JPH10503084A

JPH10503084A - Ｉｃｅ及びｉｃｅ様合成物並びにその製造方法

Info

Publication number: JPH10503084A
Application number: JP7529866A
Authority: JP
Inventors: ヴィー．タラニアン，ロバート; エル．シー．ダング，レナード; ペラムクリントンウォーカー，ナイジェル; ガユール，タリク
Original assignee: バスフエイジー
Priority date: 1994-05-12
Filing date: 1995-05-12
Publication date: 1998-03-24
Also published as: CA2189581A1; CA2189581C; WO1995031535A1; EP0754224A1; US5492824A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＩＣＥの２つのサブユニットを合わせ、かかるサブユニットを折畳んで活性な酵素を形成することにより形成したインターロイキン−１β変換酵素ＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物に向けられている。

Description

【発明の詳細な説明】ＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物並びにその製造方法発明の分野この発明は、インターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）、ＩＣＥ様合成物及びかかる合成物の製造方法を特徴とする。発明の背景インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、幾つかの炎症性疾患の病因において重要な役割を演じる。ＩＬ−１活性を示す２つの蛋白質、インターロイキン−１− α（ＩＬ−１α）及びインターロイキン−１−β（ＩＬ−１β）が記載されている。これらの２つの蛋白質は、別個の遺伝子の産物であるが、それらは２７〜３３％のアミノ酸同一性を共有し、同じレセプターと相互作用し且つ類似の生物学的活性を有することが知られている。各蛋白質は、その約３１ｋＤａの前駆体から蛋白質分解により開裂されて一層活性な１７ｋＤａの形態となる。ＩＬ−１α前駆体（プレＩＬ−１ａ）は、その成熟型よりは低いが、生物学的活性を示す。対照的に、ＩＬ−１β前駆体（プレＩＬ−１β）は、プロセッシングを受けてその成熟型になるまでは生物学的活性を示さない。両ＩＬ−１分子は分泌蛋白質であるが、両者ともシグナルペプチドを欠いている。これらの分泌の機構は完全には明らかにされていない。ある型の細胞のみがプレＩＬ−１βのプロセッシングを行なってＩＬ−１βを分泌する。単核細胞及びマクロファージは、公知のＩＬ−１βの最も効率的且つ多産の生産者であり分泌者である。単核細胞及びマクロファージの活性化の後に合成され、分泌される２つのＩＬ−１蛋白質の内では、ＩＬ−１βが一層豊富である。細胞におけるプレＩＬ−１βのＩＬ−１βへのプロセッシングは、ＩＬ−１β 変換酵素（ＩＬ−１ＣＥ又はＩＣＥ）という酵素により媒介される。ＩＣＥは、イン・ビボでは、４５ｋＤａの前駆体分子として発現され、イン・ビボで酵素分解によるプロセッシングを受けて２０及び１０ｋＤａの断片になり、これらは一緒に、ＩＣＥの活性型を構成する。ＩＬ−１β及び幾つかの炎症性疾患の病因においてそれが演じる役割の研究は、ＩＣＥの不十分な量により妨げられてきた。イン・ビボでは、単核細胞及びマクロファージは、少量のＩＬ−１β及びＩＣＥを含むだけである。ＩＣＥ及びＩＬ−１βは共に、細胞中に少量で存在し、これが、研究及び特性決定のために利用し得る物質の量を制限している。活性なＩＣＥは、主要蛋白質サブユニットを別々に大腸菌中で発現させた後に一緒に混合すること又はこれらのサブユニットを大腸菌中で同時発現させることによっては生成し得ないということが報告されている。Miller等、「Purification and Characterization of Active Human Interleukin-1β -con verting Enzyme from THP.1 Monocyte Cells」，J ．Biol．Chem．268，pp18062- 18069(1993)。本発明は、このMiller等の教示に真っ向から反対するものである。ＩＣＥと相互作用してＩＬ−１βの産生を変化させる物質は、炎症応答を調節するための治療剤として興味深い。発明の要約本発明は、ＩＣＥ、ＩＣＥ様合成物並びにＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物の製造方法を志向するものである。本発明の一具体例は、ＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物の製造方法を特徴とする。その方法は、ＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の第１及び第２サブユニットを合わせる工程及びこれらのサブユニットを折畳んでＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物を形成する工程を含む。ここで用いる場合、「ＩＣＥ」は、１９９２年８月１４日の出願日のMerck an d Company，Inc．による欧州特許出願第９２３０７４７９．３号に規定されたＩＬ−１β変換酵素をいう。用語「ＩＣＥ様合成物」は、ＩＣＥ活性を有する合成物、即ち、３１ｋＤａの前駆体蛋白質プレＩＬ−１βを１７ｋＤａの生物学的に活性な成熟ＩＬ−１β分子に変換する合成物のことをいう。例えば、制限するものではないが、かかるＩＣＥ様合成物には、別々に発現させ、合わせ、そして折畳んだＩＣＥの１０及び２０ｋＤａのサブユニット又は断片、組換えＩＣＥ、４５ｋＤａのプレＩＣＥ分子から導いたサブユニット又は断片（３２ｋＤａのサブユニット又は断片を含むが、それらに限らない）並びに重要でないアミノ酸の欠失、置換及び付加を有するＩＣＥに似た蛋白質が含まれる。別々に発現させたサブユニット又は断片及び組換えＩＣＥは、更に、かかる蛋白質をコードする核酸を細菌の系で発現させた場合には哺乳動物蛋白質に追加された更なるアミノ酸を含み又、ＩＣＥのクローニングを可能にし又はその発現を改善するＩＣＥをコードするＤＮＡ構築物の制限部位及びその他の特徴を含む。この出願は、用語「サブユニット」及び「断片」を交換可能に使用してプレＩＣＥ合成物からの導出物を表示する。ここで用いる場合、用語「合わせる」は、混合物の形成のときのように互いに近くにもたらすことをいう。用語「折畳む」は、蛋白質サブユニット又は断片が一緒に触媒的に活性な合成物を形成することをいう。好ましくは、この方法は、更に、ＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の成熟型の第１サブユニット及びＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の成熟型の第２サブユニットをコードする核酸を発現させる工程を含む。好ましくは、これらのＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の２つのサブユニットを別々に発現させる。ここで用いる場合、「発現させる」は、蛋白質を形成するための核酸の転写及び翻訳をいう。用語「別々に発現させる」は、各サブユニットを含む蛋白質配列が、転写及び翻訳に際して２つの別個の蛋白質サブユニットを生成する核酸によりコードされることを意味する。各蛋白質をコードする核酸は、一つの核酸分子上に一緒に結合されていてもよいし、２つの別個の核酸分子にて運ばれてもよい。例えば、制限はしないが、この核酸は、各領域がこれらのサブユニットの１つをコードする２つの領域を有する単一プラスミッドに含まれ得る。このプラスミッドの各領域は、別々のプロモーターの影響下にあってよい。例えば、制限はしないが、各サブユニットをコードする核酸を別々のプラスミッドにて運んで単一細胞に取込ませることができる。例えば、制限はしないが、第１の核酸を一群の細胞に含ませ、第２の核酸を第二群の細胞に含ませることができる。本発明の方法は、トランスフォームされ得る任意の細胞に用いて、ＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の第１及び第２サブユニットを生成することができる。好ましくは、トランスフォームされる細胞は大腸菌である。好適大腸菌には、大腸菌ＣＡＧ５９７が含まれる。大腸菌ＣＡＧ５９７は、１９８４年３月６日の出願日を有するハーバード大学（マサチューセッツ、Cambridge在）による米国特許出願第４，７５８，５１２号に記載されている。大腸菌ＣＡＧ５９７は市販されている。好ましくは、第１の核酸は、Seq．I.D．No．１のヌクレオチド３５８〜８９１によりコードされる配列を有する。好ましくは、第２の核酸は、Seq．I.D．No．１の９９４〜１２１２ヌクレオチド（このヌクレオチドは、１８ｋＤａのサブユニットに相当する）に相当するヌクレオチド配列を有し、最も好ましくは、Seq ．I.D．No．１の９４９〜１２１２ヌクレオチド（このヌクレオチドは、２０ｋＤａのサブユニットに相当する）に相当するヌクレオチド配列を有する。かかる核酸は、機能的にプロモーターに結合された場合、大腸菌細胞中で発現することができる。ここで用いる場合、用語「機能的に結合された」は、核酸であって、それを配置した細胞による転写及び翻訳を可能にする様式で結合された核酸をいう。典型的には、核酸及びプロモーターは、細胞に受け入れられるベクター中に取込まれる。このように形成した蛋白質は、折畳まれてＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物を形成することができる。細菌による発現系は、ＩＣＥの第１及び／又は第２サブユニット上のメチオニンを含む更なるアミノ酸を必要とし得る。これらの追加のアミノ酸が合わせ且つ折畳まれた蛋白質の生物学的活性を減ずることはないようである。プレ−ＩＣＥの蛋白質配列をSEQ ID NO:２に示す。この２０ｋＤａのサブユニットは、アミノ酸１２０〜２９７に及ぶ。この２０ｋＤａサブユニットに類似した活性を有し得る２つの２２ｋＤａサブユニットは、アミノ酸１０４〜２９７及びアミノ酸１２０〜３１６を含む。この２０ｋＤａサブユニットに類似した活性を有し得る１８ｋＤａサブユニットは、アミノ酸１３５〜２９７に及ぶ。従って、本発明の一具体例は、SEQ ID NO:２のアミノ酸１０４〜３１６から選択した１８〜２４ｋＤａサブユニットを特徴とする。１０ｋＤａサブユニットは、アミノ酸３１７〜４０４に及ぶ。この１０ｋＤａサブユニットに類似した活性を有し得る１２ｋＤａサブユニットは、アミノ酸２９９〜４０４に及ぶ。従って、本発明の一具体例は、SEQ ID NO:２のアミノ酸２９８〜４０４から選択した１０〜１２ｋＤａサブユニットを特徴とする。好ましくは、第１及び第２サブユニットは、合わせて混合物を形成する工程の前に還元して変性させる。これらの第１及び第２サブユニットは、変性条件に置くことにより変性される。これらの条件には、カオトロピック因子、還元剤を取込む第１及び第２サブユニットの溶液を形成すること、及び高いｐＨが含まれる。カオトロープは、蛋白質の分解及び変性を引き起こす化合物である。好適なカオトロープは、グアニジンの塩、特にグアニジン塩酸塩である。還元剤は、反応して他の化合物の酸化状態を例えばシスチンダイマーをシステインに還元することにより低下させる化合物である。好適な還元剤は、還元形態のジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。好適ｐＨは、７．０〜９．５の範囲であり、特にｐＨ約８．５が好ましい。この出願では、温度、監視用器具及び実験室技術における正常の変動により影響されるｐＨの変化を反映するためにｐＨに関しては用語「約」を用いる。還元及び変性工程を行なう溶液は、トリス及びＥＤＴＡを含む。これらのトリス及びＥＤＴＡなる用語は、当業者には周知である。「トリス」とは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのことを、「ＥＤＴＡ」とは、エチレンジアミン四酢酸のことをいう。好ましくは、折畳条件は、第１及び第２サブユニットの混合物溶液からのカオトロープの除去及び初期ｐＨの８．５〜９．５への上昇を含む。好ましくは、ｐＨは約９．０である。この初期ｐＨを、次いで、ｐＨ６．５〜７．０に、最も好ましくは約６．７に下げる。好ましくは、このｐＨ変化は、徐々に行なう。好ましくは、第１及び第２サブユニットを含む溶液の条件及び条件の変化によって折畳を行なう（これらの溶液は、更に、グリセロールを含む）。グリセロールの好適濃度は、５〜３０％（ｖ／ｖ）であり、最も好ましくは、約２０％（ｖ／ｖ）である。濃度に関して、この出願では、測定用の実験室技術等による変動を示唆するために用語「約」を用いる。これらの溶液は、好ましくは、トリス、ＤＴＴ及びＥＤＴＡを含む。好ましくは、折畳条件は、０〜１５℃の温度を、最も好ましくは４℃を含む。好ましくは、この方法は、ＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物を精製する工程を含む。精製条件は、遠心分離及び濾過による微粒子の除去を含む。好ましくは、精製条件は、更に、クロマトグラフィー、最も好ましくはイオン交換クロマトグラフィーを含む。クロマトグラフィーは、好ましくは、第１のクロマトグラフィー用緩衝液中で行なう。これらの緩衝液は、ＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物に化学的条件を課して、それらのＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物のイオン交換樹脂への非共有結合を引き起こす。イオン交換樹脂に結合したＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の精製を達成するために、それらのＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物を、第１のクロマトグラフィー用緩衝液の塩濃度を塩を直接加えるか又は第１の緩衝液を一層高い塩濃度を有する第２の緩衝液で徐々に置き換えることにより徐々に増加させることによって、カラムから選択的に溶出させる。好ましくは、第１のクロマトグラフィー用緩衝液は、更に、グリセロールを含む。好適濃度は、５〜３０％（ｖ／ｖ）グリセロールであり、最も好ましくは２０％（ｖ／ｖ）である。好適緩衝液は、ＨＥＰＥＳ及びＥＤＴＡを含む。ＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物は、更に精製して、結晶化可能な蛋白質を形成することができる。この結晶化蛋白質を用いて、この蛋白質の原子的細部の三次元構造を決定することができ、従って、ＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物の基質及び阻害剤の結合部位を評価することができる。結晶化ＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物は、この酵素の阻害剤をデザインするための有用性を有する。好ましくは、この方法は、ＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物をＩＣＥの阻害剤と合わせてＩＣＥ阻害剤複合体を形成する工程を含む。この阻害剤は、この酵素を安定化させる。阻害剤を伴うＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物は、ＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物とその基質のＩＬ−１βとの間の相互作用に関するモデルとしての有用性を有する。好適阻害剤は、アセチル化Ｎ末端−チロシン−バリン−アラニン−ＮＨ−ＣＨ −（ＣＨ₂ＣＯＯＨ）ＣＯ−ＣＨ₂Ｃｌであり、式中、すべてのキラル中心は天然のＬ−アミノ酸（Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ）と同じである。好ましくは、この方法は、阻害剤の結合したＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物のクロマトグラフィーによる更なる精製の工程を含む。本発明の更なる具体例は、物質としての合成物を特徴とする。本発明の合成物の一具体例は、天然に存在しないＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物を含む。ここで用いる場合、用語「天然に存在しない」は、天然状態から処理され又は変化された物をいう。細胞に適用する場合には、天然に存在しない細胞は、天然に存在しない核酸を有し、又は天然に存在しないペプチドを生成し、又は自然には結合することのない細胞と融合される。用語「天然に存在しない核酸」は、起源又は操作により、天然において会合しているすべての核酸と会合しておらず、又は天然において結合しているもの以外の核酸若しくは他の化学物質と結合しており、又は天然には存在していない、ゲノム核酸の一部分、ｃＤＮＡ、半合成核酸又は合成の新奇な核酸をいう。用語「天然に存在しないペプチド」は、起源又は操作により、天然において会合しているすべてのペプチドと会合しておらず、又は天然において結合しているもの以外のペプチド、官能基若しくは化学物質と結合しており、又は天然に存在しない、一層大きい天然のペプチド若しくは蛋白質の一部分、又は半合成若しくは合成のペプチドをいう。好ましくは、天然に存在しないＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物は、結合し且つ折畳まれてＩＣＥ様活性を有する合成物を形成するＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の１２ｋＤａのサブユニット及び１８又は２４ｋＤａのサブユニットを含む。最も好ましくは、一層大きいサブユニットは、２０ｋＤａサブユニットである。最も好ましくは、一層小さいサブユニットは、１０ｋＤａサブユニットである。好ましくは、ＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物は、組換え蛋白質である。更なる具体例は、複合体形態の、天然に存在しないＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物並びに阻害剤を特徴とする。阻害剤−ＩＣＥ複合体の一部であるＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物は、改善された安定性を示す。かかる阻害剤−ＩＣＥ複合体を精製して結晶化可能な合成物を形成することができる。好適合成物は、阻害剤−ＩＣＥ複合体の結晶を含む。本発明は、更に、下記の図面及び実施例に記載されるが、それらは、本発明の特徴を更に説明し且つ好適具体例及び本発明の特徴を実施するための最良の様式を強調する。図面の簡単な説明図１は、４５ｋＤａ蛋白質プレＩＣＥをコードする核酸のヌクレオチド配列を示し（Seq．ID No．１としても示されている）；そして図２は、プレＩＣＥに対応する４５ｋＤａ蛋白質のアミノ酸配列を示す（Seq ．ID No．２としても示されている）。発明の詳細な説明本発明を、ＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物の製造方法、並びにそれにより形成した合成物の発明として、詳細に説明する。この方法は、ＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の２つのサブユニットを合わせる工程及びそれらの合わせたサブユニットに折畳まる条件を課してプレＩＬ−１βをＩＬ−１βにする酵素的プロセッシング能力を有するＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物を形成することを含む。これらの２つのサブユニットは、合成により生成することができ、又は１つ以上の宿主細胞中で適当なプロモーターに機能的に結合させたクローン化核酸を発現させることにより生成することができる。この方法は、更に、ＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物をＩＣＥの阻害剤と結合させてこの酵素を安定化させる工程を含む。この方法は、更に、阻害剤の結合したＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物のクロマトグラフィーによる更なる精製の工程を含む。こうして形成された合成物を精製して結晶学等級のＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物を形成することができる。本発明の実施では、別段の指示のない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術及び免疫学の慣用技術を採用するが、これらは、当業者の扱い得るものであり文献に十分に説明されているものである。例えば、Sambrook，Frit sch及びManiatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Har bor Laboratory Press(1989)；DNA Cloning，第１及び第２巻（D.N．Glover,編1 985）；Oligonucleotide Synthesis（M.J．Gait,編1984）；Nucleic Acid Hybr idization （B.D．Hames及びS.J．Higgins，編1984）；Methods In Enzymologyシリーズ（Academic Press，Inc．）特に第154及び155巻（Wu及びGrossman編）並びに第182巻（Deutscher,編）；Stout及びJensen，X-ray Structure Determinat ion ，A Practical Guide （Wiley-Interscience，1989）を参照されたい。本発明の他の特徴は、下記の実施例から明らかとなろう。実施例１この実施例は、ＩＣＥ、プレＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物をコードする核酸のクローニングを記載する。ＩＣＥ、プレＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物をコードする核酸をＰＣＲの利用により構築した。ＰＣＲプライマーを、公表されたプレＩＣＥｃＤＮＡ配列に基づいて、Immunex Corporationによる１９９１年４月４日の出願日を有する国際特許ＷＯ第９１／１５５７７号及びThornberry等、Nature 第 356巻、第768-774頁(1992)に記載されたようにデザインしたが、幾つかのコドンは同じアミノ酸をコードするが大腸菌における高レベルの発現に一般に好適なコドンに変更した。この配列を、Seq．ID No．１及び図１に示す。ＩＣＥ様合成物の２０ｋＤａサブユニット（ｐ２０）に対応する核酸を、５’ プライマーＰ１及び３’プライマーＰ２を用いて、ＰＣＲにより構築した。このＩＣＥ様合成物のサブユニットＰ２０は、Seq．ID No．２及び図２に示した完全長の４５ｋＤａプレＩＣＥ分子のアミノ酸１２０〜２９７に対応し、発現を与えるためにアミノ末端に追加した更なるメチオニン残基を有する。ＩＣＥ様合成物の２２ｋＤａサブユニット（ｐ２２）は、Seq．ID No．２の１６個のアミノ酸１０４〜１２０に対応する更なるヌクレオチドを用いて容易に構築することができる。従って、この２２ｋＤａサブユニットは、完全長の４５ｋＤａプレＩＣＥ分子のアミノ酸１０４〜２９７を、好ましくは、発現を与えるためにアミノ末端に追加された更なるメチオニン残基を伴って含む。これらの実施例は、ｐ２０サブユニットを特徴とするが、ｐ２２サブユニットは類似の挙動をすると考えられる。ＩＣＥ様合成物の１０ｋＤａサブユニットに対応する核酸を、５’プライマーＰ３及び３’プライマーＰ４を用いてＰＣＲにより構築した。このＩＣＥ様合成物ｐ１０は、Seq．ID No．２に図２として示した完全長の４５ｋＤａプレＩＣＥ分子のアミノ酸３１７〜４０４に対応し、発現を与えるためにアミノ末端に追加した更なるメチオニン残基を有する。下記の表１は、プライマーＰ１（Seq．ID No．３）、Ｐ２（Seq．ID No．４）、Ｐ３（Seq．ID No．５）及びＰ４（Seq．ID No．６）を記載してある。イン・フレームの開始メチオニンをコードする核酸をｐ１０及びｐ２０構築物に５’−プライマーＰ１及びＰ３により加えた。更に、これらの５’プライマーＰ１及びＰ３は、それぞれ、ＥｃｏＲＩ制限部位をも含んだ。３’プライマーＰ２及びＰ４は、それぞれ、ＳｐｅＩ制限部位をも含んだ。更に、５’プライマーＰ１及びＰ３は、それぞれ、天然のコドンと同じアミノ酸をコードするが大腸菌における高レベルの発現に一般に好適である幾つかの新規なコドンを与える天然の核酸配列からの幾つかの核酸塩基の変化を含んでいる。一時的発現ベクター中にサブクローン化した完全長のＩＣＥ前駆体（ｐ４５）ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて、ｐ２０及びｐ１０ＩＣＥ型をＰＣＲ−クローン化した。得られたＩＣＥＰＣＲ生成物のすべてを、GeneClean（Bio 101 I nc.）を用いて精製し、大腸菌ｐＬ発現用プラスミッド中に方向指定しないでサブクローン化した。ｐＬ発現用プラスミッドからの転写を、温度感受性リプレッサー蛋白質ｃＩ⁸⁵ ⁷ により制御する。ｃＩ⁸⁵⁷は、３０℃以下で転写を阻止し、４２℃で転写を阻止するその能力を失う。ｃＩ⁸⁵⁷をコードする核酸遺伝子は、プラスミッドベクターｐＡＣＹＣ１７７ｃＩ⁸⁵⁷上にコードされている。ｐＡＣＹＣ１７７ｃＩ⁸⁵⁷は又、カナマイシン耐性遺伝子をもコードしており、このプラスミッドは、培養培地中のカナマイシンの存在により維持される。このｐＬ発現用プラスミッドは、アンピシリン耐性遺伝子をコードし、培養培地中のアンピシリンの存在により維持される。ｐＬ制御されたＩＣＥ発現用プラスミッドを用いて、任意の適合性プラスミッド上の又は大腸菌染色体中の安定なインテグラントとしての発現されるｃＩ⁸⁵⁷遺伝子を含む任意の大腸菌株においてＩＣＥ蛋白質を生成することができる。実施例２この実施例は、機能的にプロモーターに結合された成熟型ＩＣＥの１０ｋＤａサブユニット又は２０ｋＤａサブユニットをコードする核酸による大腸菌のトランスフォーメーションを記載する。２２ｋＤａサブユニットを含む他のサブユニットをコードする核酸によるトランスフォーメーションは、類似の様式で行なわれるであろう。凍結されたコンピテントな大腸菌を急速に解凍して、氷上に１０分間置いた。この細胞混合物の１００μｌのアリコートを冷却した無菌のポリプロピレンチューブに移した。スーパーコイルドプラスミッドＤＮＡ（１ｎｇ）をこれらのコンピテント細胞に加え、それらのチューブの内容物を穏やかに渦巻きを起こさせて混合した。これらのチューブを３７℃の循環水浴中に正確に２分間入れて細胞に熱ショックを与え、次いで、急いで氷中に移した。次に、１ｍｌの２×ＹＴ培地を各チューブに加えた。これらのチューブを、３０℃で１時間、２２５サイクル／分で震盪させた。これらのトランスフォームされた細胞を、アンピシリン及びカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに移した。３０℃で一晩のインキュベーションの後に、これらのトランスフォームされた細胞を選択し、２ ×ＹＴ培地中で３０℃で生育させた。実施例３この実施例は、ＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物のサブユニットをコードする遺伝子でトランスフォームされた細胞の、これらの遺伝子からＩＣＥ蛋白質サブユニットを転写し且つ翻訳するためのインキュベーションを記載する。実施例２に記載したようにトランスフォームした細胞を、１２．５リットルのＥＣ３培地に２９ ℃で接種するのに用いた。ＥＣ３培地を、２２５ｇのDifcoトリプトファン、７５ｇのDifco酵母エキス、４８ｇのＫ₂ＨＰＯ₄、３０ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１２ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄、１．５ｇのアンピシリン及び０．７５ｇのカナマイシンを１２．５リットルの脱イオン水に溶解させ、オートクレーブ滅菌することにより調製した。この溶液のｐＨを発酵中連続的にモニターし、必要に応じて１５％ＮＨ₄ ＯＨの添加によりｐＨが６．８より低くならないように維持した。１．２リットルのＥＣ３Ａ培地の溶液を発酵及び誘導期間中徐々に加えた。ＥＣ３Ａ培地は、２．０５ｇのＦｅ₂（ＳＯ₄）₃・８Ｈ₂Ｏ、０．９２ｇのＺｎ（ＮＯ₃）₂・６Ｈ₂Ｏ、０．８３ｇのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．２６ｇのＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、１１６ｍｇのＣｕＣｌ₂２Ｈ₂Ｏ、５ｇのクエン酸一水化物、６７ｍｇのＨ₃ＢＯ₃、６７ｍｇのＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、９７ｍｇのａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、７５０ｇのグリセリンＵＳＰ及び３７．５ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを１．２リットルの脱イオン水に溶解させ、その溶液をオートクレーブ滅菌することによって調製した。培養のＯＤ₆₀₀値が３０に達したときに、培養温度を４２℃に上昇させてＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物をコードする遺伝子の転写及び翻訳を誘導した。誘導の１時間前及び誘導期間中、１リットルのＦＣ３Ｂ溶液を徐々に加えた。ＥＣ３Ｂ培地は、１００ｇのDifcoトリプトファン、５０ｇのDifco酵母エキス及び５．０ｇのＮａＣｌを１リットルの脱イオン水に溶解させてオートクレーブ滅菌することによって調製した。４時間のインキュベーションの後に、０．２μｍの接線濾過物を有するMillipore Pelliconフィルターユニットを用いる濃縮とその後の１２，０００×ｇでの遠心分離により細胞を採取した。上清を取り出し、細胞ペレットを−８０℃で保存した。実施例４この実施例は、ＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物のサブユニットをコードする遺伝子でトランスフォームされ且つこのサブユニットの単離のためにＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物のサブユニットを転写するように誘導された細胞の調製を記載する。実施例３に記載したようにして調製した細胞ペーストを遠心分離用チューブに入れて解凍し、それから、氷上に置いた。２％トリトンＸ−１００及び５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）を含む７容積（ペレットの容積に対するもの）の緩衝液Ａを各遠心分離用チューブに加えた。このペレットを超音波によりホモジェナイズした。ホモジェナイズしたペレットを４℃でミクロフルイダイザーに２回通し、そのミクロフルイダイザーを更なる１容積の緩衝液Ａでフラッシュした。この混合物を顕微鏡下で検査したが、必要であればもう一度ミクロフルイダイザーに通した。この試料を、次いで、５．５リットルまで追加の緩衝液Ａで希釈し、その後、室温で攪拌しながら６０分間インキュベートした。この試料を、次いで、１２，０００×ｇで２０分間室温で遠心分離した。その上清を捨て、ペレットを等容の緩衝液Ａに４℃で再懸濁させた。ホモジェナイゼーション、インキュベーション及び遠心分離の工程を、次いで、２回繰り返した。次に、ホモジェナイゼーション、インキュベーション及び遠心分離のプロセスを、５００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）を含む緩衝液Ｂを用いて４℃で３回繰り返した。次に、ホモジェナイゼーション、インキュベーション及び遠心分離のプロセスを、５０ｍＭトリス８．０を含む緩衝液Ｃを用いて一回繰り返した。こうして調製した試料のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲル上でクロマトグラフィーにかけた。そのゲルをクーマシーブルーで染色して読み、この物質の純度の評価及びペレット中の蛋白質量の評価を与えた。実施例５この実施例は、ＩＣＥ及びＩＣＥ様合成物のサブユニットの溶液を記載する。実施例４に記載したような封入体の形態のＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の蛋白質サブユニットを変性した形態で溶解させ、６ＭＧｕＨＣｌ、トリス２００ｍＭＤＴＴ及び５０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）を含む溶液中で２４時間還元した。１０ｋＤａサブユニットを含む試料を１ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度に調製した。２０ｋＤａサブユニットを含む試料を２ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度に調製した。可溶化し変性しそして還元した蛋白質を室温で１０容積の５％（ｖ／ｖ）酢酸に対して３回、それぞれ少なくとも３時間ずつ透析した。透析後、それらの試料を２７，０００×ｇで４０分間遠心分離した。次いで、その上清を０．２２μｍのフィルターで濾過した。その濾液は、ＨＰＬＣ精製に適している。実施例６この実施例は、別々に発現させた１０ｋＤａサブユニットと２０ｋＤａサブユニットとを合わせ、かかるサブユニットを折畳んでＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物を形成することを記載する。これらのサブユニット（それらは、前述の実施例に記載のように、別々の溶液において変性及び復元にかけられた）は、活性なＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物を形成しない。かかるサブユニットは、活性なＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物を形成するには一緒に復元にかけられなければならない。この１０又は２０サブユニットに類似のサイズを有する別のサブユニットは、類似の条件下で合わせて折畳むことができる。実施例５の２つの細胞抽出物（一つは、ＩＣＥの１０ｋＤａサブユニットを含み、一つは２０ｋＤａサブユニットを含む）を、６ＭＧｕＨＣｌ及び２００ｍＭＤＴＴを含む別々の溶液にｐＨ８．５で溶解させた。これらの各サブユニットを含む抽出物を、約２ｍｇ／ｍｌ（１００〜２００ｎＭ）の濃度にまで可溶化した。これらの蛋白質溶液の濃度を定量的アミノ酸分析により測定した。溶液中の蛋白質濃度を測定するための他の技術、例えば比色アッセイを用いることもできよう。これらの可溶化蛋白質は、更なる処理を直ぐに行なわないならば−８０℃ で貯蔵することができる。これらの蛋白質を含む溶液を、次に、蛋白質変性条件にかけた。好適条件は、１０ｋＤａサブユニットを含む溶液と２０ｋＤａサブユニットを含む溶液をそれぞれ６ＭＧｕＨＣｌ、２５ｍＭトリス、２００ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）にて１ｍｇ／ｍｌまで希釈し、室温で１８〜２４時間インキュベートすることにより課せられた。低濃度のトリス緩衝液は、一層高い濃度より好ましい。１０ｍＭトリス緩衝液は、１００ｍＭトリス緩衝液の２倍まで活性酵素の収量を生じた。次に、これらの変性した１０ｋＤａ又は２０ｋＤａサブユニットを含む溶液を混合し、１０ｋＤａサブユニットの終濃度１６．７μｇ／ｍｌ及び２０ｋＤａサブユニットの終濃度３３μｇ／ｍｌまで、６ＭＧｕＨＣｌ、２５ｍＭトリス（ｐＨ９．０）、５ｍＭＤＴＴ及び０．５ｍＭＥＤＴＡにて希釈した。他のカオトロープをグアニジン塩酸塩の代わりにすることができる。６ＭＧｕＨＣｌの濃度は、好適濃度である。２．０〜８．０Ｍの範囲は、許容し得る。これらのトリス、ＤＴＴ及びＥＤＴＡを含む緩衝溶液は、好適緩衝液である。ｐＨ８．５の可能な他の緩衝液を、かかる緩衝溶液の代わりにすることができる。このトリス成分は、リン酸塩及びＨＥＰＥＳに基づく緩衝液の約３〜４倍の改善された収量を与える。１０〜１０００μｇ／ｍｌの全蛋白質濃度は、許容し得る。好ましくは、蛋白質の沈殿を回避するために、全蛋白質濃度は、２００μｇ／ｍｌより低い。これらの１０及び２０ｋＤａサブユニットを、１：１モル比で合わせる。これらの合わせたサブユニットを、透析用チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｏｒ１、６〜８０００分子量カットオフ、１ｍｌ／ｃｍ）にて、２５ｍＭトリス、５ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）を含む１００容積の溶液に対して、４℃で、３時間透析した。この透析用緩衝液は、絶えず攪拌する。温度４℃は好適温度である。一層低い温度は、凍結のために不可能である。一層高い温度は、活性ＩＣＥ酵素の一層低い収量を生じるであろう。２２℃の温度は、活性ＩＣＥ酵素の収量の半減を伴う。ｐＨ９．０は、好適ｐＨである。９．０を超えるｐＨは、望ましくない化学反応を生じ得る。７．５以下のｐＨは、活性なＩＣＥ酵素の収量を５０％減じ得る。トリス、ＤＴＴ及びＥＤＴＡの緩衝溶液は、好適緩衝液である。ｐＨ９．０の可能な他の緩衝液は、この緩衝溶液の代わりとなり得る。トリス成分は、リン酸塩及びＨＥＰＥＳに基づく緩衝液の約３〜４倍の改善された収量を与える。この透析プロセスを、新鮮な透析用緩衝液を用いて更に３時間繰り返し、再び新鮮な透析用緩衝液を用いて１４時間繰り返した。次に、これらの合わせたサブユニットを、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、５ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ６．７）を含む１００容積の新たな透析用緩衝液に対して、２時間透析した。これらの合わせて折畳んだサブユニットを、同じ組成の新鮮な緩衝液で１時間再透析した。この最後の透析中、試料の活性を３０分毎にモニターした。この蛋白質溶液を、次いで、透析用チューブから取り出し、２ＭＨＥＰＥＳ（これ自体はｐＨ調節してない）を用いて、４℃ で、ｐＨ値７．０に調節した。この蛋白質溶液を、２，２００×ｇで、３０分間、４℃で遠心分離し、０．２μｍにて濾過した。他の変性させないアルコール及び糖類をグリセロールの代わりにすることができる。しかしながら、かかる他のアルコール及び糖類は、収量の減少を伴うであろう。例えば、２０％（ｖ／ｖ）の濃度のショ糖及びソルビトールは、グリセロールと比較して３０％の活性の減少を生じ得る。グリセロール又は他の変性させないアルコール及び糖類の存在は、かかる配合物を用いないプロセスの２倍増を伴う。カオトロープを徐々に取り除いて収量を改善する。カオトロープ塩の希釈による段階的除去は、減じた収量を伴う。最後の透析については６．７のｐＨが好適ｐＨである。ｐＨ６．５〜７．０の利用は、高いｐＨの維持を超える改善された化合物の収量を伴う。ＨＥＰＥＳ緩衝液は、好適緩衝液である。これらのＨＥＰＥＳ緩衝液は、トリス緩衝液を維持するプロセスより３０〜４０％高い収量を伴う。透析を達成するための時間は、改善された収量とＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の自己触媒性分解との妥協である。一般に、２〜５時間の期間が許容し得る収量を生じる。実施例７この実施例は、実施例６に記載したように２つのサブユニットを合わせて折畳むことによりＩＣＥ様合成物を形成した後のＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の精製を特徴とする。実施例６の透析した物質を、４℃で、３０分間、２，２００×ｇで遠心分離し、そして濾過した（０．２μｍにて）。ＦＰＬＣイオン交換カラム（ＭｏｎｏＳＨＲ１６／１０、２０ｍｌベッドボリューム）を、緩衝液Ａで、４℃で、予備平衡化した。緩衝液Ａは、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ６．７（２１℃でのｐＨ）、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール及び０．５ｍＭＥＤＴＡを含む。この濾過した物質を、このＦＰＬＣカラムに、約５ｍｌ／分の流量で加えた。次いで、このカラムを、安定なベースラインが達成されるまで緩衝液Ｂで洗った。次いで、８４％の緩衝液Ａと１６％の緩衝液Ｂからなるように緩衝液を改変して塩濃度を増した。緩衝液Ｂは、１００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ６．７（２１℃ でのｐＨ）、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５００ｍＭＮａＣｌ及び０．５ｍＭＥＤＴＡを含む。遊離の２０ｋＤａＩＣＥ蛋白質及び他の夾雑物は、２８０ｎｍでモニターした溶出物の吸光度の追跡において、大きいピークとして溶出して現れた。この洗浄を、安定なベースラインが確立されるまで続けた。次に、緩衝液を再び改変して、５ｍｌより多い、７０％の緩衝液Ａと３０％の緩衝液Ｂからなるものとした。溶出物の２８０ｎｍの吸光度の変化により観察された溶出した主要ピークは、１０ｋＤａ及び２０ｋＤａ断片を１：１のモル比で含む活性な酵素を含有した。酵素的に不活性な遊離の１０ｋＤａの夾雑物ピークは、活性な酵素を含むピークの後に溶出された。主要ピークは、約４０〜８０ｍｌにて溶出された。少量のアリコートを活性についてアッセイした。５０〜８０％の活性の回復は普通である。この実施例においては、８０ｍＭの塩濃度が好適塩濃度である。８０ｍＭＮａＣｌより高濃度又は低濃度の塩を含有する溶液は、折畳まれた蛋白質及び不活性な蛋白質の一層効率の良くない分離を生じ得る。実施例８この実施例は、安定化用阻害剤と結合した精製ＩＣＥ様合成物を、そして更に、その精製を特徴とする。この精製ＩＣＥ様合成物を、アセチル−チロシン−バリン− アラニン−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₂ＣＯＯＨ）ＣＯ−ＣＨ₂Ｃｌと結合させたが、ここに、すべてのキラル中心は天然のＬ−アミノ酸と同じである（Ａｃ−ＹＶＡＤ− ＣＭＫ）。この阻害剤を、ジメチルスルホキシド中の１０ｍＭ溶液として維持する。阻害剤溶液の７５μｌのアリコートを５０ｍｌの実施例６の精製蛋白質に加えた。阻害剤溶液の更なる５０μｌのアリコートを４の総適用（２２５μｌ）につき３０分毎に加えた。次いで、この結合した阻害剤−ＩＣＥ合成物を、ＩＣＥ活性についてアッセイした。このように阻害した酵素は、通常、バックグラウンド活性しか示さない。この阻害剤−ＩＣＥ合成物を、透析用チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｏｒｌ、６〜８０００分子量カットオフ、１ｍｌ）にて、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ６．５（２１℃でのｐＨ）、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭＤＴＴを含む２００容積の溶液に対して、４℃で、約１６時間透析する。緩衝液Ｃ又はＩＣＥ−阻害剤複合体を含む溶液中の塩の存在は、ＩＣＥ−阻害剤複合体の下記のＦＰＬＣカラムへの効率の良くない結合を生じ得る。沈殿物を０．２μｍでの濾過により除去した。イオン交換カラム（ＭｏｎｏＳＨＲ１０／１０、８ｍｌベッドボリューム）を緩衝液Ｃで、約４℃で、予備平衡化した。緩衝液Ｃは、５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ６．５（２１℃で測定）を含む。この蛋白質の濾液をこのイオン交換カラムに、約２ｍｌ／分の流量で加えた。このカラムを、安定なベースラインが達成されるまで、緩衝液Ｃで洗った。緩衝液を改変して、１０ｍｌより多い９１％の緩衝液Ｃと９％の緩衝液Ｄとからなるようにして塩濃度を増した。緩衝液Ｄは、１００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ６．５（２１℃）及び５００ｍＭＮａＣｌを含む。２８０ｎｍでの溶出液の吸光度変化により観察された最初のピークは、阻害された酵素であった。その蛋白質収量を、ピークを総和することにより見積もった。溶出液１ｍｌ当り約１の波長２８０ｎｍでの吸光度単位は、阻害された蛋白質の１．２ｍｇに相当する。乾燥硫酸アンモニウムをこれらの溶液に５１６ｍｇ／ｍｌで加え（０℃で、８０％飽和）、３０分間０℃に維持して蛋白質沈殿を形成した。その後、これらの溶液及び沈殿を、２，２００×ｇで、３０分間、遠心分離した。ペレットを、２０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５．０）溶液の最少容積に再溶解させ、窒素でパージした。Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ阻害剤を、最終的にＩＣＥ蛋白質の６倍モル過剰になるように加えた。この阻害剤及び蛋白質を−８０℃に保存した。この溶液を、直接、結晶化を試みる溶液中に希釈した。実施例９この実施例は、阻害剤Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫと複合体化したＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の、この合成物を実施例８に記載したようにして調製した後での結晶化を特徴とする。阻害剤Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫと複合体化したＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の結晶を、蒸気拡散法のシッティングドロップ変法を用いて成長させた。実施例８に記載したようにして調製した２０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５．０）中の阻害剤Ａｃ− ＹＶＡＤ−ＣＭＫと複合体化したＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物溶液の２μｌの容積を、ピペットで、滑らかな半球状のくぼみを含むポリスチレン「ブリッジ」上に加えた。このブリッジを、マルチウェル組織培養プレートの約７００μｌの沈殿及び緩衝溶液を含む１つのウェル中に置いた。この沈殿及び緩衝溶液の組成は、後述の通りである。この沈殿及び緩衝溶液の２μｌの容積を、阻害剤Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫと複合体化したＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の溶液に加えた。この組織培養プレートのウェルを、顕微鏡用カバーガラスで覆って、シリコーングリースで厳重にシールした。このプレートを、４℃で、静かに、７日以上インキュベートして、阻害剤Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫと複合体化したＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の結晶の形成を行なった。２０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５．０）中の阻害剤Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫと複合体化したＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の約２〜６ｍｇ／ｍｌの濃度は、結晶の形成に好適な濃度であり、３．５ｍｇ／ｍｌの濃度は最も好ましい。２００ｍＭＭｇＣｌ₂、３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール４０００及び０．１Ｍトリス（ｐＨ８．４）を含むか；１．４Ｍ酢酸ナトリウム及び１００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を含むか；２００ｍＭ酢酸ナトリウム、３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール４０００及び１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．６）を含むか、又は２００ｍＭ酢酸マグネシウム、２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００及び１００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を含む沈殿及び緩衝溶液は好適である。これらの条件の変法は、結晶を生じさせるが、一層小さいサイズとなる。上記の好適条件を用いて調製した阻害剤Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫと複合体化したＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の結晶は、二錐体状の（bipyramidal）形態を示した。このようにして得られた結晶は、典型的には、最も離れた頂点の間で０．５ｍｍの長さを有し、残りの４つの隣接する頂点の任意の２つの間で０．２５ｍｍの長さを有した。実施例１０この実施例は、実施例９に記載したようにして調製した阻害剤Ａｃ−ＹＶＡＤ −ＣＭＫと複合体化したＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の結晶によるＸ線回折を特徴とし、こうして得られた結晶がＸ線を高分解能に回折することを示す。銅回転アノードの４．５ｋＷでの使用により生成するＸ線の源（０．３×０．３ｍｍ焦点スポット）を用いた場合、実施例９に記載したようにして調製した阻害剤Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫと複合体化したＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の結晶は、２．４Ａより狭い最小インタープレーナー間隔でＸ線を回折した。Ｘ線回折データは、これらの結晶が標準的スペースグループＰ４（３）２（１）２を示すことを示した。このＸ線回折データは又、これらの結晶がａ＝ｂ＝６４．６±０．３Ａの単位セル寸法を示すことをも示した。２．４Ａ以下に至る蛋白質結晶回折データは、当分野では、高分解能と考えられ、十分な品質で蛋白質構造を決定するために使用することができると考えられ、阻害剤デザインにおいて実質的に有用な分解能と考えられる。結晶化蛋白質から得ることのできる原子構造の品質は、回折データが測定される結晶の回折の品質により制限される。高品質の結晶の成長は、夾雑物に関しての蛋白質の純度並びにコンホメーションの均一性により制限される。高分解能まで回折する結晶の成長は、蛋白質を調製する方法が蛋白質の結晶化及び構造決定に実質的に有用であることを示す。従って、好適具体例を説明し、記載したが、本発明は変法及び改変が可能であり、それ故、示した詳細に厳格に限定されるべきでなく、後記の請求の範囲内に包含される変化及び変更を含むべきであるということは理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ダング，レナードエル．シー. アメリカ合衆国 02194 ニューハンプシャー，ハンコック，シェイディーレイン 46 (72)発明者ウォーカー，ナイジェルペラムクリントンドイツ国デー69221 ドッセンハイム, フラウエンプファート 20 (72)発明者ガユール，タリクアメリカ合衆国 01519 マサチューセッツ，グラーフトン，オークストリート６

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の工程を含む、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを有するＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の製造方法：ａ）該第１及び第２のサブユニットを合わせて該第１及び第２のサブユニットの混合物を形成し、ｂ）これらの第１及び第２のサブユニットを該混合物中で折畳むための折畳条件を課してＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物を形成する。２．前記の第１のサブユニットが、Seq．ID No．２のアミノ酸２９８〜４０４から選択するＩＣＥの１０〜２０ｋＤａサブユニットを含む、請求項１に記載の方法。３．前記の第２のサブユニットが、Seq．ID No．２のアミノ酸１０４〜３１６から選択するＩＣＥの１８〜２４ｋＤａサブユニットを含む、請求項１に記載の方法。４．前記の第１及び第２のサブユニットを、それらのサブユニットを合わせる前に変性させる、請求項１に記載の方法。５．前記の第１及び第２のサブユニットを、カオトロープ溶液にて変性させる、請求項４に記載の方法。６．前記のカオトロープ溶液がグアニジン塩を含む、請求項５に記載の方法。７．前記の第１及び第２のサブユニットを、約８．５〜９．５のｐＨを有する溶液にて変性させる、請求項４に記載の方法。８．前記の第１及び第２のサブユニットを、グアニジン塩酸塩、トリス、ＤＴＴ及びＥＤＴＡの溶液にて変性させる、請求項４に記載の方法。９．前記の折畳条件が、初期溶液ｐＨ約８．５〜９．５を含む、請求項１に記載の方法。１０．前記の折畳条件が温度４℃を含む、請求項１に記載の方法。１１．前記の折畳条件がカオトロープの除去を含む、請求項１に記載の方法。１２．前記の折畳条件が、前記の初期溶液ｐＨをｐＨ６．５〜７への変化を含む、請求項９に記載の方法。１３．前記の折畳条件が、グリセロールを含む緩衝された溶液を含む、請求項１に記載の方法。１４．前記の折畳条件が、前記の混合物からのカオトロープの除去を含み、第１の緩衝された溶液として維持された該混合物は初期ｐＨ８．５〜９．５を有し、変化する第２の緩衝された溶液はｐＨ６．５〜７．０、グリセロール濃度５〜３０％（ｖ／ｖ）及び温度４℃を有する、請求項１に記載の方法。１５．前記の混合物を、ｐＨ８．５〜９．５を有するトリス、ＤＴＴ及びＥＤＴＡを含む前記の第１の緩衝された溶液及びＨＥＰＥＳ、ＤＴＴ及びＥＤＴＡ、５〜３０％（ｖ／ｖ）グリセロール及びｐＨ６．５〜７．０を含む前記の第２の緩衝された溶液にて維持する、請求項１４に記載の方法。１６．前記の第１及び第２のサブユニットを原核細胞中で発現させる、請求項１に記載の方法。１７．前記の原核細胞が大腸菌である、請求項１６に記載の方法。１８．前記の第１のサブユニットを、第１の細胞中で発現させ、前記の第２のサブユニットを第２の細胞中で発現させる、請求項１６に記載の方法。１９．前記の第１のサブユニットを、プロモーターに機能的に結合した核酸でトランスフォームした細胞により発現させ、該核酸は、Seq．ID No．１の配列３５８〜８９１を含む、請求項１８に記載の方法。２０．前記の第１のサブユニットを、プロモーターに機能的に結合した核酸でトランスフォームした細胞により発現させ、該核酸は、Seq．ID No．１の配列９９４〜１２１２を含む、請求項１８に記載の方法。２１．ＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物に精製条件を課する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。２２．前記の精製条件が粒子の除去を含む、請求項２１に記載の方法。２３．前記の粒子を濾過及び／又は遠心分離により除去する、請求項２２に記載の方法。２４．前記の精製条件がクロマトグラフィーを含む、請求項２１に記載の方法。２５．前記のクロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーによるものである、請求項４に記載の方法。２６．前記のクロマトグラフィーが高速蛋白質液体クロマトグラフィーである、請求項２４に記載の方法。２７．前記の高速蛋白質液体クロマトグラフィーを、塩濃度０〜５ｍＭを有する第１のクロマトグラフィー用緩衝液にて行ない、該塩濃度を、安定なベースラインが達成された後に増大させる、請求項２６に記載の方法。２８．前記の第１の緩衝液がＨＥＰＥＳ、１０〜３０％（ｖ／ｖ）グリセロール及びＥＤＴＡを含む、請求項２７に記載の方法。２９．前記の塩が塩化ナトリウムである、請求項２７に記載の方法。３０．阻害剤−ＩＣＥ合成物を形成する工程を更に含み、該阻害剤−ＩＣＥ合成物は、ＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の阻害剤と共に該ＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物の混合物を作ることにより形成される、請求項１に記載の方法。３１．塩を阻害剤−ＩＣＥ合成物から透析により除去する、請求項３０に記載の方法。３２．前記の阻害剤−ＩＣＥ合成物をクロマトグラフィーにより精製する、請求項２８に記載の方法。３３．前記のクロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーである、請求項３２に記載の方法。３４．前記のイオン交換クロマトグラフィーが高速蛋白質液体クロマトグラフィーである、請求項３３に記載の方法。３５．前記のクロマトグラフィーを、第１の緩衝液及び第２の緩衝液を含む緩衝液にて行ない、該第２の緩衝液は該第１の緩衝液より高い塩濃度を有し、該緩衝液は該第１の緩衝液をベースラインが安定化するまで含み、そして、該第２の緩衝液を徐々に増大して塩濃度を増して該阻害剤ＩＣＥ合成物を溶出させる、請求項３４に記載の方法。３６．前記の第１の緩衝液が、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．０〜７．０）であり、前記の第２の緩衝液が、１００ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．０〜７．０）及び５００ｍＭＮａＣｌである、請求項３５に記載の方法。３７．前記の緩衝液が、最初に、前記の第１の緩衝液からなり、この第１の緩衝液を前記の第２の緩衝液で希釈して９１％の第１の緩衝液及び９．０％の第２の緩衝液の濃度にする、請求項３６に記載の方法。３８．ＩＣＥ阻害剤複合体を沈澱により精製する、請求項３０に記載の方法。３９．前記の沈澱を、乾燥硫酸アンモニウムを用いて達成する、請求項３８に記載の方法。４０．前記の阻害剤−ＩＣＥ合成物の結晶を形成することを更に含み、該結晶は該阻害剤−ＩＣＥ合成物に結晶化条件を課することにより形成される、請求項３０に記載の方法。４１．合成物質としての、２つのサブユニットを含む天然に存在しない組換えＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物であって、それらのサブユニットは、変性され、合わされそして折り畳まれて該天然に存在しないＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物を形成する、上記の天然に存在しないＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物。４２．サブユニットの少なくとも１つを原核細胞により作る、請求項４１に記載の合成物。４３．前記のＩＣＥ又はエＣＥ様合成物が、原核細胞により別々に発現される１０〜１２ｋＤａサブユニット及び１８〜２４ｋＤａサブユニットを有する、請求項４１に記載の合成物。４４．阻害剤−ＩＣＥ複合体を形成するように前記のＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物と複合体化した阻害剤を含む、請求項４１に記載の合成物。４５．前記の阻害剤−ＩＣＥ複合体が、該阻害剤ＩＣＥ複合体が結晶を形成することを可能にする純度を有する、請求項４４に記載の合成物。４６．合成物としての、ＩＣＥ阻害剤と複合体化されたＩＣＥ又はＩＣＥ様合成物を含む結晶。４７．前記の阻害剤が、アセチル−チロシン−バリン−アラニン−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ₂ＣＯＯＨ）ＣＯ−ＣＨ₂Ｃｌ（式中、すべてのキラル中心は天然のＬ−アミノ酸と同じである）である、請求項４６に記載の合成物。