JPH10503473A

JPH10503473A - 細胞傷害性ｔリンパ球刺激およびｈｃｖ曝露診断用ｃ型肝炎ウイルスコアペプチド

Info

Publication number: JPH10503473A
Application number: JP7526371A
Authority: JP
Inventors: エイ．バーゾフスキー，ジェイ; フェインストーン，ステファン; 陸訓白井
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1994-04-08
Filing date: 1995-04-07
Publication date: 1998-03-31
Also published as: EP0754193A1; ATE193893T1; AU697171B2; AU2274895A; WO1995027733A1; EP0754193B1; DE69517521T2; DE69517521D1; CA2187299A1

Abstract

(57)【要約】細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープに相当する、Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質の部分を示すペプチドが開示されている。このぺプチドは、ヒトＨＬＡ分子に対する結合モチーフに相当するアミノ酸配列も持っている。このぺプチドは、Ｃ型肝炎ウイルス感染を予防または治療するためのワクチンとして有用であり、Ｃ型肝炎ウイルス曝露の診断検査あるいはＣ型肝炎ウイルスの臨床経過を予測する予後検査のための診断試薬としても使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】細胞傷害性Ｔリンパ球刺激およびＨＣＶ曝露診断用Ｃ型肝炎ウイルスコアペプチド発明の背景発明の分野本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のコアタンパク質に由来するペプチドに関する。該ペプチドは、免疫化宿主体内で細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を惹起するペプチドである。本発明はまた、ＨＣＶ感染の予防および治療用ワクチンおよび患者体内でＨＣＶ曝露を検出する診断方法に関する。関連技術の説明Ｃ型肝炎ウイルスは非経口的後天性非Ａ非Ｂ型肝炎のほとんどの症例の原因であるばかりでなく、散発性集団後天性急性ウイルス性肝炎、原因不明の慢性肝炎、特発性肝硬変、およびおそらくは肝細胞癌のかなりの症例の原因でもある（２、１８、３７、５４）。このウイルスは、これらの医学上重要な問題となっている慢性感染症および慢性肝疾患を引き起こす傾向がある。したがって、このウイルスによる感染を防御するワクチンおよび患者のＨＣＶ曝露度を評価する診断方法が強く求められている。ＨＣＶは１重らせんのプラスセンスＲＮＡウイルスであり（１０）、フラビウイルス科に分類されている（８、２８）。このウイルスの構造タンパク質は、ヌクレオカプシドを形成するコアと２つのエンベロープ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２とから成る。これらのエンベロープタンパク質は配列が非常に変化しやすく（３３）、ＨＩＶ−１の研究で示されているようにＣＴＬクローンは異なるＨＣＶ単離株を識別するので（４６、６３、６４）、該エンベロープタンパク質による免疫化はＨＣＶの場合には最適な手段でないと考えられる。予想されるエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列変異性が大きいのに対し、ＨＣＶのコアタンパク質は異なる単離株群間での配列保存性が大きく（３３）、ワクチンによるＣＴＬ誘導の見地から特に興味深いものである。コアタンパク質配列が保存されているので、曝露を受けた者の体内でのＣＴＬによるＨＣＶコアタンパク質ペプチド認識を測定することによりＨＣＶ曝露を判定する診断方法のターゲット(target)としてもこのタンパク質が好適である。関連する動物ペスチウイルス同様、ＨＣＶ感染も急性非伝染性疾患ならびに慢性肝疾患、肝硬変、および肝細胞癌につながる慢性感染症を引き起こす。肝疾患の慢性化機構と病因はいずれも不明である。Ｅ２タンパク質中に見つかっている高変異性領域に起因する慢性感染症を説明する免疫回避機構が提案されている（２９、７０）。通常は１つの配列が優勢であるが、この高変異性領域に含まれる複数配列を同一の患者から同時に取得することができる。ワイナーら（Weiner e t al．）は、免疫選択下では優勢配列が経時的に変化すること、およびこのウイルスの主要中和エピトープがこの高変異性領域であることを示唆している（７１）。チンパンジーにおける実験的接種とチャレンジ実験でも、感染後に効果的な保護抗体応答が増強するということを証明することはできなかった（２３、５３）。したがって、ＨＶＣ感染においてＴ細胞応答を確認すること、および免疫ならびに病因とそのＴ細胞応答との関係を決定することが重要である。Ｔ細胞エピトープはこのウイルスの非構造的成分に存在すると考えられるので表面抗原と同じ免疫圧を受けていない可能性があるため、重要なワクチン添加物となる可能性がある。細胞傷害性Ｔリンパ球はある種のウイルス感染に対するin vivo防御を媒介することがわかっている（１９、５１、５２）。感染が慢性化することおよび病理組織学的所見からみて、おそらくＨＣＶは肝細胞中では直接的な細胞傷害性（または細胞溶解性）を示さないと思われる。過去の研究で、ＣＤ８⁺のＣＴＬはＨＣＶタンパク質内のエピトープを認識すると報告されている（３８、６０）。ワクチンとなりうる物質にＣＴＬエピトープを加えると、表面糖タンパク質のみから製造されたワクチンに見られる問題の一部が解決されるかもしれない。クラスＩとクラスＩＩのＭＨＣ分子はＴ細胞に作用して、外来抗原プロセシング後のタンパク質のポリペプチド断片を認識させる（３、２６、５６、５９、６６、７３）。とくにクラスＩのＭＨＣ分子は、内因的に合成された、感染性ウイルスのタンパク質を含む、タンパク質から切断されたペプチドを集めて、提示し、ＣＤ８⁺のＣＴＬに対しウイルス感染細胞から防御する免疫監視機構を働かせる。したがって、細胞内で合成されたウイルスタンパク質であれば、細胞表面上でインタクトの状態で発現されない場合でも、上記ＣＴＬのターゲットになりうる。合成ペプチドワクチンは、全タンパク質や減弱または死滅ウイルス免疫原よりも、好ましくない免疫応答の発生頻度が低いという長所がある（４）。発明の概要本発明の一部は、ＨＣＶのコアタンパク質のＣＴＬエピトープに相当するペプチドに存する。該ペプチドはＭＨＣ分子に結合したＨＣＶ感染細胞の表面に提示されるＨＣＶの断片である。該ペプチドはワクチン接種手順の一部として免疫原として使用することもできるし、診断または予後判定手段として使用することもできる。前者の用途においては、該ペプチドをワクチンとして処方し、ＨＣＶ感染の予防または治療を行う対象に投与する。該診断および予後判定用途においては、ペプチドを患者由来の免疫細胞と接触させることができる。次いで、ペプチドに対する免疫細胞の応答を測定する。図面の簡単な説明図１は、ＨＣＶコアタンパク質のアミノ酸配列からＴ細胞エピトープを予想するための両親媒性アルゴリズムによって選択された一連の１１種類のペプチドを示す。該合成ペプチドの配列はＨＣＶ−Ｈ単離株に基づくものである。公知配列（２９、３２、４８、７０）と異なる残基は下線付きで示す。図２Ａ〜２Ｃは、Ｃ７特異的ＣＴＬが表現型、ＭＨＣ拘束、および高度(fine) 特異性を有しているかどうかを重複ペプチドを用いて調べた結果を示す。ｖＨＶＣ＃４免疫脾臓細胞由来の短期ＣＴＬ株を１０μＭのＣ７で再刺激したもの、ならびに照射処理した同系生殖脾臓細胞、およびコンカナバリンＡ（サイトカイン源）で刺激した脾臓細胞の培養上清の１：１０希釈物をエフェクター（effector ）として用いた。図２Ａ〜２Ｃに示した実験でのペプチド非存在下での細胞溶解率は７％未満であった。ターゲット細胞をペプチド（１０μＭ）の存在下で感作した。エフェクター／ターゲット比は１００／１とした。データはＳＥ５％未満のサンプル３つの平均であり、少なくとも２つの独立した実験の代表値である。図２Ａは、Ｃ７特異的Ｈ−２^dＣＴＬの表現型を示す。抗Ｌ３Ｔ４（ＧＫ１．５）（抗ＣＤ４）または抗Ｌｙｔ２．２（２．４３）（抗ＣＤ８）モノクローナル抗体（培養上清）の１：４希釈物の存在下、または抗体の非存在下で、６時間にわたりＣＴＬ測定を行なった。１８ＮｅｏをＣ７（１０μＭ）の存在下で感作した。図２Ｂは、Ｈ−２^d株におけるＣＴＬに対するＣ７提示の原因であるＭＨＣクラスＩ分子を示す。各トランスフェクタントは、Ｈ−２^dに由来するクラスＩ分子（Ｔ４．８．３、Ｄ^d；Ｔ１．１．１、Ｌ^d；およびＢ４ＩＩＩ２、Ｋ^d）１個だけを発現するか何も発現しない（Ｌ２８）。各ケースにおけるペアレント細胞はＤＡＰ３Ｌ細胞（Ｈ−２ｋ）である。図２Ｃは、Ｃ７特異的ネズミＨ−２Ｄ^d拘束ＣＴＬの高度特異性を示す。ＣＴＬ活性は、既知濃度の下記の配列番号１〜８でＣ７にそれぞれ含まれる重複デカペプチド、ならびにＨＬＡ−Ａ２モチーフノナペプチドＣ７Ａ２（図１参照）および全長Ｃ７ペプチドの存在下、Ｈ−２^d３Ｔ３繊維芽細胞ターゲット細胞株１８Ｎｅｏ上で測定した。図３は、ＨＣＶ感染患者におけるＣ７特異的ヒトＣＴＬのＨＬＡ拘束を示す。慢性Ｃ型肝炎患者（表４の番号７）のＣ７特異的ヒトＣＴＬ活性を、抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）または抗ＨＬＡクラスＩＩＤＲ（Ｌ−２４３、ＩｇＧ２ａ）を１：４で希釈したものとともに、あるいは抗体なしの状態で、１０μＭのＣ７の存在下で自己ターゲット細胞に対する細胞傷害性について調べた。「材料および方法」で述べたようにして、ＰＢＬをマイトマイシンＣ処理ＰＢＬとペプチドＣ７で２回刺激した。ペプチドの非存在下での細胞溶解率は５％未満であった。データはＳＥが５％未満のサンプル３つの平均であり、少なくとも２つの独立した実験の代表値である。図４は、ヒトＣＴＬがＨＬＡ−Ａ２によって提示されたＣ７のノナマーセグメントを認識することを示したデータである。慢性Ｃ型肝炎患者＃７および急性Ｃ型肝炎患者＃８のＰＢＬ（表４）を、「材料および方法」で述べたようにしてin vitroでマイトマイシンＣ処理自己ＰＢＬおよびペプチドＣ７で２回刺激し、ペプチドＣ７、ノナマーペプチドＣ７Ａ２（ＤＬＭＧＹＩＰＬＶ）の存在下または非存在下で、１００：１のエフェクター／ターゲット比で下記ターゲットに対する作用を測定した。すなわち、自己ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様細胞（＃７の場合、ＨＬＡ−Ａ１，Ａ２，Ｂ５１，Ｂｗ４，Ｂｗ６）または＃８にとっては自己ＣｏｎＡ芽球標的（＃８の場合、Ａ２，Ｂ５１）（自己細胞は＊で示す）、同種間ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様細胞（ＨＬＡ−Ａ２４，３１，Ｂ５１，５４，ｗ４，ｗ６，Ｃｗ１；またはＨＬＡ−Ａ２６，ｗ３３，Ｂ１２，１５，Ｃｗ３）、Ｃ１Ｒ細胞株（３９）（ＨＬＡ−Ａ−ｎｅｇ，Ｂ−ｎｅｇ．，Ｃｗ４，ＤＲ８，ＤＰｗ４，ＤＱ３）をＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトしたもの（Ｃ１Ｒ−Ａ２）（３９）またはトランスフェクトしないもの（Ｃ１Ｒ）をターゲットとした。データはいずれもＳＥＭ＜５％の培養物３つの平均であり、少なくとも２つの独立した実験の代表値である。図５は、１９９４年４月５日の時点でゲンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）に登録されているＨＣＶ−コアタンパク質の配列、および実施例で用いたＨＣＶ−Ｈ配列（ＦＤＡ）を示す。太文字で示したアミノ酸残基は配列ごとに異なる残基を示す。発明の詳細な説明本発明のペプチドは、ＨＣＶビリオンのコアタンパク質の配列に由来するアミノ酸配列を持つ。ＨＣＶの単離株が幾つか得られており、これら全単離株のコアタンパク質のアミノ酸配列が＞９５％同一であることが認められた（３３）。幾つかのＨＣＶ単離株のコアタンパク質のアミノ酸配列を図５に示す。本出願の実施例において使用しているＨＣＶ−Ｈ単離株を，最上の行に示す（ＦＤＡ）。この配列の並びは、コアタンパク質のＣ末端配列が、単離株の間で顕著に異なっていることを示している。実施例においてより詳しく説明するが、コアタンパク質配列の変換は、ペプチドワクチンおよび診断試薬の設計において利点がある。本発明のペプチドによる免疫に応答して誘導されるＣＴＬは遊離ビリオンよりもむしろ感染した細胞を攻撃する。細胞により内因的に合成される全てのタンパク質のフラグメントがＭＨＣ分子に結合してその細胞表面に提示（ｄｉｓｐｌａｙ）されてるので、コアタンパク質がビリオン粒子の表面に局在していないということは問題ではない。さらに、内因的タンパク質がＭＨＣにより提示されるためのプロセシングのメカニズムについては、タンパク質のランダムな分解により得られる線状対応性(c ollinear)を持つペプチドはいずれもプロセシングの初期に産生されるらしいことが予測される。個体により発現される特定のＭＨＣ複合体は、その個体の細胞表面に実際に見られる特定のペプチドを選択する役割を果たしているようである（２６）。従って、ＨＬＡ−Ａ１１ハプロタイプを持つ個人は、ある特定のタンパク質のペプチドを提示する時に、ＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプを持つ個人が提示するものとは異なったペプチドを提示する可能性が高い。ある特定のＭＨＣハプロタイプに結合するペプチドの選択を説明する特定のルールは充分には確定していない。しかし、構造−結合関係について知られていることが、ＭＨＣハプロタイプに結合するペプチドについての「モチーフ（ｍｏｔｉｆｓ）」にまとめられている。これまでに文献に掲載されたモチーフの表がブラウン大学（Providence，RI）のGabriel MeisterとDr．Anne DeGrootにより編纂されており、それを表１に示す。以下に述べるように、Ｃ７ペプチドはまずＣＴＬ活性の実際のテストにより見いだされ、後にＨＬＡ−Ａ２結合モチーフと一致する配列を持つことが見いだされた。Ｃ７ペプチドはＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプを持つ集団においてのみ有用であることが期待される。しかし、この集団はヒトの集合の４０−５０％を占め、意義のある大きさの集団である。さらに、追加的ＨＬＡタイプについての結合モチーフを含むペプチドは、実施例１および２に使用されるペプチド中に確認され得る。例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６およびＣ８ペプチド（図１参照）は、それぞれヒトＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ｂ８およびＨＬＡ−Ｂ２７に対する結合モチーフを持っている。これらのペプチドの有用性を決定するために、それぞれについてＣＴＬ活性を検査し、陽性結果が出た場合、そのペプチドはＣＴＬ応答を起こすために有効であり、対応するＭＨＣ（ヒト被検者におけるＨＬＡ）ハプロタイプを持つ被検者に対する診断試薬として使用できることが確認される。全般的な実験材料と方法マウス。Ｂａｌｂ／ｃマウスとＣ５７ＢＬ６マウスは、日本チャールスリバーラボラトリーズ社（東京、日本）より購入した。使用したマウスは、８週齢であった。組換えワクシニアウイルス。ＨＣＶの構造遺伝子である、Ｃ、Ｅ１及びＥ２並びにＮＳ２（Ｈ株ＨＣＶ（Ｈ）のＦＤＡの単離体（２４））が発現している組換えワクシニアウイルス（ｖＨＣＶ＃４）を、Chakrabartiらの方法（９）により作製し、ＨＣＶコア特異的ＣＴＬを産生させるために、マウスの免疫に使用した。Bernard Moss博士、NIAID、NIHより供与されたｖＳＣ８（大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含む組換えワクシニアウイルス）は、（９）に記載され、マウスの免疫のための対照ワクシニアとして使用した。ペプチド合成と精製。ＨＣＶ（Ｈ）の予想されるアミノ酸配列（２４）（未刊行）に従って、（３１）記載のポリプロピレンメッシュ「ティーバッグ」中で、固相ペプチド合成の同時マルチペプチド法により、ＨＣＶコアペプチドを調製した。Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋカラム（ウォーターズ社、ミルフォード、ＭＡ）での逆相クロマトグラフィーにより、ペプチドを脱塩し、ＨＰＬＣにより精製し、分析した。ＣＴＬの産生。１０⁷ＰＦＵの組換えワクシニアウイルスで、マウスを静脈内免疫した。４〜６週間後、完全Ｔ細胞培地（ＣＴＭ；１０％ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び５×１０^-5Ｍ２−ＭＥを含む、ＲＰＭＩ１６４０とＥＨＡＡ培地の１：１混合液）中、２４ウエルの培養プレート内の免疫脾臓細胞（５×１０⁶ ／ｍｌ）をインビトロで、ペプチド又はｖＨＣＶ＃４を感染（１時間、３７℃）１０：１のｍｏｉ）させた照射同系脾臓細胞（２．５×１０⁶／ｍｌウエル、培養前に３回洗浄）及び１０％ＣｏｎＡ上清を含む培地（ラットＴＳｔｉｍ；コラボラティブリサーチ社、ベッドフォード、ＭＡ）で６日間刺激し、７日目に照射同系脾臓細胞（２．５×１０⁶／ｍｌウエル）とペプチドで再び刺激し、８日目と１１日目に１０％のラットＴＳｔｉｍの添加とフレッシュなＣＴＭで０．５ｍｌの培地の交換を行った。培養の７日目又は１４日目で、ＣＴＬアッセイでのエフェクターとして刺激細胞を使用した。ＣＴＬアッセイ。インビトロでの二次ＣＴＬの細胞溶解活性を、⁵¹Ｃｒ標識ターゲットを用いる６時間のアッセイを使用する既報（６２、６７）に従って測定した。ＣＴＬのペプチド特異性を試験するために、エフェクターと⁵¹Ｃｒ標識ターゲットを種々の濃度のペプチドと混合した。特異的な⁵¹Ｃｒ放出パーセントを、１００×〔（実験上の放出−自発的放出）／最大放出−自発放出）〕として計算した。最大放出は、５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の添加により溶解した細胞の上清から決定した。自発放出は、エフェクター細胞の添加なしにインキュベートしたターゲット細胞から決定した。１８Ｎｅｏ（Ｈ−２^d；クラスＩＭＨＣ⁺ 、クラスII ＭＨＣ^-ネオマイシン耐性遺伝子をトランスフェクトした３Ｔ３線維芽細胞（６２））及びＥＬ４胸腺腫細胞（Ｈ−２^b）をターゲットとして使用した。抗体によるＣＴＬ応答の阻害。抗Ｌ３Ｔ４（抗−ＣＤ４、ＩｇＧ２ｂ（７２））又は抗Ｌｙｔ２．２（抗−ＣＤ８（５８））をそれぞれ含むハイブリドーマＧＫ１．５又は２．４３の培養上清を、指示された濃度でＣＴＬアッセイの９６ウエルのプレートに添加した。クラスＩＭＨＣトランスフェクタント。Ｄ^d、Ｌ^dを有するマウスＬ細胞トランスフェクタント（２１、４１、４３、４５）は、Davi d Margulies博士、NIAIDより供与された。Ｋ^dを発現しているトランスフェクタントは、Abastadoらによって作製され（１）、Keiko Ozato博士(NICHD)より供与された。すべてのトランスフェクタント細胞株を、抗−Ｈ−２Ｄ^d、抗−Ｈ−２Ｋ^d及び抗−Ｈ−２Ｌ^dｍＡｂの適当なパネルを用いるＦＡＣＳ分析により試験を行い、本明細書に記載の機能的な研究を行う前に、それらの発現型を確認した。ＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトしていない（ＣｌＲ）又はＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトした（ＣｌＲ−Ａ２）（３９）ヒトＣＩＲ細胞株（３９）（ＨＬＡ−Ａ−ｎｅｇ、Ｂ−ｎｅｇ．、Ｃｗ４、ＤＲ８、ＤＰｗ４、ＤＱ３）は、Victor Engelhard博士、バージニア大学より供与されたものである。実施例１：ＨＣＶコアタンパク質におけるＣＴＬエピトープの同定ＨＣＶ−Ｈ単離体のコアタンパク質の予想されるアミノ酸配列に基づいて、ＨＣＶコア配列の７２．３％をカバーし、Ｔ細胞エピトープの可能性のある両親媒性（amphipathicity）に基づいて選ばれた、一連のオーバーラップする１１残基のペプチドを合成した（１３、１７、４０）。選択に使用したコンピュータープログラムのＦＯＲＴＲＡＮ情報コードは、参考文献７５の追加として刊行されている。ＨＣＶ−Ｈのコア領域の予想されるアミノ酸配列と他の公知の単離体（３２、３６、６５）との比較により、公知の配列と比べて、該ペプチドの３個が１又は２個の残基に置換を有することが明らかになった（図１）。マウスにおいてペプチドに特異的なＣＴＬを作製するために、組換えワクシニアウイルスで免疫したマウスの脾臓細胞を、インビトロでペプチドを用いて刺激した。ｖＨＣＶ＃４で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスは、ペプチドＣ７に対するＣＴＬ応答を発現したが、他のどのペプチドにも応答しなかった（表２）。Ｈ−２^bマウスは、試験したどのペプチドにも応答を示さなかった。ＨＣＶ−Ｈコア領域を発現する１０⁷ＰＦＵの組換えワクシニアウイルス（ｖＨＣＶ＃４）で、マウスを静脈内初回免疫した。「材料と方法」で記載のように、インビトロでＣｏｎＡ上清（ＩＬ−２）の存在下、１０μＭのペプチド又はペプチドなしで、免疫脾臓細胞を１３日間再び刺激した。ＢＡＬＢ／ｃＣＴＬに対してはｎｅｏ遺伝子でトランスフェクトした３Ｔ３線維芽細胞（１８Ｎｅｏ、Ｈ− ２^dクラスＩ陽性、クラスII 陰性）及びＣ５７ＢＬ／６ＣＴＬに対してはＥＬ４（Ｈ−２^b）に対して、ＣＴＬ活性を測定した。ターゲットを１０μＭの各ペプチド又はペプチドなしで６時間増感した。エフェクター／ターゲット（Ｅ：Ｔ）比１００：１，５０００ターゲット細胞／ウエル。ペプチドの非存在下での溶解は、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６では＜５％であった。データは、＜５％のＳＥを有する三連の試料の平均であり、少なくとも２つの独立した実験を代表する。コアタンパク質に対するＣＴＬの特異性は、インビボで初回免疫したリンパ球、インビトロでの再刺激及びＣＴＬアッセイでのターゲット細胞における発現の段階で説明された（表３）。コア遺伝子を発現している組換えワクシニアウイルス（ｖＨＣＶ＃４）のみが、Ｃ７に特異的なＣＴＬを産生するためにマウスを初回免疫することができたが、対照ワクシニアウイルス（ｖＳＣ８）はできなかった（表３）。免疫脾臓細胞を刺激するために使用したペプチドの濃度の滴定により、Ｈ−２適合ターゲット細胞に対する有意な殺傷性を誘導するための免疫脾臓細胞の刺激には、Ｃ７は１〜１０μＭのペプチドの濃度が必要であることがわかった。ＣＴＬは、インビトロでのペプチドを用いる刺激により産生するので、それらは、単にペプチドではなく、内因性に合成されたコアタンパク質の処理産物を認識することを確認することが重要である。Ｈ−２^d（ＢＡＬＢ／ｃ）により拘束されたＣＴＬは、内因性にコアを発現しているｖＨＣＶ＃４感染同系ターゲット細胞（１８Ｎｅｏ細胞、ネオマイシン耐性遺伝子でトランスフェクトしたＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞）、並びにＣ７の存在下で１８Ｎｅｏ細胞を殺傷することができたが、対照ターゲットであるｖＳＣ８（対照ワクシニアウイルス）を感染した１８Ｎｅｏ又はＣ７の非存在下で１８Ｎｅｏを殺傷することができなかった（表３）。従って、これらのＣＴＬは、外因性のペプチドばかりでなく、内因性に合成されたＨＣＶコアタンパク質の処理産物にも特異的であった。挿入されたウイルス遺伝子産物に特異的なＣＴＬを初回免疫したり、刺激するための組換えワクシニアウイルスの能力を用いて、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^d）マウスにおけるＨＣＶコアに特異的なＣＴＬを作製した。非免疫脾臓細胞又は免疫脾臓細胞をインビトロで、Ｃ７を１０μＭ（又は指示された濃度で）、又はワクシニア（ｖＳＣ８）感染照射同系脾臓細胞を用いて再刺激し、１００：１のＥ／Ｔ比率で、ペプチド（Ｃ７１０μＭ；Ｃ８１０μＭ）の存在下又は非存在下、ワクシニアウイルス感染１８Ｎｅｏ（１時間、３７℃、１０：１のｍｏｉ、使用前に３回洗浄）及び１８Ｎｅｏに対する試験を行った。ｖＨＣＶ＃４，ＨＣＶ −Ｈのコア及びエンベロープを発現している組換えワクシニアウイルス；ｖＳＣ８，対照ワクシニアウイルス；１８Ｎｅｏ，ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞，Ｈ−２^d。データは、＜５％のＳＥを有する三連の試料の平均であり、少なくとも２つの独立した実験を代表する。＊ｖＨＣＶ＃４免疫細胞，「材料と方法」及び参考文献（６１）に記載のように、Ｃ７１００μＭ及び１０％ＣｏｎＡの上清で２回再刺激された。抗−ＣＤ８モノクローナル抗体を用いてＣ７に特異的なＣＴＬを処理すると、ターゲット細胞に対する細胞傷害活性を減少させたり、又は全く失わせるが、抗 −ＣＤ４抗体はそうではなかった（図２Ａ）。これらのデータより、Ｃ７を認識するエフェクター細胞は、通常のＣＤ８⁺ＣＤ４^-（Ｌｙｔ２⁺Ｌ３Ｔ４^-）ＣＴＬであることが明らかである。ＢＡＬＢ／ｃにおいてＨ−２^d拘束ペプチド特異的ＣＴＬに対して、クラスIIではなくクラスＩを発現している１８Ｎｅｏ細胞をターゲットとして使用した。これらの事実プラスＨ−２^bではなくＨ−２ｄへのＭＨＣの拘束という事実は、Ｌｙｔ２⁺ＣＤ８⁺エフェクターＴ細胞に予想されるように、これらのＣＴＬは、クラスＩＭＨＣ拘束性であることが明らかとなった。Ｈ−２^dにおいてＣ７の提示にどの分子が特異的に必要であるかを決定するために、Ｄ^d、Ｌ^d又はＫ^d分子を発現しているトランスフェクタントを使用した。ターゲットを⁵¹Ｃｒで標識して、ペプチドの存在下、エフェクター細胞と共に培養した。Ｔ４．８．３．（Ｄ^d）がＣ７を提示することがわかった（図２ｂ）が、Ｌ^d又はＫ^dはＣＴＬにＣ７を提示しなかった。従って、Ｄ^dがこのペプチドを提示するために必要かつ十分条件であった。滴定研究において、Ｃ７は、０．０３〜３０μＭ間の濃度でＣＴＬによる溶解のターゲット細胞を増感させた（図２ｃ）。１μＭを超える濃度のＣ７の存在下で、溶解はプラトーに達していった。クラスＩＭＨＣ分子拘束性を有するＣＤ８⁺Ｔ細胞による同じ１６残基のペプチドの認識により、ＭＨＣ分子によるペプチドの一部の提示を再提示することができる（２０、２５、５５）。より詳細にペプチドマッピングを開始するために、クラスＩＭＨＣ分子は、この場合ではＤ^dを含んでおり、８〜１０残基の長さのペプチドを提示する傾向があるという発見に基づき（１５、２２、２６）、Ｃ７内の各９残基ずつオーバーラッピングするオーバーラッピングデカペプチドを７個すべて（図２Ｃの図面の説明中の配列を参照）、並びにＨＬＡ−Ａ２モチーフに対応するノナペプチドＣ７Ａ２（図１と以下の結果を参照）を合成した。これらの中で、Ｃ７−Ａ１０（ＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡ）のみが、全長のＣ７ペプチドよりも活性が高かった（図２Ｃ）。Ｃ７−Ｇ１０及びＣ７−Ｐ１０Ｍオーバーラッピングデカペプチドのいずれも活性がなかったことから、これらのオーバーラッピングデカペプチド中に含まれるノナペプチドはいずれも最適応答に十分でないと結論する。従って、デカペプチドＣ７−Ａ１０は、これらのＤ^d拘束ＣＴＬによる認識にとって最適のペプチドであるように考えられる。興味深いことには、このペプチドはＤ^dから遊離した内因性のペプチドにより明確にされたようなＤ^dモチーフを含んでいなかった（１５）（下記参照）。Ｈ−２^dマウスにおいて、ＨＣＶコアタンパク質を発現している同系ターゲット細胞、並びにペプチドＣ７（ＨＣＶのコア内１２９〜１４４残基）の存在下でインキュベートしたターゲットを殺傷する能力を有するネズミＣＴＬを誘導したが、Ｈ−２^dマウスでは誘導しなかった。Ｈ−２^dは、Ｃ７に対する免疫応答（Ｉｒ）遺伝子応答体ハプロタイプであるが、Ｈ−２^dは応答体ではないと結論する。３つのＨ−２^dクラスＩ分子のいずれにＣ７が存在するかを決定するために、Ｋ^d、Ｌ^d又はＤ^dを発現しているＬ細胞（Ｈ−２^k）トランスフェクタントを使用し、Ｃ７ペプチドは、効果的なペプチド提示のためにＤ^d分子を必要とすることがわかった。興味深いことに、αヘリックスとして折り畳まれたときに両親媒性の側面において類似している点を除いては配列の著しい類似性を共有しない、本発明のＣ７（又はより具体的にはＣ７−Ａ１０）、ＨＣＶＮＳ５由来のペプチドＰ１７（６０）、並びにＨＩＶ−１ｇｐ１６０由来のＰ１８（６３）及びＨＰ５３（６１）を、同じＭＨＣ分子が提示することがわかった。これら４つのペプチドの中で、Ｐ１８のみが、Ｄ^dから溶離した内因性のペプチド、ＸＧＰＸ〔Ｋ／Ｒ／Ｈ〕ＸＸＸ（Ｘ）〔Ｌ／Ｉ／Ｆ〕、配列番号：９（１５）により限定される明確なＤ^d結合モチーフを有する。従って、Ｄ^dに結合する他のモチーフも同様に存在しているにちがいない。該新規のＤ^d結合ペプチドの同定は、該新規なモチーフの特徴付けにおいて、助けとなるであろう。Ｄ^d結合に明確なモチーフを限定するには不十分なホモロジーが存在しているけれども、各ペプチドに対するＤ^d結合に含まれる残基の分析（６３）は、Ｄ^d特異性にとって構造的な必要性に新しい光を注ぐかもしれない。最大の殺傷性を得るためには、インビトロでの二次的にＣＴＬを刺激したり、ターゲットを増感させるために必要なペプチドの濃度は、Ｃ７及びＣ７−Ａ１０両方とも１〜３０μＭであることが明らかであった。この結果より、Ｄ^dモチーフを有するＤ^dにより拘束されたＨＩＶ−１ｇｐ１６０の免疫優性ＣＴＬ決定基であるＰ１８（６２）と比較して、これらのペプチドは、Ｈ− ２Ｄ^dに中程度の親和性のみを有して結合することが示唆される。Ｃ７又はＣ７ −Ａ１０の修飾は、どちらがより高い親和性で結合したり、より効果的に刺激するＤ^dモチーフにより近いかを明らかにすることができるであろう（５〜７）。また、Ｃ７は、ＣＴＬの非存在下、直接細胞に対する毒性はなかった。実施例２ＨＣＶに暴露したヒト患者の同定ネズミＣＴＬについてのエピトープを同定した我々は、ＨＣＶ血清陽性の患者から得たＴ細胞によってもそれが認識されるかどうかを知りたかった。８名のＨＣＶ−血清陽性患者、２名の慢性Ｂ型肝炎患者、および２名の健常人から得たＰＢＬを、in vitroで刺激し、１０μＭのペプチドとインキュベートした、自己ＥＢＶ−形質転換細胞またはＣｏｎＡ芽細胞の溶解について試験した（表４）。ヒトＣＴＬ。我々は８名を選択した。これらの患者は香川医科大学、医科センター（香川県、日本）の患者で、抗−Ｃ１００−３（ＨＣＶＡｂテスト、ＯｒｔｈｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）または推定（putative）コア、ＮＳ３、ＮＳ４のＨＣＶタンパク質（Ｃ２２、Ｃ３３およびＣ１００−３抗原）に特異的な第二世代の酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）テスト（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＮｏｒｔｈＣｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）により検出されるＨＣＶ特異的血清抗体、および５’−非コーディング領域に基づいて得られる外部および内部（ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ））の２組のプライマーを用いる二重ポリメラーゼチェーンリアクション法により検出される血清ＨＣＶＲＮＡを持っ患者であった（４９）。ＨＣＶ以外の肝臓ウイルスにも感染していることが血清学的検査により検出された患者は試験より除外した。我々は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）血清値の上昇（>1年の間80 から450IU/L）を示す７名の慢性Ｃ型肝炎患者と、最近発症した急性C型肝炎を持ち、血清ＡＬＴ値が高く（1054 IU/L）、ＰＣＲでＨＣＶ陽性および第二世代のＥＡＩで血清陽性と出たが、以前に肝炎の臨床的既往のない１名の患者（＃８）を試験した（表４）。ラジオイムノアッセイ検査（HBsAgおよびHBeAgに陽性、Ab bott Laboratories，North Chicago、IL）で検出された慢性Ｂ型肝炎（非Ｃ型）を持つ患者２名、およびＨＣＶおよびHBsAgに対して血清陰性の２名の健常人も試験した。ＰＢＬをin vitroでマイトマイシンＣ−処置ＰＢＬおよび各ペプチド１０μＭで刺激し、「材料と方法」に記載するようにＥ／Ｔ比１００：１で、対応するペプチド（１０μＭ）の存在下または不在下で自己標的（target）細胞についてテストした。標的に対するペプチドの毒性は観察されなかった。２名の慢性肝炎患者および２名の健常人は、Ｃ７に対して応答しなかった（＜４％）。ＰＢＬからのＣｏｎＡ芽細胞標的を患者No．２、５および８で使用した。データは、ＳＥ＜５％の３つのサンプルの平均であり、少なくとも２つの独立した実験の代表値である。＊ＨＣＶＲＮＡ⁺および第二世代のＥＩＡにより陽性。＃ＰＢＬはin vitroで２回刺激した。 ¶ＨＬＡ−Ａ２．１陽性ヒトのアッセイにおいては、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）形質転換によるドナー末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）に由来する細胞系（１２）または以前に記述されるように（６１）自己ＰＢＬより作製したＣｏｎＡ芽細胞を、ペプチド（１０μＭ）の存在下またはｖＨＣＶ＃４による感染後のいづれかにおいて、標的として使用した（６１）。ＰＢＬをリンパ球分離培地（LeucoPREP，Becto n Dickinson，Mountain View，CA）上で分離した。このＰＢＬ(24穴培養プレートに４×10⁶/ml)を、day 1 およびday 8に加える10μMのペプチド、day 2、day 9およびday 12に新鮮なCTMとともに添加した50単位/mlのヒトrIL2(Cetus Corp. ，Emeryville，CA)の存在下において、同一ドナーのマイトマイシンC-処理ＰＢＬ(24穴培養プレートに２×10⁶/ml)により刺激した。培養のday 8またはday 15 において、この刺激されたＰＢＬを効果細胞(effector)として使用し、0.1 mCi の⁵¹Ｃｒにより一晩標識した標的細胞のEBV形質変換細胞系またはＣｏｎＡ芽細胞においてテストした。６時間⁵¹Ｃｒ放出アッセイを上述のように行った。２名の患者（＃７と＃８）のＰＢＬは、Ｃ７の存在下で特異的に標的細胞を殺したが、他のペプチドの存在下または培地のみでは殺さなかった。テストしたペプチドの内、他の４名の患者に認識されたものはなかった。逆に、４名のＨＣＶ−血清陰性ドナーからのＰＢＬは、Ｃ７の存在下で標的を殺さなかった（表４）。急性および慢性の肝炎を持つ患者も、vHCV#4に感染し内因性のＨＣＶコアタンパク質を発現する標的細胞に対して細胞毒性活性を示した。これらの２名のドナーの内の１名について、我々は効果細胞の表現型を検査することができた。慢性肝炎に罹患する反応患者＃７のＣＴＬ活性は抗ＨＬＡクラスＩ(W6/32、IgG2a)によりブロックされたが、抗ＨＬＡクラスII DR(L-243、IgG 2a)によってはブロックされなかった(図３)。したがって、これらは通常の抗原特異的ＨＬＡクラスＩ拘束ＣＤ８⁺ＣＴＬであることが期待される。患者＃７および＃８についてＨＬＡのタイプ分けを行ったところ、それぞれＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ｂ５１、Ｂｗ４、Ｂｗ６とＨＬＡ−Ａ２、Ｂ５１であった。さらに、我々は、Ｃ７ペプチド配列が、ＤＬＭＧＹＩＰＬＶの配列を持つＨＬＡ−Ａ２−結合モチーフを含んでいることに注目した（２２、３４）。これらの患者のＣＴＬによるＣ７の認識が、ＨＬＡ−Ａ２によるこのノナマー配列の提示によるものかを知るために、我々は対応するノナマーペプチドを合成してＣ７Ａ２と命名し、これと完全長の１６−マー(16-mer)、つまりＣ７の患者＃７および＃８のＣＴＬによる認識を、ＨＬＡ−Ａ２を共有するあるいは共有しない標的細胞についてテストした（図４）。ＣＴＬはＣ７あるいはノナマーＣ７Ａ２の存在下で、自己標的細胞を殺し、またＨＬＡ−Ａ２によりトランスフェクトしたＨＬＡ−Ａ−および − Ｂ−陰性細胞系のＣ１Ｒも殺したが、トランスフェクトされていないＣ１ＲまたはＨＬＡ−Ａ２を欠く自己標的細胞は殺さなかった（図４）。従って、Ｃ７ペプチドは、ＨＣＶに感染した急性および慢性肝炎患者のヒトＣＴＬに対してＨＬＡ −Ａ２により提示されるＨＬＡ−Ａ２モチーフ−陽性ノナマーを含んでいると我々は結論する。これらのデータは、このペプチドは、あるネズミＭＨＣハプロタイプにおいて認識されるが、ヒトＭＨＣ分子に関連しても認識され得ることを示している。同じ１６残基のペプチドがマウスおよびヒトの両方のクラスＩＭＨＣ分子を持つ異なったＴ細胞により認識されるということは、広く認識される同じ部位を複数の(multiple)クラスＩ分子が提示する可能性、あるいは異なってはいるが部分的に重複するペプチド部位を異なったＭＨＣ分子が提示する可能性が考えられる得ることを示している（２０、２５、５５）。これらの可能性を区別するために、我々は該１６残基ペプチドに沿った７つの重複するデカペプチドを用いてネズミＣ７エピトープのファインマッピング（fi ne mapping）を行った（図2c参照）。16−マーと同等かそれ以上の活性を示しめした唯一のペプチドはＣ７−Ａ１０であった。実際に、このデカペプチドは、ネズミＣＴＬについて最小のペプチドと考えられる。何故ならば、Ｃ７−Ａ１０内に含まれる２つのノナペプチドは、活性のかなり低い重複するペプチドＣ７−Ｇ１０およびＣ７−Ｐ１０Ｍのいづれか一つにも含まれているからである。（１６ −マー全体が同じ条件下でプロセシングを受けて活性型になるので、これらの他のデカペプチドがプロセシングの失敗により不活性であるといることは考えにくい。）。一方、ＨＬＡ−Ａ２により拘束されるヒト応答の場合において、我々は少なくとも一つのノナマーエピトープがペプチドＤＬＭＧＹＩＰＬＶであることを確認しており、これは２および９位にアンカー残基を持つＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを含んでいる（２２、３４）。このペプチドは、ＨＣＶコアタンパク質のこの部分において最小のＨＬＡ−Ａ２− 拘束ＣＴＬエピトープを構成している。しかし、Ｈ−２^dマウスはこのノナマーペプチドに応答せず（図２ｃ）、このノナマーを含むＣ７−Ｇ１０とＣ７−Ｖ１０にごく弱く応答する（図２ｃ）のみであるため、マウスとヒトに認識される最小エピトープは同一であるはずはなく、緊密にオーバーラップしているはずである。実際、ヒトエピトープの１残基を除く全ての残基が、ネズミエピトープ内に含まれている。マウスおよびヒトにより認識されるためのＣ７のコア残基の類似性は著明である。最近のＨＣＶ配列についての多様な報告から、いくつかの単離株の比較ができる（（１１、２９、４２、４８、７０）、（３３）における総説））。高度な多様性を持つエンペロープ糖タンパクＥ１及びＥ２に比較して、コアタンパク質は良く保存されている。このＨＣＶエンベロープタンパクの超多様性は、ヒトおよびマウスの両方において主要な中和抗体ドメインであるとともにＣＴＬの決定基であるＨＩＶ−１エンペロープタンパクＶ３ループの場合において示唆されているように（１２、２７、５０、５７、６２）、これらの表面タンパク質が、変異の免疫学的選択圧（immunologic selective pressure for variation）の下におかれている可能性を示唆している。しかし、ＨＣＶ単離株のグループ（報告されているＨＣＶ配列全てを比較することにより広くさらに分類される）内においては、このコアは９５％から１００％の配列の一致をしめしている（３３）。ＣＴＬがウイルスの成長をブロックし得るとする多くの証拠がある（１９、３５、４４、４７、５１、５２、６８、６９）。非常に良く保存されているために、ＨＣＶコアタンパク質からのペプチド、これはクラスＩＭＨＣ分子によってマウスとヒトの両方のＣＤ８⁺ＣＤ４^-ＣＴＬに対して提示されるが、ＨＣＶに対して広い効果を示すワクチンの成分として有用である可能性があり、特にＨＬＡ− Ａ２が最も優勢なヒトクラスＩ分子であり、米国人口の約４６％に存在することを考えるとそうである。また、我々の研究所の一つにおけるＣ型肝炎の日本人患者の小規模な予備的サンプリングにおいて２３名中１５名がＨＬＡ−Ａ２⁺であった。ヒトの集合におけるこのようなＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプの優勢は、ＨＣＶ単離株におけるＣ７ペプチドの強い保存性とともに、多くのＨＣＶ株への暴露またはこれによる感染を検出するために、ヒト集合の大きな割合を占める部分においてペプチドＣ７が診断試薬として有用であることを示している。ＨＬＡ−Ａ２−陽性、ＨＣＶ感染患者において考えられる肝炎の臨床経過とこのペプチドに対する応答の相関性について感染患者を評価するすることが重要となろう。このような分析から、予後予測のための価値をもつ情報が得られるかもしれない。ＨＣＶに感染した患者におけるＣ７−特異的ＣＴＬの存在は、患者がウイルスを急速に消失していくかあるいは慢性肝炎に進展していくかについての情報を与えるかもしれない。この情報は、これからの治療を計画するために有用であろう。ＨＩＶ−１タンパクｇｐ１６０と逆転写酵素についての我々の以前の経験において、ネズミＣＴＬにより認められるエピトープはヒトＣＴＬによっても認められた（１２、３０、６２）。この所見は、マウスにおけるＣＴＬエピトープを検出する本方法が、ヒトＨＣＶレトロウイルス感染に対するワクチンおよび診断試薬として一般的に有用であることを意味している点で重要である。実施例３：本発明のペプチドを用いる付加的な診断方法ペプチド試薬に対して特異的なＣＴＬによる、標的細胞の特異的な溶解の測定に加えて、ＣＴＬの、抗原認識に関わる他の活性が測定できる。例えば、ＣＴＬの抗原活性化に応答して分泌されるサイトカインが測定できる。測定に特に好適なサイトカインはγ−インターフェロンである。特定のサイトカインの測定方法は、当技術分野でよく知られている。サイトカインのイムノアッセイとサイトカイン依存性細胞株の増殖の測定が、二つの好ましい測定形態（formats）である。さらに、患者からのＰＢＬをＥＢＶを用いて形質転換する工程を除くことにより、実施例２に記載の方法を変更することができる。ウイルスを用いての形質転換は実験的な目的でなされ、増殖可能な細胞株が確立される。臨床での測定目的のためには、短期間のうちに、形質転換せずにＰＢＬを十分な数まで培養することができる。ＥＢＶにより形質転換されたＢリンパ芽球（B-lymphoblastoid）細胞の代わりに、自己由来の、コンカナバリンＡ刺激化ＰＢＬ芽細胞（blasts）を標的として用いることができる。また、抗原特異的ＣＴＬの応答としてのγ−インターフェロンの分泌の測定には、標的は不要である。実施例４：医薬組成物としてのペプチドの処方本発明のペプチドは、薬学的に許容できるあらゆる担体、アジュバント又は希釈剤と混合することができる。好ましくは、本発明の医薬組成物は、静脈注射、皮下注射、筋内注射又は皮内注射のために調製される。このような処方においては、５０〜５００μｇの範囲の用量を供給する濃度として溶解される。溶媒としては無菌の生理食塩水又は薬学的に許容できるあらゆる溶媒が使用できる。アジュバントに関しては、ペプチド及びタンパク質全体のいずれにも、フロイントの不完全アジュバント（皮下注射、筋内注射又は皮内注射用）、及びＱＳ２１を用いることができる。タンパク質全体の初回免疫のアジュバントとして、アラム（Alum）も用いることができる。 Deres，K．（デレス、ケー）ら、Nature 342:561-564(1989)に記載されたように、脂質の尾と結合させることによりペプチドを修飾することができる。さらに、静脈注射のためには、タンパク質の分解に対する耐性を付与する修飾をペプチドに行っても良い。修飾の典型例としては、ペプチドのカルボキシル末端をアミド化することである。これらのペプチド誘導体を完成させる方法は、当技術分野でよく知られている。実施例５：ＨＣＶ感染防御用ワクチンとしてのペプチドの投与当該技術分野の典型的なワクチン投与プロトコールの一部として、実施例３に説明されたコアタンパク質及びペプチドを投与できる。被験者はまずＨＣＶのコアタンパク質の投与により初回免疫され、次いで、ペプチドの投与により追加免疫される。全タンパク質（Whole Whole protein）の投与は注射、好ましくは筋内注射又は皮下注射により実施される。直接注射することに加えて、Takehashi（タケハシ）ら（７４）に記載され、同時係属出願中の08/031,494号にあるように、ペプチドを自己由来のＰＢＭＣと２時間インキュベートし、インキュベートされた細胞を照射し、そして静脈内に再び注入することによってもペプチドを投与することができる。ＨＣＶコアタンパク質は、タンパク質全体を発現する組換えベクターにより得ることができる。組換えベクターは特に限定されるものではないが、ベクターの好ましい態様としては、ＨＣＶコアタンパク質をコードしているＤＮＡを、ワクシニアウイルスベクターから発現するものが挙げられる。実施例１に記載のｖＨＣＶ＃４ベクターは特に好ましい。組換えベクターは静脈注射又は皮内注射により投与される。その代わりに、患者の細胞をベクターで形質転換することが可能であり、その形質転換された細胞を患者に注入すること又は皮下に移植することも可能である。初回免疫後しばらくの後、好ましくは１〜２週間後に、本発明に記載のペプチドで患者をさらに免疫する。ペプチドは、かかるＣＴＬの応答を測定するあらゆる公知の方法により決定され、免疫されたペプチドに応答するＣＴＬを導くのに十分な量が投与される。実施例２に記載された方法はすべて適用できる。典型的には、ペプチドは５０〜５００μｇの量が投与される。追加免疫を繰り返し行うことができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年４月５日【補正内容】英文明細書第５〜６頁補正各トランスフェクタントは、Ｈ−２^dに由来するクラスＩ分子（Ｔ４．８．３、Ｄ^d；Ｔ１．１．１、Ｌ^d；およびＢ４ＩＩＩ２、Ｋ^d）１個だけを発現するか何も発現しない（Ｌ２８）。各ケースにおけるペアレント細胞はＤＡＰ３Ｌ細胞（Ｈ−２ｋ）である。図２Ｃは、Ｃ７特異的ネズミＨ−２Ｄ^d拘束ＣＴＬの高度特異性を示す。ＣＴＬ活性は、既知濃度の下記の配列番号２〜８でそれぞれＣ７に含まれる重複デカペプチド、ならびにＨＬＡ−Ａ２モチーフノナペプチドＣ７Ａ２（図１参照）および全長Ｃ７ペプチドの存在下、Ｈ−２^d３Ｔ３繊維芽細胞ターゲット細胞株１８Ｎｅｏ上で測定した。図３は、ＨＣＶ感染患者におけるＣ７特異的ヒトＣＴＬのＨＬＡ拘束を示す。慢性Ｃ型肝炎患者（表４の番号７）のＣ７特異的ヒトＣＴＬ活性を、抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）または抗ＨＬＡクラスＩＩＤＲ（Ｌ−２４３、ＩｇＧ２ａ）を１：４で希釈したものとともに、あるいは抗体なしの状態で、１０μＭのＣ７の存在下で自己ターゲット細胞に対する細胞傷害性について調べた。「材料および方法」で述べたようにして、ＰＢＬをマイトマイシンＣ処理ＰＢＬとペプチドＣ７で２回刺激した。ペプチドの非存在下での細胞溶解率は５％未満であった。データはＳＥが５％未満のサンプル３つの平均であり、少なくとも２つの独立した実験の代表値である。図４は、ヒトＣＴＬがＨＬＡ−Ａ２によって提示されたＣ７のノナマーセグメントを認識することを示したデータである。慢性Ｃ型肝炎患者＃７および急性Ｃ型肝炎患者＃８のＰＢＬ（表４）を、「材料および方法」で述べたようにしてin vitroでマイトマイシンＣ処理自己ＰＢＬおよびペプチドＣ７で２回刺激し、ペプチドＣ７、ノナマーペプチドＣ７Ａ２（ＤＬＭＧＹＩＰＬＶ）の存在下または非存在下で、１００：１のエフェクター／ターゲット比で下記ターゲットに対する作用を測定した。すなわち、自己ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様細胞（＃７の場合、ＨＬＡ−Ａ１，Ａ２，Ｂ５１，Ｂｗ４，Ｂｗ６）または＃８にとっては自己ＣｏｎＡ芽球標的（＃８の場合、Ａ２，Ｂ５１）（自己細胞は＊で示す）、同種間ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球様細胞（ＨＬＡ−Ａ２４，３１，Ｂ５１，５４，ｗ４，ｗ６，Ｃｗ１；またはＨＬＡ−Ａ２６，ｗ３３，Ｂ１２，１５，Ｃｗ３）、Ｃ１Ｒ細胞株（３９）（ＨＬＡ−Ａ−ｎｅｇ，Ｂ−ｎｅｇ．，Ｃｗ４，ＤＲ８，ＤＰｗ４，ＤＱ３）をＨＬＡ−Ａ２．１でトランスフェクトしたもの（Ｃ１Ｒ−Ａ２）（３９）またはトランスフェクトしないもの（Ｃ１Ｒ）をターゲットとした。データはいずれもＳＥＭ＜５％の培養物３つの平均であり、少なくとも２つの独立した実験の代表値である。図５は、１９９４年４月５日の時点でゲンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）に登録されているＨＣＶ−コアタンパク質の配列、および実施例で用いたＨＣＶ−Ｈ配列、配列番号２２〜２６、を示す。太文字で示したアミノ酸残基は配列ごとに異なる残基を示す。発明の詳細な説明本発明のペプチドは、ＨＣＶビリオンのコアタンパク質の配列に由来するアミノ酸配列を持つ。ＨＣＶの単離株が幾つか得られており、これら全単離株のコアタンパク質のアミノ酸配列が９８〜９９％同一であることが認められた（３３）。幾つかのＨＣＶ単離株のコアタンパク質のアミノ酸配列を図５に示す。本出願の実施例において使用しているＨＣＶ−Ｈ単離株を，最上の行に示す（ＦＤＡ）。この配列の並びは、コアタンパク質のＣ末端配列が、単離株の間で顕著に異なっていることを示している。実施例においてより詳しく説明するが、コアタンパク質配列の変換は、ペプチドワクチンおよび診断試薬の設計において利点がある。英文明細書第２３頁補正Ｃ７−Ｇ１０及びＣ７−Ｐ１０Ｍオーバーラッピングデカペプチドのいずれも活性がなかったことから、これらのオーバーラッピングデカペプチド中に含まれるノナペプチドはいずれも最適応答に十分でないと結論する。従って、デカペプチドＣ７−Ａ１０は、これらのＤ^d拘束ＣＴＬによる認識にとって最適のペプチドであるように考えられる。興味深いことには、このペプチドはＤ^dから遊離した内因性のペプチドにより明確にされたようなＤ^dモチーフを含んでいなかった（１５）（下記参照）。Ｈ−２^dマウスにおいて、ＨＣＶコアタンパク質を発現している同系ターゲット細胞、並びにペプチドＣ７（ＨＣＶのコア内１２９〜１４４残基）の存在下でインキュベートしたターゲットを殺傷する能力を有するネズミＣＴＬを誘導したが、Ｈ−２^bマウスでは誘導しなかった。Ｈ−２^dは、Ｃ７に対する免疫応答（Ｉｒ）遺伝子応答体ハプロタイプであるが、Ｈ−２^bは応答体ではないと結論する。３つのＨ−２^dクラスＩ分子のいずれにＣ７が存在するかを決定するために、Ｋ^d、Ｌ^d又はＤ^dを発現しているＬ細胞（Ｈ−２^k）トランスフェクタントを使用し、Ｃ７ペプチドは、効果的なペプチド提示のためにＤ^d分子を必要とすることがわかった。興味深いことに、αヘリックスとして折り畳まれたときに両親媒性の側面において類似している点を除いては配列の著しい類似性を共有しない、本発明のＣ７（又はより具体的にはＣ７−Ａ１０）、ＨＣＶＮＳ５由来のペプチドＰ１７（６０）、並びにＨＩＶ−１ｇｐ１６０由来のＰ１８（６３）及びＨＰ５３（６１）を、同じＭＨＣ分子が提示することがわかった。これら４つのペプチドの中で、Ｐ１８のみが、Ｄ^dから溶離した内因性のペプチド、ＸＧＰＸ〔Ｋ／Ｒ／Ｈ〕ＸＸＸ（Ｘ）〔Ｌ／Ｉ／Ｆ〕、配列番号：９（１５）により限定される明確なＤ^d 結合モチーフを有する。従って、Ｄ^dに結合する他のモチーフも同様に存在しているにちがいない。該新規のＤ^d結合ペプチドの同定は、該新規なモチーフの特徴付けにおいて、助けとなるであろう。Ｄ^d結合に明確なモチーフを限定するには不十分なホモロジーが存在しているけれども、各ペプチドに対するＤ^d結合に含まれる残基の分析（６３）は、Ｄ^d特異性にとって構造的な必要性に新しい光を注ぐかもしれない。最大の殺傷性を得るためには、インビトロでの二次的にＣＴＬを刺激したり、ターゲットを増感させるために必要なペプチドの濃度は、Ｃ７及びＣ７−Ａ１０両方とも１〜３０μＭであることが明らかであった。この結果より、Ｄ^dモチーフを有するＤ^dにより拘束されたＨＩＶ−１ｇｐ１６０の免疫優性ＣＴＬ決定基であるＰ１８（６２）と比較して、これらのペプチドは、Ｈ−２Ｄ^dに中程度の親和性のみを有して結合することが示唆される。英文明細書第３２頁補正さらに、静脈注射のためには、タンパク質の分解に対する耐性を付与する修飾をペプチドに行っても良い。修飾の典型例としては、ペプチドのカルボキシル末端をアミド化することである。これらのペプチド誘導体を完成させる方法は、当技術分野でよく知られている。実施例５：ＨＣＶ感染防御用ワクチンとしてのペプチドの投与典型的なワクチン投与プロトコールの一部として、実施例４に説明されたコアタンパク質及びペプチドを投与する。被験者はまずＨＣＶのコアタンパク質の投与により初回免疫され、次いで、ペプチドの投与により追加免疫される。全タンパク質（Whole protein）の投与は注射、好ましくは筋内注射又は皮下注射により実施される。直接注射することに加えて、Takehashi（タケハシ）ら著、International Imm unology,5:849-857,1993に記載され、同時係属出願中の08/031,494号にあるように、ペプチドを自己由来のＰＢＭＣと２時間インキュベートし、インキュベートされた細胞を照射し、そして静脈内に再び注入することによってもペプチドを投与することができる。ＨＣＶコアタンパク質は、タンパク質全体を発現する組換えベクターにより得ることができる。組換えベクターは特に限定されるものではないが、ベクターの好ましい態様としては、ＨＣＶコアタンパク質をコードしているＤＮＡを、ワクシニアウイルスベクターから発現するものが挙げられる。実施例１に記載のｖＨＣＶ＃４ベクターは特に好ましい。組換えベクターは静脈注射又は皮内注射により投与される。その代わりに、患者の細胞をベクターで形質転換することが可能であり、その形質転換された細胞を患者に注入すること又は皮下に移植することも可能である。初回免疫後しばらくの後、好ましくは１〜２週間後に、本発明に記載のペプチドで患者をさらに免疫する。ペプチドは、かかるＣＴＬの応答を測定するあらゆる公知の方法により決定され、免疫されたペプチドに応答するＣＴＬを導くのに十分な量が投与される。請求の範囲１．配列番号：４、配列番号：１０、及び配列番号：１７からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する精製ペプチド、並びに担体を含有し、該精製ペプチドは哺乳動物において細胞傷害性Ｔリンパ球応答を刺激する有効量存在する組成物。２．該精製ペプチドのアミノ酸配列が配列番号：４である請求項１記載の組成物。３．該精製ペプチドのアミノ酸配列が配列番号：１０である請求項１記載の組成物。４．該精製ペプチドのアミノ酸配列が配列番号：１７である請求項１記載の組成物。５．該担体がアジュバントＱＳ２１である請求項１〜４いずれか記載の組成物。６．該担体が、照射をうけた（irradiated）自己由来の末梢血単核細胞を含有する請求項１〜４いずれか記載の組成物。７．該ペプチドが、５０〜５００μｇの範囲の投与量を与える量存在する請求項１〜６いずれか記載の組成物。８．該哺乳動物がヒトである請求項１〜７いずれか記載の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フェインストーン，ステファンアメリカ合衆国ワシントン，ディーシー 2008 エヌ．ダブリュー．，キャシードラルアベニュー 3021 (72)発明者白井陸訓香川県木田郡三木町池戸1239−２

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質の一部分のアミノ酸配列を有する精製ペプチドであって、該一部分が天然に存在する全コアタンパク質より小さいものであり、哺乳動物において細胞傷害性Ｔリンパ球応答を刺激し、そしてヒトＨＬＡ分子の結合モチーフに対応するアミノ酸配列を含む、精製ペプチド。２．ヒトＨＬＡ分子の該結合モチーフが表１のモチーフの一つから選ばれる請求項１記載の精製ペプチド。３．アミノ酸の長さが８〜１６である請求項１記載の精製ペプチド。４．図５に示されるアミノ酸配列に由来する請求項１記載の精製ペプチド。５．配列番号：１ＧＦＡＤＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬのアミノ酸配列を有する精製ペプチド。６．配列番号：１０ＤＬＭＧＹＩＰＬＶのアミノ酸配列を有する精製ペプチド。７．配列番号：４ＬＭＧＹＩＰＬＶＧＡのアミノ酸配列を有する精製ペプチド。８．請求項１記載のペプチド及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。９．請求項４記載のペプチド及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。１０．請求項５記載のペプチド及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。１１．請求項６記載のペプチド及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。１２．請求項８記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスに対する被験者の免疫化方法。１３．１）Ｃ型肝炎ウイルス抗原に対して被験者を初回免疫するのに効果的な量のＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを投与し、２）該被験者において該ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導するのに効果的な量の請求項８記載の医薬組成物を投与する、ことを含む、Ｃ型肝炎ウイルスに対する被験者の免疫化方法。１４．請求項９記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスに対する被験者の免疫化方法。１５．１）Ｃ型肝炎ウイルス抗原に対して被験者を初回免疫するのに効果的な量のＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを投与し、２）該被験者において該ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導するのに効果的な量の請求項９記載の医薬組成物を投与する、ことを含む、Ｃ型肝炎ウイルスに対する被験者の免疫化方法。１６．請求項１０記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスに対する被験者の免疫化方法。１７．１）Ｃ型肝炎ウイルス抗原に対して被験者を初回免疫するのに効果的な量のＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを投与し、２）該被験者において該ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導するのに効果的な量の請求項１０記載の医薬組成物を投与する、ことを含む、Ｃ型肝炎ウイルスに対する被験者の免疫化方法。１８．i)患者から末梢血単核細胞の試料を得、 ii）細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖を促進する条件下で、請求項１記載のペプチドと共に該末梢血単核細胞を培養し、そして iii）該培養物中のペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球活性を測定する、患者のＣ型肝炎ウイルスへの暴露の診断方法、又はＣ型肝炎ウイルスの感染後の患者の臨床経過の予想方法。１９．ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球活性の測定が、標的細胞の溶解の測定、サイトカインの分泌の測定、及び細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖の測定からなる群より選ばれる請求項１８記載の方法。２０．i）患者から末梢血単核細胞の試料を得、 ii）細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖を促進する条件下で、請求項４記載のペプチドと共に該末梢血単核細胞を培養し、そして iii）該培養物中のペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球活性を測定する、患者のＣ型肝炎ウイルスへの暴露の診断方法、又はＣ型肝炎ウイルスの感染後の患者の臨床経過の予想方法。２１．ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球活性の測定が、標的細胞の溶解の測定、サイトカインの分泌の測定、及び細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖の測定からなる群より選ばれる請求項２０記載の方法。２２．i）患者から末梢血単核細胞の試料を得、 ii）細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖を促進する条件下で、請求項５記載のペプチドと共に該末梢血単核細胞を培養し、そして iii）該培養物中のペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球活性を測定する、患者のＣ型肝炎ウイルスへの暴露の診断方法、又はＣ型肝炎ウイルスの感染後の患者の臨床経過の予想方法。２３．ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球活性の測定が、標的細胞の溶解の測定、サイトカインの分泌の測定、及び細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖の測定からなる群より選ばれる請求項２２記載の方法。