JPH10503371A - 新規化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 少なくとも１つのヒト免疫グロブリン不変領域またはそのフラグメントに融合したＩＬ４変異体または変異株からなる、ＩＬ４および／またはＩＬ１３アンタゴニストまたは部分アンタゴニスト活性を有する可溶性蛋白質。

Description

【発明の詳細な説明】 新規化合物 本発明は、ある種のＩgＥ介在アレルギー性疾患、Ｔ細胞介在自己免疫症状お よび感染剤に対する不当な免疫応答などの、ＩＬ４および／またはＩＬ１３の望 ましくない作用に由来の症状を治療するためのヒトインターロイキン４（ＩＬ４ ）および／またはヒトインターロイキン１３（ＩＬ１３）のアンタゴニストに関 する。 インターロイキンは免疫応答の分泌性ペプチドメディエーターである。公知の インターロイキンは、各々、免疫系の細胞の発生、活性化、増殖および分化にお いて多くの効果を有する。ＩＬ４はかかる機能において生理学的役割を有するが 、また疾患の発病の一因ともなりうる。特に、ＩＬ４は、外因性喘息、鼻炎、ア レルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎およびアナフィラキシーなどのアレルギー 性疾患の顕著な特徴であるＩgＥ抗体の形成に至るＢリンパ球の発生の経路に関 連している。ＩＬ４はまた、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症およびリウ マチ様関節炎などのある種の自己免疫症状における、および移植拒絶反応におけ る組織損傷の一因となるＴリンパ球に対する一般的な増殖および分化のファクタ ーとしても作用しうる。ＩＬ４はさらに、感染症を制御するのに要求される細胞 介在応答の形成を抑制しうる。したがって、ＩＬ４のＴまたはＢリンパ球に対す る効果の拮抗作用は、かかる疾患に対して有効な作用があると考えられる。ＩＬ １３は、最近になって同定されたものであり、レセプター構造／機能の態様（Ａ versa,Ｇ.ら（１９９３）、Ｊ.Ｅxp.Ｍed．１７８、２２１３〜２２１８）を含 め、ＩＬ４の生物学的特性と多くの類似性を共有している（Ｍinty,Ａ.ら（１９ ９３）、Ｎature ３６２、２４８〜２５０）。 ヒトＩＬ４は、２つのＮ−グリコシル化可能な部位および３個のジスルフィド 結合に関連する６個のシステインを有する１２９個のアミノ酸のポリペプチド単 鎖からなる（Ｌe,Ｈ.Ｖ.ら（１９８８）、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．２６３、１０８１７ −１０８２３）。ＩＬ４のアミノ酸配列およびこれらジスルフィド結合の位置は 知られている（Ｃarr,Ｃ.ら、（１９９１）Ｂiochemistry ３０、１５１５−１ ５２３）。 ジスルフィド結合は、残基３と１２７、２４と６５、および４６と９９の間に ある。ＩＬ４の分子量は、グリコシル化度で１５ｋＤａ（グリコシル化せず）か ら６０ｋＤａ（過グリコシル化のＩＬ４）まで変化する。 ヒトＩＬ４についてのＤＮＡ配列はまた、Ｙokota,Ｔ.らにより、Ｐ.Ｎ.Ａ.Ｓ .１９８６ ８３ ５８９４−５８９８に記載されている。 ＷＯ９３／１０２３５は、ＩＬ４アンタゴニストまたは部分アンタゴニストで ある、ＩＬ４のある種の変異株を記載する。 ＥＰ−Ａ−０４６４５３３は、種々の免疫グロブリン分子の不変領域部と、別 のヒト蛋白質またはその部分とからなる融合蛋白質を開示する。 本発明は、最低１つの免疫グロブリン不変領域またはそのフラグメントに融合 したＩＬ４変異体または変異株からなる、ＩＬ４および／またはＩＬ１３アンタ ゴニストまたは部分アンタゴニスト活性を有する可溶性蛋白質を提供するもので ある。 「変異体または変異株」なる語は、ヒトに内投与した後、ＩＬ４および／また はＩＬ１３を拮抗する能力を保持するＩＬ４蛋白質の不完全な誘導体または他の 誘導体などのいずれの分子をも包含する。かかる他の誘導体は、アミノ酸を付加 、欠失、置換または転位することで、またはその化学的修飾で調製することがで きる。 ＩＬ４の変異体または変異株をコードするＤＮＡポリマーは、常法により、例 えば、Ｇ.Ｗinterらにより、Ｎature １９８２、２９９、７５６−７５８に、ま たはＺollerおよびＳmith １９８２；Ｎucl.Ａcids Ｒes.、１０、６４８７−６ ５００に記載されているように、ＩＬ４をコードするｃＤＮＡの部位定方向性突 然変異、またはＣhanおよびＳmithによりＮucl.Ａcids Ｒes.、１９８４、１２ 、２４０７−２４１９にて、またはＧ.ＷinterらによりＢiochem.Ｓoc.Ｔrans. 、１９８４、１２、２２４−２２５に記載されているような欠失突然変異、ある いはＭikaelianおよびＳergeantによりＮucleic Ａcids Ｒesearch、１９９２、 ２０、３７６に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応により調製できる。 本明細書にて用いる場合、「ＩＬ４および／またはＩＬ１３アンタゴニストま たは部分アンタゴニスト活性を有する」とは、ＳpitsらによりＪ．Ｉmmunology １３９、１１４２（１９８７）にて記載されている検定にて、ＩＬ４刺激性Ｔ細 胞増殖が用量依存的にて阻害されることを意味する。 １２０から１２８までのいずれか１つの位置で、野生型ＩＬ４にて天然に存在 する少なくとも１個のアミノ酸が異なる天然アミノ酸と置換されている、適当な ＩＬ４変異体がＷＯ９３／１０２３５に開示されている。特に、１２４位に天然 に存在するチロシンは、グリシン、さらに好ましくはアスパラギン酸などの異な る天然アミノ酸で置換されていてもよい。 免疫グロブリンはいずれのサブクラス（ＩgＧ、ＩgＭ、ＩgＡ、ＩgＥ）であっ てもよいが、好ましくはＩgＧ１、ＩgＧ３またはＩgＧ４のようなＩgＧである。 該不変領域またはそのフラグメントは重鎖または軽鎖あるいはその両方から誘導 される。本発明は、Ｆcレセプター結合のような天然免疫グロブリンの望ましく ない特性を削除する、および／または安定性のような望ましい特性を導入する、 免疫グロブリン成分における突然変異を包含する。例えば、Ａngal Ｓ.、Ｋing Ｄ.Ｊ.、Ｂodmer Ｍ.Ｗ.、Ｔurner Ａ.、Ｌawson Ａ.Ｄ.Ｇ.、Ｒoberts Ｇ.、Ｐ edley Ｂ．およびＡdair Ｒ.は、Ｍolecular Ｉmmunology、vol.３０、１０５− １０８頁、１９９３において、残基２４１（Ｋabat番号付け）がセリンからプロ リンに変わっているＩgＧ４分子を記載する。この変化は、ＩgＧ４分子の血清半 減期を増加させる。Ｃanfield Ｓ.Ｍ.およびＭorrison Ｓ.Ｌ.はＪournal of Ｅ xperimental Ｍedicine、 vol.１７３、１４８３−１４９１頁において、ＩgＧ ３にてロイシンからグルタメートへの、およびマウスＩgＧ２ｂにてグルタメー トからロイシンへの残基２４８（Ｋabat番号付け）の変更を記載する。前者にお けるロイシンのグルタメートとの置換はＦcγＲＩレセプターに関連する免疫グ ロブリン分子のアフィニティーを減少させ、後者でのグルタメートのロイシンと の置換はそのアフィニティーを増加させる。ＥＰ０３０７４３４は、ＩgＧの残 基２４８（Ｋabat番号付け）のＬからＥへの突然変異を包含する種々の突然変異 を開示する。 不変領域またはそのフラグメントは、ヒトＩgＧの重鎖の不変領域の全体また は置換部であることが好ましく、最も好ましくはＩgＧ４である。一の態様にお いて、ＩgＧ成分はＣＨ２およびＣＨ３領域ならびに重鎖間のジスルフィド結合 に寄与するシステイン残基を含むＩgＧ１のヒンジ領域、例えばＩgＧ１ヒンジ領 域の残基１１と１４からなる（Ｆrangione Ｂ.およびＭilstein Ｃ.、Ｎature、 vol２１６、９３９−９４１頁、１９６７）。好ましくは、ＩgＧ１成分は、Ｅll ison Ｊ.、Ｂerson Ｂ.およびＨood Ｌ.Ｅ.、Ｎucleic Ａids Ｒesearch、vol１ ０、４０７１−４０７９頁、１９８２に記載のＩgＧ１のヒンジの残基１−４お よび６−１５、ＣＨ２の１−１１０およびＣＨ３の１−１０７に対応するアミノ 酸からなる。ヒンジの残基５は、ヌクレオチド配列のＴＧＴからＧＣＣへの 変更により、公開されたＩgＧ１配列におけるシステインからアラニンへと変わ っている。別の態様において、ＩgＧ成分は、ＣＨ２およびＣＨ３領域と、重鎖 間のジスルフィド結合に寄与するシステイン残基を包含するヒンジ領域、例えば ＩgＧ４ヒンジ領域の残基８および１１とからなるＩgＧ４より誘導される（Ｐin ck Ｊ.Ｒ.およびＭilstein Ｃ.、Ｎature、vol２１６、９４１−９４２頁、１９ ６７）。好ましくは、ＩgＧ４成分は、Ｅllison Ｊ.、Ｂuxbaum Ｊ.およびＨood Ｌ.、ＤＮＡ、vol１、１１−１８頁、１９８１に記載のＩgＧ４のヒンジの残基 １−１２、ＣＨ２の１−１１０およびＣＨ３の１−１０７に対応するアミノ酸か らなる。ＩgＧ４における適当な変異の一例として、ヒンジの残基１０（残基２ ４１、Ｋabat番号付け）を野生型のセリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）に変え、Ｃ Ｈ２の残基５（残基２４８、Ｋabat番号付け）を野生型のロイシン（Ｌ）からグ ルタメート（Ｅ）に変える。 ＩＬ４変異体または変異株のＩg不変領域またはフラグメントへの融合は、一 の成分のＣ−末端を他の成分のＮ−末端に融合させることでなされる。好ましく はＩＬ４変異体または変異株をそのＣ−末端を介してＩg不変領域またはフラグ メントのＮ−末端に融合させる。 好ましい態様において、本発明の融合蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号：４ 、配列番号：７または配列番号：１０で表される。 さらなる態様において、本発明は、本発明の化合物の製法であって、組換え宿 主細胞にて該化合物をコードするＤＮＡを発現させ、その産物を回収することか らなる方法を提供する。 該化合物をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡポリマーもまた本発明 の一部を形成する。 好ましい態様において、ＤＮＡポリマーは、配列番号：３、配列番号：６また は配列番号：９の配列からなる。 本発明の方法は、Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning−Ａ Ｌaboratory Ｍanu al：Ｃold Ｓpring Ｈarbor、１９８２およびＤＮＡ Ｃloning、第Ｉ巻、第II巻 および第III巻（Ｄ.Ｍ.Ｇlover編、ＩＲＩ Ｐress Ｌtd.）に記載されてい るような慣用的組換え技法により行うことができる。 特に、該方法は： ｉ）宿主細胞中、本発明の化合物をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ ポリマーの発現能を有する複製可能な発現ベクターを調製し； ii）宿主細胞を該ベクターで形質転換し； iii）該形質転換された宿主細胞を該ＤＮＡポリマーの発現を可能とする条件下 で培養し、該化合物を産生し；および iv）該化合物を回収する 工程からなる。 本発明はまた、適当なモノ−、ジ−またはオリゴマーヌクレオチドユニットを 融合することでＤＮＡポリマーを調製する方法を提供する。 該調製は、化学的に、酵素学的に、または２つの方法を組み合わせることによ り、適宜、in vitroまたはin vivoにて行うことができる。かくして、ＤＮＡポ リマーは、Ｄ.Ｍ.Ｒovertsら、Ｂiochemistry、１９８５、２４、５０９０−５ ０９８に記載されているような常法に従って、適当なＤＮＡフラグメントを酵素 的に連結することで調製される。 ＤＮＡフラグメントは、必要なヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、化学的合 成により、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型での酵素的重合により、またはこれらの方法 の組み合わせにより、適当な制限酵素で消化することで得られる。 制限酵素を用いる消化は、２０〜７０℃の温度で、一般に、５０μｌまたはそ れ以下の容量の適当なバッファー中、０.１〜１０μｇのＤＮＡで行うことがで きる。 ＤＮＡの酵素的重合は、１０〜３７℃の温度で、一般に５０μｌまたはそれ以 下の容量の、要すればヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよ びｄＴＴＰを含有する適当なバッファー中、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフ ラグメント）などのＤＮＡポリメラーゼを用い、in vitroにおいて行うことがで きる。 ＤＮＡフラグメントの酵素的連結は、４℃ないし外界温度で、一般に５０μｌ またはそれ以下の容量の適当なバッファー中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡ リガーゼを用いて実施することができる。 ＤＮＡポリマーまたはフラグメントの化学的合成は、'Ｃhemical and Ｅnzyma tic Ｓynthesis of Ｇene Ｆragments−Ａ Ｌaboratory Ｍanual'（Ｈ.Ｇ.Ｇass enおよびＡ.Ｌang編）、Ｖerlag Ｃhemie、Ｗeinheim（１９８２）または他の科 学刊行物、例えば、Ｍ．Ｊ.Ｇait、Ｈ.Ｗ.Ｄ.Ｍatthes、Ｍ.Ｓingh、Ｂ.Ｓ.Ｓpr oatおよびＲ.Ｃ.Ｔitmas、Ｎucleic Ａcids Ｒesearch、１９８２、１０、６２ ４３；Ｂ.Ｓ.ＳproatおよびＷ.Ｂannwarth、Ｔetrahedron Ｌetters、１９８３ 、２４、５７７１；Ｍ.Ｄ.ＭatteucciおよびＭ.Ｈ.Ｃaruthers、Ｔetrahedron Ｌetters、１９８０、２１、７１９；Ｍ.Ｄ.ＭatteucciおよびＭ.Ｈ.Ｃaruthers 、Ｊournal of the Ａmerican Ｃhemical Ｓociety、１９８１、１０３、３１８ ５；Ｓ.Ｐ.Ａdamsら、Ｊournal of the Ａmerican Ｃhemical Ｓociety、１９８ ３、１０５、６６１；Ｎ.Ｄ.Ｓinha、Ｊ.Ｂiernat、Ｊ.ＭcＭannusおよびＨ.Ｋo ester、Ｎucleic Ａcids Ｒesearch、１９８４、１２、４５３９；およびＨ.Ｗ. Ｄ.Ｍatthesら、ＥＭＢＯ Ｊournal、１９８４、３、８０１に記載されているよ うな固相合成法を用い、通常のホスホトリエステル、亜リン酸またはホスホルア ミダイト化学により行うことができる。好ましくは、自動式ＤＮＡ合成装置を用 いる。 ＤＮＡポリマーは、好ましくは、一緒になって化合物をコードするＤＮＡ配列 を構成する２またはそれ以上のＤＮＡ分子を連結することで調製される。本発明 による個々の方法は、そのＩＬ４変異体または変異株をコードする第１のＤＮＡ 分子およびその免疫グロブリン領域またはそのフラグメントをコードする第２の ＤＮＡ分子を連結することからなる。 ＤＮＡ分子は、必要なコーディング配列を有するベクターの適当な制限酵素で 消化することにより、またはポリメラーゼ連鎖反応合成法を用いることにより得 られる。 ＤＮＡ分子の正確な構造およびそれを得る方法は、所望の産物の構造に依存す る。化合物をコードするＤＮＡ分子を構築するための適当な方法を設計すること は当該分野における当業者にとって慣用的なことである。 組換え宿主細胞にて化合物をコードするＤＮＡポリマーの発現は、宿主細胞中 、ＤＮＡポリマーの発現能を有する複製可能な発現ベクターで行ってもよい。該 発現ベクターは新規であり、さらに本発明の一部を形成する。 複製可能な発現ベクターは、宿主細胞と適合するベクターを切断し、無傷のレ プリコンを有する線状ＤＮＡセグメントを得、該線状セグメントをその線状セグ メントと一緒になって連結反応条件下で化合物をコードする１またはそれ以上の ＤＮＡ分子を合することにより、本発明に従って調製することができる。 線状セグメントと１以上のＤＮＡ分子の連結は、同時にまたは所望により連続 的に行ってもよい。 すなわち、ＤＮＡポリマーは、予め形成されていても、または所望によりベク ターの構築の間に形成されてもよい。 ベクターの選択は、原核細胞、例えばイー・コリ（Ｅ.coli）、または真核細 胞、例えばマウスＣ１２７、マウス骨髄腫、チャイニーズハムスター卵巣または ヒーラ細胞、菌類、例えば糸状菌または単細胞酵母または昆虫細胞、例えばドロ ソフィラである宿主細胞によりいくらかは決定されるであろう。宿主細胞はまた 形質転換した生物であってもよい。適当なベクターは、プラスミド、バクテリオ ファージ、コスミドおよび例えば、バキュロウイルス、ワクシニアまたはセムリ キ森林熱ウイルスに由来の組換えウイルスを包含する。 複製可能な発現バクターの調製は、例えば、Ｍaniatisら、前掲の操作により ＤＮＡの制限、重合および連結についての適当な酵素を用いて慣用的に行われる 。重合および連結は、ＤＮＡポリマーの調製について前記したように行うことが できる。制限酵素を用いる消化は、２０〜７０℃の温度で、一般に５０μｌまた はそれ以下の容量の適当なバッファー中、０.１〜１０μｇのＤＮＡで行うこと ができる。 組換え宿主細胞は、本発明によれば、宿主細胞を、形質転換条件下、本発明の 複製可能な発現ベクターで形質転換することにより調製される。適当な形質転換 条件は慣用的なものであり、例えば、Ｍaniatisら、前掲に、または“ＤＮＡ Ｃloning”第II巻、Ｄ.Ｍ.Ｇlover編、ＩＲＬ Ｐress Ｌtd，１９８５に記載さ れている。 形質転換条件の選択は宿主細胞により決定される。すなわち、イー・コリのよ うな細菌宿主をＣaＣl₂の溶液（Ｃohenら、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.、１９７３ 、６９、２１１０）で、またはＲbＣl、ＭnＣl₂、酢酸カリウムおよびグリセロ ールの混合物からなる溶液で処理し、ついで３−［Ｎ−モルホリノ］−プロパン −スルホン酸、ＲbＣlおよびグリセロールで処理してもよい。培養物中の哺乳動 物細胞は、ベクターＤＮＡの細胞上へのカルシウム共沈殿により形質転換されて もよい。 本発明はまた本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞にま で及ぶ。 形質転換された宿主細胞の、ＤＮＡポリマーの発現を可能とする条件下での培 養は、例えば、前記したＭaniatisら、“ＤＮＡ Ｃloning”に記載されているよ うに、慣用的に行われる。かくして、好ましくは、細胞に栄養素を供給し、４５ ℃以下の温度で培養す。 発現産物は宿主細胞に応じた常套手段により回収される。すなわち、宿主細胞 がイー・コリのようなバクテリアであるなら、それを物理的、化学的または酵素 学的に溶菌させ、蛋白質産物を得られた溶菌液より単離してもよい。産物が細菌 細胞より分泌されるものであるならば、それを周辺腔または栄養培地より回収し てもよい。宿主細胞が哺乳動物細胞であるならば、産物は栄養培地より単離され るのが一般的である。 ＤＮＡポリマーを、産物を発現する安定な形質転換された哺乳動物細胞系を単 離するように設計されたベクター；例えば、ウシパピロマウイルスベクターまた はチャイニーズハムスター卵巣細胞の増幅ベクターに組み入れてもよい（ＤＮＡ Ｃloning、第II巻、Ｄ.Ｍ.Ｇlover編、ＩＲＬ Ｐress １９８５；Ｋaufman,Ｒ. Ｊ.ら、Ｍolecular and Ｃellular Ｂiology ５、１７５０−１７５９、１９８ ５；Ｐavlakis Ｇ.Ｎ.およびＨamer,Ｄ.Ｈ.、Ｐroceedings of the Ｎational Ａcademy of Ｓcience（ＵＳＡ）８０、３９７〜４０１、１９８３；Ｇoeddel, Ｄ.Ｖ.ら、欧州特許出願第００９３６１９号、１９８３）。 本発明の化合物はＩＬ４および／またはＩＬ１３アンタゴニスト活性を有し、 したがってＩＬ４および／またはＩＬ１３の望ましくない作用に由来する症状、 例えばＩgＥ介在アレルギー性疾患およびＴ細胞介在自己免疫症状または慢性微 生物感染症の治療にて有用であるかもしれない。 したがって、本発明はさらに、本発明の化合物と、医薬上許容される担体とか らなる医薬組成物を提供する。 使用において、該化合物は、通常、ヒト医薬用担体、希釈体および／または賦 形剤と組み合わせた医薬組成物の形態にて用いられるが、組成物の正確な形態は 投与方法に依存する。化合物は、例えば、吸入用のエアロゾルまたは噴霧溶液ま たは非経口投与用の滅菌溶液の形態にて用いられる。 本発明の化合物を投与する場合の投与量は、ＩＬ４および／またはＩＬ１３介 在症状に対して所望の効果を付与し、それによりＩgＥ抗体介在徴候が減少する か、または自己免疫疾患の進行が停止または後退する量である。その投与量は、 一般に、年齢、医学的症状、たとえあるとしても禁忌の程度または重篤度で変化 する。単位投与量は１ｍｇ以下から３００ｍｇまで変化しうるが、典型的には用 量当たり１〜２０ｍｇの範囲であり、一日の投与量が０.０２〜４０ｍｇ／ｋｇ の範囲にあるように、一日に１回またはそれ以上、例えば１〜６回投与する。 注射に適する組成物は、溶液、懸濁液またはエマルジョン、あるいは使用前に 適当なビヒクルに溶かすかまたは懸濁させる乾燥散剤の形態である。 流体単位投与形は、化合物および発熱物質不含の滅菌ビヒクルを用いて調製さ れる。用いるビヒクルおよび濃度に応じて、化合物をビヒクルに溶かすかまたは 懸濁させることができる。溶液は非経口投与用のあらゆる形態にて用いることが でき、とりわけ静脈内感染用に用いられる。溶液の調製においては、化合物をビ ヒクルに溶かし、必要ならば塩化ナトリウムを添加することで溶液を等張にし、 適当な滅菌バイアルまたはアンプルに充填し、かつ密封する前に無菌技法を用い 、滅菌フィルターを介して濾過することで滅菌処理する。別法として、溶液の安 定性が十分であるならば、密封容器中の溶液をオートクレーブで滅菌処理しても よ い。有利には、緩衝化剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤または殺菌剤、沈殿防止 剤または乳化剤および／または局所麻酔剤のような添加剤をビヒクルに溶かして もよい。 使用前に適当なビヒクルに溶かすかまたは懸濁させることができる乾燥散剤は 、予備滅菌処理した薬および他の成分を滅菌分野における無菌技法を用いて滅菌 容器に充填することにより調製してもよい。また、薬および他の成分を水性ビヒ クルに溶かし、該溶液を濾過により滅菌処理し、滅菌分野における無菌技法を用 いて適当な容器に分配してもよい。ついで、産物を凍結乾燥させ、容器を無菌状 態で密封する。 筋肉内、皮下または皮内注射に適する非経口用懸濁液は、滅菌化合物を滅菌ビ ヒクルに溶かす代わりに懸濁させ、滅菌処理を濾過で達成することができないこ とを除いて、実質的に同じ方法で調製する。化合物を滅菌状態で単離するか、ま たは別法として単離後に、例えば、γ線照射により滅菌処理してもよい。有利に は、沈殿防止剤、例えば、ポリビニルピロリドンを組成物中に配合し、化合物の 均一な分配を促進する。 気道を介する投与に適する組成物は、吸引用のエアロゾル、噴霧性溶液または 微細状粉末を包含する。後者の場合、５０ミクロン未満、特に１０ミクロン未満 の粒径が好ましい。そのような組成物は、常法にて製造され、通常の投与装置と 一緒に用いることができる。 さらなる態様において、ＩＬ４および／またはＩＬ１３の望ましくない作用に 由来する症状の治療法であって、有効量の本発明の化合物を患者に投与すること からなる方法を提供する。 本発明はさらには活性治療物質として用いるための、特にＩＬ４および／また はＩＬ１３の望ましくない作用に由来する症状を治療するための化合物を提供す る。 本発明はまたＩＬ４および／またはＩＬ１３の望ましくない作用に由来する症 状を治療するための医薬の製造における本発明の化合物の使用を提供する。 本発明の化合物を本発明に従って投与する場合、予期せぬ毒性作用は考えられ ない。 以下に実施例を用いて本発明を説明する。 実施例１ ＩＬ４．Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ１融合蛋白質 ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ１キメラｃＤＮＡの構築、哺乳動物の発現系におけ る対応する蛋白質の発現およびその活性を記載する。 １． 融合蛋白質をコードするＤＮＡの構築 （ａ） ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄコーディング領域の構築 蛋白質の残基１２４を野生型のチロシンからアスパラギン酸に変異させたと記 載されている（Ｋruse,Ｎ、Ｔony,Ｈ−ＰおよびＳebald,Ｗ．ＥＭＢＯ Ｊournal １１：３２３７［１９９２］）、ヒトＩＬ４遺伝子の変異体を、ヒトＩＬ４ｃ ＤＮＡ（Ｂritish Ｂiotechnologyより購入）をＰＣＲ突然変異誘発に付して産 生した。ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ ｃＤＮＡを、ＨindIIIおよびＢg１ II部位を用いて 発現ベクターｐＴＲ３１２に挿入し（Ｍ Ｊ Ｂrowne、Ｊ Ｅ Ｃarey、Ｃ Ｇ Ｃh apman、Ａ Ｗ Ｒ Ｔyrrell、Ｃ Ｅntwise、Ｇ Ｍ Ｐ Ｌawrence、Ｂ Ｒeavy、Ｉ Ｄodd、Ａ Ｅsmail＆Ｊ Ｈ Ｒobinson．Ｊournal of Ｂiochemistry２６３：１ ５９９、［１９８８］）、プラスミドｐＤＢ９０６を形成した。 ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ分子を増幅し、都合のよい制限部位を、各々、サブクロー ニングの終わりで加えるために、ＰＣＲ反応を基質として２０ｎｇのｐＤＢ９０ ６プラスミドを用いて行った。ＰＣＲプライマーを制限酵素部位を有するように 設計し、側面に１０−１５個のヌクレオチド塩基対を付し、終わりにプライマー を「アンカー」した。プライマー配列は以下のとおりであった： プライマーを最終濃度５ｎｇ／μｌで用い、ｄＮＴＰを合計１００μｌの反応 容量中０.２ｍＭの最終濃度で加えた。３１サイクルのＰＣＲを行った。サイク ルは９４℃で１分間の変性工程と、５０℃で１分３０秒間のアニーリング工程と 、７２℃で１分３０秒間の延長工程とからなる。サイクル１で、変性を５分間に 延ばし、最終サイクルで延長を７分間に延ばした。Ａdvanced Ｂiotechnologies 由来の２.５ユニットのＴaqポリメラーゼ酵素をＰＣＲ反応に用いた。５８７ｂ ｐのＰＣＲ産物を産生した。これをＰromega“マジックＰＣＲクリーンアップ（ Ｍagic ＰＣＲ cleanup）”キットを用いて精製し、ついで反応バッファー４中 、ＥcoＲＩおよびＫpnＩ（制限酵素はすべてＧibcoＢＲＬより購入した）で消化 し、「付着末端」を生成した。３７℃で４時間３０分経過した後、反応物を７０ ℃で１０分間加熱し、ついでエタノール沈降に付した。得られたＤＮＡをアガロ ースゲル電気泳動に付して分析し、約５７０ｂｐ、４６３ｂｐおよび１００ｂｐ の３つのバンドの存在が認められた。消化物は不完全であるため、存在した５７ ０ｂｐフラグメントはＩＬ４の全長ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ変異体を示す。２個のよ り小さなフラグメントは、ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ ｃＤＮＡ中にＥcoＲＩ部位がある ために産生された。５７０ｂｐバンドをＧeneclean^TM操作により精製し、ＥcoＲ ＩおよびＫpnＩで、つづいてＧeneclean^TMで消化することで調製されたＢluescr iptＫＳ^+TMに連結した。ＢluescriptＫＳ⁺／ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ組換え体をこう して形成した。この多量の組換えＤＮＡをＰromega“マジック・マキシプレプ（ Ｍagic Ｍaxiprep）”法を用いて産生した。ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ挿入体を、Ｓma ＩおよびＫpnＩを用い、Ｂluescript組換え体より切除した。２０μｇの組換え ＤＮＡを、反応バッファー４中、２５ユニットのＳmaＩと一緒に３０℃で一夜イ ンキュベートした。ついで、２５ユニットのＫpnＩをその消化物に加え、それを ３７℃で５時間インキュベートした。その得られた約５８０ｂｐのフラグ メントをＧeneclean^TMで精製し、ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＳmaＩ／ＫpnＩフラグメ ントを生成した。 （ｂ）ＩgＧ１コード領域の構築 ＣＯＳＦcＬinkベクター（表１）は、Ｅllison Ｊ.、Ｂerson Ｂ.およびＨood Ｌ.Ｅ.、Ｎucleic Ａcids Ｒesearch、第１０巻、４０７１−４０７９頁、１９ ８２に記載の、ヒンジのアミノ酸１−４および６−１５、ＣＨ２の１−１１０お よびＣＨ３の１−１０８をコードするヒトＩgＧ１ ｃＤＮＡを含有する。ヒンジ の残基５を、ヌクレオチド配列のＴＧＴをＧＣＣに変更することで、公開されて いるＩgＧ１配列のシステインからアラニンに変える。これを、ＲＴ−ＰＣＲを 用い、ヒトＩgＧ形質細胞白血病ＡＲＨ−７７（アメルシャム型組織収集（Ａmer ican Ｔype Ｔissue Ｃollection））よりクローンし、完全に配列決定し、公開 されている配列［特許出願公開ＷＯ９２／００９８５］との同一性を確認した。 ＣＯＳＦcの構築を前記のヒトＩgＧ１ ｃＤＮＡを含有するｐＵＣ１８ベクタ ー（ｐＵＣ１８−Ｆｃ）で始め、それをＫpnＩおよびＳacIIで消化し、ＣＨ１、 ヒンジおよびＣＨ２の一部を欠失させた。欠失領域を、以下のヒンジ−ＣＨ２領 域を含有するＰＣＲ増幅フラグメントで置き換えた。次のＰＣＲプライマーを用 いた： および ヒンジ−ＣＨ２領域含有のＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１８-Ｆcより増幅し、 ＫpnＩおよびＳacIIで消化し、ゲル精製し、ＫpnＩ／ＳacII消化ｐＵＣ１８-Ｆc ベクター中にクローンした。ＩgＧ１重鎖の２３０位に存する（Ｋabat番号付け ；Ｋabatら、“Ｓequence of Ｐroteins of Ｉmmunological Ｉnterest”、第５ 版、ＵＳＤepartment of Ｈealth and Ｈuman Ｓervices、ＮＩＨ出版、Ｎo.９ １− ３２４２（１９９１））Ｃysを、ヌクレオチド配列のＴＧＴをＧＣＣに置換する ことでＡlaに変更した。ＰＣＲプライマーの一部の変更ＤＮＡ配列をヒンジの５ '末端の独特ＫpnＩ部位に導入した。得られたプラスミドはｐＵＣ１８Ｆcmodと 称され、結合およびＰＣＲ増幅領域を確認のために配列決定した。 ｐＵＣ１８-Ｆcmod中の完全なヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３挿入物を、ＫpnＩおよ びＸbaＩで単一のＤＮＡフラグメントとして除去し、ゲル精製し、ＫpnＩおよび ＸbaＩで切断したＳＦcＲ１Ｃos４に連結し、ＣＯＳＦcを形成した。 ＳＦcＲ１Ｃos４はｐＳＴ４ＤＨＦＲ（Ｄeen,Ｋ、ＭcＤougal,ＪＳ、Ｉnacker ,Ｒ、Ｆolena-Ｗasserman,Ｇ、Ａrthos,Ｊ、Ｒosenberg,Ｊ、Ｍaddon,ＰＪ、Ａx el,ＲおよびＳweet,ＲＷ、Ｎature ３３１：８２［１９８８］）の誘導体であり 、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターとウシ成長ホルモン（ＢＧＨ） ポリアデニレーション領域の間に挿入される可溶性ＦcレセプターＩ型（ｓＦｃ Ｒ１）を含有し、さらにβ−グロビンプロモーターとＳＶ４０ポリアデニレーシ ョン領域の間に挿入されるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ、Ｓ Ｖ４０複製起点および細菌における成長のためのアンピシリン耐性遺伝子を含有 する。ベクターをＫpnＩおよびＸbaＩで切断することで、ＣＯＳＦcベクターが ＣＭＶプロモーターとＢＧＨポリＡ領域の間に挿入されるヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ ３領域を含有するように、ｓＦcＲ１コード領域が除去される。 このＥcoＲＩ部位を再び形成し、またＢstＥII、ＰstＩおよびＥcoＲＶをクロ ーンする部位を導入する、ベクターの独特ＥcoＲＩ部位でオリゴヌクレオチドリ ンカーを挿入することにより、ＣＯＳＦcＬinkベクターをＣＯＳＦcより調製し た。 結合を配列決定し、ベクターにおける配向を確認した。最終ベクターの大きさ は６.３７ｋｂである。 （ｃ）融合蛋白質をコードするＤＮＡの構築 ＩＬ４.Ｙ１２４ＤｃＤＮＡを挿入するために、ＣＯＳＦcＬinkベクターをＥc oＲＶおよびＫpnＩで以下のように消化することで調製した：５μｇのＤＮＡを 反応２にて３７℃で５時間、１５ユニットのＥcoＲＶと一緒にインキュベートし 、つづいてエタノール沈降に付した。得られたＤＮＡを反応４にて３７℃で３時 間、ＫpnＩで消化し、エタノール沈降に付した。ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＳmaＩ／ ＫpnＩおよびＣＯＳＦcＬink／ＥcoＲＶ／ＫpnＩフラグメントを連結し、ＩＬ４ .Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ１融合蛋白質をコードする、プラスミドｐＤＢ９５１を形成 した。Ａmersham ＤＮＡ連結キット、製品コードＲＰＮ １５０７を用い、反応 物を１６℃で一夜インキュベートし、連結を達成した。連結反応産物をＰromega ＪＭ能力細胞（高能力）に形質転換し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌで含有 するＬuria Ｂroth寒天にプレートした。形質転換物をＬuria Ｂroth（アンピシ リンを５０μｇ／ｍｌで含有）中で培養し、ＤＮＡをＰromega“マジック・マキ シプレプ”を用いて調製した。ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＣＯＳＦcＬink組換えＤＮ Ａの産生を制限消化物およびＤＮＡ配列決定により確認した。完全ＩＬ４.Ｙ１ ２４Ｄ配列およびＣＯＳＦcＬinkＤＮＡとの結合をＤＮＡ配列決定により確認し た（表２）。組換えＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ１ＤＮＡのコード配列を表３に示 し、融合蛋白質のアミノ酸配列を表４に示す。ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＣＯＳＦcＬ ink組換えＤＮＡを調製し、塩化セシウム勾配を用いて精製し、そのＤＮＡを用 いてヒーラ細胞を一時的にトランスフェクトした。 ２．融合蛋白質の発現 ヒーラ細胞を、１０％ウシ胎児血清および１％グルタミンを含むＭＥＭα培地 （Ｇibco）にて培養した。検定のために、トランスフェクションの４日前、１ｘ １０⁶個のヒーラ細胞を、７５ｃｍ²のフラスコ中、１０％ウシ新生児血清、１％ グルタミンを含む１５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地（「シード培地」）にて接 種した。トランスフェクションの前日に、さらに１２.５ｍｌのシード培地を各 フラスコに加えた。トランスフェクションの当日に、培地を、１５ｍｌの「トラ ンスフェクション培地」（１０％ウシ新生児血清および１％非必須アミノ酸を有 するエール（Ｅarle's）塩を含むＭＥＭ培地）に変えた（時間０）。＋３時間の 時に、０.１２５Ｍ ＣaＣl₂、１ｘＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝セイライン）中の適 当なＤＮＡ（２５μｇ）をその細胞に加えた。＋７時間の時に、細胞をグリセロ ールショック（１５％ｖ／ｖ）に付し、ついで５ｍＭの酪酸ナトリウム含有の１ ２.５ｍｌのシード培地中で一夜放置してインキュベートした。その翌日、細胞 をＰＢＳ（ダルベッコ（Ｄulbecco）のリン酸緩衝セイライン）で洗浄し、１２. ５ｍｌの「収集培地」（７.５％のストック炭酸水素ナトリウム溶液を２％有す るＲＰＭＩ−１６４０）を加えた。さらに１２４時間インキュベートした後、上 澄を取り出し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離に付し、細胞残骸を除去し、４ ℃または−２０℃のいずれかで貯蔵した。 ３．生物学的活性 ＩＬ４アンタゴニスト活性について上澄を検定するために：Ｓpitsら、Ｊ．Ｉ mmunology １３９，１１４２（１９８７）に記載の方法を用い、ヒト末梢血液リ ンパ球をフィトヘマグルチニン、Ｔ細胞マイトジェンと一緒に３日間インキュベ ートし、ＩＬ４レセプターをアップレギュレーションさせた。ついで、得られた 芽細胞をＩＬ４でさらに３日間刺激した。増殖を３Ｈチミジンの組み込みにより 測定した。 ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ１キメラは、用量依存法における１３３ｐＭのＩＬ ４で刺激されたヒト末梢血液Ｔリンパ球による³Ｈチミジンの組み込みを阻害し た。 実施例２ ＩＬ４．Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４融合蛋白質 １．融合蛋白質をコードするＤＮＡの構築 ＰＣＲを行って、ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄコード領域を増幅し、ＸhoＩ部位を形成 する３'末端でサイレントヌクレオチド置換を導入した。ＰＣＲ反応のための基 質として、２０ｎｇの線状化ｐＤＢ９５１プラスミド（実施例１.１（ｃ））を 用いた。用いたオリゴヌクレオチドプライマーを以下のとおりであった： 第２のＰＣＲ反応を行って、ヒトＩgＧ４重鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３フラ グメントを増幅した。このための基質は合成ヒトＩgＧ４重鎖ｃＤＮＡであり、 その配列は表５に記載されており、Ｇenbank配列ＧＢ：ＨＵＭＩＧＣＤ２に基づ いている（Ｅllison Ｊ.、Ｂuxbaum Ｊ.およびＨood Ｌ.Ｅ.、ＤＮＡ １：１１ −１８、１９８１）。多くのサイレント置換を公開されたヌクレオチド配列に対 して行った。２つの０.５ｋｂ合成ＤＮＡフラグメントを合することで遺伝子を 組み合わせた。各０.５ｋｂのフラグメントは、一連の重複オリゴヌクレオチド をアニーリングし、ついでギャップをＰＣＲで充填することで調製した。２個の ０.５ｋｂフラグメントをＳacII部位で合し、ｐＣＲ２ベクターに挿入した。完 全な不変領域を含有する１.０ｋｂのＡpaＩ-ＢglIIフラグメントを単離し、ヒト 化ＩＬ４特異的可変領域を含有する発現ベクター、ｐＣＤに連結した。この構築 物をＰＣＲ基質として用い、ＩgＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域を増幅した 。 ＩgＧ４ヒンジ-ＣＨ２-ＣＨ３領域を増幅するのに用いたオリゴヌクレオチド プライマーは次のとおりであった： 両方のＰＣＲ反応についての条件はｐＤＢ９５１の誘導について記載したとお りであった。簡単には、プライマーを５ｎｇ／μｌで用い、ｄＮＴＰを合計１０ ０μｌの反応容量中０.２ｍＭの最終濃度で加えた。２.５ユニットのＡdvanced ＢiotechnologiesからのＴaqポリメラーゼ酵素を用いて、３１サイクルのＰＣＲ 反応を行った。サイクルは９４℃で１分間の変性工程、５０℃で１分３０秒間の アニーリング工程、および７２℃で１分３０秒間の延長工程からなった。サイク ル１で変性を５分間に延ばし、最終サイクルで延長を７分に延ばした。 約７００ｂｐ（ＩgＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）および４００ｂｐ（ＩＬ ４.Ｙ１２４Ｄ）のＰＣＲ産物を得、Ｐromega“マジック・ＰＣＲ・クリーンア ップ”キットを用いて精製した。ついで、精製したＰＣＲ反応物を次の酵素で消 化し、「付着末端」を形成した：ＩgＧ４ではＸhoＩおよびＸbaＩならびにＩＬ ４.Ｙ１２４ＤではＥcoＲＶおよびＸhoＩ。消化物を３７℃で３時間インキュベ ートし、ついでエタノール沈降に付した。得られたＤＮＡをゲル電気泳動法によ り分析し、約６９０ｂｐ（ＩgＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）および３７０ｂ ｐ（ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ）の大きさを得た。 ｐＤＢ９５１（ＣＯＳＦｃＬinkにおけるＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ）をＥcoＲＶおよ びＸbaＩで消化することによりＩgＧ４ ＰＥのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３およびＩ Ｌ４.Ｙ１２４Ｄフラグメントを連結させ、大部分のＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ １融合分子を除去するためのベクターを調製する。わずかに残っている部分はＩ Ｌ４の５'末端の約７５ｂｐであり、それはＰＣＲ増幅で産生したＩＬ４.Ｙ１２ ４Ｄ ＥcoＲＶ／ＸhoＩフラグメントには存在しなかった。５μｇのｐＤＢ９５ １ＤＮＡを反応バッファー２（ＧibcoＢＲＬ）を用いて合計３０μｌの容量にて 消化した。得られた５.８ｋｂのＤＮＡフラグメントをＧeneclean^TM操作を用い て精製した。 ３種の記載されているフラグメント（ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ ＥcoＲＶ／ＸhoＩ、 ＩgＧ４ ＸhoＩ／ＸbaＩのヒンジ-ＣＨ２-ＣＨ３およびｐＤＢ９５１のＥcoＲＶ ／ＸbaＩ消化により得られる５.８ｋｂフラグメント）を一緒に連結して、ＩＬ ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４融合蛋白質をコードする、プラスミトｐＤＢ９５２を形 成した。連結反応をＡmersham製のＤＮＡ連結キット（製品コードＲＰＮ１５０ ７）を用い、反応物を１６℃で一夜インキュベートすることで行った。連結反応 産物をＰromega ＪＭ１０９能力細胞（高能力）に形質転換し、アミピシリンを ５０μｇ／ｍｌで含有するＬuria Ｂroth寒天上にプレートした。形質転換体を Ｌuria Ｂroth（アミピシリンを５０μｇ／ｍｌで含有する）で培養し、ＤＮＡ をＰromega“マジック・ミニプレプス”を用いて調製した。ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ ／ＩgＧ４組換えＤＮＡの産生を制限消化物で確認し、完全ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄお よびヒンジ-ＣＨ２-ＣＨ３ ＩgＧ４領域をＤＮＡ配列決定により確認した。表６ はＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４融合分子のコード領域の配列だけを記載し、表７ は融合蛋白質のアミノ酸配列を含む。ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４組換えＤＮＡ を調製し、塩化セシウム勾配で精製し、そのＤＮＡを用いてヒーラ細胞を一時的 にトランスフェクトさせた。 ２．融合蛋白質の発現 ヒーラ細胞を１０％ウシ胎児血清および１％グルタミンを含むＭＥＭα培地（ Ｇibco）で増殖させた。検定のために、トランスフェクションの４日前、１ｘ１ ０⁶個のヒーラ細胞を、フラスコ（７５ｃｍ²）中、１０％ウシ新生児血清、１％ グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０（「シード培地」）（１５ｍｌ）に接種し た。トランスフェクションの前日に、さらに１２.５ｍｌのシード培地を各フラ スコに加えた。トランスフェクションの当日に、培地を、１５ｍｌの「トランス フェクション培地」（１０％ウシ新生児血清および１％非必須アミノ酸を有する エール塩を含むＭＥＭ培地）に変えた（時間０）。＋３時間の時に、０.１２５ Ｍ ＣaＣl₂、１ｘＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝セイライン）中の適当なＤＮＡ（２５ μｇ）をその細胞に加えた。＋７時間の時に，細胞をグリセロールショック（１ ５％ｖ／ｖ）に付し、ついで５ｍＭ酪酸ナトリウム含有の１２.５ｍｌのシード 培地にて一夜放置してインキュベートした。その翌日、細胞をＰＢＳ（ダルベッ コ・リン酸緩衝セイライン）で洗浄し、１２.５ｍｌの「収集培地」（７.５％の ストック炭酸水素ナトリウム溶液を２％含むＲＰＭＩ−１６４０）を加えた。 さらに２４時間インキュベートした後、上澄を取り出し、１０００ｒｐｍで５分 間遠心分離に付し、細胞残骸を除去し、４℃または−２０℃のいずれかで貯蔵し た。 ３．生物学的活性 ＩＬ４アンタゴニスト活性について上澄を検定するために：Ｓpitsら、Ｊ.Ｉm munology １３９、１１４２（１９８７）に記載の方法を用い、ヒト末梢血液リ ンパ球をフィトヘマグルチニン、Ｔ細胞マイトジェンと一緒に３日間インキュベ ートし、ＩＬ４レセプターをアップレギュレーションさせた。ついで、得られた 芽細胞をＩＬ４でさらに３日間刺激した。増殖を３Ｈチミジンの組み込みにより 測定した。 ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４キメラは、用量依存法の１３３ｐＭのＩＬ４で刺 激されたヒト末梢血液Ｔリンパ球による³Ｈチミジンの組み込みを阻害した。 実施例３ ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４ ＰＥ融合蛋白質 １．融合蛋白質をコードするＤＮＡの構築 ＰＣＲを行い、ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄコード領域を増幅し、実施例２に記載する ようにＸhoＩ部位を形成するその３’末端でサイレントヌクレオチド置換を導入 する。 第２のＰＣＲ反応を行い、ヒトＩgＧ４重鎖ＰＥ変異体のヒンジ−ＣＨ２−Ｃ Ｈ３フラグメントを増幅させる。ＩgＧ４ ＰＥにおいて、ヒンジの残基１０（Ｋ abat番号付け、残基２４１）を野生型のセリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）に変え 、ＣＨ２の残基５（Ｋabat番号付け、残基２４８）を野生型のロイシン（Ｌ）か らグルタミン酸塩（Ｅ）に変える。Ａngal Ｓ.、Ｋing Ｄ.Ｊ.、Ｂodmer Ｍ.Ｗ. 、Ｔurner Ａ.、Ｌawson Ａ.Ｄ.Ｇ.、Ｒoberts Ｇ.、Ｐedley Ｂ.およびＡdair Ｒ.、Ｍolecular Ｉmmunology、第１３０巻、１０５〜１０８頁、１９９３は、 ２４１残基（Ｋabat番号付け）がセリンからプロリンに改変されているＩgＧ４ 分子を記載する。この変化はＩgＧ４分子の血清半減期を増加させる。 ＩgＧ４ ＰＥ変異体を、表５に記載の合成ヒトＩgＧ４重鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ 突然変異誘発に付して形成させ、ついでｐＣＤ発現ベクターに連結させた。これ はＩgＧ４ＰＥのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３フラグメントを増幅させるＰＣＲ反応 の基質として用いるブラスミドであった。ＩgＧ４ ＰＥ変異体の配列を表８に記 載する。ＰＥ変異体を調製するのに改変されるＩgＧ４ ヌクレオチド配列の残基 は以下のとおりである： 表８を参考にして： 残基３２２を野生型の「Ｔ」からＰＥ変異体にて「Ｃ」に改変し； 残基３３３を野生型の「Ａ」からＰＥ変異体にて「Ｇ」に改変し；そして 残基３４３〜３４４を野生型の「ＣＴ」からＰＥ変異体にて「ＧＡ」に改変 する オリゴヌクレオチドのプライマーを、ｐＤＢ９５２の誘導化について記載する ように、ＩgＧ４ ＰＥ変異体のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域を増幅するのに用い る。 約７００ｂｐ（ＩgＧ４ ＰＥ変異株のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）および４００ ｂｐ（ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ）のＰＣＲ産物を得、Ｐromega“マジックＰＣＲクリ ーンアップ”キットを用いて精製する。ついで、その精製したＰＣＲ反応物を次 の酵素で消化し、「付着末端」：ＩgＧ４ ＰＥではＸhoＩおよびＸbaＩならびに ＩＬ４.Ｙ１２４ＤではＥcoＲＶおよびＸhoＩを形成する。消化物を３７℃で３ 時間インキュベートし、ついでエタノール沈降に付す。得られたＤＮＡは約６９ ０ｂｐ（ＩgＧ４ ＰＥのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）および３７０ｂｐ（ＩＬ４. Ｙ１２４Ｄ）の大きさである。 多量のＩgＧ４ ＰＥ変異体のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３フラグメントおよびＩＬ ４.Ｙ１２４Ｄフラグメントを得るために、精製し、かつ消化したＰＣＲ産物を 、ＩgＧ４ ＰＥフラグメントのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ではＸhoＩおよびＸbaＩ またはＩＬ４.Ｙ１２４ＤフラグメントではＥcoＲＶおよびＸhoＩのいずれかで 消化することで調製されるＢluescript ＫＳ^+TMに、つづいてＧeneclean^TMに連 結する。こうして、Ｂluescript ＫＳ⁺／ＩgＧ４ ＰＥ組換え体のヒンジ−ＣＨ ２−ＣＨ３およびＢluescript ＫＳ⁺／ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ組換え体を生成する。 多 量のこれらのＤＮＡがＰromega“マジック・マクシプレプ（Ｍagic Ｍaxiprep） ”法を用いて産生される。ＩgＧ４ ＰＥヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３フラグメントを ＸhoＩおよびＸbaＩを用いてＢluescript組換え体より切除する。得られた約６ ９０ｂｐのフラグメントをＧeneclean^TMで精製し、多量のＩgＧ４ ＰＥヒンジ− ＣＨ２−ＣＨ３ＸhoＩ／ＸbaＩフラグメントを生成する。ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄフ ラグメントをＥcoＲＶおよびＸhoＩを用いてＢluescript組換え体より切除し、 得られた約３７０ｂｐのフラグメントをＧeneclean^TMで精製する。 ｐＤＢ９５２の誘導化で記載したように、ｐＤＢ９５１をＥcoＲＶおよびＸba Ｉで消化することによりＩgＧ４ ＰＥのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３およびＩＬ４. Ｙ１２４Ｄフラグメントを連結させるためのベクターを調製する。 ３種の記載されているフラグメント（ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ ＥcoＲＶ／ＸhoＩ、 ＩgＧ４ ＰＥ変異体ＸhoＩ／ＸbaＩのヒンジ-ＣＨ２-ＣＨ３およびｐＤＢ９５１ のＥcoＲＶ／ＸbaＩ消化により得られる５.８ｋｂフラグメント）を一緒に連結 して、Ａmerscham製のＤＮＡ連結キット（製品コードＲＰＮ１５０７）を用い、 １６℃で一夜反応体をインキュベートして、プラスミドｐＤＢ９５３を形成する 。連結反応産物をＰromega ＪＭ１０９能力細胞（高能力）に形質転換し、５０ μg／ｍｌのアミピシリンを含有するＬuria Ｂroth寒天上にプレートする。形質 転換体をＬuria Ｂroth（アミピシリンを５０μｇ／ｍｌで含有する）で培養し 、ＤＮＡをＰromega“マジック・ミニプレプス”を用いて調製する。ＩＬ４.Ｙ １２４Ｄ／ＩgＧ４ＰＥ変異体組換えＤＮＡの産生を制限消化物で確認し、完全 ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄおよびヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ ＩgＧ４ ＰＥ変異体領域をＤ ＮＡ配列決定により確認する。表９はＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４ ＰＥ融合分 子のコード領域の配列だけを記載し、表１０は融合蛋白質のアミノ酸配列を含む 。ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４ ＰＥ組換えＤＮＡを調製し、塩化セシウム勾配 で精製し、そのＤＮＡを用いてヒーラ細胞を一時的にトランスフェクトさせる。 ２．融合蛋白質の発現 ヒーラ細胞を１０％ウシ胎児血清および１％グルタミンを含むＭＥＭα培地（ Ｇibco）で増殖させた。検定のために、トランスフェクションの４日前、１ｘ １０⁶個のヒーラ細胞を、フラスコ（７５ｃｍ²）中、１０％ウシ新生児血清、１ ％グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０（「シード培地」）（１５ｍｌ）に接種 した。トランスフェクションの前日に、さらに１２.５ｍｌのシード培地を各フ ラスコに加えた。トランスフェクションの当日に、培地を、１５ｍｌの「トラン スフェクション培地」（１０％ウシ新生児血清および１％非必須アミノ酸を有す るエール塩を含むＭＥＭ培地）に変えた（時間０）。＋３時間の時に、０.１２ ５Ｍ ＣaＣl₂、１ｘＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝セイライン）中の適当なＤＮＡ（２ ５μｇ）をその細胞に加えた。＋７時間の時に，細胞をグリセロールショック（ １５％ｖ／ｖ）に付し、ついで５ｍＭ酪酸ナトリウム含有の１２.５ｍｌのシー ド培地にて一夜放置してインキュベートした。その翌日、細胞をＰＢＳ（ダルベ ッコ・リン酸緩衝セイライン）で洗浄し、１２.５ｍｌの「収集培地」（７.５％ のストック炭酸水素ナトリウム溶液を２％含むＲＰＭＩ-１６４０）を加えた。 さらに２４時間インキュベートした後、上澄を取り出し、１０００ｒｐｍで５分 間遠心分離に付し、細胞残骸を除去し、４℃または−２０℃のいずれかで貯蔵し た。 ３．生物学的活性 ＩＬ４アンタゴニスト活性について上澄を検定するために：Ｓpitsら、Ｊ．Ｉ mmunology １３９、１１４２（１９８７）に記載の方法を用い、ヒト末梢血液リ ンパ球をフィトヘマグルチニン、Ｔ細胞マイトジェンと一緒に３日間インキュベ ートし、ＩＬ４レセプターをアップレギュレーションさせた。ついで、得られた 芽細胞をＩＬ４でさらに３日間刺激した。増殖を３Ｈチミジンの組み込みにより 測定した。 ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４ ＰＥキメラは、用量依存法で１３３ｐＭのＩＬ ４を用いて刺激したヒト末梢血液Ｔリンパ球による³Ｈチミジンの組み込みを阻 害した。 実施例４．ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４ ＰＥをコードするＤＮＡ含有の哺乳動 物発現ベクター １．ＤＮＡの構築 ｐＣＤＮベクター（Ａiyar,Ｎ.、Ｂaker,Ｅ.、Ｗu,Ｈ-Ｌ.、Ｎambi,Ｐ.、Ｅdw ards,Ｒ.Ｍ.、Ｔrill,Ｊ.Ｊ.、Ｃ.Ｂergsma,Ｄ．Ｍolecular and Ｃellular Ｂi ochemistry １３１：７５−８６、１９９４）は、ＣＭＶプロモーター、ポリリ ンカークローニング領域、およびＢＧＨポリアデニル化領域を含有する。このベ クターは、Ｇeneticin^TMを選択するためにβ−グロビンプロモーターとＳＶ４０ ポリアデニル化領域の間に挿入される細菌性ネオマイシンホスホトランスフェラ ーゼ遺伝子（ＮＥＯ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）を増幅するためにβ−グロ ビンプロモーターとＢＧＨポリアデニル化領域の間に挿入されるＤＨＦＲ選択カ セット、細菌を増殖するためのアンピシリン耐性遺伝子および複製のＳＶ４０起 点を含有する。 ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４ ＰＥｃＤＮＡを挿入するために、ｐＣＤＮベク ターを以下のようにＮde１およびＢstＸ１で消化することで調製した：１５μｇ のＤＮＡを反応２にて３０ユニットのＢstＸ１（Ｇibco-ＢＲＬ）と５５℃で１ 時間インキュベートし、エタノール沈降に付した。得られたＤＮＡを反応２にて Ｎde１を用い、３７℃で１時間消化し、エタノール沈降に付した。ｐＤＢ９５３ （実施例３．１）をＢstＸ１およびＮde１で以下のように消化することでＩＬ４ .Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４ ＰＥフラグメントを調製した：１５μｇのＤＮＡを反応 ２にて３０ユニットのＢstＸ１と５５℃で１時間インキュベートし、エタノール 沈降に付した。得られたＤＮＡを反応２にてＮde１を用い、３７℃で１時間消化 し、エタノール沈降に付した。 ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４ ＰＥ Ｎde１／ＢstＸ１およびｐＣＤＮ Ｎde１ ／ＢstＸ１フラグメントを連結し、プラスミドｐＣＤＮ−ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ ＩgＧ４ ＰＥを形成させた。連結を２ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｇibco- ＢＲＬ）とＴ４ＤＮＡリガーゼバッファーを一緒に用いて行った。反応物を１６ ℃で一夜インキュベートした。連結反応産物をＧibco-ＢＲＬ ＤＨ５ａ能力細胞 （サブクローニング能）に形質転換し、７５μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬur ia Ｂroth寒天上にプレートした。形質転換体をＬuria Ｂroth（５０μｇ／ ｍｌのアンピシリン含有）中で培養し、アルカリ性溶菌によりＤＮＡを調製した 。ｐＣＤＮ−ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４ ＰＥ ＤＮＡの産生を制限消化物で確 認した。組換えＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４ ＰＥ ＤＮＡの完全な配列を配列決 定により確認した。ｐＣＤＮ−ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４ ＰＥ組換えＤＮＡ を調製し、Ｑiagenカラムを用いて精製し、ＤＮＡを用いて一時的にＣＯＳ細胞 を感染させ、ＣＨＯ細胞をエレクトロポレーションに付し、安定なクローンを形 成させた。 ２．融合蛋白質の発現 ａ）ＣＯＳにおける一時的発現 ＣＯＳ−１細胞を１０％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ培地中に増殖させた。 トランスフェクションのために、２４時間前に細胞を３５ｍｍの組織培養皿に２ ｘ１０⁵細胞で接種した。血清不含の１００μｌのＤＭＥＭ中に１μｇのＤＮＡ を含有する溶液を、血清不含の１００μｌのＤＭＥＭ中に６μｌのＬＩＰＯＦＥ ＣＴＡＭＩＮＥ試薬（Ｇibco-ＢＲＬ）含有の溶液に添加し、緩やかにかき混ぜ 、室温で４５分間インキュベートする。該細胞を血清不含ＤＭＥＭで１回洗浄す る。０.８ｍｌの血清不含ＤＭＥＭをＤＮＡ−ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ溶液 に添加し、緩やかに混合し、その希釈溶液を細胞上に重層させる。細胞を３７℃ で５時間インキュベートし、ついで１ｍｌの２０％ウシ胎児血清含有のＤＭＥＭ を加える。細胞を４８−７２時間後に検定し、発現レベルを測定する。 ｂ）ＣＨＯ細胞へのエレクトロポレーション ＣＨＯ細胞、ＡＣＣ−０９８（ＣＨＯ ＤＧ−４４由来の懸濁細胞系、Ｕrlaub ,Ｇ.、Ｋas,Ｅ.、Ｃarothers,Ａ.Ｍ.およびＣhasin,Ｌ.Ａ．Ｃell,３３．４０５ −４１２、１９８３）を血清不含成長培地にて増殖させた（ＷＯ９２／０５２４ ６）。１５μｇのｐＣＤＮ−ＩＬ４.Ｙ１２４Ｄ／ＩgＧ４ ＰＥプラスミドを３ ０ユニットのＮot１を用い、３７℃で３時間消化して該プラスミドを直線状にし 、エタノールを用いて沈降させた。得られたＤＮＡを５０μｌの１ｘＴＥ（１０ ｍＭ トリス、pＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再び懸濁させた。ＤＮＡを、３８ ０Ｖおよび２５μＦdにセットしたＢio Ｒad Ｇene Ｐulserを用い、１ｘ１０⁷ ＡＣＣ−０９８細胞にエレクトロポレートした。細胞を成長培地中に２.５ｘ１ ０⁴細胞／ｍｌで再び懸濁させ、２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレート の各ウェルにプレートした。４８時間後、培地を４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ Ｇeneticin）含有の成長培地に変えた。選択後２４時間経過した後、生じたコロ ニーに由来の条件培地をＥＬＩＳＡ検定によりスクリーンした。最も高い発現コ ロニーを、スケールアップするために２４ウェルプレートに移した。 1

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ブラウン，マイケル・ジョゼフ イギリス、シーエム19・５エイディ、エセ ックス、ハーロウ、ザ・ピナクルズ、コー ルドハーバー・ロード （番地の表示な し） スミスクライン・ビーチャム・ファ ーマシューティカルズ (72)発明者 マーフィ，ケイ・エリザベス イギリス、シーエム19・５エイディ、エセ ックス、ハーロウ、ザ・ピナクルズ、コー ルドハーバー・ロード （番地の表示な し） スミスクライン・ビーチャム・ファ ーマシューティカルズ (72)発明者 チャップマン，コンラッド・ジェラルド イギリス、シーエム19・５エイディ、エセ ックス、ハーロウ、ザ・ピナクルズ、コー ルドハーバー・ロード （番地の表示な し） スミスクライン・ビーチャム・ファ ーマシューティカルズ (72)発明者 クリンケンバード，ヘレン・エリザベス イギリス、シーエム19・５エイディ、エセ ックス、ハーロウ、ザ・ピナクルズ、コー ルドハーバー・ロード （番地の表示な し） スミスクライン・ビーチャム・ファ ーマシューティカルズ (72)発明者 ヤング，ピーター・ロナルド アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州 キング・オブ・プルシア、スウェードラン ド・ロード709番 スミスクライン・ビー チャム・ファーマシューティカルズ、リサ ーチ・アンド・ディベロップメント (72)発明者 シャッツマン，アラン・リチャード アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州 キング・オブ・プルシア、スウェードラン ド・ロード709番 スミスクライン・ビー チャム・ファーマシューティカルズ、リサ ーチ・アンド・ディベロップメント

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１つのヒト免疫グロブリン不変領域またはそのフラグメントに 融合したＩＬ４変異体または変異株からなる、ＩＬ４および／またはＩＬ１３ア ンタゴニストまたは部分アンタゴニスト活性を有する可溶性蛋白質。 ２．１２０から１２８位までのいずれか１つの位置で、野生型ＩＬ４にて天然 に存在する少なくとも１個のアミノ酸が異なる天然アミノ酸で置換されている請 求項１記載の化合物。 ３．１２４位に天然に存在するチロシンが異なる天然アミノ酸で置換されてい る請求項２記載の化合物。 ４．１２４位に天然に存在するチロシンがアスパラギン酸で置換されている請 求項３記載の化合物。 ５．免疫グロブリンがサブクラスＩgＧのものである前記した請求項のいずれ か１つに記載の化合物。 ６．不変領域（複数）またはそのフラグメントがヒトＩgＧの重鎖の不変領域 の全体または実体的部分である請求項５記載の化合物。 ７．不変領域（複数）またはそのフラグメントがヒトＩgＧ４の重鎖の不変領 域の全体または実体的部分である請求項５記載の化合物。 ８．配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配 列を有する請求項１記載の化合物。 ９．前記した請求項のいずれか１つに記載の化合物の製法であって、 組換え宿主細胞にて該化合物をコードするＤＮＡを発現させ、その産物を回収す ることからなる方法。 10． ｉ）宿主細胞中、前記した請求項のいずれか１つに記載の化合物をコードするヌ クレオチド配列からなるＤＮＡポリマーの発現能を有する複製可能な発現ベクタ ーを調製し； ii）宿主細胞を該ベクターで形質転換し； iii）該形質転換された宿主細胞を該ＤＮＡポリマーの発現を可能とする条件下 で培養し、該化合物を産生し；および iv）該化合物を回収する ことからなる請求項９記載の方法。 11．請求項１ないし８のいずれか１つに記載の化合物をコードするヌクレオチ ド配列からなるＤＮＡポリマー。 12．配列番号：３、配列番号：６または配列番号：９の配列からなる請求項１ １記載のＤＮＡポリマー。 13．請求項１１に記載のＤＮＡポリマーからなる複製可能な発現ベクター。 14．請求項１３に記載の複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 15．請求項１ないし８のいずれか１つに記載の化合物と、医薬上許容される担 体とからなる医薬組成物。 16．ＩＬ４および／またはＩＬ１３の望ましくない作用に由来する症状の治療 方法であって、有効量の請求項１に記載の化合物を患者に投与することからなる 方法。 17．治療にて用いるための請求項１ないし８のいずれか１つに記載の化合物。 18．ＩＬ４および／またはＩＬ１３の望ましくない作用に由来する症状の治療 にて用いるための請求項１ないし８のいずれか１つに記載の化合物。 19．ＩＬ４および／またはＩＬ１３の望ましくない作用に由来する症状の治療 にて用いるための医薬の製造における請求項１ないし８のいずれか１つに記載の 化合物の使用。