JPH10503085A - 多価で生理学的に分解可能な炭水化物リセプター・ブロッカーの酵素的糖鎖付加反応による製造法及び炭水化物構成要素の製造のためのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、その全体または分解生産物の形のいずれかにおいて、生体内にて不寛容反応を起こさない、多価のポリマーに基づいた炭水化物リセプター・ブロッカーの製造法に関する。リセプター・ブロッカーの炭水化物側鎖は、水性緩衝液等において、そして生分解性ポリマーの直接上の均一相における酵素的糖鎖付加反応により集合する。この糖鎖付加反応の収率は公知方法の収率に比較して顕著に改善されており、概して反応は定量的に起こり、そして負荷密度をはっきりと増大する。さらに本発明により製造される炭水化物リセプター・ブロッカーによる遊離のオリゴサッカライドの製造法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 多価で生理学的に分解可能な炭水化物リセプター・ ブロッカーの酵素的糖鎖付加反応による製造法及び 炭水化物構成要素の製造のためのその使用 本発明は、その全体または分解生産物の形のいずれかにおいて、生体内にて不 寛容反応を起こさない、多価のポリマーに基づいた炭水化物リセプター・ブロッ カーの、酵素的糖鎖付加反応による製造法に関し、及び炭水化物構造単位(carbo hydrate building blocks)の製造のためのその使用に関する。 近年、生理学的に関連する認識過程における情報伝達体としての炭水化物の重 要性は詳細に研究され解読されてきた。リガンドの形で細胞表面上に配置し、特 異的リセプターとの結合を介することにより、この炭水化物は細胞内の情報交換 や細胞内の認識プロセスに決定的な役割を果たすことが可能となる。細胞表面の 炭水化物リガンドは、ウィルス、バクテリア、トキシン、レクチンに対する認識 ドメインである。それゆえこれらは、たとえば、バクテリアやウィルスの感染や 、たとえば、リューマチ関節炎、アレルギー、梗塞後の症候群、ショック、卒中 及び敗血症等の炎症プロセスの開始時に決定的な役割を果たす。従来の研究によ り、炎症プロセスにおいて、体内で内皮細胞により発現されるセレクチンは、炭 水化物リガンドによる白血球の炎症中心への吸着を仲介することが示されてきた 。 細胞接着に特に重要なのは、シアリル−ルイスＸ（sialyl-Lewis X）やシアリ ル−ルイスＡ(sialyl-Lewis A)のような、シアル酸化された、および／または、 フコース化された炭水化物である。天然のリガンドの代わりにリセプターに結合 することを意図された遊離 の炭水化物を用いた炎症疾患の治療は、リセプターと炭水化物の親和性が低いた め(１価のガラクトシドと対応するレクチンの間でKD〜10^-4Ｍ、D.T．Connolly e t al．J．Biol．Chem．257，939，(1982))に、極めて大量の炭水化物が投与され なければならず、目的を果たさない。 ２価の構造の中には特定のリセプターに対する結合が強いものがあることが、 Wongらにより記載されている（J．Am．Chem．Soc．115，7549，(1993)およびUS 5,254,676）。 多くのリガンドを表面に連結することによりリセプターとリガンドの相互作用 が増大することも知られている。細胞表面のノイラミン酸に結合するウィルス蛋 白質ヘマグルチニンを例に採り、このようなポリマーの使用による多価効果がリ ガンド−リセプター相互作用にどのように顕著な効果をもたらすかについて示さ れてきた（１価 K_D＝２×20^-4Ｍ、多価 K_D＝３×10^-7Ｍ、Spaltenstein et al． J．Am．Chem．Soc．113，686(1991)）。 現在まで使用されてきた表面は、リポソーム(N．Yamazaki，Int．J．Biochem ．24，99(1991); WO 91／19501; WO 91／19502)、ポリアクリルアミド（R.C．Ra thi et al．J．Polym．Sci．: Part A: Polym．Chem．29，1895，(1991)，S.− Ｉ．Nishimura et al．Macromolecules 24，4236(1991)）、ポリリジンまたは硫 酸多糖類である。これらの多価構造は、生体内で低い安定性しか有さないか、毒 性代謝物への分解により生体内で寛容化されないとの欠点を有する。ポリリジン か硫酸多糖類の場合は、細胞表面構造と非特異的な相互作用がある。欧州公開公 報0 089 938、0 089 939、0 089 940は鎖長が異なり、細胞表面に存在するリガ ンドまたは微生物にある リセプターと同一の炭水化物化合物を記載している。これらのケースにおける発 明的なアイデアは、各疾患の診断や治療を可能にするために、微生物の表面に位 置するリセプターを炭水化物化合物でブロックすることにある。炭水化物化合物 は、担体(carrier)に結合され得る。この担体は、なかんずく、抗体を生産する ために使用される。同様に、WO 92／02527は、固体担体に連結され、炎症過程を 診断するために使用される炭水化物構造単位を開示している。固体担体は、生理 学的系に対しては不活性であり、生理学的に分解されない。 逆に、EP 0 601 417 A2は、ポリマー表面上の炭水化物構造単位を運搬する、 生理学的に分解可能な、ポリマーを基本とする炭水化物リセプター・ブロッカー を開示している。ポリマーの表面に多価的に存在する炭水化物構造単位との相互 作用の増進、および、特異的な構造のブロックにより、医薬として改良された活 性がもたらされる。 該EP 0 601 417 A2に記載された炭水化物リセプター・ブロッカーは生理学的 に寛容であり、好適には70kD以下の分子量を有している。 さらに詳しくは、該EP 0 601 417 A2に開示された、生理学的に寛容で生理学 的に分解可能であり、ポリマーを基本とする炭水化物リセプター・ブロッカーは 以下の構造を有する。 炭水化物側鎖−スペーサー−親水性で生分解性のポリマー−（最適には）−ポ テンシエーター（potentiator）であり、 ここで、炭水化物の側鎖は、１から20の天然に存在する同一または異なった単 糖類単位から成り、かつ、天然または合成起源の一つ または二以上の二価性スペーサーを介して親水性で生分解性のポリマーと連結し ており、ここで親水性で生分解性のポリマーは、最適には、疎水性、親水性また はイオン性の性質を有する一つまたは二以上の基から成るか、あるいは、クロス リンカー(crosslinker)であるかまたは溶解性増強物質であるポテンシエーター にも連結している： EP 0 601 417 A2に開示された炭水化物リセプター・ブロッカーの炭水化物部 位は、たとえば、以下の糖残基から成り得る： Galβ1-4GlcNAc-； Galβ1-3GlcNAc-； SAα2-6Galβ1-4GlcNAc-； SAα2-3Galβ1-4GlcNAc-； SAα2-3Galβ1-3GlcNAc-； Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-； Galβ1-3(Fucα1-3)GlcNAc-； SAα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-； SAα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-； 炭水化物部位の他の好適な具体例は： シアリル−ルイスＸ、シアリル−ルイスＡ、VIM-2および次の血液型決定基ル イスＡ、Ｂ、Ｘ、ＹおよびＡ型¹、Ａ型²、Ｂ型¹、Ｂ型²およびＨ型¹およびＨ型² （R.U．Lemieux，Chem．Soc．Rev.，1978，423ページおよび1989，347ページ） である。 炭水化物部位の特に好適な具体例は、シアリル−ルイスＸ、シアリル−ルイス ＡまたはシVIM-2である。 シアリル−ルイスＸの式は：NeuNAcα2-3Galβ1-4-(Fucα1-3) GlcNAcであり、そしてシアリル−ルイスＡの式は：NeuNAcα2-3Galβ1-3-(Fucα 1-4)GlcNAcである。 VIM-2の式は：NeuNAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcで ある。 該EP 0 601 417 A2は炭水化物リセプター・ブロッカーの製造法を開示してい る。 記載された製法における炭水化物リセプター・ブロッカーの合成は、実験室の 規模で行われる。 このことは、本発明による炭水化物リセプター・ブロッカーは、ミリグラム量 からグラム量合成され、一方、その合成に必要な中間体、すなわち、親水性で生 分解性のポリマー、二価性スペーサーおよびポテンシエーターはグラム量からキ ログラム量調製し得ることを意味する。しかるに、炭水化物部位は例外を構成す る。それはミリグラムから１グラム量においてのみ合成され得る。このケースに おいて、文献にて開示されたオリゴ・サッカライドの合成模式図は、通常は定量 的収量を伴わない反応の後に得られる生産物の混合液が、シリカゲルでのカラム クロマトグラフィーにより精製されるようにデザインされている。この精製工程 は一般的に、工業的要求に見合う量を調製するためには費用がかかり過ぎかつ精 密過ぎ、せいぜい最終産物か価値の高い中間体を精製するために使用される位で ある。加えて、重金属化合物がオリゴ・サッカライドを合成するために、非常に しばしば使用される。薬理作用を伴った物質の合成のためにこのものを使用する ことは、炭水化物リセプター・ブロッカーについて将来的に医薬としての認可を 受けるとの展望に関しては、極めて異議を呼ぶものである。 記載された製造法においては、必要なオリゴ・サッカライドは、このオリゴ・ サッカライドが非常に多くの化学的および／または酵素化学的な合成段階により 集合した後にのみスペーサーにより生分解性ポリマーに連結する。この合成は、 当業者に知られたところの、オリゴ・サッカライドの集合（保護基、アノマー（ anomer）の形成、糖鎖付加反応の収率の低さ、非立体選択的な糖鎖付加反応、工 程が多すぎること）という問題のため極めて長たらしくかつ困難である。 炭水化物リセプター・ブロッカーの化学的および／または酵素化学的な合成に おける、首尾一貫した反応および精製の工程に非常に多くの努力が必要であると の観点より、近年、いくつかの固相合成が提唱されてきた。 オリゴ・ヌクレオチドとペプチドの確立された固相合成と対称的に、ポリマー の固相上におけるオリゴ・サッカライドの化学合成は、極めて多くの官能性とグ リコシドの連結に対する立体選択的な形成の必要性のため極めて困難である。Da nishefskyら(Science，260，1307，(1993))は、シリル・エーテル連結を介し、3 ,4−保護グリカールをポリスチレン・コポリマーへ連結している。後者はエポキ シドとして活性化され、オリゴ・サッカライドを生じるために別のグリカール・ アクセプターに連結し得る。Douglasら（J．Am．Chem．Soc．113，5095(1991)は 、PEG結合グルコース単位上のジまたはトリ・サッカライドの合成を記載してい る。Zehavi（J．Am．Chem．Soc．95，5673(1973)）は、ポリマーの固相として光 感受性のスチレン／ジビニル・ベンゼンのコポリマーを使用している。保護オリ ゴ・サッカライドは照射によりこのポリマーから消去される。 オリゴ・サッカライドの化学的固相合成の不利な点は： −ある場合には、糖鎖付加反応が不完全なこと −ドナー側とアクセプター側の両方に好適な炭水化物構造単位が限られているこ と、 −特定の反応に適切な保護基の必要性である。 ポリマー・マトリックス上のオリゴ・サッカライドの化学合成に関するこれら の不利益は、酵素的な糖鎖付加反応により避けることができる。この反応は保護 基なしに行われ、絶対的に立体選択的であり、かつ、極めて多くのグリコシルト ランスフェラーゼやヌクレオチド活性化糖がグリコシルドナーとして入手可能な ため、非常に広く採用され得る。 1980年の昔に、NunozとBarker(Biochemistry 19，489(1980))は、ヘキサノー ルアミンのスペーサーを介してのアガロースに連結したＮ−アセチルグルコサミ ンの酵素的な糖鎖付加反応について記載した。しかるに、極めて多量のガラクト シル・トランスフェラーゼ酵素が使用された。U．Zehaviは、水に不溶および可 溶の両方の光感受性ポリマーの上でのガラクトシル・トランスフェラーゼを用い る酵素的ガラクトシル化について記載している。転移収率は最低で１％以下、最 高で36％であるU．Zehavi et al.，Carbohydrate Res．124，23(1983)，U．Zeha vi et al．Carbohydrate Res．128，160(1984)，U．Zehavi，Reactive Polymers 6，189(1987)，U．Zehavi et al．Glycoconjugate J．7，229(1990)およびU．Z ehavi Innovation Perspect．Solid Phase Synthesis Collect．Paper，Int．Sy mp．1990，389〜396)。ポリマー上に得られたジサッカライドはポリマーから光 の作用または酵素により消去される(U．Zehavi ら、Carbohydrate Res．133，339(1984))。 ニシムラら（Biochemical and Biophysical Research Comm．199，249-254(19 94)）は、水溶性のＮ−アセチルグルコサミン担持ポリアクリルアミドのステッ プワイズの酵素的糖鎖付加反応による、3′−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサ ミン側鎖を持つ水溶性ポリアクリルアミドの酵素的調製について記載している。 しかるに、この製法では達成された負荷密度が低いため、全収率も低い。さらに 最近の論文（Wongら、J．Am．Chem．Soc．116，1135(1994)）は、修飾シリカゲ ル上でのオリゴ・サッカライドの酵素的合成を記載している。酵素的な炭水化物 合成に必要な水性緩衝液におけるシリカゲルの不溶性のために、および、ペプチ ドを介して連結されたGlcNAc構造単位の負荷密度が低いため、３つの反応工程す べてにおいて糖鎖付加反応の低い収率しか達成されない。このように、ペプチド ・アンカーの酵素的切断の後に、要求される生産物が20％しか含まれず、使用さ れた前駆体が45％しか含まれない生産物の混合液が得られた。 WO 92／22661、WO 92／22565、WO 92／22563は、シアリトランスフェラーゼを 用いての、「非天然担体（人工的担体）」に連結したジサッカライドの酵素的糖 鎖付加反応を提唱している。「非天然担体」は、通常、例えば、牛血清アルブミ ン、KLH、HSA、ジフテリアまたは破傷風毒素等の抗原性としての性質を有する高 分子量または低分子量の担体か、生理学的系に不活性な固体担体である。 該技術状況に基づき、本発明の目的のひとつは、初めに記載された、多価の、 生理学的に寛容でかつ生理学的に分解可能な炭水化物リセプター・ブロッカーの 調製法であって、水性緩衝液系における、 および、生分解性ポリマーの直接上の均一相における酵素的糖鎖付加反応により リセプター・ブロッカーの炭水化物部位の集合が起こり、その糖鎖付加反応の収 率は公知の調製法の収率に比較して顕著に増進されており、反応は定量的に起こ り、かつ、そのポリマー上のオリゴ・サッカライドの負荷密度がはっきりと増大 している点で傑出している調製法を提供することにあり、そして遊離のオリゴ・ サッカライドの調製法の発明に従い調製された炭水化物リセプター・ブロッカー の使用を提供することにある。 この目的は、 a) 親水性で生分解性のポリマー単位、 b) 少なくとも一つのジまたはオリゴ・サッカライド単位、および、 c) そのものによりジまたはオリゴ・サッカライド単位がポリマー単位に連結し ている少なくとも一つの、二価性のスペーサー、 から成る生理学的に寛容でかつ生理学的に分解可能な、ポリマーを基礎とする炭 水化物リセプター・ブロッカーの調製法により、本発明により達成され、この調 製法は、モノまたはオリゴ・サッカライド、スペーサーおよび親水性で生分解性 のポリマーの化学的連結によりアクセプターを調製し、その後に一つまたは二以 上の他のモノサッカライド単位が酵素的糖鎖付加反応により付加されることから 成る。 この酵素的糖鎖付加反応は、立体選択的に、ポリマーの直接上で驚異的に高い 収率を伴って起こり、各々の糖鎖付加反応の工程は定量的に行われるので、所望 のドナーとともに、所望により何度も繰り返される。このようにして、収率が低 く、それゆえ生産物の混合 液が別の糖鎖付加反応工程を伴う技術状況とは対照的に、ポリマー上でのオリゴ ・サッカライド構造の直接的な集合により多価の炭水化物化合物を極めて容易に 、かつ高い収率で製造することが可能である。他の有利な点は、多価の炭水化物 化合物の単離が容易で均質であることである。 酵素的糖鎖付加反応に対するアクセプターは、モノまたはオリゴ・サッカライ ドと二価性スペーサーとの共有結合を形成し、次にモノまたはオリゴ・サッカラ イド−スペーサー複合体をポリマーに連結することにより調製される。 アクセプター上の酵素的糖鎖付加反応は、均一な水相中で、好適にはドナーと してのヌクレオチド活性化炭水化物およびグリコシルトランスフェラーゼを使用 して行われる。 水性培地は特定のグリコシルトランスフェラーゼに適合した緩衝液系でなけれ ばならず、この緩衝液系は好適には0.01Ｍから１Ｍの濃度であり、特定のグリコ シルトランスフェラーゼの活性化に必要な陽イオンを含むと有利である。 pHは6.0と8.5の間であり、好適には6.0と8.5の間であり、特に好適には7.0と7 .5の間である。 ドナーを等モルまたは過剰に添加する場合、アルカリ・フォスファターゼを反 応溶液に添加しなければならない。 0.01から10単位のグリコシルトランスフェラーゼが反応溶液に添加される。 酵素的糖鎖付加反応は10から40℃、好適には20から37℃、さらに好適には25か ら37℃、１から５日間行われる。 本発明は以下に詳細に説明される。 １．酵素的糖鎖付加反応に対するアクセプターの合成 酵素的糖鎖付加反応に対するアクセプターは、スペーサーを介し、親水性で生 分解性のポリマーに共有結合的に連結したモノまたはオリゴ・サッカライドから 成る。このポリマーは、ポテンシエーターを備えることができる。このアクセプ ターは当業者に知られた方法で合成される。アクセプターの個々の構造単位は以 下に説明する。 親水性生分解性ポリマー 定義すると、このポリマーは、一緒に直鎖状または枝分かれ鎖状に連結し、分 子量の分布を示し得る、少なくとも二つの同一または異なったモノマー単位から 成る。 このポリマーは、好適には、70kDより低いまたは等しい分子量のポリアミドま たはポリアンハイドライドとして連結したポリアミノ酸である。ポリマーの好適 な最小サイズは、低分子量の担体に比較して増大された血中残存時間を達成する ために２kDである。 ポリマーを基礎とする、炭水化物リセプター・ブロッカーの調製に適しており そして特に好適なポリアミノ酸は、例えばポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチ ル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド、ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド、ポリグルタメ ート、ポリ−Ｌ−リジン・メチルエステルフマルアミドおよびこれらの共重合体 のような、ポリアスパルトアミド、ポリスクシンイミド、ポリグルタメートおよ びポリリジン−フマルアミドである。 親水性で生分解性のポリマーは、当業者に知られた方法で調製 Switzerland，1991/92またはD．Braun，H．CherdronおよびW．Kern， Praktikum der Makromolekularen Organischen Chemie〔Practical る。 このように、例えば、ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド（PSI）は、160℃〜180℃ の温度で、アスパラギン酸に85％濃度のリン酸の作用により、Neriらの方法(J． Med．Chem.，16，893(1973))により得られる。室温またはそれよりやや上の温度 での、PSIポリマーとハイドロキシエチルアミンとの反応により、ポリ−α,β− (２−ヒドロキシエチル)−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド(PHEA)が得られる(Neriら、 上記)。PHEAのアルコール基は、慣用的な方法(USP 5,041,291)によりエステル化 され得る。PSIとエタノール・アミンとの部分的反応により、対応する共重合体 が得られる（USP 5,229,469）。PSIの塩基性加水分解は、ポリアスパラギン酸を 生じる（Giammonaら、Chem．Pharm．Bull．37(8)，2245（1989）に類似する）。 ヒドロキシ・エチルアミンとの反応に類似して、PSIは他のアミンとも反応さ せることができ（EP 0 548 794）、これは、ポテンシエーターとして作用すると ころの追加的官能基の導入を可能にする。 他の始発ポリマーとしての、ポリ−Ｌ−リジン・メチルエステルフマルアミド は、Ｌ−リジン・メチルエステルと塩化フマリルの境界相重縮合により調製され る（US 4,834,248）。メチル・エステル基は、直接にまたは、例えば、ｐ−ニト ロフェニル・エステルのように部分加水分解およびこれに続く活性化の後に、ア ミノ基を含むモノ、ジまたはオリゴ・サッカライドと反応させることができる。 類似した方法において、すなわち、ｐ−ニトロフェニル・エステ ルを使用して、ポリグルタルメートに基づくポリマー炭水化物リセプター・ブロ ッカーの調製が可能である（“Macromolecules as Drugs and as Carriers for Biologically active Materials”(D.A．Tirell編集，NY Acad．Sci.，NY，（19 85）67〜75ページのAndersonの記述に類似したポリマー合成)。 スペーサー スペーサー、または、共有結合的に連結したスペーサーおよび炭水化物から成 る化合物へのポリマーの共有結合的連結、並びに、スペーサー、または、共有結 合的に連結したスペーサーおよび炭水化物から成る化合物へのポリマーとポテン シエーターの共有結合的化合物の共有結合的連結は、反応基および活性化された 基の間の反応により行われる。この関連で、反応基がスペーサー、または、共有 結合的に連結したスペーサーおよび炭水化物から成る化合物の末端に位置するこ とおよび活性化された基がポリマー、または、共有結合的に連結したポリマーお よびポテンシエーターから成る化合物上に位置すること、並びに、活性化された 基がスペーサー、または、共有結合的に連結したスペーサーおよび炭水化物から 成る化合物の末端に位置することおよび反応基がポリマー、または、共有結合的 に連結したポリマーおよびポテンシエーターから成る化合物上に位置することの いずれもが可能である。反応基と活性化された基の間の反応は、当業者に知られ た、アルキル化、アシル化または二重結合への付加についての製造法により行わ れる。これらの製造法は、文献より当業者に知られている(Larock，R.C．Compre hensive Organic Transformations，1989，VCH Verlagsgesellschaft Weinheim) 。 スペーサーは、好適には、式Ｉを有する。 （モノ−またはオリゴ・サッカライド）−Ｏ− 〔Q¹-(CH₂)_p-Q²〕_r（ポリマー単位） Ｉ ここで、 ｐは１〜６の整数であり、そして ｒは１または２である。 アクセプターの炭水化物部分 酵素的糖鎖付加反応に対するアクセプターの炭水化物部分は、天然起源より得 るか、または、化学的、酵素化学的または酵素的に調製することができる。炭水 化物に適する天然起源は、生化学的文献より当業者に知られている。この文献に はオリゴ・サッカライドを精製するための当業者に知られた確立された方法につ いても同様に記述されている。 細胞表面リセプターとして認められている炭水化物の化学的、酵素的または酵 素化学的合成方法は化学文献および総説類から当業者に知られている。化学合成 については、例えばCarbohydrate Research，Elsevier Science Publishers B.U ．Amsterdam; Journal of Carbohydrate Chemistry，Marcel Dekker Inc．New Y ork; H．Paulsen，Angew．Chem．94，184(1982)および102，851(1990); R.R．Sc hmidt Angew．Chem．98，213(1987); H．Kunz．Angew．Chem．98，247（1987） がある。酵素的合成については、例 えばCarbohydrate Research，Elsevier Science Publishers B.U．Amsterdam; J ournal of Carbohydrate Chemistry，Marcel Dekker Inc．New York; Bednarski and Simon Enzymes in Carbohydrate Synthesis，ACS Symposium Series 466(1 991); K.G.I．Nilsson，Applied Biocatalysis 1991，117; S．David et al．Ad v．Carbo-hydr．Chem．Biochem．49，175(1991); Y．Ichikawa et al．Anal．Bi ochem．202，215(1992); D.G．Drueckhammer et al．Synthesis 1991，499; E.J ．Toone et al．Tetrahedron 45，5365(1989)がある。 このように調製されたモノ−またはオリゴ・サッカライドは、遊離の還元末端 を担持し、かつ、スペーサーに連結した形で得ることができる。このスペーサー は、化学的または酵素的糖鎖付加反応に対し、当業者に知られた方法により導入 される。 ２．酵素的糖鎖付加反応 酵素的糖鎖付加反応によるポリマーの炭水化物リセプター・ブロッカーの調製 のための発明に従う方法は以下に記載される。 酵素的糖鎖付加反応に対するアクセプターは、１において得られたように、ス ペーサーを介して親水性で生分解性のポリマーへ共有結合的に連結したモノ−ま たはオリゴ・サッカライドから成る。ポリマーはポテンシエーターを備えること ができる。アクセプターの酵素的糖鎖付加反応は、好適には、均一な液相で行わ れる。ヌクレオチド活性化炭水化物がドナーとして好適に使用され、酵素として グリコシルトランスフェラーゼが好適に使用される。 アクセプターは水性緩衝液系に溶解される。この緩衝液は特定のグリコシルト ランスフェラーゼに対し適しており、例えば、0.01Ｍ から１Ｍのカコジレート、HEPES、PIPES、MOPS、クエン酸塩、重炭酸塩等から成 り得る。このものは例えば、Mnのような、特定のグリコシルトランスフェラーゼ の活性化に必要な陽イオンを含む。 同様にpHは特定のグリコシルトランスフェラーゼに適しており、6.0から8.5の 間であり、好適には6.5から7.8の間であり、特に好適には、7.0から7.5の間であ る。 アクセプターが水性緩衝液系に溶解された後ドナーが添加される。後者はヌク レオチド活性化糖またはヌクレオチド活性化糖の類縁体である。このヌクレオチ ド活性化糖は購入できる場合もあるが、当業者に知られた方法により化学的また は酵素的合成によっても調製することもでき、天然起源より単離することもでき る。このことは類縁体にも適用される。ドナーは1.1から２倍程度添加されるこ ともあり、また、公知の方法によりイン・シトゥーで再生される（例えばY．Ich ikawa et al．J．Am．Chem．Soc．114，9283(1992)，C.H．Wong et al．J．Org ．Chem．57，4343(1992)，Y．Ichikawa et al．J．Am．Chem．Soc．113，6300(1 991)およびC.H．Wong et al．J．Org．Chem．47，5416(1982)。 酵素的糖鎖付加反応に使用されるドナーは、通常は、UDP−ガラクトースであ る。しかるに、UDP−ガラクトースを形成するために、酵素UDP−ガラクトース・ ４−エピメラーゼによりイン・シトゥーで酵素的にエピマー化され得るUDP−グ ルコースから開始することも可能である(J．Thiemら、Angew．Chem．102，78(19 90))。 酵素的糖鎖付加反応においてドナーが等モル量または過剰に使用された場合、 グリコシルトランスフェラーゼの阻害を阻止するため、アルカリ・フォスファタ ーゼの添加により反応において遊離された UDPを酵素的に分解することが必要である(C．Unverzagtら、J．Am．Chem．Soc．112 ，9308(1990))。 ヌクレオチド活性化糖は、UDP−グルコース、UDP−ガラクトース、UDP−Ｎ− アセチルグルコサミン、UDP−Ｎ−アセチルガラクトサミン、UDP−グルクロン酸 、CMP−ノイラミン酸、GDP−フコース、GDP−マンノース、dTDP−グルコースお よびdUDP−ガラクトースである。ヌクレオチド活性化糖の調製のための当業者に 知られた方法は、例えば：（M．Kittelmann et al．Annals of the New York Ac ademy of Science Vol．672 Enzymes Engineering，444〜450ページ(1992)，S． Makino et al．Tetrahedron Lett．34，2775(1993)，T.J．Martin et al．Tetra hedron Lett．34，1765(1993)，欧州特許出願0 524 143 A1; K．Ikeda，Carbohy drate Res．224，123(1992)，E.L．Kean Glycobiology 1，441(1991); Y．Ichik awa et al．J．Org．Chem．57，2943(1992)，K．Adelhorst et al．Carbohydrat e Research 242，69(1993)，R.R．Schmidt et al．Lieb．Ann．Chem．1991，121 ，R．Stiller et al．Lieb．Ann．Chem．1992，467; J.E．Heidlas et al．J．O rg．Chem．57，146(1992)，J.E．Heidlas Acc．Chem．Res．25，307(1992)，E.S ．Simon et al．J．Org．Chem．55，1834(1990)，C.H．Wong et al．J．Org．Ch em．57，4343(1992)およびJ.E．Pallanca et al．J．Chem．Soc．Perkin Trans ．１ 1993，3017に記述されている。 特定のヌクレオチド活性化糖をリセプターに転位することのできる0.01から10 単位のグリコシルトランスフェラーゼが、緩衝液系に溶解されたアクセプターお よびヌクレオチド活性化糖に添加される。 グリコシルトランスフェラーゼは、購入できる場合もあるが、天然期限から単 離することまたは組換え技術で得ることもできる。本発明に従った製造法を目的 とする酵素的糖鎖付加反応で使用され得るグリコシルトランスフェラーゼの例は 、β−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ(R．Barker et al．J．Biol．Chem ．247，7135(1972)およびC.H．Krezhorn et al．Eur．J．Biochem．212，113(19 93))、Gal−β−１−４−GlcNAc α−２−６−シアリルトランスフェラーゼ（J. C．Paulson et al．J．Biol．Chem．252，2363(1977)，Higa et al．J．Biol．C hem．250，8838(1985)およびJ．Weinstein et al．J．Biol．Chem．257，13835( 1982)）、Gal−β−１−３−GalNAc α−２−３−シアリルトランスフェラーゼ （W．Gillespie et al．J．Biol．Chem．267，21004(1992)）、Gal-β−１−3(4 )−GalNAc α−２−３−シアリルトランスフェラーゼ(J．Weinstein et al．J． Biol．Chem．257，13835(1982)およびM．Nemansky et al．Glycoconjugate J．1 0 ，99(1993))、GalNAcα−２−６−シアリルトランスフェラーゼ(H.J: Gross et al．Biochemistry 28，7386(1989))、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフ ェラーゼ(R．Oehrlein et al．Carbohydrate Res．244，149(1993)，T．Szumilo et al．Biochemstry 26，5498(1987)，O．Hindsgaul et al．J．Biol．Chem．2 66 ，17858(1991)およびG.C．Look et al．J．Org．Chem．58，4326(1993)）、α −１−３−フコシルトランスフェラーゼ(B.W．Weston，J．Biol．Chem．267，41 52(1992))、α−１−２−フコシルトランスフェラーゼ（T.A．Beyer，J．Biol． Chem．255，5364(1980)）、α−３／４−フコシルトランスフェラーゼ（P.H．Jo hnson Glycoconjugate J．9，241 (1992)）、α−１−２−マンノシルトランスフェラーゼ(P．Wang，J．Org．Chem ．58，3985(1993))、一般的記述：T.A．Beyer et al．Advances in Enzymology Vol．52，23〜175(1981)，WO 93／13198である。 酵素的糖鎖付加反応は、10から40℃、好適には20から37℃、特に好適には25か ら37℃で、１から５日間行われる。 仕上げのために、反応後の生成物溶液は、クロマトグラフィー法（TLC、HPLC ）により同定可能であるが、２回−蒸留水に対して透析される。次に、炭水化物 リセプター・ブロッカーは、例えば、ゲル・クロマトグラフィーのようなクロマ トグラフィー法によりさらに精製され得る。 本発明に従った製造法は、特に以下のオリゴ−またはジサッカライド単位を伴 った炭水化物リセプター・ブロッカーの調製に適している。 Galβ1-4GlcNAc-； Galβ1-3GlcNAc-； SAα2-6Galβ1-4GlcNAc-； SAα2-3Galβ1-4GlcNAc-； SAα2-3Galβ1-3GlcNAc-； Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-； Galβ1-3(Fucα1-3)GlcNAc-； SAα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc-； SAα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-； シアリル−ルイスＸ、シアリル−ルイスＡ、VIM-2および次の抗原決定基ルイ スＡ、Ｂ、Ｘ、ＹおよびＡ型¹、Ａ型²、Ｂ型¹、Ｂ型²およびＨ型¹、Ｈ型²(R.U． Lemieux，Chem．Soc．Rev.，1978,423ページおよび1989，347ページ)そして、さ らに、シアリル−ルイスＸ、シアリル−ルイスＡまたはVIM-2 シアリル−ルイスＸの式はNeuNAcα2-3Galβ1-4-(Fucα1-3)GlcNAcであり、そ してシアリル−ルイスＡの式はNeuNAcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcである。V IM-2の式はNeuNAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcである。 合成法の実施例は以下に記載される。 炭水化物部位を伴ったポリマーの、一方では二つの機能を有するスペーサーと 、他方ではポテンシエーターとの、共有結合を形成するための反応： 実施例 １ １−（６−アミノヘキシル）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グル コピラノシド ２−アミノ−２−デオキシグルコース・塩酸塩はR.U．Lemieuxらの方法（ACS Symp．Ser．39，90(1976)）により、無水フタル酸との反応およびこれに続く無 水酢酸／ピリジンとの反応により、1,3,4,6−テトラアセチル−２−Ｎ−アセチ ル−２−デオキシグルコースへ変換される。Nicolaouらの方法(J．Am．Chem．So c．112，3695(1990))による四塩化スズ／チオフェノール処理により、対応する １−チオフェニル誘導体が得られる。後者は、B.A．Silwanisらの方法（J．Carb ohydr．Chem．10，1067(1991)）により６−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル） アミノヘキサノールと反応する。ア セチルおよびフタロイル保護基は、K.C．Nicolaouらの方法(J．Am．Chem．Soc． 114，3127(1992))と類似した方法で、無水ヒドラジンにより切断された。ベンジ ル保護基(H2／Pd(OH)2、MeOH)の消去の前に、遊離のアミノ基は、遊離の水酸基 の存在下で、過剰の無水酢酸により選択的にアセチル化された。１−（６−アミ ノヘキシル）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシドが 得られた。 実施例 ２ ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘ キシル−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノース（ポリ− Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−Ｄ,Ｌ−アスパルト−アミド−C₆−GlcNAc ） PSI（500mg，分子量24,000）を２mlのDMFに溶解し、DMF 2.5ml中の225mg（0.7 1mmol）の１−（６−アミノヘキシル）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β −Ｄ−グルコピラノシド(GlcNAc−C₆−NH₂)を添加した。混合物を窒素下、室温 で5.5時間攪拌した。次に40mlの１−ブタノールにより沈殿が行われ、得られた ポリマーはメタノールで洗浄された。DMFからの１−ブタノール中での２回目の 沈殿の後、生成物は再びメタノールで洗浄され、次いでオイル真空ポンプ下で乾 燥された。 収量：490mg NMRによる置換の程度：12.5％ 実施例 ３ ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘ キシル−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ− グルコピラノース（ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−Ｄ,Ｌ−アスパ ルト−アミド−C₆−GlcNAc） 実施例２と同様にして、320mgのPSI(分子量24,000)を、300mgの１−（６−ア ミノヘキシル）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド （GlcNAc-C₆−NH₂）と反応させ、DMFから１−ブタノールにより２回の沈殿処理 がなされた。 収量：383mg NMRによる置換の程度：18.5％ 実施例 ４ ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘ キシル−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノース（ポリ− Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−Ｄ,Ｌ−アスパルト−アミド−C₆−GlcNAc ） 実施例２と同様にして、480mgのPSI(分子量9,600)を、210mgの１−（６−アミ ノヘキシル）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド（ GlcNAc−C₆−NH₂）と反応させ、DMFから１−ブタノールにより２回の沈殿処理が なされた。 収量：485mg NMRによる置換の程度：12.5％ 実施例 ５ ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘ キシル−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノース（ポリ− Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−Ｄ,Ｌ−アスパルト−アミド−C₆−GlcNAc ） 実施例２と同様にして、300mgのPSI(分子量9,600)を280mgの１ −（６−アミノヘキシル）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコ ピラノシド（GlcNAc−C₆−NH₂）と反応させ、DMFから１−ブタノールにより２回 の沈殿処理がなされた。 収量：331mg NMRによる置換の程度：18％ 実施例 ６ ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc） 実施例２からのPSI−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc(200mg)を２mlのDMF に溶解し、新たに蒸留されたヒドロキシエチルアミン（81mg）を添加した。窒素 下、室温で16時間攪拌後、１−ブタノールにより沈殿させた。ポリマーはエタノ ールで洗浄され、H₂Oに溶解され、凍結乾燥された。 収量：180mg NMRによる置換の程度：87.5％HEA、12.5％GlcNAc−C₆−NH₂ 実施例 ７ ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc） 実施例３からのPSI−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc(100mg)を２mlのDMF に溶解し、新たに蒸留されたヒドロキシエチルアミン（41mg）を添加した。窒素 下、室温で16時間攪拌後、１−ブタノー ルにより沈殿させた。ポリマーはエタノールで洗浄され、H₂Oに溶解され、凍結 乾燥された。 収量：112mg NMRによる置換の程度：81.5％HEA、18.5％GlcNAc−C₆−NH₂ 実施例 ８ ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc） 実施例４からのPSI−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc(150mg)を２mlのDMF に溶解し、新たに蒸留されたヒドロキシエチルアミン（61mg）を添加した。窒素 下、室温で16時間攪拌後、１−ブタノールにより沈殿させた。ポリマーはエタノ ールで洗浄され、H₂Oに溶解され、凍結乾燥された。 収量：147mg NMRによる置換の程度：87.5％HEA、12.5％GlcNAc-C₆−NH₂ 実施例 ９ ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc） 実施例５からのPSI−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc(150mg)を２mlのDMF に溶解し、新たに蒸留されたヒドロキシエチルアミン（61mg）を添加した。窒素 下、室温で16時間攪拌後、１−ブタノールにより沈殿させた。ポリマーはエタノ ールで洗浄され、H₂Oに溶 解され、凍結乾燥された。 収量：127mg NMRによる置換の程度：82％HEA、18％GlcNAc−C₆−NH₂ 実施例 10 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc） 実施例２からのPSI−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc(170mg)を２mlのDMF に溶解し、新たに蒸留されたヒドロキシエチルアミン（43mg）を添加した。窒素 下、室温で４時間攪拌後、１−ブタノールにより沈殿させた。ポリマーはエタノ ールで洗浄され、H₂Oに溶解され、凍結乾燥された。 収量：160mg NMRによる置換の程度：61.5％HEA、12.5％GlcNAc−C₆−NH₂ 実施例 11 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc） 実施例３からのPSI−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc(120mg)を２mlのDMＦ に溶解し、新たに蒸留されたヒドロキシエチルアミン（30mg）を添加した。窒素 下、室温で４時間攪拌後、１−ブタノールにより沈殿させた。ポリマーはエタノ ールで洗浄され、H₂Oに溶解され、凍結乾燥された。 収量：126mg NMRによる置換の程度：45.5％HEA、18.5％GlcNAc−C₆−NH₂ 実施例 12 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc） 実施例４からのPSI−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc(150mg)を２mlのDMF に溶解し、新たに蒸留されたヒドロキシエチルアミン（38mg）を添加した。窒素 下、室温で４時間攪拌後、１−ブタノールにより沈殿させた。ポリマーはエタノ ールで洗浄され、H₂Oに溶解され、凍結乾燥された。 収量：146mg NMRによる置換の程度：56％HEA、12.5％GlcNAc−C₆−NH₂ 実施例 13 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc） 実施例５からのPSI−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc(150mg)を２mlのDMF に溶解し、新たに蒸留されたヒドロキシエチルアミン（38mg）を添加した。窒素 下、室温で４時間攪拌後、１−ブタノールにより沈殿される。ポリマーはエタノ ールで洗浄され、H₂Oに溶解され、凍結乾燥された。 収量：143mg NMRによる置換の程度：50％HEA、12.5％GlcNAc−C₆−NH₂ 実施例 14 ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−α,β−（５−カルボキシペンチル）−Ｄ,Ｌ− アスパルトアミド 500mgのPSI（分子量9,600）を２mlのDMFに溶解し、８mlのフォルミドに溶解し た1.38ｇの６−アミノヘキサン酸、および１mlのトリエチルアミンを添加した。 混合物は45℃で13時間撹拌され、次いで１−ブタノールにより沈殿させた。ポリ マーはメタノールで洗浄し、H₂O中に取り上げられ、凍結乾燥された。 収量：350mg NMRによる置換の程度：８％アミノヘキサン酸 実施例 15 ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−（５−カルボキシペンチル）−Ｄ, Ｌ−アスパルトアミド 500mgのPSI(分子量24,000)を２mlのDMFに溶解し、４mlのフォルミドに溶解し た690mgの６−アミノヘキサン酸、および１mlのトリエチルアミンを添加した。 混合物は室温で３日間、45℃で５時間撹拌され、次いで１−ブタノールにより沈 殿させた。ポリマーはメタノールで洗浄し、H₂O中に取り上げられ、凍結乾燥さ れた。 収量：470mg NMRによる置換の程度：12.5％アミノヘキサン酸 実施例 16 ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−（５−カルボキシペンチル）−Ｄ, Ｌ−アスパルトアミド−コ−α,β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル− ２−デオキシ−２−アセトアミド−β −Ｄ−グルコピラノース（PCPA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc） 実施例14からの100mgのPCPAを２mlのH₂Oに溶解し、20mgの１−（６−アミノヘ キシル）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド(GlcNA c−C₆−NH₂)を添加した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ ルボジイミド塩酸塩(EDC)を20mgずつ４回にわたって36時間の間に添加した。透 析および凍結乾燥後に生成物が残った。 収量：112mg NMRによる置換の程度：８％GlcNAc−O(CH₂)₆NH₂ 実施例 17 ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−（５−カルボキシペンチル）−Ｄ, Ｌ−アスパルトアミド−コ−α,β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル− ２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノース（PCPA−コ−アス パルトアミド−C₆−GlcNAc） 実施例15からの100mgのPCPAを２mlのH₂Oに溶解し、20mgの１−（６−アミノヘ キシル）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノシド(GlcNA c−C₆−NH₂)を添加した。36時間に渡って４回に分け、20mg分の１−エチル−３ −（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(EDC)を20mgずつ４回 にわたって36時間の間に添加した。透析および凍結乾燥後に生成物が残った。 収量：137mg NMRによる置換の程度：12.5％GlcNAc−O(CH₂)₆NH₂ 酵素的ガラクトシル化反応 実施例 18 ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−アスパルトアミド−C₆−GlcNAcの酵 素的ガラクトシル化反応 実施例２からのポリマー50mgを10mlの0.05Ｍ HEPES緩衝液pH7.5に溶解し、MnC l₂ ２mg、UDP−グルコース55mgおよびラクトアルブミン１mgを添加した。２単位 のUDP−ガラクトース４−エピメラーゼ、２単位のガラクトシルトランスフェラ ーゼおよび40単位のアルカリフォスファターゼ（牛腸由来）添加後、混合物を25 ℃で８日間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてセファデックスＧ10上 でクロマトグラフィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：74mg NMRによるLacNAcの置換の程度：12.5％ 実施例 19 ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−アスパルトアミド−C₆−GlcNAcの酵 素的ガラクトシル化反応 実施例３からのポリマー50mgを10mlの0.05Ｍ HEPES緩衝液pH7.5に溶解し、MnC l₂ ２mg、UDP−グルコース55mgおよびラクトアルブミン１mgを添加した。２単位 のUDP−ガラクトース４−エピメラーゼ、２単位のガラクトシルトランスフェラ ーゼおよび40単位のアルカリフォスファターゼ（牛腸由来）添加後、混合物を25 ℃で８日間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてセファデックスＧ10上 でクロマトグラフィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：76mg NMRによるLacNAcの置換の程度：18.5％ 実施例 20 ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−アスパルトアミド−C₆−GlcNAcの酵 素的ガラクトシル化反応 実施例４からのポリマー50mgを10mlの0.05Ｍ HEPES緩衝液pH7.5に溶解し、MnC l₂ ２mg、UDP−グルコース55mgおよびラクトアルブミン１mgを添加した。２単位 のUDP−ガラクトース４−エピメラーゼ、２単位のガラクトシルトランスフェラ ーゼおよび40単位のアルカリフォスファターゼ（牛腸由来）添加後、混合物を25 ℃で８日間保温した。水で透析した後凍結乾燥され、続いてセファデックスＧ10 上でクロマトグラフィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：77mg NMRによるLacNAcの置換の程度：12.5％ 実施例 21 ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシニミド−コ−α,β−アスパルトアミド−C₆−GlcNAcの酵素 的ガラクトシル化反応 実施例５からのポリマー50mgを10mlの0.05Ｍ HEPES緩衝液pH7.5に溶解し、MnC l₂ ２mg、UDP−グルコース55mgおよびラクトアルブミン１mgを添加した。２単位 のUDP−ガラクトース４−エピメラーゼ、２単位のガラクトシルトランスフェラ ーゼおよび40単位のアルカリフォスファターゼ（牛腸由来）添加後、混合物を25 ℃で８日間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてセファデックスＧ10上 でクロマトグラフィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：78mg NMRによるLacNAcの置換の程度：18％ 実施例 22 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−ａ, ｂ−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc）の 酵素的ガラクトシル化反応 実施例６からのポリマー50mgを10mlの0.05Ｍ HEPES緩衝液pH7.5に溶解し、MnC l₂ ２mg、UDP−グルコース40mgおよびラクトアルブミン１mgを添加した。２単位 のＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ、２単位のガラクトシルトランスフェ ラーゼおよび40単位のアルカリフォスファターゼ（牛腸由来）添加後、混合物を 25℃で７日間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてセファデックスＧ10 上でクロマトグラフィーに付された。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：70.6mg NMRによるLacNAcの置換の程度：12.5％ 実施例 23 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc）の 酵素的ガラクトシル化反応 実施例７からのポリマー50mgを10mlの0.05M HEPES緩衝液pH7.5に溶解し、MnCl₂ ２mg、UDP−グルコース40mgおよびラクトアルブミン１mgを添加した。２単位 のUDP−ガラクトース４−エピメラーゼ、２単位のガラクトシルトランスフェラ ーゼおよび40単位のアルカリ フォスファターゼ（牛腸由来）添加後、混合物を25℃で７日間保温した。水で透 析した後凍結乾燥し、続いてセファデックスＧ10上でクロマトグラフィーに付し た。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：69mg NMRによるLacNAcの置換の程度：18.5％ 実施例 24 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc）の 酵素的ガラクトシル化反応 実施例８からのポリマー50mgを10mlの0.05Ｍ HEPES緩衝液pH7.5に溶解し、MnC l₂ ２mg、UDP−グルコース40mgおよびラクトアルブミン１mgを添加した。２単位 のUDP−ガラクトース４−エピメラーゼ、２単位のガラクトシルトランスフェラ ーゼおよび40単位のアルカリフォスファターゼ（牛腸由来）添加後、反応液を25 ℃で７日間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてセファデックスＧ10上 でクロマトグラフィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：55mg NMRによるLacNAcの置換の程度：12.5％ 実施例 25 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ −アスパルトアミド−C₆−GlcNAc）の酵素的ガラクトシル化反応 実施例９からのポリマー50mgを10mlの0.05Ｍ HEPES緩衝液pH7.5に溶解し、MnC l₂ ２mg、UDP−グルコース40mgおよびラクトアルブミン１mgを添加した。２単位 のUDP−ガラクトース４−エピメラーゼ、２単位のガラクトシルトランスフェラ ーゼおよび40単位のアルカリフォスファターゼ（牛腸由来）添加後、反応液を25 ℃で７日間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてセファデックスＧ10上 でクロマトグラフィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：55mg NMRによるLacNAcの置換の程度：18％ 実施例 26 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc）の 酵素的ガラクトシル化反応 実施例10からのポリマー50mgを10mlの0.05Ｍ HEPES緩衝液pH7.5に溶解し、MnC l₂ ２mg、UDP−グルコース40mgのおよびラクトアルブミン１mgを添加した。２単 位のUDP−ガラクトース４−エピメラーゼ、２単位のガラクトシルトランスフェ ラーゼおよび40単位のアルカリフォスファターゼ（牛腸由来）添加後、混合物を 25℃で７日間保温した。水で透析した後凍結乾燥され、続いてセファデックスＧ 10上でクロマトグラフィーに付した。再び凍結乾燥した後生成が残った。 収量：54mg NMRによるLacNAcの置換の程度：12.5％ 実施例 27 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc）の 酵素的ガラクトシル化反応 実施例11からのポリマー50mgを10mlの0.05Ｍ HEPES緩衝液pH7.5に溶解し、MnC l₂ ２mg、UDP−グルコース40mgおよびラクトアルブミン１mgを添加した。２単位 のUDP−ガラクトース４−エピメラーゼ、２単位のガラクトシルトランスフェラ ーゼおよび40単位のアルカリフォスファターゼ（牛腸由来）添加後、混合物を25 ℃で７日間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてセファデックスＧ10上 でクロマトグラフィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：71mg NMRによるLacNAcの置換の程度：18.5％ 実施例 28 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc）の 酵素的ガラクトシル化反応 実施例12からのポリマー50mgを10mlの0.05Ｍ HEPES緩衝液pH7.5に溶解し、MnC l₂ ２mg、UDP−グルコース40mgおよびラクトアルブミン１mgを添加した。２単位 のUDP−ガラクトース４−エピメラーゼ、２単位のガラクトシルトランスフェラ ーゼおよび40単位のアル カリフォスファターゼ（牛腸由来）添加後、混合物を25℃で７日間保温した。水 で透析した後凍結乾燥し、続いてセファデックスＧ10上でクロマトグラフィーに 付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：66mg NMRによるLacNAcの置換の程度：12.5％ 実施例 29 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−GlcNAc）の 酵素的ガラクトシル化反応 実施例13からのポリマー50mgを10mlの0.05Ｍ HEPES緩衝液pH7.5に溶解し、MnC l₂ ２mg、UDP−グルコース40mgおよびラクトアルブミン１mgを添加した。２単位 のUDP−ガラクトース４−エピメラーゼ、２単位のガラクトシルトランスフェラ ーゼおよび40単位のアルカリフォスファターゼ（牛腸由来）添加後、混合物を25 ℃で７日間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてセファデックスＧ10上 でクロマトグラフィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：64mg NMRによるLacNAcの置換の程度：18％ 酵素的シアリル化（enzymatic sialylation） 実施例 30 ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−アスパルトアミド−C₆−LacNAcの酵 素的シアリル化 実施例18からの35mgのポリマーを２mlの0.05Ｍカコヂル酸ナトリウム緩衝液(s odium cacodylate buffer)pH7.8に溶解し、牛血清アルブミン1.5mg、MnCl₂ ２mg およびCMP−ノイラミン酸５mgを添加した。20ミリ単位の２−６−シアリルトラ ンスフェラーゼおよび20単位のアルカリフォスファターゼを添加し、25℃で８日 間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてバイオゲルP2上でクロマトグラ フィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：36.6mg 2,6−シアリル−LacNAcの置換の程度：12.5％ （0.65μmol／mgポリマー） 実施例 31 ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−アスパルトアミド−C₆−LacNAcの酵 素的シアリル化 実施例19からの30mgのポリマーを２mlの0.05Ｍカコヂル酸ナトリウム緩衝液(s odium cacodylate buffer)pH7.8に溶解し、牛血清アルブミン1.5mg、MnCl₂ ２mg およびCMP−ノイラミン酸５mgを添加した。20ミリ単位の２−６−シアリルトラ ンスフェラーゼおよび20単位のアルカリフォスファターゼを添加し、25℃で８日 間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてバイオゲルP2上でクロマトグラ フィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：32mg 2,6−シアリル−LacNAcの置換の程度：18.5％ （0.77μmol／mg ポリマー） 実施例 32 ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α−アスパルトアミド−C₆− LacNAcの酵素的シアリル化 実施例20からの30mgのポリマーを２mlの0.05Ｍカコヂル酸ナトリウム緩衝液(s odium cacodylate buffer)pH7.8に溶解し、牛血清アルブミン1.5mg、MnCl₂ ２mg およびCMP−ノイラミン酸５mgを添加した。20ミリ単位の２−６−シアリルトラ ンスフェラーゼおよび20単位のアルカリフォスファターゼを添加し、25℃で８日 間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてバイオゲルP2上でクロマトグラ フィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：21mg 2,6−シアリル−LacNAcの置換の程度：12.5％ （0.65μmol／mg ポリマー） 実施例 33 ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド−コ−α,β−アスパルトアミド−C₆−LacNAcの酵 素的シアリル化 実施例21からの35mgのポリマーを２mlの0.05Ｍカコヂル酸ナトリウム緩衝液(s odium cacodylate buffer)pH7.8に溶解し、牛血清アルブミン1.5mg、MnCl₂ ２mg およびCMP−ノイラミン酸５mgを添加した。20ミリ単位の２−６−シアリルトラ ンスフェラーゼおよび20単位のアルカリフォスファターゼを添加し、25℃で８日 間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてバイオゲルP2上でクロマトグラ フィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：38mg 2,6−シアリル−LacNAcの置換の程度：18％ （0.76μmol／mg ポリマー） 実施例 34 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノ シル）−（１−４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノ ース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−LacNAc）の酵素的シアリル化 実施例22からの35mgのポリマーを２mlの0.05Ｍカコヂル酸ナトリウム緩衝液(s odium cacodylate buffer)pH7.8に溶解し、牛血清アルブミン1.5mg、MnCl₂ ２mg およびCMP−ノイラミン酸５mgを添加した。20ミリ単位の２−６−シアリルトラ ンスフェラーゼおよび20単位のアルカリフォスファターゼを添加し、25℃で８日 間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてバイオゲルP2上でクロマトグラ フィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：29mg 2,6−シアリル−LacNAcの置換の程度：12.5％ （0.51μmol／mg ポリマー） 実施例 35 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノ シル）−（１−４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノ ース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−LacNAc）の酵素的シアリル化 実施例23からの35mgのポリマーを２mlの0.05Ｍカコヂル酸ナトリウム緩衝液(s odium cacodylate buffer)pH7.8に溶解し、牛血清アルブミン1.5mg、MnCl₂ ２mg およびCMP−ノイラミン酸５mgを添加した。20ミリ単位の２−６−シアリルトラ ンスフェラーゼおよび20単 位のアルカリフォスファターゼを添加し、25℃で８日間保温した。水で透析した 後凍結乾燥し、続いてバイオゲルP2上でクロマトグラフィーに付した。再び凍結 乾燥した後生成物が残った。 収量：29mg 2,6−シアリル−LacNAcの置換の程度：18.5％ （0.64μmol／mg ポリマー） 実施例 36 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノ シル）−（１−４）−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノース （PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−LacNAc）の酵素的シアリル化 実施例24からの35mgのポリマーを２mlの0.05Ｍカコヂル酸ナトリウム緩衝液(s odium cacodylate buffer)pH7.8に溶解し、牛血清アルブミン1.5mg、MnCl₂ ２mg およびCMP−ノイラミン酸５mgを添加した。20ミリ単位の２−６−シアリルトラ ンスフェラーゼおよび20単位のアルカリフォスファターゼを添加し、25℃で８日 間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてバイオゲルP2上でクロマトグラ フィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：34mg 2,6−シアリル−LacNAcの置換の程度：12.5％ （0.51μmol／mg ポリマー） 実施例 37 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−Ｏ− （β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−２−デオキシ−２−アセトアミ ド−β−Ｄ−グルコピラノース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−LacNAc）の 酵素的シアリル化 実施例25からの25mgのポリマーを２mlの0.05Ｍカコヂル酸ナトリウム緩衝液(s odium cacodylate buffer)pH7.8に溶解し、牛血清アルブミン1.5mg、MnCl₂ ２mg およびCMP−ノイラミン酸５mgを添加した。20ミリ単位の２−６−シアリルトラ ンスフェラーゼおよび20単位のアルカリフォスファターゼを添加し、25℃で８日 間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてバイオゲルP2上でクロマトグラ フィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：25mg 2,6−シアリル−LacNAcの置換の程度：18％ （0.63μmol／mg ポリマー） 実施例 38 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノ シル）−（１−４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノ ース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−LacNAc）の酵素的シアリル化 実施例26からの35mgのポリマーを２mlの0.05Ｍカコヂル酸ナトリウム緩衝液(s odium cacodylate buffer)pH7.8に溶解し、牛血清アルブミン1.5mg、MnCl₂ ２mg およびCMP−ノイラミン酸５mgを添加した。20ミリ単位の２−６−シアリルトラ ンスフェラーゼおよび20単位のアルカリフォスファターゼを添加し、25℃で８日 間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてバイオゲルP2上でクロマトグラ フィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：28mg 2,6−シアリル−LacNAcの置換の程度：12.5％ （0.54μmol／mg ポリマー） 実施例 39 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノ シル）−（１−４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノ ース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−LacNAc）の酵素的シアリル化 実施例27からの35mgのポリマーを２mlの0.05Ｍカコヂル酸ナトリウム緩衝液(s odium cacodylate buffer)pH7.8に溶解し、牛血清アルブミン1.5mg、MnCl₂ ２mg およびCMP−ノイラミン酸５mgを添加した。20ミリ単位の２−６−シアリルトラ ンスフェラーゼおよび20単位のアルカリフォスファターゼを添加し、25℃で８日 間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてバイオゲルP2上でクロマトグラ フィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：33mg 2,6−シアリル−LacNAcの置換の程度：18.5％ （0.69μmol／mg ポリマー） 実施例 40 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノ シル）−（１−４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノ ース（PHEA−コ−アスパル トアミド−C₆−LacNAc）の酵素的シアリル化 実施例28からの35mgのポリマーを２mlの0.05Ｍカコヂル酸ナトリウム緩衝液(s odium cacodylate buffer)pH7.8に溶解し、牛血清アルブミン1.5mg、MnCl₂ ２mg およびCMP−ノイラミン酸５mgを添加した。20ミリ単位の２−６−シアリルトラ ンスフェラーゼおよび20単位のアルカリフォスファターゼを添加し、25℃で８日 間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてバイオゲルP2上でクロマトグラ フィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：31mg 2,6−シアリル−LacNAcの置換の程度：12.5％ （0.55μmol／mg ポリマー） 実施例 41 ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−コ−α, β−Ｄ,Ｌ−アスパルトアミド−６−ヘキシル−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノ シル）−（１−４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−β−Ｄ−グルコピラノ ース（PHEA−コ−アスパルトアミド−C₆−LacNAc）の酵素的シアリル化 実施例29からの35mgのポリマーを２mlの0.05Ｍカコヂル酸ナトリウム緩衝液(s odium cacodylate buffer)pH7.8に溶解し、牛血清アルブミン1.5mg、MnCl₂ ２mg およびCMP−ノイラミン酸５mgを添加した。20ミリ単位の２−６−シアリルトラ ンスフェラーゼおよび20単位のアルカリフォスファターゼを添加し、25℃で８日 間保温した。水で透析した後凍結乾燥し、続いてバイオゲルP2上でクロマトグラ フィーに付した。再び凍結乾燥した後生成物が残った。 収量：15mg 2,6−シアリル−LacNAcの置換の程度：18％ （0.68μmol／mg ポリマー） 実施例 42 Ａ．組換可溶性セレクチン融合蛋白質への細胞接着に対するポリマー炭水化物リ セプター・ブロッカーの効果を調べるための一次アッセイ このアッセイは、セレクチンによる前骨髄性細胞の細胞接着に対するポリマー 結合性炭水化物単位の効果を検出するために使用される： ポリマー−結合性炭水化物単位の、Ｅ−およびＰ−セレクチン（それぞれELAM −１およびGMP−140の古い命名法）とそれらのリガンドとの相互作用に対する活 性を試験するために使用されるアッセイは、それぞれのケースにおいてこれらの 相互作用のうちひとつにのみ特異的である。リガンドは、前骨髄性細胞HL60細胞 上の表面構造として、その天然の形で提供される。HL60は、特異性において広く 異なるリガンドおよび接着分子を有しているので、このアッセイに要求される特 異性は、結合パートナーを介してのみ提供され得る。それぞれの場合のＥ−及び Ｐ−セレクチン中の細胞質外ドメインからの遺伝子操作された可溶性融合蛋白質 およびサブクラス・IgG１のヒト免疫グロブリンの定常領域が結合パートナーと して用いられる。 Ａ１．Ｌ−セレクチン−IGG１の調製 Walzらにより1990年に公表された遺伝学的構築物「EALM-Rg」が、可溶性Ｌ− セレクチンIgG１融合蛋白質を調製するために使用された。 発現のため、プラスミドDNAはDEAE−デキストランを使用してCOS−７細胞（AT CC）へトランスフェクトされた（分子生物学的方法：Ausubel，F.M.，Brent，R. ，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Struhl，K.およびSmith，J.A .，1990．Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley，Mew Yorkを 参照せよ）。トランスフェクションの７日後、培養上清が得られ、細胞および細 胞断片を除去するために遠心され、25mM Hepes pH7.0、0.3mM PMSF、0.02％アジ 化ナトリウムに調整され、＋４℃で貯蔵された。 Walz，G.，Aruffo，A.，Kolanus，W.，Bevilacqua，M.およびSeed，B．1990， ELAM−１による、骨髄性および腫瘍細胞上のシアリル−Lex決定基の認識、Seien ce 250，1132-1135。 Ａ２．Ｌ−セレクチン−IGG１の調製 Aruffoらにより1991年に公表された遺伝学的構築物「CD62Rg」が、可溶性Ｐ− セレクチンIgG１融合蛋白質を調製するために使用された。これに続く操作は、A 1で記載されたＬ−セレクチンIgG１の調製に対応する。 Aruffo，A.，Kolanus，W.，Walz，G.，Fredman，PおよびSeed，B．1991、骨髄 性および腫瘍細胞のスルファチドによるCD62／Ｐ−セレクチンの認識、Cell 67 ，35-44。 Ａ３．CD4−IGG１の調製 Zettlemeisslらにより1990年に公表された遺伝学的構築物「CD4:IgG１ヒンジ 」が、可溶性CD４−IgG１融合蛋白質を調製するために使用された。これに続く 操作は、A1で記載されたＬ−セレクチンIgG１の調製に対応する。 Zettelmeissl，G.，Gregersen，J.-P.-，Duport，J.M.，Mehdi，S.，Reiner， G.およびSeed，B．1990，ヒトCD4: 免疫グロブリン融合蛋白質の発現および特徴 把握、DNA and Cell Biology 9，347-353。 Ａ４．組換可溶性接着分子のHL60細胞接着アッセイのための操作 １．50mMのトリスpH9.5で希釈（１＋100）された100μlのヤギ抗−ヒトIgG抗体 （Sigma）が満たされた96ウェル・ミクロタイター・アッセイ・プレート(Nunc M axisorb)は室温で２時間保温される。抗体溶液を除去した後、PBSで一回洗浄さ れる。 ２．150μlのブロック用緩衝液が、室温で１時間、ウェル中に置かれる。ブロッ ク用緩衝液の組成は： 0.1％ゼラチン、１％BSA、５％子牛血清、0.2mM PMSF、0.02％アジ化ナトリ ウムである。ブロック用緩衝液を除去した後、PBSで一回洗浄される。 ３．適切にトランスフェクトされ、発現しているCOS細胞からの細胞培養上清100 μlがそれぞれのウェルにピペットで注入される。室温で２時間保温が行われる 。細胞培養上清を除去した後、PBSで一回洗浄される。 ４．20μlの結合緩衝液がウェルに置かれる。結合緩衝液は組成：50mM Hepes,， pH7.5；100mM NaCl；１mg／ml BSA：２mM MgCl₂；１mM CaCl₂；３mM MnCl₂；0.0 2％アジ化ナトリウム；0.2mM PMSFを有している。５μlの披検物質がピペットに より添加され、プレートを振って混合し、室温で10分間保温する。 ５．200,000細胞／mlのHL60細胞培養液50mlを350gで４分間遠心する。ペレット は10mlのRPMI 1640で再懸濁され、細胞は再び遠心 される。細胞を標識するため、50μlのBCECF-AM(モレキュラー・プローブス)が 無水DMSOに溶解される；これに続き、1.5mlのRPMI 1640がこのBCECF-AM／DMSO溶 液に添加される。細胞はこの溶液に再懸濁され、37℃で30分間保温される。350 ｇで２分間遠心後、標識化細胞ペレットは11mlの結合緩衝液に再懸濁し、この再 懸濁された細胞はミクロタイタープレートのウェル中に100μl溶液ずつ撒布され る。このプレートは、細胞が試験プレートの底に沈降するために、10分間室温で 置かれる。この操作は、細胞にコートされたプラスチックに付着する機会を与え る。 ６．アッセイを停止するため、ミクロタイター・プレートは45°の角度で停止、 緩衝液（25mM トリス、pH7.5；125mM NaCl；0.1％BSA；２mM MgCl₂；１mM CaCl₂ ；３mM MnCl₂；0.02％アジ化ナトリウム）に完全に沈められる。停止緩衝液は 、逆転によりウェルから除去され、この操作はさらに２回繰り返される。 ７．ウェル中に堅固に付着した、BCECF-AM−標識細胞は、セット４の感度、485 ／22nmの励起波長および530／25nmの放射波長でサイトフルオリメーター（ミリ ポア）中で測定された。 Ｅ−セレクチン−IgGへのHL60細胞の付着のIC₅₀： 実施例30の化合物： 60μM 実施例31の化合物： 60μM 実施例32の化合物： 100μM 実施例33の化合物： 60μM 実施例34の化合物： 150μM 比較値： Ｅ−セレクチン−IgGへのHL60細胞の付着のIC₅₀： シアリル−Le^x−O(CH₂)₆NH₂： １mM （EPA 93 119 098.7参照） Ｂ．刺激されたヒト内皮細胞への細胞接着に対するポリマー炭水化物リセプター ・ブロッカーの効果を調べるための二次アッセイ 組換可溶性融合蛋白質への細胞接着に対するポリマー炭水化物リセプター・ブ ロッカーの活性の試験は一つのタイプの接着分子と対応するリガンドとの相互作 用に基づく極めて特異的なアッセイである。細胞−細胞相互作用の生体内の状況 を刺激するために、我々は、HL60細胞が刺激されたヒト臍内皮細胞に接着するア ッセイを使用する。 １．ヒト腋内皮細胞（HUVEC）の取得 出産後の臍帯は、次の処理操作まで＋４℃で100,000IU／Ｌのペニシリン、100 mg／Ｌのストレプトマイシン、50mg／Ｌのゲンタミシン、50,000IU／Ｌのマイコ スタチンを含むPBS中で保存された。 臍帯からもっとも長く損傷を受けていない断片がメスで切り出され、新しいア ルミホイルに置かれる。臍帯の一端がクリップで閉じられる。もう一端より適し た管が臍帯管に挿入され、臍帯の端を縛ることにより固定される。 この管を介し臍帯管にはコラゲナーゼ溶液（50mgコラゲナーゼ／100ml 25mM H epes，pH7.0）が満たされ、37℃で15分保温される。 細胞の収率を上げるため、依然として付着している内皮細胞を剥離するために 臍帯は保温後、優しくマッサージされる。 これに続いて、細胞懸濁液は管から外に出され、細胞培養培地および10％の牛 胎児血清を含む培養試験管へ入れられる。管は残余細胞を得るため、PBSで洗浄 される。 細胞懸濁液は500ｇで５分間遠心される：これに続いて細胞ペレットは４mlの 培養培地に再懸濁され、細胞は手抜状にする。３〜４日後、細胞はコンフルエン トに成長し、継代することができる。 内皮細胞培養液の純度をチェックするため、培養液は、ファクターVIIIに対す る抗体を用い、免疫蛍光に対して染色された。正の反応は内皮細胞においてのみ 示され、混入した線維芽細胞によっては示されない。 ２．アッセイ操作 96−ウェルのミクロタイター・プレート中で、ウェル当たり20,000の内皮細胞 が撒布され、37℃で24時間保温される。この目的に使う内皮細胞は５〜６回以上 は継代されていてはならない。アッセイの４時間前、内皮細胞はIL-１の添加(最 終濃度：15Ｕ／ml)により刺激される。培養培地の除去後、細胞は血清無添加のR PMI培地で１度洗浄される。20μlのRPMI培地が除去され、新たにピペットで注入 された後、被検物質が添加される。 ３．アッセイにおけるこれ以降の工程、すなわち、HL60細胞の標識およびHL60細 胞の導入は、Ａ４、項目５〜７により行われる。 Ｃ．リンパ組織の凍結切片に対する細胞接着に対するポリマー炭水化物リセプタ ー・ブロッカーの影響を調べるための二次アッセイ 試験管内で、白血球がリンパ組織の凍結切片上の内皮細胞に結合する程度を調 べることは可能である。これらの細胞−細胞相互作用 は、凍結切片中の内皮細胞表面の接着分子と白血球表面の対応するリガンドとの 間の相互作用に基づいている。初代の白血球の代替として、その表面リガンドが 科学文献においてよく記載されているところのHL60細胞を使用することが可能で ある。結合したHL60細胞の数より、HL60細胞のリンパ節凍結切片への接着が起こ っているかを決定することが可能である。 １．腋窩、頸部または腸間膜のリンパ節が、新たに殺されたラットより切開して 取り出され、液体窒素にて速やかに凍結される。 ２．凍結リンパ節より10μm厚の低温切片が調製され、環状のカバーグラス（直 径18mm）に移され、２時間室温で乾燥される。 ３．20μlの結合緩衝液が切片の上にピペットで落とされる。被検物質が添加さ れ10分間室温で保温される。HL60細胞は、Ａ４．項目５．に従い標識される。10 0μlの結合緩衝液中の200,000の標識HL60細胞がそれぞれのカバーグラスに添加 され、10分間放置される。これにより、沈降する細胞が内皮細胞に到達し、ある 細胞はこの内皮細胞に接着することができる。 ４．カバーグラスは、非接着細胞を洗い落とすために45°の角度で停止緩衝液に 沈められる。それに続き、カバーグラスはPBS中４％のホルムアルデヒドで室温 で10分間固定される。 ５．リンパ血管の横断切片は免疫蛍光顕微鏡下で写真により記録される（FITC励 起）。接着HL60細胞は、無染色の背景から明確に区別される。この結果は、内皮 細胞単位面積当たりの結合HL60細胞として表される。 Ｄ．ラット生体内における白血球の接着に対するポリマー炭水化物 リセプター・ブロッカーの影響を調べるための三次アッセイ 以下に記載される方法は、白血球の動脈血管内膜への接着を阻害する物質の生 体内の活性を確認することができる。 循環する白血球細胞のいくつかは、動脈血管内膜へ接着する傾向を有すること が知られている。この傾向は、炎症の過程において顕著に増進する。正常状態で 白血球は連続的に血管壁に衝突するが、この衝突は、細胞がある程度跳ね返り、 循環に戻るように柔軟なものである。炎症の過程において、白血球および血管に ライニングされる内皮細胞の双方における生化学的な変化は、両タイプの細胞の 表面の性質の変化に結びつく。細胞の挙動はより接着性が増すようになる。この 接着性は初めに、内皮に衝突後の白血球が内皮細胞上を転がるという傾向によっ て表れる。白血球が内皮上でこのように転がると、両方の結合パートナー上のさ らなる生化学的反応が誘導され、その結果として細胞接着が増進する。この接着 性のさらなる増進は、白血球が内皮に堅固に接着するまで白血球の転がりの速度 を落とす。この堅固な接着の次のステップとして、白血球が血管の外に移動する 。この白血球の転がり、堅固な接着及び血管より外への移動は、FMLP（f-Met-Le u-Phe）、LPS（リポポリサッカライド）またはTNF（腫瘍壊死因子）のような白 血球刺激因子により誘導され得る。これらの過程の顕微鏡による記録は、例えば 、ラットから切開により取り出された腸間膜組織上で可能である。それゆえ、血 流中に注入された物質は、誘導された白血球の接着に影響を与え得るかを見るた め調べることが可能である。 この調査を実行に移すため、ラットは、［隙窩］で麻酔される。腹部高が切開 され小腸の断片が引き出される。小腸の断片は、暖化可能な顕微鏡台の上で連続 的に加湿される。顕微鏡の観察のため、 小腸組織の一領域は流動パラフィンで覆われる。対照のため、この領域の−刺激 されていない−すべての接着白血球は30分間各５分毎に計測される。これと並行 して、血圧、体温、血流の流速が記録される。被検物質は、検査の間中、連続的 管注入により投与される。白血球刺激剤は腸組織にドロップワイズで添加される が、その使用の後、接着性白血球は90分間各５分毎に計測される。 この調査はそれぞれ３匹の動物から成る試験グループにて実施される。最初の 動物は、自発の接着を決定するために運搬体のみを受ける。２番目の動物は、病 因論的な対照を決定するために白血球の刺激のみを受ける。３番目の動物は、白 血球刺激剤と被検物質を受ける。 病因対照における接着性白血球の数は、100％に等しく設置される。病因対照 と比較して被検物質を投与したときの白血球接着のパーセンテージの変化が、被 検物質の活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バールトニク，エカルト ドイツ連邦共和国デー−65205 ヴイース バーデン．カールスルーアーシユトラーセ ８ (72)発明者 ザイフゲ，デイルク ドイツ連邦共和国デー−55246 マインツ −コストハイム．コストハイマーラントシ ユトラーセ11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．最初にモノ−またはオリゴ・サッカライド、スペーサーおよび親水性で生分 解性のポリマーの化学的連結によりアクセプターを調製し、その後に一つまたは 二以上の他のモノサッカライド単位が酵素的糖鎖付加反応により付加されること から成り、 a) 親水性で生分解性のポリマー単位、 b) 少なくとも一つのジまたはオリゴ・サッカライド単位、および、 c) そのものによりジまたはオリゴ・サッカライド単位がポリマー単位に連結 している少なくとも一つの、二価性のスペーサー から成る、生理学的に寛容でかつ生理学的に分解可能な、ポリマーを基礎とす る炭水化物リセプター・ブロッカーの調製方法。 ２．アクセプターの酵素的糖鎖付加反応が均一な水性相で行われる、請求項１に 記載の方法。 ３．アクセプターの酵素的糖鎖付加反応が、ドナーとしてのヌクレオチド活性化 炭水化物およびグリコシル・トランスフェラーゼの援用により行われる、請求項 ２に記載の方法。 ４．アクセプターの酵素的糖鎖付加反応が、特定のグリコシル・トランスフェラ ーゼに適した緩衝液系において行われる、請求項３に記載の方法。 ５．緩衝液系が、0.01Ｍから１Ｍの濃度を有する、請求項４に記載の方法。 ６．緩衝液系が、特定のグリコシル・トランスフェラーゼの活性化のために必要 な陽イオンを含む、請求項４または５に記載の方 法。 ７．水性培地のpHが6.0から8.5の間である、請求項２から６のいずれか一項に記 載の方法。 ８．ドナーが等モル量または過剰量添加された場合に、アルカリ・フォスファタ ーゼが反応培地に添加される、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。 ９．0.01から10単位のグリコシル・トランスフェラーゼが水性緩衝液系に溶解さ れたアクセプター及びヌクレオチド活性化炭水化物に添加される、請求項３から ８のいずれか一項に記載の方法。 10．酵素的糖鎖付加反応が10から40℃で１から５日間行われる、請求項２から９ のいずれか一項記載の方法。 11．ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアミド、ポリアンハイドライド、ポ リイミノカーボネート、ポリアンハイドライド、ポリオルトエステル、ポリジオ キサノン、ポリホスファゼン、ポリハイドロキシカルボン酸、ポリアミノ酸また はポリサッカライドが親水性で生分解性のポリマーとして使用される、請求項１ から10のいずれか一項に記載の方法。 12．分子量が70kDより低いまたは70kDに等しくポリアミドまたはポリアンハイド ライドの形で存在するポリアミノ酸が、親水性で生分解性のポリマーとして使用 される、請求項11に記載の方法。 13．ポリアミノ酸が、ポリ−α,β−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ,Ｌ−アスパ ルトアミド、ポリ−Ｄ,Ｌ−スクシンイミド、ポリグルタメート、ポリ−Ｌ−リ ジン・メチルエステルフマルアミドおよびこれらのポリアミノ酸の共重合体であ る、請求項12に記載の方法。 14．アクセプターのスペーサーが式Ｉを有する、請求項１から13のいずれか一項 に記載の方法。 （モノ−またはオリゴ・サッカライド）−Ｏ− [Q¹-(CH₂)_p-Q²]_r−（ポリマー単位） Ｉ、 ここで、 ｐは１〜６の整数であり、そして ｒは１または２である。