JPH10503205A

JPH10503205A - ジスルフィド結合含有生物活性ペプチドの安定類似体

Info

Publication number: JPH10503205A
Application number: JP8505827A
Authority: JP
Inventors: スリニバサン，アナンサチャリ; ライル，レオン・アール; ラジャゴパラン，ラガバン
Original assignee: マリンクロッド・メディカル・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-07-21
Filing date: 1995-07-18
Publication date: 1998-03-24
Also published as: EP0776334A1; EP1132394A1; CA2195525A1; US6664367B1; WO1996003429A1; EP0776334A4

Abstract

(57)【要約】ジスルフィド結合を含有する安定な環状ペプチド類似体を開示する。このジスルフィド結合は４つの方法のうちの１つで修飾される。それらは(ａ)スルフィド収縮、(ｂ)同配性置換、(ｃ)チオケタール拡張、または(ｄ)アルキル化拡張である。スルフィド収縮では、ジスルフィド結合(−Ｓ−Ｓ−)がモノスルフィド結合(−Ｓ−)で置換され、２官能性エフェクター分子例えばリガンドあるいは走化性剤が新ペプチド連鎖と結合する。同配性置換では、１つの硫黄原子が炭素原子で置換され、修飾側での少なくとも１つの炭素原子は二官能性エフェクター分子である。チオケタール拡張では、アルキリデン単位(−ＣＲ₁Ｒ₂−)が２つの硫黄原子間に挿入される。アルキル化拡張では、Ｃ₂ないしＣ₃のアルキル部分が２つの硫黄原子間に挿入される。

Description

【発明の詳細な説明】ジスルフィド結合含有生物活性ペプチドの安定類似体１．発明の分野本発明は、ジスルフィド結合含有生物活性ペプチドの構造的および化学的に安定な類似体に関する。本発明は、２官能性キレート化剤、抗腫瘍剤、酵素、コエンザイム、または走化性剤(ケモトキシン)のような２官能性エフェクター分子を、ジスルフィド結合が修飾される部位と同じ部位に有する、ジスルフィド結合類似体に関する。２．技術的背景ジスルフィド結合を有する多くの生物活性ペプチドがある。多くの天然に存在する環状(および構造的に制限された)ペプチドはジスルフィド結合を有する。ジスルフィド結合を有するペプチドは、通常、１０から２０員環マクロサイクルとして存在するが、より大きい環サイズも知られており、巨大ポリペプチドまたはタンパク質で一般的である。このような小さな環状ペプチドおよび小さなペプチド模倣物は、診断および治療において非常に重要になっている。特に、放射−および化学治療剤の標的送達において積極的に検討されている。Ｆischman，Ａ.Ｊ．et al.,“ＡＴicket to Ｒide：Ｐeptide Ｒadiopharmaceuticals,”Ｔhe Ｊ ournal of Ｎuclear Ｍedicine，Ｖol．34，Ｎo．12，1993年12月参照。これらのジスルフィド架橋の主な欠点は、緩和な還元条件下でさえ、不安定であることであり、−Ｓ−Ｓ−結合の分解は通常ペプチドの生物活性を失わせる。例えば、スズイオンおよびジチオナイトのような還元剤の使用のため、放射標識条件はしばしばジスルフィド結合を破壊する放射性医薬の製造を必要とする。同様に、血流成分はジスルフィド結合を分解できる。また、ジスルフィド結合はチオール含有化合物を容易にチオール−ジスルフィド内部変換をし得る。診断および治療に使用するために、診断的および治療的に有効な金属イオンと錯化可能な２官能性キレート化剤、抗腫瘍剤、酵素、コエンザイムまたは走化性剤(ケモトキシン)のような２官能性エフェクター分子をペプチドに結合することがしばしば必要である。過去において、アミノおよびカルボキシル基を含む側鎖を有するＥＤＴＡ−様２官能性キレート化剤を生物活性ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に挿入している。Warshawskyおよび共同研究者，Ｊ．Ｃhem．Ｓo c.，Ｃhem．Ｃomm.，1133(1985)およびＳynthesis，825(1989)；Ｊ．Ｃhem．Ｓo em.，2，323(1991)参照。ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端はしばしば生物活性に必要であり、ペプチドの末端へのリガンドの結合はペプチドの生物活性を破壊する。ペプチドの生物活性が破壊された場合、続いて放射性異性体で標識されたそのペプチドは、診断または治療適用において僅かな価値しかない。従って、当分野において、改善された化学的および生物学的安定性を有するジスルフィド結合を含有し、一方全三次元ペプチド構造および生物活性を実質的に残した環状生物活性の類似体を提供することは明白な利点である。このようなペプチド類似体に２官能性エフェクター分子を結合することもまた当分野において明白な利点である。このような生物活性ペプチドの安定な類似体を本明細書に記載し、請求する。発明の要約本発明は、ジスルフィド結合を有する環状生物活性ペプチドの安定類似体を指向する。本発明により、−Ｓ−Ｓ−結合を４つの方法のうちの一つで修飾する： (ａ)スルフィド収縮、(ｂ)同配性置換、(ｃ)チオケタール拡張または(ｄ)アルキル化拡張。これらの方法を一般的に下記に図説する：本発明のスルフィド収縮は、ジスルフィド結合(−Ｓ−Ｓ−)のモノスルフィド結合(−Ｓ−)での置換であり、下記に図説のように２官能性キレート、抗腫瘍剤または走化性剤(ケモトキシン)のような２官能性エフェクター分子を修飾部位で新規ペプチドに結合させる。式中、Ｒ₁またはＲ₂の少なくとも一つは２官能性エフェクター分子であり、他のＲ₁またはＲ₂は、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアルキル、アミノアルキル、カルボキシルおよびカルボキシアルキル(ここで、炭素含有部分は１ないし１０炭素原子を含む)からなる群から選択される。本明細書で使用の同配性置換は、ジスルフィド結合の一つの硫黄原子の炭素原子での置換である。下記に図説のように、ペプチドの修飾部位の少なくとも一つの炭素原子は２官能性エフェクター分子を有する：式中、Ｒ₃、Ｒ₄またはＲ₅の少なくとも一つは２官能性エフェクター分子であり、他のＲ₃、Ｒ₄またはＲ₅は、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアルキル、アミノアルキル、カルボキシルおよびカルボキシアルキル(ここで、炭素含有部位は１ないし１０の炭素原子を含む)からなる群から選択される。本発明のチオケタール拡張は、二つの硫黄原子の間へのアルキリデン単位(− ＣＲ₆Ｒ₇−)の挿入を含む。下記のように、チオケタール拡張は、還元とそれに続く、得られたジチオールのアルデヒドまたはケトンとの反応により達成できる。：式中、Ｒ₆およびＲ₇は同一または異なって、水素、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシアルキル(ここで、炭素含有部分は１ないし１０の炭素原子を含む)、および−(ＣＨ₂)_n−Ｙ(ここで、Ｙは２官能性エフェクター分子であり、ｎは０から６である)からなる群から選択され：そしてＤＴＴはジチオスレイトールである。Ｒ₆およびＲ₇は、共に結合し、３から７員の環を形成し得る。このような環系を形成するための一つの方法を下記に図説する。：式中、Ｒは水素、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシアルキル(ここで、炭素含有部分は１ないし１０の炭素原子を含む)、および−(ＣＨ₂)_n−Ｙ(ここで、Ｙは２官能性エフェクター分子であり、ｎは０から６である)からなる群から選択される置換基である。あるペプチドがジスルフィド還元に耐性であるか、または厳しい条件下でのみ還元が起こるかのいずれかである。このような場合、保護チオール基を有する対応する直鎖ペプチドを標準ペプチド合成法により製造し、保護基を硫黄から除去し、直ぐにジチオールと好適な環状または非環状カルボニル化合物の縮合を行うことが好ましい。本明細書で使用するアルキル化拡張は、Ｃ₂からＣ₃のアルキル分子の２個の硫黄原子の間への挿入を含む。大きいアルキル分子(Ｃ₃以上)を硫黄原子の間に挿入することが可能であるが、ペプチドの構造的配置が大きいアルキル分子により明らかに変わることがあり、それによりこのような変化がなされた場合、生物活性の損失を導く。アルキル化拡張は、下記のように、還元、続くジチオールの求電子またはアルキル化剤によるアルキル化により達成する：式中、Ｒ₈およびＲ₉は、上記でＲ₆およびＲ₇について定義したのと同じ意味である。Ｘはハロゲン、トシルまたはメシル基のような好適な遊離基である。Ｒ₈およびＲ₉は、共に結合し、３から７員の環を形成し得る。このような環系を形成するための一つの方法を下記に図説する：式中、Ｒは水素、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アミノアルキル、カルボキシル、カルボキシアルキル(ここで、炭素含有部位は１ないし１０の炭素原子を含む)、および−(ＣＨ₂)_n−Ｙ(ここで、Ｙは２官能性エフェクター分子であり、ｎは０から６である)からなる群から選択される置換基；およびＸはハロゲン、トシルまたはメシル基のような好適な脱離基である。図面の簡単な説明図１は、ソマトスタチン受容体結合ペプチド、オクトレオチドの三次元構造である。図２は、オクトレオチドのチオケタール類似体の三次元構造である。発明の詳細な説明本発明は、ジスルフィド結合を有する環状生物活性ペプチドの構造的および化学的安定化類似体を提供する。本発明により、−Ｓ−Ｓ−結合は、以下の技術の一つで修飾される：(ａ)スルフィド収縮、(ｂ)同配性置換、(ｃ)チオケタール拡張または(ｄ)アルキル化拡張。有利には、診断的および治療的に有効な金属イオン(例えば、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｙｔ、Ｔｂ、Ｓｍ、Ｇｄ、ＭｎおよびＦｅを含む)と錯化できるキレート化剤、抗腫瘍剤、酵素、コエンザイムまたは走化性剤(ケモトキシン)のような２官能性エフェクター分子を、本発明のジスルフィド架橋類似体に結合可能である。本発明のスルフィド収縮および同配性置換技術は、下記一般式：但し、ＡＡ₁、ＡＡ₂、およびＡＡ₃はα−アミノ酸であり、ＡＡ₁、Ｑ、ＡＡ₂、Ｚ、およびＡＡ₃を結合している各結合は通常のペプチド結合であり；ｋ、ｌ、およびｍは０ないし１０であることができるがｋ、ｌ、およびｍのうち少なくとも２つはゼロより大であり；ＷおよびＸは、Ｗが−Ｓ−のときＸが−ＣＨＲ₁₀− でありＷが−ＣＨＲ₁₀−のときＸが−Ｓ−であるような−Ｓ−または−ＣＨＲ₁₀ −であり；Ｒ₁₀は−(ＣＨ₂)_n−Ｙであり；ｎはないし１０であり；Ｙは−Ｃのような２官能性エフェクター分子と結合し得る反応性官能基であり；そしてＱおよびＺは同一または異なることができかつ下記一般構造：式中、ｐは０ないし３であり、ＲはＨ、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、およびカルボキシルであって各炭素含有部分は１ないし１０の炭素原子を含有するものであるか、または、天然に存在するα−アミノ酸類の側鎖部分であることができる、を有するものである、により図説される。本発明のチオケタール拡張およびアルキル化拡張は、下記一般式：但し、ＡＡ₁、ＡＡ₂、ＡＡ₃、Ｑ、Ｚ、ｌ、ｋおよびｍは上記の定義と同様であり、ＡＡ₁、Ｑ、ＡＡ₂、Ｚ、およびＡＡ₃を結合している各結合は通常のペプチド結合である、により図説できる。Ｌは、式中、各種のＲ置換基は同一または異なることができかつ上記Ｒと同一の意味を有する、からなる群から選ばれるものであり；そしてＹは上記で定義の意味である。スルフィド収縮既知のスルフィド収縮において、システインアミノ酸(ジスルフィド結合を形成する２つの硫黄の一つを提供する)を最初にセリンで置換する。セリン残基の脱水によりオレフィンを得る。最後に２重結合上へのチオールのミカエル反応により、元のペプチドのスルフィド類似体を産生する。この基本工程を、天然環状ペプチドマルフォーミンを参考にして図説する：マルフォーミンのスルフィド類似体は、最初に、以下のペプチドの一つのようなセリン含有ペプチドを合成することにより製造する：式中、ＰＧは保護基である。第２に、セリン基を脱水し、デヒドロアラニル基を得る。最後に、保護基(ＰＧ)の硫黄からの除去、続く縦の二重結合上でのチオールのミカエル反応により所望のスルフィド類似体を産生する。あるいは、スルフィド誘導体を、チオアルキルホスフィンとジスルフィド結合を有する環状ペプチドの反応により直接製造できる。本発明のスルフィド収縮は、ペプチド架橋を有するメチレン単位の一つに種々の２官能性分子を結合させることにより、当分野で既知のものを越える。更に具体的には、既知のスルフィド収縮工程は、システイン基の代わりに以下の構造を有するオレフィンアミノ酸を用いることにより、修飾する：式中、Ａ₁は水素、アルキル、カルボキシアルキル、アリール、ヒドロキシアルキル(ここで、炭素含有部分は１ないし１０の炭素原子を含む)；Ａ₂およびＡ₃ は、同一または異なって、−ＣＯ₂Ｒ、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＮまたは−ＮＯ₂のような電子吸引基である。オレフィン結合は、硫黄求核基を受け取るためのミカエル受領体として働く。余分の−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＮまたは−ＮＯ₂官能基は、種々の２官能性エフェクター分子を結合するためのハンドルとして働く。下記の図式１は、スルフィド収縮を有するペプチド類似体を製造するための一つの技術を記載する。当業者は、同様な技術が、同じ環状ペプチド類似体を達成するために利用し得ることを認識するであろう。図説した反応工程の全ては当業者に既知である。式中、ＥＤＣはエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミドであり、ＤＣＣはジシクロヘキシルカルボジイミドである。Ｊ．Ｊones，Ｔhe Ｃhemical Ｓynt hesis of Ｐeptides，Ｃlarendon Ｐress，1991およびＭ．Ｂodanszly，Ｐrinci ples of Ｐeptide Ｓynthesis，第２版、Ｓpringer-Ｖerlag，1993(これらは参考としてその内容を本明細書に包含する)に記載のような混合無水物工程のような他の通常使用されている結合法もまた本発明で使用できる。上記図式１において、ＤＭＦ(５mＬ)中のＮ−ｔ−Ｂoc−デヒドログルタミン酸γ−ｔ−ブチルエステル(１.１mmol)、テトラペプチド(２)(１.０mmol)およびＥＤＣ(１.２mmol)を環境温度で２４時間撹拌する。反応混合物を水に注ぎ、沈殿(３)を濾過して回収し、水で洗浄して乾燥させる。ペプチド(３)を水性メタノール(５mＬ)に再溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム(２.５mＬ)で処理し、環境温度で２４時間撹拌する。その後、反応混合物を１ＮＨＣｌ(２.５mＬ)で処理し、溶媒を減圧下取り除く。残渣を最少量の水(または水性メタノール)に再溶解し、逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製して酸(４)を得る。酸(４)への２官能性エフェクター分子(ＢＥＭ)の結合法は下記である：ＤＭＦ (５mＬ)中の酸(４)(１.０mmol)、イミダゾールリガンド(下記)(１.０５mmol)およびジシクロヘキシルカルボジイミド(１.１mmol)を環境温度で２４時間撹拌する。反応混合物を濾過してジシクロヘキシルウレア(ＤＣＵ)を除去し、濾液を水に注ぐ。沈殿を濾過して回収し、乾燥して下記の完全に保護されたペプチド−リガント結合体(５ａ)を得る。化合物(５ａ)について、Ｒ"はｔＢｕおよびＲ'は−ＣＯ₂ｔＢｕである。式中、ＴＨＰは２−テトラヒドロピラニルである。完全に保護されたペプチド−リガント結合体を９６％ギ酸(５mＬ)で処理し、環境温度に２４時間置く。ギ酸を真空蒸発により除去する。反応生産物を水(１m Ｌ)に再溶解し、逆相(フラッシュまたはＨＰＬＣのいずれか)クロマトグラフィーにかけ、所望の環状ペプチド(５ｂ)を得る。化合物(５ｂ)について、Ｒ"およびＲ'は−Ｈである。同配性置換同配性置換(硫黄の−ＣＨ₂−での置換)は既知であるが、本発明では硫黄を− ＣＨ(Ｙ)−単位で、式中、Ｙは、２官能性エフェクター分子、すなわちＹは造影または放射性治療目的のための２官能性キレートまたは癌化学療法の走化性剤( ケモトキシン)または抗腫瘍剤のような特定の機能の実行が可能なものである、で置換する。下記図式２は、ジスルフィド架橋の硫黄原子の一つの同配性置換によるペプチドの製造の技術を記載する。当業者は、同様の技術が同様の環状ペプチド類似体を達成するために行い得ることを認識するであろう。図説した全ての反応工程は、当業者に既知である。式中、ＤＭＥは１,２−ジメトキシエタン(グリム)、Ｂoc−Ｏ−Ｂocはジ−ｔ −ブチルジカルボネート、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、Ｅｔ₃ＳｉＨはトリエチルシランである。無水グリム(２０mＬ)中のフタルイミド(６)(１１mmol)およびジエチルブロモマロネート(７)(１０mmol)混合物を４時間加熱還流した。混合物を濾過してＫＣｌを除去し、濾液を減圧下乾燥した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、(８)を得た。乾燥ＤＭＦ(１０ml)に(８)(１０mmol)と水素化ナトリウム(１５mmol)を加えた混合物に、ＤＭＦ(５ml)に４−ブロモクロトン酸ｔ−ブチル(１１mmol)を溶かした溶液を加える。次いで、この混合物を５５℃ないし６０℃で２時間加熱し、氷冷した水に加える。生成物を塩化メチレン(３ｘ２５ml)で抽出し、水(３ｘ５０m l)で洗浄し、乾燥し(硫酸マグネシウム)、濾過する。濾液を減圧で乾固し、残渣をシリカゲルによるクロマトグラフで精製して、(９)を得る。メタノール(２０ml)に(９)(１０ml)とヒドラジンヒドラート(１５ml)を加えた混合物を２時間還流下に加熱する。溶媒を減圧下に蒸発させて除去し、残渣を水 (２５ml)に再溶解し濃塩酸(１ml)を添加する。混合物を濾過してフタリルヒドラジドを除き、濾液を水酸化ナトリウム(２２ml)を添加する。この溶液を室温で１５−２０時間攪拌し、濃塩酸(２ml)で処理し、５５−６０℃で１時間加熱する。減圧下に水を除去し、残渣を逆相フラッシュクロマトグラフで精製して、５−アミノ−２−ヘキセンジオイック酸ｔ−ブチルを得る。アセトニトリル(２０ml)にこのアミノ酸(１０mmol)、ジ−ｔ−ブチルジカーボネイト(Ｂoc−Ｏ−Ｂoc)(１１mmol)およびトリエチルアミン(１１mmol)を加え、室温で２４時間攪拌する。溶媒を減圧下に除き、残渣を水に溶かし、６Ｎ塩酸(２ml)で処理し、逆相のフラッシュクロマトグラフして(１０)を得る。テトラペプチド(２)(１mmol)と酸(１０)(１.０５mmol)をＤＭＦ(５mmol)に加えた混合物にＥＤＣ(１.１mmol)を添加し、室温で２４時間攪拌する。反応混合物を水に注ぎ、析出物を濾取し、十分水洗し、乾燥する。固形物にトリフルオロ酢酸(５ml)とトリエチルシラン(１ml)を添加し、室温に１時間保持する。ＴＦＡを減圧下に蒸発させて除去する。残渣を１Ｎ水酸化ナトリウム(１ml)に再溶解し、トリフェニルメタンを濾去し、逆相でフラッシュクロマトグラフして所望のペプチド(１１)を得る。チオケタール拡張本発明によるチオケタール拡張は、２個の硫黄原子の間にアルキリデン・ユニット(−ＣＲ¹Ｒ²−)を挿入することを含む。下記の図式３は、チオケタール拡張ジスルフィド橋アナログで環状ペプチド製造する方法を説明する。当業者は、この技術がジスルフィド結合を有する多くのペプチドに使用できることを理解するであろう。式示されている反応工程はすべて、当業者によく知られているものである。化合物(１４ａ)では、Ｒ¹＝Ｒ²＝−Ｈ；化合物(１４ｂ)では、Ｒ¹＝Ｒ²＝−ＣＨ₃ ；化合物(１４ｃ)では、Ｒ¹＝−ＣＨ₃、Ｒ²＝−(ＣＨ₂)₃ＣＯ₂Ｈ；化合物(１４Ｒ¹とＲ²が水素である化合物(１４ａ)は次のようにして製造され得る。水性エタノール(１：１、１０ml)にマルフォリンＡ(１.０mmol)を溶かした溶液に水素化ホウ素ナトリウム(１.１mmol)を加え、この混合物を室温で４時間攪拌する。次いで、この反応混合物に濃塩酸(１ml)を加え、減圧下に乾固する。残渣を水( １ｍｌ)に再溶解し、逆相のフラッシュクロマトグラフで精製して(１３)を得る。このジチオール(１３)(１.０mmol)をフォルムアルデヒド・ジメチルアセタール(１０ml)に懸濁し、ボロントリフルオライド・エーテレート(１滴)を加え、室温で１６時間攪拌する。減圧下に、溶媒を蒸発させ、残渣に１Ｎ水酸化ナトリウム(１.１ml)を添加し、この溶液を逆相でフラッシュクロマトグラフして所望の環状ペプチド(１４ａ)を得る。Ｒ¹とＲ²がメチルである化合物(１４ｂ)は、化合物(１４ａ)を製造するのと実質的に同じ操作で製造される。ただし、ジチオール(１３)は、フォルムアルデヒド・ジメチルアセタールでなく、アセトン(１０ml)に懸濁する。Ｒ¹がメチルで、Ｒ²が−(ＣＨ₂)₃ＣＯ₂Ｈである化合物(１４ｃ)は次のようにして製造され得る。テトラペプチド(１３)(１.０mmol)とｔ−ブチル５−ケトヘキサン酸(１.１mmol)をジオキサン(１０ml)に溶かした溶液にボロントリフルオライド・エーテレート(１滴)を加えて、室温で１６時間攪拌する。減圧下に溶媒を蒸発させ、残渣に１Ｎ水酸化ナトリウム(１ml)を加え、この溶液を次いで逆相でフラッシュクロマトグラフして所望の環状ペプチド(１４ｃ)を得る。キサン酸に代えて４−カルボキシベンズアルデヒドを使用する以外は、化合物(１４ｃ )を製造するのと実質的に同じ操作で製造される。スルフィド・コントラクションに関連して前述したイミダゾール・リガンドのような二官能性エフェクター分子は、次のようにして化合物(１４ｄ)に結合させ得る。該酸(１.０mmol)、イミダゾール・リガンド(下記)(１.０５mmol)およびジシクロヘキシルカルボキイミド(１.１mmol)をＤＭＦ(５ml)に加えた混合物を室温で２４時間攪拌する。反応混合物を濾過してジシクロヘキシル尿素(ＤＣＵ)を除き、濾液を水に注ぐ。析出物を濾取し、乾燥して、下式のペプチド・リガンド・コンジュゲイト(１４ｄ )を得る。ここに記載しているチオケタール拡張で得られる環状ペプチドは、生物活性を保持しており、これらがさらに二官能性エフェクター分子を含んでいなくても、ある種の治療に適用するうえで有用である。エフェクター分子は、ペプチドが目的とする治療効果を発揮し得ないときに、造影もしくは放射線療法の目的のために放射性原子核を、また化学療法のために走化性剤(ケモトキシックエージェント)もしくは抗新生物剤を、標的に移送するために導入される。これは、レセプターへの結合が起っているにもかかわらず、所望の治療的生物効果が認められないような場合である。アルキル化拡張ここで使用されるアルキル化拡張は、２個の硫黄原子の間にＣ₂ないしＣ₃のアルキル基を挿入することを含む。より長いアルキル鎖を導入することもできる。しかし、元のペプチドと修飾したアナログとの間の位相的類似性を保存できる可能性は、大きなユニットによって有意に減少するであろう。アルキル化拡張は、上記チオケタール拡張の場合のように還元し、次いでアルキル化することによって実施される。下記の図式４は、アルキル化拡張ジスルフィド橋アナログで環状ペプチドを製造する技術を説明する。当業者は、この技術がジスルフィド結合を有する多くのペプチドに使用できることを理解するであろう。式示されている反応工程はすべて、当業者によく知られているものである。 (１３)(１mmol)と炭酸水素ナトリウム(３mmol)を水(５ml)に加えた溶液に２− ブロモメチルアクリル酸メチル(１.１mmol)を加え、全体の混合物を室温で２４時間攪拌する。その後、１Ｎ水酸化ナトリウム(１ml)を加え、室温で２４時間攪拌する。反応混合物に１Ｎ塩酸(３.２ml)を加え、始めの容積の約半量まで濃縮する。この溶液を、逆相でフラッシュクロマトグラフし、所望の環状ペプチド(１５ )を得る。これまでの上記記載は、環状ペプチドマルフォルミンＡとの関連において本発明を説明してきたが、当業者は、本発明の教示がジスルフィド結合を有する他の小型ペプチド用の使用に適合することを理解するであろう。例えば、オクトレオチド、[Ｄ−Ｐen^2'5,ｐ−Ｃl−Ｐhe⁴]−エンケファリン、[Ｄ−Ｐen^2' ₅]−エンケファリン、オキシトシンおよび他の既知のあるいは新規のペプチドが本発明の方法で使用され得る。さらに、２個のシステイン残基が１個のアミノ酸単位で分けられている化学走性サイトカイン(またはケモカイン)の“ＣＸＣ”属あるいは２個のシステインが相互に結合しているケモカインの“ＣＣ”属に属する長鎖の断片もまた使用され得る。化学走性のサイトカインのＣＸＣ属にはインターロイキン−８、マクロファージ炎症性蛋白−２(ＭＩＰ−２)、ＧＲＯα、ＧＲＯβおよびＧＲＯγを含む成長制限遺伝子産物(ＧＲＯ)、メラノーマ成長促進活性(ＭＧＳＡ)、血小板ファクター４(ＰＦ−４)、ガンマインターフェロン誘導蛋白(gamma−ＩＰ)、血小板基礎蛋白、結合組織活性化蛋白(ＣＴＡＰ−III)、β−トロンボグロブリン(β−ＴＧ )、好中球活性化蛋白(ＮＡＰ−２)、ニワトリｖ−src−ｖ−誘導蛋白(９３)、内皮細胞由来好中球活性化因子−７８(ＥＮＡ−７８)およびここに引用する米国特許５,０７９,２２８に記載されている関連ペプチドが含まれるが、これらに限定されものではない。典型的なＣＣケモカインには化学親和性蛋白(ＭＣＰ)物質、例えば単球化学親和性蛋白−１(ＭＣＰ−１)、ＭＩＰ_α、ＭＩＰ_β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ−３０９、ＭＣＰ−２(ＨＣ−１４としても知られる)およびＭＣＰ−３などが含れるが、これらに限定されるものではない。環状ペプチドアナログの化学的安定性当業者には理解されるように、前述の環状ペプチドアナログを製造する方法は、ジスルフィド結合を１またはそれ以上のチオエーテル基に変換するものである。チオエーテルは、ジスルフィドが不安定であるような条件下で化学的に安定であることがよく知られている。環状ペプチドアナログの立体的近似性オクトレオチド(１６)、ジスルフィド結合を有する環状オクタペプチドおよびその対応するチオケタールおよびそのチオケタールアナログ(１７)を分子模型で比較検討した。図１および図２に描かれている構造に示されているように、これらの構造間には驚くべき３次元的位相類似性がある。本発明によるたの環状ペプチドの分子模型は、原環状ペプチドと修飾環状ペプチドの間に非常に近い位相的類似性があることを示した。以上の記載から、本発明は、全体としてペプチドの３次元的立体構造を実質的に保ちながら、化学的および生物学的安定性を改善したジスルフィド結合を含む環状ペプチドのアナログを提供するものであることが理解されるであろう。本発明は、さらに二官能性エフェクター分子を結合している環状ペプチドアナログを提供する。本発明は、その精神と本質を離れることなく、他の特定の形態に具体化されることができる。ここに記載された具体例は、あらゆる観点において、単なる例示であり、限定的な意図はないものと考えられるべきである。従って、本発明の範囲は前述の説明よりは、むしろ付属する請求項によって示されている。請求項には、その均等的意味と範囲に含まれる限り、あらゆる変形がその範囲に包括されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 45/00 7419−4ＨＣ０９Ｋ 3/00 １０８Ｃ 51/00 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 Ｃ０９Ｋ 3/00 １０８ 8615−4Ｃ 43/00 (72)発明者ライル，レオン・アールアメリカ合衆国63119ミズーリ州ウェブスター・グローブス、ウェブスター・パス・ドライブ1319番 (72)発明者ラジャゴパラン，ラガバンアメリカ合衆国63043ミズーリ州メリーランド・ハイツ、ビンソン・コート 13031番

Claims

【特許請求の範囲】１．下記一般式：但し、(ＡＡ₁)_k、(ＡＡ₂)_l、および(ＡＡ₃)_mはペプチド中のα−アミノ酸であり、(ＡＡ₁)_k、Ｑ、(ＡＡ₂)_l、Ｚ、および(ＡＡ₃)_mを結合している各結合は通常のペプチド結合であり；ｋ、ｌ、およびｍはα−アミノ酸の数であってその数は０ないし１５であることができるがｋ、ｌ、およびｍのうち少なくとも２つはゼロより大であり；ＷおよびＸは、Ｗが−Ｓ−のときＸが−ＣＨＲ¹−でありＷが− ＣＨＲ¹−のときＸが−Ｓ−であるような−Ｓ−または−ＣＨＲ¹−であり；Ｒ¹ は−(ＣＨ₂)_n−Ｙであり；ｎは０ないし１０であり；Ｙは２官能性エフェクター分子と結合し得る反応性官能基であり；そしてＱおよびＺは同一または異なることができかつ下記一般構造：式中、ｐは０ないし３であり、Ｒ²はＨ、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、およびカルボキシルであって各炭素含有部分は１ないし１０の炭素原子を含有するものであるか、または、天然に存在するα−アミノ酸類の側鎖部分であることができる、を有するものである、を有する環状ペプチド類似体。２．Ｙがの群から選ばれる、請求項１に記載の環状ペプチド類似体。３．さらに官能性基Ｙに結合した２官能性エフェクター分子を含んでなる、請求項１に記載の環状ペプチド類似体。４．(ＡＡ₁)_k、Ｑ、(ＡＡ₂)_l、Ｚ、および(ＡＡ₃)_mが、全体で、オクトレオチドのアミノ酸配列を形成するものである、請求項３に記載の環状ペプチド類似体。５．２官能性エフェクター分子が、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｙｔ、Ｔｂ、Ｓｍ、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅから選ばれる金属を錯化し得る２官能性キレート化剤である、請求項４に記載の環状ペプチド類似体。６．(ＡＡ₁)_k、Ｑ、(ＡＡ₂)_l、Ｚ、および(ＡＡ₃)_mが、全体で、エンケファリンのアミノ酸配列を形成するものである、請求項３に記載の環状ペプチド類似体。７．２官能性エフェクター分子が、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｙｔ、Ｔｂ、Ｓｍ、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅから選ばれる金属を錯化し得る２官能性キレート化剤である、請求項６に記載の環状ペプチド類似体。８．(ＡＡ₁)_k、Ｑ、(ＡＡ₂)_l、Ｚ、および(ＡＡ₃)_mが、全体で、オキシトシンのアミノ酸配列を形成するものである、請求項３に記載の環状ペプチド類似体。９．２官能性エフェクター分子が、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｙｔ、Ｔｂ、Ｓｍ、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅから選ばれる金属を錯化し得る２官能性キレート化剤である、請求項８に記載の環状ペプチド類似体。１０．(ＡＡ₁)_k、Ｑ、(ＡＡ₂)_l、Ｚ、および(ＡＡ₃)_mが、全体で、「ＣＸＣ」走化性サイトカインペプチドのアミノ酸配列を形成するものである、請求項３に記載の環状ペプチド類似体。１１．２官能性エフェクター分子が、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｙｔ、Ｔｂ、Ｓｍ、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅから選ばれる金属を錯化し得る２官能性キレート化剤である、請求項１０に記載の環状ペプチド類似体。１２．(ＡＡ₁)_k、Ｑ、(ＡＡ₂)_l、Ｚ、および(ＡＡ₃)_mが、全体で、「ＣＣ」ケモカインペプチドのアミノ酸配列を形成するものである、請求項３に記載の環状ペプチド類似体。１３．２官能性エフェクター分子が、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｙｔ、Ｔｂ、Ｓｍ、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅから選ばれる金属を錯化し得る２官能性キレート化剤である、請求項１２に記載の環状ペプチド類似体。１４．下記一般式：但し、(ＡＡ₁)_k、(ＡＡ₂)_l、および(ＡＡ₃)_mはペプチド中のα−アミノ酸であり、(ＡＡ₁)_k、Ｑ、(ＡＡ₂)_l、Ｚ、および(ＡＡ₃)_mを結合している各結合は通常のペプチド結合であり；ｋ、ｌ、およびｍはα−アミノ酸の数であってその数は０ないし１５であることができるがｋ、ｌ、およびｍのうち少なくとも２つはゼロより大であり；そしてＱおよびＺは同一または異なることができかつ下記一般構造：式中、ｐは０ないし３であり、ＲはＨ、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、およびカルボキシルであって各炭素含有部分は１ないし１０の炭素原子を含有するものであるか、または、天然に存在するα−アミノ酸類の側鎖部分であることができる、を有するものであり、Ｌは式中、各種のＲ置換基は同一または異なることができかつ上記Ｒと同一の意味を有する、からなる群から選ばれるものであり；そしてＹは水素または２官能性エフェクター分子と結合し得る官能性基である、を有する環状ペプチド類似体。１５．Ｙがの群から選ばれる、請求項１４に記載の環状ペプチド類似体。１６．さらに官能性基Ｙに結合した２官能性エフェクター分子を含んでなる、請求項１４に記載の環状ペプチド類似体。１７．(ＡＡ₁)_k、Ｑ、(ＡＡ₂)_l、Ｚ、および(ＡＡ₃)_mが、全体で、オクトレオチドのアミノ酸配列を形成するものである、請求項１６に記載の環状ペプチド類似体。１８．２官能性エフェクター分子が、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｙｔ、Ｔｂ、Ｓｍ、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅから選ばれる金属を錯化し得る２官能性キレート化剤である、請求項１７に記載の環状ペプチド類似体。１９．(ＡＡ₁)_k、Ｑ、(ＡＡ₂)_l、Ｚ、および(ＡＡ₃)_mが、全体で、エンケファリンのアミノ酸配列を形成するものである、請求項１６に記載の環状ペプチド類似体。２０．２官能性エフェクター分子が、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｙｔ、Ｔｂ、Ｓｍ、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅから選ばれる金属を錯化し得る２官能性キレート化剤である、請求項１９に記載の環状ペプチド類似体。２１．(ＡＡ₁)_k、Ｑ、(ＡＡ₂)_l、Ｚ、および(ＡＡ₃)_mが、全体で、オキシトシンのアミノ酸配列を形成するものである、請求項１６に記載の環状ペプチド類似体。２２．２官能性エフェクター分子が、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｙｔ、Ｔｂ、Ｓｍ、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅから選ばれる金属を錯化し得る２官能性キレート化剤である、請求項２１に記載の環状ペプチド類似体。２３．(ＡＡ₁)_k、Ｑ、(ＡＡ₂)_l、Ｚ、および(ＡＡ₃)_mが、全体で、「ＣＸＣ」走化性サイトカインペプチドのアミノ酸配列を形成するものである、請求項１６に記載の環状ペプチド類似体。２４．２官能性エフェクター分子が、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｙｔ、Ｔｂ、Ｓｍ、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅから選ばれる金属を錯化し得る２官能性キレート化剤である、請求項２３に記載の環状ペプチド類似体。２５．(ＡＡ₁)_k、Ｑ、(ＡＡ₂)_l、Ｚ、および(ＡＡ₃)_mが、全体で、「ＣＣ」ケモカインペプチドのアミノ酸配列を形成するものである、請求項１６に記載の環状ペプチド類似体。２６．２官能性エフェクター分子が、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｙｔ、Ｔｂ、Ｓｍ、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅから選ばれる金属を錯化し得る２官能性キレート化剤である、請求項２５に記載の環状ペプチド類似体。