JPH10503476A - ＤＮＡ損傷剤およびр５３を含有する組成物 - Google Patents

ＤＮＡ損傷剤およびр５３を含有する組成物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞、および特にガン細胞を殺傷することにおいて用いるためのDNA損傷剤または因子と組み合わせた腫瘍抑制遺伝子の使用に関する。腫瘍抑制遺伝子であるp53は、化学療法剤と組み合わせて、インビトロおよびインビボの両方で組換えアデノウイルス仲介遺伝子転移により送達された。処置細胞は、特異的なDNAの断片化とともにアポトーシスをうけた。腫瘍へのp53アデノウイルス構築物の直接皮下注入、続くDNA損傷剤であるシスプラチンの腹腔内投与は、腫瘍の大規模なアポトーシス性の破壊を誘導した。本発明はまた、ヒトのガンを処置するために複製能欠損野生型p53アデノウイルスを用いる遺伝子置換とDNA損傷薬とを組合せるレジメの臨床適用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 DNA損傷剤およびp53を含有する組成物 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、一般的に、化学療法介入の改善のための新規な戦略の分野に関する 。他の局面において、本発明は、DNA損傷剤の効力と腫瘍抑制因子(suppressor) の組合せ送達とを組み合せる新規な方法および新規な組成物を提供する。DNA損 傷因子と腫瘍抑制因子遺伝子の異種発現との組合せは、個々の成分の作用を上回 る明確な相乗作用を導く。 ２．関連技術の説明 放射線療法、外科手術、および化学療法を含むガンに対する現在の処置方法は 、有効性が限られていることが知られている。肺ガン単独で、合衆国において年 間、140,000名を上回る人々が死亡している。現在、肺ガンの年齢調整死亡率は 、女性の乳ガンの死亡率を上回る。喫煙減少化プログラムの実行により喫煙の割 合は減少しているが、肺ガン死亡率は、21世紀に向かって高いままである。肺ガ ンに対する新しい治療の合理的な開発は、分子レベルでの肺ガンの生物学の理解 に依存する。 種々のガンが、少なくとも一部は、１つ以上の遺伝子の過剰発現または１つも しくは複数の異常遺伝子もしくは変異遺伝子の発現のいずれかを生じる遺伝的異 常により引き起こされることは、今や十分に確立されている。例えば、多くの場 合、ガン遺伝子の発現が、ガンを発達させることが知られている。「ガン遺伝子 」は遺伝子的に変化した遺伝子で、この変異した発現産物は、正常な細胞機能ま たは制御をある手段により分断する（Spandidosら、1989）。 現在までに研究されたほとんどのガン遺伝子は、正常細胞遺伝子（すなわち、 「ガン原遺伝子」）のコード領域における変異（ほとんど、点変異）の結果とし て「活性化される」ことが見出されている。この変異により、発現したタンパク 質産物においてアミノ酸置換が生じている。この変化した発現産物は、新生物形 成プロセスに関与する異常な生物学的機能を示す（Travaliら、1990）。このも ととなる変異は、種々の手段により（例えば、化学的変異誘発または電離放射線 により）生じ得る。ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、およびablを含 む多くのガン遺伝子およびガン遺伝子ファミリーが、現在、同定され、そして種 々の程度で特徴付られている（Travaliら、1990；Bishop、1987）。 正常細胞増殖中、増殖促進ガン原遺伝子は、増殖抑制的な腫瘍抑制遺伝子によ り平衡していると考えられる。いくつかの因子が、新生物生成状態をもたらすこ れらの２つの力における不均衡を導き得る。このような１つの因子は、腫瘍抑制 遺伝子における変異である（Weinberg、1991）。 １つの重要な腫瘍抑制遺伝子は、細胞性タンパク質であるp53をコードする遺 伝子である。このタンパク質は、細胞増殖を制御する53kDの核リンタンパク質で ある。p53遺伝子に対する変異および染色体17p（この場に、本遺伝子が位置する ）での対立遺伝子の喪失は、ヒトの悪性腫瘍で同定される最も頻発する変異の１ つである。p53タンパク質は、進化を通じ高度に保存されており、そしてほとん どの正常組織において発現されている。野生型p53は、細胞周期の制御（Mercer 、1992）、転写調節（Fieldsら、1990、およびMietzら、1992）、DNA複製（Wilc ockおよびLane、1991、およびBargonettiら、1991）、およびアポトーシスの誘 導（Yonish-Rouachら、1991、および、Shawら、1992）に関与することが示され ている。 種々の変異p53対立遺伝子は、１塩基の置換が全く異なる増殖調節特性を有し 、そして最終的には悪性腫瘍に導くタンパク質の合成を引き起こすことで知られ ている（Hollsteinら、1991）。実際、p53遺伝子は、一般的なヒトのガンにおい て最も変異の頻度の高い遺伝子であることが分かっており（Hollsteinら、1991 ；Weinberg、1991）、そして喫煙に関連するそれらのガンと特に関連がある（Ho llsteinら,1991；Zakut-Houriら、1985）。胸部腫瘍におけるp53の過剰発現もま た、報告されている（Caseyら、1991）。 ガンのための遺伝子治療の最も魅力的な局面の１つは、p53のような腫瘍抑制 遺伝子の利用に関する。野生型p53を特定の型の乳ガン細胞および肺ガン細胞へ トランスフェクトすることにより、細胞株における増殖抑制制御が回復され得る ことが報告されている（Caseyら、1991；Takahashiら、1992）。DNAトランスフ ェクションは、患者細胞へのDNA導入のために実用的な手段でないが、これらの 結果は、p53遺伝子送達のための改善された手段が開発され得る場合、変異p53遺 伝子を有するガン細胞への野生株p53の供給が、効果的な処置方法であり得るこ とを示し得る。 腫瘍抑制のための遺伝子治療に適用可能な遺伝子送達系は、現在、研究中であ り、そして開発中である。ウィルスに基づく遺伝子転移媒体は、特に興味深い。 なぜなら、それは、実際の生存細胞の感染におけるウィルスの効率、ウィルスの 遺伝物質自体が転移されるプロセスのためである。この点に関して、例えば種々 の遺伝子を送達するために遺伝子操作されたレトロウィルスベクターの生成にお いて、いくつかの進展がなされた。しかし、遺伝子治療のためにレトロウィルス ベクターを使用することで、大きな問題が想起される。なぜなら、これらの感染 効率は標的細胞におけるレトロウィルスレセプターの利用性に依存し、それらを 濃縮して精製することは困難であり、そして複製細胞中に効率よく組み込むだけ であるからである。 化学療法薬に対する腫瘍細胞の耐性は、臨床ガン学における大きな問題である 。NSCLCは、少なくとも80％の肺ガン患者に報告される；しかし、NSCLCを有する 患者は、化学療法に対して一般的に応答しない（Doyle、1993）。現在のガン研 究の目標の１つは、遺伝子産物と化学療法薬との間の相互作用を研究することに より、ガンのための遺伝子置換治療の効力を改善する方法を見出すことである。 単純ヘルペスチミジンキナーゼ（HS-tK）遺伝子は、レトロウィルスベクター系 により脳腫瘍に送達させた場合、抗ウィルス薬剤のガンシクロビルに対する感受 性を首尾良く誘導した（Culverら、1992）。HS-tK遺伝子産物は外来ウィルスの 酵素であるが、wt-p53タンパク質は正常組織において発現する。このことは、wt -p53中の変化による化学耐性の調節が、内在性の遺伝的プログラムにより仲介さ れる経路を使用する代替アプローチであることを示唆する。 アデノウィルス系は、インビボでの遺伝子送達のための潜在的な利点を有する 。例えば、高力価のウィルスの容易な生産、高い感染効率、および多くの型の細 胞 に対する感染性である。しかし、導入した遺伝子の発現の安定性および期間は、 依然として議論されている。化学療法薬に対して感受性の細胞におけるp53レベ ルの増加が、DNA損傷刺激剤後の６時間以内に生じ得る（Fritscheら、1993、Zha nら、1993）。しかし、刺激剤を取り除くと、増加したp53 DNA結合活性は４時間 の経過にわたって逆転され得る。従って、高レベルのp53発現は、薬物曝露の休 止後でも維持され得る。wt-p53タンパク質のAd-p53による発現は、感染後３日目 でピークに達し（内在性の野生型よりも14倍多い）、そして９日までに低いレベ ルに減少する（Zhangら、1993）。このことは、一時的に高いレベルのwt-p53発 現が、ガン細胞において細胞障害プログラムを開始するに十分であることを示唆 する。 p53は、ヒト肺ガン細胞において化学感受性の決定因子として重要な役割を有 する。外科手術、化学療法、および放射線療法を含む種々の処置プロトコルをヒ トNSCLCに対して試みたが、長期の生存率は満足していない。必要とされるのは 、組み合わせ治療であり、単独で、または原発性腫瘍の切除後の局所的再発を防 止するための有効なアジュバント処置として、または薬物耐性の原発性の、転移 性の、もしくは局所的な再発性の肺ガンにおける病変内注射によりなされ得る処 置として使用される。組成物および方法は、ガンの処置のための新規な組成物の 臨床上の適用性について開発し、探索し、そして改善することもまた必要とされ る。さらに、これらの方法および組成物は、インビボの環境においてその価値を 明らかにしなければならない。 発明の要旨 本発明は、腫瘍抑制遺伝子またはタンパク質とDNA損傷薬剤または因子との効 果を組み合わせることにより細胞を殺傷するのに用いるための改善された治療調 製物の必要性を扱う。本発明はまた、標的細胞においてp53のような野生型腫瘍 抑制遺伝子の発現を促進するためおよびDNA損傷を誘導する薬剤または因子を送 達するために、ウイルス仲介遺伝子転移を用いる組成物および方法を含む、組成 物および方法を提供する。本発明者らは驚くべきことに、本明細書中に開示した 組成物を用いて、非常に多くの標的細胞においてプログラム細胞死（アポトーシ スとしても知られる）を誘導し得ることを見出した。 本発明を用いて、本発明者らは細胞の増殖、特に腫瘍細胞の増殖の制御におい て著しい効果を示した。腫瘍細胞形成および増殖（「形質転換」としても知られ る）は、細胞分裂を制御する能力を失った細胞の形成および増殖、つまり、それ らがガン性であることを記載する。多くの異なるタイプの形質転換された細胞（ 例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、および広範な種類の固体腫瘍など）が、本発 明の方法および組成物の潜在的な標的であることが想像される。悪性の細胞増殖 を有する任意の組織が標的であり得るが、肺組織および乳房組織が好ましい標的 である。本発明者らは、p53発現組換え送達ベクターを、DNA損傷剤とともに用い た場合に細胞の増殖速度を顕著に減少し得たことを本明細書において開示する。 本発明は、特定の実施態様において、細胞（単数および複数）(例えば、悪性 細胞(単数および複数))を殺傷するための方法および組成物であって、細胞を殺 傷するに有効な組合せ量でp53タンパク質または遺伝子および１以上のDNA損傷剤 に細胞または細胞集団を接触させるまたは曝すことによる方法または組成物を提 供する。本発明を用いて殺傷され得る細胞は、例えば、非所望だが良性の細胞（ 例えば、良性の前立腺過形成細胞または過剰活動性甲状腺細胞）；自己免疫疾患 関連細胞（例えば、関節炎に関する抗体を産生するＢ細胞、狼蒼、重症筋無力症 、扁平上皮化生、形成異常など）を包含する。一般に全ての非所望の細胞を殺傷 するために適用可能であるが、本発明は悪性細胞の殺傷に格別な有用性を有する 。「悪性細胞」は、細胞分裂周期を制御する能力を失った細胞として定義され、 「形質転換された」または「ガン性の」表現型を導く。 悪性細胞または転移細胞のような細胞を本発明の方法および組成物を用いて殺 傷するために、一般に細胞を殺傷するに有効な組合せ量でp53タンパク質または 遺伝子および少なくとも１つのDNA損傷剤と「標的」細胞を接触させる。このプ ロセスは、細胞をp53タンパク質または遺伝子およびDNA損傷剤または因子（単数 または複数）と同時に接触させる工程を含み得る。これは、細胞を両方の薬剤を 含む単一の組成物または薬理学的処方物と接触させることにより、または細胞を ２つの異なる組成物または処方物（ここで、一方の組成物はp53タンパク質また は遺伝子を含み、他方はDNA損傷剤を含む）と同時に接触させることにより達成 され得る。 もちろん、標的細胞をまずDNA損傷剤に曝し、次いでp53タンパク質または遺伝 子と接触させ得ること、あるいはその逆もまた想像され得る。しかし、DNA損傷 因子およびp53が細胞に別々に適用される実施態様においては、一般に、DNA損傷 剤およびp53がなお有利に組み合わせた効果を細胞に発揮し得るように、有効期 間がそれぞれの送達時の間に失効しないことを確実にする。このような例では、 両方の薬剤とそれぞれ約12〜24時間以内に、より好ましくはそれぞれが約６〜12 時間以内に、最も好ましくは約12時間のみの遅延時間で、細胞を接触させること を意図する。 用語「接触する」および「曝す」は、細胞に適用される場合、本明細書におい ては腫瘍抑制遺伝子またはタンパク質（例えば、p53）およびDNA損傷剤または因 子が、標的細胞に送達されるまたは標的細胞と直接並置されるプロセスを記載す るために用いられる。細胞の殺傷を達成するために、両方の薬剤は細胞を殺傷す る（すなわち、プログラム細胞死またはアポトーシスを誘導する）に有効な組合 せ量で細胞に送達される。用語「殺傷」、「プログラム細胞死」および「アポト ーシス」は、本明細書において標的細胞の死を導く一連の細胞内事象を記載する ために互換性で用いられる。細胞死のプロセスは、例えば、細胞核退化および核 DNA断片化を導く細胞内プロテアーゼおよびヌクレアーゼの活性化を伴う。種々 の細胞内分子が相互作用して細胞死を達成する正確な機構の理解は、本発明を実 施するために必要ではない。 DNA損傷剤および因子は、細胞に適用された場合にDNA損傷を誘導する任意の化 合物または処置方法として本明細書において定義される。このような薬剤および 因子は、DNA損傷を誘導する放射線および電波（例えば、γ線照射、Ｘ線、UV照 射、マイクロ波、電子放出など）を包含する。種々の化合物（「化学療法剤」と しても記載される）は、DNA損傷を誘導するように機能する。それらの全てが、 本明細書に開示した組み合わせ処置方法において有用であることが意図される。 使用が意図される化学療法剤は、例えば、アドリアマイシン、5-フルオロウラシ ル(5FU)、エトポシド(VP-16)、カンプトセシン、アクチノマイシンＤ、マイトマ イシンＣ、シスプラチン(CDDP)、および過酸化水素までも包含する。本発明はま た、放射ベースまたは実際の化合物のいずれであろうとも、１以上のDNA損傷剤 の組合せの使用（例えば、Ｘ線とシスプラチンとの使用またはシスプラチンとエ トポシドとの使用）もまた包含する。１実施態様では、p53タンパク質または遺 伝子と組み合わせたシスプラチンの使用が、この化合物として特に好ましい。 細胞内の機能的なp53タンパク質レベルの増加をもたらす方法であれば、細胞 をp53と接触させるために任意の方法もまた用いられ得る。本方法は、細胞へのp 53タンパク質の直接送達、およびp53をコードする遺伝子またはDNAセグメント（ この遺伝子は、細胞内でのp53の発現および生成を導く）の送達の両方を包含す る。タンパク質送達はタンパク質分解および細胞への低い取り込みのような障害 を受けるために、p53タンパク質を発現する組換えベクターの使用が特に利点を 提供することを意図する。 広範な種々の組換えプラスミドおよびベクターは、p53タンパク質を発現する ように遺伝子操作され得、そしてp53を細胞に送達するように用いられ得る。こ れらは、例えば、細胞へ遺伝物質を直接転移するための裸のDNAおよびp53プラス ミド(Wolfeら、1990)；リポソーム(Ledleyら、1987)またはウイルスエンベロー プレセプタータンパク質を含むプロテオリポソーム(Nicolauら、1983)に閉じこ めたp53コードDNAの処方物；およびポリリジン糖タンパク質キャリア複合体に結 合したp53コードDNAの使用を包含する。 p53を発現するように遺伝子操作された組換えウイルスの使用もまた想像され る。Miller(Miller、1992)に記載のように種々のウイルスベクター、例えば、レ トロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（米国特許第5,288,641号、これ は本明細書中に参考として援用されている）、サイトメガロウイルスなどが用い られ得、これは、米国特許第5,139,941号（これは本明細書中に参考として援用 されている）に記載のもののような組換えアデノ随伴ウイルス（AAVベクター） 、および特に組換えアデノウイルスベクターが用いられ得る。複製能欠損感染性 ウイルスの調製のための技術は、Ghosh-ChoudhuryおよびGraham(1987); McGrory ら(1988); およびGluzmanら（1982）（これらはそれぞれ本明細書中に参考とし て援用されている）により例示されるように当該分野では周知である。 本発明に従って細胞を殺傷するために、一般に、細胞を殺傷するに有効な組合 せ量でp53タンパク質または遺伝子およびDNA損傷剤と細胞を接触させる。用語「 細胞を殺傷するに有効な組合せ量」は、p53およびDNA損傷剤の量が、細胞内で組 合せた場合に、細胞が誘導されてアポトーシスをうけるに充分な量であることを 意味する。全ての実施態様において必要なわけではないが、p53およびDNA損傷剤 の組合せ有効量は、好ましくはいずれかの成分単独の使用よりも有意に多い細胞 死を誘導する量であり、そして最も好ましくは組合せ有効量は、いずれかの成分 単独を用いて観測される効果と比較して相乗作用的に細胞死を誘導する量である 。 多くのインビトロでのパラメーターが、本発明の組成物および方法により生じ る効果を決定するために用いられ得る。これらのパラメーターは、例えば、本明 細書に記載の組成物に曝す前後の正味の細胞数の観測、ならびに形成される多細 胞腫瘍球様体のサイズ（例えば、組織培養で形成されたそれらのコロニー）を包 含する。インビトロでの細胞殺傷は、本開示の実施例７において特に示される。 あるいは、プログラム細胞死をうける細胞の指標となるパラメーターを測定し得 る。このパラメーターは、例えば、細胞ゲノムDNAのヌクレオソームサイズの断 片への断片化であり、これは、一般に、断片をアガロースゲル電気泳動により分 離する工程、DNAを染色する工程、およびDNAとDNAサイズラダーとを比較する工 程により同定される。ヌクレオソームサイズの断片は、約200塩基対の塩基単位 を有する単量体および多量体の漸進的な段またはラダーとして同定される。 同様に、「治療有効量」は、組み合わせて動物に投与された場合、その動物内 で細胞を殺傷するに有効であるp53タンパク質または遺伝子およびDNA損傷剤の量 である。これは特に、腫瘍を有する動物またはヒト被験体内でのガン細胞（例え ば、肺ガン細胞、乳ガン細胞、または大腸ガン細胞）の殺傷により証明される。 従って、「治療的に有効な併用」は、一般にいずれかの成分単独より多くの細胞 を殺傷するように機能するp53およびDNA損傷剤の組合せ量であり、そして好まし くは腫瘍負荷に相乗作用的な減少をもたらす組合せ量である。 従って、細胞死の特定のインビボまたはエキソビボのパラメーターの研究もま た、本発明の組成物および方法の有効性を評価するために効果的な手段である。 例えば、腫瘍形成性の阻害に対する効果を観測する。これは、病理分野の当業者 に公知のように、凍結組織切片のTdT発現によりまたは他の染色方法および標的 抗原の使用により測定される。当然、腫瘍の大きさ、増殖、および生存力を決定 する他の手段もまた、標的細胞の殺傷を評価するために用いられ得る。特に、ヒ トガン細胞が動物の中に局在するモデル系を含む、種々の動物ガンモデル系にお いて効果を評価し得る。ガンの動物モデルは、AIDSの動物モデルと異なり、ヒト の処置レジメについて非常に予測的であることが知られている(Rothら編(1989)) 。予測的な動物モデルの１つの例示的な実施態様は、ヒト小細胞肺ガン細胞(H35 8細胞)が皮下で増殖する動物モデルである。この系を用いて、本発明者らは、化 学療法剤の同時投与とともに腫瘍内に注入したp53を有するアデノウイルスが、 驚くほど有効な腫瘍の減少を生じることを示した。 p53タンパク質を細胞に送達する特に好ましい方法は、細胞を組換えアデノウ イルスビリオンまたは粒子と接触させることである。この組換えアデノウイルス ビリオンまたは粒子は、所定の細胞タイプにおいてp53の発現を導き得るプロモ ーターの制御下に位置するp53発現領域を含む組換えアデノウイルスベクターを 含む。 ベクター中のp53発現領域は、ゲノム配列を含み得るが、しかし簡略化のため に、一般に、当該分野で容易に入手できかつより容易に操作されるp53cDNA配列 を用いることが好ましいことを意図する。p53発現単位およびプロモーター領域 を含むことに加えて、ベクターはまた、一般に、SV40初期遺伝子、またはプロタ ミン遺伝子、ポリアデニル化シグナルなどのようなポリアデニル化シグナルを含 む。 好ましい実施態様において、p53発現領域を強力な構成的プロモーター(例えば 、CMVプロモーター、ウイルスLTR、RSV、またはSV40プロモーター、または哺乳 動物細胞において高レベルで発現される遺伝子に付随するプロモーター(例えば 、伸長因子１またはアクチンプロモーター))の制御下に位置させることを所望す ることが意図される。このような変形物は全て、本発明において有用であると想 像される。現在、特に好ましいプロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)IE プロモーターである。 p53遺伝子またはcDNAは、本発明に従って、p53コード配列をウイルスゲノムに 単に挿入または付加することにより組換えアデノウイルスに導入され得る。しか し、好ましいアデノウイルスは、複製および／またはパッケージングに必須のウ イルス遺伝子が、アデノウイルスベクター構築物から欠損した複製能欠損ウイル スであり、p53発現領域をその位置に導入させ得る。複製に必須（例えば、E1A、 E1B、E2、およびE4）であるかまたは非必須（例えば、E3）のいずれであっても 、任意の遺伝子が、欠失しそしてp53で置換され得る。特に好ましいのは、図１ のゲノム構造により例示するように、アデノウイルスベクターのE1AおよびE1B領 域が欠失し、そしてその場所にp53発現領域が導入されているベクターおよびビ リオンである。 複製能欠損アデノウイルスを調製するための技術は、Ghosh-ChoudhuryおよびG raham(1987); McGroryら(1988); およびGluzmanら（各々は、本明細書中に参考 として援用されている）により例示されるように、当該分野で周知である。存在 し得る任意の複製能欠損を相補する限り、種々の細胞株が組換えアデノウイルス の増殖のために使用され得ることもまた周知である。好ましい細胞株は、ヒト29 3細胞株であるが、複製可能な他の細胞株（すなわち、好ましい場合、E1Aおよび E1Bを発現する）も用いられ得る。さらに、細胞はそれらのウイルスストックを 得るためにプラスチックディッシュ上または懸濁培養中のいずれかで増殖させ得 る。 本発明は、E1欠損ウイルスおよびE1発現細胞のみに限定されない。実際、ウイ ルスおよび宿主細胞の他の相補的な組み合わせが、本発明に関して用いられ得る 。機能的なE2を欠くウイルスおよびE2発現細胞が使用され得、機能的E4を欠くウ イルスおよびE4発現細胞なども用いられ得る。複製に必須でない遺伝子が欠失お よび置換された場合（例えば、E3遺伝子）、この欠損は宿主細胞により特に相補 される必要はない。 アデノウイルスベクターを、p53を発現するように遺伝子操作することを必要 とする以外、最初のアデノウイルスの性質は本発明の好結果の実施に重大ではな いと考えられる。アデノウイルスは、42の異なる公知の血清型またはサブグルー プＡ〜Ｆのいずれかであり得る。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発 明の方法に使用するための条件的複製能欠損アデノウイルスベクターを得るため に好ましい出発材料である。これはなぜなら、アデノウイルス５型は、かなりの 量の生化学的および遺伝的情報が知られており、かつアデノウイルスをベクター として用いるほとんどの構築のために歴史的に用いられてきたヒトアデノウイル スだからである。 本発明の方法および組成物は、インビトロおよびインビボの両方で細胞（単数 および複数）を殺傷するために同等に適している。殺傷される細胞が動物内に位 置する場合（例えば、肺ガン細胞、乳ガン細胞、または大腸ガン、あるいはp53 変異を有する他の細胞）、p53タンパク質または遺伝子およびDNA損傷剤は両方と も、薬理学的に受容可能な形態で動物に投与される。用語「薬理学的に受容可能 な形態」は、本明細書中で用いられるように、動物に投与され得る任意の組成物 の形態、および動物に照射を接触させる形態（すなわち、動物体のある領域が、 例えば、γ線照射、Ｘ線、UV照射、マイクロ波、電子放出などで照射されるよう に）の両方の形態をいう。DNA損傷照射およびDNA損傷波の使用は、放射線療法の 当業者には公知である。 本発明はまた、ガンを処置するための有利な方法を提供する。この方法は、一 般に、ガンを有する動物またはヒト患者に、p53タンパク質または遺伝子およびD NA損傷剤の治療的に有効な組み合わせを投与する工程を含む。これは、組換えウ イルス、特に腫瘍の細胞中でp53を発現し得るベクターを有するアデノウイルス を用いて達成され得る。p53遺伝子送達組成物は、一般に、しばしば腫瘍と緊密 に接触して、薬学的に受容可能な組成物の形態で動物に投与され得る。組換えウ イルス内に収容したような治療有効量のp53遺伝子の腫瘍部位への病変内直接注 入は、好ましい方法の１つである。しかし、他の非経口投与経路（例えば、静脈 注射、経皮注射、内視鏡、または皮下注射）もまた包含される。 本発明に従ってガンを処置するには、腫瘍細胞をp53タンパク質または遺伝子 に加えてDNA損傷剤に接触させる。これは、局在する腫瘍部位をDNA損傷放射線（ 例えば、Ｘ線、UV光、γ線、またはマイクロ波までも）で照射することにより達 成され得る。あるいは、腫瘍細胞は、動物にDNA損傷化合物を含む治療有効量の 薬学的組成物を投与することによりDNA損傷剤と接触し得る。この化合物は、例 えば、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル、エトポシド、カンプトセシン、 アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、またはより好ましくはシスプラチンで ある。DNA損傷剤は、上記のようにp53タンパク質、遺伝子、または遺伝子送達系 と組み合わせることにより、組み合わせた治療組成物またはキットとして調製さ れ、そして使用され得る。 本発明の驚くべき成功は、シスプラチンと組み合わせてAd5CMV-p53ウイルスを 用いることにより、ヌードマウスモデルを用いる研究において十分な結果が得ら れたという発見により証明される。組み合わせたウイルスDNA損傷治療レジメは 、H358細胞（通常、著しい腫瘍集塊を生成する細胞）の腫瘍形成性を著しく阻害 した。肺ガン細胞の腫瘍形成性は、Ad5CMV-p53による処置を介して阻害されたが 、しかしルシフェラーゼを発現するコントロールウイルスによっては阻害されな かった。これは、DNA損傷剤と組み合わせたp53タンパク質が大きな治療効力を有 することを示す。 DNA発現構築物を含む化学療法処方物を真核細胞へ送達するための多くの方法 が、当該分野で公知である。本開示に照らしてみると、当業者は、DNA損傷剤お よびp53タンパク質または遺伝子の両方を多くの異なる有効な方法で細胞に送達 し得る。 DNAのインビボ送達のために、本発明者らは、任意の遺伝子送達系（例えば、 ウイルス仲介トランスフェクションおよびリポソーム仲介トランスフェクション ）の使用を想像する。本明細書で使用するように、用語「トランスフェクション 」は、送達系（例えば、アデノウイルス法、AAV法、レトロウイルス法、または プラスミド送達遺伝子転移法）を用いての真核細胞へのDNAの標的化送達を記載 するために用いられる。ウイルス遺伝子送達の特異性は、遺伝子を特定の標的細 胞に優先的に導くために選択され得る。これは、例えば、特定の細胞タイプに感 染し得るウイルスを用いることによる。当然、異なるウイルス宿主範囲が遺伝子 転移について選択されるウイルス、ならびに所定の悪性細胞タイプを殺傷するた めに発現される有望な腫瘍抑制遺伝子を指図する。 種々の手段を通して（例えば、静脈注射および皮下注射などの非経口送達方法 を用いることにより）DNA損傷化学療法剤を提供し得るということもまた想像さ れる。このような方法は、薬物送達分野の当業者には公知であり、そして本明細 書の薬学的調製物および処置に関する節においてさらに記載される。 インビトロ遺伝子送達のために、例えば、リン酸カルシウム仲介トランスフェ クションまたは硫酸デキストラン仲介トランスフェクション；エレクトロポレー ション；ガラス投射物ターゲッティング(glass projectile targeting)などの種 々の方法が用いられ得る。これらの方法は、当業者に公知であり、正確な組成物 および実施は、本開示に照らしてみれば明らかである。 他の実施態様は、DNA損傷剤（例えば、シスプラチン）と組み合わせてp53タン パク質または遺伝子を含む薬学的処方物を含む組成物に関する。このような組成 物において、p53は、動物細胞においてp53タンパク質を発現し得るDNAセグメン ト、組換えベクター、または組換えウイルスの形態であり得る。アデノウイルス 粒子のような組換えウイルス遺伝子送達系を含むものを含むこれらの組成物は、 薬理学的に受容可能な溶液または緩衝液に分散させることによりインビボ投与の ために処方され得る。好ましい薬理学的に受容可能な溶液は、リン酸塩、乳酸塩 、Trisなどで緩衝化した中性生理食塩水溶液を包含する。 もちろん、ウイルス送達系を用いて、ベクター構築物をうける細胞内、動物内 、または個体内で不都合な反応を生じないように、欠陥のある干渉ウイルス粒子 またはエンドトキシンおよび他の発熱物質のような非所望の混入物が本質的にな いようにするために、ビリオンを十分に精製することが望ましい。ベクターの好 ましい精製手段は、塩化セシウム勾配遠心のような浮遊密度勾配の使用を含む。 本発明の好ましい薬学的組成物は、薬理学的に受容可能な溶液または緩衝液の 中に、化学療法DNA損傷剤と組み合わせて、p53タンパク質、またはより好ましく はp53遺伝子を含むものである。例示的な化学療法剤は、アドリアマイシン、5- フルオロウラシル、カンプトセシン、アクチノマイシンＤ、過酸化水素、マイト マイシンＣ、シスプラチン(CDDP)、およびエトポシド(VP-16)であり、シスプラ チンの使用が特に好ましい。 本発明のさらに別の実施態様は、悪性細胞のような細胞の殺傷に使用するため のキットであり、ガンの処置に使用するための治療キットに処方され得る。本発 明のキットは一般に、適切な容器手段、動物細胞においてp53タンパク質を発現 し得る組換えベクターの薬学的処方物、およびDNA損傷剤の薬学的処方物を含む 。 組換えベクターおよびDNA損傷剤は、単一の容器内に存在し得るか、またはこれ らの成分は、異なるまたは分かれた容器手段中に提供され得る。好ましい実施態 様において、組換えベクターは、アデノウイルス粒子内に存在する組換えp53発 現アデノウイルスベクターであり、そしてDNA損傷剤はシスプラチンである。 キットの成分は、好ましくは液体溶液、または乾燥粉末として提供される。成 分が液体溶液で提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好 ましい。試薬または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は適切な溶媒の 添加により再構成され得る。溶媒もまた別の容器手段において提供され得ること が想像される。 図面の簡単な説明 以下の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに 示すために含められる。本発明は、１つ以上のこれらの図面を本明細書中に提供 される具体的な実施態様の詳細な説明と組合わせて参照することにより、さらに 理解され得る。 図１。組換えp53アデノウイルスの作製のスキーム。p53発現カセットを、pXCJ L.1のXbaI部位とClaI部位との間に挿入した。p53発現ベクター(pEC53)および組 換えプラスミドpJM17を293細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクト された細胞を、細胞障害性効果が始まるまで培地中で維持した。プロテイナーゼ Ｋおよびおよびフェノール抽出で処理したCPE上清から調製したDNAテンプレート を用いるDNAのPCR分析による新たに作製したp53組換えアデノウイルス(Ad5CMV-p 53)の同定。 図２Ａ。Ad5CMV-p53 DNAの構造分析のために使用されるマップ。p53発現カセ ット、PCRプライマー、および制限部位の位置を有する、Ad5CMV-p53ゲノムDNAの マップ。ゲノムサイズは約35.4kbであり、100のマップユニット(map unit)に分 割される(１m.u.＝0.35kb)。Ad5ゲノムのE1領域(1.3〜9.2 m.u.)を置換したp53 発現カセット。プライマー１は、ヒトCMV主要IE遺伝子プロモーターの下流の第 １イントロン中に位置する。プライマー２は、SV40初期ポリアデニル化シグナル 中に位置する。両方のプライマーは、両末端でp53cDNA挿入物から15〜20bp離れ て、1.4kbのPCR産物を規定する。プライマー３およびプライマー４は、それぞれ Ad5ゲノムの11m.u.および13.4m.u.に位置し、0.86kbのウイルスゲノム特異的PCR 産物を規定する。 図２Ｂ。PCR産物のアガロースゲル分析。それぞれの反応において、1.4kb(p53 )および0.86kb(Ad5)DNA断片を規定する２組のプライマーを使用した。それぞれ の反応において使用したDNAテンプレートは、pEC53プラスミド(レーン１)、Ad5/ RSV/GL2 DNA(レーン２)、DNAなし(レーン３)、およびAd5CMV-p53DNA(レーン４) であった。(M)と標示されたレーンは分子量マーカーに対応する。 図２C．Ad5CMV-p53 DNAの制限マッピング。CsCl勾配精製したAd5CMV-p53 DNA サンプルを、それぞれ酵素なし(U)、HindIII(H)、BamHI(B)、EcoRI(E)、およびC laI(C)で消化し、そして１％アガロースゲルで分析した。(M)と標示されたレー ンは分子量マーカーである。 図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄ。組換えアデノウイルスによる293にお ける細胞障害性効果の観察。図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄは、293細胞 の一連の相対比画像(×400)である。図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄは、 １ページの図の４つのパネルである。図３Ａはトランスフェクション前であり； 図３Ｂはトランスフェクション後12日目のネガティブコントロールであり；図３ Ｃはトランスフェクション後12日目のCPEの開始である；図３Ｄは、トランスフ ェクション後14日目のCPEの完了である。 図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄ。組換えアデノウイルスに感染した細 胞の免疫組織学。図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは、一連のH358細胞の 免疫組織学的画像である。図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは、１ページ の図の４つのパネルである。H358細胞におけるAd5CMV-p53の感染性。H358細胞を 、50PFU/細胞で24時間、Ad5CMV-p53またはAd5/RSV/GL2で感染させた。培地単独 を偽感染として用いた。感染細胞を免疫染色により分析した。図４Ａは、抗p53 抗体でプローブした偽感染である。図４Ｂは、Ad5/RSV/GL2コントロールで感染 させ、そして抗p53抗体でプローブした細胞である。図４Ｃは、非関連抗体(MOPC -21)でプローブしたAd5CMV-p53感染細胞である。図４Ｄは、抗p53抗体でプロー ブしたAd5CMV-p53感染細胞である。使用した抗p53抗体はPab 1801であり、そし て 染色のためにアビジン-ビオチン法を用いた。 図５Ａ。H358細胞における外因性p53の発現の相対的なレベルを比較する、ク マシーブルー染色したSDS-PAGEゲル。30PFU/細胞でAd5CMV-p53またはAd5/RSV/GL 2で感染させたH358細胞サンプルを、感染後24時間および72時間で調製した。SDS -PAGE分析のクマシーブルー染色は、載せられたタンパク質サンプルの相対的な 量を示す。レーン１およびレーン４は、Ad5/RSV/GL2感染細胞のサンプルを含む 。レーン２およびレーン３は、感染後24時間でAd5CMV-p53の２つの個々のストッ クで感染させた細胞のサンプルを含む。レーン５およびレーン６は、感染後72時 間で採集したAd5CMV-p53感染細胞サンプルである。レーン７は、感染後72時間の 偽感染H358サンプルである。レーンMは、kDa単位のあらかじめ染色された分子量 マーカーである(GIBCO-BRL)。 図５Ｂ．図５ＡにおけるSDS-PAGEと同一のレーン設定のゲルのウエスタンブロ ット分析。p53の発現の相対的なレベルを抗p53を用いるウエスタンブロッティン グにより分析した。使用した一次抗体は、p53タンパク質に対するモノクローナ ル抗体(PAb 1801，Oncogene Science Inc.)およびβ-アクチンに対するモノクロ ーナル抗体(Amersham Inc.)であった。HRP結合二次抗体およびECL発色剤は、Ame rsham Inc.製であった。ウエスタンブロッティングによるウイルス感染H358細胞 。図５Bのウエスタンブロットは、図５Ａと等価な構成およびオーダーを有する 。 図６．ウエスタンブロッティングにより測定したp53発現の時間経過。複数の ディッシュのH358細胞を10PFU/細胞でAd5CMV-p53で感染させた。細胞溶解物を感 染後の示された時間で調製した。ウエスタンブロッティングを抗p53抗体および 抗アクチン抗体で同時にプローブした。「Ｃ」と指定されるレーンはネガティブ コントロールを表す。ヒストグラムは、デンシトメーターにより測定されたp53 の相対的量を表す。 図７Ａ．ウイルス感染ヒト肺ガン細胞の細胞株H358の増殖曲線。細胞を１ディ ッシュ(60mm)当たり105細胞で、そして１細胞株あたり６ディッシュを接種した 。24時間後、細胞を10 m.o.i(感染多重度、すなわちPFU/細胞)でAd5CMV-p53また はAd5/RSV/GL2で感染させた。感染後、６日間毎日細胞を計数した。増殖曲線は 、４つの異なる研究から得たデータを表す。 図７Ｂ．ウイルス感染ヒト肺ガン細胞の細胞株H322の増殖曲線。細胞を１ディ ッシュ(60mm)当たり105細胞で、そして１細胞株あたり６ディッシュを接種した 。24時間後、細胞を、10 m.o.i(感染多重度、すなわちPFU/細胞)でAd5CMV-p53ま たはAd5/RSV/GL2で感染させた。感染後、６日間毎日細胞を計数した。増殖曲線 は、４つの異なる研究から得られたデータを表す。 図７Ｃ．ウイルス感染ヒト肺ガン細胞の細胞株H460の増殖曲線。細胞を１ディ ッシュ(60mm)当たり105細胞で、そして１細胞株あたり６ディッシュを接種した 。24時間後、細胞を、10 m.o.i(感染多重度、すなわちPFU/細胞)でAd5CMV-p53ま たはAd5/RSV/GL2で感染させた。感染後、６日間毎日細胞を計数した。増殖曲線 は、４つの異なる研究から得られたデータを表す。 図８．正常位の肺ガンモデルにおけるAd5CMV-p53の試験のフローチャート。H2 26Br細胞およびウイルスで接種したヌードマウスの処置用量および処置スケジュ ールをフローチャートに要約する。 図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、および図９Ｄ。処置したマウスおよびコントロール マウス由来の肺および縦腔洞切開のサンプル。図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、および 図９Ｄは、４つのパネルの１つの図である。マウスを処置後６週間で屠殺した。 肺および縦腔洞組織を腫瘍形成の評価のために切開した。図９Ａは、正常ヌード マウス由来の縦腔洞ブロックのサンプルである；図９Ｂ，ベヒクル(PBS)処置マ ウス由来の縦腔洞ブロックのサンプルである；図９Ｃは、Ad5CMV-p53処置マウス 由来の縦腔洞ブロックのサンプルである；図９Ｄは、Ad5/RSV/GL-2処置マウス由 来の縦腔洞サンプルである。矢印は腫瘍塊を示す。 図10Ａ．H358親細胞、Ad-Luc感染H358細胞およびAd-p53感染H358細胞の増殖速 度におけるCDDPに対する継続曝露の効果。H358細胞(1.5×105細胞/ウェル)を２ 連で24ウェルプレートに播いた。24時間後、100μlの培地、Ad-Lucウイルススト ック(108PFU/ml)またはAd-p53ウイルスストック(108PFU/ml)を添加した。さらな る24時間のインキュベーション後、ウイルスを含む培地を10μg/mlのCDDPを含有 する新鮮な培地と交換した。 図10Ｂ．H358親細胞、Ad-Luc感染H358細胞、およびAd-p53感染H358細胞の増殖 速度におけるCDDPに対する24時間の曝露。細胞をCDDPに継続して(図10A)または 24時間(図10B)曝露し、続いて薬剤不含有培地中で回収した。付着した単層とし て残る細胞を、トリパンブルーの取り込みを測定することにより５日間にわたっ て生存性について評価した。平均値+/-SEを示す。Ad-p53：CDDP群の５日目の細 胞数は、ＡおよびＢの両方について全ての他の群と顕著に異なる(Studentのt検 定によるp＜0.05)。 図10Ｃ．Ad-p53感染H358細胞の生存性における異なる濃度のCDDPの効果。Ad-L ucウイルスまたはAd-p53ウイルスに対して24時間の曝露後、細胞を０、10、また は100μg/mlのCDDPで24時間処置し、次いで生存性について評価した。 図11Ａ．CDDPに曝露したAd-p53感染H358細胞におけるヌクレオソームDNAの断 片。細胞を感染させ、そして図10に対する説明に記載するように24時間CDDPで処 置した。 図11Ｂ、図11Ｃ、図11Ｄ、図11Ｅ、図11Ｆ、および図11Ｇ。チャンバースライ ド上で増殖させ、Ad-p53で24時間感染させ、さらなる24時間CDDPで処置し、そし てDNA断片のインサイチュ標識のために固定したH358細胞。写真は、CDDP処置し なかったH358親細胞(Ｂ)、またはCDDP処理したH358親細胞(Ｃ)；CDDP処理しなか ったAd-Luc感染細胞(Ｄ)またはCDDP処理したAd-Luc感染細胞(Ｅ)；CDDP処理しな かったAd-p53感染細胞(Ｆ)またはCDDP処理したAd-p53感染細胞(Ｇ)である。矢印 の先は、暗く染色された核断片の例を示す。バー＝100μm。 図12Ａ。H358腫瘍球状体におけるAd-p53感染とCDDP処置との組み合わせの効果 。H358細胞の多細胞腫瘍球状体を以前に記載されたように(Takahashiら(1989)) 調製した。０日目、直径150μm〜200μmの球状体を、24ウェルの寒天でコートし たプレート内に置き、24時間Ad-p53またはAd-Lucに曝露した。１日目、10μg/ml のCDDPを有する培地を、ウイルスを含む培地の除去後に添加した。２日目、24時 間のインキュベーション後、上層(overlay)を１mlの薬剤を含まない新鮮な培地 と交換した。直交する直径を倒立顕微鏡を用いて測定した。相対的な体積変化を 、式a2×b／a1 2×b1(ここで、aおよびbは、それぞれ、球状体の最小直径および 最大直径であり、a1およびb1は１日目の直径である)に従って算出した。Ad-p53/ CDDP球状体の相対的な容量のみがコントロール群(Ctl)より顕著に低い(Student のt検定によるp＜0.05)。 図12Ｂ、図12Ｃ、図12Ｄ、および図12Ｅ。アポトーシスの検出のためのTdTを 用いるインサイチュdUTP標識。３日目にH358球状体を固定し、そして実施例７の 物質および方法に記載するように染色した。(Ｂ)コントロールの非処置球状体、 (Ｃ)CDDPで処置した球状体、(Ｄ)Ad-p53感染球状体、および(Ｅ)CDDPで処置した Ad-p53感染球状体。バー＝100μm。 図13Ａ。腫瘍体積変化により測定した、インビボのAd-p53感染後のCDDPによる アポトーシスの誘導。0.1ml ハンクス平衡化塩溶液中のH358細胞(５×106)をBAL B/cメスnu/nuマウスの右脇腹に皮下注射した。30日後、200μlの培地のみを、ま たはAd-Luc(108PFU/ml)またはAd-p53(108PFU/ml)を含む培地を、５〜６mmの直径 の腫瘍に注射した。腫瘍内注射(100μl)および２つの対向部位での腫瘍周辺注射 (それぞれ50μl)を行った。CDDP(３mg/kg)またはコントロールの生理食塩水を腹 膜内投与した。処置群の区分なく、腫瘍を、２つの直交する直径をカリパスで測 定し、そして断面直径の積の平方根として算定した腫瘍の平均直径を有する球状 形を想定することにより腫瘍の体積を算定した。５匹のマウスを各処置群に用い た。そして平均値+/-SEを示す。データをStudentのt検定を用いて分析した。矢 印は処置の日数を表す。２つの独立した測定を示す。試験１においては５日目以 降p＜0.05であり；試験２においては７日目以降p＜0.05である(Ｂ〜Ｅ)。 図13Ｂ、図13Ｃ、図13Ｄ、および図13Ｅ。TdT媒介ビオチンdUTP標識技術を用 いる組織学的研究。腫瘍を処置開始後５日目に採取し、そして即座にO.C.T.化合 物中に包埋した。凍結した組織を、低温槽で５μm厚に切り出した。切片を１μg /mlのプロテイナーゼＫで処置し、そして図12に対する説明で記載したように染 色した。写真は、(Ｂ)CDDP単独で処置したH358腫瘍、(Ｃ)Ad-p53単独で処置した H358腫瘍、(Ｄ、Ｅ)CDDPと組み合わせたAd-p53で処置したH358腫瘍である。バー ＝0.5mm。全ての動物の取り扱いは、UT M.D．Anderson Institutional AnimalCa re and Use Committeeに従った。 好適な実施態様の詳細な説明 A．肺ガン発生における分子事象 本発明者により行われる研究は、ガンの発生と進行を導く重要な分子事象を同 定した。これにより、本発明者らは、インビボで特定の正常なタンパク質機能を 回復して悪性表現型を抑制し得る新たな方法を開発することが可能になった。 最も一般的な肺ガン組織学(80％)は、非小細胞肺ガン(NSCLC)という用語のも とに分類され、そして、鱗状(squamous)、腺ガン、および未分化大細胞を包含す る。肺ガンの分子生物学に基づく現在の多くのデータは、より一般的でない小細 胞肺ガン(SCLC)の研究に由来する。SCLCは、細胞の神経内分泌の特徴によりNSCL Cと区別し得る；SCLCは化学療法に対し非常に応答的であるが、処置後すぐに再 発する。NSCLCもまた、他の発ガン物質に誘導される上皮ガンのモデルとしての 役割を果たし得る。本研究において開発されたアプローチおよび観察は他の型の 上皮ガンにも適用可能であり得る。 悪性形質転換のプロセスは遺伝的パラダイムにより仲介されるという多くの証 拠が積み重ねられている。ガン細胞において検出される主要な病変は、優性なガ ン遺伝子および腫瘍抑制遺伝子に存在する。優性ガン遺伝子は、シグナル変換お よび転写を包含する重要な正常細胞機能に関与する、ガン原遺伝子と呼ばれるク ラスの遺伝子において変化を有する。形質転換する能力を与える優性なガン遺伝 子における主要な変化として、点変異、転座、再配置、および増幅が挙げられる 。形質転換が起こるためには、腫瘍抑制遺伝子は、変異、欠失またはこれらの組 み合わせによる機能の同型喪失を必要とするようである。いくつかの腫瘍抑制遺 伝子は、転写の調節により増幅の管理における役割を果たすようである。優性な ガン遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の発現の変化は、悪性表現型に寄与する細胞の 特定の特性に影響するようである。 ガン遺伝子仲介形質転換に関係するメカニズムの知識の増加にかかわらず、ガ ン遺伝子およびその産物を特異的に標的とする治療戦略の開発においてはほとん ど進歩がない。最初に、この領域における調査が優性なガン遺伝子に焦点が置か れ、これらが第１に特徴付けされた。DNA仲介遺伝子転移研究により、悪性ヒト 腫瘍由来のDNAの転移後の正常細胞による悪性表現型の獲得が示された。 B．ガンにおけるp53およびp53変異 現在、p53は腫瘍抑制遺伝子として認識されている(Montenarh，1992)。化学的 発ガン、紫外線放射、およびいくつかのウイルス(SV40を含む)により形質転換さ れた多くの細胞において高レベルが見出されている。p53遺伝子は、しばしば、 広範なヒト腫瘍における変異不活性化の標的となり、そして一般的なヒトガンに おいて、もっとも頻繁に変異が起こる遺伝子であることが既に裏付けされている (Mercer，1992)。この遺伝子は、ヒトNSCLCの50％以上において(Hollesteinら、 1991)および他の広範な腫瘍において変異している。 p53遺伝子は、大Ｔ抗原およびE1Bのような宿主タンパク質と複合体を形成し得 る375アミノ酸のリンタンパク質をコードする。このタンパク質は、正常な組織 および細胞で見出されるが、その濃度は、形質転換された細胞または腫瘍組織と 比較して微小である。興味深いことに、野生型p53は細胞の増殖および分裂の調 節において重要なようである。野生型p53の過剰発現は、いくつかの場合におい てヒト腫瘍細胞株において抗増殖的であることが示されている。従って、p53は 、細胞増殖の負のレギュレーターとして作用し得(Weinberg，1991)、そして非制 御細胞増殖を直接抑制し得るか、または間接的に、この増殖を抑制する遺伝子を 活性化し得る。従って、野生型p53の存在または非活性化は、形質転換に寄与す る。しかし、いくつかの研究は、遺伝子の形質転換する潜在能力の完全な発現の ためには、変異p53の存在が必要であることを示す。 野生型p53は、多くの細胞型において中心的に重要な増殖レギュレーターとし て認識されるが、その遺伝子的特性および生化学的特性も、同様の役割を有する ようである。ミスセンス変異はp53遺伝子には一般的であり、そしてガン遺伝子 の形質転換能力に不可欠である。点変異により促進される１つの遺伝的変化によ り発ガン性p53を作製し得る。しかし、他のガン遺伝子と異なり、p53の点変異は 、少なくとも30の異なるコドンにおいて起こることが知られており、しばしば、 同型接合性を減少させることなく細胞表現型のシフトを生み出す優性対立遺伝子 を作製する。さらに、これらの優性ネガティブ対立遺伝子の多くは、生物内で許 容され、そして生殖細胞に伝えられる。種々の変異対立遺伝子は、最小限の機能 障害を起こした対立遺伝子から強力に影響を与える優性ネガティブ対立遺伝子ま での範囲であるようである(Weinberg，1991)。 Caseyと共同研究者らは、２つのヒト乳ガン細胞株への野生型p53をコードする DNAのトランスフェクションにより、このような細胞における増殖抑制制御を回 復することを報告している(Caseyら、1991)。同様の効果がまた、ヒト肺ガン細 胞株への野生型(しかし、変異ではない)p53のトランスフェクションにおいても 示されている(Takahasiら、1992)。p53は変異遺伝子以上に優性であるようであ り、そして変異遺伝子を有する細胞へトランスフェクトされる場合、増殖に対し て選択を行う。トランスフェクトされたp53の正常な発現は、内因性p53を有する 細胞の増殖に影響しない。従って、このような構築物は、有害効果なく正常細胞 により取り込まれ得る。 従って、野生型p53を用いるp53関連ガンの処置により悪性細胞数を減少させる ことが可能である。しかし、上記のような研究は、このような研究の達成からは 程遠い。なぜなら、少なくとも特に、DNAトランスフェクションは、患者の身体 内のガン細胞へDNAを導入するために使用され得ないからである。 C．遺伝子治療技術 今日までに提示された遺伝子治療に対するいくつかの実験的アプローチが存在 するが、各々がその特有の欠点を抱える(Mulligan，1993)。上記のように、目的 の遺伝子を有するDNAを、非生物学的に(例えば細胞膜を物理的にまたは化学的に 透過性にすることにより)細胞内へ導入する基本的なトランスフェクション方法 が存在する。本来、このアプローチは、一時的に身体から取り出され得、そして 処置の細胞障害性に耐え得る細胞(すなわちリンパ球)に限られる。特定の脂質お よび両親媒性ペプチドを用いて形成されるリポソームまたはタンパク質結合体が トランスフェクションのために使用され得るが、遺伝子組み込みの効率は依然と して非常に低く、1,000細胞〜100,000細胞当たり１つの組み込みの程度であり、 そしてトランスフェクトされた遺伝子の発現は、しばしば、増殖中の細胞におい て何日間かに限られるか、または非増殖中の細胞においては、何週間かに限られ る。それ故、DNAトランスフェクションは明らかにガン処置のための適切な方法 ではない。 第２のアプローチは、ウイルスの細胞へ進入する自然の能力(ウイルスがそれ 自身の遺伝物質をウイルスと共に持込むこと)を利用する。レトロウイルスは、 その遺伝子を宿主ゲノムへ組み込む能力、多量の外来遺伝物質を転移し、広範な 種および細胞型に感染し、そして特定の細胞株中でパッケージされることにより 遺伝子送達ベクターとしての可能性を有する。しかし、３つの大きな問題により 、レトロウイルスベクターの実際の使用が妨げられる。第１に、レトロウイルス の感染力は、標的表面のウイルスのレセプターの利用可能性に依存する。第２に 、レトロウイルスのみが効率的に複製細胞に取り込まれる。そして最後に、レト ロウイルスは、濃縮し、そして精製することが困難である。 D．遺伝子治療における使用のためのアデノウイルス構築物 ヒトアデノウイルスは、約36kbのゲノムサイズを有する２本鎖DNA腫瘍ウイル スである(Tooza，1981)。真核生物遺伝子発現のためのモデル系として、アデノ ウイルスは広く研究され、そして十分に特徴付けされており、これは、遺伝子転 移系としてのアデノウイルスの開発について、アデノウイルスを魅力的な系にす る。この群のウイルスは、容易に増殖し、操作され、そしてインビトロおよびイ ンビボで広い宿主域を示す。溶解的に感染した細胞において、アデノウイルスは 宿主のタンパク質合成を停止させ得、多量のウイルスタンパク質を合成する細胞 構造を誘導し、そして多量のウイルスを産生する。 ゲノムのE1領域は、ウイルスゲノムの転写調節に関与するタンパク質をコード するE1AおよびE1B、ならびに小数の細胞遺伝子を含む。E2AおよびE2Bを含むE2発 現は、ウイルスの複製機能(例えば、DNA結合タンパク質、DNAポリメラーゼ、お よび複製をプライムする末端タンパク質)の合成を可能にする。E3遺伝子産物は 、細胞障害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を妨げ、そしてウイルス 増殖に重要であるようである。E4タンパク質に関連する機能は、DNA複製、後期 遺伝子発現、および宿主細胞の停止(shutoff)を包含する。後期遺伝子産物は、 ほとんどのビリオンキャップシドタンパク質を包含し、そしてこれらは、主要後 期プロモーターからの１つの一次転写物のプロセシングが生じた後にのみ発現さ れる。主要後期プロモーター(MLP)は、感染の後期相の間、高い効率を示す(Stra tford-PerricaudetおよびPerricaudet，1991a)。 ウイルスゲノムの少しの部分のみがシスにおいて必要であるようであるため(T ooza，1981)、アデノウイルス由来ベクターは、293細胞のような細胞株に関連し て使用された場合、大きなDNA断片の置換のための優れた潜在能力を提供する。A d-5により形質転換されたヒト胎児腎臓細胞株(Grahamら、1977)が、トランスに おける必須ウイルスタンパク質を提供するために開発されている。従って、本発 明者は、アデノウイルスの特質により、アデノウイルスはインビボでガン細胞を 標的化するのに有用な候補物になると論じた(GrunhausおよびHorwits，1992)。 細胞への外来タンパク質の送達のためのアデノウイルス系の特に有用な利点と して、(i)外来DNAによりウイルスDNAの比較的大きな部分を置換する能力；(ii) 組換えアデノウイルスの構造安定性；(iii)ヒトへのアデノウイルス投与の安全 性；および(iv)アデノウイルス感染とガンまたは悪性腫瘍との公知の関連がない こと；(v)組換えウイルスの高い力価を得る能力；および(vi)アデノウイルスの 高い感染力、が挙げられる。 レトロウイルス以上にアデノウイルスベクターのさらなる利点として、高レベ ルの遺伝子発現が挙げられる。さらに、アデノウイルス複製は、レトロウイルス の配列と異なり、宿主遺伝子複製から独立している。E1領域のアデノウイルス形 質転換遺伝子を容易に欠失し得、そしてそれでもなお効率的な発現ベクターを提 供し得るため、アデノウイルスベクターのガン遺伝子的な危険性は無視し得ると 考えられる(GrunhausおよびHorwitz，1992)。 一般に、アデノウイルス遺伝子転移系は、E1のようなそのゲノムの一部の欠失 により、複製不能にされるが、それでも依然その感染能力を保持する組換え、遺 伝子操作アデノウイルスを基礎とする。さらなる欠失がアデノウイルスゲノムに おいてなされる場合、比較的大きな外来タンパク質を発現し得る。例えば、E1領 域およびE3領域の両方が欠失したアデノウイルスは10kbまでの外来DNAを有し得 、そして293細胞において高い力価に増殖し得る(Stratford-PerricaudetおよびP erricaudet，1991a)。驚くことに、アデノウイルス感染後の転移遺伝子の持続的 な発現もまた、報告されている。 アデノウイルス仲介遺伝子転移は、最近、真核生物細胞および全動物への遺伝 子転移を仲介する手段として研究されている。例えば、珍しい劣性遺伝子障害で あるオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症のマウスの処置において、 アデノウイルス構築物が正常なOTC酵素を補給するために用いられ得ることが見 出された。残念ながら、OTCの正常レベルの発現は、17例の中４例において達成 されたに過ぎなかった(Stratford-Perricaudetら、1991b)。それ故、欠損症はほ とんどのマウスにおいて部分的に矯正されたに過ぎず、そして生理的変化または 表現型変化を導かなかった。それ故、これらのタイプの結果は、ガン治療におけ るアデノウイルスベクターの使用をほとんど促進しない。 ワタオオネズミ(cotton rat)の肺上皮細胞への嚢胞性線維症膜貫通コンダクタ ンスレギュレーター(CFTR)遺伝子を転移するためにアデノウイルスを使用する試 みもまた、部分的に成功しているが、動物の上皮における転移遺伝子の生物活性 を評価することは不可能であった(Rosenfeldら、1992)。また、これらの研究は 、肺気道細胞におけるCFTRタンパク質の遺伝子転移および発現を示したが、生理 的な効果は示さなかった。1991年のScienceの論文において、Rosenfeldらは、α １-アンチトリプシンタンパク質の肺発現を示したが、これもまた生理的効果を 示さなかった。事実、彼らは、観察した発現のレベルは、ヒトにおける肺の保護 に必要なレベルの約２％(すなわち、生理的効果に必要なレベルよりはるかに低 い)にすぎなかったと算定した。 ヒトα１-アンチトリプシン遺伝子は、門脈内注入により正常ラットの肝臓へ 導入された。この場合、遺伝子は発現し、そしてこの結果、これらのラットの血 漿中に導入されたヒトタンパク質を分泌した(Jaffeら、1992)。しかし、そして 、残念なことに、得られたレベルは治療値レベルには十分な高さではなかった。 これらのタイプの結果は、アデノウイルスが組換え細胞において十分なタンパ ク質の発現を導き、生理的に関連する効果を達成し得ることを示さず、それ故、 ガン治療に関連した使用のためのアデノウイルス系の有用性を示唆しない。さら に、本発明の以前には、p53は障害性であるため、アデノウイルスを調製するた めに用いられるようなパッケージング細胞中に取り込まれ得ないと考えられた。 アデノウイルスのE1Bはp53に結合するため、これは、アデノウイルスとp53技術 は組み合わせられないさらなる理由と考えられた。 E．p53アデノウイルス構築物および腫瘍抑制 本発明は、新規なそしてさらに効果的な腫瘍抑制ベクターを用いるガン遺伝子 治療を提供する。この組換えウイルスは、高力価、広い標的域、効率的な形質導 入、および標的細胞での非組み込みのようなアデノウイルスベクターの利点を利 用する。本発明の１つの実施態様において、ヒトサイトメガロウイルスプロモー ターの制御下で野生型p53(Ad5CMV-p53)を発現する、複製能欠損、ヘルパー非依 存アデノウイルスが作製される。 哺乳動物細胞において発現が所望される場合、発現ベクターの制御機能はしば しばウイルスから提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポ リオーマ、アデノウイルス２およびシミアンウイルス40(SV40)に由来する。SV40 ウイルスの初期および後期プロモーターは特に有用である。なぜなら、両方は、 SV40ウイルスの複製起点をも含む断片として容易にウイルスから得られるからで ある。ウイルスの複製起点内に位置するHindIII部位からBglI部位へ伸びる約250 bpの配列を含む場合、より短いかまたはより長いSV40断片もまた使用され得る。 さらに、含まれる遺伝子配列と通常、関連するプロモーター配列または制御配列 (そのような制御配列が宿主細胞系と適合する場合)を、利用することもまた、可 能であり、そしてしばしば望ましくある。 複製起点は、ベクターの構築により提供されて、SV40または他のウイルス(例 えば、ポリオーマ、アデノ、VSV、BPV)起源に由来し得る外因性起点を含み得る か、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得る。ベクターが宿主細胞 染色体中に組み込まれる場合、多くの場合、後者で十分である。 好ましいp53アデノウイルスの設計および増殖を図１に図示する。これと関連 して、組換えアデノウイルスを増殖させそして同定するための改善されたプロト コルが開発された(以下で論じられる)。同定の後、p53組換えアデノウイルスを 、図２に示すように、PCR分析により構造的に確認した。その構造体の単離およ び確認後、p53アデノウイルスは、同型p53遺伝子欠失を有するヒト肺ガン細胞株 H358を感染させるために用いられた。ウエスタンブロットは、外因性p53タンパ ク質は、高レベルで発現され(図４および図５)、そして感染後３日目でピークに なったことを示した(図６)。 p53点変異細胞株H322において、変異p53は、外因性p53の発現によりダウンレ ギュレートされることも示された。コントロール実験として、Ad5CMV-p53ビリオ ンと構造的類似性を有するビリオン(Ad5/RSV/GL2)を使用した。このビリオンは 、ビリオンの発現カセット内にラウス肉腫ウイルスLTRプロモーターにより駆動 されるルシフェラーゼcDNAを含んだ。ビリオンAd5/RSV/GL2により感染させた細 胞において、p53発現およびアクチン発現の変化はいずれも検出されなかった。 非感染細胞またはコントロールビリオンで感染させたH358細胞の増殖と対照的に 、Ad5CMV-p53で感染させたH358細胞の増殖は大きく阻害された(図７Ａ)。H322細 胞の増殖もまた、p53ビリオンにより大きく阻害された(図７Ｂ)が、野生型p53を 含有するヒト肺ガンH460細胞の増殖は、ほとんど影響を受けなかった(図７Ｃ)。 Ad5CMV-p53は、インビトロの肺ガン細胞増殖における強力な阻害効果を仲介し た。細胞をIPFU/細胞未満のMOIでAd5CMV-p53で感染させた場合、増殖阻害はそれ 程明らかでなかったが、100PFU/細胞より高いMOIではコントロールウイルスAd5/ RSV/GL2においても細胞障害性が観察され得た。本発明者らの研究において、増 殖速度研究に最適な用量は10〜50PFU/細胞であった。この用量範囲内で、細胞増 殖阻害は、発現したp53タンパク質に帰因し得た。 ヌードマウスにおける試験は、Ad5CMV-p53処置のH358細胞の腫瘍形成が大きく 阻害されたことを示した。正所性ヒト肺ガンのマウスモデルにおいて、p53に点 変異を有する腫瘍形成H226Br細胞を、ウイルス処置の３日前に気管内接種した。 Ad5CMV-p53の気管内点滴注入により、このモデル系における腫瘍形成が妨げられ た。これは、改変されたアデノウイルスが、ヒトガン細胞において腫瘍抑制遺伝 子の転移および発現を仲介するための効率的なベクターであり、そしてAd5CMV-p 53ウイルスは、ガン遺伝子治療における使用のための治療薬剤としてさらに開発 され得ることを示唆する。 Ad5CMV-p53は、ウエスタンブロット分析により示されたように、ヒト肺ガン細 胞におけるp53遺伝子の高レベルの発現を仲介した。H460細胞において、外因性p 53タンパク質は、内因性野生型p53より約14倍多く、そしてH358細胞においては βアクチン内部コントロールより約２倍〜４倍多かった。高レベルの発現は、(1 )非常に効率的な遺伝子転移、(2)p53 cDNAを駆動する強力なCMVプロモーター、 および(3)p53 cDNA転写を増強するアデノウイルスE1エンハンサー、に帰因し得 る。H358細胞において、感染後のp53発現の持続期間は、15日より長かった。し かし、感染後５日目以後、発現が急速に減少した。感染H358細胞由来のDNAサン プルのPCR分析は、タンパク質レベルの減少を伴うウイルスDNAレベルの減少を示 し、インビトロでのガン細胞の継続的な増殖の間のウイルスDNAの喪失を示した 。 p53発現の減少はまた、p53発現を制御するCMVプロモーターの細胞性弱化(atte nuation)の結果であった。なぜなら、宿主細胞仲介のCMVプロモーターの停止現 象が以前に報告されているからである(Daiら、1992)。アデノウイルスベクター は非組み込み遺伝子転移ベクターであり、それ故、遺伝子発現の持続期間は、宿 主細胞、転移される遺伝子、および関係するプロモーターを包含する多くの要因 に依存する。Crystalおよび共同研究者は、ワタオネズミ上皮細胞における嚢胞 性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター遺伝子の低レベル発現が、感染後 ６週間で検出可能であることを示した(Rosenfeldら、1992)。Perricaudetの研究 室は、mdxマウスの筋肉におけるミニジストロフィン(minidystrophin)遺伝子の 最小限の発現が、感染後３ヶ月より長く継続したことを示した。本研究において 観察された野生型p53タンパク質の短期間の高レベル発現は、インビボでのAd5CM V-p53を用いる処置後の正常細胞における可能な副作用を減少させる有利な効果 を有し得る。 本明細書において開示される研究は、p53組換えアデノウイルスは腫瘍抑制の 特性を有することを示し、腫瘍抑制は、腫瘍細胞中でp53タンパク質機能を回復 することにより作用するようである。これらの結果は、ガン処置のための治療薬 剤としてのAd5CMV-p53ビリオンの使用についての支持を提供する。 F．DNA損傷薬剤 広範な種々のDNA損傷薬剤が本発明に用いられ得る。例えば、DNAを直接架橋す る薬剤、DNAに挿入される薬剤、そして核酸合成に影響を与えることにより、染 色体異常および有糸分裂異常を導く薬剤である。 本明細書において、相乗作用的な抗新生物的な組み合わせを導くDNA損傷に到 る核酸、特にDNAを直接架橋する薬剤が期待されそして示される。シスプラチン 、および他のDNAアルキル化剤のような薬剤が使用され得る。シスプラチンは、 合 計３段階の間、３週間ごとに５日間20mg/m2の臨床適用において用いられる効率 的な用量で、ガンを処置するために広く使用されている。シスプラチンは経口的 に吸収されず、それ故静脈内、皮下的、腫瘍内または腹腔内注射により送達され なければならない。 DNAに損傷を与える薬剤はまた、DNA複製、有糸分裂、および染色体分離を妨げ る化合物を包含する。これらの化合物の例として、ドクソルビシンとしても知ら れるアドリアマイシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシンなどが挙 げられる。新生物の処置のための臨床設定において広く使用されるこれらの化合 物は、ボーラス注射により、アドリアマイシンについては21日間隔で25〜75mg/m2 の範囲の用量で静脈内投与され、エトポシドについては、35〜50mg/m2の範囲の 用量で静脈内投与されるかまたは静脈内投与の２倍の用量で経口投与される。 核酸前駆体の合成および忠実度を破壊する薬剤、およびサブユニットもまた、 DNA損傷を導く。そのようなものとして、多くの核酸前駆体が開発されている。 拡大試験を受けそして容易に入手可能な薬剤が特に有用である。そのようなもの として、5-フルオロウラシル(5-FU)のような薬剤が、新生物組織により優先的に 使用されるが、これは新生物細胞に対する標的のために、この薬剤を特に有用に する。5-FUは相当に障害性であるが、局所的を含めて広範なキャリア中で適用可 能である。しかし、３mg〜15mg/kg/日の範囲の静脈内用量が一般的に使用される 。 DNA損傷を引き起こし、そして広く使用されている他の因子は、一般にγ線、 Ｘ線として知られるもの、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の方向付け された送達を包含する。DNA損傷因子の他の形態はまた、マイクロ波および紫外 線照射などが考慮される。これらの全ての因子は、DNA前駆体、DNAの複製および 修復、ならびに染色体の組立および維持における広範な損傷をもたらす。Ｘ線に ついての用量範囲は、長期間(３〜４週間)について50〜200レントゲンの日常用 量から2000〜6000レントゲンの単回用量の範囲である。放射性同位体についての 用量範囲は、広く変化し、そして同位体の半減期、放射される放射線の強度およ びタイプ、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。 当業者は「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、第33章、特に624 〜652頁を参照されたい。処置される被験体の状態に依存して、用量のいくらか の変更が必然的に起こり得る。投与に責任を負う人が、いかなる場合でも、個々 の被験体に適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与については、調製物は、FD AのOffice of Biologics基準により要求される減菌度基準、発熱性基準、一般的 な安全性基準および純度基準に合致すべきである。 G．p53およびシスプラチン処置 ヒトガンにおける遺伝子置換治療と化学療法との組み合わせの効力を測定する 努力において、本発明者らは、Ad-p53およびCDDPの連続投与がインビボでアポト ーシスを誘導し得るか否か調べた。Ad-p53の直接腫瘍内注射またはCDDPの腹腔内 投与の３日後、nu/nuマウスにおいて皮下移植されたH358腫瘍は、増殖の多少の 緩和を示した。しかし、Ad-p53およびCDDPが同時に投与された場合、腫瘍は部分 的に退縮し、そして腫瘍サイズは、他のいずれの処置群のサイズより統計的に有 意に小さいままであった。増殖阻害効果は、処置の２サイクル後でさらに顕著で あった(図13Ａ)。組織学的検査は、CDDPで処置されたマウスにおいてAd-p53が注 射された領域における腫瘍細胞の大量の破壊を明らかにした。インサイチュ染色 は、無細胞空間の周りの多くのアポトーシス性の細胞を示した(図13Ｂ-図13Ｅ) 。対照的に、CDDP単独かまたはAd-p53単独で処置された腫瘍は、無細胞領域およ びアポトーシス性領域のいずれも示さなかった。 本発明は、DNA架橋剤を用いる従来の化学療法と組み合わせたヒト遺伝子治療 のための新規な戦略を記載する。化学療法剤に耐性の腫瘍細胞は、臨床腫瘍学に おける主要な問題を代表する。NSCLCは肺ガンの症例の少なくとも80％を数える ；しかし、NSCLCの患者は、一般的に化学療法に対して非応答性である(Doyle, 1 993)。現在のガン研究の１つの目標は、遺伝子産物と化学療法薬剤との間の相互 作用を研究することによりガンのための遺伝子置換治療の効力を改善する方法を 見い出すことである。単純ヘルペスチミジンキナーゼ(HS-tK)遺伝子は、レトロ ウイルスベクター系により脳腫瘍へ送達される場合、抗ウイルス剤であるガンシ クロビルに対する感受性を首尾良く誘導した(Culverら、1992)。HS-tK遺伝子産 物は外因性ウイルス酵素であるが、wt-p53タンパク質は正常組織中で発現される 。これは、wt-p53発現の変化による化学耐性の調整は、内因性遺伝子的プログ ラムにより仲介される経路を用いる代替アプローチであり得ることを示唆する。 アデノウイルス系は、高力価のウイルス産生の容易さ、高い感染効率、および 多くの細胞型に対する感染力のような、インビボでの遺伝子送達のための潜在的 な利点を有する。しかし、導入される遺伝子の発現の安定性および持続期間は依 然として議論の余地がある。化学-遺伝子治療について、発現のレベルおよび高 い感染力は発現の持続期間より重要であり得る。なぜなら、薬物は感染細胞を数 日以内に殺傷し得るからである。化学療法剤に感受性の細胞におけるp53レベル の増加は、DNA損傷刺激後６時間以内に起こり得る(Fritscheら、1993、Zhanら、 1993)が、増加したp53 DNA結合活性は、刺激が除去される場合、４時間の経過の 間逆となり得る(Tishlerら、1993)。本発明のモデルにおいて、wt-p53遺伝子の 発現は、Ad-p53ベクターに含まれるサイトメガロウイルスにより独立して駆動さ れる。それ故、薬物曝露の停止後でも高レベルのp53発現が維持され得る。Ad-p5 3によるwt-p53タンパク質の発現は、感染後３日目でピークとなり(内因性野生型 の14倍を超える)、そして９日目までに低レベルに減少する(Zhangら、1993)。こ れは、一時的な高レベルのwt-p53発現が、ガン細胞において細胞障害プログラム を開始するには十分であることを示唆する。 H．患者および処置プロトコル 本発明者は、p53関連ガン（例えば、切除不能な閉塞性気管支内ガン）患者に おける肺ガン細胞へのアデノウィルスp53遺伝子構築物の部位的送達は、臨床疾 患に対処するために治療学的に有効な遺伝子を送達する非常に効率的な方法であ ると提案する。p53遺伝子の送達は、DNA損傷を導く薬剤または因子との組合せて 行われるべきである。この組み合わせアプローチは、現在のガン治療（例えば、 シスプラチン単独に対する感受性の喪失）に対する大きな進歩である。この治療 は、DNA損傷をもたらすことにより末期ガン細胞を殺傷または除去する試みに依 存する。腫瘍細胞休止は確立された現象であるため、これにより効果的な殺傷を 行うことは成功の見込みが非常に少ない。 NSCLC細胞によるアデノウィルス構築物の取り込みはこれらの細胞の増殖速度 を低下させることが期待されるが、本実施例は、DNA損傷薬剤または因子のp53ア デノウィルスとの組み合わせ使用が、それぞれの因子単独では見られない細胞増 殖および腫瘍サイズの十分な減少を導くことを示す。本明細書で開示する組成物 および方法は、冒された肺が肥大した状態である時間の長さの増加を強く警告し 、腫瘍の再増殖および腫瘍細胞の分裂を阻止し、そして患者の生存を延長する。 部分的にまたは完全に気道を閉塞して、かつ外部からのビーム放射線療法を受 けられなかったかまたは受けられ得ない切除不能な気管支内腫瘍再発を有する患 者は、この組み合わせたプロトコルに対して考慮される。この状態について既存 の治療は、短期間の緩和を提供するのみである。ほとんどの患者は、外部ビーム 放射線療法にもかかわらず、再発する。近接照射療法（brachytherapy）カテー テルを挿入し、そして付加的な放射線療法、DNA損傷薬剤の静脈内投与を行うこ とは可能であり得る。現行の処置を受けている患者は、その生存が平均して６カ 月である。近接照射療法が不可能な患者はまた、遺伝子治療を受けることも望ま しいとされる。腫瘍は、レーザーまたはバイオプシー鉗子を用いて気道から除去 され得る。これはアデノウィルスの構築物の注入と一緒に行われ得、従って注入 しなければならない容量を減らし得る。腫瘍が進行している場合、ウィルス構築 物の投与は、他の緩和治療を受けている患者を除外しない。 I．他の遺伝子転移技術 遺伝子治療の成功には、一般的に、遺伝子疾患を直し得る遺伝子の宿主ゲノム への組込みが必要とされる。この場合、その遺伝子は、宿主DNAと共存して複製 し、そして欠陥遺伝子を補償するレベルで発現される。理想的には、疾患は、重 篤な副作用を伴わずに１つまたはいくつかの処置により治療される。遺伝子治療 に対するいくつかのアプローチが今日までに提案されており、これらは本発明と ともに使用され得る。 第１のアプローチは、目的の遺伝子を含有するDNAを細胞にトランスフェクト することである（例えば、化学的または物理的のいずれかにより細胞膜を透過さ せることによる）。このアプローチは、一般的に、身体から一時的に取り出され 得、かつ処置の細胞障害性に耐え得る細胞（すなわち、リンパ球）に限定される 。特定の脂質および両親媒性ペプチドとともに形成されるリポソームまたはタン パ ク質結合体が、インビボトランスフェクションのために使用され得る（Stewart ら、1992；Torchilinら、1992；Zhuら、1993）。しかし、現在の遺伝子組込み効 率は非常に低い。目的の遺伝子は、1,000〜100,000においてわずか１個の細胞の ゲノムに組み込まれると推定される。組込みがない場合、組込まれなかったDNA の崩壊のために、トランスフェクトされた遺伝子の発現は、増殖細胞においては 数日または非増殖細胞においては数週間に限定される。 第２のアプローチは、細胞に進入するために、ウィルスとともに自身の遺伝物 質を持ち込むウィルスの本来の能力を利用する。レトロウィルスは、自身の遺伝 子を宿主ゲノムに組み込む能力のために、遺伝子送達ベクターとしての可能性を 有する。それは、大量の外来遺伝物質を転移させ、広範囲の種および広範囲の細 胞タイプに感染し、そして特別な細胞株においてパッケージされることによる（ Miller、1992）。 第３の方法は他のウィルスを用いる。このウィルスとしては、例えば、アデノ ウィルス、単純ヘルペスウィルス（HSV）、サイトメガロウィルス（CMV）、およ びアデノ関連ウィルス（AAV）が挙げられ、これらは遺伝子転移用のベクターと して取り扱うために操作される。外来遺伝物質を受容し得るいくつかのウィルス は、収容し得るヌクレオチド数および感染する細胞の範囲において限定されるが 、これらのウィルスは、遺伝子発現を首尾良く達成することが示されている。し かし、アデノウィルスは遺伝物質を宿主ゲノムに組み込まず、それ故に遺伝子発 現のための宿主の複製を必要としない。そのため、迅速で効率的な異種遺伝子発 現に対して理想的に適している。 本発明をある程度詳細に記載しているが、多くの代替、改変、および変化が以 下の開示に照らして当業者に明白であることは明らかである。従って、本発明の 意図および範囲内にあるこのような代替、改変、および変化は、定義される請求 の範囲に包含されることを意図する。 以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すために含まれる。以下の本 実施例において開示される技術は、本発明の実施においてよく機能することが本 発明者により見出された技術を表し、そしてその実施のための好ましい態様を構 成すると見なされ得ることは、当業者により理解されるべきである。しかし、当 業者は、本開示に照らして、開示され、そしてさらに本発明の意図および範囲か ら逸脱することなく同様の結果または類似の結果が得られる特定の実施様態にお いて多くの変更をなし得ると理解すべきである。 実施例１ p53 発現ベクターの構築 本実施例はp53発現ベクターの構築を記載する。このベクターを、指示される 通りに構築し、そしてアデノウィルス株Ad5ゲノムのE1領域（1.3-9.2m.u.）を置 換するために使用して、実施例２に記載のアデノウィルスビリオン（virion）を 構築するために用いる。 図１に示すp53発現カセットは、ヒトサイトメガロウィルス（CMV）プロモータ ー（Boshartら、1985）、p53cDNA、およびSV40初期ポリアデニル化シグナルを含 有し、これをpXCJL1（Frank L．Graham博士、McMaster University、Canadaより 提供された）のXbaI部位とClaI部位との間に挿入した。 ゲノムサイズは約35.4kbであり、100マップユニット（map unit）（１m.u.＝0 .35kb）に分割される。p53発現カセットは、Ad5ゲノムのE1領域（1.3-9.2m.u.） を置換した。 プライマー１は、配列5'-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3'（配列番号：１）を有し、 そしてヒトCMV主要IE遺伝子プロモーター（Boshartら、1985）の下流の第１イン トロン中に位置する。プライマー２は、配列5'-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3'（配列 番号：２）を有し、そしてSV40初期ポリアデニル化シグナル中に位置する。両方 のプライマー（p53 cDNA挿入物から両端で15bp〜20bp離れている）は、1.40kb P CR産物を規定する。プライマー３は、配列5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3'（配列番 号：３）を有し、そしてプライマー４は、配列5'-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3'（配 列番号：４）を有し、それぞれ、Ad5ゲノムの11m.u.および13.4m.u.に位置し、 これらは、0.86kbウィルスゲノム特異的PCR産物を規定する。 実施例２ 組換えp53アデノウィルスの生成および増殖 本実施例は、p53を発現するヘルパー非依存的組換えアデノウィルスを生成す るために最適な１つの方法を記載する。組換えアデノウィルスを作製するために 用いた分子戦略は、アデノウィルスのパッケージング限界のため、pJM17はそれ 自身でウィルスを形成できないという事実に基づく。従って、トランスフェクト された細胞内でのp53発現ベクタープラスミドとpJM17との間の相同組換えの結果 、必要なアデノウィルスタンパク質を発現する細胞内でのみパッケージされ得る 生存可能なウィルスが生じる。 本実施例の方法は、E1またはE3領域で異種DNA発現カセットの置換を含有する 、ウィルスを増殖させるための宿主細胞として、293細胞を利用する。このプロ セスは、293細胞へのDNAのコトランスフェクション(cotransfection)を必要とす る。トランスフェクションは、ウィルス増殖の効率を主として決定する。本発明 以前の293細胞へのDNAのトランスフェクションのために使用された方法は、通常 、リン酸カルシウム／DNA共沈殿であった（Grahamおよびvan der Eb、1973）。 しかし、プラークアッセイを伴うこの方法は、比較的困難であり、そして典型的 にはウィルス増殖効率が低い結果となる。本実施例で図示するように、トランス フェクションおよび感染細胞のその後の同定は、トランスフェクトされた細胞を 細胞変性効果（CPE）により同定する場合、リポソーム仲介トランスフェクショ ンを使用することにより著しく改善された。 293細胞株を、10％熱不活性化ウマ血清を補充したダルベッコ改変最少必須培 地中で維持した。相同組換えのためのp53発現ベクターおよびプラスミドpJM17（ McGroryら、1988）を、製造者のプロトコル（Boehringer Mannheim Biochemical s、1992）に従い、DOTAP仲介トランスフェクションにより293細胞にコトランス フェクトした。これを、図１に模式的に示す。 293細胞（継代35、60％コンフルエント）を60mmディッシュまたは24ウェルプ レートのいずれかでトランスフェクト前24時間インキュベートした。各ウェル中 の細胞を、30μl DOTAP、２μgのp53発現ベクター、および３μgのプラスミドpJ M17とともにトランスフェクトした。トランスフェクション後、CPEの開始まで、 細胞にMEM培地を２〜３日毎に与えた。 実施例３ 組換えアデノウィルスの同一性の確認 本実施例は、適当な細胞株のコトランスフェクション後の組換えビリオンの同 一性を確認するための新しいポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイを示す。 細胞培養上清のアリコート（50μlから370μl）を試験プレートから集め、プ ロテイナーゼＫ（0.5％SDSおよび20mM EDTAとともに50μg/ml）で56℃で１時間 処理し、フェノール-クロロホルムで抽出し、そして核酸をエタノール沈殿した 。DNAペレットを20μl dH2O中で再懸濁して、PCR増幅のための鋳型として使用し た。PCRプライマーの相対的位置およびそれらの配列を図１に示し、そして、そ れらはそれぞれ配列番号１、２、３および４である。cDNA挿入物特異的プライマ ーは1.4kb PCR産物を規定し、そしてウィルスゲノム特異的プライマーは0.86kb PCR産物を規定する。PCR反応を、４mM MgCl2、50mM KCl、0.1％triton X-100、2 00μMの各dNTP、10mM Tris-Cl（pH9.0）、２μMの各プライマー、および1.0ユニ ットのTaqポリメラーゼ（Promega）を含有する50μl容量で行った。反応を、94 ℃、0.5分、56℃、0.5分、そして72℃、１分で、30サイクル行った。 新たに増殖した組換えウィルスの同定の手順を単純化するために、細胞培養培 地上清からのDNAサンプルに対する直接PCRアッセイを開発した。CPEを有する細 胞培地上清のアリコート（50μlまたは370μl）を、プロテイナーゼＫで処理し 、そしてフェノール／クロロホルム抽出した。エタノール沈殿後、DNAサンプル を、挿入物特異的配列およびウィルスゲノム特異的配列を増幅するための２組の プライマーを用いるPCRを使用して分析した。PCRプライマー標的およびそれらの 配列を図１に示す。プライマー１、２、３および４は、それぞれ配列番号１、２ 、３および４により表される。 結果として、1.4kb cDNA挿入物および0.86kbウィルスゲノムフラグメントを、 発現ベクター（ポジティブコントロール）およびポジティブ細胞培養物のDNAサ ンプルから増幅した（図２Ｂ、それぞれレーン１および４）。0.86kbフラグメン トのみが、Ad5/RSV/GL2ウィルスのDNAサンプルから増幅された（ネガティブコン トロール、レーン２）。いずれの未処理ポジティブ細胞培養培地上清をも用いた PCR反応物からは、増幅されたバンドは見られなかった（レーン３）。 これらの結果は、細胞培養培地中に放出されたアデノウィルスは、DNA鋳型調 製のために50μl程度の細胞培養培地上清を用いても、PCRにより検出可能である ことを示した。これらの結果により、アデノウィルス力価（titer）の測定のた めにこの技術を用いる定量法の開発が可能となる（ウィルス力価の測定は、従来 は、プラークアッセイにより行われていた）。 Ad5CMV-p53ウィルスでのp53 cDNAの野生型の配列を、CsCl勾配精製ウィルスDN AにおいてジデオキシDNA配列決定法により確認した。同様の方法で生成したコン トロールウィルスAd5/RSV/GL2は、AD5CMV-p53と同様の構造を有するが、ラウス （Rous）肉腫ウィルスプロモーターおよびルシフェラーゼcDNAをその発現カセッ ト内で使用したことが異なる。E.coliのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（LacZ）を 有する組換えアデノウィルス（Ad5CMV-LacZ）もまた、Ad5CMV-p53と同様の構造 を有し、そしてZhangらに開示されるようにして、およびFrank L．Graham博士（ Grahamら、1991を参照願いたい）から得ることができる。 ウィルスのストック、力価、および感染。Ad5CMV-p53、Ad5/RSV/GL2、およびA d5CMV-LacZウィルスの個々のクローンを、GrahamおよびPrevec（1991）の方法に 従ってプラーク精製により得た。単一のウィルスクローンを293細胞中で増殖さ せた。完全な細胞変性効果を示す293細胞の培養培地を集め、そして1000×gで10 分間遠心分離した。プールした上清をアリコートに小分けし、そしてウィルスス トックとして-20℃で保存した。ウィルス力価をプラークアッセイ（Grahamおよ びPrevec、1991）により決定した。細胞株の感染を、ウィルス溶液（60mmディッ シュ当たり0.5ml）の細胞単層への添加、および５分毎の短時間の撹拌を伴う30 分間の室温でのインキュベーションにより行った。この後、培養培地を添加し、 感染細胞を37℃の培養器に戻した。 組換えアデノウィルスの遺伝子転移効率もまた、一連の細胞株（たとえば、H2 26Br、H322、H460、HeLa、Hep G2、LM2、およびVero）においてAd5CMV-LacZを用 いて評価した。X-gal染色により、すべての細胞株が、30PFU/細胞のMOIでのAd5C MV-LacZによる感染後、97〜100％青に染色された。 実施例４ ヒト肺ガン細胞におけるAd5CMV-p53により支配されるp53遺伝子発現 本実施例は、同型接合の（homozygous）p53遺伝子欠失を有するヒト肺ガン細 胞を感染させるための組換えp53アデノウィルスの使用を示す。結果は、これら の細胞の増殖および変異p53の発現が抑制されたことを示し、このことは、転移 性細胞の制御のための有用な薬剤としてのAd5CMV-p53ビリオンの可能性を示す。 3.8％ホルマリンで固定し、そしてメタノール中３％ H2O2で５分間処理した感 染細胞単層に対して、免疫組織化学を実施した。免疫組織化学的分析は、Vectas tain Eliteキット（Vector、Burlingame、CA）を用いて実施した。使用した一次 抗体は、抗p53抗体PAb 1801（Oncogene Science、Manhasset、NY）であり；MOPC -21(Organon Teknika Corp.、West Chester、PA）をネガティブコントロールと して使用した。二次抗体は、アビジン標識抗マウスIgG（Vector）であった。ビ オチン化西洋わさびペルオキシダーゼABC複合試薬を、抗原抗体複合体を検出す るために用いた。最後に、細胞を、ハリス（Harris）ヘマトキシリン（Sigma） で後染色し、サイトシール(Cytoseal)60（Stephens Scientific、Riverdale、NJ ）で固定した。 感染細胞株の免疫組織化学的分析を行い、Ad5CMV-p53ウィルスのCMVプロモー ターにより駆動されるp53発現物のインサイチュ発現を調べた。H358細胞株（本 細胞株はp53の同型接合欠失を有する）において、p53遺伝子は、30〜50プラーク 形成単位(PFU)／細胞の感染多重度でAd5CMV-p53を用いて細胞を感染させた場合 、97-100％の効率で転移された（免疫組織化学的分析により検出：図４）。 組換えアデノウィルスの高転移効率が、Ad5CMV-LacZにより確認された。本ウ ィルスは、ヒトCMV IEプロモーターにより転写されるLacZ遺伝子を有する。30〜 50 PFU/細胞のMOIで、HeLa、Hep G2、LM2およびヒトNSCLCガン細胞株を含む試験 した細胞のすべては、X-gal染色によりb-ガラクトシダーゼ活性について97〜100 ％ポジティブであった。これらの結果は、アデノウィルスベクターがヒトガン細 胞への遺伝子転移のための効率の良い媒体であることを示す。 ウェスタンブロット分析を、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄し た後にSDS-PAGEサンプル緩衝液（60mmディッシュ当たり0.5ml）を含むディッシ ュ中で単層細胞を溶解することにより調製した、全細胞溶解物について実施した 。 SDS-PAGE分析について、レーンには、５×104個の細胞に相当する細胞溶解液（1 0〜15ml）を載せた。ゲル中のタンパク質をHybondTM-ECL膜（Amersham、Arlingt on Heights、IL）に転写した。膜をPBS中で0.5％の粉ミルクでブロックして一次 抗体（マウス抗ヒトp53モノクローナル抗体PAb 1801およびマウス抗ヒトβ-アク チンモノクローナル抗体（Amersham））とプローブさせ、洗浄して二次抗体（西 洋わさびペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIgG（Pierce Chemical Co.、Rock ford、IL））とプローブさせた。膜を、Amershamの増強化学発光プロトコルに従 って現像した。発現した外因性p53の相対量を、デンシトメーター（Molecular D ynamics Inc.、Sunnyvale、CA）により測定した。 ウェスタンブロットは、外因性p53タンパク質が高レベルで発現していること を示した（図5A、レーン２、３、および５、６）。タンパク質は、感染後３日目 でピークに達した（図６、挿入、0.5日から３日）。コントロールとして、実施 例１の組換えAd5CMV-p53に類似する構造を有するビリオンを構築した。このビリ オンは、ビリオンの発現カセットにおいてラウス肉腫ウィルスLTRプロモーター により駆動されるルシフェラーゼcDNAを含有する。p53発現およびアクチン発現 の変化のいずれも、ビリオンAd5/RSV/GL2により感染させた細胞においては検出 されなかった。 組換えp53アデノウィルスを用いて、３つのヒト肺NSCLC細胞株を感染させた： 細胞株H358（本細胞株はp53遺伝子の同型接合欠失を有する）、細胞株H322（本 細胞株は、コドン248にてp53遺伝子の点変異（ＧからＴ）を有する）、および細 胞株H460（本細胞株は野生型のp53遺伝子を有する）。ヒトNSCLC細胞の増殖速度 を60mm培養ディッシュにおいてH322およびH460（１×105）またはH358（２×105 ）を接種した後ウィルス感染前24時間に測定した。細胞には10PFU/細胞の感染多 重度（MOI）でウィルスを感染させた。培養培地を、偽感染コントロールのため に用いた。異なる処理を行ったそれぞれの細胞株の３連(triplet)培養物を、感 染後１日〜６日の間の毎日、計測した。 Ad5CMV-p53を感染させたH358細胞の増殖は、非感染細胞またはコントロールビ リオンを感染させた細胞の増殖と対照的に、大きく阻害された（図７Ａ）。H322 細胞の増殖もまた、p53ビリオンにより大きく阻害されたが（図７Ｂ）、一方野 生型p53を含有するヒト肺ガンH460細胞の増殖は、ほとんど影響されなかった（ 図７Ｃ）。Ad5CMV-p53ウィルス感染H358細胞の増殖は79％阻害されたが、一方非 感染細胞またはコントロールウィルスを感染させた細胞の増殖は阻害されなかっ た。p53の点変異を有する細胞株H322の増殖はAd5CMV-p53により72％阻害された が、野生型p53を含有する細胞株H460はそれ程影響を受けなかった（28％阻害） 。 この結果は、p53組換えアデノウィルスは腫瘍抑制の性質を有することを示し 、これは腫瘍細胞においてp53タンパク質機能の回復により機能している。 実施例５ p53 欠損細胞の処置におけるAd5CMV-p53 本実施例は、インビトロで腫瘍細胞の増殖抑制を回復させ、それにより細胞の 悪性または転移性増殖を処置するための組換えp53アデノウィルスの使用に関す る。本実施例は、本発明がアデノウィルス仲介遺伝子治療によるガンの処置にお いて有用であると想定される、いくつかの方法を記載する。 H358細胞をAd5CMV-p53およびAd5/RSV/GL2を用いて10PFU/細胞のMOIで感染させ た。等量の細胞を培地で処理して、偽感染とした。感染後24時間、処理細胞を集 め、PBSで２回リンスした。各処置について、0.1mlの容量中に３百万（３×106 ）個の細胞を、各ヌードマウスに皮下注射した（Harlan Co.、Houston、TX）。 ５匹のマウスを各処置について使用した。マウスを注射前に照射（300cGy、60Co ）し、注射後週毎に調べた。腫瘍形成を６週間の終わりで評価し、そして腫瘍体 積を、直交する直径の積の平方根として計算される平均腫瘍直径を有する球様体 であると仮定して計算した。 Ad5CMV-p53により仲介された腫瘍形成能について阻害効果を測定するために、 ヌードマウスにH358細胞（ヒトNSCLC型細胞）を皮下注射して、腫瘍性増殖を誘 導した。各マウスには、10PFU/細胞で24時間、Ad5CMV-p53またはAd5/RSV/GL2で 感染させた細胞を、１回注射した。培地単独で処理したH358細胞を、偽感染コン トロールとして使用した。腫瘍（注射後14日で初めて明瞭になる）は、表Ｉに示 すように偽感染細胞またはコントロールウィルス感染細胞によってのみ誘導され た： 表１に示すように、Ad5CMV-p53処理細胞を受けたマウスは腫瘍を発達させなか った。６週間の終わりでの腫瘍は直径４〜10mmであった。この研究を、群当たり ５匹のマウスを用いて開始した；Ad5CMV-p53群またはAd5/RSV/GL2群のそれぞれ １匹のマウスは研究を完了できなかった。早期の死亡は、おそらく処置に伴う(n osocomial)感染のためであった。 実施例６ 肺ガンの処置におけるAd5CMV-p53 本実施例は、インビボで腫瘍細胞の増殖抑制を回復させ、そしてそれにより動 物におけるガンを処置するための組換えp53アデノウィルスの使用に関する。本 実施例は、本発明がアデノウィルス仲介遺伝子治療によるガンの処置において有 用であると想定される、いくつかの方法を記載する。 腫瘍形成能の阻害におけるAd5CMV-p53の効率を、正所性(orthotopic)ヒト肺ガ ンのマウスモデルにおいてさらに評価した。H358細胞およびH322細胞はこのモデ ルにおいて腫瘍を産生しないため、細胞株H226Brを使用した。この細胞株は、鱗 状肺ガン起源を有して、肺から脳に転移した。H226Brは、p53遺伝子の第７エク ソンのコドン254での点変異（ATCからGTC）を有し、そしてマウスにおいて腫瘍 形成的である。 正所性ヒト肺ガンのマウスモデルにおける試験手順を以前に記載した（George sら、1993）。簡潔に説明すると、放射線（300cGy、60Co）処置したヌードマウ スを、気管内滴注(intratracheal instillation)によりH226Br細胞を接種した。 各マウスには、0.1ml PBSの容積中に２×106個の細胞が注入された。接種後３日 で、群当たり10匹のマウスを、２日間にわたり１日１回、気管内滴注により0.1m lのウィルスまたは0.1mlの媒体（PBS）で処置した。用いたウィルス供与量は、 マウス当たり５×107個のAd5CMV-p53または５×107個のAd5/RSV/GL2であった。 マウスを６週間の終わりで安楽死させた。腫瘍形成を、肺および縦隔組織を切開 し、そして腫瘍サイズを測定することにより評価した。腫瘍塊の切片の組織化学 的分析により、腫瘍を確認した。 照射されたヌードマウスに、２×106個のH226Br細胞／マウスを気管内滴注に より接種した。接種後３日で、それぞれのマウス（群当たり８〜10匹のマウス） を、２日間にわたり１日に１回、気管内滴注によりAd5CMV-p53またはAd5/RSV/GL 2または媒体（PBS）のいずれかの0.1mlで処置した。用いたウィルス供与量は５ ×107PFU/マウスであった。腫瘍形成を、肺および縦隔組織を切開し、そして腫 瘍サイズを測定することにより６週間の終わりで評価した。手順の流れ図を図７ に示し、図８に代表的な切開図を示す。検出された腫瘍は組織学的分析により確 認された。腫瘍測定のデータを表IIに要約する： Ad5CMV-p53処置マウスの25％のみが腫瘍を形成したが、媒体またはAd5/RSV/GL 2コントロール群においては、処置マウスの70〜80％が腫瘍を形成した。Ad5CMV- p53群の平均腫瘍サイズは、コントロール群の平均腫瘍サイズより有意に小さか った。これらの結果は、Ad5CMV-p53が、正所性ヒト肺ガンのマウスモデルにおい てH226Brが腫瘍を形成するのを阻止し得ることを示す。 実施例７ p53 とDNA損傷との間の共同作用 プログラム細胞死（アポトーシス）の生化学的性質は、核DNAの切断に由来す るDNAの切断化の特徴的なパターンを示す。最近の研究は、化学療法薬または電 離放射線によるアポトーシスの誘導はp53遺伝子の状態に関連し得、そしてDNA損 傷刺激薬は、アポトーシスの過程にある細胞における細胞内p53タンパク質のレ ベルを上昇させ得ることを示した（Loweら、1993、Clarkeら、1993、Fritscheら 、1993、Harperら、1993、El-Deiryら、1993）。野生型p53（wt-p53）タンパク 質の増加したレベルによるG1期における細胞周期の阻害は、DNA修復のために多 くの時間を必要とする；もし最適な修復が不可能な場合、p53はプログラムされ た細胞死の引き金を引き得る。従って、p53は、化学療法剤によるアポトーシス 性の腫瘍細胞死の誘導に寄与し得る。 ミスセンス変異または欠失によるp53遺伝子の不活性化は、ヒトガンにおける 最もありふれた遺伝的変化である（Levineら、1991、Hollsteinら、1991）。p53 機能の喪失が、種々の化学療法剤に対する細胞の耐性を増強させることが報告さ れている（Loweら、1993）。本発明者の研究は、ヒト非小細胞肺ガン（NSCLC）H 358細胞（本細胞においては、p53の両方の対立遺伝子は欠失している）が化学療 法薬に対して耐性であったことを示したが、細胞株WTH226b（本細胞株は内在性W t-p53を有する）は、シスプラチン（CDDP）およびエトポシド（VP-16）での処理 後16時間で、アポトーシス性の細胞死を容易に示した（T．Fujiwara、E.A．Grim m、T．Mukhopadhyay、J.A．Roth、未公表データ）。従って、本発明者は、アデ ノウィルスベクターによるwt-p53遺伝子のH358細胞への導入が、インビトロおよ びインビボでのDNA架橋剤であるCDDPに対する細胞の感受性を増加させ得るかど うかを決定することを試みた。 材料および方法 H358細胞は、A．GazdarおよびJ．Minnaにより快く提供された（Takahashiら、 1989）。 アデノウィルスベクター ヒトwt-p53（Ad-p53）またはルシフェラーゼ（Ad-Luc）をコードするcDNAを含 有する組換えアデノウィルスベクターの構築および同定は、以前に報告された（ Zhangら、1993）。簡単に説明すると、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター 、wt-p53cDNA、およびSV40初期ポリアデニル化シグナルを含有するp53発現カセ ットをpXCJL.1のXbaI部位とClaI部位との間に挿入した。p53シャトルベクターお よび組換えプラスミドpJM17を、リポソーム仲介技術により293細胞（Ad5形質転 換ヒト胎児腎臓細胞株）にコトランスフェクトした。完全な細胞変性効果を示す 293細胞の培養上清を集めて、その後の感染のために使用した。コントロールAd- Lucウィルスを同様に作製した。Ad-p53ウィルスおよびAd-Lucウィルスを293細胞 で増殖させた。複製可能なウィルスの存在を、HeLa細胞アッセイにより排除した 。ウィルス力価をプラークアッセイにより測定した（Grahamら、1991）。 ヌクレオソームDNA断片化の検出 DNAを、親細胞、Ad-Luc感染細胞、およびCDDP処置を受けたまたは受けなかっ たAd-p53感染細胞から、細胞を55℃で６時間溶解緩衝液（50mM Tris-HCl（pH 8. 0）、100mM EDTA、100mM NaCl、１％SDS、および50μg/mlプロテイナーゼＫ）中 でインキュベートすることにより単離した。DNAを、等量のフェノールで２回お よびクロロホルム−イソアミルアルコール（24:1）で１回抽出して、次いでエタ ノールで沈殿させた。サンプルを、1.5％アガロースゲルで電気泳動に供し、そ して臭化エチジウム染色により可視化させた。 TdT仲介dUTPニック末端標識を、以前に報告された手順に従い実施した（Gavri eliら、1992）。単層の細胞を0.01％NP-40で処理した。スライドガラスを、TdT 緩衝液（30mM Tris-HCl、pH 7.2；140mMカコジル酸ナトリウム；１mM塩化コバル ト）中に浸し、そしてビオチン化dUTP（Boehringer Mannheim、Indianapolis、I N）およびTdTと共に37℃で45分間インキュベートした。スライドガラスを、２％ ウシ血清アルブミンで10分間覆い、そしてアビジン−ビオチン複合体（Vectasta in Eliteキット；Vector Laboratory、Burlingame、CA）と共に30分間インキュ ベートした。ジアミノ−ベンジジンの使用により比色検出を実施した。 結果 H358細胞を、Ad-p53に曝すことによりヒトwt-p53 cDNAでインビトロで形質導 入した。ウェスタンブロット分析は、Ad-p53での感染後24時間程度の早さで高レ ベルのwt-p53タンパク質の発現を示したが、親（非感染）細胞またはAd-Lucを感 染させたコントロール細胞においては、wt-p53は検出されなかった（データ示さ ず）。共に行った免疫組織学的評価は、80％より多くの感染細胞においてwt-p53 タンパク質が検出できたことを示し、AD-p53によるp53の転移および発現は非常 に効率的であったことを示唆した（データ示さず）。 CDDPへのAd-p53感染H358細胞の連続曝露は、その生存率を急激に減少させる一 方で、親細胞およびAd-Luc感染細胞については、CDDPへの72時間の曝露後のみで 顕著な細胞死が生じた（図10Ａ）。生存率の喪失は、Ad-p53で形質導入した細胞 において大きく増大した。さらに、生存率の低下は、細胞を24時間の曝露後に薬 物非含有培地中で維持した場合でも観測され得た。このことは、致死的損傷が24 時間以内に誘導されたことを示し得る（図10Ｂ）。wt-p53形質導入H358細胞のCD DPに対する感受性は、用量依存的であった（図10Ｃ）。 DNA断片化の指標となるヌクレオソーム間DNAラダーは、CDDPへの24時間の曝露 後にwt-p53を発現している細胞において明白であった；しかし、親細胞およびAd -Luc感染細胞は、DNA断片化を示さなかった（図11Ａ）。ターミナルデオキシヌ クレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）仲介2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸 （dUTP）ビオチンニック末端標識（これは、インサイチュでのアポトーシスに特 徴的なDNA断片化を検出する）は、図11Ｇに示すように、24時間CDDPで処理したA d-p53感染細胞において多数のアポトーシス性の細胞を示した。図11Ｇは、図11 Ｂ〜図11Ｆに存在しない、濃く染まっている核および核断片を示す。 wt-p53の導入は、欠失したp53または変異したp53を有する数種の腫瘍細胞株で アポトーシスを誘導することが知られている（Yonish-Rouachら、1991、Shawら 、1992、Ramqvistら、1993）。しかし、wt-p53単独の過剰発現は、p53ネガティ ブなH358細胞株においてDNA断片化を促進し得なかった（図11）。しかし、その 増殖は、Ad-p53により抑制された（図10）。このことは、安定なH358クローンが レトロウィルス仲介wt-p53転移後に得られ得ること、そしてこのクローンは親細 胞よりもゆっくりと増殖することを示す、本発明者の以前の観察（Caiら、1993 ）と矛盾しない。 Ad-p53とCDDPとの組み合わせの潜在的な治療効率を、H358球様体の体積の相対 的変化によって評価した。多細胞腫瘍球様体モデルは、初期腫瘍および微小転移 巣と類似した組織学的構造をインビトロで示す。CDDPでの処理は、Ad-p53感染H3 58球様体で相対的体積の減少を引き起こしたが、親球様体またはAd-Luc感染細胞 球様体において大きな変化はなかった（図12Ａ）。インサイチュTdT仲介dUTP標 識は、Ad-p53感染球様体の表面上でアポトーシスの過程にある多数の細胞を示し たが、Ad-p53を感染させなかった球様体ではアポトーシス性の細胞は全く見られ なかった（図12Ｂ〜図12Ｅ）。レトロウィルス仲介wt-p53発現が、トランスフォ ーミング増殖因子α（TGF-α）により誘導されるH322a球様体の増殖を阻害した と、本発明者は以前に報告している（Fujiwaraら、1993）。しかし、レトロウィ ルスベクターはH358球様体に感染し得なかった。なぜなら、これらの球様体内の 細胞は、外因性TGF-αに応答して急速に増殖しないからである。CDDPへの曝露に より、Ad-p53に感染したH358球様体のサイズが、その表面上でアポトーシスを誘 導することにより減少するという発見は、Ad-p53は非増殖細胞に感染することお よびCDDPは休止細胞においてアポトーシスプロセスを開始させることを示唆する 。 実施例８ 処置養生におけるp53およびDNA損傷剤の使用 動物モデルを、本明細書下記ならびに実施例５、６、および７に記載するよう に、前臨床試験の一部として用いた。アデノウィルス仲介遺伝子転移処置に関す る医学上の徴候が確立した患者を、アデノウィルスに対する抗体の存在について 試験した。抗体が存在し、そして患者が薬理学的物質または天然に存在する物質 のいずれかに対するアレルギーの経歴を有する場合、綿密な臨床観察下で、103 〜106個のオーダーでの組換えアデノウィルスの試験用量の適用が示され得た。 Ad5CMV-p53を用いるガンの処置のために、適切なプロモーター／エンハンサー エレメント（例えば、CMVプロモーター）の制御下でp53を発現する組換えアデノ ウィルスを調製し、そして、ヒト被験体への投与のために食品医薬品局（the Fo od and Drug Administration）(FDA)に受け入れられ得る方法に従って精製した 。このような方法は、塩化セシウム密度勾配遠心分離、続く効力および純度につ いての試験を包含するが、これに限定されない。 ２つの基本的な方法が、p53アデノウィルス処置方法について適切であると考 えられる。それは、直接的または局所的な投与およびより全身的な投与である。 本発明の方法は、p53変異に関連していることが知られる任意の種々の異なるガ ンを処置することに適している。全身投与に関して、アデノウィルスの単一の静 脈内注射は、注射から離れた部位での組織のウィルス感染を十分に起こし得るこ とが示されており（Stratford-Perricaudetら、1991b）、そして従って、すべて のp53関連の悪性疾患の処置について適切である。ウィルスは、任意の薬理学的 に受容可能な溶液における静脈内投与により、または一定期間にわたる注入とし て患者に投与され得る。一般的に言って、投与されるべき機能的ウィルス粒子の 有効な数は１×1010個〜５×1012個の範囲であると考えられる。 また、特に、肺ガンに関する場合、組換えアデノウィルスのより直接的な身体 上のターゲッティングが、所望であれば、襄胞性線維症膜貫通コンダクタンスレ ギュレーターの気管内投与（Rosenfeldら、1992）と類似の方法で使用され得る 。これにより、標的細胞の部位に対して、より接近した組換えp53アデノウィル スの送達がもたらされ得る。 方法 アポトーシスの検出のためのTdTでのインサイチュdUTP標識 H358球様体を３日目で固定し、そして実施例７に記載するように染色した。簡 潔に記すと、標識TdTプローブを、TdT緩衝液中に浸したスライドガラスと接触さ せ、そしてビオチン化dUTPおよびTdTとともに37℃で45分間インキュベートした 。スライドガラスを、２％ウシ血清アルブミンで10分間覆い、そしてアビジン− ビオチン複合体とともに30分間インキュベートした。比色検出を、ジアミノ−ベ ンジジンを用いて行った。 Ad-p53でのインビボ感染後のCDDPによるアポトーシスの誘導 0.1mlのハンクス平衡塩溶液中のH358細胞（５×106個）を、BALB/c雌性nu/nu マウスの右腹部に皮下注射した。30日後、200μlの培地単独またはAd-Luc（108P FU/ml）またはAd-p53（108PFU/ml）を含む200μlの培地を、５mm〜６mmの直径を 有する腫瘍に注射した。腫瘍内注射（100μl）および２カ所の向かい合った部位 での腫瘍周辺への注射（それぞれ50μl）を行った。CDDP(３mg/kg)またはコント ロールの生理食塩水を腹腔内投与した。(Ａ)腫瘍体積の変化。どれが処置群であ るかを知らせずに、２つの直交する直径においてカリパスで腫瘍を測定し、そし て断面直径の積の平方根として計算される平均腫瘍直径を有する球体形状と仮定 することにより、腫瘍体積を計算した。５匹のマウスを各処置群について使用し た。そして平均+/-SEを示す。データを、スチューデントのｔ検定を用いて解析 した。矢は処置の日を示す。２つの独立した測定を示す。試験１において、５日 目からｐ＜0.05；試験２において７日目からｐ＜0.05である。TdT仲介ビオチンd UTP標識技術を用いる組織学的研究。腫瘍を、処置の開始後５日で採取し、そし て直ちにO.C.T.コンパウンドに包埋した。凍結組織を、低温保持装置(cryostat) で５μmの厚さに切断した。切片を１μg/mlのプロテイナーゼＫで処理し、そし て上記のように染色した。動物のすべての世話は、UT M.D．Anderson Instituti onal Animal Care and Use Committeeに従った。 結果 ヒトガンにおいて、遺伝子置換療法および化学療法の組み合わせの方法のイン ビボでの効率および組成物の効率を示すために、本発明者は、Ad-p53およびCDDP の連続投与が、インビボでアポトーシスを誘導するか否かを試験した。Ad-p53の 直接的な腫瘍内注射またはCDDPの腹腔内投与の３日後、nu/nuマウスにおいて皮 下に移植したH358腫瘍は、適度なゆっくりした増殖を示した。しかし、Ad-p53お よびCDDPを同時に投与した場合、腫瘍は部分的に縮退し、そして腫瘍サイズは、 他の処置群のいずれの腫瘍よりも統計学的に有意に小さいままであった。増殖阻 害効果は、２つの処置サイクル後でもさらにより際立っていた（図13Ａ）。組織 学的検査は、CDDPで処置したマウスにAd-p53を注射した領域における腫瘍細胞の 大規模な破壊を明らかにした。インサイチュ染色は、無細胞領域周辺に多くのア ポトーシス性の細胞を示した（図13Ｂ〜図13Ｅ）。対照的に、CDDP単独またはAd -p53単独で処置した腫瘍は、無細胞性(acellularity)またはアポトーシス性領域 のどちらも示さなかった。 さらに詳細には、好ましい処置プロトコルを、以下に沿って開発し得る。最初 に、患者は気管支鏡検査を受け、障害の程度を評価され得る。可能な限り大きな 腫瘍を内視鏡検査的に切除する。好ましくは、患者は、局部麻酔または全身麻酔 下で気管支鏡検査を受ける。Stifcortm気管支経由(trnasbronchial)吸引用針（2 1g）を、気管支鏡のバイオプシーチャネルを通して入れる。次いで、残存腫瘍部 位に、約10mlまたはそれ未満のような小容量でp53アデノウィルスを注射する。 いかなる場合においても、用いるアデノウィルスは複製不能であるため、健常 被験体でのウィルス自体の有害な作用は全く予想されない。しかし、急性または 遅延の悪性反応を監視するために少なくとも48時間の処置の間は、患者を入院さ せる。ヒトにおける遺伝子転移媒体としての複製不全アデノウィルスの使用の安 全に関する事柄は過去に述べられている（Rosenfeldら、1992；Jaffeら、1992） 。しかし、投与し得るアデノウィルスの用量は、都合の悪い副作用の可能性をさ らに最小にするために適時モニターされるべきである。 応答の必要の存在または毒性の存在を示すとして考慮すべき種々の判断基準が ある。毒性の存在を決定することを補助するために、腫瘍床(bed)を、治療コー スの前に写真撮影するべきである。最大直径およびその直交する直径を測定する 。サイズは、直径の積として記録する。これらのデータから、腫瘍の再増殖速度 をこれらの数字から計算し得る。 進行に対する時間もまた、進行性疾患の徴候があるまで、腫瘍塊の減少を伴う 最初の観測から測定され得る。進行性疾患を、測定病巣の直径の積の和において 25％以上の増加として定義する。進行の指摘がなされる前に、患者は、少なくと も２コースの治療を受けなければならない。患者の生存は、プロトコルへの参加 から測定される。 追跡試験は、ガン治療において日常的に用いられるすべての試験を包含し得る 。試験は、臨床上の徴候を監視する工程ならびに種々のp53遺伝子の発現パター ンを評価する標準的な分子生物学的分析のためのバイオプシーを行う工程を包含 する。これはまた、転移遺伝子を受け入れた細胞数に関する情報およびインビボ での相対的プロモーター強度に関する情報を提供する。得られたデータに基づき 、処置に対して調節することが望ましいとされ得る。これらの調節は、異なるプ ロモーターを使用するアデノウィルス構築物、または組換え遺伝子の非生理学的 な過剰発現を行うことなく、さらに多くの、もしくはすべての腫瘍細胞の感染を 確実にするために注射されるpfu数の変化を包含し得る。 アデノウィルスによりインビボで転移した外因性遺伝子の発現が、長期間にわ たり持続し得ることが期待される。ウィルスにより転移された外因性遺伝子の治 療に有効な長期発現は、個別の事例ごとに検討されなければならない。マーカー 遺伝子は、それらの有用性において、遺伝子発現の治療に関連した持続を評価す ることに限定されている。なぜなら、任意の与えられた遺伝子疾患の改善のため に必要とされる発現レベルは、他の疾患を完全に治癒するために必要とされるレ ベルとかなり異なるからである。 本発明の組成物および方法を好ましい実施態様によって記載してきたが、本発 明の概念、意図および範囲から逸脱しない限り、変化をこの組成物、方法、本明 細書に記載される工程または工程の順序において適用し得ることは当業者にとっ て明らかである。さらに詳細には、化学的および生理学的の両方で関連する特定 の薬剤は本発明に記載の薬剤と置換し得るが、同一の結果または同様の結果を達 成し得ることは明らかである。当業者に明らかなこのような置換および改変のす べては、添付の請求項により定義される本発明の意図、範囲および概念内である と見なされる。請求事項および方法のすべては行われ得、そして過度の試験を行 うことなく実行され得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 33/24 9551−4Ｃ Ａ６１Ｋ 33/24 35/76 8115−4Ｃ 35/76 38/00 ＡＤＵ 9051−4Ｃ 48/00 48/00 9051−4Ｃ 37/02 ＡＤＵ 51/00 8615−4Ｃ 43/00 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 グリム， エリザベス エイ. アメリカ合衆国 テキサス 77030， ヒ ューストン，ボルスオーバー 2324 (72)発明者 マックホパッドハイアイ， タパス アメリカ合衆国 テキサス 77030， ヒ ューストン，スタッフォード シア 7338， アパートメント １ (72)発明者 ザン， ウェイ−ウェイ アメリカ合衆国 イリノイ 60030， グ レイズレイク， カントリー ドライブ 1805， アパートメント 104 (72)発明者 オーウェン−シュアーブ， ローリー ビ ー. アメリカ合衆国 テキサス 77478， シ ュガー ランド，ウォーカー スクール ロード 1006

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．細胞を殺傷する方法であって、細胞をp53タンパク質または遺伝子およびDNA 損傷剤と、該細胞を殺傷するに有効な組合せ量で接触させる工程を包含する、方 法。 ２．前記細胞が、Ｘ線放射線、UV照射、γ線照射、マイクロ波、アドリアマイシ ン、5-フルオロウラシル、エトポシド、カンプトセシン、アクチノマイシンＤ、 マイトマイシンＣ、またはシスプラチンと組み合わせて、p53タンパク質または 遺伝子と接触される、請求項１に記載の方法。 ３．前記細胞が、シスプラチンと組み合わせて、p53タンパク質または遺伝子と 接触される、請求項２に記載の方法。 ４．前記細胞が、DNA損傷剤と組み合わせて、該細胞においてp53タンパク質を発 現する組換えベクターと接触される、請求項１に記載の方法。 ５．前記p53発現組換えベクターが、裸のDNAプラスミド、リポソーム内のプラス ミド、レトロウイルスベクター、AAVベクター、または組換えアデノウイルスベ クターである、請求項４に記載の方法。 ６．前記p53発現組換えベクターが組換えアデノウイルスベクターである、請求 項５に記載の方法。 ７．前記p53発現組換えベクターが、サイトメガロウイルスIEプロモーターの制 御下に位置するp53発現領域を含む組換えアデノウイルスベクターである、請求 項６に記載の方法。 ８．前記組換えアデノウイルスベクターが、p53発現領域、サイトメガロウイル スIEプロモーター、およびSV40初期ポリアデニル化シグナルを含む、請求項６に 記載の方法。 ９．アデノウイルスの複製に必須である少なくとも１つの遺伝子が、前記アデノ ウイルスベクター構築物から欠失しており、そして前記p53発現領域がその場所 に導入される、請求項６に記載の方法。 １０．前記アデノウイルスベクターのE1A領域およびE1B領域が欠失しており、そ して前記p53発現領域がそれらの場所に導入される、請求項９に記載の方法。 １１．前記組換えアデノウイルスベクターが組換えアデノウイルス内に存在する 、請求項６に記載の方法。 １２．前記細胞がまずp53タンパク質または遺伝子と接触され、次いでDNA損傷剤 と接触される、請求項１に記載の方法。 １３．前記細胞がまずDNA損傷剤と接触され、次いでp53タンパク質または遺伝子 と接触される、請求項１に記載の方法。 １４．前記細胞がp53タンパク質または遺伝子およびDNA損傷剤と同時に接触され る、請求項１に記載の方法。 １５．前記細胞が、p53タンパク質または遺伝子を含む第１の組成物およびDNA損 傷剤を含む第２の組成物と接触される、請求項１に記載の方法。 １６．前記第１または第２の組成物が薬理学的に受容可能な処方物中に分散され る、請求項１５に記載の方法。 １７．前記細胞が、DNA損傷剤と組み合わせてp53タンパク質または遺伝子を含む 単一の組成物と接触される、請求項１に記載の方法。 １８．前記組成物が薬理学的に受容可能な処方物中に分散される、請求項１７に 記載の方法。 １９．前記細胞が、DNA損傷剤と組み合わせて該細胞においてp53を発現する組換 えベクターを含む単一の組成物と接触される、請求項１７に記載の方法。 ２０．前記細胞が、DNA損傷剤と組み合わせて該細胞においてp53を発現する組換 えベクターを含む組換えアデノウイルスを含む単一の組成物と接触される、請求 項１９に記載の方法。 ２１．前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。 ２２．前記細胞が悪性細胞である、請求項１に記載の方法。 ２３．前記細胞が肺ガン細胞である、請求項２２に記載の方法。 ２４．前記細胞が乳ガン細胞である、請求項２２に記載の方法。 ２５．前記細胞がp53遺伝子に変異を有する、請求項２２に記載の方法。 ２６．前記細胞が動物内に位置し、そして前記p53タンパク質または遺伝子およ びDNA損傷剤が、薬理学的に受容可能な形態で動物に投与される、請求項１に記 載の方法。 ２７．ガンの処置方法であって、ガンを有する動物にp53タンパク質または遺伝 子およびDNA損傷剤の治療的に有効な組み合わせを投与する工程を包含する、処 置方法。 ２８．腫瘍細胞においてp53を発現する組換えベクターを含む組換えアデノウイ ルスを含む薬学的組成物の治療有効量を腫瘍部位中に注射する工程、および該腫 瘍をDNA損傷剤と接触させる工程を包含する、請求項２７に記載の方法。 ２９．前記腫瘍部位をＸ線放射線、UV照射、γ線照射、またはマイクロ波で照射 することにより、前記腫瘍がDNA損傷剤と接触される、請求項２８に記載の方法 。 ３０．DNA損傷化合物を含む薬学的組成物の治療有効量を前記動物に投与するこ とにより、前記腫瘍がDNA損傷剤と接触される、請求項２８に記載の方法。 ３１．前記DNA損傷化合物がシスプラチンである、請求項２８に記載の方法。 ３２．DNA損傷剤と組み合わせてp53タンパク質または遺伝子を含む、組成物。 ３３．アドリアマイシン、5-フルオロウラシル、エトポシド、カンプトセシン、 アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、またはシスプラチンと組み合わせてp5 3タンパク質または遺伝子を含む、請求項３２に記載の組成物。 ３４．シスプラチンと組み合わせて、p53タンパク質または遺伝子を含む、請求 項３３に記載の組成物。 ３５．DNA損傷剤と組み合わせて、動物細胞においてp53タンパク質を発現する組 換えベクターを含む、請求項３２に記載の組成物。 ３６．前記組換えベクターが、裸のDNAプラスミド、リポソーム内のプラスミド 、レトロウイルスベクター、AAVベクター、または組換えアデノウイルスベクタ ーである、請求項３５に記載の組成物。 ３７．前記組換えベクターが組換えアデノウイルスベクターである、請求項３６ に記載の組成物。 ３８．前記組換えベクターが、組換えアデノウイルス粒子内に存在する組換えア デノウイルスベクターである、請求項３７に記載の組成物。 ３９．シスプラチンと組み合わせて、組換えアデノウイルス粒子内に存在する組 換えアデノウイルスベクターを含む、請求項３２に記載の組成物。 ４０．薬理学的に受容可能な処方物中に分散される、請求項３２に記載の組成物 。 ４１．病変内投与のために処方される、請求項４０に記載の組成物。 ４２．適切な容器手段中に、動物細胞においてp53タンパク質を発現する組換え ベクターの薬学的処方物、およびDNA損傷剤の薬学的処方物を含む、治療キット 。 ４３．前記組換えベクターおよび前記DNA損傷剤が単一の容器手段内に存在する 、請求項４２に記載のキット。 ４４．前記組換えベクターおよび前記DNA損傷剤が異なる容器手段内に存在する 、請求項４２に記載のキット。 ４５．動物細胞においてp53タンパク質を発現する組換えベクターを含む組換え アデノウイルスの薬学的処方物およびシスプラチンの薬学的処方物を含む、請求 項４２に記載のキット。 ４６．腫瘍細胞においてp53を発現する組換えベクターを含む組換えアデノウイ ルスを含む薬学的組成物の治療有効量を腫瘍部位中に注射する工程、および該腫 瘍をDNA損傷剤と接触させる工程を包含する、請求項２６に記載の方法。 ４７．前記腫瘍部位をＸ線放射線、UV照射、γ線照射、またはマイクロ波で照射 することにより、前記腫瘍がDNA損傷剤と接触される、請求項４６に記載の方法 。 ４８．前記腫瘍部位をＸ線放射線で照射することにより、前記腫瘍がDNA損傷剤 と接触される、請求項４７に記載の方法。 ４９．前記腫瘍部位をUV照射で照射することにより、前記腫瘍がDNA損傷剤と接 触される、請求項４７に記載の方法。 ５０．前記腫瘍部位をγ線照射で照射することにより、前記腫瘍がDNA損傷剤と 接触される、請求項４７に記載の方法。 ５１．前記腫瘍部位をマイクロ波で照射することにより、前記腫瘍がDNA損傷剤 と接触される、請求項４７に記載の方法。 ５２．DNA損傷化合物を含む薬学的組成物の治療有効量を動物に投与することに より、前記腫瘍がDNA損傷剤と接触される、請求項４６に記載の方法。 ５３．前記DNA損傷剤がシスプラチンである、請求項５２に記載の方法。 ５４．前記DNA損傷剤がドキソルビシンである、請求項５２に記載の方法。 ５５．前記DNA損傷剤がエトポシドである、請求項５２に記載の方法。 ５６．前記DNA損傷剤がベラパミルである、請求項５２に記載の方法。 ５７．前記DNA損傷剤がポドフィロトキシンである、請求項５２に記載の方法。 ５８．前記DNA損傷剤が5-FUである、請求項５２に記載の方法。 ５９．前記腫瘍部位をＸ線放射線で照射することにより、前記腫瘍がDNA損傷剤 と接触される、請求項２９に記載の方法。 ６０．前記腫瘍部位をUV照射で照射することにより、前記腫瘍がDNA損傷剤と接 触される、請求項２９に記載の方法。 ６１．前記腫瘍部位をγ線照射で照射することにより、前記腫瘍がDNA損傷剤と 接触される、請求項２９に記載の方法。 ６２．前記腫瘍部位をマイクロ波で照射することにより、前記腫瘍がDNA損傷剤 と接触される、請求項２９に記載の方法。 ６３．DNA損傷化合物を含む薬学的組成物の治療有効量を動物に投与することに より、前記腫瘍がDNA損傷剤と接触される、請求項２６に記載の方法。 ６４．前記DNA損傷剤がドキソルビシンである、請求項２８に記載の方法。 ６５．前記DNA損傷剤がエトポシドである、請求項２８に記載の方法。 ６６．前記DNA損傷剤がベラパミルである、請求項２８に記載の方法。 ６７．前記DNA損傷剤がポドフィロトキシンである、請求項２８に記載の方法。 ６８．前記DNA損傷剤が5-FUである、請求項２８に記載の方法。 ６９．前記p53遺伝子またはタンパク質が前記DNA損傷剤より前に投与される、請 求項２６に記載の方法。 ７０．前記p53遺伝子またはタンパク質が前記DNA損傷剤より後に投与される、請 求項２６に記載の方法。 ７１．前記p53遺伝子またはタンパク質が前記DNA損傷剤と同時に投与される、請 求項２６に記載の方法。 ７２．前記p53遺伝子またはタンパク質が前記DNA損傷剤より前に投与される、請 求項２７に記載の方法。 ７３．前記p53遺伝子またはタンパク質が前記DNA損傷剤より後に投与される、請 求項２７に記載の方法。 ７４．前記p53遺伝子またはタンパク質が前記DNA損傷剤と同時に投与される、請 求項２７に記載の方法。
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