、通常は重篤な潜在的疾患に関連している重要なヒ トの病原体である。これはまた、院内感染の主な原因であり、その特徴として抗 菌剤に抵抗する傾向がある。このグラム陰性の非発酵性の桿菌は、創傷感染、菌 血症、気道および尿路感染症のような異なる臨床症状の原因でもあり得、また、 嚢胞性線維症の患者における罹病および死亡の主要な原因でもある。 Pseudomonas種は、現在、増殖の特徴および幾つかの生物化学的特性に基づき 識別されており、このため、病原体の正しい同定をするために２４〜７２時間か かっている。 既にモノクローナルまたはポリクローナル抗体の開発により、Pseudomonas種 の同定は著しく改善された。しかし最近、標的ＤＮＡを前もって増幅して、また は増幅せずに、ＤＮＡプローブを使用する非常に高感度で特異的な方法で、臨床 サンプル中で直接生物を検出することが可能であることが証明された示された。 Pseudomonas aeruginosaを研究するためのＤＮＡプローブは、既に記載されて おり、主に疫学的分類に使用されている（Ogle et al.，1987; Samadpour et al .，1988; McIntosh etal.，1992）。しかし、これらのプローブのいずれも１６ Ｓ−２３Ｓスペーサーから誘導されたものではない。 以下の種： ‐Pseudomonas aeruginosa 5669 ‐Pseudomonas alcaligenes LMG 1224^T ‐Pseudomonas fluorescens LMG 5167 ‐Pseudomonas putida LMG 2232 ‐Pseudomonas stutzeri LMG 2333^T ‐Pseudomonas pseudoalcaligenes LMG 1225^T にいいて、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子ス ペーサー領域および２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部を、保存プライマー（上流プ ライマー：TGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA(SEQ ID NO 155）；下流プライマー：CCTTT CCCTCACGGTACTGGT(SEQID NO 156））で増幅した。 得られたアンプリコン（ampllcons）のクローニングを促進するために、Ｎｏ ｔＩ認識部位を下流プライマーに付加した。精製およびＮｏｔＩでのフラグメン トの消化後、このアンプリコンをＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩで消化したpBluescriptS K⁺プラスミドベクターにクローン化した。 プラスミドベクターに配置したプライマーの組み合わせの二本鎖プラスミドＤ ＮＡを使用して、または内部ＰＣＲプライマーとの組み合わせの精製後のＰＣＲ 産物について直接のいずれかで、ジデオキシ−鎖停止化学法（dideoxy-chain te rminating chemistry）により、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子スペーサー領域 の配列決定を行った。 図３６〜４０は、上記の異なるPseudomonas種由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ 遺伝子スベーサー領域のヌクレオチド配列を表す。P.fluorescensについては、 部分配列情報のみが得られた。 P.aeruginosa 5669 株由来のスペーサーの核酸配列から、５つのオリゴヌクレ オチドプローブを選択して化学合成した。それらのオリゴヌクレ オチドの配列は、下記のとおりである： リバースハイブリダイゼーションアッセイを用いて、オリゴヌクレオチドプロ ーブの特異性および感度の試験を行った。異なる試験細菌のゲノムＤＮＡを、ビ オチン化プライマー（クローニング用と同じプライマー、上記参照）を用いて増 幅した。１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子スペーサー領域にわたる、得られたア ンプリコンを変性して、異なるオリゴヌクレオチドプローブを線状に固定化した メンブランストリップにハイブリダイズさせた（ＬｉＰＡ）。ハイブリダイゼー ションは、３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエ ン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）および２０％ホルムアミド（ＦＡ）の混合物中で ５０℃の温度で１時間行った。同じ混合物中で同じ温度で１５分間洗浄を行った 。 アルカリホスファターゼに結合したストレプトアビジン結合体を用いてハイブ リッドを検出し、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）およびＢＣＩＰ（ブロ モ−クロロ−インドリルリン酸）を用いる沈降反応によりプローブを可視化した 。 プローブＰＡ１、ＰＡ２およびＰＡ３で得られたハイブリダイゼーション結果 を表４に示すが、これは、プローブＰＡ１およびＰＡ３が、Pseudomonas aerugi nosa に対して１００％特異的であり、全ての試験株にハイブリダイズしたことを 示している。プローブＰＡ３による５０℃でのハイブリダイゼーションシグナル は最適ではなかったため、この特定のプローブに幾つかの追加のヌクレオチドを 付加することにより、このオリゴヌクレオチドプローブを改良した。この新たに 設計したプローブはＰＡ５である。 プローブＰＡ５によるハイブリダイゼーション実験により、このプローブもP.aeruginosa に対して１００％の特異性および１００％の感度を示すことが判った 。 オリゴヌクレオチドプローブＰＡ２は、試験したP.aeruginosa１７株の内５株 のみにハイブリダイズした。これらのプローブにハイブリダイズしなかった株の １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子スペーサー領域の直接配列決定により、異なる 株間の幾つかの異質性が示された。最初に開発したＰＡ２プローブとの比較によ り２つのミスマッチが見られた。ＰＡ２プローブの領域における異なる株間のこ の異質性を克服するために、新規プローブＰＡ４を設計した。このプローブは、 ミスマッチの位置で縮重して、いるので、５０℃でのハイブリダイゼーションシ グナルを改善するために幾つかの追加のヌクレオチドを付加した。 ハイブリダイゼーション結果に示されるように、この縮重プローブにより１０ ０％の特異性および１００％の感度が得られた。 実施例２：Mycobacterium 種々のマイコバクテリア種が、重篤なヒトの感染症に関与し得る。有名な例は 、Mycobacterium tuberculosisおよびMycobacterium lepraeである。最近では、 特に免疫不全の宿主において、ヒトの病原体として、M.avium、M.intracellular e およびM.kansasiiのような他の種にしばしば遭遇するようになった。 したがって、マイコバクテリア感染症の臨床検査診断は、M.tuberculosis複合 体に限定するべきでなく、理想的には大部分の臨床的に関連するマイコバクテリ ア種を含むべきである。 従来の検査技術による種のレベルでの病原性マイコバクテリアの同定および識 別は、一般に、困難で時間のかかることである。 これらの問題を克服するためにＤＮＡ技術を手段とした。報告されている方法 は、直接的なのＤＮＡプロービングから自動化配列解析にまで及ぶ。幾つかのア プローチが最近になって報告されている（Jonas et al.，1993; Frothingham an d Wilson，1993; Tomioka et al.，1993; Saito et al.，1989; Vaneechoutte e t al.，1993; Telenti et しかし、これらの方法は全て独特の不利な面を有し、これらの大部分は未だに 培養に依存している。さらに、そして最も重要なことに、これらの方法のいずれ によっても、１回の試験操作で異なる臨床的に関連するマイコバクテリア種の同 時検出が可能ではない。また、Mycobacterium avium−intracellulare複合体内 の特定の群の識別は困難であり、しばしば不可能でさえある。 上述の不利な点を克服するために、多くのMycobacteriumの種および群を同時 に高い信頼性で検出および識別を可能にするＬｉＰＡ試験が開発 された。これらの目的を達成するために使用されるプローブのセットは、全て１ ６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域から誘導した。使用される方法は、実施 例１に記載された方法と同様である。 １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、並びに１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮ Ａ近接遺伝子の一部を、Mycobacterium属用に保存されているプライマーでＰＣ Ｒにより増幅した。上流プライマーとして１６Ｓ遺伝子に位置する少なくとも１ つの以下のプライマーを使用した： 増幅のため下流プライマーとして２３Ｓ遺伝子に位置する少なくとも１つの以下 のプライマーを使用した： M.chelonaeに対して作用しなかったプライマーＭＹＣ−Ｐ２を除いて、上述の全 てのプライマーは、試験した全てのMycobacterium株のスペーサー領域を増幅し た。検出の感度を増強するために、Ｐ５およびＰ４を外部プライマーとして、Ｐ １およびＰ３を内部プライマーとして使用して、時にはネステッドＰＣＲ(neste d PCR)を行った。 本発明者らの目的に適合するプローブおよびプローブの組合せを設計して選択 できるようにするため、多くのマイコバクテリア株の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ スペーサー領域を配列決定した。得られた配列を相互に、および文献から公知の もの（例えば、Fronthingham et al.，1993，1994；Kempsell et al.,1992；Suz uki et al.,1988；EP-A-0395292；Van der Giessen et al.,1994）または公的に 利用可能な データバンクからのものと比較した。対応する配列は、図１〜３５に表される(S EQ ID NO ７６〜SEQ ID NO １１０)。 これらのデータから誘導したプローブは全て、統一されたハイブリダイゼーシ ョンおよび洗浄条件（即ち、３×ＳＳＣ、２０％脱イオン化ホルムアミド、５０ ℃）を用いて所望のハイブリダイゼーション特性が得られるように調整した。異 なるマイコバクテリア株にハイブリダイゼーションさせるために使用される調整 した１セットのプローブは、表１ａ、SEQ ID NO １〜３３に表される。本実施例 において使用されるプローブの命名法は、表１ａで使用されるものを略したもの であり、即ち、「ＩＣＧ」の文字は常に割愛されていることに注意されたい。得 られた特異的なハイブリダイゼーションパターンにより、試験株は、下記の種ま たは種の群の１つに割り当てることができた：M.tuberculosis複合体、M.avium 、M.intracellulareまたはM.intracellulare複合体、M.kansasii、M.chelonaeお よびM.gordonae）。各群に属する試験株を、表４にまとめる。全ての株は、Inst itute of Tropical Medecine, Antwerp,Belgiumから入手した。各群について得 られた異なるプローブパターンを表３に示し、更に詳細に後述する。M .tuberculosis複合体 M.tuberculosis 複合体は、M.tuberculosis 、M.bovis 、M.africanumおよびM .microtiに属する全ての株を含む。プローブＭtｂ1、Ｍtb2およびＭtb3は、全て の試験したM.tuberculosis複合体株に由来するＤＮＡとハイブリダイズする。試 験した他の株のいずれも、使用した条件ではこれらのプローブとはハイブリダイ ズしなかった。 更に、M.tuberculosis複合体株は、試験した他の全てのマイコバクテリア株の 場合と同様に、myc1若しくはmyc22プローブのいずれかまた は両方とハイブリダイズする。これらの２つのプローブは、単独または相互の組 合せで、一般的なMycobacteriumプローブとして設計されている。M.avium／M.pa ratuberculosis 検討した全てのM.aviumおよびM.paratuberculosisは、１セットのプローブに より同一のハイブリダイゼーションパターンを示した。このタイプの生物では、 プローブmyc1/myc22、mai1、ｍil11、ｍav1、mah1およびmav22 により陽性のハ イブリダイゼーションシグナルが得られる。後の２つのプローブは、M.aviumお よびM.paratuberculosis株と独占的にハイブリダイズし、このため、種特異的プ ローブとして使用することができる。M.avium単離体およびM.paratuberculosis 単離体の１６Ｓ−２３Ｓスペーサー配列は、同一であるか、またはほぼ同一であ るため、これら２つの分類群は、相互に識別することができない。この知見は、M .aviumおよびM.paratuberculosisが、実際１つの遺伝子種に属すると考えるべ きである（Rogal et al.，1990）（M.avium spp.aviumおよびM.avium spp.parat uberculosis ）ことを示す１６Ｓ ｒＲＮＡ配列データを支持する。M .intracellulareおよびM.intracellulare複合体（ＭＩＣ） ＭＩＣ株は、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域の配列データによると 、他のMycobacterium種から分離した別個のクラスターに属する、遺伝子型的に 非常に近縁の生物である。M.aviumおよびM.scrofulaceumは、これらに最も近い 類縁体である。一般にM.avium複合体（ＭＡＣ）株（以前のＭＡＩＳ−複合体） と呼ばれる試験したほぼ全ての株は、ＭＩＣ群に見い出すことができる。即ち、 本発明で定義されるＭＩＣ群は、M.scrofulaceumであると考えられるＭＡＣ−Ｇ を除いて、FronthinghamおよびWilson（1993）により報告されたＭＡＣタイプ株 を包含する。また、狭義のM.intracellulare株（M.intracellulares.s.）もこの クラスターの一部である。 このＭＩＣ群は、その中の亜群が、プローブのセットに対して異なるハイブリ ダイゼーション特性を示すような、非常に大きな群の株を含有するため、ＭＩＣ 型に更に細分することが考えられた。 ＭＩＣ １型は、幾つかの他のＭＡＣ株と共にM.intracellulare s.s.を含む 。全てのＭＩＣ １型単離体は、例外なく、以下のプローブとハイブリダイズす る：myc1/myc22、mai1およびmac1。以下のプローブは、ＭＩＣ １群内で更に細 分するために使用することができる：mil11、min1、min2〜2222、mil22およびmh ef1。 狭義のM.intracellulare株（ＭＩＣ 1.1.a型）は、この群の株にのみ陽性であ るプローブmin1により、この群を他のサブタイプから識別することができる。Ｍ ＩＣ 1.1.a型株の全ての株は、ＭＡＣに対するGen-Probe Rapid Diagnostic sys temのM.intracellulareプローブにより試験する時、陽性である。ＭＩＣ 1.1.b およびＭＩＣ 1.2 型は、M.intracellulareに非常に近縁の株を含む。これらは 、mil11およびmi122プローブを用いることにより識別することができる（表３参 照）。これらの群内の更なる細分は、プローブ：min2、min22、min222およびmin 2222を用いることにより達成できたであろうが、試みられなかった。更なる細分 は、疫学的な動機に有用であろう。 本発明者らの試験した株のコレクションの内２つだけが、ＭＩＣ ２株として 分類される。これらの株の１つは「Mycobacterium lufu」株（ＩＴＧ ４７５５ ）である。これらの株により生成する特異的なプローブパターンは、以下のプロ ーブによる陽性のハイブリダイゼーションシグナルを特徴とする：myc1/myc22、 mai1,，mi122、mah1および mal1。min2222、mac1およびmhef1プローブにより可変のハイブリダイゼーション 結果が得られる。他のプローブは陰性である。この型の更に多くの株を同定する 時、ＭＩＣ ２が異種の群であることが最終的に判るということはありそうにな い。これが適切なのであれば、可変のプローブは、更なる区別に役立つであろう 。 ＭＩＣ ３型には、M.intracellulare s.s.株に関係の遠いかなり多くのＭＡＣ 株および大部分の他のＭＡＣ株が分類される。このクラスターは、遺伝子型に基 づきM.aviumおよびM.intracellulareとは別個のものと見なされる。全てのＭＩ Ｃ ３サブタイプは、myc1/myc22、mai1、mil22およびmco1プローブにハイブリダ イズする。最後のプローブ(mco1)による陽性のシグナルは、ＭＩＣ ３株の特徴 である。以下のプローブにより可変のハイブリダイゼーション結果が得られる： mac1、mhef1およびmah1。ＭＩＣ ３は、３つのプローブ：mth11、mth2およびmef 11を使用することにより４つのサブタイプに更に細分することができる。mth2 プローブは、免疫不全のヒトから単離された非常に近縁のＭＡＣ株の群を含むＭ ＩＣ ３.１ 型に特異的である。大部分のＭＩＣ ３株は、ＭＩＣ ３．１サブタイ プに分類される。最終的に、種の階層では、この群の株に指定されるかもしれな いし、また、未だ命名されていないＭＡＣ株の他の群であることもある。サブタ イプＭＩＣ ３.４、ＭＩＣ ３.３およびＭＩＣ ３.２は、本発明者らの試験し た株のコレクションでは各々わずか２つ、１つおよび１つの株である。 ＭＩＣ ４型は、M.intracellulareとは関係の遠い「ＭＡＩＳ」株(M.malmoens e を含む)のコレクションである。一般的なmycl/myc22 プローブを別にして、Ｍ ＩＣ ４にハイブリダイズする上述のセットの唯一のプローブは、mai1プローブ である。このプローブは、M.avium、M .intracellulareおよび他のＭＩＣ株並びにM.scrofulaceumにもハイブリダイズ する、広い特異性を示す。M .scrofulaceum 試験した全てのM.scrofulaceum株は、プローブのセットとの同一のハイブリダ イゼーションパターンを示す。msc1プローブによる陽性シグナルは、M.scrofula ceum 株に独特なものである。この種に対して陽性シグナルを有する他のプローブ は、明らかにmyc1/myc22およびmai1のみである。M.kansasii mka3およびmka4プローブは、M.kansasiiに特異的である：即ち、M.kansasii株 からの増幅したＤＮＡをハイブリダイゼーションに使用する時、ＬｉＰＡストリ ップ上で明確な陽性シグナルが得られるが、試験した他の全ての生物ではシグナ ルはない。mka1およびmka2プローブの配列は、標的配列と完全に相補的ではない （各々、３つおよび１つのミスマッチ）が、使用した条件（５０℃、３×ＳＳＣ 、２０％ホルムアミド）下で、これらはM.kansasiiＤＮＡに独占的にハイブリダ イズし、試験した他のどのマイコバクテリアＤＮＡにもハイブリダイズしないた め、これらのプローブも有用であることが判った。このことは、プローブが有用 であるために必ずしも標的に完全に一致する必要はなく、配列および長さの調節 がある程度まで可能であることを示している。M .chelonae M.chelonae種は、M.chelonae ssp.chelonaeおよびM.chelonae ssp.abscessus 株を包含する。各亜種の１つの株についてスペーサー領域を配列決定すると、小 さな違いが観察された（SEQ ID NO １０３およびSEQ ID NO １０２）。mch1およ びmch2プローブは、両方の株にハイ ブリダイズする。myc1/myc22を除いて、他の全てのプローブは、これら２つの株 に対して陰性である。 表４に記載されていない更に２つのM.chelonae株（即ち、両者ともInstitute of Tropical Medecine, Antwerp, Belgiumから入手したM.chelonae９４−３７９ およびM.chelonae９４−３３０）とのmch1およびmch2プローブの試験の結果、こ れらはmch1プローブとハイブリダイズしなかったようであった。これは、これら ２つの株のスペーサー領域の配列決定により確認した（SEQ ID NO 184）。他の マイコバクテリアによるスペーサー領域のクラスター解析により、M.chelonae株 は２つの群に細分することができることが判った。この第２群の株（９４−３７ ９および９４−３３０が属する）を特異的に検出するための、第３のmch3プロー ブを設計した。 このことは、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域から誘導されたＤＮＡ プローブの使用が、古典的な同定法によっては同じ種に属する、異なる群の株を 識別するのに役立つこと、そして恐らくマイコバクテリアの新規な種を検出して 記載するために使用することができることを示している。この場合、mch2は、全 てのM.chelonae株を検出するが、mch1およびmch3は、異なる亜群を識別する。M .gordonae 試験した５つのM.gordonae株は、全てmgo5プローブにハイブリダイズする。my c1/myc22 プローブでも陽性のハイブリダイゼーションシグナルが得られ、そし て幾つかのM.gordonae株は、mgo1 およびmgo2 にもハイブリダイズする。 他のマイコバクテリア種 上述以外のマイコバクテリア種に属する株は、一般的なプローブである myc1/myc22にのみハイブリダイズする。これは、これらの株が、恐らくMycobact erium 属には属するが、記載された他のプローブの１つまたはそれ以上を使用す ることにより特異的に同定することができる１つの種または群に属さないことを 示している。 結論として、本発明者らは、使用する本発明のプローブの特定の組合せにより 、異なるレベルでのＤＮＡプローブ試験を提供するできると述べることができる 。 全てのプローブを１回に同じＬｉＰＡ試験に使用すると、種のレベルの識別お よびマイコバクテリアの特定の群のサブタイプ分けを行うことができる。しかし 、ストリップ上のプローブの組み立ては、種特異的なプローブに限定することが できる：この場合種のレベルで同定が行われる。ストリップ上のプローブの数を 更に減らすと、唯一のまたは少数の種の特異的な検出ができる。明らかに、サブ タイプ株、例えばM.intracellulare複合株（ＭＩＣ）に属する株に対して単独に 試みるＬｉＰＡストリップを設計することができる。マイコバクテリアの診断お よび／またはタイプ分けを行う検査室の特定のニーズに依存して、これら全ての 異なる適用が有用であろう。しかし、ＬｉＰＡ形式でのプローブの組合せを使用 することにより、臨床サンプル中に存在する生物の同定に関して得られる情報量 は、単一のプローブのみを使用するＤＮＡプローブ試験に比較してかなり上昇す る。幾つかの群、または少なくとも幾つかの群の更なる細分については、この（ 亜）群と唯一ハイブリダイズする単一のプローブは設計することができなかった 。この場合、プローブパターンのみが、必要な情報を提供することができる。こ れらの適用のために、ＬｉＰＡは、有利な形式である。 実施例３：Listeria Listeria種は、天然に広く存在するグラム陽性桿菌の１群である。この群内で 、L.monocytogenesのみがヒトおよび動物に対して病原性であると考えられる。L .monocytogenesは、髄膜炎(meningitis)、流産(abortion)、脳炎(encephalitis) および敗血症(septicemia)を起こすリステリア症の原因である。免疫不全の個体 、新生児および妊婦は、この食品が原因の疾患に対する高リスク群である。多く の場合動物由来の食物、特にソフトチーズの消費により引き起こされる。したが って、L.monocytogenesの存在は食物から排除されるべきである。安全性の測定 として、幾つかの国では、食品中に全てのListeria種が存在しないことを要求し ている。 日常食品中のL.monocytogenesの古典的な同定方法は、４８時間の富化培養お よびこれに続く選択的寒天培地で４８時間のコロニー形成、次いで生物化学およ び形態学的アッセイの全部を含む（Farber and Peterkin，1991）。この方法は 、遺伝子プローブの使用により非常に単純化することができた。 L.monocytogenesの同定について、幾つかのＤＮＡプローブが既に報告されて いる。この生物の病原性を担う遺伝子（例えば、リステリオリシン（listerioly sin）Ｏ遺伝子（Datta et al.,1993）または侵襲関連タンパク質（invasion-ass ociated-protein：ｉａｐ）（Bubert et al.,1992））から幾つかのプローブが 誘導されている。 特異的１６Ｓ ｒＲＮＡプローブに基づく市販の同定システムが、GenProbe（H erman and De Ridder，1993；Ninet et al.,1992）により紹介された。 これらの特異的なプローブは、富化および選択的寒天培地への塗布後得 られたコロニーに、確認アッセイとして使用される。 最近幾つかの刊行物が、ＤＮＡプローブの標的領域を増幅するためのポリメラ ーゼ連鎖反応の使用を報告しているが、これらにより、アッセイの特異性および 感度を妨害することなく、アッセイ時間を短縮することができる。L.monocytoge nes ＤＮＡを特異的に増幅することができる、異なるプライマーセットが報告さ れている。これらのプライマーセットは、リステリオリシンＯ遺伝子（Golstein Thomas et al.,1991）、およびｉａｐ遺伝子（Jaton et al.,1992）から誘導さ れた。 本発明者らは、Listeriaの属特異的プローブおよびListeria monocytogenesに 特異的なプローブの開発の標的として１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子スペーサ ー領域を使用した。 １６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端および２３Ｓ ｒＲＮＡの５’末端から誘導された 保存プライマー（配列は実施例１で作成した）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反 応を使用してスペーサー領域を増幅し、次に実施例３と同じ方法により適切なプ ラスミドベクターにクローン化した。 長さの異なる２つのアンプリコン（８００bpおよび１１００bp）を得た。両方 のＰＣＲフラグメントを以下のListeria種についてクローン化した： −Listeria monocytogenes（serovar）4b、IHE（Instituut voor −Listeria ivanovii ＣＩＰ 78.42（Collection Nationale de Cultures de Microorganisms de l'Institut Pasteur, France） −Listeria seeligeri 血清型 4a，nr．42.68(Bacteriologisches Milchwirtschaft Weihenstephan, Germany)。 １６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の配列は、８００b pのＰＣＲフラグメントに由来するクローン化された材料を使用して決定され、 これは、３つの記載されたListeria種に関して行われた。図４１〜４３は、得ら れた異なる短いスペーサー領域の配列を示す。L.monocytogenesのこの短いスペ ーサー領域の配列はまた、ＥＭＢＬデータバンクからも検索された（ＬＭＲＧＳ ＰＣＲ）。 この配列情報に基づき、種特異的検出のための以下のオリゴヌクレオチドを選 択して化学合成した： また、Listeriaに対する属特異的プローブを設計した： このオリゴヌクレオチドプローブをメンブランストリップに固定化して、ビオチ ン化ＰＣＲフラグメントによるリバースハイブリダイゼーション後、沈降反応を 用いてハイブリッドを可視化した。異なるListeria種のハイブリダイゼーション 結果を表５に要約する。 これらのハイブリダイゼーション結果は、ＬＩＳ１プローブが全ての記載され たListeria種を検出することができるが、また種特異的なプローブは、相互に交 差ハイブリダイズすることをも示している。このため、この短いスペーサー領域 からは十分な特異性を有するプローブは見い出しえなかった。 Listeria monocytogenesに関して、１１００bpフラグメントに由来する１６Ｓ −２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子スペーサーも配列決定した。図４５は、この種で得ら れた配列を示している。この配列情報はまた、L.seeligeri（図４６参照）につ いても得られ、大きなスペーサー領域の部分配列情報は、L.ivanovii（図４４参 照）についても得られた。 L.seeligeriでの配列の整合性に基づき、L.monocytogenesを特異的に検出する ため以下のオリゴヌクレオチドプローブを選択した。 最初のハイブリダイゼーション結果（示していない）は、他のListeria種との 交差ハイブリダイゼーションがこのL.monocytogenesプローブＬＭＯ３では見ら れなかったこと、および使用した全てのListeria株が、一般的なプローブＬＩＳ １にハイブリダイズしたことを示した。 オリゴヌクレオチドプローブ（全てのListeria種の検出のためのＬＩＳ１、お よびL.monocytogenesの特異的な検出のためのＬＭＯ３）はメンブランストリッ プに固定化して、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域を含有する、異なる 生物から誘導された標識アンプリコンにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ 結果は、下記の表に示される。 各々種および属レベルでＬＭＯ３およびＬＩＳ１プローブについて、優れた特 異性および感度が得られた。 これら２つのプローブは、食品試料で直接、または液体ブロス中で試料の富化 後、Listeria種およびL.monocytogenesの検出に使用することができる。どちら の場合も、これらの試料中の非常に高いバックグラウンドの微生物叢により保存 プライマーセットについての増幅の問題が発生しうる。 この問題を回避するために、本発明者らはListeria種の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲ ＮＡスペーサー領域から誘導される数セットのプライマーを設計した。 プライマーＬＩＳ−Ｐ１およびＬＩＳ−Ｐ２は、上流プライマーであり、一方 ＬＩＳ−Ｐ３およびＬＩＳ−Ｐ４は、下流プライマーである。これらのプライマ ーセットは、小さい１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、およびListeria 種（L.grayiおよびL.murrayiを除く）の大きなスペーサーを増幅する。必要であ れば、これらのプライマーは、ＬＩＳ−Ｐ１／ＬＩＳ−Ｐ４が外部プライマーで あり、そしてＬＩＳ−Ｐ２／ＬＩＳ−Ｐ３が内部プライマーである、ネステッド ＰＣＲアッセイに使用することができる。 Listeria monocytogenesの特異的検出のために、ＬＭＯ−ＩＣＧ−３プローブ を設計して、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡの大きなスペーサー領域から誘導した。 試料中でのこの病原体の改良された直接検出用にこの大きいスペーサー領域のみ を特異的に増幅するため、小さいｒＲＮＡスペーサーには存在しない１６Ｓ−２ ３Ｓ ｒＲＮＡの大きなスペーサー領域からの配列情報の一部から、１セットの プライマーを誘導した。この目的のため、プライマーＬＩＳ−Ｐ５およびＬＩＳ −Ｐ６を上流プライマーとして使用し、ＬＩＳ−Ｐ７を下流プライマーとして使 用する。 Listeria spp.に対するプローブの評価において、古典的な測定方法ではListe ria に類似しているある生物をチーズから単離した。この単離体（ＭＢ４０５） は、以下の特徴を示した（Listeria spp.に類似）：グラム陽性、オックスフォ ードおよびトリプチックソイ寒天（Tryptic Soy Agar）上で増殖、カタラーゼ陽 性。Listeria spp.との唯一の違いは、運動性が陰性であることであった。 この単離体ＭＢ４０５の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域を増幅する ために、実施例１に記載した保存プライマーを使用して、この株でListeria spp .と同じアンプリコンパターンが得られた。このアンプリコンのハイブリダイゼ ーションでは、Listeria spp.に対するどのプローブでもシグナルは得られない ことを示した。 単離体ＭＢ４０５の１６Ｓ ｒＲＮＡの配列決定およびその後のListeria spp. および類似体との比較により、この生物は、現在までに文献に記載された他のど の種よりもListeria spp.により近縁であることが示された。分類学的検討を行 えば、この単離体がListeria属に属するが否かが判るであろう。この単離体、お よび同じタイプから続いて単離された生物は、本出願においてはListeria様生物 と呼ばれる。 単離体ＭＢ４０５は、クローン化され配列決定された少なくとも３つの異なる １６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域を含有するようであった。Listeria spp.との整合により、Listeria様株を特異的に検出するためのオリゴ ヌクレオチドプローブを選択した： このプローブとListeria spp.の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域とのリ バースハイブリダイゼーション反応では、交差ハイブリダイゼーションは見られ ないことを示した。実施例４：Chlamydia trachomatis Chlamydia trachomatisは、小さな偏性細胞内グラム陰性細菌であり、主要外 膜タンパク質（major outer membrane protein）（ＭＯＭＰ）により識別される １５の血清型（Ａ〜Ｋ、Ｂａ、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）を有し、細胞内増殖に必 要な潜在プラスミドを含有する。Ａ〜ＫおよびＢａ血清型は、トラコーマの生理 学的性状型（biovar）を構成し、一方Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３血清型は、ＬＧＶ の生理学的性状型を構成する。 Ａ、Ｂ、Ｂａ、およびＣ血清型は、通常トラコーマに関連しており、予防可能 な盲目を世界中に引き起こす。Ｄ〜Ｋの血清型は、主に性行為感染症で見い出さ れ、女性の子宮頚管炎および骨盤内炎症性疾患、並びに男性の尿道炎および精巣 上体炎の主要な原因である。Ｌ１、Ｌ２およびＬ３血清型は、稀な性行為感染症 である性病性リンパ肉芽腫に関係している。 細胞培養は、臨床検査診断のための基準法と見做されるが、輸送中検体の生存 力を維持することは難しく、検査法には時間がかかり技術が要求される。したが って、固相酵素免疫測定法（enzyme-linkedimmunosorbent assay）および直接蛍 光抗体染色のような、多くのより迅速な試験キットが開発された。しかし、これ らの免疫測定法のいずれもが、高レベルの感度または特異性を有することが証明 されていない。 クラミジアのｒＲＮＡを検出する非アイソトープ性ＤＮＡプローブアッ セイ（Gen-Probe PACE；Woods et al.,1990）が市販されている。最近、ポリメ ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法がChlamydia感染の検出に使用されるようになった 。検出は、潜在プラスミド（Loeffelholz et al.,1992）、または主要外膜タン パク質をコードするomp1 遺伝子（Taylor-Robinson et al.,1992）のいずれかを 標的とした。他の方法に比較して、ＰＣＲは感度および特異性が高い（Ossewaar de et al.,1992）。これらのアッセイのいずれもが、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ 遺伝子スペーサー領域がら誘導されるＤＮＡプローブを利用していない。 Chlamydia trachomatis L2 およびChlamydia psittaci 6BC株について、保存 プライマー（実施例１参照）を使用して１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領 域を含有するリボソームＲＮＡシストロンの一部を増幅して、次にプラスミドベ クターにクローン化した。ジデオキシ鎖停止化学法を用いて、この１６Ｓ−２３ Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域を配列決定した。 両方のChlamydia種のスペーサー領域の配列を図４７〜４８に示す。 この配列情報に基づき、以下のオリゴヌクレオチドプローブを化学合成した： オリゴヌクレオチドプローブをメンブランストリップ上に線状に固定化して、 次に標的として、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域を含有する、ビオチ ン化ＰＣＲ産物による、リバースハイブリダイゼーションアッセイに使用した。 ハイブリダイゼーションは、５０℃の温度で３×ＳＳＣおよび２０％ホルムア ミド（ＦＡ）の溶液中で行った。 異なるプローブによるハイブリダイゼーション結果を以下の表に示す。 表に示すように、５０℃のハイブリダイゼーション温度ではＣＨＴＲ１、ＣＨ ＴＲ２およびＣＨＴＲ３プローブは、Chlamydia trachomatisに特異的であり、 ＣＨＰＳ１プローブは、Chlamydia psittaciに特異的である。 従来法を使用してChlamydia trachomatisとして同定した、SSDZ，Delft，Neth erlandsから入手した幾つかの臨床単離体を、異なるオリゴヌクレオチドプロー ブによりリバースハイブリダイゼーションアッセイで試験した。全てのChlamydi a trachomatis特異的プローブは、陽性のハイブリダイゼーションシグナルを与 え、単離体のいずれもが、Chlamydia psittaciプローブとは反応しなかった。幾 つかの臨床単離体については、ＣＨＴＲ２プローブは、ＣＨＴＲ１またはＣＨＴ Ｒ３に比べて著しく弱く反応した。これらの単離体の１つ（94 M 1961）のスペ ーサー領域を配列決定して（SEQ ID NO 197）、配列にはＬ２株のスペーサー配 列とは１つのミスマッチがあることが判った。追加のプローブ（ＣＨＴＲ４）は 、 この新規なスペーサー配列から誘導した： このプローブは、Chlamydia trachomatisからの幾つかの臨床単離体と、ＣＨＴ Ｒ２よりも強いハイブリダイゼーションシグナルを与える。これは、単独が、ま たはＣＨＴＲ２プローブとの組合せで使用することができる（例えば、両方のプ ローブを１つのＬｉＰＡラインに適用する）。 臨床検体中のChlamydia trachomatisの直接検出用の非常に高感度のアッセイ を開発するために、Chlamydia種のスペーサー領域を特異的に増幅する、特異的 なプライマーセット、ＣＨＴＲ−Ｐ１（上流プライマー）およびＣＨＴＲ−Ｐ２ （下流プライマー）、を１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域から誘導した 。 実施例６：Mycoplasma pneumoniaeおよびMycoplasma genitalium マイコプラズマは、無細胞培地で増殖し、細胞壁を欠いており、そしてＧ＋Ｃ 含量の低い非常に小さいゲノムを有する、最も小さな原核生物の群である。１０ ０以上の異なる種が、ヒト、動物、植物、および昆虫から単離されている。 ヒトでは、マイコプラズマは、病原性生物または共生生物のいずれかとして認 識されている。最もよく知られた病原体は、特に小児および青少年の、原発性非 定型肺炎の原因である、Mycoplasma pneumoniaeである。M.pneumoniaeの診断は 、培養法による直接単離または患者血清中のM.pneumoniaeに対する特異的抗体の 検出に基づいていた。 最初に非淋菌性尿道炎の患者からの尿道検体から単離された別の病原体は、M.genitalium として報告された。このマイコプラズマは、M .pneumoniaeと共通の幾つかの性質を有する。両種とも病原性であり、両者とも 赤血球、種々の組織細胞、ガラス、およびプラスチック表面に付着する能力を有 する。更には、M.genitaliumおよびM.pneumoniaeは、抗原を共有するため、血清 試験において広範囲の交差反応を起こす。M.genitaliumは肺炎の患者からの気道 試料にも見い出され、M.pneumoniaeとの混合物から単離されたという観察は、M.genitalium の病原性の可能性に疑問を投げかけている。 両方の種の培養は時間がかかり、血清検査は特異性が低いため、これらマイコ プラズマを同定するため、より迅速で特異的なアッセイが開発された。ＤＮＡプ ローブによるハイブリダイゼーションアッセイの使用は、これらの種について報 告されたが、良好な特異性にもかかわらず、これらの試験では、低レベルのM.pn eumoniae またはM.genitaliumを検出できない。このため更に最近になって、ポリ メラーゼ連鎖反応を使用するＤＮＡハイブリダイゼーション法が開発された。Ｐ １アドヘシン（adhesin）遺伝子（Buck et al.,1992）および１６Ｓ ｒＲＮＡ遺 伝子（Kuppeveld et al.,1992）を用いるM.pneumoniae特異的ＰＣＲアッセイが 報告された。アドヘシン遺伝子および１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子からの配列を用い る、M.genitalium用の特異的ＰＣＲアッセイが報告された。 M.pneumoniae およびM.genitalium の臨床単離体（U. 列を決定した。これらを図４９〜５０に示す。この配列は、ＥＭＢＬデータバン クに寄託された同じ種の他の株（各々ＭＰＭＡＣおよびＭＧＧ３７）由来の配列 とは多少異なっている。この情報に基づき、４つのプローブを誘導した：１つの 一般的なマイコプラズマプローブ、２つのM.pneumoniae特異的プローブ、および １つのM.genitalium特異的プ ローブ： プローブをＬｉＰＡストリップに適用して、４つのM.pneumoniae株、１つのM.genitalium 株および２２の非Mycoplasma種の株からの増幅したスペーサー材料に 標準的条件（３×ＳＳＣ、２０％ホルムアミド、５０℃）下でハイブリダイズさ せた。一般的なプローブは、試験した５つのMycoplasma株にのみハイブリダイズ し、一方特異的プローブは、そのためにそれが設計された種の株にのみハイブリ ダイズした。実施例７：他のマイコバクテリア種 検査技術の着実な進歩により、いわゆる「潜在的に病原性の環境的マイコバク テリア」の分類学および臨床的な意味に関する情報が急速に増加した。新たに認 識された疾患の出現により、異なるマイコバクテリア種に関連したさらなる症状 が現われ、重要性を帯びてきた。 実施例２に記載されるような、異なるマイコバクテリア種の同時検出用にＬｉ ＰＡ試験を拡大するため、以下の種を特異的に同定するよう新規なセットのＤＮ Ａプローブを設計した：Mycobacterium ulcerans、Mycobacterium genavense、M ycobacterium xenopi、Mycobacterium simiae、Mycobacterium fortuitum、Myco bacterium malmoense、Mycobacterium celatumおよびMycobacterium haemophilu m 。 これらのプローブは、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域配列から誘導 した。上述の種について、ＰＣＲ産物の直接配列決定により、またはＰＣＲ増幅 スペーサー領域のクローニング後、この情報を得た。得られ た配列を図８０〜９７に、およびM.malmoenseについては図３８に示す。 上述のマイコバクテリア種のスペーサー領域の配列を、実施例２または公衆に 利用可能な供給源に既に記載された配列と比較して整合をとった。多様な領域か ら、種特異的なＤＮＡプローブを設計した。実施例２で言及した他のマイコバク テリアプローブについて明記したのと同じ条件（即ち、３×ＳＳＣ、２０％脱イ オン化ホルムアミド、５０℃）下で所望のハイブリダイゼーション特性（即ち、 種特異的なハイブリダイゼーション）が得られるように、プローブを選択して設 計した。これは、少なくとも２つの（可能であれば全ての）本発明に記載された マイコバクテリア種の同時検出を可能にする。 以下のオリゴヌクレオチドプローブは、各々M.ulcerans、M.genavense、M.xen opi 、M.simiae、M.fortuitum、M.malmoense、M.celatumおよびM.haemophilumの スペーサー領域配列から設計した： プローブをＬｉＰＡストリップに固定化して、実施例２に記載された１セット の代表的なマイコバクテリア種から誘導した増幅したビオチン化物質とハイブリ ダイズさせた。スペーサー領域の増幅は、実施例２に記載 されたプライマーセットを使用してＰＣＲにより行った。特異性試験に使用した 異なる株を、得られたハイブリダイゼーション結果と共に表８に示す。この菌株 は、Institute for Tropical Medecine，Antwerp，Belgiumのコレクションから 入手した。 試験したプローブ（ＭＳＩ−ＩＣＧ１、ＭＸＥ−ＩＣＧ−１、ＭＦＯ−ＩＣＧ −１、ＭＦＯ−ＩＣＧ−２、ＭＭＬ−ＩＣＧ−１、ＭＭＬ−ＩＣＧ−２、ＭＣＥ −ＩＣＧ−１およびＭＨＰ−ＩＣＧ−１）は、各々M.simiae、M.xenopi、M.fort uitum 、M.malmoense、M.celatumおよびM.haemophilumを特異的に検出し、試験し た他のマイコバクテリア種とは交差ハイブリダイゼーションを示さなかった。し たがって、これらのプローブは、実施例２で記載されたＤＮＡプローブのセット を使用して更に同定できなかった、マイコバクテリア種の特異的な検出を可能に する。M.malmoenseは、実施例２では「ＭＩＣ４」型として分類されたが、上述 の他の種は、Mycobacterium属に対する一般的なプローブＭＹＣ１／ＭＹＣ２２ にのみハイブリダイズしたため、実施例２では「他のマイコバクテリア種」とし て分類された。 全ての試験したM.genavense単離体は、ＭＧＶ−ＩＣＧ１およびＭＧＶ−ＩＣ Ｇ２と反応したが、M.genavenseに非常に近縁のM.simiae用に設計されたＭＳＩ −ＩＣＧ１とは反応しなかった。M.simiaeとM.genavenseの間に位置する１群の 「中間体」生物を、Institute of Tropical Medecine，Antwerp，Belgiumから受 け取ったが、これらは「M.simiae様」として分類されていた（４３５８、４８２ ４、４８３３、４８４４、４８４９、４８５７、４８５９、７３７５、７３７９ 、７７３０、９７４５、９４−１２２８株）。これらの株は、ＭＧＶ−ＩＣＧ２ プローブとのみ反応し、狭義のMycobacterium simiae株を特 異的に検出するＭＳＩ−ＩＣＧ１プローブとは反応しなかった。これら２つの「M .simiae様」単離体（７３７９および９７４５株）の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ スペーサー領域の配列決定（SEQ ID NO １６１および１６２参照）により、これ らがM.simiaeよりもM.genavenseと近縁であることを確認した。おそらく新種に 属する、この群の生物を特異的に検出するように、新規プローブＭＧＶ−ＩＣＧ ３を設計した。 このことは、１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域から誘導したＤＮＡプローブの使 用が、古典的な分類学上の基準により決定できない異なる群の株を識別するのに 役立つことを再度示している。これらのＤＮＡプローブの使用は、恐らくマイコ バクテリアの新規な（亜）種の記載にいたるであろう。この場合、ＭＧＶ−１プ ローブは、狭義のM.genavense株にのみ反応し、ＭＧＶ−３プローブは、中間体 の「M.simiae様」株にのみ反応し、そしてＭＧＶ−２プローブは、両方の型の株 を検出するであろう。 ＭＵＬ−ＩＣＧ−１プローブは、試験した全てのM.ulcerans株と反応したが、M .marinum株ＩＴＧ７７３２とも交差ハイブリダイゼーションを示した。このM.m arinum 株のスペーサー領域の配列決定により、実際M.ulcerans株１８３７の配列 と同一配列であることを明らかにした（図８０参照）。M.marinumおよびM.ulcer ans 間のさらなる識別は、M.ulceransの１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子（これの一部は 増幅のためにＭＹＣ Ｐ１〜Ｐ５プライマーを使用する時スペーサー領域と共に 同時増幅される）からのプローブを使用して行うことができる。マイコバクテリ ア種の識別のためのスペーサープローブと同じハイブリダイゼーション条件下で 作用可能な、M.ulceransの種特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡプローブは、例えば以下 のものである： 上記段落は、スペーサー領域から誘導したプローブを使用することが好適であ るが、このスペーサープローブを他の遺伝子配列（例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝 子）から誘導したプローブと合わせることも可能であり、そして時には必要であ ることを示している。ここで再度、これらの追加のプローブは、スペーサープロ ーブと同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で所望のハイブリダイゼー ション特性を示すように選択される。 M.kansasiiについて、実施例２で述べたものに追加の株を、実施例２で記載さ れるＭＫＡ−ＩＣＧ−１、２、３および４プローブで試験した。これらのプロー ブのいずれも完全に満足のいくものではなかったため、M.kansasiiの検出のため に追加のプローブを設計した。このために、追加のM.kansasii株ＩＴＧ６３２８ 、８６９８および８９７３の幾つかのスペーサー領域を配列決定した（図９０〜 ９２参照）。これらの株も、Institute of Tropical Medecine，Antwerp，Belgi umから入手した。明らかに、M.kansasii株は、異なる株とはスペーサー配列に著 しい違いを有する、全くの異種の群を構成する。前述のものと同じ条件（即ち、 ３×ＳＳＣ、２０％脱イオン化ホルムアミド、５０℃）下で全て再度ハイブリダ イズする、追加のプローブＭＫＡ−ＩＣＧ−５、６、７、８、９および１０を設 計した。Institute of Tropical Medecine，Antwerp，Belgiumから入手した試験 株のコレクションによりプローブを試験して、結果は表８に示す。 試験した限りではM.kansasiiプローブのいずれもが、M.kansasii以外の種とは ハイブリダイズしない。しかし、この種の異種性により、M.kansasiiプローブの いずれもが、全てのM.kansasii株とはハイブリダイズしない。異なるM.kansasii プローブは、M.kansasiiの異なる株 を認識する。この識別ハイブリダイゼーションは、臨床的重要性を有する。他方 では、全てのM.kansasii株の検出が必要であるならば、異なるM.kansasiiプロー ブの組合せを考えることができる。 実施例８：Brucella ブルセラ症は、非常に広範囲で経済的に重要な、ヒトにも感染する動物原性感 染症である。 Brucella spp.の同定のためには、主に細菌学的および免疫学的検出法が使用 されている。これらの試験は、時間がかかり、しばしば偽陽性の結果を与える。 主にＤＮＡ増幅およびハイブリダイゼーションに基づく、迅速で信頼性の高い同 定法が開発されている。 ４３kDaの外膜タンパク質（Fekete A．et al.,1990）または１６Ｓ ｒＲＮＡ 遺伝子の一部（Herman and De Ridder,1992）の増幅に基づくBrucella spp.の特 異的な検出法が既に報告されている。 Brucella spp.の検出のための特異的ＤＮＡプローブおよびプライマーを開発 するために、本発明者らは、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子スペーサー領域を 解析した。保存プライマー（配列は実施例１に与えられる）を使用して、スペー サー領域を増幅し、次に実施例１と同じ方法によりBluescriptSK＋ベクター中に クローン化した。 長さ約１４００bpの得られたアンプリコンを以下のBrucella種についてクロー ン化した： 構築物をＨｉｎｄIII消化し、次に得られたフラグメント（ｎ＝３）をサブクロ ーニングして、３つの記載されたBrucella spp.についてのスペーサー領域の配 列決定を行った。図５６、５７および７９は、各々Brucella melitensis、Bruce lla suisおよびBrucella abortusの上述の株について得られたスペーサー領域の 配列を表す。異なるBrucella 種間のこれらのスペーサー領域配列の高い相同性により、この配列情報から種特 異的なＤＮＡプローブを導きだすことはできず、属特異的なプローブのみを設計 した。 この目的で、以下のプローブを化学合成した： このオリゴヌクレオチドをメンブランストリップに固定化して、ビオチン化ＰＣ Ｒフラグメントによるリバースハイブリダイゼーション後、沈降反応を用いてハ イブリッドを可視化した。異なるBrucella spp.および近縁の生物による固定化 プローブのハイブリダイゼーション結果を表９に表す。 これらのハイブリダイゼーション結果は、プローブＢＲＵ−ＩＣＧ２、ＢＲＵ −ＩＣＧ３およびＢＲＵ−ＩＣＧ４がBrucella spp.に特異的であり、これらの 病原体の検出のためのリバースハイブリダイゼーションアッセイに使用すること ができることを示している。プローブＢＲＵ−ＩＣＧ１は、２つの分類学的に非 常に近縁の生物であるが、Brucella検出のために使用される同じ試料物質中に存 在するとは予想されていない、Ochrobactrum antropiおよびRhizobium loti株と 交差ハイブリダイズする。 前記実施例（例えば３および４）に記載されたように、Brucella株からのスペ ーサー領域を特異的に増幅するために１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域 からBrucella特異的プライマーをも選択した。 上流プライマーとしてＢＲＵ−Ｐ１およびＢＲＵ−Ｐ２を使用し、下流 プライマーとしてＢＲＵ−Ｐ３およびＢＲＵ−Ｐ４を使用する。ネステッドＰＣ Ｒアッセイに使用する時には、ＢＲＵ−Ｐ１／ＢＲＵ−４の組合せが外部プライ マーセットであり、一方ＢＲＵ−Ｐ２／ＢＲＵ−Ｐ３の組合せが内部プライマー セットである。 実施例９：Staphylococcus aureus Staphylococcus aureusは、ヒトおよび動物の感染に最も普通に関連している スタフィロコッカス種である。Staphylococcus aureus株は、市中感染および院 内感染の両方での重要な病因として同定されている。最近メチシリン耐性黄色ブ ドウ球菌（methicillin-resistant S.aureus：ＭＲＳＡ）による院内感染は、多 くの国において益々流行してきたようである。この種に属する株はまた、食品損 傷および中毒の原因である。 他のスタフィロコッカスからS.aureus株を迅速で特異的な方法で識別するため に、ＤＮＡプローブおよび／またはＰＣＲに基づく分子的手法の使用が既に文献 に記載されている。これらのＤＮＡに基づくアッセイの開発に使用される標的遺 伝子の例には、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（De Buyser et al.,1992; Geha et al., 1994）、mecA遺伝子（Ubukata et al.,1992; Shimaoka et al.,1994）およびnuc 遺伝子（Brakstad et al.,1992; Chesneau et al.,1993）がある。 特異的ＤＮＡプローブの開発の標的として、本発明者らは１６Ｓ−２３Ｓ ｒ ＲＮＡ遺伝子スペーサー領域を選択した。１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子 から誘導した保存プライマー（配列は実施例１参照）を使用して増幅すると、得 られるパターンは、試験した全てのS.aureus株で類似ではなかった。得られたフ ラグメントの数およびこれらの異なるフラグメントのサイズに、多くの変動が見 られた。 ＵＺＧ５７２８株からの１つのスペーサー領域およびＵＺＧ６２８９株からの ４つのスペーサー領域（長さが異なる）を、BluescriptSK＋ベクター中にクロー ン化して、次に配列決定した。配列を図６４〜図６８に表す（SEQ ID NO １３９ 〜SEQ ID NO １４３）。特異的なＤＮＡプロー ブの開発のために、これらの異なるスペーサー領域を相互に、およびStaphyloco ccus epidermidis ＵＺＧ ＣＮＳ４１株から誘導したスペーサー領域（SEQ ID N O １４４）と比較した。 以下のプローブを化学合成した： このオリゴヌクレオチドをメンブランストリップに固定化して、ビオチン化Ｐ ＣＲフラグメントによるリバースハイブリダイゼーション後、比色沈降反応を用 いてハイブリッドを可視化した。 異なるStaphylococcus spp.および非スタフィロコッカス生物との固定化プロ ーブのハイブリダイゼーション結果を表１０に表す。 これらのハイブリダイゼーション結果は、ＳＴＡＵ−ＩＣＧ３およびＳＴＡＵ −ＩＣＧ４プローブのみが、Staphylococcus aureus株に特異的であることを示 している。ＳＴＡＵ−ＩＣＧ１プローブは、試験した全てのStaphylococcus spp .と反応し、ＳＴＡＵ−ＩＣＧ２プローブは、S.lugdinensis株と交差ハイブリダ イズする。ＳＴＡＵ−ＩＣＧ３プローブもＳＴＡＵ−ＩＣＧ４プローブも、試験 した全てのS.aureusは検出しないが、両方のプローブをＬｉＰＡアッセイで同時 に使用すると、試験した全てのS.aureus株がこれらのプローブの１つまたは両方 とハイブリダイズする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:44） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:35） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:32） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ファン・ヘーフェルスウィン，ヒューゴ ベルギー国、ベー−9270 カルケン、コル マンストラート 80

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サンプル中の少なくとも１つの微生物の検出および同定のための、若しくは 数個の微生物の同時検出のための方法であって、以下の工程： (i)必要なら、サンプル中で検出されるべき微生物からポリ核酸を放出させ、単 離および／または濃縮する工程； (ii)必要なら、検出されるべき微生物由来の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサ ー領域若しくはその一部を、少なくとも１つの適切なプライマー対を用いて増幅 する工程； (iii)工程(i)若しくは(ii)のポリ核酸を少なくとも２つのプローブを含むプロー ブのセットと、同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、ハイブリダイ ズさせる工程、ここで、該プローブは表１ａの配列若しくはその等価物から選択 されるか、および／または図１〜１０３に示した任意のスペーサー配列から誘導 された分類群特異的プローブから選択され、該分類群特異的プローブは、表１ａ の少なくとも１つのプローブと同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で ハイブリダイズし得るように選択される； (iv)工程(iii)で形成されたハイブリッドを検出する工程； (v)工程(iv)で得られた特徴的なハイブリダイゼーションシグナルからサンプル 中に存在する微生物を同定する工程、 を包含する方法。 ２．前記サンプルが、気道を起源とするものであり、そして工程(iii)で定義さ れたプローブのセットが以下のスペーサープローブ そして、より好ましくは以下のスペーサープローブ： から選択される少なくとも１つのプローブ若しくは該プローブの等価物を含むか 、 および／または、該プローブのセットは、該サンプル中の検出されるべき微生物 の１つに対応するスペーサー領域配列から誘導された少なくとも１つの分類群特 異的プローブを含み、該スペーサー領域配列はSEQ ID NO７６〜１０６、１５７ 〜１７４、１２４、１２５、１１１〜１１５、１３９〜１４４、若しくは１２６ 〜１３０によって示される任意の配列から選択され、 そして、該プローブ若しくは等価物は以下の生物：Haemophilusinfluenzae、Str eptococcus pneumoniae、Moraxella catarrhalis、若しくはBordetella pertuss is の少なくとも１つを検出する任意のプローブと組み合わせて用いてもよい、請 求項１に記載の方法。 ３．前記サンプルが、脳脊髄液から入手したサンプルであり、そして、工程(iii )で記載されたプローブのセットが以下のスペーサープローブ そして、より好ましくは以下のスペーサープローブ： から選択される少なくとも１つのプローブ若しくは該プローブの等価物を含むか 、 および／または、該プローブのセットは、該サンプル中の検出されるべき微生物 の１つに対応するスペーサー領域配列から誘導された少なくとも１つの分類群特 異的プローブを含み、該スペーサー領域配列はSEQ ID NO１１６、１１８〜１２ １、若しくは２１３〜２１５によって示される任意の配列から選択され、 そして、該プローブ若しくは等価物は以下の生物：Neisseria meningitidis、Ha emophilus influenzae若しくはStreptococcus pneumoniaeの少なくとも１つを検 出する任意のプローブと組み合わせて用いてもよい、請求項１に記載の方法。 ４．前記サンプルが、尿生殖器管を起源とするものであり、そして、工程(iii) で記載されたプローブのセットが以下のスペーサープローブ から選択される少なくとも１つのプローブ若しくは該プローブの等価物を含むか 、 および／または、該プローブのセットは、該サンプル中の検出されるべき微生物 の１つに対応するスペーサー領域配列から誘導された少なくとも１つの分類群特 異的プローブを含み、該スペーサー領域配列はSEQ ID NO１２２、１２３、１９ ７、１２４若しくは１２５によって示される任意の配列から選択され、 該プローブ若しくは等価物は以下の生物：Neisseria gonorrhoeae、Haemophilus ducreyi若しくはStreptococcus agalactiaeの少なくとも１つを検出する任意の プローブと組み合わせて用いてもよい、請求項１に記載の方法。 ５．前記サンプルが、食物を起源とするものであり、そして、工程(iii)で 定義されたプローブのセットが以下のスペーサープローブ そして、より好ましくは以下のスペーサープローブ： から選択される少なくとも１つのプローブ若しくは該プローブの等価物を含むが 、 および／または、該プローブのセットは、該サンプル中の検出されるべき微生物 の１つに対応するスペーサー領域配列から誘導された少なくとも１つの分類群特 異的プローブを含み、該スペーサー領域配列はSEQ ID NO１１６、１１８〜１２ １、２１３〜２１５、１３９〜１４４、１３１、１３２、１５４、１３３〜１３ ８、１９５若しくは１９６によって示される任意の配列から選択され、 該プローブ若しくは等価物は、Campylobacter種の株を検出する任意のプローブ と組み合わせて用いてもよい、請求項１に記載の方法。 ６．前記サンプルが、患者の胃腸管を起源とするものであり、そして、工程(iii )で定義されたプローブのセットが以下のスペーサープローブ そして、より好ましくは以下のスペーサープローブ： から選択される少なくとも１つのプローブ若しくは該プローブの等価物を含むか 、 および／または、該プローブのセットは、該サンプル中の検出されるべき 微生物の１つに対応するスペーサー領域配列から誘導された少なくとも１つの分 類群特異的プローブを含み、該スペーサー領域配列はSEQ ID NO１３３〜１３８ 若しくは１９５〜１９６によって示される任意の配列から選択され、 該プローブ若しくは等価物は、Campylobacter種を検出する任意のプローブと組 み合わせて用いてもよい、請求項１に記載の方法。 ７．サンプル中の１以上のMycobacterium種および亜種を検出しそして同定する 方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： そして、より好ましくは、以下の制限されたグループのスペーサープローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO７６〜１１０若しくは１５７〜１７４から誘導され る任意のプローブであって、Mycobacterim種と特異的にハイブリダイズするプロ ーブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１に記載の方法。 ８．サンプル中の１以上のMycobacterium tuberculosis複合体株を検出しそして 同定する方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO７６から誘導される任意のプローブであって、M.tub erculosis 複合体株と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハ イブリダイズさせる工程を包含する、請求項７に記載の方法。 ９．ＭＡＩＳ複合体由来の１以上のMycobacterium株を検出しそして同定する方 法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO７７〜１００若しくは１０８〜１１０から誘導され る任意のプローブであって、ＭＡＩＳ複合体由来の株と特異的にハイブリダイズ するプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項７に記載の方法 。 １０．サンプル中の１以上のM.aviumおよびM.paratuberculosis株を検出しそし て同定する方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO７７および７８から誘導される任意のプローブであ って、M.avium若しくはM.paratuberculosisと特異的にハイブリダイズするプロ ーブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項９に記載の方法。 １１．サンプル中の１以上のMycobacterium inracellulare株およびＭＩＣ株を 検出しそして同定する方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６ 、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８ 、若しくは９９から誘導される任意のプローブであって、M.inracellulare株お よびＭＩＣ株と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる 工程を包含する、請求項９に記載の方法。 １２．サンプル中の１以上のMycobacterium intracellulare株を検出しそして同 定する方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： 若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO８９から誘導される任意のプローブであって、M.inr acellulare 株と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる 工程を包含する、請求項９に記載の方法。 １３．サンプル中の１以上のMycobacterium scrofulaceum株を検出しそして同定 する方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： 若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１００から誘導される任意のプローブであって、M.s crofulaceum と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる 工程を包含する、請求項９に記載の方法。 １４．サンプル中の１以上のMycobacterium kansasii株を検出しそして同定する 方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： そして、より好ましくは： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１０１、１６７、１６８若しくは１６９から誘導さ れる任意のプローブであって、M.kansasiiと特異的にハイブリダイズするプロー ブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項７に記載の方法。 １５．サンプル中の１以上のMycobacterium chelonae株を検出しそして同定する 方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１０２、１０３、若しくは１７４から誘導される任 意のプローブであって、M.chelonaeと特異的にハイブリダイズするプローブと、 ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項７に記載の方法。 １６．サンプル中の１以上のMycobacterium gordonae株を検出しそして同定する 方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： そして、より好ましくは： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO １０４、１０５若しくは１０６から誘導される任意 のプローブであって、M.gordonaeと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハ イブリダイズさせる工程を包含する、請求項７に記載の方法。 １７．サンプル中の１以上のMycobacterium ulcerans株若しくはM.marinum株を 検出しそして同定する方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： 少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１５７から誘導される任意のプローブであって、M.u lcerans 若しくはM.marinumと特異的にハイブリダイズするプ ローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項７に記載の方法。 １８．サンプル中の１以上のMycobacterium genavense株を検出しそして同定す る方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： 若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１５８、１５９、１６０、１６１若しくは１６２か ら誘導される任意のプローブであって、M.genavenseと特異的にハイブリダイズ するプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項７に記載の方法 。 １９．サンプル中の１以上のMycobacterium xenopi株を検出しそして同定する方 法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： 若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１６３から誘導される任意のプローブであって、M.x enopi と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を 包含する、請求項７に記載の方法。 ２０．サンプル中の１以上のMycobacterium simiae株を検出しそして同定する方 法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： 若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１６４若しくは１６５から誘導される任意のプロー ブであって、M.simiaeと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイ ズさせる工程を包含する、請求項７に記載の方法。 ２１．サンプル中の１以上のMycobacterium fortuitum株を検出しそして同定す る方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： 若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１６６から誘導される任意のプローブであって、M.f ortuitum と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程 を包含する、請求項７に記載の方法。 ２２．サンプル中の１以上のMycobacterium celatum株を検出しそして同定する 方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： 若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１７０から誘導される任意のプローブであって、M.c elatum と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を 包含する、請求項７に記載の方法。 ２３．サンプル中の１以上のMycobacterium haemophilum株を検出しそして同定 する方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： 若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１７１、１７２若しくは１７３から誘導される任意 のプローブであって、M.haemophilumと特異的にハイブリダイズするプローブと 、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項７に記載の方法。 ２４．サンプル中の１以上のMycobacterium株を検出しそして同定する方法であ って、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、ハイブリダイズさせる工程を 包含する、請求項７に記載の方法。 ２５．サンプル中の１以上のMycoplasma株を検出しそして同定する方法であって 、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１２４若しくは１２５から誘導される任意のプロー ブであって、Mycoplasma種と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリ ダイズさせる工程を包含する、請求項１に記載の方法。 ２６．サンプル中の１以上のMycoplasma pneumoniae株を検出しそして同定する 方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１２５から誘導される任意のプローブであって、Myc oplasma pneumoniaeと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズ させる工程を包含する、請求項２５に記載の方法。 ２７．サンプル中の１以上のMycoplasma genitalium株を検出しそして同定する 方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： 若しくは該プローブの等価物と、 または、SEQ ID NO１２４から誘導される任意のプローブであって、Mycoplasma genitalium と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工 程を包含する、請求項２５に記載の方法。 ２８．サンプル中の１以上のPseudomonas株を検出しそして同定する方法であっ て、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１１１、１１２、１１３、１１４若しくは１１５か ら誘導される任意のプローブであって、Pseudomonas株と特異的にハイブリダイ ズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１に記載の方 法。 ２９．サンプル中の１以上のPseudomonas aeruginosa株を検出しそして同定する 方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： そして、最も好ましくは以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１１１から誘導される任意のプローブであって、Pse udomonas aeruginosaと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイ ズさせる工程を包含する、請求項２８に記載の方法。 ３０．サンプル中の１以上のStaphylococcus種を検出しそして同定する方法であ って、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１３９、１４０、１４１、１４２、１４３若しくは １４４から誘導される任意のプローブであって、Staphylococcus種と特異的にハ イブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１ に記載の方法。 ３１．１以上のStaphylococcus aureus株を検出しそして同定する方法であって 、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ、および好ましくは両方、若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１３９、１４０、１４１、１４２若しくは１４３か ら誘導される任意のプローブであって、Staphylococcus aureusと特異的にハイ ブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項３０ に記載の方法。 ３２．サンプル中の１以上のStaphylococcus epidermidis株を検出しそして同定 する方法であって、ここで、工程(iii)がSEQ ID NO１４４から誘導される任意の プローブであって、Staphylococcus epidermidisと特異的にハイブリダイズする プローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項３０に記載の方法。 ３３．サンプル中の１以上のAcinetobacter株を検出しそして同定する方法であ って、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１２６、１２７、１２８、１２９若しくは１３０か ら誘導される任意のプローブであって、Acinetobacter sp.と特異的にハイブリ ダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１に記載 の方法。 ３４．サンプル中の１以上のAcinetobacter baumanii株を検出しそして同定する 方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１２６から誘導される任意のプローブであって、Aci netobacter baumaniiと特異的にハイブリダイズするプローブ と、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項３３に記載の方法。 ３５．サンプル中の１以上のListeria株を検出しそして同定する方法であって、 ここで、工程(iii)が以下のプローブ： そして、最も好ましくは以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１１６、１１８、１１９、１２０、１２１、２１３ 、２１４若しくは２１５から誘導される任意のプローブであって、Listeria種と 特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する 、請求項１に記載の方法。 ３６．サンプル中の１以上のListeria monocytogenes株を検出しそして同定する 方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： そして、より好ましくは以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１１８若しくは１２０から誘導される任意のプロー ブであって、Listeria monocytogenesと特異的にハイブリダイズするプローブと 、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項３５に記載の方法。 ３７．サンプル中の１以上のBrucella株を検出しそして同定する方法であって、 ここで、工程(iii)が以下のプローブ： そして、最も好ましくは以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１３１、１３２若しくは１５４から誘導される任意 のプローブであって、Brucella株と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハ イブリダイズさせる工程を包含する、請求項１に記載の方法。 ３８．サンプル中の１以上のSalmonella株を検出しそして同定する方法であって 、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： そして、最も好ましくは以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１３３、１３４、１３５、１３６、１３７若しくは １３８から誘導される任意のプローブであって、Salmonella株と特異的にハイブ リダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１に記 載の方法。 ３９．サンプル中の１以上のChlamydia株を検出しそして同定する方法であって 、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１２２、１２３若しくは１９７から誘導される任意 のプローブであって、Chlamydia株と特異的にハイブリダイズするプローブと、 ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１に記載の方法。 ４０．サンプル中の１以上のChlamydia trachomatis株を検出しそして同定する 方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１２３若しくは１９７から誘導される任意のプロー ブであって、Chlamydia trachomatisと特異的にハイブリダイズ するプローブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項３９に記載の方 法。 ４１．サンプル中の１以上のChlamydia psittaci株を検出しそして同定する方法 であって、ここで、工程(iii)が少なくとも以下のプローブ： 若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１２２から誘導される任意のプローブであって、Chl amydia psittaciと特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさ せる工程を包含する、請求項３９に記載の方法。 ４２．サンプル中の１以上のStreptococcus株を検出する方法であって、ここで 、工程(iii)がSEQ ID NO１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１ ５１、１５２若しくは１５３から誘導される任意のプローブであって、Streptoc occus 株と特異的にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイズさせる工程 を包含する、請求項１に記載の方法。 ４３．サンプル中のChlamydia trachomatisを特異的に検出しそして同定する方 法であって、ここで、工程(ii)は、下記のプライマー： の少なくとも１つ若しくはそれらプライマーの等価物を用いる、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域若しくはその一部の増幅を包含し、該等価物がChlamyd ia trachomatisのスペーサー領域若しくはその一部をなお特異的に増幅するもの であって、該等価物は１以上のヌクレオチドの変化により上記プライマーと配列 が異なっている、請求項１に記載の方法。 ４４．サンプル中のListeria種を特異的に検出しそして同定する方法で あって、ここで、工程(ii)は、下記のプライマー： の少なくとも１つ若しくはそれらプライマーの等価物を用いる、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域若しくはその一部の増幅を包含し、該等価物がListeri a 種のスペーサー領域若しくはその一部をなお特異的に増幅するものであって、 該等価物は１以上のヌクレオチドの変化により上記プライマーと配列が異なって いる、請求項１に記載の方法。 ４５．サンプル中のMycobacterium種を特異的に検出しそして同定する方法であ って、ここで、工程(ii)は、下記のプライマー： の少なくとも１つ若しくはそれらプライマーの等価物を用いる、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域若しくはその一部の増幅を包含し、該等価物がMycobac terium 種のスペーサー領域若しくはその一部をなお特異的に増幅するものであっ て、該等価物は１以上のヌクレオチドの変化により上記プライマーと配列が異な っている、請求項１に記載の方法。 ４６．請求項１〜４５および５１〜５３に定義したプローブ若しくはプラ イマーの少なくとも１つを含む組成物。 ４７．請求項１〜４２および５１のいずれか１項で定義したプローブ。 ４８．請求項４３〜４５および５２〜５３のいずれか１項で定義するプライマー 。 ４９．固体支持体、より好ましくはメンブランストリップ上の既知の位置に固定 されている、請求項１〜４２および５１に定義した任意のプローブを包含するリ バースハイブリダイゼーション法。 ５０．サンプル中の、少なくとも１つの微生物を検出しそして同定するための、 若しくは数個の微生物を同時に検出しそして同定するための、キットであって、 以下の成分： （ｉ）適切な場合、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域若しくはその一部 の増幅を可能にする少なくとも１つの適切なプライマー対； （ｉｉ）請求項１〜４２および５１で定義したプローブのうち少なくとも１つ； （ｉｉｉ）該プローブと該サンプル中に存在するポリ核酸あるいはそれらの増幅 産物とのハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液、若しくは該緩衝液を 作成するのに必要な成分； （ｉｖ）適切な洗浄条件下で、形成された該ハイブリッドの洗浄を可能にする溶 液、若しくはその溶液を作成するのに必要な成分； （ｖ）適切な場合、先行のハイブリダイゼーションの結果得られた該ハイブリッ ドを検出する手段、 を含むキット。 ５１．サンプル中の１以上のYersinia enterocolitica株を検出しそして同定す る方法であって、ここで、工程(iii)が以下のプローブ： の少なくとも１つ若しくは該プローブの等価物と、 および／または、SEQ ID NO１９５若しくは１９６から誘導される任意のプロー ブであって、Yersinia enterocolitica株と特異的にハイブリダイズするプロー ブと、ハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１に記載の方法。 ５２．サンプル中のBrucella種を特異的に検出しそして同定する方法であって、 ここで、工程(ii)は、下記のプライマー： の少なくとも１つ若しくはそれらプライマーの等価物を用いる、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域若しくはその一部の増幅を包含し、該等価物がBrucell a 種のスペーサー領域若しくはその一部をなお特異的に増幅するものであって、 該等価物は１以上のヌクレオチドの変化により上記プライマーと配列が異なって いる、請求項１に記載の方法。 ５３．サンプル中のYersinia enterocolitica種を特異的に検出しそして同定す る方法であって、ここで、工程(ii)は、下記のプライマー： の少なくとも１つ若しくはそれらプライマーの等価物を用いる、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域若しくはその一部の増幅を包含し、該等 価物がYersinia enterocolitica種のスペーサー領域若しくはその一部をなお特 異的に増幅するものであって、該等価物は１以上のヌクレオチドの変化により上 記プライマーと配列が異なっている、請求項１に記載の方法。