JPH07502729A - 免疫応答または抗感染応答を誘発するための方法と組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

免疫応答または抗感染応答を誘発するだめの方法と組成物 １１立ＩＪ これは、１９９１年１２月２日に出願された同時出願中の米国特許出願第０７／ ８００．９３２号の部分継続出願である。 １　日　の 本発明は一般に、エイズ、ヘルペス、インフルエンザ、ネコ白血病等のウィルス 感染症の予防と治療法、並びにｉｎ　ｖｉｖｏにおける特定の細胞障害性１９２ ８球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ−１ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：　ＣＴＬ）を感作させ るための組成物に関する。ＣＴＬワクチンの調製に使用する候補物質、典型的な のはポリペプチドであるが、その同定法を説明する。全身分布、活性、抗ウィル ス細胞障害性Ｔ細胞の寿命を増強し、ＨＩＶ感染症からヒト細胞を防御するペプ チドの組成物を開示する。 ２　関連　術の一説」方 エイズが米国で初めて認められたのは１９８１年のことであるが、それ以来、患 者数は劇的な速さで増加している。１９７８年以来、米国だけでも、２４０万例 以上のエイズ感染症例が報告されている（Ｒｅｅｓ、　１９８７）。感染患者に おいて、一旦明らかな免疫抑制症状が現れると、予想される結果は死である。こ の病気の致命的結果を無期限に延期あるいは予防する治療法は、現在のところ知 られていない。エイズは、最初同性愛または同性愛の男性と静注麻薬常用者に出 現したが、現在ではウィルスキャリアとの性交、またはウィルスキャリアがら得 られた血液製剤の投与により他の人々にも広がっている。 エイズの原因物質は、ヒトＴ細胞向性ウィルス口型（Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅ１ｌ 　Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｖｉｒｕｓ−ｔｙｐｅ　ＩＩＩ：　ＨＴＬＶ− ｍ）、リンパ腺症ウィルス（Ｌ＾■）、エイズ関連ウィルス（＾ＲＶ）として一 般に知られており、より最近ではヒト免疫不全ウィルス（旧■）と呼ばれる密接 な関係があるレトロウィルスの一群として同定されている。ここでは、これらの ウィルスを、便宜上まとめて旧■と呼ぶ。 他のレトロウィルスと同様、旧■はその遺伝物質としてＲＮＡを持っている。ウ ィルスが宿主細胞の中に入ると、逆転写酵素として知られるウィルスの酵素がウ ィルスＲＮＡを二本鎖ＤＮ＾の中に複写する。ウィルスＤＮＡは、細胞の核に移 動し、ここでウィルスＤＮＡはウィルスＲＮＡを更に複写するための鋳型として 働き、そこでウィルスＲＮ＾は新しいウィルス粒子に構成される。ウィルスＲＮ Ａは、ウィルスのコアタンパク質ＰＩ８、Ｐ２４、ＰＩ３および逆転写酵素等の 特定のウィルスタンパク質のメツセンジャーＲＮ＾（ｍＲＮ＾）としても作用す る。ＲＮＡは、ウィルスの外膜に挿入されているｇｐ４１およびＧＰ１２０とし て知られる２つのグリコジル化された構造タンパク質等の他の幾つがのウィルス タンパク質を産生ずるために必要な特異的ウィルスｍＲＮＡの中に「スプライシ ングコすることもできる（Ｖａｉｎ−Ｂｏｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５ ）。実験研究において、精製ｇｐ１２０は、ヤギ、ウマ、アカゲザルにおいてｌ ’ｌｌＶを中和させる抗体を誘発することが知られている（Ｒｏｂｅｙｅｔ　ａ ｌ、、　１９８６）。 ワクチンは、ウィルス等の物質によって引き起こされる感染を予防するために長 年使用されてきた。一般的な方法として、ヒトの免疫システムを感作して感染性 ウィルスに対する攻撃を開始させるために、健常人に、例えば死滅あるいは修飾 したウィルス調製物質を注入している。組み換えＤＮＡ技術における最近の進歩 によって、より安全なワクチン接種方法が可能となった。 この方法は、微生物系によって産生される露出したウィルス構成成分を使用する 方法である。十分な精製後、例えばタンパク質サブユニット等のウィルス構成成 分が適切な賦形剤またはアジュバントと共にワクチンとして投与される。後者は 、ウィルスのサブユニットに対する免疫応答を改善するように宿主のシステムを 刺激する。 別の可能なワクチン調製法は、化学的に合成されたウィルスタンパク質サブユニ ットのペプチド断片を使用する方法である。この方法には、製品の精製度、再現 性、免疫応答の特異性等の点で、他のワクチン調製法を凌ぐ利点がある。 感染性ウィルスの表面抗原は、Ｔ細胞とＢ細胞の応答を誘発し得る。Ｍｉｌｉｃ ｈと共同研究者の研究（Ｍｉｌｉｃｈｅｔ　ａｌ、、１９８６；　Ｍｉｌｉｃｈ 　＆　ＭｃＬａｃｈｌａｎ、１９８６）によれば、あるタンパク質ペプチド鎖の ある領域がＴ細胞エピトープあるいはＢ細胞エピトープのいずれかを所有し得る ことは明らかである。これらのエピトープは、しばしば互いに異なり、異なるペ プチド配列によって構成されることがある。他の例として、ニワトリ卵白リゾチ ームに関するＭａｉｚｅ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８０）の研究、グルカゴンに 関する５ｅｎｙｋ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９７１）の研究がある。従って、ある タンパク質配列の短い部分はＴ細胞の応答は誘発できるが、Ｂ細胞の応答は誘発 できない。この点に関するこれらの観察結果およびその他の観察結果をより完全 にレビューしたものが、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ　＆　Ｆａｔｈｍａｎ　（１９ ８７）の報告に示されている。 感染性Ｂ型肝炎ウィルスの表面タンパク質の中の短いペプチド領域が、マウスに おいてＴ細胞応答だけを誘発することが明らかにされている（Ｍｉｌｉｃｈ　ｅ ｔ　ａｌ、。 １９８６）。特に、Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子のｐｒｅ−３（２）ドメイン内に位 置する１２０〜１３２番目のアミノ酸由来の配列を持つ合成ペプチドは、そのペ プチドに対する非常に強力なＴ細胞感作反応を誘発するが、抗体反応は非常に僅 かしか刺激しなかった。言い換えれば、マウスのそのペプチドに対する抗体反応 は僅かだったが、免疫化されたマウスのＴ細胞は効率的に感作され（すなわち活 性化され）、Ｔ細胞増殖分析において測定された様に、そのペプチドを認識した （Ｍｉｌｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６）。 このペプチドによって免疫感作されたマウスによって産生された低レベルの抗体 は、天然のウィルス表面抗原に結合しなかった。 上記の結果と対照的に、第二のペプチド配列（アミノ酸１３２〜Ｉ４５）は、マ ウスにおいて非常に弱いＴ細胞応答を誘発した（Ｍｉｌｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、 １９８６）。しかし、この第二のペプチドは、Ｔ細胞のエピトープが供給される 条件において、第二のペプチドに対して作製された抗体と効率的に結合した。 マウスは、上述のＴ細胞とＢ細胞を活性化するペプチド配列の両者によって構成 されるより長いペプチドによっても免疫感作された。この場合、Ｂ部位のペプチ ドに対しては高力価の抗体が産生されたが、Ｔ部位のペプチドに対しては産生さ れなかった。１つのペプチドの中にＴ部位とＢ部位の両者を組み入れれば、ペプ チド鎖のＢ細胞エピトープに対する特異抗体産生により測定された様に、Ｔ細胞 とＢ細胞の両方の応答が刺激されるはずである。Ｔ細胞応答のみのものと、Ｔ細 胞応答とＢ細胞応答を組み合わせたものとの２種類の免疫応答を誘発するために 、合成ペプチド抗原を作製することができる。 細胞免疫応答は、ウィルス感染細胞の増殖を低下させる主要機序となっている（ Ｄｏｈｅｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５）。 Ｅａｒｌ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８６）による報告によれば、ウィルス表面タ ンパク質ワクチンによる、フレンドウィルス（レトロウィルス）により誘発され るマウス白血病に対する１９２３球の免疫感作と防御作用が明らかになっている 。 ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＨＩＶ増殖抑制作用において、１９２３球（ＯＫＴ８／Ｌ ＥＵ２陽性）ザブセットが果たす役割を示す直接的証拠がＷａｌｋｅｒ　ｅｔ　 ａｌ、、　（１９８６）によって最近得られた。 この研究によって、更に次のことが証明された。ＨＩＶに感染しているヒトの血 液からＣＤ８’　１９２３球が枯渇すると、最初はウィルス陰性であったか、あ るいは非常に低濃度のウィルスしか持っていなかった無症状のセロポジティブの 同性愛男性７例中４例の患者の末梢血単核細胞から大量の旧■が分離された。従 って、ＣＤ８’細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、ウィルスに感染しているヒ トにおいて、ｌ’ｌｌＶの複製と病気の進行の予防にある役割を果たしている可 能性がある。 ワクチン候補の一部に含めるために、タンパク質においてＴ細胞エピトープを同 定するという概念が重要と考えられる様になったのは、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ　ｅｔ 　ａｌ、、　（１９８６）により、インフルエンザ核タンパク質のＣＴＬエピト ープが、短い合成ペプチドによって規定できることが証明されたためである。し かし、現在までに、ｉｎ　ｖｉｖＯにおけるＣＴＬの感作に合成ペプチドを使用 した例は、インフルエンザウィルス、センダイウィルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウ ィルスに関連する３例に過ぎない。上記の例のいずれにおいても、免疫感作プロ トコルは煩雑で、ＣＴＬを証明するためにペプチドの修飾または多くの免疫感作 を実施しなくてはならず、大量の候補物質を迅速にスクリーニングするのには適 していない。例えば、Ａ１１ｃｈｅｌｅと共同研究者（１９９０）の方法は、１ 週問おきに３回の皮下投与による免疫感作を行い、分析用のＣＴＬと考えられる 物質が得られるまで、４週間を要する。 構造および調節ＦＩＩＶタンパク質の両者において候補となるＣＴＬｘビトープ が提案されたが（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、。 １９８８；　Ｎ１ｘｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８）、これらの内、ｉｎ　ｖｉ ｖｏでウィルスに特異的なＣＴＬを誘発できることが明らかにされたものは全く なかった（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、　１９９１）。例えば、ペプチドＲＩＱＲＧＰ ＧＲＡＦＶＴＩＧＫｌｉ、ｃＴＬノエピトーブトシテ同定されたが（Ｔａｋａｈ ａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）、これらの研究において、ｉｎ　ｖｉｖ ｏにおける旧ＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴ　ＩＧＫに特異的なＣＴＬの誘発は、ＨＩＶ 　ｅｎｖタンパク質を発現する組み換えワクシニアウィルスを用いて感染させた Ｂａ１ｂ／ｃマウスによって達成され（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８８）、遊離ペプチドを用いる免疫感作の試みは成功しながった（Ｂｅｒｚ ｏｆｓｋｙ、１９９１）。　Ｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、（１９９１）も、　ＣＴ Ｌエピトープ配列ＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳ　ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴ　Ｉヲ 持つ単一ペプチドを用いて免疫感作を行い、ＣＴＬ応答を引き起こすことはでき なかった。 ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるペプチドによって誘発されるＣＴＬ応答の基礎となる機 序はまだ完全に判っていない。例えば、Ｇａｏ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９９１） が報告したところによれば、ＣＴＬ抗原決定基にヘルパーＴ細胞抗原決定基を加 えてハイブリッドペプチドを作製しても、インフルエンザウィルスに対するＣＴ Ｌ産生は増強されなかった。これらの結果は、ヘルパーＴ細胞活性の誘発が、効 果的なＣＴＬ産生に特に必要でないことを示唆しているが、同じ研究において、 ＣＤ’細胞の枯渇により、ペプチドに対するＣＴＬ産生が抑制されたことが明ら かにされている。 従って、ｉｎ　ｖｉｖｏで特異的ＣＴＬ応答を誘発できるＣＴＬエピトープの迅 速な同定法の開発と、ＣＴＬ誘発の最適化の両者が今なお必要とされている。ｉ ｎ　ｖｉｖｏで作用するＣＴＬ誘発エピトープを同定するための過去の分析法は 多くの欠点があった。最も顕著な欠屯は、次の通りである。被験物質を複数回注 射しなくてはならない、その物質がＣＴＬ応答誘発作用を持つかどうかを決定す るのに３週間またはそれ以上待たなくてはならない、応答を誘発するために、被 験物質と共に修飾因子を一般に含めなくてはならない、等である。多様な疾患に 関する予防法と治療法を考える上で、ｉｎ　ｖｉｖｏでＣＴＬを誘発できるペプ チドを同定するための迅速な方法が極めて重要であることは明らかである。 現在の技術では、ペプチドによる免疫感作後、持続する高レベルの全身性ＣＴＬ 応答を引き起こす有効な方法も見つかっていない。抗ウィルスＣＴＬ細胞の産生 と全身分布を増強する方法を開発することは、感染性ウィルスに対するワクチン の開発に非常に有利である。その様な方法は、エイズやインフルエンザ等のウィ ルスに対して使用する重要な武器であるばかりでなく、寄生虫等の他の物質に対 するワクチン接種にも応用できる可能性がある。 ｇｐ１２０のｖ３ループ領域は、ＨＩＶ−１が細胞内に侵入するのに不可欠であ ることが知られているが（Ｔｒａｖｉｓ　ｅｔａｌ、、　１９９１；　Ｆｒｅｅ ｄ　＆　Ｒ１５ｅｒ、１９８７；　Ｆｒｅｅｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１）、 この知見はまたＨＩＶ感染を予防する有効な臨床的方法の開発を導くものとなる はずである。■３由来の合成ペプチドは、ＨＩＬＬに感染した細胞間のシンシチ ウム形成を抑制することが報告されている（Ｋｏｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、。 １９８９）。これとは対照的に、Ｄｅ　Ｒｏｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９９ １）は、ＣＤ４依存性機序により■３由来の合成ペプチドが細胞のＦＩＩＶ−１ 感染を実際に増強したことを報告した。従って、ＨＩＶに対する適切なワクチン が無いことは明らかであり、更に、ウィルス感染を阻止するための、またＨＩＶ に感染したヒトにおいて病気の進行を阻止するための有効な手段も今の所無い。 １１立１ｊ 本発明は、免疫応答または抗感染応答を誘発するための新しい組成物と方法を幾 つか提供することによって、従来の技術における既述のあるいはその他の欠点を １つ以上解決しようとするものである。第一に、本発明は、ウィルス疾患に対す る免疫感作、特にＩ’ｌｌＶに対する免疫感作のための特異的な組成物と方法を 提供する。本発明の改善された免疫感作のための組成物、すなわちワクチンは、 ウィルスに特異的な細胞障害性１９２３球（ＣＴＬ）の寿命や、全身分布、活性 レベルを増強する合成ペプチドの組み合わせによって構成される。 第二に、本発明は、ＩＩＴＶ感染症を抑制するために使用される治療用の組成物 と方法を提供する。本発明の治療用処方は、Ｉ（ＩＶ感染からヒトの細胞を防御 する機能を持つ合成ペプチドから構成される。従って、本発明は、予防にも治療 にも応用できる抗ウィルス、特に抗１（ＩＶ作用を有する組成物を広範に含んで いる。 第三に、本発明は、ＣＴＬを特異的に感作する能力を持ち、従ってＣＴＬ誘発ワ クチン接種等の治療用組成物に使用するのに最も適切なものを同定するために、 ペプチド等の多数の候補化合物の迅速かつ鋭敏なスクリーニングのための免疫感 作および検定方法をも提供する。 本発明のこの面は一般に、１（ＩＶおよびインフルエンザウィルス等の感染物質 に感染した細胞に対する反応性をＣＴＬに獲得させるために、ＣＴＬを特異的に 感作する能力を持つワクチン構成成分を同定するための方法と組成物に関するも のである。 ＣＴＬ応答の増強に関する実施例では、本発明は特定の免疫原に対する、特にＣ ＴＬ誘発ペプチドに対する、動物のＣＴ　Ｌ応答を増強するための組成物と方法 に関する。ＣＴＬ誘発ペプチドは、ＣＴＬを誘発するエピトープを持っているペ プチドで、このペプチドを動物に投与すると、特定の細胞障害性１９２３球の形 成を刺激したり、あるいは活性を上昇させたりすることができる。　ｒＣＴＬ応 答を増強する」という文言は、ここではＣＴＬ応答の全ての面における改善を含 む意味で使用され、例えばＣＴＬ誘発ペプチドに対する応答の全身分布、活性レ ベル、応答期間の長さの改善等が含まれる。 ペプチド等の免疫原に対するＣＴＬ応答を増強するための本発明の方法は、ヘル パーＴ細胞誘発活性を持つ免疫感作混合物に別々の異なるクラスのペプチドを含 む組成物を加えることである。従って、この方法でＣＴＬ応答の増強を達成する ために、免疫原そのものの他に、免疫学的に有効な分量のヘルパーＴ細胞のエピ トープを持つペプチドを動物に投与する。 関連する実施例において、本発明はＣＴＬ応答を増強することが可能な候補物質 の同定方法を提供している。 ペプチドの様な増強物質を同定するために、候補物質とＣＴＬ応答を誘発するこ とが可能な免疫原の両方を動物に投与する。次に、ＣＴＬを動物から回収し、全 身分布と寿命を含む活性を測定する。ＣＴＬ応答を増強できる候補物質は、上記 のパラメータのいずれかを用いて、免疫原単独の場合に観察された以上にＣＴＬ 応答を上昇させた物質として同定される。 本発明の免疫感作法は一般に、ウィルスまたは寄生虫等の多様な感染物質由来の ものも含めて、いかなる感染源から得られた免疫原でも、それに対するＣＴＬ応 答を増強するために応用することができる。しかし、本発明の望ましい実施例に おいて、ＩＩＩＶウィルスの構成成分に対するＣＴＬ応答を増強する一例が示さ れている。ＣＴＬ応答は、どの様なウィルス遺伝子であろうと、その生成物中に 位置するエピトープに対して生じさせることができる。それらの遺伝子には、例 えばｇａｇ、　ｐｏｌ、ｎｅｆ、　ｅｎｖ遺伝子等があり、ｅｎｖ遺伝子の生成 物は望ましい目標である。 本発明によれば、多種多様なペプチド配列のいずれでもＣＴＬ誘発エピトープと して使用できる。これらには、表１に示されるペプチドが含まれる。これは、勿 論−例であって、完璧なリストではない。望ましい実施例において、ｅｎｖ（エ ンベロープ）遺伝子生成物由来のペプチドと、より望ましくはＨＩＶ　ｇｐ１２ ０のｖ３ループ由来のペプチドがＣＴＬ誘発ペプチドとして使用されるものと考 えられる。様々なＨＩＶ−１分離株から得られた■３ループペプチドの一例を示 すリストが表２に示されている。ＣＴＬ応答の誘発に成功したことが明らかにさ れている■３ループ由来のペプチドの具体的な例としてペプチドＲ１５Ｋがアリ 、配列ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ　（、配列番号１）を持っている。 表２ 種々の１１日弓分離株のＶ３ループから得られた合成ペプチドＤ２３（２４ａａ ）　ＭＮ　ＹＮＫＲＫＲＩｔｌｌＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮＮＩＧＣＤ２４（１５ ａａ）　ＭＮ　ＲＩＩＩＩＧＩ’ＧＲＡＦＹＴＴＫＮＤ２５（１５ａａ）　Ｗｉ ｌＪ　−３５ＬＳＩＧＰＧＲＡＰＲＴＲＥＩＤ２６（２４ａａ）　ＲＦ　ＮＮＴ Ｒに５ＩＴＫＧＰＧＲ１’１ＹＡＴＧＱＩＩＧＤＤ２７（１５ａａ）　ＮＹ−５ ＣＩＡＩＧＰＧＲＴＬＹＡＲＥＫＤ２８（１５ａａ）　ＲＦ　５ＩＴＫＧＰＧＲ ＶＩＹＡＴＧＱＤ２９（１５ａａ　）　ＣＤＣ４ＲＶＴＬＧＰＧＲＶｉＹＴＴＧ ＥＤ３０（１５ａａ）　ＳＣ５ＩＩＩＩＧＰＧＲＡＦＹＡＴＧＤＤ３１（１５ａ ａ）　２３　５ＩＲＩＧＰＧＫＶＦＴＡＫＧＧＤ３２（１５ａａ）　ＳＦ２　５ ＩＹＩＧＰＧＲＡＦＨＴＴＧＲＤ３３（１５ａａ）　１ｌＡＬ　ＧＩＩＩＦＣＰ ＧＱＡＬＹＴＴＧＩＤ３４（１５ａａ）　２３２１　５ＩＳＩＧＰＧＲＡＦＦＡ ＴＴＤＤ３５（１５ａａ）　Ｚ６　５ＴＰＩＧＬＧＱＡＬＹＴＴＲＧＤ３７（１ ５ａａ）　ＪＹＩ　５ＴＰＩＧＬＧＱＡＬＹＴＴＲＩＤ３８（１５ａａ）　Ｅｌ 、Ｉ　ＲＴＰＴＧＬＧＱＳＬＹＴＴＲ３Ｄ３９（１５ａａ）　ＩＩＮ（Ｙ−Ｌ） 　ＲＩＨＩＧＰＧＡＲＦＬＴＴＫＮＤ４０（１５ａａ）　ＭＮ（Ｙ−Ｆ）　ＲＩ ＩＩＩＧＰＧＲＡＦＦＴＴＫＮＤ４４（１５ａａ）　（Ｒ１５Ｋ）　ＩＩＩＢ　 ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ様々な方法を利用して、本発明に使用するのに 適したヘルパーＴ細胞を誘発するエピトープを同定することができる。例えば、 ペプチド配列の両親媒性は、ヘルパーＴ細胞誘発物質として機能するペプチド配 列の能力に影響することが知られている。望ましい実施例において、両親媒性値 が約プラス１０がら約プラス２０のヘルパーＴ細胞を誘発するエピトープの使用 が望まれるであろうと考えられる。他の定量可能な特性には、例えば１００＋　 １５度のαヘリックス回転、または１２０±１５度の回転の３＋ｏヘリックス回 転等が含まれる。特にＨＩｖに関連する実施例において、両親媒性値が上述の範 囲内にあるＨ■■ｇ＋）１２０配列がら得られたヘルパーＴ細胞誘発ペプチドが 望ましいであろう。 再ヒａｌｖｒ：関連ｔ、テ、配列ＣＲＩＫＱＩＩＮＭＷＱＧＶＧＫＡＭＹＡ（１ ９Ａ。 配列番号２）を含むペプチドの使用が望ましい。と言うのは、このペプチドはＣ ＴＬ応答の増強に特に効果があることが認められたからである。しがし、他のヘ ルパーＴ細胞誘発ＨＩ　Ｖを含むペプチドも利用できる。ヘルパーＴ細胞誘発旧 Ｖに関しては、引用することにより本明細書の一部とする米国特許第５．１２８ ．３１９号の中で十分検討されている。 本発明に関連する実施例は、ＣＴＬ応答の改善に影響する組成物に関するもので ある。その様な組成物は、一般に少なくとも２つのペプチドを含んでいる。１つ は免疫応答が特に期待されるＣＴＬ誘発エピトープで、もう１つはヘルパーＴ細 胞誘発エピトープである。このような組み合わせのペプチドを薬理学的に許容で きる賦形剤中に分散した組成物が、ワクチンとして使用するには理想的な処方で あろう。 本発明の第二の一般的な側面は、ヒトの細胞を）ＩＩＶ−１感染から防御する合 成ペプチドの同定に関するものである。このような抑制作用を持つペプチドは、 細胞のＨＩＶ感染を抑制するために使用することができ、たとえば検定分析に使 用されたり、エイズの治療に使用する治療薬として使用される。 ここに使用されているｒ　ＨＩＶ感染を抑制する配列」という文言は、Ｉ’ｌＩ Ｖウィルスがその標的細胞に侵入するのを防ぐペプチド配列を示している。抑制 作用を持つペプチドはそれ自体、感染過程に関与しているか、あるいは標的細胞 に接触する作用を持つペプチド配列を含むという特徴を持っている可能性がある 。感染を抑制するペプチドは特に、その配列に対する抗体がＩ’ｌｌＶの細胞感 染を抑制できるような配列から構成されるペプチドを含んでいる。 本発明は、ＨＮ’−１ｅｎｖ遺伝子生成物であるｇｐ１２０由来の配列を持つ合 成ペプチドが、ＩＩＩＶの細胞感染を抑制する能力を持つことを開示している。 特に、発明者らは、■３ループの中とｇｐ１２０のＮ末端領域に旧Ｖ感染を抑制 する配列を同定した。ｌ’ｌｌＶ感染を抑制する配列は、ＣＤ４結合領域内にも 位置しているかもしれないと考えられる。 望ましい実施例において、発明者等はｇｐ１２０のｖ３ループ由来の配列を持つ 旧■感染を抑制する配列の使用を考えている。ここに詳細に示す様に、この点に おいて有用であることが見いだされたペプチドには、表１１のペプチド、特にペ プチドＤ２３、Ｄ２４、Ｄ２６、Ｄ３０、Ｄ３５、Ｄ３８、Ｄ３９、Ｄ４０、Ｄ ４４（Ｒ１５Ｋ）が含まれ、これらの配列が表１１＾１こ示されている。これら のペプチドは、ｍｎ、　ｒｆ、　ｗｍｊ−３、ｓｃ、　ｚ６、ｅｌｉ、ｍｎ（ｙ −１）、ｍｎ（ｙ−ｐ）等の様々な株の■３ループ由来の配列を持っている。望 ましいｖ３由来の感染を抑制するペプチドには、表１１＾に示される配列や、配 列ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴ４ＧＫ　（配列番号１）を持−）　Ｒ１５に、　配 列ＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＴＡＦＶＴＩＧＫＩＧ　（配列番号３）を持ツ Ｎ２４Ｇも含まれるものと考えられる。 本発明の重要な側面は、様々な異なる）ＩＴＶ分離株から得られた配列に対応す る配列を持つペプチドが細胞のＨＩＶ感染を抑制する能力を持っていることを発 見した点である。表１１八に示されている以外に、これらのペプチドには例えば 、ＨＩＶ−１ｍｎ株から得られた■３ループペプチドである旧３Ｎ　（ＨＩＧＰ ＧＲＡＦＹＴＴＫＮ、配列番号７）と旧Ｖ−１ｒｆ株由来のｖ３ループペプチド であるＴ１３Ｑ　（ＴＫＧＰＧＲＶＩＹＡＴＧＱ、配列番号６）が含まれる。し かし、表１１に関しては、このデータが、１種類の１７株、すなわち）ＩＮ’− Ｉ　ＩＩＩ　Ｂによる感染の抑制に特に注目して分析したものであることに注意 を要する。従って、表１１Ｂに示されているＤ２７、Ｄ２８、Ｄ２９、Ｄ３１． 　Ｄ３２、Ｄ３３、Ｄ３４、Ｄ３７の様なペプチドは、ある特定の抑制作用分析 には活性を示さないかも知れないが、例えばＨＩＶ株ｎｙ−５、ｒｆ、、ｃｄｃ ４、ｚ３、ｓｆ２、ｍａｌ。 ｚ３２１、ｊｙｌ等の他の多様なＨＩＶ株による標的細胞の感染の抑制には有用 かも知れない。 発明者等はまた、配列ＥＱＬＷＶＴＶＹＹＧＶＰＶ　（配列番号４）を持つＥ１ ３Ｖの様なｇｐ１２０　Ｎ末端からのペプチドを、感染を抑制するペプチドとし て同定した。ｇｐ１２０のこの領域は異なるＦＩＩＶ株において比較的保存され ていることが知られているので、これは重要な所見である。 これらの配列の一部を含むより小さなペプチド、例えば配列ＲＡＦＶＴＩＧＫ　 （配列番号５）を持つＲ８に等も、感染を抑制する配列を有するものとして同定 された。より小さなペプチドとペプチド断片そのものが、ここに示す方法に従っ て、また本発明の範囲内で有用であると考えられる。 本発明の感染を抑制するペプチドには、天然あるいは工学的に生成され、なおＨ ＩＶが細胞内に侵入するのを防ぐ作用を有する多様な配列が含まれるものと思わ れる。表１．２．１１のペプチドと生物学的機能が同等の物質と、ＲＩ５に、　 Ｎ２４Ｇ、　Ｒ１３Ｋ、　Ｔ１３Ｑ等のペプチドも本発明の範囲に入るものと考 えられる。 この様な生物学的な機能性を有するペプチドと同等の物質は、アミノ酸のヒトロ バシー指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｎｄｅｘ）に基づ（変更を含みうる。ア ミノ酸の相対的ヒトロバシー特性は、結果的に生成されるタンパク質またはペプ チドの二次構造を決定し、これによってレセプターや抗体等の他の分子との相互 作用が規定されるものと考えられている。特定のアミノ酸を、類似のヒトロバシ ー指数またはスコアを有する他のアミノ酸と置換しても、同様の物活性を有する ペプチドを得ることができることが知られている（Ｋｙｔｅ　＆　Ｄｏｏｌｉｔ ｔｌｅ、　１９８２）。 アミノ酸のヒトロバシー指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　１ｎｄｅｘ）は、以下 の通りである。イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋ ３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システィン／シスチン（＋２．５） 、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０，４）、ス レオニン（−〇。 ７）、セリン（−０，８）、トリプトファン（−０，９）、チロシン（−１，３ ）、プロリン（−１，６）、ヒスチジン（−３，２）、グルタミン酸（−３，５ ）、グルタミン（−３，５）、アスノぐラギン酸（−３，５）、アスパラギン（ −３，５）、リジン（−３，９）、アルギニン（−４，５）。生物学的機能が同 等な物質は、ヒトロバシー指数が±２以内でアミノ酸を置換されたペプチドと考 えられ、より望ましいのは±ｌ、更に望ましいのは土０５である。 類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて行うこともできる。これによって作 製された生物学的機能が同等のタンパク質またはペプチドを、本発明の場合の様 に、免疫学的実施例において使用することを目的とした場合には、特に当てはま る。引用することにより本明細書の一部とする米国特許第４．５５４．１０１号 によれば、隣接するアミノ酸の親水性によって左右されるタンパク質の局所的な 平均親水度の最大値は、その免疫原性と抗原性、すなわちそのタンパク質の生物 学的特性と関係がある。 米国特許第４．５５４゜１０１号に詳細に述べられている様に、アミノ酸残基に 以下の親水性値が示されている。アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０） 、アスパラギン酸（＋３゜０±１）、グルタミン塩（＋３．０±１）、セリン（ ＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン酸（＋０．２）、グリシン （０）、プロリン（−０，５±１）、スレオニン（−０，４）、アラニン（−０ ，５）、ヒスチジン（−０，５）、システィン（−１，０）、メチオニン（−１ ，３）、バリン（−１，５）、ロイシン（−１，８）、イソロイシン（−１，８ ）、チロシン（−２，３）、フェニルアラニン（−２，５）、トリプトファン（ −３，４）である。同様に、生物学的機能が同等な物質は、親水性の値が±２以 内でアミノ酸を置換されたペプチドと考えられ、より望ましいのは＋１、更に望 ましいのは±０．５である。 従って、上記に概説した様に、アミノ酸の置換は一般に、疎水性、親水性、電荷 、大きさ等のアミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性に基づいている。前述の様々 な特徴を考慮に入れた模範的な置換例は、本技術に精通している者にはよく知ら れており、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、セリンとスレ オニン、グルタミンとアスパラギン、そして、バリンとロイシンとイソロイシン 等がある。 上述の特定の配列と、それらと生物学的機能が同等の物質以外の配列も、旧■の 感染を抑制するペプチドとして使用することができる。例えば、上述の様に、そ の配列に対する抗ペプチド抗体が、ウィルスが細胞内に侵入するのを抑制するこ とが明らかにされている配列ならば、ここに示される方法に準じて使用するのに 適したｔｌｌＶ感染を抑制するペプチドとなる。本発明の長所として、約ｌμｇ ／ｍｌから約１ｎｇ／ｍｌの様な低濃度において、この様なペプチドが有効に作 用することが証明されたことが挙げられる。 いずれにしても、本発見に照らして、現在ＨＩＶ感染を抑制するペプチドとして 機能する可能性のある候補配列を同定し、テストすることができる。この様な候 補ペプチドは、ｇｐ１２０の■３ループまたはＮ末端領域内に位置する配列、あ るいはｇｐ１２０のＣＯ２結合領域内に位置する配列さえ含んでいる可能性が高 く、望ましくは、その配列に対して抗体が生成され、その抗体が）ＩＩＶの細胞 感染を抑制あるいは減少させることが明らかにされている様な配列である。候補 配列は、ペプチドとして合成され、ＨＩＶの細胞感染を抑制する能力をテストす ることができる。 上記に論じられている様に、本発明の組成物において、ＣＴＬを誘発するエピト ープを含むペプチドは、ヘルパーＴ細胞を誘発するエピトープを含むペプチドと 組み合わせて、免疫感作、またはワクチンの組成物を作製することができる。免 疫感作のためのペプチドの組み合わせに関しては、ＩＩＩＶ　ｇｐ１２０の保存 度の高い領域に対応する配列を持つペプチドを使用するのが一般に望ましい。更 に、特にＨＩＶに関して、ＣＴＬを誘発するペプチドを、治療用組成物としての ＨＩＶ惑染を抑制する配列と組み合わせることができる。 しかし、重要なことであるが、ここに同定された３つの異なるペプチド分類の３ 類全てによって構成される組成物も、本発明によって考えられている。この様な 組成物は、それだけでＨＩＶ−１にょるヒトの細胞の感染を防止し、かつ、ｎ＋ ｖ−ｔに特異的なＣＴＬ応答を誘発することが可能であると思われる。これらの 組成物は全て、合成により得ることができ、また完全に定義されているので、こ れらの試薬は経済性と安全性の両者を備えている。 当然、どのペプチドも、一つ以上の免疫活性を持つものと思われる。この現象の よい例として、ＣＴＬ誘発と感染抑制特性を持つペプチドＲ１５Ｋが挙げられる 。最も望ましい実施例において、天然のＨＩＶに結合する抗体の著しい産生を引 き起こさないペプチドを使用することが考えられている。モノマーとして直接使 用されるのに加え、本発明ののペプチドは、ポリマー、または末端が脂質のペプ チドとしても生成することができる。 本発明の第三の一般的側面は、ある組成物の、動物における細胞障害性Ｔ細胞（ ＣＴＬ）の応答を誘発する能力を分析するための改善された方法に関するもので ある。 これに関連して、ある組成物が有する、別の成分によって誘発されたＣＴＬ応答 を増強する能力を分析する方法がある。これらのスクリーニング法は、一般；こ 次の過程が含まれる。ヒトまたはマウス、う・ソト、ウサギ、モルモット、ヤギ 、アカゲザル、またはチンノ々ンジー等の実験動物等の動物を免疫感作し、その 後、動物のリンパ節またはその他のリンパ組織から細胞を採取し、次に免疫感作 されたＣＴＬが存在するかどうかをテストする。免疫感作されたＣＴＬは、ウィ ルスのエンベロープ、コアタンパク質、機能タンノクク質（例えば逆転写酵素） 等の感染性物質の成分を産生ずる細胞を、死滅また（ま溶解させる。 従って、本発明のこの方法は一般に、３つのステ・ツブを含んでいる。第一のス テ・ツブは、テストする組成物を用いて動物を免疫感作することである。許容で きるものであればどの様な免疫感作法でも、経路でも使用でき、ここに示す方法 に従って幾つかの利点を達成することができるものと考えられているが、発明者 等は、陵内投与による免疫感作が特に有利であることを見いだした。陵内投与に よる免疫感作は、免疫システムの中の細胞免疫をより効率的に活性化する様（こ 作用するため、より望ましいと考えられている。更に、希望すれば、免疫感作物 質の複数回投与を選択することができ、複数部位に注射することもできるが、発 明者等の発見したところによれば、本発明の特別な利点は、リンパ節付近におい て検出可能なＣＴＬの活性化を達成するには、候補物質の単回投与で十分である 点である。 更に、希望すれば、ヘルパーＴ細胞のペプチド配列、ミセル形成を引き起こす脂 質構造、ペプチドの重合法等の免疫感作修飾因子を候補組成物と共に使用するこ とができるが、発明者等は、分析の感度から、ＣＴＬの免疫感作を達成するため にその様な修飾因子を使用する必要は一般にないことを見いだした。 一旦免疫感作が達成されたならば、次に必要なのは、免疫感作した動物のリンパ 組織から細胞障害性Ｔ細胞を回収することである。望ましいリンパ組織はリンパ 節組織で、注射部位近位の排出リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏ ｄｅ）の組織が最も望ましい。ここに使用されている「近位のリンパ節」という 文言は、注射部位の近位に位置するリンパ節を意味しており、例えば、マウスの 足の肉旺に注射後の膝窩リンパ節がそれにあたる。 ＣＴＬの活性化を同定するために近位または排出リンパ節を使用する理由は、本 発明のより望ましい点である迅速性にある。この様なリンパ節は免疫感作部位の 近傍に位置するか、あるいは免疫感作部位からの排出領域に位置しており、また 免疫感作部位からは物理的に遠隔に位置する排出リンパ節も含まれる。 非常に総合的な意味で分析の最終ステップは、当該細胞障害性Ｔ細胞がその組成 物によって活性化されたかどうかを決定することである。一般的には必要でない が、実際に活性化レベルを測定することが一般に望ましい。これは例えば、放射 性クロム放出分析またはその他のラジオアイソトープ分析、または単細胞分析に よって行われ、ウィルス株および／または細胞選別器を使用する単細胞障害性分 析を行うこともできる。 細胞障害性Ｔ細胞の活性化を測定したい場合、望ましい方法は、細胞表面に候補 エピトープを持つＭＨＣ適合標的細胞に死滅効果を発揮する分量の当該細胞障害 性Ｔ細胞を接触させ、当該細胞障害性Ｔ細胞が当該標的細胞を溶解するのに十分 な時間当該接触を維持し、Ｔ細胞による当該標的細胞の溶解の程度を決定する。 しかし、特異的なＣＴＬ応答を検出できるどの様な方法でも使用でき、クロム放 出分析、単細胞分析等、細胞と細胞の複合体の測定等があるが、これらに限定さ れるものではない。 本発明の利点は、候補物質のＣＴ　Ｌ活性化能を迅速に測°・　定できる点にあ る。従来の技術によれば一般に数週間時たなくてはならなかった（Ｋａｓｔ　ｅ ｔ　ａｌ、、１９９１；　Ａｉｃｈｅｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０）。しか し、本技術では一般に免疫感作後７〜１０日しかかからない。本発明の分析によ り、ＣＴＬ応答を達成するにに必要な時間が短縮される理由は、免疫感作の経路 と排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）または近位のリンパ節細胞を使用した結果である。 更なる利点は、ペプチド候補のＣＴ　１．活廿を増強するために、ｔｐ体分子、 肪質末端１．またはヘルパーＴ細胞エピトープの様な関連する修飾因子を使用せ ずに、ペプチド候補をテストできる点である。 ＣＴＬの免疫感作能をテストされる組成物は一般に、有用な活性を持つものと確 信されている、あるいは疑われている一以上のペプチドまたはペプチドマルチマ ーから構成される。本発明の技術をその様なペプチドに応用することによって、 この様なペプチドに実際にＣＴＬ免疫感作作用があるのかどうかを決定すること ができる。もしそうならば、ペプチドはＣＴＬ免疫感作ワクチンの候補に含めら れることになる。ＣＴＬ免疫感作作用を持つ候補物質は一般にペプチド（または タンパク質）によって構成されるが、非ペプチジル化合物にも本発明の分析法を 使用できることは、本技術に精通している者には理解できるであろう。 本発明の方法は、広範囲に応用できることが提唱されている。特に、エイズ、イ ンフルエンザ、ネコ白血病、ウシ白血病、ヘルペスウィルス感染症等のウィルス 性疾患、および寄生虫や細菌感染症等のウィルス以外の感染性疾患の場合にも、 その治療および／または予防用ワクチンの調製に使用する成分の同定に特に応用 できる。従って、特異的な抗ＨＩＶ　ＣＴＬ応答を促進するエピトープの同定を 目的とした実施例の場合、本発明は一般に、Ｉ’ｌＩＶに感染している細胞に対 するＣＴＬ応答を指示する能力を持つペプチドを同定することになる。 ワクチン開発の場合、本発明の方法によれば、まず、前述の方法に準じてＣＴＬ と反応する組成物を同定し、その組成物を一以上の水、塩、乳化剤および／また はアジュバント等の薬理学的に許容できる希釈剤または添加剤と混合する。ワク チンに添加する組成物の量は、当然その特異的ＣＴＬ応答誘発能、溶解度、その 他の生物学的反応によって異なる。従って、同定されたＣＴＬを免疫感作する組 成物の適切な量の選択は、本発見の技術の範囲で十分に行われる。 他の実施例において、本発明は、細胞障害性Ｔ細胞の調製方法を示している。非 常に一般的な意味で、この方法は、望ましくは皮肉投与によって、標的タンパク 質の予め選択したエピトープに対する細胞障害性Ｔ細胞の応答を誘発する能力を 持つ組成物を用いて、動物を免疫感作する方法が含まれている。使用されるエピ トープは、ＣＴＬ免疫感作に特異的かどうかわからないので、標的タンパク質と 交差反応する抗体を実質的に誘発することも、しないこともある。しかし、本発 明のこの側面を実用化する場合には、動物のリンパ節から得られた細胞障害性Ｔ 細胞を、更に利用するために、回収することを望むのが普通であろう。例えば、 人間の治療の場合、特異的に免疫感作されたＣＴＬを培養し、ウィルス感染症ま たは癌患者の治療のために投与することが考えられる。この場合、ＣＴＬはｉｎ 　ｖｉｖｏてその種を免疫感作することによって調製され、免疫細胞を分離し１ 、。ｖｉｔｒｏで適切なペプチドや、サイトカイン、得られた細胞の存在下にお いて増殖させる。 典型的には、１（ＥＶを標的とするＣＴＬ応答の誘発に、本発明は、７個から３ ０個のアミノ酸残基から構成され、ウィルスによって発現されるｇｐ１６０エン ベロープおよびコアタンパク質、逆転写酵素、ｔａｔ、　ｒｅｖ、その他の遺伝 子生成物等のＨＩＶタンパク質のドメインに対応する配列を持つペプチドを使用 している。この様なペプチドはその構造の中に保存領域を含んでいる。 ワクチンの調製には、単一の複合体の中に複数のＣＴＬエピトープを含めるため に、ペプチドマルチマーが一般に望ましい。特定の２つのクラスのペプチドマル チマーが明らかにされている。１つのクラスのペプチドマルチマーにおいては、 １つのペプチドのアミン末端残基はスペーサーペプチドにペプチド結合されてお り、スペーサーペプチドは１個のリシル残基およびグリシル残基等の約１個から ５個のアミノ酸残基を含み、混成ポリペプチドを形成している。これらのスペー サーペプチドに付いている残基は、マルチマーの免疫感作能も、また水性組成物 において界面活性剤の様なミセル形成能も障害しない。アミノ末端リンル残基の アルファおよびニブシロン−アミノ基は、パルミチン酸の様なＣｌ２−Ｃ＋８の 脂肪酸によりアミド化され、使用される反応生成物を形成する。この様に形成さ れたジアミドは、水性組成物において界面活性剤様のミセルのマルチマーを形成 する。 第二のクラスのマルチマーは、反復するユニットととしてペプチドを含むポリマ ーである。この場合、各ペプチドはそのアミン末端およびカルボキシ末端の両末 端にシスティン（Ｃｙｓ）残基を含む様に合成される。次に、得られた２つのシ スティン末端を持つ（ｄｉ−Ｃｙｓ）ペプチドを酸化し、ジーＣｙｓペプチドモ ノマーをポリマーまたは環状ペプチドマルチマーにポリマー化する。ここで、反 復するユニットはンスチン（システィンが酸化されたもの）残基によって結合さ れている。 どちらのクラスのペプチドマルチマーも、１つまたは複数の異なるペプチド配列 を含んでいる。マルチマーのペプチドは、下達の組成物において使用されると、 マルチマーが細胞障害性Ｔ細胞生産の様な細胞性免疫を誘発できることから「活 性」ペプチドである。マルチマーは、例えばマルチマーを水性培地に拡散するの を助けるための不活性ペプチドも含んでいる。前述のリシルを含むペプチドスペ ーサーは、それ自体不活性ペプチドと見なすことができる。 ペプチドマルチマーは水性組成物（接種物）として利用される。この組成物は、 前述のマルチマーをその中に拡散させる水を含んでいる。この組成物は、マウス 等の免疫能力のある宿主動物の免疫感作に使用すると、マルチマーの活性ペプチ ドの配列と配列に関して対応する天然の［Ｖタンパク質に対する細胞障害性Ｔ細 胞の活性化等の細胞性免疫を誘発する能力を有するが、対応する天然のＨＩＶタ ンパク質と免疫反応を示す抗体の産生は殆ど誘発しない。従って、この組成物は 、免疫感作有効量の前述のマルチマーのペプチドを含んでいる。 図面の簡単な説明 図１は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＢａ１ｂ／Ｃマウスの免疫感作後の、ｉｎ　ｖ ｉｔｒｏにおける腰高リンパ節（ｐｏｐｌｉｔｅａｌ　ｌｙｍｐｈｎｏｄｅｓ： 　ＰＬＮ）の増殖を示す。Ｂａ１ｂ／ｃマウスを、ペプチド６１６３．６５．６ ７のそれぞれから調製した免疫学的有効量の本発明のペプチドマルチマーポリマ ーを含む水性組成物によって免疫感作した。図に示されている様に、ツベルクリ ン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）を対照として使用した。′Ｈ−チミジン（” ）Ｉ−ＴｄＲ）取込み量分析をこれらの試験に使用した。データは、刺激指数で 示され、刺激指数は、抗原を加えないバックグラウンド値と比較し、ペプチド抗 原が存在する場合に放射能カウント数が増加した倍率として計算される。この試 験の詳細は、この後に検討されている。 図２は、ペプチド６１．６３．６５．６７のそれぞれから調製した免疫学的有効 量の本発明のペプチドマルチマーポリマーを含む水性組成物によって８６Ｃ３Ｆ ｌマウスを免疫感作した後の、ＰＬＮ細胞のＴ細胞増殖（”ＴＩ−ＴｄＲ取り込 み量）を示す。無関係なペプチド、ＰＰＤとｇｐ１６０を対照として使用した。 データは’）Ｉ−ＴｄＲの取り込み量［１分間当たりのデルタ（Δ）カウント数 （ｃｐｍ）　］として表示されている。これは、抗原を加えたウェル内の放射能 値から抗原を加えない対照ウェル内の放射能値を引いて得られる。この試験の詳 細と図３〜５の試験の詳細は、この後に検討されている。 図３は、＾、　５ＷｘＢａｌｂ／Ｆｌマウスを動物宿主として利用した以外は、 図２の場合と同様である。。 図４は、１０３から１１７まで（それぞれａから０まで）のペプチドから調製し たマルチマーを使用して８６Ｃ３Ｆｌマウスを免疫感作した以外は、図２と同様 である。 図５は、＾５ＷｘＢａｌｂ／Ｆｌマウスを動物宿主として利用した以外は、図４ の場合と同様である。 図６は、抗原として種々の濃度のペプチドマルチマーとｇｐ１２０を使用した’ ＴＩ−ＴｄＲ取り込みによるＢ６Ｃ３ＦｌマウスのＰＬＮ細胞増殖を示す。パネ ル＾は、ペプチド１０から調製したペプチドマルチマーポリマー。パネルＢは、 ペプチド１０６から調製したマルチマー。ＰＰＤと無関係なペプチドを対照とし て使用した。図６〜８に関してはこの後火に検討されている。 ｒ２ｊ７は、抗原として種々の濃度のｇｐ１６０とペプチド６１（パネル＾）お よび６３（パネルＢ）から調製したペプチドマルチマーポリマーを使用したＢ６ Ｃ３Ｆｌマウスから得たＰＬＮ細胞の増殖を示す。ＰＰＤと無関係なペプチドを 対照として使用した。 図８は、抗原として種々の濃度のｇｐ１２０とペプチド６５（パネルＡ）および １１１（パネルＢ）から調製したペプチドマルチマーポリマーを使用した８６Ｃ ３Ｆｌマウスから得たＰＬＮ細胞の増殖。ＰＰＤと無関係なペプチドを対照とし て使用した。 図９は、３種類の形態のＨＩＶ　ｅｎｖ　Ｖ３ループＲ１５にペプチド（ａａ　 ３１５−３２９）を用いて免疫感作後のＢａ１ｂ／ｃ？ウスから得られた腰高リ ンパ節（ＰＬＮ）のＣＴＬ活性。＾は、直線モノマー；Ｂは、Ｎ末端とＣ末端の 両端に添加されたシスティン残基によって形成される′ジースルフィドー結合ポ リマー、Ｃは、Ｎ末端においてシバルミチル−リジン−グリシン−グリシンに結 合することによって形成される末端に脂質が付いたミセル（）Ｉｏｐｐ、　１９ ８４；　５ａｓｔｙ　ｅｔ　ａｌ、。 １９９１）である。Ｂａ１ｂ／ｃマウス（６〜８週令）をペプチド（ＣＦ＾が１ ：１の乳化剤の形態で１００μｇ）を用いて後足の内証に免疫感作した。１０日 後、ＰＬＮから得られた細胞を、３７℃で２時間、モノマー型ペプチド（４０μ ｇ／ｍｌ）で前処理しておいた放射線照射（３３００ラド）された同遺伝子型マ ウス牌臓細胞を用いて５日間ｉｎ　ｖｉｔｒｏで再刺激した。細胞混合物を、１ ０９６ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と５０μＭの２−メルカプトエタノールを補給し た５〜１０ｍ１のクリック培地（Ｃ１ｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９７２）内で維 持してから、ＲＰＭ、Ｉ　１６４０培地、　１０９６　ＦＣＳで３回洗浄した。 ＣＴＬ活性は、３７℃で２時間モノマー型ペプチドで前処理した場合としない場 合の標的細胞（Ｐ８１５）に対する８ＩＣｒ放出分析（ｐｌａｔｓｏｕｃａｓ＆ 　Ｇｏｏｄ、１９８１）によって決定した。 図１０は、Ｒ１５に型ペプチドを用いてｉｎ　ｖｉｖｏで免疫感作したＢ　ａ　 １．　ｂ　／　ｃマウスから得たＣＴＬが、ペプチドモノマー（Ｐ８１５＋ペプ チド）で前処理するか、または、ＦＩＩＶＩ［ＩＢエンベロープタンパク質、ｇ ｐ１６０を発現する組み換えワクワクシニアウィルスを感染させた（Ｐ８１５＋ 　ＶＰＥ１６）Ｍｌ（Ｃ適合標的細胞を認識することを示す。マウスの免疫感作 とＰ８１５標的細胞の前処理は、図９の場合と同様に実施した。５Ｘ　１０６個 のＰ８１５標的細胞は、１００μＣｉの６１　Ｃｒで標識する前に、５Ｘ　１０ ’プラ一ク形成単位の対照（ＶＳｅ２）とＨＩＶＩＩＩＢエンベロープタンパク 質を発現する組み替えワクシニアウィルス（ＶＰＥ１６）により、１８〜２０時 間感染させた（ＩＣＮ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　［ｒｖｉｎｅ、　Ｃ ＾）。細胞障害活性を″Ｃｒ放出分析により決定した（Ｐｌａｔｓｏｕｃａｓ　 ＆　Ｇｏｏｄ。 ＋９８１）。 図１１は、ＨＩｖ■３ループＲ１５にヘブチドノーｖ−７７−型または末端が脂 質のミセル型のいずれかを用いてｉｎ　ｖｉｖｏで免疫感作されたＣＴＬは、Ｃ Ｄ８陽性であることを示す。 再刺激された（図９の場合の様に）ＰＬＮ細胞を、補体のみ（＋Ｃ）、または、 抗ＣＤ４モノクローナル抗体（クローンＧＫ−１，５）とＣ（＋抗ＣＤ４−Ｃ） 、または、抗ＣＤ８モノクローナル抗体（クローン５３−６．７２）とＣ（＋抗 ＣＤ８＋Ｃ）を用いて（Ｐｌａｔｓｏｕｒｃａｓ　＆　Ｇｏｏｄ、１９８１）の 場合の様に処理した。次に、その結果得られた細胞を、モノマー型ペプチド（Ｐ ８１５＋ペプヂド）またはＨＩＶ［ＩＩＢエンベロープタンパク質ｇｐ１６０（ Ｐ８１５＋　ＶＰＥ１６）を発現する組み換えワクシニアウィルスで感染させた ＭＥＩＣ適合標的細胞を溶解する能力に関してテストした。 図１２は、Ｒ１５に／Ｒ］５に＋　Ｔｈを用いて免疫感作したマウスから得られ た牌臓細胞のＣＴＬ活性を示す。６〜８週令のＢａ１ｂ／ｃマウスを、１００μ ｇのＲ１５にペプチド単独またはＣＦ八に乳化した１００μｇのヘルパーＴ細胞 ペプチド（Ｔ１）を用いて後足内針に免疫感作した。免疫感作後２．３．４週目 に、マウスからＰＬＮ細胞と牌臓細胞を採取し、Ｒ１５にで２時間前処理し、放 射線照射した同遺伝子型マウス牌臓細胞を用いて５日間再刺激した。５ａｓｔｒ ｔｙ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９９２）が報告した様に、標準の４時間にわたる８ １Ｃｒ放出分析を実施した。ＰＬＮ細胞（＾）と牌臓細胞（Ｂ）の代表データが 示されており、Ｆ［［Ｖ　ｅｎｖタンパク質のヘルパーＴ細胞が、Ｒ１５に■３ ループペプチド（配列番号１）に対する全身的なＣＴＬ応答を増強することを明 らかにしている。 図１３は、ペプチドＲ１５ＫがＨＩＶ−１によるヒトＴ細胞（ＭＴ−４）の感染 を抑制する様子を示す。ＭＴ−４細胞は、ヒトＴ細胞白血病ウィルス１型によっ て慢性的に感染され、ＨＩＶ−１による溶解性感染を受けているヒトＴ細胞であ る（Ｌａｒｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９）。従って、ＭＴ−４細胞のＨｒｖ −１感染抑制により、細胞の死滅が抑制される。これらの実験において、９６ウ エルのミクロタイタープレートのウェルを各濃度につき３個ずつ使用し、ＭＴ− ４細胞（５×１０４個７１００μｍ）を、種々の濃度のＲ１５にペプチドと共に 、３７℃で１５分間、ブレインキュベートし、）ＩＩＶ−１を作用させた。対照 には細胞だけが含まれ、細胞はＨＩＶ−１による感染は受けたが、ペプチドは添 加されなかった。感染７日後、Ｌａｒｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８９）の ＭＴＴ染色還元分析を用いて、ウェル細胞総数を決定した。　ｒ　ｎｏ　ｖｉｒ ｕｓＪと記された線は、旧Ｖ−１感染がない場合のＭＴ−４細胞の生存率に対す る種々の濃度のペプチドの影響を示している。 ｒ　ｖｉｒｕｓ＋　Ｊと記された線は、ペプチドＲＩ５Ｋ（配列番号１）の防御 効果を示している。 図１４は、逆転写酵素分析により測定して、ペプチドＲＩ５ＫがＭＴ−４細胞の ）ＩＩＶ−１感染を抑制することを示す。 これらの実験において、ＭＴ−４細胞を図１３と同様に感染させたが、細胞障害 作用を測定する代わりに、Ｐｏｐｏｖｉｃ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８４）の方 法により感染７日後に培地内の逆転写酵素（ＲＴ）活性量を測定した。 図１５は、ペプチドＲ１５ＫがヒトＴ細胞のＣＥＭ系およびＲ９系のＨＩＶ−１ 感染を抑制することを示す。別々の実験において、４８ウエルのプレートのウェ ルを各濃度につき３個ずつ使用して、種々の濃度のペプチドＲ１５Ｋが存在する 場合としない場合で、ＣＥＭ細胞とＨ９細胞（細胞ｌＸＩＯ３個／ウェル）をＨ ＩＶ−１で感染させた。実験プロトコルは図１３に説明した通りであった。感染 ７日後に、Ｐｏｐ。 ｖｉｃ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８４）の方法により培地上清の逆転写酵素（Ｒ Ｔ）活性を測定した。 図１６は、Ｖ３ループペプチドが初代ヒｌ−Ｔ細胞の旧Ｖ−１感染を抑制するこ とを示す。健康なＨＩＶ−１セロネガテイブな供血者から得られた末梢血単核細 胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｌｅｏｎ−ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離により分離した。Ｔ 細胞の多いリンパ球集団の調製には、ｌ！ａｎｎｈａｌｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 　（１９８６）によって報告されているＥロゼツテイング（Ｅ−ｒｏｓｅｔｔｉ ｎｇ）を使用した。Ｔ細胞（ＩＸ　１０’個／ｍｌ）を、９６ウエルのミクロタ イタープレートの３個ずつのウェル内で、培地のみ、または１μｇ／ｍｌの濃度 の対照の無関係なペプチド（ｃ−ｍｏｓプロトオンコジーン生成物の配列に対応 する）または種々の■３ループペプチドと共に、インキュベートした。他のペプ チドは次の通りである。Ｈ１３Ｎは、ＩＩＶ−１ｍｎ株の■３ループペプチド（ 配列番号７）；Ｔ１３Ｑは、ＨＩＶ−１ｒｆ株の■３ループのｖ３ループペプチ ド（配列番号６）：Ｒ８には、ＨＩＶ−Ｉ　Ｉ［１８株の■３ループの８個のア ミノ酸ペプｆ　Ｆ　（配列番号５　）　；　Ｎ２４Ｇｉ；！、１（ＴＶ−Ｉ　１ １１μ株）２４個のアミノ酸ヘフチト（配列番号３）；Ｒ１５にハ、ＨＩＶ−Ｉ 　ＩＩＩ　Ｂ　Ｖ３／ｌ；−プの１５個のアミノ酸（配列番号１）である。９日 後、Ｐｏｐｏｖｉｃ　ｅｔ　ａｔ、、　（１９８４）の方法に準じて、培地上清 中の逆転写酵素活性を測定した。 図１７は、ペプチドＲ１５にの血清中の安定性を示す。 Ｒ１５にペプチド（配列番号１）を１００μｇ／ｍｌの濃度のウシ胎児血清と共 に３７℃でインキュベートした。異なる時間に、最終濃度１μｇ／ｍｌに相当す るペプチド／血清混合物の部分標本を、９６ウエルのマイクロタイタープレート 中のＭＴ−４細胞に加えた。ペプチドと共にインキュベート後、ＫＴ−４細胞を 図１３で述べた様にＩ（ＩＶ−１で感染させた。感染７日後に、生存可能な細胞 総数を、ＮＴＴ染色還元分析（Ｌａｒｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９）によ って測定した。対照ニは、培地のみでインキュベートし、ウィルス感染させた細 胞とウィルス感染させない細胞、および胎児ウシ血清中でブレインキュベートし ていないＲ１５にペプチドとインキュベートした細胞が含まれた。 図１８は、ｇｐ１２０のアミノ末端ドメインからのペプチドＥＩ３Ｖ（配列番号 ４）が、初代ヒｌ−Ｔ細胞のＨＩＶ−１感染を抑制することを示す。実験の詳細 は、この実験においては異なる濃度のＥＩ３ＶをＲ１５にの代わりに使用した以 外は、図１６と同じである。 ましい　の４−な」

【朋 エイズは、ＨＩＶとして一般に知られている密接な関係にある一群のレトロウィ ルスによって引き起こされる非常に感染力の強い、致命的な病気である。現在＋ （ＩＶ感染を予防するワクチンはなく、一旦感染が始まってしまうと、進行を止 める有効な治療薬はない。本発明は、抗ウイルスワクチン接種および抗ウイルス 治療用処方の開発にペプチド技術を利用することによって、現在抱えている予防 と治療の両方の問題を処理するものである。 まず、本発明者等は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて特異的ＣＴＬ応答を誘発する能力 を持つペプチドを同定する迅速な方法を開発した。この方法は、スクリーニング とワクチン接種の両方に広く応用でき、エイズだけでなく、広範囲にわたる他の 病気に対する予防用ワクチンの開発にも関係している。次に、これらのＣＴＬ誘 発誘発方法へルパーＴ細胞誘発ペプチドを追加することによって改良され、ペプ チドによる免疫感作に対し、全身にわたる持続性の高レベルのＣＴＬ活性を引き 起こすための特に有効な組成物と方法が得られた。 ワクチン処方に加え、発明者等はヒトの標的細胞の中にＨＩＶが侵入するのを効 果的に抑制する作用を持つペプチド配列も同定した。ウィルス感染を阻止するこ れらのペプチドは、ＨＩＶ−１感染患者においてウィルスの拡散と病気の進行を 止める有効な抗ＦＩＩＶ治療薬の基礎を形成するものと思われる。 臨床的実施例において、例えばタンパク質の代わりにペプチドを使用することは 、様々な理由から一般に望ましい。これらの理由には、低コスト、大規模調製が 比較的簡単であること、製品の信頼性等が挙げられる。例えばペプチドの組織の 通過が容易であること、免疫原性が低いこと等、その生物学的特性も望ましい。 臨床利用の前に、例えばアシル化またはアミド化等により、Ｎ末端またはＣ末端 に基を付加して、ペプチドを安定させることができる。本発明のペプチドを様々 なポリマーに調製することについては、下記に詳細に論じられている。 本発明の１つの側面として、例えばＣＴＬワクチンに使用するための適切なＣＴ Ｌ誘発作用を持つ化合物を同定するために、ペプチドまたはそのマルチマー等の 候補化合物をスクリーニングする新しい迅速法がある。望ましいスクリーニング 法において、候補ペプチドまたはペプチドマルチマーは、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけ るＣＴＬ誘発に関して分析される。これは、被験物質を実験動物に注射し、リン パ節からＴ細胞を回収し、その様なＣＴＬの活性（免疫感作）を測定することに よって行われる。最も望ましい免疫感作は、完全フロインドアジュバントに入れ た被験ペプチドを、マウスの後足間ぬト等の適切な部位に単回皮肉投与し、リン パ節Ｔ細胞、望ましくは排出腰高リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ　ｐｏｐｌｉｔｅ ａｌ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅｓ：ＰＬＮ）から得たＴ細胞を回収し、候補ペプチ ドを付けた、あるいは親タンパク質を発現している旧ＩＣ適合標的細胞のＴ細胞 によって仲介される溶解を分析することによってＣＴＬ活性を測定する。この手 順によって、免疫感作後僅か８〜１０日後に結果を得ることができる。 この様なスクリーニング法を使用することによって、実質的にＣＴＬ応答だけを 誘発するペプチドであろうと、抗体反応も誘発するペプチド（すなわち、Ｂ細胞 に反応する）であろうと、■細胞を活性化するペプチドを同定することができる 。組織適合性遺伝子が異なる多くのマウスの系をこれらのスクリーニングに使用 することができる。霊長類、そして最終的にはヒトにおいて更に研究を行うため には、多様なＭＨＣ遺伝子型において広範な応答を引き起こすペプチドを選択し なくてはならない。模範的な分析手順がこの後に示されている。 ペプチドの合成は、自動ペプチド合成器を用いて行うことができる。例えば、改 変型Ｖａｇａ２５０自動ペプチド合成器でＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相法（Ｍｅｒ ｒｉｆｉｅｌｄ、　１９６３）を用いて、あるいはＩ’ｌｏｕｇｈｔｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　（１９８５）によって報告されている様に“Ｂａｇ”法によって合 成することができる。 合成反応に続いて、完成されたペプチドが回収される。 上記の２つの方法において、これは、Ｔ−ＢＯＣ遮断基を除去し、０℃で１時間 フッ化水素酸（ＩＦ）処理して、樹脂からペプチドを加水分解することが含まれ る。次に、例えば、エーテル抽出により様々な有機副産物を除去することができ 、２５％酢酸等の試薬により支持樹脂からペプチドが抽出される。 適切なＣＴＬ誘発候補化合物を同定するだめの迅速スクリーニング法において、 発明者等は、マウスの皮肉投与による免疫感作が最も有利に行われることを見い だした。皮肉投与による免疫感作は、免疫系の細胞性の部分を効率的に活性化す る場合に特に有効であると考えられている。発明者等は、この免疫感作プロトコ ルの更に有利な点として、（１）検出可能なＣＴＬ活性化を達成するのに、候補 物質の単回投与で通常十分であること、（２）分析法の感度が、ＣＴＬを感作す るために免疫感作修飾因子を一般に使用する必要がない程度であることを見いだ した。 従って、望ましいスクリーニングの実施例において、適切な組成物を後足肉汁の 中に陵内注射することによってマウスは免疫感作される。例えば、完全フロイン ドアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ：　 Ｃｒ人）と被験ペプチドの比が１・１の乳化剤の悪様で１００μｇの被験ペプチ ドを皮肉投与する。　ＣＴＬ応答を誘発するのに十分な一定期間の後、例えば１ ０日後、排出腰高リンパ節（ＰＬＮ）を外科的に切除し、細胞を穏やかにホモゲ ナイズして分離する。この様にしてＰＬＮ細胞が得られ、典型的には細胞ＩＯ〜 ５０Ｘ　１０’個／リンパ節／マウスを、クリック培地、１０９６ＦＣ３，５０ μＭの２−メルカプトエタノールといった溶液５〜１０ｍ１中で維持し、候補ペ プチドで前処理した放射線照射（３３００ラド）した同遺伝子型マウス牌臓細胞 を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏで５日間再刺激する。ＨＩＶ　ｇｌ）１６０タンパク 質の様な、ペプチドが由来する親タンパク質を発現する同遺伝子型細胞は適切な 標的細胞となるであろう。しかし、発明者等は、例えば、約４０μｇ／ｍｌの濃 度のペプチドモノマーにより細胞を３７℃で２時間前処理することによって簡単 に生成できるペプチドを付けた牌臓細胞が、本発明に準じて使用するのに望まし いかも知れない、と考えている。 次に、再刺激されたエフェクター細胞を、例えばＲＰｌｌＪ　１６４０培地、】 ０％　Ｆｅ２を用いて洗浄し、５Ｘ　１０’個／ｍｌの範囲の適切な細胞密度で 再懸濁し、ＣＴＬ活性を分析する。ＣＴＬ活性を分析するのに適した方法は、特 異的標的細胞からの代謝されない放射能標識物質の放出量を測定する方法である 。標的細胞には予めその放射能標識物質を付着させておく。ＰＩａｔｓｏｕｒｃ ａｓ　＆　Ｇｏｏｄ　（１９８１）によって報告されたペプチド処理された同遺 伝子型細胞からのｌｌＣｒ放出量を測定する方法を、発明者等は特に適切な方法 と考えている。 ＣＴＬ分析に使用するために、ペプチドを発現する標的細胞を作製するには、ま ず、Ｐ８１５細胞の様な適切な同遺伝子型細胞を、クロムの様な放射性化合物で 標識する。これは、細胞を２５０μＣｉの”Ｃｒと共に３７℃で２時間インキュ ベートすることによって達成することができる。それから細胞を３回洗浄し、約 ４０μｇ／ｍｌの濃度のモノマー型の被験ペプチドと共に３７℃で更に２時間イ ンキュベートする。それから細胞をＲＰＭＥ培地、１０％ＦＣＳ等の溶液で洗浄 し、適切な濃度、例えば細胞５Ｘ１０’個／ｍｌの近辺で再懸濁する。この様に 産生された標的細胞をＣＴＬ分析に使用する。これは、例えば、標的細胞を候補 エフェクター細胞と共にＵ字形底の９６ウエルミクロタイタープレート内で、エ フェクター細胞対標的細胞（ＥＡＴ）の比を変えて混合して行う。 あるいは、上述の様に、被験ペプチドが得られた親タンパク質を発現する標的細 胞を作製し、ＣＴＬ分析に使用することができる。この方法においては、同遺伝 子型細胞を、発現されることになっている親タンパク質の遺伝子を含む適切な量 の、例えば５Ｘ　１０’プラ一ク形成単位の組み換えワクシニアウィルスに１８ 〜２０時間感染させる。対照として、同遺伝子型細胞を免疫学的に無関係な遺伝 子を持つワクシニアウィルスに感染させることができる。この段階で、特異抗体 を用いてこの２種類の感染細胞をウェスタンプロット分析することにより、標的 細胞には必要なタンパク質が存在するが、対照細胞には存在しないことを確認し たいと思うであろう。次に、上述の様に、この方法で作製された標的細胞を放射 性化合物、この場合は１００μＣｉの６１Ｃｒで標識し、クロム放出ＣＴＬ分析 （Ｐｌａｔｓｏｕｒｃａｓ　＆　Ｇｏｏｄ、１９８１）に使用することができる 。 スクリーニングされる候補ペプチドが旧■タンパク質ｇｐ１６０から得られる様 な特定の実施例において、組み換えワクシニアウィルス系を使用して、このタン パク質を特異的に発現する細胞を調製することができる。この様に使用する場合 には、エイズ研究および基準試薬プログラム（エイズ部門、国立アレルギー感染 症研究所、アメリカ合衆国公衆衛生研究所　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆＡＩＤＳ。 ＮＩＡＩＤ、Ｎ１）Ｉ）を経由してＢｅｒｎａｒｄ　Ｍｏ５ｓ博士から入手した 対４．（ＶＳｅ２）およびＨＩＶ　ｅｎｖ発現（ＶＰＥ１６）組み換えワクシニ アウィルスが特に有用であることを、発明者等は見いだした。この様なＶＰＥ１ ６に感染したＰ８１５標的細胞におけるｇｐ１６０タンパク質の存在を確認する ために、発明者等は、ウェスタンプロット分析実験において、ＨＩＶ抗体陽性ヒ ト血清の使用が便利であることを見いだした。 ＣＴＬ分析に〜ＰＥ１６に感染したＰ８１５標的細胞を使用する場合、発明者等 は、標的細胞５Ｘ　１０’個／ｍｌと候補ＣＴＬエフェクター細胞ｌＸｌ０’個 ／ｍｌを、最初のＥ：Ｔ比が２０＋１ニなる様に混合して使用するのが便利であ ることを明らかにした。 上述の標的細胞のいずれを使用してＣＴＬ分析を実施する場合でも、特異的５Ｉ Ｃｒ放出のパーセントは次の様に計葬できる。 最大放出量は、細胞膜を破壊するために、非イオン界面活性剤トリトンＸ−１０ ０の５９６溶液を用いて、完全溶解を実験的に誘発された標的細胞から上清中に 放出される放射能を測定することによって決定される。自然放出量は、エフェク ター細胞を加えずにインキュベートされた標的細胞から上清中に放出される放射 能を測定することによって決定される。有効な実験においては、標的細胞の自然 溶解値が、観察される最大溶解値の１５〜２０９６を示すものと思われる。 ＣＴＬ活性を発揮する可能性に関してのＰＬＮ細胞の分析に先立ち、まずＣＤ４ ’またはＣＤ８’といった特定の細胞集団を細胞混合物から除去したいと思うで あろう。この観点から、Ｐｌａｔｓｏｕｃａｓ　＆　Ｇｏｏｄ　（１９８１）に よって報告された様に、再刺激されたＰＬＮ細胞細胞を、抗ＣＤ４モノクローナ ル抗体（クローンＧＫ−１，５）と補体（Ｃ）（＋抗ＣＤ４＋Ｃ）、または、抗 ＣＤ８モノクローナル抗体（クローン５３−６．７２）とＣ（十抗ＣＤ８＋　Ｃ ）により処理することができる。比較のために、特定のＰＬＮ細胞を補体のみ（ 十〇）で処理することも望ましいであろう。次に、これらの方法のいずれかで処 理された細胞は、モノマー型ペプチド、あるいは被験ペプチドを入手した親タン パク質を発現する組み換えワクシニアウィルスによって前処理されたＭＨＣ適合 標的細胞を溶解する能力に関してテストすることができる。 抗体産生能を示さないＣＴＬに反応する化合物を同定したい場合には、Ｔ細胞活 性を同定されたペプチドをスクリーニングして、Ｂ細胞刺激活性を持たないもの を同定することができる。この様なペプチドは、ウィルス疾患の治療または予防 用ワクチンの調製に特に有用であることが提案されている。エイズの様なウィル ス疾患では、抗体反応が実際に原因ウィルスの感染力を増強することがある。こ の様なペプチドの同定は、候補ペプチドを免疫能を有する動物（例えばマウス） に注射し、ペプチドと配列が一部一致している天然のタンパク質に対する顕著な 抗体反応を産生じないペプチドを同定することによって達成される。例えば、Ｈ Ｉｖの場合、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、またはコアタンパク質に対する反応性を有 する抗体産生に関して、テストしたいと思うであろう。 勿論、上述の様に、本発明は、Ｔ細胞応答とＢ細胞応答の両方を惹起できる化合 物の同定にも関わるものである。この後者のグループが、免疫感作された宿主に おける抗体に基づく防御免疫を誘発する作用を発揮するためである。 本発明のＣＴＬ活性を示す組成物は、次の方法でＴ細胞を感作する。感染ウィル スが後日出現すると、メモリＴ細胞が活性化され、細胞性免疫応答が引き起こさ れ、その結果対応する標的タンパク質またはその一部をその表面に持っている標 的細胞が破壊され、それによってウィルスが破壊される。 発明者等は、ペプチド免疫原に対するペプチドによって誘発されるＣＴＬ応答を 引き起こすだめの上述の方法を更に至適化した。具体的な目標は、牌臓等の注射 部位からより遠隔のリンパ組織による特異的ＣＴＬ産生を増加させ、応答の寿命 を改善することである。ヘルパーＴ細胞エピトープ配列を含むペプチドを、ＣＴ Ｌ誘発ペプチドと物理的に混合すると、内針において複数回皮下（ｓｃ）注射後 でも、単回皮肉（ｉｄ）注射後でも、マウスにおけるＣＴＬ応答が増強された。 更に、牌臓における高レベルのＣＴＬ応答が、１回の】ｄ注射後８週間まで維持 された。 適切なヘルパーＴ細胞の１例はＣ１９Ａで、配列ＣＲＩＫＱＩｒＮＭＷＱＧＶＧ ＫＡＭＹＡ（配列番号２）を持っており、これはモノマー、末端が脂質、ジ−ス ルフィドポリマー型で有効であることが見いだされた。 ペプチドによって誘発されるＣＴＬ応答が、ｉｎ　ｖｉｙ□でヘルパーＴ細胞を 誘発するペプチドによって増強される機序は不明である。しかし、増強作用を示 すペプチドは、ヘルパーＴ細胞を誘発する能力があるため、特異的ＣＴＬのクロ ーン増加と拡散を助けるサイトカインの必要量を増大させるものと思われる。基 礎となる機序とは関わりなく、免疫感作またはワクチン処方にヘルパーＴ細胞を 誘発するペプチドとＣＴＬを誘発するペプチドの混合物を使用することによって 、ＣＴＬ誘発ペプチドだけを用いる免疫感作と比べ、比較的長い半減期の全身性 ＣＴＬ応答を引き起こす能力を大きく改善するものと予想される。 ）＋１Ｖに関して、特に有用なＣＴＬ応答を引き起こすペプチドは、ウィルス遺 伝子、ｇａｇ、　ｐｏＬ　ｎｅｆ、　ｅｎＶ遺伝子由来の発明者等を持つペプチ ドで（表１）、特にｅｎｖ遺伝子が望ましい。更に望ましいのは、ＨＩＶ　ｇｐ １２０のｖ３ループ由来の配列を持つペプチドである。これらのペプチドは表２ に一覧表として記載されており、ＣＴＬ誘発ペプチドとして使用することができ る。本発明のに使用されるヘルパーＴ細胞誘発エピトープは、一般に両親媒性値 が約プラスＩＯから約プラス２０であると考えられる。 ワクチンまたはその構成成分として適していると考えられるペプチドとペプチド の組み合わせを、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、アカゲザル、チ ンパンジー、その他の実験動物モデルにおいて、テストすることができる。この 様なテストは、様々な感染物質に対して防御作用を示す細胞性免疫を誘発するワ クチンの作製につながる。 本発明の別の点は、ＨＩＶに対して使用する治療薬としての合成ペプチドの同定 と処方に関するものである。 これらの化学的に規定される合成ペプチドは、ヒト細胞をＨＩＶ−１感染から防 御する。 ｇｐ１２０のｖ３ループ領域は、細胞の旧ｖ−１感染に不可欠であることが知ら れている（Ｔｒａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１；　Ｆｒｅｅｄ　ａｎｄ　 Ｒｉａｓｅｒ、１９８７；　Ｆｒｅｅｄ　ｅｔ　ａｔ、、１９９１）。抗ｖ３ル ープ抗体は、細胞のレセプター、ＣＤ４に結合するｇｐ１２０を妨害せずに、■ ＩＶ−１の細胞感染を抑制することが明らかにされている（Ｌｉｎｓｌｅｙ　ｅ ｔ　ａｔ、、　１９８８；　Ｊａｖａｈｅｒｉａｎｅｔ　ａｌ、、１９８９）。 ｖ３ループ領域は、宿主細胞表面に存在するトリプシンに関連するプロテアーゼ の標的であることも知られている（Ｍｕｒａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９ １）。ｇｌ）１２０がＣＤ４に結合した後、■３ループが細胞表面のプロテアー ゼによって切断され、ｇｐ１２０／ｇｐ４１タンパク質複合体の立体配座の変化 を引き起こすものと推定される（ＭｃＣｕｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）。 この様な変化によって、貫膜タンパク質ｇｐ４１の融合誘導ドメインが露出され 、ウィルス粒子膜と細胞膜の融合が起こる可能性がある。従って、発明者等はｖ ３ループペプチドが、ｇｐ１２０　Ｖ３ループの切断を抑制することによって細 胞の感染を抑制している可能性があると推論した。 この分野における最近の研究から、対立する結果が得られている。Ｋｏｉｔｏ　 ｅｔ　ａｌ、、　（１９８９）は、ｇｐ１２０のｖ３ループのＨＩＶ−１を中和 する主要エピトープに対応する合成ペプチドが、用量依存性にＨＩＶ−１に感染 したＣＣＲＦ−ＣＥ輩細胞と感染していないＭｏ１ｔ−４細胞の間のシンシチウ ム形成を抑制することを報告した。これらの研究において、■３ループ全体を表 す３６個のアミノ酸ペプチド（残基３０３−３３８）、ＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳ 　ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴ　ＩＧ）：　ＩＧＮＭＲＱＡＨＣｌｉ、］０００ １Ｍ約３００μｇ／ｎ＋１）の濃度において３０〜６０％シンシチウム形成を抑 制することが認められた。しかし、■３ループの中央部分を表す２４個のアミノ 酸ペプチド（残基３０８−３３１、ＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲｃＰＧＲＡＦＶＴＩ ＧＫＩＧ）　ハ、）：、　Ｆ）　効率ｂ＜　低（、同程度のシンシチウム形成抑 制作用を達成するのに、３００μ祉の濃度が必要であった（約７２０μｇ／ｍｌ ）。 これらのペプチドのいずれに関しても、細胞の）ＩＩＶ感染抑制能に関してはテ ストされなかった。 これに反して、Ｄｅ　Ｒｏｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）は、最近、異なる ＨＩＶ−１分離株の■３ループ領域の２４個のアミノ酸の長さを持つ合成ペプチ ドが、ＣＤ４に依存する機序によって、ＩＴＩＶ−１の細胞感染を実際に１１工 （ことを報告した。これらの実験において、０．６２〜２０μＭ（約１．５から ４８μｇ／ｍｌ）の濃度の合成ペプチドが使用され、１つのヒトＴ細胞系（Ｍｏ ｌｔ−３）がテストされた。 上記の所見にもかかわらず、本発明者等は、ｖ３ループ合成ペプチドの旧■感染 抑制能のテストを進めた。 ｇｌ）１２０の■３ループから選択した様々な長さく８〜２４個のアミノ酸）の 合成ペプチドは、Ｔ細胞の）ＩＩＶ感染抑制に驚くべき効果を発揮することが明 らかにされた。これには、Ｒ９、ＣＥｌｌ、　ＭＴ−４等の培養ヒトＴ細胞と、 新しイ調製された初代ヒトＴ細胞が使用された。これらのペプチド結合、配列Ｒ ＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ（配列番号１）を持ッＲ１５にト、配列ＮＮＴＲ ＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧ（配列番号３）を持っＮ２４Ｇが含 まれる。表１１Ａに配列が示されているＣ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ３ ０，Ｃ３５、Ｃ３８、Ｃ３９，０４０と呼ばれるペプチドも、ＨＩＶによる細胞 感染を抑制することが見いだされた。 本発明の重要な発見は、種々の異なるＨＩＶ分離株に由来する配列を有するペプ チドが、旧Ｖ−１ｎＩＢによる細胞感染を抑制する能力を持つという所見である 。これらには、表２に詳細に示されているペプチドの他に、ＨＩＶ−１ｍｎ由来 のＨ１３Ｎ　（）ＩＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ、配列番号７）と）ＩＴＶ−１ｒ ｆ由来のＴ１３Ｑ　（ＴＫＧＰＧＲＶＩＹＡＴＧＱ、配列番号６）が含まれる。 重要なことであるが、他のウィルス株のｖ３ループ配列に対応する配列を持つペ プチドも、同種あるいは他の関連する旧■株による感染抑制に有用であると考え られる。Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３１，Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３４、Ｃ３７（ 表１１Ｂ）等のペプチドも、それ自体、感染抑制ペプチドとして有用であること が見いだされる可能性があると思われる。 発明者等は、先にｇｐ１２０アミノ末端（残基３９〜５１）由来＋７）　ヘア’ 　ｆ　）’　ＥＱＬＷＶＴＶＹＹＧＶＰＶ　（Ｅ１３Ｖ、配列番号４）が、マウ スにおいて抗ＨｒＶヘルパーＴ細胞応答を誘発できることを示した（Ｓａｓｔｒ ｙ　＆＾ｒｌｉｇｈａｕｓ、　１９９１）。このペプチドに対する抗体は、変性 ｇｐ１２０に結合できるが、天然のｇｐ１２０には結合できないことが見いださ れた。ベプチＦＥ１３Ｖ（配列番号４）が、ＨＩＶが細胞内に侵入するのを妨害 し、感染を抑制する能力を分析する際、発明者等は、このペプチドも有効な感染 抑制ペプチドであることを見いだした。 Ｒ１５Ｋ（配列番号１）およびＥ１３Ｖ（配列番号４）の様な本発明の感染抑制 ペプチドは、ＨＩＶ−１によるヒト細胞の感染抑制のための有効な治療処方とし て理想的な候補物質であると予想される。ヒトの治療に関係する所見は、例えば 旧５には、ウシ胎児血清中でインキュベーション後４時間まで、抑制作用の強度 を完全に保持したことである。この様な処方は完全に合成され、定義されるので 、これらの薬剤は経済性と安全性を兼ね備えている。 また、ｖ３ループペプチドを混合物として使用することにより、ウィルスに感染 した細胞を全て効果的死滅させることができるＨ　［Ｖ　−１に特異的なＣＴＬ 応答を誘発しながら、細胞が新たに感染するのを抑制することができるので、免 疫治療薬としての利点が更に加わる。 従って、本発明は最終的に、合成ペプチドを含むワクチンと治療処方の両者を調 製することである。ワクチンには、ＣＴＬ誘発エピトープを持つペプチドと、理 想的にはヘルパーＴ細胞誘発エピトープを持つペプチドも含まれることになるも のと予想される。勿論、治療処方にもその様な配列が含まれるものと思われる。 しかし、その様な治療組成物の構成成分として使用するには、［ＩＩＶ感染を抑 制する配列を組み入れたペプチドが特に望ましい。 本発明のワクチン接種用ペプチドに関して、ここに示す方法に準するＣＴＬ誘発 ワクチンの調製にはペプチドマルチマーが特に有利と思われる。望ましいマルチ マーは、界面活性剤様ミセルとポリマーによって形成される。アミノ末端リシル 残基の他に、スペーサーペプチドは、およそ１個から５個の残基を更に含んでい る。 マルチマーを含む水性組成物のＴ細胞免疫感作能と、水性組成物においてジアミ ド反応生成物が界面活性剤様ミセルを形成する能力を障害しない限り、殆どどの アミノ酸残基でも利用できる。スペーサーペプチド当たり１個から約３個のグリ シル残基が望ましい。 前述のペプチドとアミノ末端リシル残基を含むペプチドスペーサーは、互いにペ プチド結合しており、従って混成ポリペプチドと見なすことができる。従って、 有用なジアミドは、アミノ末端リシル残基のアルファアミノ基およびニブシロン アミノ基と、複合ポリペプチド当たり２モルのＣｌ２−Ｃ１＠脂肪酸の反応生成 物である。 従って、混成ポリペプチドは、１つの配列として調製することができ、固相合成 を用いる場合には、従来の技術によって、樹脂から除去する前、または後にアミ ド化することができる。 「界面活性剤様ミセル」という言葉は、ここでは、水性組成物において、ジアミ ドリシル複合ポリペプチドが、界面活性剤によって形成されるミセルと同様のミ セルを形成する様に見えることを強調し、その様なマルチマーを、やはりミセル としばしば呼ばれるポリマー分子から構成される原形質の超顕微鏡的構造単位と 区別するために使用される。　「ミセル」という言葉もここでしばしば使用され るが、この様に使用される場合には、界面活性剤様ミセルと同じ意味である。 前述のペプチドマルチマーの別の形態は、複数のペプチドを反復する単位を持つ ポリマーである。この場合、その天然の配列の一部として２つの末端システィン を含むペプチドを選択し、合成することができる。 この様なシスティンを持たないペプチドは、１個または２個の余分なシスティン をＮ末端またはＣ末端にそれぞれ付加することによって修飾することができる。 ペプチド当たり２個のシスティンが存在する場合には、空気酸化によりサブユニ ットペプチドをポリマーし、酸化システィン（ンスチン）結合ポリマーおよび／ または環状ペプチドを形成することができる。この様なマルチマーは、キャリア ーを必要とせずに、ペプチドの免疫認識を増強する。 末端がリジンのスペーサーペプチドは、リシル残基の他に１個から約５個のアミ ノ酸残基を含むことがあり、１個または２個の付加された末端システィン残基は 、本発明のペプチドの長さを計測する場合には含まれない。 末端にシスティン残基を含むペプチドは、ジ−システィン−末端ペプチドまたは より簡単に、ジーＣｙｓペプチドと呼ばレル。ジーＣｙｓペプチドの反復単位を 含むポリマーの調製に関する詳細は、この後に記載されている。 本発明の水性組成物（接種）は、免疫学的有効量のＣＴＬ誘発、ヘルパーＴ細胞 誘発、または旧■感染抑制ペプチドから構成される。これらは、マルチマー型の 場合もそうでない場合もあり、また薬理学的に許容できる水性媒質に溶解または 拡散している。この様な組成物も、接種と呼ばれる。 「薬理学的に許容できる」という言葉は、人間に投与した時に、アレルギー反応 または同様の望ましくない反応を引き起こさない分子本体と組成物を指す。 ペプチドまたはマルチマーの様な免疫感作分子、または活性成分としてペプチド の様な感染抑制作用を持つ構成成分を含む水性組成物の調製法は、本技術におい て十分理解されている。典型的には、この様な組成物は、液体溶液または懸濁液 の形態で注射液として、溶液または懸濁液に使用するのに適した固体として調製 され、注射前の液体としても調製可能である。製剤は乳化することもできる。 ペプチドまたはペプチドマルチマーは、組成物中に中性または塩の形態で処方さ れる。薬理学的に許容できる塩には酸を付加した塩（ペプチドの遊離アミノ基と 共に形成される）が含まれ、例えば、塩酸または燐酸等の無機酸、または酢酸、 シュウ酸、酒医師酸、マンデル酸等の有機酸により形成される６　遊離カルボキ シル基と共に形成される塩も、例えばナト）」ラム、力１Ｊウム、アンモニウム 、カルシウム、水酸化機等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチル アミン、ヒスチジン、プロ力イン、その他の有機塩基から得ることができる。 処方の際、ワクチンは、投与処方に合った方法で、免疫学的に有効な蚤が投与さ れる。ここに使用されている様に、　「免疫学的有効量」とは、特異的標的とさ れた細胞障害性Ｔ細胞によって誘発される様に、宿主（＠乳動物）において有効 なＣＴＬ応答を誘発するのに十分な量のペプチドまたはペプチドマルチマーを含 む組成物量が使用されていることを意味する。望ましし）実施例においては、免 疫学的に有効なワクチン組成物は、ヘルパーＴ細胞活性を誘発するのに有効な量 のペプチドまたはペプチドマルチマーも含み、その結果ＣＴＬ作川も用強するも のと考えられる。この後に述べられてしする様に、この様な細胞障害性Ｔ細胞の 存在が分析されている。 ワクチンの場合には、投与されるペプチド量と組成物量は、免疫感作される宿主 細胞、Ｔ細胞を活性化する宿主動物の免疫系の能力、目的とする防御作用の程度 に依存している。投与しなくてはならない活性ペプチドマルチマーの正確な量は 医師の判断に委ねられており、各個人毎に異なる。しかし、活性成分ペプチドの 適切な１人当たりの投与量範囲は、約ｌθマイクログラム（μｇ）から約５００ ミリグラム（ｍｇ）のオーダーで、望ましくは約５０μｇから約１　ｍ　ｇｓ更 に望ましくは約１００μｇである。ペプチドマルチマーの免疫感作量を分散する のに必要な最小量の組成物が一般に利用される。初回投与とブースター投与の適 切な投与方法も多様であるが、初回投与後、１〜２週間以内に続けて注射するか 、あるいは別の投与を行うのが典型的である。 組成物には、賦形剤の一部としてアジュバントを含めることもできる。実験宿主 哺乳動物に使用する完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロインド アジュバント（ｒＦＡ）等のアジュバントは、本技術において公知で、ここに例 として示されている。アラムの様な薬理学的に許容できるアジュバントも使用で きる。 以下の例は、本発明の望ましい実施例を示すために含まれている。本技術に精通 する者は、発明者等によって発見された代表的な技術がその後に続く例において 明らかにされている本技術が、本発明の実施にあたり十分機能し、従ってそれを 実施するための望ましい方法を構成するものと見なされることを理解するであろ う。しかし、本技術に精通する者は、本発見に照らして、明らかにされている具 体的な実施例において多くの変更が可能であり、本発明の意図と範囲から逸脱す ることなく、なお同様の結果を得ることができることを理解するであろう。 例１−ペプチド、ペプチドポリマー、ペプチドミセルの調製法 Ｖｅｇａ　２５０自動ペプチド合成器改変型を使用するＭｅｒｒｉ、ｆｉｅｌｄ （１９６３）の固相技術を用いて、あるいはＩｌｏｕｇｈｔｅｎ（１９８５）に よって報告されている“ｂａｇ”法により、コアおよびｇｐ１６０　（ｇｐ１２ ０とｇｌ）’１１）分子の選択された保存ドメインに対応する、約７個から３０ 個のアミノ酸残基の長さの合成ペプチドを調製した。どちらの場合も、ｔ−プチ ルオキシカルポニル（ｔ−ＢＯＣ）アミノ酸遮断基の除去と、０℃、１時間のフ ッ化水素酸（）ＩＦ）処理により樹脂からのペプチドの加水分解を行った。次に 、ペプチドを含む混合物をジエチルエーテルで抽出しペプチド以外の有機化合物 を除去し、２５９６酢酸（ｗ／Ｖ）を用いて、合成されたペプチドを樹脂から抽 出した。 様々な合成ペプチドがこの手順で調製されており、これには、表３に一晃表とし て示されている様に、８９１２０分子とｇｌ）’＄　１分子の保存ドメインに対 応する１９種類が含まれている。合成されたペプチドは、表示されている様に、 ＩＩＩＶのｇｐ１６０の指定された保存ドメイン（領域）に対応している。 表３ 合成ペプチドのアミノ酸配列 ＋０３　’　”ＥＱＬｆＶＴｌ’ＹＹＧｔ’Ｐｌ”　’　Ｇｒ’＋６Ｏ−ＣＲ− １１０４４ｈ　ＶＹＹＧＶＰｖＴにＥ＾”　ＧＩ’＋６Ｏ−ＣＲ−１＋０５　１ 　、ＧＶＩ’ＶＩＫＥＡＴＴＬＦＣ＠　ｌ　Ｏｒ’　＋６Ｏ−ＣＲ−１＋０６　 ”ＡＩＩＫＶｆＡＴＩＩＡＣＶ”　ＣＰ＋６Ｏ−ＣＲ−１＋０７　”　Ｃ１’Ｐ ＴＮＰＶＰＱＥＶＶ’　”　Ｇｒ’＋６Ｏ−ＣＲ−１＋０８　’　”ＶＬＥＮＶ ＴＥＮＦＮＭ　’　”　’　ＣＰ＋６Ｏ−ＣＲ−１１０９目’ＮＮ１ＮＮ１１Ｖ ＥＱ、Ｄ！’　”　ＣＰ＋６Ｏ−ＣＲ−１＋１０　１６’ＥＱＭＨＣＤＩＩＳＬ ｆＤＱ”’　ＧＩ’＋６Ｏ−ＣＲ−１１ＩＩ　ｌｌ’ＬｆＤＱＳＬＫＰＣＶＫＬ Ｔ”＠ＣＰ＋６Ｏ−ＣＲ−１１１２目’５ＬＫＰＣＶＩＬＴＰＬＣ”’　にＩ” ＋６Ｏ−ＣＲ−１＋１３　”’５ｖｌＴＱＡＣ３ＫＶＳＦＥ”＠ＣＰ＋６Ｏ−Ｃ Ｒ−２１１４’口ＦＥＰＩＰＩｌｌＹＣＡＦｒ’ＧＦ”　’　Ｏｒ’　＋６Ｏ− ＣＲ−２＋１５　”’ＫＫＦＮＧＴＧＰＣＴＮ”６　ＣＩ’＋６Ｏ−ＣＲ−２１ １６”’ＧＴＧＰＣＴＮＶＳＴＶＱＣ”’　ＧＩ’＋６Ｏ−ＣＲ−２＋１７　” ＠ＶＱＣＴＩＩＧＩＲＰｖＶＳＴＱ”’　ＣＰ＋６Ｏ−ＣＲ−２６１”’ＹＬＲ ＤＱＱＬＬＧＩＶＧＣ””　ＣＰ＋６Ｏ−ＣＲ−５６３″”　ＦＬＧＦＬＧＡＡ ＧＳＴＩＩＧ＾＾５Ｌ−ＴＬＴＶＱＡＮＱ”　’　ＣＰ＋６Ｏ−ＣＲ−５６５′ 目ＣＲＩＫＯＩＩＮＩＩＩＱＧＶＧＫＡＩＩＹＡ”’　ＣＩ’＋６Ｏ−ＣＲ−３ ６７″”ＣＲＩＫＯ１ｌＮＭＶＱＧｌ’ＧＫ＾トＹＡＰＰＩＧＧＯＩＲＣ”’　 ＣＰ＋６Ｏ−ＣＲ−３１、Ｍｏｄｒｏｖ　ｅｔ　ａｌ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６１ ：５７０　（１９８７）に従って、各ペプチドのＮ末端およびＣ末端のアミノ酸 残基は、ｇｐ＋６ｏのアミノ酸残基配列におけるそれらの位置の番号が付けられ ている。ダッシュ（−）は、配列が次の行まで続くことを示している。 ２、　ＣＲ＝保存領域 表３に一覧されているペプチドの２種類の高分子量（マルチマー）型を調製した 。マルチマーの主な形態（よ、ジ−システィン（ｄｉ−Ｃｙｓ末端）ポリマーで 、ボ１ツマ−の中で複数のペプチドはジスルフィド結合により末端と末端で結合 された。これらのジ−システィンポリマーは、合成中システィン残基を、各ペプ チドの末端に付加することによって生産された。次に、ジ−システィン末端（ｃ ｌｉ−Ｃｙｓ）ペプチドを、重炭酸アンモニウム（０，１Ｍ）に室ｆＡ（約２５ ℃）で溶解しく１０ｍｇ／ｍｌ）、約１６時間撹拌し、スルフヒドリル基の酸化 を行い、ペプチドのポリマー型を生産した。ペプチド溶液を凍結乾燥し、ＩＩＰ Ｌｃで分析し、ペプチドのポリマー型の存在を確認した。 生産された第二の高分子量型は、界面活性剤様ミセルである。これは、アミノ末 端リジンを含むスペーサーペプチド（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−）をペプチド配 列（こ結合させて複合ポリペプチドを形成してから、Ｈｏｐｐ（１９８４）力く 報告している様に、パルミチン酸の様なＣＩ２〜Ｃｐｓの脂肪酸を、アルファお よびニブシロンアミノ基の両方１二カップリングさせることによって形成される 。生産されたＣ１２〜０口の脂肪酸を含むペプチドを次に９５％酢酸中に抽出し 、水性組成物において大きなミセルを形成するために利用する。この水性組成物 は、ペプチドよりも高い免疫原性を示す。 表３に一覧されている全てのペプチドのｄｉ−Ｃｙｓポリマーマルチマーを調製 した。水性ペプチドミセルマルチマ調製され、それぞれペプチド６２、６４、６ ６、６８と名付けられている。１０３から１１７と名付けられたペプチドは、ｄ ｉ−Ｃｙｓポリマーマルチマーの形態でのみ利用された。 生産された高分子量マルチマー型は、ＨＩＶのｇｐ１２０とｇｐ４　１の特定領 域の複数のコピーに対応している。命名を簡単にするために、マルチマー型は、 それが構成されたペプチドの番号によって呼ばれる。すなわち、ペプチド６１は 、ペプチド６１のｄｉ−Ｃｙｓマルチマー（ポリマー）型を指し、ペプチド６６ は、ペプチド６５の水性ミセル型を指す。一方１０３〜１１７は、ポリマーマル チマーを指す。 ペプチド６５と６６は、細胞表面のＴ４レセプターに結合するｇｐ１２０領域に 対応する。ペプチド６１と６２は、エイズ患者の血清に認められる主な免疫優性 エピトープに相当するｇｐ４　１アミノ末端付近領域に対応する。 例２ー抗ペプチド抗体反応 免疫能力を有するマウス系、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて、マルチマーの水性組 成物、すなわち例１において生産されたｄ　ｉ−Ｃｙｓペプチドポリマーとミセ ルが、抗ペプチド抗体反応誘発能を持つか否かに関して分析した。 数群のＢａｌｂ／ｃマウス（６〜８週令の雌、３〜５匹／群、ｃｈａｒｌｅｓ　 Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、完全フロインドアジュバント（Ｃ ＦＡ）（１：ｌの比率）中のペプチドマルチマー（１００μｇ／注射）を皮下（ ｓ．　ｃ．　）または皮肉（ｉ．ｐ．）注射により免疫感作した。不完全フロイ ンドアジュバント（ＩＦＡ）（１：］）中のブースター注射（５０μｇのペプチ ドマルチマー）を初回免疫感作後６透口と１０週透口投与した。各マウスを後眼 窩叢から２週問おきに採血し、各群の個々のマウス毎に血清を収集した。 抗ペプチド抗体の存在を検出するために、ペルオキシダーゼを結合したヤギ抗マ ウスＩｇＧ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌｓ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）を第二抗体として利用して、各 血清毎にエリザ分析を行った。ペプチド６１〜６８の予備試験結果が表４に示さ れており、ペプチド６１．６３．６５．６７．１０３〜１１７の更に精密な結果 が表５に示されている。 ペプチド６５．６６．６７．６８．１０５から１１０．１１２．１１４．１１５ ．１１７の高分子量型は高い抗体力価を惹起したが、ペプチド６１６２．６３． ６４．１０３．１０４．１１１．１１３．１１６では非常に低いか、無視できる 量の抗ペプチド抗体が産生された。同様の結果が、免疫能力を持つ別の系、Ｂ６ Ｃ３ＦＩマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に おける抗体反応に関して得られた。 一部の血清について、更に天然のｇｐ１６０に対する抗体反応（反応性）を分析 した。結果が表６に示されている。結果から、天然のｇｐ１６０との免疫反応が 認められなかったことから、これらのペプチドはＢ細胞エピトープには対応しな いことが証明されている。 表５ ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける各種ペプチドの抗体反応ペプチド　エリザ力価 ８＋６２＾＾５８６−５９８　１・４００＃６３＾＾５１９−５４３　１・５１ ２゜＃６５＾＾４１７−４３５　１　：２ｘｌＯ’＃６７＾＾４１７−４４４　 ’　ｌ　：８２ｘｌＯ’＝１０３八＾　３９−５１　＋６４゜ ＃１０４＾＾　４５−５５　１　：２０００：１０５　ＡＡ　４ｇ−６１１＋５ ０００＃１０６＾＾　７２−８２　１　＋４ｘｌＯ’＃１０７＾＾　８１−９２ 　１：Ｉｘｌｏ’＃１０８＾＾　９２−１０２　１１ｘｌＯ’：１０９＾＾１０ ５−１１６　１：８ＸＩＯ’ｆｌｌｌｏＡ＾１０９−１２１　１：６ＸＩＯ’ｔ ｌｌｌ＾＾ｌ　１８−１３０　１　：ｇ。 ＝１１２八＾１２１−１３３　１１ｘｌＯ’＝ＩＩ３＾＾２０４−２１６　１　 ：６４０５１１４　ＡＡ２１５−２２！ｌ　Ｉ＋ＩｘｌＯ＆：１１５＾＾２３６ −２４６　１　＋４ｘｌＯ’：１１６八＾２４０−２５２　１　：６４０：１１ ７＾＾２５０−２６３　１：１ｌｌｘｌＯ’表６ マウスにおける１１１ｖエノベロープＧｌ”１６０由来合成ペプチド抗原に対す るＴ細胞およびＢｍ胞の反応＊　ｉｎ　ｖｉｔｒｏの無関係な抗原の反応により 、ｃｐｍ値は補正され、分類されている。 電電抗体はＢａ１ｂ／ｃマウスにおいて作製され、反応性はエリザにより測定さ れ、終了点に従って分類されている。 １ｊｌＤ　測定されなかった。 例３−Ｔ細胞応答 例１に述べられているペプチドの高分子量、マルチマー、ｄｉ−Ｃｙｓペプチド ポリマー型を、Ｍｉｌｌｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、。 （１９８５）の様に、Ｔ細胞増殖応答の惹起に関して分析した。 マウス（３または５匹／群）の右後足内針にペプチドポリマー（１００μｇ／注 射）とＣＦ＾のｌ；ｌ混合物を注射した。ペプチド６Ｌ　６３．６５．６７を、 Ｂ６Ｃ３ＦＩｌマウス）！−２”’、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）と＾、５ＷＸＢＡＬＢ／ＣＦ１７ウス（Ｈ−２“１、Ｊａｃｋ ｓｏｎ　Ｌａｂｓ、　Ｂａｒ　）ｌａｒｂｏｒ、　ＭＥ）に注射した。１０日後 、排出腰高リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ　ＰＬＮ）細胞を採取し、９６ウエルの ミクロタイタープレートにおいて様々な濃度の合成ペプチド、ｇｐ１６０、無関 係なタンノクク様物質または培地のみを含む０．２ｍｌのクリ・ツク培地（Ｃ１ ｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７２）内で３７℃で９６時間、５％のｃｏ、の加 湿大気中で培養した（細胞２Ｘ　１０’個／ウェル）。最後の１６〜１８時間の 培養中、　′Ｈ−チミジン（’）ｌ−ＴｄＲ）（１μＣｉ／ウエル、６〜７Ｃｉ ／ｍ　ｍｏｌｅ、　ＩＣＮ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を加えた。細胞を 濾紙片に採取し、”Ｈ−ＴｄＲの取り込み員を監視した。データは図１．２．３ ．４．５に示されている。 図１は、Ｂａ１ｂ／ｃマウスにおけるペプチド６１．６３．６５．６７の結果を 示しており、これらの結果は、抗原を加えなかったバックグラウンドに対する抗 原が存在した場合の放射能カウント数の増加率を示す刺激指数（ＳＩ）として表 されている。異なるペプチドのＳｌ値は、陽性対照抗原としての精製無蛋白ツベ ルクリン（ＰＰＤ）によって得られたＳｌ値結果と比較した。 図２〜５は、全ての合成ペプチドに関して、主要組織適合性のハブロタイブが異 なるマウス、Ｂ６Ｃ３Ｆｌ　（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｘ　Ｃ”ＦＩ／）ＩｃＪ）？ウス （図２および４）と（＾、ＳＷｘ　Ｂａ１ｂ／ｃ）Ｆ１マウス（図３および５） におけるＴ細胞応答に関するペプチドに特異的な’Ｈ−ＴｄＲ取り込み量（Δｃ ｐｍ）を示している。’Ｈ−ＴｄＲ取り込み値は、抗原を含むウェル内の放射能 値と対照ウェル内の放射能値の差を表している。ＰＬＮ細胞の非特異的増殖は、 分析に無関係なペプチドを含めることによって決定された。これは、各ペプチド の水平線として示されている。 分析されたペプチドの全てがＢ６Ｃ３Ｆｌマウスにおいて良好なＴ細胞増殖応答 を示し、ペプチド１０５．１０７．１０９．１１１を除く分析されたペプチド全 てが、＾ＳＷｘ　ＢＡＬＢ／ｃ　Ｆｌマウスにおいて良好なＴ細胞増殖応答を示 した。 上記の結果と例２に述べられた結果によって、ペプチド６１．６３．１０３．１ ０４．１１３は、抗ペプチド抗原産生を刺激しないが、ジスルヒフィド（ｄｉ− Ｃｙｓ）ポリマーの形態では、対応するペプチドと天然のＩＩＮ’エンベロープ タンパク質ｇｐ１６０の両者に対する強力なＴ細胞応答を惹起する非常に優れた 免疫原である。 ’Ｈ−ＴｄＲ取り込み量によって測定されるＴ細胞増殖も、Ｔ細胞抗原の関数と して同様に分析した。ここで、様々な量の天然のｇｐ１２０またはｇｐ１６０を １つの対照として、ＰＰＤをもう１つの対照として使用した。Ｂ６Ｃ３Ｆｌマウ スのＰＬＮ細胞をこれらの研究において使用した。ペプチド１０４、＋０５とｇ ｐ１２０に関する結果が図６＾と６Ｂにそれぞれ示され、ペプチド６Ｌ　６３と ｇｐ１６０に関する結果が図７八と図７Ｂにそれぞれ示され、ペプチド６５．１ １１とｇｌ）１６０に関する結果が図８八と図８Ｂに、それぞれ示されている。 例４−　ＨＩＶに特異的な細胞障害性Ｔリンパ球の誘発３から５匹の同遺伝子型 雌マウス（６〜８週令）群を、適切な部位にモノマーまたは前述のＤＦ八に入っ たマルチマー（］：ｌ）の形態で免疫感作（ＣＴＬ刺激）量のペプチドを含む水 性組成物を陵内注射することによって免疫感作する。免疫感作後１０日ｌ１排出 ＰＬＮ細胞と牌臓リンパ球を入手し、予め免疫原として同じ同遺伝子型ペプチド により前処理しておいた放射線照射した同遺伝子型の正常牌臓細胞と共に６日間 培養することによってｉｎ　ｖｉｔｒＯで再刺激する。 以下に示す４時間の５１（ｒ放出分析によって細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の存 在を決定する。ＰＬＮ細胞は、適切な被験ペプチドで前処理しておいた放射線照 射された同遺伝子型正常牌臓細胞と共に１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むク リック培地内において３７℃で５日間維持される。 これらの細胞は、エフェクター細胞と呼ばれ、Ｈ−２’　ＩＪＨＣクラス！抗原 を発現する。 標的細胞（対応するＨＩｖタンパク質を発現するフィトヘマグルチニンにより刺 激された（ＰＨ＾）芽細胞またはＰ８１５マウス細胞）を血清を含まないＲＰＭ １１６４０培地で３回洗浄してから、２５０μＣ１のクロム酸ナトリウム（比活 性２００〜４００Ｃｉ／ｇ　”Ｃｒ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａ ｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍ＾）ニ混合し、接触させ、３７℃で約１．５から約２ 時間維持（インキュベート）する。その後、標的細胞を、ｌＯ％ＦＣ８を含むＲ ＰＭＩ　１６４０培地で洗浄し、ｌＯ％ＦＣ３と異なる濃度のペプチドを含むＲ ＰＭＩ　１６４０培地中に再懸濁する。これらの細胞をｌＯ％ＦＣ３を含むＲＰ ＭＴ　１６４０で３回洗浄し、細胞５Ｘ　１０’個／ｍｌになる様に再懸濁する 。各細胞懸濁液の１００μｍの部分標本を、９６ウエルのＵ字形底マイクロタイ タープレートのウェルに加える。 適切なエフェクター細胞懸濁液（細胞５Ｘ１０’個／ｍ１）の部分標本１００μ ｌを各ウェルに加え、２倍連続希釈を行い、異なるエフェクター細胞対標的細胞 （Ｅ：Ｔ）比を得る。対照ウェルには、エフェクター細胞を含まないｌＯ％ＦＣ ３だけを含むＲＰＭ　Ｉ培地０．１ｍｌを加え、自然５１Ｃｒ放出の値を得る。 Ｏ，１ｍｌの５％トリトンＸ−１００デタージエントを加え、最大５１Ｃｒ放出 値を得る。 プレートを３７℃で約４時間インキュベートし、その後、各ウェルの１００μｍ の上清をガンマカウンタ内でモニターし、５ＩＣｒ放出量を決定する。細胞障害 のパーセントは以下の様に計算される。 （エフェクター細胞に 例５−免疫優性ペプチドによって誘発されるＨＩＶに特異的なＣＴＬの迅速分析 法 ＨＩＶ　ｇｐ１６０免疫優性■３ループの配列ＲＴＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ を持つ配列は、ここではＲ１５Ｋ（配列番号１）と呼ばれるが、過去にＨ−２６ マウスにおいてＣＴＬ免疫優性エピトープとして同定されている（Ｔａｋａｈａ ｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）。最初の研究において、ＨｒＶ　ｅｎｖタ ンパク質を発現する組み換えワクシニアウィルスによりＢａ１ｂ／ｃマウスを感 染させることによって、ｉｎ　ｖｉｖｏで誘発されたＣＴＬは、Ｒ１５にでブレ インキュベートした同遺伝子型標的細胞を溶解することが明らかにされた。残念 ながら、今までのところ、遊離Ｒ１５にペプチドによるマウスの免疫感作により 、ＣＴＬの誘発には成功していない（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、１９９１）。 従って、本発明者等は、異なる接種部位を用いて、異なる組織由来のエフェクタ ー細胞を回収することによって、６〜８週令のＢａ１ｂ／ｃマウスにおいて、Ｃ Ｄ８”　Ｉ（ＩＶＲＩ５Ｋに特異的なＣＴＬの誘発を検討しようとした。ＣＦＡ のｌ：１のエマルジョン中の１００μｇのＲ１５にペプチド（配列番号１）によ り免疫感作されたマウスの排出腋窩リンパ節（Ｐ　Ｌ　Ｎ　）細胞は、モノ？　 −Ｒ１５Ｋ（４０μｇ／ｍｌ、　３７℃で２時間）でブレインキュベートされ、 放射線照射された（３３００ラド）同遺伝子型標的細胞に対する最も良好なＣＴ Ｌエフェクター供給源であった。これは特に重要で生理学的に意義がある。と言 うのは、ヒトリンパ節は、ＨＩＶ複製の主要部位と報告されているからである（ Ｋａｎｅｓｈｉｍａ　ｅｔａｌ、、１９９１；　Ｆａｕｃｉ　１９９１）。この 免疫感作プロトコルノ重要な点は、ＣＴＬが穏やかなホモゲナイゼーションによ り、わずか１０日後に外科的に切除されたＰＬＮ細胞から回収できた点である。 ｉｎ　ｖｉｖｏでペプチドに特異的なＣＴＬを一貫して誘発するためのペプチド の最適形態を決定するために、Ｒ１５Ｋ（配列番号ｌ）を次の３種類の形態に調 製した。ａ）直線モノマー、ｂ）　Ｎ末端およびＣ末端の両方に付加されたシス ティン残基の酸化により形成されるジスルフィド−結合ポリマー、ｃ）　Ｎ末端 でシバルミチル−リジン−グリシン−グリシンにペプチドをコンジュゲートさせ ることによって形成されるミセル（Ｈｏｐｐ、　１９８４；　Ｓａｓｔｒｙａｎ ｄＡｒｌｉｎｇｈａｕｓ、１９９１）。ＣＦＡに乳化した上記のＲ１５にのどの 形態を用いても、後足内針においてＢａ１ｂ／Ｃマウスを単回免疫感作すること によって、ペプチドと共にブレインキュベートされたＭｌ（Ｃ適合標的細胞（Ｒ ８１５、）ｌ−２’）を特異的に溶解したＣＴＬを一貫して産生じたことが見い だされた。この様な応答は、ペプチドのモノマー型によって免疫感作された１２ ２匹中８のマウスにおいて観察され、ミセル型によって免疫感作された１３３匹 中１匹のマウスに、ジスリフイドポリマー型によって免疫感作された８匹中６匹 のマウスにおいて観察された。ペプチドによる前処理（Ｒ８１５）を行わなかっ たＭＨＣ適合標的細胞は、溶解は認められなかった。代表的な結果が図９に示さ れている。 このペプチドの３種類の型によって誘発されたＣＴＬも、組み換えワクシニアウ ィルスに感染して旧Ｖ　ｇｌ）１６０（ＶＰＥ１６）を発現しているＲ８１５細 胞を特異的に溶解したが、対照のワクシニアウィルスに感染した細胞（Ｒ８１５ ＋　ＶＳｅ２）は溶解しなかった（図１０）。ＨＩ■抗体陽性のヒト血清による ウェスタンブロッティング法によって、ＶＰＥｌＢに感染したＲ８１５標的細胞 においてｇｐ＋６０タンパク質の存在が確認されたが、ＶＳｅ２に感染したＲ８ １５標的細胞においては確認されなかった。Ｂａ１ｂ／ｃマウスにおいてペプチ ドによって誘発されたＣＴＬは、Ｈ−２に限定されていた。 ペプチドによって前処理されたＨ−２’標的細胞（Ｒ８１５）のみを溶解し、ペ プチドによって前処理された３Ａ９標的細胞は溶解しなかった。この細胞は、Ｈ −２１ハブロタイブを発現している。 Ｒ１５Ｋ（配列番号１）ペプチドのミセル型によって免疫感作されたマウスにお いて産生されたＣＴＬに関する結果が表７に示されている。ＲＩ５にペプチドの モノマー型およびポリマー型の注射によって誘発されたＣＴＬに関しても、同様 の結果が得られた。 ＣＤ４“であるのかを決定するために、実験を行った。モノマー型によって免疫 感作されたマウスがらのＣＴＬエフェクターを抗ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｍ Ａｂ）とウサギ補体によって処理すると、ペプチドによって処理された標的ある いはｅｎｖを発現している標的に対する細胞障害性が消失した（図１１＾）。こ れに対して、エフェクター細胞を抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ＭＡｂ）および 補体、あるいは補体のみ、で処理した場合には、有意な効果を認めなかった。ミ セル型のペプチド（図１１８）、あるいはポリマー型のペプチドで免疫感作した マウスにおいて産生されたＣＴＬに関しても同様の結果が得られた。Ｒ１５Ｋ（ 配列番号１）によるＣＤ８’　ＣＴＬの誘発は、ＭＦＩＣクラスＩ遺伝子生成物 を発現し、クラス１■遺伝子生成物を発現しないＲ８１５標的細胞の使用に関し ても矛盾しない（Ｍａｒｙａｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５）。ＭＨＣクラ ス■限定は、ＣＤ８”１７ｚクターＣＴＬに関して、一般に観察される。 本研究において検討されたＣＴＬエピトープは、ＨＩＶ　ｇｐ１２０の免疫優性 なり細胞活性領域の中央に存在するので、Ｒ１５にペプチドのＢ細胞活性を検討 した。モノマー型でも、末端が脂質のミセルでも、ＫＬＨとのコンジュゲートで も、このペプチドによっては、マウスにおいて抗ペプチド抗体力価は測定可能な 程度まで誘発されなかった。しかし、ＫＬＨとのコンジュゲートによって免疫感 作されたマウスは、ＫＬ）Ｉに対する抗体を産生じ、このマウスが免疫機能不全 ではないことを示した。内針への注射によって免疫感作されたマウスの血清も試 験され、抗ペプチド抗体の形成は認めらなかった。 表７ ＨＩＶエンベロープｖ３ループＲＩ５にペプチド（配列番号１）によりＢａ１ｂ ／Ｃマウスにおいて誘発されたＣＴＬのペプチドと標的細胞に対する特異性 種々のＥ丁’比での％比溶解 Ｐ８１５　＋へ８４”　７６．７　６７．２　６５．９Ｐ８１５　＋　ＢＩ０６ ’　４．２　０．６　０Ｐ８１５　＋　８１０５°　６．７　０　Ｑ３＾９　’ 　７．０　０．６　０ ３＾９＋＾８４’　１０．０　８．０　０ａ−標的細胞に対するエフェクター比 り＝ＭＨＣ適合標的細胞０１−２’） Ｃ＝旧Ｖ　ｅｎｖ　ｖ３ループのＲＩ５にペプチドによって前処理されたＨ−２ １細胞 ｄ＝インフルエンザウィルスペプチドによって前処理された＋１−２’細胞 ｅ−センダイウィルスペプチドによって前処理されたＩ＋−２ｄ細胞ｆ　＝　１ １ＨＣＩニー　ａ　合Ｌ　ナイ標的細胞（Ｈ−２’）ｇ　＋＝Ｈ１ｖｅｎｖペプ チド■３ループによって前処理された１ト２１標的細胞直上に提示した結果にも かかわらず、Ｒ１５にはＨＩＶ　ｇｐ１６０の変異領域（Ｖ３ループ）に位置す るため、このペプチドは有力なワクチンの候補として選択できないとも考えられ る。しかし、２４５種の異なったＨＩＶ分離株からのｇｐ１６０のアミノ酸配列 を比較すると、全てのウィルス分離株間で、血清学的には少なくとも異なった５ 箇所の共通配列が認められている（ＬａＲｏｓａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０年 ）。 従って、発明者等は、主要なＨＩＶグループ全て（５種類、あるいはそれ以下と 思われる）を包含する■３ループ領域由来のＣＴＬ誘発ペプチドの混合物は、全 てではないにしても殆どの１７株に由来する、ｇｐ１２０の発現細胞に特異的な ＣＴＬを十分に誘発する可能性がある。この様な混合物は、ヒトにおける旧Ｖ感 染の予防に関して、評価するためのワクチンの原型として利用されるであろう。 例６−ヘルパーＴ細胞誘発ペプチドによるウィルスに特異的なＣＴＬ応答の増強 本例は、ＣＴＬエピトープを持つペプチドによって誘発された、ウィルスに特異 的なＣＴＬの全身的拡散、活性の程度、寿命を増強する方法に関するものである 。　この方法は、あるペプチド免疫原のＣＴＬ誘発活性を増強する方法として、 ヘルパーＴ細胞誘発活性を持つ、別の独特な種類のペプチドを免疫感作混合物に 加えることである。 例５に解説したように、ペプチド免疫原に対してＣＴＬ応答を誘発する、発明者 等の方法は、近位のリンパ節（注射部位の近傍）において迅速なＣＴＬ誘発を引 き起こした。しかし、遠隔リンパ組織（即ち、牌臓）に抗原に特異的なＣＴＬが 軽度に集積したことが注目された。次に、発明者等は、ヘルパーＴ細胞活性をさ らに誘発すれば、特異的なＣＴＬの拡散を改善するために有利であろうと推論し た。上記に解説した方法によって、ヘルパーＴ細胞エピトープ配列を含む必要な しに、ＣＴＬ誘発ペプチドのスクリーニングが可能であるので、発明者等は、Ｉ ＩＶ　ｌ：　特異的すＣＴ　Ｌ　誘Ｑ　ペプチド（ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ ＧＫ、　Ｒ１５Ｋ。 配列番号１）と物理的に混合したＨＩＶヘルパーＴ細胞ペプチドが、複数回の皮 下（ｓｃ）注射後にマウスに認められるＣＴＬ応答を増強するかどうかを試験し た。この研究に用いたヘルパーＴ細胞ペプチドは、ＣＲＩＫＱＩＩＮＭＩＩＱＧ ＶＧＫＡＭＹ＾、Ｃｌ９Ａ、　（配列番号２）であり、これは以前にヘルパーＴ 細胞誘発活性を有することが証明されている。 Ｂａ１ｂ／Ｃマウスに、ヘルパーＴ細胞ペプチドと混合したＲＩ５にペプチドを ２週間毎に３回皮下注射した。ヘルパーＴ細胞ペプチドは、次の３種類の形態の 内の１種類とした。すなわち、Ｉ）モノマー、２）末端が脂質のポリマー、３） ジスルフィドポリマーの１つである。最後の注射後１週間目に牌臓細胞を採取し 、再刺激し、ＣＴＬ活性を試験した。この実験は成功に終わり、全てのマウスに 顕著なＣＴＬ活性が認められた（表８）。続いて、この実験が繰り返され、Ｒ１ ５にとヘルパーＴ細胞ペプチドのモノマー型の混合物が同様にマウスに注射され た。今回の実験では、牌臓細胞がＨＩＶに特異的なＣＴＬ応答に関して、１回、 ２回、３回の皮下注射後に測定され、軽度ではあるが有意な程度のＣＴＬ応答の 存在が観察された（表９）。 表８ Ｒ１５Ｋ（配列番号１）とヘルパーＴ細胞ペプチドＣＩ９＾（配列番号２）の混 合物の皮下注射により免疫感作した［１ａｌｂ／ｃマウスから得た牌臓細胞のＣ ＴＬ活性ｐ８１５’　！＋、９　１２．５　７．９　５．ｌＲ１５に＋１２２ゝ 　ｐ８１５ｊＲＩ５に’　５３．６　４７．４　３４．０　２５．２ｐ８１５＋ ＋２２’　＋０．６　５．４　３．８　１．３ＲＩ５に斗６５’　ｐ８１５　８ ．４　１３．４　７．５　４．４ｐ８１５＋ＲＩ５Ｋ　４ｇ、４　２７，９　２ ５．３　１２．９ｐ８１５Ｎ２２　６．８　９．９　０　０ＲＩ５に邊６６’　 ｐ８１５　２７．４　１６，０　１６．０　１０．５ｐ８１５＋Ｒ１５に　５８ ．８　３７，４　３３．８　２０．７９８１５＋＋２２　１６．３　７．０　４ ．１　２．２８＝標的細胞に対するエフェクター比 ｂ＝ＲＩ５にと混合されたモノマー型のヘルパーＴ細胞ペプチドＣ＝ＲＩ５にと 混合されたポリマー型のヘルパーＴ細胞ペプチドｄ＝ＲＩ５にと混合された末端 が脂質型のヘルパーＴ細胞ペプチドｅ＝ＭＨｃ適合標的細胞（Ｐ８１５、Ｈ−２ ’）ｆ＝Ｒ１５にとブレインキュベートされたＰ８１５標的細胞ｇ−ヘルパーＴ 細胞ペプチドのモノマー型とブレインキュベートされたＰ８１５標的細胞 マウスを、完全フロインドアジュバント中に乳化したペプチド混合物（１：１） の皮下注射を２週間の間隔で６週間（全注射回数３回）実施して、免疫感作した 。５ａｓｔｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９２に準じて、最後の注射後１週間で、 牌臓細胞を採取し、５日間再刺激した。ペプチド１２２は、ヘルパーＴ細胞を刺 激するペプチドであり、配列はＣＲＩＫＱＩＩＮＭＷＱＧＶＧＫＡＭＹ＾である 。本明細書中では、Ｃ１９＾（配列番号２）とも呼ばれている。Ｒ１５には、Ｃ ＴＬ誘発ベプチトテあり、配列はＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ（配列番号１ ）である。 両者の配列は、旧Ｖ−１のｇｐ１２０配列に由来する（ｓａｓｔｒｙｅｔ　ａｌ 、　１９９１；　１９９２）。 表９ Ｒ１５Ｋ（配列番号ｌ）とヘルパーＴ細胞ペプチドＣＩ９＾（配列番号２）の混 合物の皮下注射により免疫感作したＢａ１ｂ／ｃマウスから得た誇臓細胞のＣＴ Ｌ活性Ｉ　ｐ８１５’　２．９　４．７　３．３　３．３ｐ８１５＋Ｒ１５に’ 　１１．０　？、７　３．６　０．１ｐ８１５１１２２′″　９．４　３．８　 ２．２　＋、＋１２　９８１５　５．５　３．８　１．６　１．８ｐ８１５４Ｒ １５Ｋ　１３．１　１１．０　５．０　０．８ｐ８１５＋Ｉ２２　３．０　４． ３　２．８　１．８３　ｐ８１５　６．６　３．６　４．３　４．３ｐ８１５＋ ＲＩ５Ｋ　Ｎ、７　４．３　５．６　０．５ｐ８１５＋Ｉ２２　１０．５　５． ２　４．９　６．８ａ＝標的細胞に対するエフェクター比 り＝マウスはＲ１５にとヘルパーＴｍ胞ペプチドのモノマー型の混合物を使用し て、１回、あるいは２回、あるいは３回の免疫感作を受けた。 ｃ＝１１Ｈｃ適合標的細胞（ｐＨＩ５、）Ｉ−ｓ’）ｄ＝ＲＩ５にとブレインキ ュベートされたＰ８１５標的細胞ｅ＝ヘルパーＴ細胞ペプチドのモノマー型とブ レインキュベートされたＰ８１５標的細胞 マウスは、ＣＦＡ中に乳化されたペプチド混合物（１：１）の２週間間隔の皮下 投与によって免疫感作された。各皮下注射の１週間後に、牌臓細胞が採取され、 ５ａｓｔｒｙ　ｅｔａｌ、、　１９９２０報告に従って再刺激された。 現在まで、Ｒ１５にペプチドそれ自体は、ＣＴＬ応答を誘発する効果があると報 告した研究者はいない。しかし、本発明者等は、本明細書で明らかにした様に、 Ｂａ１ｂ／ｃマウスにおいて、Ｒ１５にのみの単回皮肉投与による免疫感作後、 ７日以内に腰高部リンパ節においてＣＴＬ応答の誘発を証明した（図１２＾）。 従って、Ｒ１５にとヘルパーＴ細胞ペプチドから構成される混合物を単回皮肉投 与すれば、ＩＮ’に特異的なＣＴＬ応答を広く全身的に長期間に渡って獲得する ことは十分に可能であると忍われる。 多数のマウスを、ＣＴＬペプチドのみ（Ｒ１５Ｋ）、あるいはＣＴＬペプチドと ヘルパーＴ細胞ペプチドＣ１９＾（配列番号２）との混合物のいずれかの内針へ の単回皮内注射によって免疫感作した。その結果（図１２）、混合物によって免 疫感作されたマウスは、Ｒ１５にペプチドのみを注射されたマウスよりも、牌臓 におけるＣＴＬ応答が非常に高度であったことが示された（図１２Ｂ）。さらに 、牌臓における高度のＣＴＬ応答は、単回皮内注射後８週まで維持されたが、同 時に注射されたヘルパーＴ細胞ペプチド（Ｃ１９Ａ、配列番号２）は、ＣＴＬ誘 発活性を欠如していた。 Ｌａ５ａｒｔｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９９２）は、　最近、Ｒ１５Ｋを持ツＣＴＬ エピトープとヘルパーＴ細胞エピトープであるＫＱＵＩＩＮ［Ｑ　Ｅ　Ｖ　Ｇ　 Ｋ　Ａ　Ｍ　Ｙ＾の混合物の複数同腹腔内投与によって、マウスにおいて３週間 後に、軽度の！（１ｖに特異的なＣＴＬ応答を誘発したと報告した。しかし、今 回の実験においては、ＣＴＬペプチドそれ自体は、複数回注射後においてさえ、 旧■に特異的なＣＴＬを誘発することができなかった。従って、本研究において は、ヘルパーＴ細胞ペプチドの役割は不明である。一方、上記の研究においては 、ＣＴＬペプチドはＣＴＬ誘発能力を持っており、ヘルパーＴ細胞ペプチドの役 割は、ＣＴＬペプチドに固有のＣＴＬ応答を拡大し増強することであることが示 されている。従って、本研究によっては、有効な全身的に長期間に渡る細胞性免 疫を獲得するには、候補となるワクチンは、理想的には、ヘルパーＴ細胞ペプチ ドとＣＴＬペプチドを含まなくてはならないことが示唆されている。本発明の、 もう一つの重要な側面は、この様な混合物を皮肉に投与すれば、長期間持続する 全身的な抗原特異的なＣＴＬ応答を十分に誘発できることである。 例７−インフルエンザウィルスとセンダイウィルスに特異的なＣＴＬの迅速な誘 発 ）ＩＴＶに特異的なＣＴＬの誘発に関するプロトコルが上記例５において解説さ れたが、このプロトコルは、ｉｎ　ｖｉＶＯにおけるＣＴＬ感作の能力に関して 、不明のエピトープ特異性を持つペプチドの同定、選択、測定にも全般的に応用 可能であると考えられた。よって、インフルエンザウィルスに特異的なＣＴＬの ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるペプチド誘発が検討された。Ｄｅｒｅｓ　ｅｔ　ａｔ、 　（１９８９）は、インフルエンザウィルスの核タンパク質の一部に対応する合 成ペプチドＲ−１ＴＹＱＲＴＲＡＬＶＴＧ　（ａａ　１４７−１５８）によって 、Ｎ末端にトリバルミトイル−８−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（ Ｐ＊Ｃ３５）を共有結合させｔこ場合にのみ、マウスにおいてｉｎ　ｖｉｖｏの インフルエンザウィルス異的なＣＴＬを感作させることが可能であることを既（ こ示している。しかし、上記に解説されたプロトコルを利用すれば、ＣＤ８’に 特異的なＣＴＬが、遊離合成ペプチド１こよって免疫感作することにより、ｉｎ 　ｖｉｖｏにおいて誘発可能であった。このＣＴＬによって、本ペプチド（こよ って前処理された標的細胞は溶解される（表１０）。 この免疫感作プロトコルを利用すれば、未修飾の遊離合成ペプチドであるｌ（Ｇ ＥＦＡＰＧＮＹＰＡＬＷＳＹ＾に対して、１ｎｖｉｖｏのＣＴＬ応答を引き起こ すことも可能であった。この合成ペプチドは、センダイウィルスの核タンノ々り 質に由来する免疫優性のＣＴＬエピトープ（Ｂ１０５＋　ＮＰ　３２１３３６） を代表するものである。 従って、本方法は、）ＩＩＶウィルスに関するシステム以外において、実際に有 用であることが見Ｌ”ビされｊこ。 しかも、この迅速スクリーニング法は、候補ワクチンを開発し、種々の感染症の 治療に関して、医学的に有用であると考えられる。 例８　−　ｇｐ１２０由来の合成ペプチドによる、）ＩＩＶ−１感染とヒト細胞 によるシシンチウム形成の抑制本例は、ヒト細胞をＩＩＩＶ−１感染から予防し 、シンシチウム形成を抑制する、ｇｐ１２０に由来する合成ペプチドの同定と利 用を解説する。ＭＴ−４細胞は、ヒトＴ細胞白血病ウィルスｌ型により長期的に 感染しており、ＨＩＶ−１によって溶解性感染を起こすヒトＴ細胞である（Ｌａ ｒｄｅｒｅｔ　ａｌ．、１９８９）。従って、ＭＴ−４細胞のＨＩＶ−１１．： よる感染を抑制すれば、細胞の死滅を予防することになる。 ｇｐ１２０に由来する合成ペプチドによる）ＩＩＶ感染の抑制効果について検討 した。ｇｐ１２０の■３ループから選択された種々の長さく８〜２４個のアミノ 酸）の合成ペプチドが、新鮮に調整された初代ヒトＴ細胞（図１６）と培養ヒト Ｔ細胞（図１３、１４、１５）の両者において、ＨＩＶ感染を抑制することを示 す所見が得られた。 ＦＩＩＶ−１　１１１Ｂの■３ループに由来する配列を持つ、２４個のアミノ酸 ペプチドであるＮ２４Ｇ（ａａ　３０８−３１１，　ＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧ ＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧ，配列番号３）と１５個のアミノ酸ペプチドであるＲ １５Ｋ（ａａ　３１５−３２９、ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ、配列番号１ ）の両者は、１μｇ／ｍｌ（約０．　４　〜０．　６，ｃｚ　Ｍ）の濃度におい て、初代ヒトＴ細胞の旧Ｖ感染を９２％抑制することが観察された（図１６）。 ｖ３ループペプチドのより短い形である８個のアミノ酸ペプチドであるＲ８Ｋ（ ａａ　３２２−３２９、ＲＡＦＶＴＩＧＫ，配列番号５）も、Ｉμｇ／ｍｌ（約 １．２５μＭ）の濃度において、初代ヒトＴ細胞の旧Ｌｌ感染を６６％抑制する ことが認められた（図１６）。異型分離株の■３ループ領域からの合成ペプチド であるＨＩＶ−１ｍｎ　（Ｔ１３ＱＳＴＫＧＰＧＲＶＩＹＡＴＧＱ，配列番号６ ）およびＨＩＶ−１ｒｆ　（Ｈ１３Ｎ，　ＨＩＧＰＧＲ＾ＦＹＴＴＫＮ，配列番 号７）も、ｌμｇ／ｍｌ（約０．　７８μＭ）の濃度において、１１１８株によ る細胞感染を有意に（〉６０％）抑制することが認められた（図１６）。 他の旧Ｖ−１株の■３ループに由来する配列を持つ種々のその他のペプチドも、 ヒト細胞に対する旧Ｖ−１　１１１Ｂの感染抑制に関して、有意な活性を示すこ とが認められた。表１１＾に詳細を示すように、これらのペプチドには、Ｄ２３ 、Ｄ２４、Ｄ２５、Ｄ２６、Ｄ３０、Ｄ３５、Ｄ３８、Ｄ３９、Ｄ４０、Ｄ４４ が含まれ、これは、種々の株、例えば、ｍｎ，　ｒｆ，　ｗｍｊ−３、ｓｃ，　 ｚ６、ｅｌｉ、ｍｎ（ｙ−１）、ｍｎ（ｙ−ｐ）を反映している。 しかし、今回の測定は、異型株であるＨＩＶ−１　１１１Ｂの感染抑制に限定さ れていることに注意しなくてはならない。つまり、表１１Ｂに記載されている様 なペプチドは、今回の限定した測定において活性を示さなくても、感染ヒト集団 に認められる種々のＨＩＶ株に対して、感染抑制効果を発揮する配列として有用 であるかも知れない。 表１１　Δ ヒトの細胞のＩＩＩＶ−１１１１［１感染に対するｖ３ループペプチドの作用ペ プチド　ＲＴ活性　％ＲＴ ＮＯ株　配列　（Ｃｒ’Ｍ）　抑制 Ｄ２３（２４ａａ）　ＭＮ　ＹＮＫＲＫＲＩＩＩＩＧＰＧＲＡＦＹＴ　９４　９ ８．８ＴＫＮＮＩＧＣ Ｄ２４（１５ａａ）　ＭＮ　ＲＩＩＩＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ　５０００　２ ２．　ＩＤ２５（１５ａａ）　ｆｌｌＪ−３５ＬＳＩＧＰＧＲＡＰＲＴＲＥＩ　 ４３４２　４２．４Ｄ２６（２４ａａ）　ＲＦ　ＮＮＴＲＫＳＩＴＫＧｒ’ＧＲ ＶＩＹ＾　２０９３　７２．２７ＧＯＩＩＧＤ Ｄ３０（１５ａａ）　ＳＣ５ＩＩＩＩＧＰＧＲＡＦＹＡＴＧＤ　３４４３　５４ ．３Ｄ３５（１５ｓａ）　２６２　ＳＴｒ’１ＧＬＧＯ＾ＬＹＴＴＲＧ　５２４ ２　３０．３Ｄ３８（１５ａａ）　ＥＬＩ　ＲＴＩ’ＴＧＬＧＱＳＬＹＴＴＲＳ 　５ｇ２３　３３．７Ｄ３９（１５ａａ）　ＭＮ（Ｙ−Ｌ）　ＲＩｔｌｌＧＰＧ ＡＲＦＬＴＴＫＮ　１９７１１　７３．８Ｄ４０（１５ａａ）　１ｌＮ（Ｙ−Ｆ ）　ＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＦＴＴにＮ　２８０５　Ｇ２．８Ｄ４４（１５ａａ） 　＋１１８　ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ　２０２１　７３．２Ｒ１５に 非感染細胞　５５８ 表１１Ｂ ヒトの細胞の旧Ｖ−１１１１＋１感染に対するｖ３ループペプチドの作用Ｄ２７ （１５ａａ）　ＮＹ−５Ｇｌ＾ＩＧＰＧＲＴＬＹＡＲＥＫ　７６５７　０Ｄ２８ （１５ａａ）　ＲＦ　５ＩＴＫＧＰＧＲＶＩＹＡＴＧＱ　７６３４　０Ｄ２９（ １５ａａ）　ＣＤＣ４ＲＶＴＬＧＰＧＲｖｌＹＴＴＧＦ、　１３００９　０Ｄ３ ［１５ａａ）　Ｚ３　５ＩＲＩＧＰＩＪＹＦＴ＾にＧＧ　１１８７７　０Ｄ３２ （１５ａａ）　ＳＦ２　５ＩＹＩＧＰＧＲＡＦＩＩＴＴＧＲ８００２０Ｄ３３（ １５ａａ）　ＭＡＬ　Ｇ１口ＦＧＰＧＱＡＬＹＴＴＧＩ　８９５９　０Ｄ３４（ １５ａａ）　２３２１　５ＩＳＩＧＰＧＲＡＦＦＡＴＴＤ　１１１４２　０Ｄ３ ７（＋５ａａ）　ＪＹＩ　５ＴＰＩにＬＧＱＡＬＹＴＴＲＩ　７０２７　０ペプ チドなし　７５２８　０ 非感染細胞　５５８ ｇｐ１２０のアミノ末端に由来するペプチドＥ１３Ｖ　ＥＱＬＷＶＴＶＹＧＶＰ Ｖ　（配列番号４）の初代ヒトＴ細胞に対する■ＩＶ−１感染の抑制効果も測定 された。このペプチドは、ｌｏｇ／ｍ　］、　（約０．７７ｎＭ）という低濃度 でも、ＨＩＶ−１感染を９０％抑制した（図１８）。 異なったＩ（Ｎ’−１株からの■３ループ由来合成ペプチドのシンシチウム形成 に対する効果を測定するために、さらに研究が行われた。これらの研究では、そ れぞれのＴＩＩＶ−１株（即チ、Ｒ１５に、Ｈ１３Ｎ、Ｔ１３Ｑ）由来ノ■３ル ーブヘフチドの存在下に、また非存在下に、ＨｅＬａ　ＣＤ４細胞に、ＨＩＶ− １１１１Ｂのｍｎ株あるいはｒｆ株のエンベロープタンパク質であるｇｌ）１２ ０を発現する組み換えワクシニアウィルスを、感染多重度＋００において感染さ せた。感染後１８時間で、１００倍の拡大率において、ジンシチウムに関して細 胞の顕微鏡検査を行った。 これらの研究において、それぞれの組み換えワクシニアウィルスによる感染前に 、合成ペプチドとインキュベートした細胞に関しては、シンシチウムは認められ なかった。この結果は、ｖ３ループペプチドが）ＩＴ’／−１の細胞から細胞へ の伝播を抑制することを、明らかに示すものである。 旧Ｖ−１１ＴＴＢ分離株由来のＲ１５にペプチドの、血清中の安定性を検討する ために、さらに研究が行われた。これらの研究においては、Ｒ１５Ｋ（配列番号 １）ペプチドはウシ胎児血清中に３７℃でインキュベートされ、インキュベート 中の種々の時、つで、最終濃度１μｇ／ｍｌ（約０．６μＭ）の分割量がヒトＴ 細胞系列（！ＪＴ−４細胞）に対するＨＩＶ−１感染の抑制に関して試験された 。結果は、図１７に示されている。ＲＩ５にペプチドは、３７℃におけるウシ胎 児血清中のインキュベーションにおいて、４時間まで抑制効果を完全に維持し、 対照の未処理ペプチドの５０％の抑制活性が２４時間後でも維持されていた。 臨床利用の可能性が認められる合成ペプチドあるいはその混合物に関して、安定 性試験を行うことになると予想される。それらの試験には、例えば、ヒト血清あ るいは血漿とのブレインキュベーション、種々のプロテアーゼによる処理、温度 安定性またｐＨ安定性分析が含まれる。もし、必要であれば、合成ペプチドの安 定性は、種々の方法によって増強することも考えられる。それらの方法としては 、例えば、ペプチド合成においてしアミノ酸の代わりにＤアミノ酸を使用する、 ｔ−ｂｏｃなどの遮断基を利用する、ペプチドをリポソーム内に封入するなどが ある。放射能によって標識されたペプチドをマウスおよびアカゲザルに注射して 組織分布を分析することにより、選択されたペプチド混合物の生物学的利用能も 測定されると考えられる。 Ｒ１５にペプチドによってＣＴＬ応答を誘発することが可能であるとした、発明 者らの以前の証明（上記、例５を見よ）に加えて、このペプチドと他のＨＩＶ− １分離株由来の類自体によって、ＨＩＶ−１によるヒトＴ細胞への感染が効果的 に予防されることが示されている。本活性は、Ｈ９細胞、ＣＥＭ細胞、ＭＴ−４ 細胞などの培養細胞、および新鮮に調整されたヒトＴ細胞を使用して証明された 。これらの結果は、Ｖ３ループペプチドが２つの異なった機序で作用することを 示唆している。１）　）ＩＩＶ−１ｇｐ１２０を発現する細胞を特異的に死滅さ せ、ｌ（Ｎ’−］に特異的な細胞障害性Ｔリンパ球を誘発する、２）正常細胞が 感染性ウィルスによって感染するのを予防するという、２つの機序である。従っ て、これらのｖ３ループペプチドはワクチンとしての利用のみでなく、ヒトにお ける旧ｖ−１感染を予防するため、あるいは、ＨＩＶ−１に感染した患者におい てウィルス感染が拡大するのを抑制するための治療剤としても利用できる。 例９−合成ペプチド混合物による免疫感作によるＨＩＶに特異的なＴ細胞応答の サルにおける誘発本例は、アカゲザルにおいて８種類の合成ペプチドの混合物を 使用して、ＩＩＴＶに特異的なＴ細胞応答の誘発に成功したことを解説するもの である。この８種類の内７種類はＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質の保存領 域に由来するものである。これらの結果は、ヒト以外の霊長類においてＩ（ＩＶ 川に特異的なＴ細胞応答が誘発されることを証明するものであり、ヒトをＨＩＶ 感染から予防する広範な細胞性免疫を誘発することができる合成ペプチドに基づ くワクチンの同定と構造決定に向かっての大きな一歩である。 本研究においては、３匹のアカゲザル（＃７、＃２３、＃２８３Ｃ）を、完全フ ロインドアジュバントにｌ：１の比率で乳化した８種類の合成ペプチド混合物（ 滅菌水中に各ペプチドが３００μｇ）を１ｍ１（各部位につきＯ，１ｍ１）皮下 投与によって免疫感作した。これらの８種類のペプチドは、６１６３．１０４． １０５．１１１．１１３．１１６、Ｒ１５にと名付けられているが（表１２）、 以前に、ｇｐ１６０に特異的なＴ細胞応答を活性化させる合成ペプチドとして同 定されていたものである。初回免疫感作後３週および７週において、不完全フロ インドアジュバント内に乳化されたペプチド混合物（滅菌水中に各ペプチドが１ ５０μｇ）のブースター注射が、各サルに２回投与された。＃７のサルは本研究 に無関係な健康上の理由により３４週で層殺し、残りの２匹のサル（＃２８３Ｃ および＃２３）は、さらに１回のブースター注射を２５週で受けた。 表１２ 免疫感作ペプチドのアミノ酸配列 ｐｅｐｔｉｄｅ　６１　ａａ　５８６−５９８　ＹＬＲＤＱＱＬＬＧ目ＧＣｐｅ ｐｔｉｄｅ　６３　ａａ　５１９−５４３　ＦＬＧＦｌ、Ｇ＾＾ＧＳＴＩＩＧ＾ ＾５ＬＴＬＴＶＱＡＲＣｐｅｐｔｉｄｅ　１０４　ａａ　４５−５５　ＶＹＹＧ Ｖｒ’ｌＫＥ＾ｐｅｐｔｉｄｅ　１０５　ａａ　４８−６１　ＧＶＰＶｆＫＥＡ ＴＴＬＦＣｐｅｐｔｉｄｅ　ＩＩＩ　ａａ　１１Ｂ−１３０１４ＤＯｓＩＫＩ’ ＣｖＫＬＴｐｅｐｔｉｄｅ　１１３　ａａ　２０４−２１６　５ＶＩＴＱＡＣ３ にＶＳＦＥｐｅｐｔｉｄｅ　１１６　ａａ　２４０−２５２　ＧＴＧＰＣＴＮＶ ＳＴＶＱＣｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒ＋５に　ａａ　３１５−３２９　ＲＩＱＲＧＰＧ ＲＡ１４ＴＩＧＫ各ペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端のアミノ酸の番号は Ｍｏｄｒｏｗ　ｅｔ　ａｌ、の１９８７年の報告に準じている。 各動物の初回免疫感作に続いて２週間の間隔で、１５ｍ１のヘパリン処理した全 血が静脈穿刺によって採取された。末梢血液中の単核球（ＰＢＭＣ）が、標準的 なフイコ−ルーハイペイク遠心分離によって分離され、増殖測定に使用された。 核ペプチドと組み換えｇｐ１６０に対する増殖応答に関して、ＰＭＢＣが２週間 毎に３２週間に渡ってモニタされた。 ３匹のアカゲザルからのＰＭＢＣは全て、ペプチド１０４（ａａ　４５−５５） 、ペプチド１１１（ＡＡ　１１８−１３０）、ペプチド６３（ａａ５１９−５４ ３）による良好な増殖応答を示すことが見いだされ、ペプチド１１３（ａａ　２ ０４−２１６）、ペプチド１１６（ａａ　２４０−２５２）に関しては応答が弱 かった（表１３）。３匹のアカゲサルの内の２匹からのＰＭＢＣ試料によっても 、ペプチド６１（ａａ　５８６−５９８）による良好な増殖応答が認められた（ 表１３）。ペプチド１０５（ａａ　４８−６１）およびペプチドＲ１５Ｋ（ａａ ３１５−３２９）に関しては、いずれのサルにおいても有意な応答が得られなか った。旧Ｌｌエンベロープタンパク質の前駆体である組み換えｇｌ）１１６０に よって、実験の全期間に渡って、有意に強い増殖応答が、３匹のサル全てのＰＭ ＢＣｉ：認められた。 表１３ Ｔ細胞増殖反応 ｓ７　ａ２３　＃２１１３Ｃ １０４（ａａ４５−５５）　４Ｉ２１　４令ＩＩＩ　（ａａ　１１８−１３０） 　３邊　２４　３＋６３　（ａａ　５１９−５４３）　２ｉ　４÷　３４＋１３ 　（ａａ　２０４−２１６）　Ｎ　２４　２斗＋１６　（ａａ　２４０−２５２ ）　Ｉ斗　３４　２令６１　（ａａ　５８６−５９８）　−３４２４ＲＩ５Ｋ　 （ａａ　３１５−３２９）　−ＧＰＩ６０　（ａａ　ｌ−８６３）　６４　４４ 　４４（−）、応答が検出されない。（ｌ＋）、弱い応答。（２＋）、良好な応 答。 （３＋）、より良好な応答。（４＋、６＋）、最高の応答。 これらの結果は、）ＩＴＶのｅｎｖ遺伝子の生成物に由来する合成ペプチドの混 合物によって、アカゲザルにおいてｇｐ１６０に特異的なＴ細胞応答を感作する ことが可能であることを証明するものである。これらのペプチド混合物はマウス とアカゲザルの両者において特異的なＴ細胞応答を誘発することが可能なのであ るか呟　これらのＩＩＶ　ｅｎｖペプチドは、ヒトにおいて旧■感染を予防する ワクチン成分として有用であると提唱される。 零＊＊ 本発明の組成物と方法を望ましい実施例に関して解説したが、本技術に精通する 者は、本報告で解説されている、組成物、方法、方法の手順、方法の手順の組み 合わせを、本発明の構想、意図、範囲を逸脱することなく、変更し得ることが明 らがであろう。より限定的に言えば、本報告に記載された薬剤の代わりに、化学 的にも、および生理学的にも関連するある種の薬剤を利用して、同一のあるいは 同様の結果が得られることも明らかである。本技術に精通する者にとって明らか な、全ての類似の代替物あるいは変法は、付随する請求項によって規定される様 に、本発明の精神、範囲、構想に含まれると考えられる。 引用文献 下記は、本明細書の中で特定された事項に関して、そして、本発明の種々の側面 の基礎となる事項を開示し、教示し、実施可能にし、提供する範囲において、引 用することにより本明細書の一部とするものである。 ＾ｈｅａｒｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ ｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ＾ＩＤＳ、ｈｅｌｄ　ｉｎ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ 、Ｃ，、Ｊｕｎｅ　１−５．　１９８７゜Ａｂｓｔｒａｃｔ　＃Ｍ、１０．３． 　ｐａｇｅ　８＾１ｃｈｅｌｅ、　Ｐ、　Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ、　Ｈ，Ｚｉｎ ｋｅｒｎａｇｅｌ、　Ｒ，Ｍ、　＆５ｃｈｕｌｚ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｅｘｐ、　Ｍ ｅｄ、　１７１：１８１５−１８２０　（１９９０）Ｂａｒｎｅｓ、　５ｃｉｅ ｎｃｅ、　２３６：２５５　（１９８７）Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｎａｔｕｒｅ、　３３４ニア０６−７０８　（１９８８）Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ 、　Ｊ、Ａ６．　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、、　５：２４１２−２４１８　（１９９１） Ｂｏｄａｎｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　 Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　５ｏｎｓ、　５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　 （１９７６）Ｂｕｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２８ニア７　 （１９８７）Ｃｅａｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。 ８４：４２４９−４２５３　（１９８７）Ｃｌｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ ｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、３＋２６４−２７６（＋９７２） Ｃｏａｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３２６：５４９　（１９８７）Ｃ ｕｌｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１９：２３ ８３　（１９８９）Ｄａｄａｇｌｉｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 １４７：２３０２　（１９９１）Ｄｅ　Ｌｉ５ｉ　＆　Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ。 ソ・７０４８　（１９８５） Ｄｅｒｅｓ、Ｋ、５ｃｈｉｌｄ、Ｈ，Ｗｉｅｓｍｕｌｌｅｒ、Ｋ−Ｈ，Ｊｕｎｇ 、Ｇ、＆Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ、Ｈ−Ｇ、、Ｎａｔｕｒｅ　３４２：５６１−５６ ４　（１９８９）Ｄｅ　Ｒｏｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８４ ：１８７−１９６　（＋９９］）Ｄｏｈｅｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｄｖ、　 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。、　４２：Ｉ　（１９８５）Ｅａｒｌ　ｅｔ　ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ、２３４ニア２８　（１９８６）Ｆａｔｈｍａｎ、、八ｎｎ、Ｒ ｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　５：４７７　（１９８７）Ｆａｕｃｉ、＾、、＾［ ＤＳ　ＩＪｐｄａｔｅ　４＋１０３　（１９９１）Ｆｒｅｅｄ　＆　Ｒ１５ｓｅ ｒ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６１＋２８５２−２８５６．　（１９８７）Ｆｒｅｅｄ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｐｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡＵ・４６５０−４ ６５４　（１９９０）Ｇａｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７： ３２６８−３２７３　（１９９１）Ｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ杉　９４４８−９４５２　（１９９１）Ｈｏ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、Ｌｌ：２０２４　（１９８７）Ｔｌｏｐｐ　＆ 　Ｗｏｏｄｓ、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、２３＋８０７　（１９８２）Ｈｏｕｇ ｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。 甘・５１３１−５１３５　（１９８５）Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ　＾Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、Ｅ口：１５１２　（１９９１）Ｊｏｈｎｓｏｎ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｗｅｄ、、１７５：９６１−９７１　（１９９２ ）Ｋａｎｅｓｈｉｍａ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ。 Ｕ、Ｓ、八、　録：４５２３−４５２７　（１９９１）Ｋａｓｔ、Ｗ、Ｍ、ｅｔ 　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 Ｌｌ、Ｓ、Ａ、８８：２２８３−２２８７　（１９９１）Ｋｏｅｎｉｇ、Ｓ、ｅ ｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４５：１２７　（１９９０）Ｋｏｉｔｏ 　ｅｔ　ａｌ　、　Ｔｎｔ、ＩｍｍｕｎｏＬ、ｉ：６１３−６１８　（１９８９ ）Ｋｙｔｅ　＆　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１５７：１０ ５−１３２（＋９８２） Ｌａｒｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２４３：１７３１−１７３４　 （１９８９）ＬａＲｏｓａ、Ｇ１．ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：９ ３２−９３５Ｌａｓａｒｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｌ ｉ１：２１１−２１８　（１９９２）Ｌｅｇｒａｉｎ　ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｖｉ ｒｏｌ、、６０：１１４１　（１９８６）Ｌｉｎｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、６２＋３６９５−３７０２　（１９８８）Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ　 ＆　Ｆａｔｈｍａｎ、＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏ１．５：４７７Ｍａｄｄｏ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ、４７：３３３　（１９８６）Ｍａｉｚｅｌ　ｅｔ 　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０＋５０９　（１９８０）Ｍａｎｎ ｈａｌｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６：２７９２−２７９ ９Ｍａｒｙａｎｓｋｉ、Ｊ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。 １５：１１１１−１１１７　（１９８５）ＫｃＣｕｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ ｌ　５３＋５５−６７　（１９８８）ＭｃＯｍｉｅ、Ｊ、Ｆ、Ｗ、、Ｐｒｏｔｅ ｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　ＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐｌｅ ｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、（１９７３）。 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８５：２１４９−２１５ ４　（１９６３）Ｍｉｃｈｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏ−ｖｉｒｕｓｕｓ、ト１〕：４６９−４７８　 （１９９２）Ｍｉｌｉｃｈ　ａｎｄ　ＭｃＬａｃｈｌａｎ、５ｃｉｅｎｃｅ、２ ３４：Ｈ９８，（１９８６）Ｍｉｌｌｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、１３４＋４１９４−４２０３　（１９８５）Ｋｉｌｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６４：５３２　（１９８６）Ｍｉｔｔｌｅｒ、Ｒ，Ｓ、 ＆　Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｍ、に、、５ｃｉｅｎｃｅハ」。１３８０−１３８２　（ １９８９）Ｍｏｄｒｏｗ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６１：５７０−５ ７８　（１９８７）Ｍｕｒａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、＾ｃｔａＵロ９：２７９−２８４　（＋９９１）Ｎａｓｏ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、４５：１２００　（１９８３）へ°１ｘｏｎ、Ｄ、Ｆ 、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：４８４−４８７　（１９８Ｂ）Ｐｌａ ｔｓｏｕｋａｓ、Ｃ，Ｄ、＆　Ｇｏｏｄ　Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｎ、Ａｃａｄ 。 Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７８：４５００−４５０５　（１９８１）Ｐｏｐｏｖｉｃ 　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２４：４９７−５００　（１９８４）Ｒｏ ｂｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＬＩＳ＾む ゴ０２３　（１９８６） Ｓａｓｔｒｙ、Ｋ、Ｊ、＆　ＡｒｌｉｎＡｒｌｌｎ、Ｒ，Ｂ、、ＡＩＤＳ。 旦：６９９−７０７　（１９９１） Ｓａｓｔｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、ｖｔｒｏｌｏｇｙ、出：５０２−５０９　（１９ ９２）Ｓｅｎｙｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ＥＸｐ、＆Ｉｅｄ、、ｌ、ｉ：１２９４ 　（１９７１）Ｓｅｔｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、にｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、２３： ８０７　（１９８６）Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ、Ｒ，Ｆ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１． 　５４：５６１−５７５　（１９８８）Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｆｌ、ｅｔ　ａｌ 、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｎ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 ｕ、ｓ　Ａ、、８５：３１０５−３１０９　（１９８８）Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、＾ 、Ｒ，Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１．　４４＋９５９−９６８　（１９８６）Ｔ ｒａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８６：３１３−３１７　（１ ９９２）Ｖａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ、４０：９　（１９ ８５）Ｗａｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３４：１５６３−１５ ６６　（１９８６）Ｗａｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３２Ｂ：３４ ５　（１９８７）Ｌ’ａｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａ ｄ、Ｓｃｉ、、８６：９５１４（”　Ｉ　９８９　） Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、　Ｋ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１ ４；　二３０９１−３０９７配列一覧表 （１）一般的情報： （１）出願人：ボード・オヴ・リージエンツ、ザ・ユニヴアーシティ・オヴ・テ キサス・システム（ｉｉ）発明者、サストリー、ジャガンナダ・ケイアーリング ハウス、ラルフ・ビー ブラツアウカス、グリス・ディー ネヘテ、プラモド・エヌ （ｉｉｉ）発明の名称。 免疫応答または抗感染応答を誘発するだめの方法と組成物 （ｉｖ）配列の数＝７ （ｖ）連絡先 （＾）あて先：＾ｒｎｏｌｄ、　Ｗｈｉｔｅ　＆　Ｄｕｒｋｅｅ（Ｂ）街：　Ｐ 、０．Ｂｏｘ　４４３３（Ｃ）市：ヒユーストン （Ｄ）州：テキサス （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）ジップコード（郵便番号）　：　７７２１０（ｖｉ）コンピューター読取 可能な形式（＾）媒体　フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣ互換器（Ｃ）オペレーティングシステム： 　ＰＣ−ＤＯ３／ＩＪｓ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア、ワードパーフェクト５， １（ｖｉＤ本出願データ： （＾）出願番号・不明 （Ｂ）出願日・不明 （Ｃ）分類　不明 （ν１１１）先の出願データ： （＾）出願番号、第０７／８００．９３２号（Ｂ）出願日　１９９１年１２月２ 日 （Ｃ）分類；４２４ （１ｘ）先の出願データ： （＾）出願番号　第０７／９４５．８６５号（Ｂ）出願日＋　１９９２年９月１ ６日（Ｃ）分類：不明 （ｘ）代理人の情報 （＾）氏名、　パーカー、ディピッド・エル（Ｂ）登録番号：第３２．１６５号 （Ｃ）参照番号：　ＬＩＴＦＣ３０５ＰＣＴ（ｘｉ）電子通信の情報 （Ａ）電話番号：　５１２−３２０−７２００（Ｂ）ファクス番号：　５１２− ４７４−７５７７（Ｃ）テレックス、なし ＩＱ）Ｐｉｌｌ母会７部会７ （６）配列番号５の情報 （ｉ）　配列の性質 （Ａ）　配列の長さ＝　８個のアミノ酸（Ｂ）　配列の型：　アミノ酸 （Ｃ）　鎖の数＝　１本鎖 （Ｄ）トポロジー二１１鎖状 （１１）　配列の橿ｗＡ：　ペプチド （ｘｌ）　配列：　配列番号５ ＡｒｇＡｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ（７）配列番 号６の情報 （ｉ）　配列の性質 （Ａ）　配列の長さ：　１３個のアミノ酸ＣＢ＞　配列の型：　アミノ酸 （Ｃ）　鎖の数＝　１本鎖 （０）トポロジｍ：　直鎖状 （Ｉ］）　配列の種ｗ４：　ペプチド （ｘｉ）　配列：　配列番号６ Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａ（ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ａ ｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇ１ｎｔＱＩ［ＩＬ７１１ｆｌｒ″ＪｌリノＩＭＦＷ（ ｉ）　配列の性質 ％５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｌｙｓｉｓ ｃ１０比壽椅 ＦＩＧ、　１１Ａ ＦＩＧ、　ＩＩＢ ＦＩＧ、　１２Ａ ＦＩＧ、　１２Ｂ ％Ｃｅ１ｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ’１０　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＴ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ・ん１ヌゴ見・ ￥±↑午阜八 Ｒへ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　（ｃｐｍ　ｘ　１ｏ−３１ＲＴル）Ｉ’ｔ 国際調査報告 、　、、、、＝、、　ＰＣＴ／ＵＳ　９２／１０３７Ｂ、、、、−ＰＣＴ／ＬＩ Ｓ９２／１０３７８フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３ 　Ｄ　８３１０−２ＪＫ　８３１０−２Ｊ ３３１５６９　Ｈ９０１５−２Ｊ Ｌ　９０１５−２Ｊ Ｊ　９０１５−２Ｊ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。 ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。 Ｃ３，ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　Ｌ Ｕ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ 、ＳＤ、ＳＥ、ＵＡＩ （７２）発明者　プラツアウカス、グリス・ディーアメリカ合衆国、７７００４ 　テキサス、ヒユーストン、エイピーティー　２３シー、バーマン　１１１１ （７２）発明者　ネヘテ、プラモド・エヌアメリカ合衆国、７７０３０　テキサ ス、ヒユーストン、エイピーティー　９、イートン・ストリート　１３０３

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．第一および第二のペプチドからなる組成物であって、該第一のペプチドはＣ ＴＬを誘発するエピトープからなり、該第二のペプチドは、ＨＩＶ感染を抑制す る配列あるいはヘルパーＴ細胞を誘発するエピトープからなる組成物。
2. ２．上記第二のペプチドが、ＨＩＶ感染を抑制する配列からなる請求の範囲第１ 項に記載の組成物。
3. ３．上記第二のペプチドが、ヘルパーＴ細胞を誘発するエピトープからなる請求 の範囲第１項に記載の組成物。
4. ４．上記第一のペプチドが、ＣＴＬを誘発するエピトープとＨＩＶ感染を抑制す る配列の両方である請求の範囲第１項に記載の組成物。
5. ５．第一、第二、第三のペプチドからなり、該第一のペプチドがＣＴＬを誘発す るエピトープからなり、該第二のペプチドがヘルパーＴ細胞を誘発するエピトー プからなり、該第三のペプチドがＨＩＶ感染を抑制する配列からなる請求の範囲 第１項に記載の組成物。
6. ６．ヘルパーＴ細胞を誘発する上記エピトープが、約１０から約２０のプラスの 両親媒性値を示すことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成物。
7. ７．上記の第一、第二、第三のペプチドの配列がＨＩＶ遺伝子生成物に由来する 配列からなる請求の範囲第１項に記載の組成物。
8. ８．ＣＴＬを誘発するエピトープからなる上記ペプチドの配列が、表１に示され た配列からなる請求の範囲第７項に記載の組成物。
9. ９．上記の第一、第二、第三のペプチドの配列が、ＨＩＶエンベロープ遺伝子生 成物に由来する配列からなる請求の範囲第７項に記載の組成物。
10. １０．上記の第一、第二、第三のペプチドの配列がＨＩＶｇｐ１２０に由来する 配列からなる請求の範囲第９項に記載の組成物。
11. １１．ＣＴＬを誘発するエピトープからなる上記ペプチドの配列が、ＨＩＶｇｐ １２０のＶ３ループに由来する配列からなる請求の範囲第１０項に記載の組成物 。
12. １２．Ｖ３ループ由来のＣＴＬを誘発する上記ペプチドが、表２に示されている 配列からなる請求の範囲第１１項に記載の組成物。
13. １３．Ｖ３ループに由来するＣＴＬを誘発する上記ペプチドの配列が、ＲＩＱＲ ＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ（Ｒ１５Ｋ、配列番号１）の配列を含む請求の範囲第１ ２項に記載の組成物。
14. １４．ヘルパーＴ細胞を誘発するエピトープからなる上記ペプチドの配列が、約 １０から約２０のプラスの両親媒性値を示すことを特徴とするＨＩＶｇｐ１２０ 配列に由来する配列からなる請求の範囲第１０項に記載の組成物。
15. １５．ヘルパーＴ細胞を誘発する上記ペプチドが、ＣＲＩＫＱＩＩＮＭＷＱＧＶ ＧＫＡＭＹＡ（Ｃ１９Ａ、配列番号２）の配列を含む請求の範囲第１４項に記載 の組成物。
16. １６．ＨＩＶ感染を抑制する配列からなる上記ペプチドが、その配列に対する抗 体がＨＩＶ細胞感染を抑制するような配列からなる請求の範囲第９項に記載の組 成物。
17. １７．ＨＩＶ感染を抑制する上記ペプチドの配列が、ＨＩＶｇｐ１２０のＶ３ル ープ、Ｎ末端部分、またはＣＤ４結合領域に由来する配列からなる請求の範囲第 １０項に記載の組成物。
18. １８．ＨＩＶ感染を抑制する上記ペプチドの配列が、表１１Ａに示した配列から なる請求の範囲第１７項に記載の組成物。
19. １９．ＨＩＶ感染を抑制する上記ペプチドの配列が、ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴ ＩＧＫ（Ｒ１５Ｋ、配列番号１）、ＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ ＧＫＩＧ（Ｎ２４Ｇ、配列番号３）、ＥＱＬ７ＶＴＶＹＹＧＶＰＶ（Ｅ１３Ｖ、 配列番号４）、ＲＡＦＶＴＩＧＸ（Ｒ８Ｋ、配列番号５）、ＴＫＧＰＧＲＶＩＹ ＡＴＧＱ（Ｔ１３Ｑ、配列番号６）、または、ＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＸＮ（Ｈ １３Ｎ、配列番号７）の配列を含む請求の範囲第１７項に記載の組成物。
20. ２０．ＨＩＶ感染を抑制する上記ペプチドの配列が、ＥＱＬＷＶＹＹＧＶＰＶ（ Ｅ１３Ｖ、配列番号４）を含む請求の範囲第１７項に記載の組成物。
21. ２１．上記ペプチドがモノマー、ポリマー、または、末端が脂質のペプチドであ る請求の範囲第１項に記載の組成物。
22. ２２．上記ペプチドが、薬理学的に許容できる賦形剤中に拡散している請求の範 囲第１項に記載の組成物。
23. ２３．上記第一あるいは第二のペプチドの配列が、インフルエンザウイルスタン パク質あるいはセンダイウイルスタンパク質に由来する請求の範囲第１項に記載 の組成物。
24. ２４．上記ペプチドの配列が、ＴＹＱＲＴＲＡＬＶＴＧあるいはＨＧＥＦＡＰＧ ＮＹＰＡＬＷＹＡの配列を含む請求の範囲第２３項に記載の組成物。
25. ２５．哺乳動物における免疫応答を誘発する薬剤調製のための請求の範囲第１項 から第２４項のいずれか１項に記載の組成物の使用。
26. ２６．標的細胞のＨＩＶ感染を抑制する薬剤調製のための請求の範囲第２項及び 第４項から第２２項のいずれか１項に記載の組成物の使用。
27. ２７．下記のステップからなる、ＣＴＬ応答を強化することが可能な候補物質の 同定方法。 ｉ）候補物質とＣＴＬ応答を誘発することが可能な免疫原の両者を動物に投与す る。 ｉｉ）該動物からＣＴＬを回収する。 ｉｉｉ）該候補物質の存在によってＣＴＬ応答が強化されたかどうかを決定する 。
28. ２８．動物にヘルパーＴ細胞エピトープを含むペプチドの免疫学的有効量を追加 投与することにより、動物のＣＴＬ誘発免疫原に対するＣＴＬ応答の強化方法。
29. ２９．下記のステップからなる、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘発する効 力に関する組成物評価方法。 ｉ）該組成物を使用して皮内投与により動物を免疫感作する。 ｉｉ）該免疫感作動物の排出リンパ節あるいは近位部のリンパ節より細胞障害性 Ｔ細胞を回収する。 ｉｉｉ）該細胞障害性Ｔ細胞が該組成物によって活性化されているかどうかを測 定する。
30. ３０．上記候補物質が、ＣＴＬによって認識されるペプチドであると推定される 少なくとも１種のペプチドからなる請求の範囲第２９項に記載の方法。
31. ３１．上記ペプチドが関連する修飾因子を含まない請求の範囲第２９項に記載の 方法。
32. ３２．病原体に関連するタンパク質に対する上記組成物のＣＴＬ応答誘発能を試 験する請求の範囲第２９項に記載の方法。
33. ３３．上記組成物が、ＨＩＶタンパク質に由来するＣＴＬ反応性ペプチドからな る、請求の範囲第３２項に記載の方法。
34. ３４．上記組成物が、インフルエンザウイルスタンパク質に由来するＣＴＬ反応 性ペプチドからなる、請求の範囲第３２項に記載の方法。
35. ３５．上記組成物が、センダイウイルスタンパク質に由来するＣＴＬ反応性ペプ チドからなる、請求の範囲第３２項に記載の方法。
36. ３６．上記排出リンパ節が、該組成物の注射部位の近位に位置する請求の範囲第 ２９項に記載の方法。
37. ３７．上記細胞障害性Ｔ細胞の活性化の程度が測定される、請求の範囲第２９項 に記載の方法。
38. ３８．標的タンパク質を表現するＭＨＣ適合細胞を用いて上記細胞の細胞障害活 性を測定することにより、該細胞障害性Ｔ細胞の活性化を測定する請求の範囲第 ２９項に記載の方法。
39. ３９．上記組成物が、ヒトあるいは動物ワクチンに利用される、請求の範囲第２ ９項に記載の方法。
40. ４０．抗体反応の誘発能に関して、上記組成物をさらに試験する、請求の範囲第 ２９項に記載の方法。
41. ４１．下記のステップからなる、細胞障害性Ｔ細胞応答の誘発能に関する組成物 評価方法。 ｉ）候補の組成物の単回投与により動物を免疫感作する。 ｉｉ）該免疫感作動物のリンパ節から細胞障害性Ｔ細胞を回収する。 ｉｉｉ）該細胞障害性Ｔ細胞が組成物によって活性化されたかどうかを決定する 。
42. ４２．特異的にＣＴＬを感作することができる組成物を同定することと、該組成 物を一種あるいは二種類以上の薬理学的に許容できる希釈剤あるいは添加荊と混 合することとからなるワクチンの調製方法において、該組成物同定方法は、次の ステップを含む。 組成物により動物を免疫感作する。 該免疫感作動物の排出リンパ節より細胞障害性Ｔ細胞を回収する。 該細胞障害性Ｔ細胞が組成物により括性化されたかどうかを決定する。
43. ４３．上記組成物が１種あるいは複数極の天然タンパク質に由来する１種あるい は複数種のペプチドからなって、該組成物が１種あるいは複数種の該天然タンパ ク質に対して抗体反応を誘発できない、請求の範囲第４２項に記載の方法。
44. ４４．上記組成物が１種あるいは複数種の天然タンパク質に由来する１種あるい は複数種のペプチドからなり、該組成物が、１種あるいは複数種の該天然タンパ ク質に対して、さらに抗体反応を誘発する、請求の範囲第４２項に記載の方法。
45. ４５．下記の方法からなる、選択された組成物に対して特異的に感作された細胞 障害性Ｔ細胞を調製する方法。 ｉ）細胞障害性Ｔ細胞の感作が可能な組成物によって動物を免疫感作する。 ｉｉ）該免疫感作動物の排出リンパ節から細胞障害性Ｔ細胞を回収する。