RS63295B1 - Anti-vista antitela i fragmenti - Google Patents

Anti-vista antitela i fragmenti

Info

Publication number
RS63295B1
RS63295B1 RS20220562A RSP20220562A RS63295B1 RS 63295 B1 RS63295 B1 RS 63295B1 RS 20220562 A RS20220562 A RS 20220562A RS P20220562 A RSP20220562 A RS P20220562A RS 63295 B1 RS63295 B1 RS 63295B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
vista
cells
seq
human
Prior art date
Application number
RS20220562A
Other languages
English (en)
Inventor
Linda Snyder
Gordon Powers
Original Assignee
Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52444326&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63295(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Janssen Pharmaceutica Nv filed Critical Janssen Pharmaceutica Nv
Publication of RS63295B1 publication Critical patent/RS63295B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57505—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the blood, e.g. leukaemia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5751—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the skin, e.g. melanoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0001] Ekspresija negativnih regulatora imunih kontrolnih tačaka od strane ćelija kancera ili imunih ćelija u tumorskom mikrookruženju može suprimirati imuni odgovor domaćina protiv tumora. Za efikasnu borbu protiv kancera, poželjno je blokirati supresiju imunog odgovora domaćina koja je posredovana tumorom. Prema tome, postoji potreba za novim i efikasnim terapeutskim sredstvima koji inhibiraju negativne regulatore imunih kontrolnih tačaka u tumorskom mikrookruženju koji suprimiraju imune odgovore protiv tumora. WO 2011/120013 se odnosi na protein, označen PD-L3 ili imunoglobulinski supresor aktivacije T ćelija V domena (VISTA), koji ima sličnosti sa članovima PD-L1 familije.
SUŠTINA PRONALASKA
[0002] Pronalazak je definisan u pratećim patentnim zahtevima. Predmetni pronalazak se odnosi na izolovana antitela i njihove fragmente antitela koji se vežu za V-domen Ig supresora T ćelijske aktivacije (VISTA), pri čemu pomenuto antitelo ili njegov fragment antitela sadrži varijabilni polipeptid teškog lanca SEQ ID NO: 37 i varijabilni polipeptid lakog lanca SEQ ID NO: 44. VISTA je regulator kontrolne tačke koji negativno suprimira imune odgovore. Videti Wang et al., "VISTA, a novel mouse Ig superfamily ligand that negatively regulates T cell responses," J. Exp. Med., 208(3) 577-92 (2011). Eksprimiran je na normalnim humanim neutrofilima, monocitima i podsetovima T ćelija. Dodatno, ćelije cinomolgus majmuna eksprimiraju VISTA prema sličnom obrascu u odnosu na normalne humane ćelije. VISTA je takođe eksprimiran u ćelijama periferne krvi pacijenata koji imaju kancer.
[0003] Vezivanje antitela ili fragmenta antitela za VISTA modulira ili pojačava imuni odgovor. Fragment antitela može uključiti, na primer, Fab, F(ab’)2, ili scFv fragment antitela. Antitelo ili fragment antitela može sadržati konstantni region antitela. Antitelo ili fragment antitela može se vezati za VISTA koji je eksprimiran na hematopoetskoj ćeliji, na primer, mijeloidnoj ćeliji i/ili limfocitu, monocitu ili neutrofilu, T ćeliji, ćeliji prirodnoj ubici (NK), prirodnoj T ćeliji ubici (NKT) tumorskoj ćeliji, i/ili u tumorskom mikrookruženju (TME). Tumorsko mikrookruženje je ćelijsko okruženje tumora. Može uključiti imune ćelije u okruženju, fibroblaste, krvne sudove, druge ćelije, signalne molekule, i vanćelijski matriks.
[0004] Antitelo ili fragment antitela sadrži sva tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDRs) i sva 3 CDRs lakog lanca anti-VISTA antitela VSTB112 (S2), VSTB140, VSTB149, ili VSTB174. Ovde su prikazani, ali nije zahtevano su antitela ili fragmenti antitela koji sadrže jedan ili više CDRs teškog lanca i/ili jedan ili više CDRs lakog lanca, ukljčujući jedan ili više CDRs (npr., sva tri CDRs teškog lanca, sva 3 CDRs lakog lanca, ili svih 6 CDRs) bilo kog od ostalih ovde opisanih anti-VISTA antitela, uključujući antitela označena sa VSTB116 (S5), VSTB95 (S16), VSTB50 (S41), VSTB53 (S43) i VSTB60 (S47). U nekim izvođenjima, antitela ili njihovi fragmenti su izabrani iz grupe koja se sastoji iz VSTB112, VSTB140, VSTB149, i VSTB174. Ovde prikazani, ali nije zahtevano su antitela ili njihovi fragmenti izabrani iz grupe koja obuhvata VSTB95, VSTB116, VSTB50, VSTB53 i VSTB60. U jednom izvođenju, antitela ili fragmenti antitela sadrže bar jedan težak lanac i bar jedan laki lanac anti-VISTA antitela VSTB112 (S2), VSTB140, VSTB149, ili VSTB174. Ovde prikazana, ali nije zahtevano su antitela ili fragmenti antitela koja dalje mogu sadržati bar jedan težak lanac i bar jedan laki lanac bilo kog od drugih ovde opisanih anti-VISTA antitela. U nekim izvođenjima, antitelo ili fragment antitela sadrži bar jedan težak lanac koji se sastoji iz varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 37, i bar jedan laki lanac koji se sastoji iz varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 44. Antitelo kao što je definisano u pratećim zahtevima sadrži region humanog regiona okvira. U nekim izvođenjima, antitelo je puno antitelo. U nekim izvođenjima, fragment je anti-VISTA vezujući član. Ovde takođe prikazano ali nije zahtevano, CDRs teškog lanca antitela su predstavljeni u SEQ ID NOs: 1, 2, i 3 i CDRs lakog lanca su predstavljeni u SEQ ID NOs: 4, 5, i 6. Ovde takođe prikazano ali nije zahtevano, aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i lakog lanca su redom predstavljene u SEQ ID NOS: 7 i 8.
[0005] Ovde takođe prikazana ali nisu zahtevana su anti-VISTA antitela koja su u suštini slična sa ovde opisanim antitelima; na primer, antitelo ili fragment koji sadrži VH domen antitela sadrži VH CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je u suštini slična sa SEQ ID NO: 1, VH CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je u suštini slična sa SEQ ID NO:2 i VH CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je u suštini slična sa SEQ ID NO:3, i koja dalje sadrži VL domen antitela koji sadrži VL CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je u suštini slična sa SEQ ID NO:4, VL CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je u suštini slična sa SEQ ID NO:5 i VL CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je u suštini slična sa SEQ ID NO:6.
[0006] Ovde takođe prikazana ali nisu zatražena su anti-VISTA antitela koja kompetitivno inhibiraju, ili su u kompeticiji za vezivanje sa, ovde opisanim anti-VISTA antitelima.
[0007] U nekim izvođenjima, anti-VISTA antitela su deo konjugata, na primer, konjugata koji sadrži citotoksični molekul ili drugo ovde opisano sredstvo. Takvi molekuli su dobro poznati u oblasti tehnike.
[0008] U nekim izvođenjima, antitelo ili fragment antitela je monoklonsko antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je himerno, humanizovano ili humano antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo ili fragment antitela sadrži humani konstantni region. U nekim izvođenjima, antitelo ili fragment antitela je specifičan za epitop VISTA, npr., koji se nalazi u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 9. U nekim izvođenjima, antitelo ili fragment antitela se veže za epitop VISTA sa afinitetom od bar 1x10<-7>litra/molu, na primer, od bar 1x10<-8>litra/molu, na primer, bar 1x10<-9>litra/molu.
[0009] U nekim izvođenjima, modulacija imunog odgovora obuhvata povećanje u CD45+ leukocitima, CD4+ T ćelijama, i/ili CD8+ T ćelijama. U nekim izvođenjima, modulacija imunog odgovora obuhvata pojačanu proizvodnju (npr., T-ćelijskih) citokina (npr., IFNγ, IL-10, TNFα, IL-17), pojačani odgovor T-ćelija, i/ili modulaciju ekspresije Foxp3.
[0010] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na kompozicije koje sadrže antitelo ili fragment antitela iz pronalaska (npr., anti-VISTA antitelo) i farmaceutski prihvatljivi nosač, rastvarač, ili ekscipijens. Na primer, kompozicija može sadržati VISTA antagonist koji sadrži antitelo ili njegov fragment antitela koji sadrži region koji vezuje antigen koji se veže za VISTA, i vakcinu (kao što je vakcina virusnog vektora, bakterijska vakcina, DNK vakcina, RNK vakcina, peptidna vakcina). U nekim izvođenjima, kompozicija je farmaceutska kompozicija i vezivanje antitela ili fragmenta antitela za VISTA modulira ili pojačava imuni odgovor.
[0011] Pronalazak se takođe odnosi na antitelo ili fragment antitela ili kompoziciju kao što je definisano u pridruženim zahtevima za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera koja obuhvata davanje individui (npr., sisaru, npr., čoveku ili nehumanoj životinji) kome je potrebno efikasne količine bar jednog antitela, fragmenta antitela, ili kompozicije koji su ovde opisani.
[0012] U nekim izvođenjima, antitelo ili fragment antitela veže se za VISTA, time modulišući ili pojačavajući imunogeni odgovor na kancer. U nekim izvođenjima, kancer je leukemija, limfom, mijelodisplastični sindrom i/ili mijelom. U nekim izvođenjima, kancer može biti bilo koje vrste ili tip leukemije, uključujući limfocitnu leukemiju ili mijelogenu leukemiju, kao što je, npe., akutna limfoblastna leukemija (ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL), akutna mijeloidna (mijelogena) leukemija (AML), hronična mijelogena leukemija (CML), leukemija dlakaste ćelije, T-ćeljska prolimfocitna leukemija, velika granularna limfocitna leukemija, ili leukemija T-ćelija kod odraslih. U nekim izvođenjima, limfom je histocitni limfom, i u nekim izvođenjima, kancer je multipli mijelom. U nekim izvođenjima, kancer je solidni tumor, na primer, melanom, ili kancer bešike. U nekim izvođenjima, kancer je kancer pluća (npr., karcinom nemalih ćelija pluća (NSCLC)). Neke upotrebe dalje sadrže davanje vakcine (kao što je vakcina virusnog vektora, bakterijska vakcina, vakcina zasnovana na ćeliji, DNK vakcina, RNK vakcina, peptidna vakcina, ili proteinska vakcina). Pronalazak se takođe odnosi na antitelo ili fragment antitela ili kompoziciju kao što je definisano u pridruženim zahtevima za upotrebu u suprimiranju tumorskog rasta kod individue kojoj je potrebno, pomenuta upotreba obuhvata davanje efikasnog antitela ili fragmenta antitela ili kompozicije koja se ovde opisuje.
[0013] Kompozicija, antitelo ili fragment ili drugo farmaceutsko sredstvo (npr., vakcina) mogu se davati bilo kojim parenteralnim ili neparenteralnim načinima, na primer, intravenozno (IV), subkutanozno (SQ) ili oralno (PO).
[0014] U nekim izvođenjima, kompozicija, antitelo ili fragment je davano kvartalno, nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, ili jednom svake četiri nedelje. U nekim izvođenjima, druga farmaceutska ili terapeutska sredstva su davana istovremeno, pre, tokom ili nakon antitela, fragmenata i kompozicija koje su ovde opisane. Istovremeno davano sredstvo može se davati istim načinom primene kao antitelo, fragment ili kompozicija, ili različitim načinom.
[0015] Pronalazak takođe uključuje postupke za dobijanje antitela, fragmente i kompozicije, na primer, postupak za dobijanje antitela ili fragmenta iz pronalaska koji obuhvata kultivisanje ćelija domaćina pod uslovima za proizvodnju pomenutog antitela. Postupak dalje može sadržati izolovanje antitela. Pronalazak se takođe odnosi na nukleinske kiseline, npr., izolovane nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira antitela i fragmente, ekspresione vektore koji se sastoje iz takvih nukleinskih kiselina npr., u operativnoj vezi sa promotorom, i ćelije domaćina koje su transformisane sa takvim ekspresionim vektorom.
[0016] Pronalazak se takođe odnosi na komplete i na proizvodne artikle koji sadrže kompoziciju koja se sastoji iz anti-VISTA antitela i kontejnera, i dalje sadrži umetak pakovanja ili etiketu koja označava da se kompozicija može koristiti za lečenje kancera.
[0017] Izolovano antitelo ili njegov fragment antitela kao što je definisano u pridruženim zahtevima koji sadrži region za vezivanje antigena koji se veže za V-domen Ig supresora T ćelijske aktivacije (VISTA), pri čemu antitelo sadrži VH domen antitela koji se sastoji iz varijabilnog polipeptida teškog lanca SEQ ID NO: 37 koji sadrži VH CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25, VH CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26 i VH CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27, i koji dalje sadrži VL domen antitela koji sadrži varijabilni polipeptid lakog lanca SEQ ID NO: 44 koji sadrži VL CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28, VL CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29 i VL CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30. Antitelo ili fragment antitela kao što je definisano u pridruženim zahtevima sadrži jedan ili više humanizovanih ili humanih regiona okvira. Antitelo ili fragment antitela sadrži VH domen antitela koji sadrži SEQ ID NO:37 i VL domen antitela koji sadrži SEQ ID NO:44. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca (npr., konstantni region humanog teškog lanca) i/ili konstantni region lakog lanca (npr., konstantni region humanog lakog lanca, kao što je konstantni region lakog lanca koji se nalazi u SEQ ID NO:56). Poželjno, konstantni region teškog lanca je konstantni region teškog lanca IgG1 (npr., konstantni region teškog lanca IgG1 koji je prikazan u SEQ ID NO:61). U posebnom izvođenju, konstantni region teškog lanca IgG1 je modifikovan kako bi se pojačala otpornost antitela na proteazu. Primer konstantnog regiona teškog lanca IgG1 koji je modifikovan da bi se pojačala otpornost na proteazu je konstantni region teškog lanca IgG1 koji je predstavljen u SEQ ID NO:60. U određenim izvođenjima, antitelo ili fragment antitela sadrži težak lanac koji se sastoji iz SEQ ID NO:60 i laki lanac koji se sastoji iz SEQ ID NO:56; ili težak lanac koji se sastoji iz SEQ ID NO:61 i laki lanac koji se sastoji iz SEQ ID NO:56. U posebnom izvođenju, antitelo ili fragment antitela je eksprimiran u ćeliji kojoj nedostaju enzimi za fukozilaciju (npr., ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) kojoj nedostaju enzimi za fukozilaciju).
[0018] Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov fragment antitela kao što je definisano u pratećim zahtevima koji sadrži VH domen antitela koji sadrži variijabilni polipeptid teškog lanca SEQ ID NO: 37 koji sadrži VH CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25, VH CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26 i VH CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27, i koji dalje sadrži VL domen antitela koji sadrži polipeptid varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 44 koji sadrži VL CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28, VL CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29 i VL CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; i farmaceutski prihvatljiv nosač, rastvarač, ili ekscipijens.
[0019] U drugom izvođenju, pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela koje se vezuje za V-domen Ig supresora T ćelijske aktivacije (VISTA) kao što je definisano u pridruženim zahtevima, gde antitelo sadrži VH domen antitela koji sadrži varijabilni polipeptid teškog lanca SEQ ID NO: 37 koji sadrži VH CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25, VH CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26 i VH CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27, i koji dalje sadrži VL domen antitela koji sadrži varijabilni polipeptid lakog lanca SEQ ID NO: 44 koji sadrži VL CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28, VL CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29 i VL CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30, za upotrebu u lečenju kancera kod individue kojoj je potrebno. U posebnom izvođenju, kancer je kancer pluća. U drugom izvođenju, kancer pluća je karcinom nemalih ćelija pluća (NSCLC). U nekim izvođenjima, upotreba dalje obuhvata davanje drugog tretmana protiv kancera (npr., operacija, hemoterapija, terapija zračenjem, biološka terapija, imunomodulatorna terapija, i njihove kombinacije).
[0020] Antitelo ili njegov fragment antitela koji se sastoji iz regiona koji vezuje antigen koji se veže za V-domen Ig supresora T ćelijske aktivacije (VISTA), kao što je definisano u pridruženim zahtevima, veže se za konformacioni epitop u VISTA (npr., humani VISTA). Ovde prikazani ali nisu zahtevani, antitelo ili njegov fragment antitela sastoji se iz regiona koji vezuje antigen koji se veže za V-domen Ig supresora T ćelijske aktivacije (VISTA) vezuje se za konformacioni epitop koji sadrži, ili se nalazi unutar, ostataka 103-111 (NLTLLDSGL (SEQ ID NO:62)) i 136-146 (VQTGKDAPSNC (SEQ ID NO:63)) humanog VISTA (SEQ ID NO:46). Antitelo ili njegov fragment antitela sadrži region koji se vezuje za antigen koji se veže za V-domen Ig supresora T ćelijske aktivacije (VISTA), kao što je definisano u pridruženim zahtevima, vezuje se za konformacioni epitope koji sadrži, ili se nalazi unutar, ostataka 24-36 (LLGPVDKGHDVTF (SEQ ID NO:64)), 54-65 (RRPIRNLTFQDL (SEQ ID NO:65) i 100-102 (TMR) humanog VISTA (SEQ ID NO:46), kao i FG petlji humanog VISTA (SEQ ID NO:46).
[0021] Dodatno, pronalazak se odnosi na antitelo koje vezuje V-domen Ig spresora T ćelijske aktivacije (VISTA), ili njegov fragment antitela, koji sadrži region koji vezuje antigen koji se veže VISTA kao što je definisano u pratećim zahtevima, za upotrebu u pokretanju imunog odgovora u individui kojoj je potreban, time pojačavajući imuni odgovor na kancer. U posebnom izvođenju, imuni odgovor je imuni odgovor protiv tumora.
[0022] U drugom izvođenju, pronalazak obezbeđuje antitelo koje vezuje V-domen Ig supresora T ćelijske aktivacije (VISTA), ili njegov fragment antitela, koji sadrži region koji vezuje antigen koji se veže za VISTA kao što je definisano u pratećim zahtevima, za upotrebu u pokretanju biološkog odgovora u individui kojoj je potreban, time pojačavajući imuni odgovor na kancer. Primeri bioloških odgovora uključuju aktivaciju monocita; indukciju proliferacije T ćelija i lučenje citokina; citotoksičnost posredovanu ćelijama koja zavisi od antitela
[0023] (ADCC) ćelija koje eksprimiraju VISTA; i fagocitoza ćelija koja zavisi od antitela (ADCP) ćelija koje eksprimiraju VISTA.
KRATAK OPIS NACRTA
[0024] Patent ili dokument prijave sadrži bar jedan nacrt izveden u boji. Zavod će obezbediti kopije ovog patenta ili objave prijave patenta sa nacrt(ima)om po zahtevu i uplati neophodne takse.
Slika 1A-1C: Grafici koji pokazuju ekspresiju VISTA na TF1 AML ćelijama Ekspresija VISTA proteina sa protočnom citometrijom je prikazana u TF-1 AML ćelijskoj liniji.
Slika 2A-2E: Grafici koji pokazuju bojenje i strategije gejtinga za identifikaciju humanih mijeloidnih i limfoidnih podsetova.
Slika 3A-3G: Grafici koji pokazuju ekspresiju VISTA na humanim mijeloidnim i limfoidnim podsetovima iz jednog zdravog normalnog donora.
Slika 4: Grafik koji pokazuje ekspresiju VISTA na humanim mijeloidnim i limfoidnim podsetovima kroz brojne zdrave normalne donore.
Slika 5A-5B: Grafik koji pokazuje bojenje i strategije gejtinga za identifikaciju ekspresije VISTA na humanim monocitima i makrofagima.
Slika 6A-6C: Grafici koji pokazuju ekspresiju VISTA na humanim monocitima i makrofagima.
Slika 7A-7E: Grafici koji pokazuju bojenje i strategije gejtinga za identifikaciju ekspresije VISTA na podsetovima humanih T i NK ćelija.
Slika 8A-8G: Grafici koji pokazuju ekspresiju VISTA na podsetovima humanih T i NK ćelijskih podsetova iz jednog zdravog normalnog donora.
Slika 9: Grafik koji pokazuje ekspresiju VISTA na podsetovima humanih T i NK ćelijama kroz brojne zdrave normalne donore.
Slika 10A-10D: Grafici koji pokazuju bojenje i strategije gejtinga za identifikaciju ekspresije VISTA na podsetovima humanih dendritičnih ćelija.
Slika 11A-11C: Grafici koji pokazuju ekspresiju VISTA na podsetovima humanih dendritičnih ćelija i bazofila iz jednog zdravog normalnog donora.
Slika 12: Grafici koji pokazuju ekspresiju VISTA na podsetovima humanih dendritičnih ćelija i bazofila kroz brojne zdrave normalne donore.
Slika 13A-13D: Analiza VISTA ekspresije na ćelijama periferne krvi zdravog čoveka. Profil VISTA ekspresije na na ćelijama periferne krvi zdravog čoveka: Uzorci cele krvi iz 2 različite individue su analizirani za VISTA ekspresiju na (Slika 13A) monocitima SSC<lo>,CD11b<hi>CD14<hi>CD16<-ve>CD33<+ve>HLA-DR<+ve>CD19<-ve>) (Slika 13B) neutrofili (SSC<hi>CD177+CD11b<hi>CD14<lo>CD16<+ve>CD33<+ve>HLA-DR<-ve>CD19<-ve>). Mononuklearne ćelije iz periferne krvi su analizirane korišćenjem gradijenta Fikola za for analizu (Slika 13C) CD4+ T ćelija (CD3<+ve>CD4<+ve>), i (Slika 13D) CD8+ T ćelija (CD3<+ve>CD8<+ve>).
Slika 14A-14C: Analiza VISTA kspresije u ćelijama periferne krvi iz pacijenta koji ima kancer pluća i donora zdrave kontrole. Profil VISTA ekspresije naćelijama periferne krvi kod pacijenta koji ima kancer pluća korišćenjem multikolorne protočne analize: Reprezentativni FACS dijagram (Slika 14A) iz jedne individue je prikazan. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi su izolovane sa Fikolom i analizirane su za VISTA ekspresiju na (Slika 14B) monocitima (CD14+ CD11b+ CD33+ HLADR+ CD15-) i (Slika 14C) supresorskim ćelijama izvedenim iz mijeloida (CD14- CD11b+ CD33-HLADR-CD15+ CD16+).
Slika 15A-15C: Profil VISTA ekspresije u ćelijama periferne krvi iz pacijenta koji ima kancer debelog creva, korišćenjem analize multikolorne protočne citometrije: Reprezentativni FACS dijagram (Slika 15A) iz jedne individue je prikazan. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi su izolovane sa Fikolom i analizirane su za VISTA ekspresiju na (Slika 15B) monocitima (CD14+ CD11b+ CD33+ HLADR+ CD15) i (Slika 15C) supresorskim ćelijama izvedenim iz mijeloida (CD14- CD11b+ CD33-HLADR-CD15+ CD16+).
Slika 16A-16D: Profil VISTA ekspresije na ćelijama periferne krvi Cinomolgus majmuma korišćenjem analize multikolorne protočne citometrije: Cela krv iz 4 različita majmuna je analizirana na VISTA ekspresiju na (Slika 16A) monocitima (SSC<lo>CD11b<hi>CD14<hi>HLA-DR<hi>CD16<-ve>CD19<-ve>i (Slika 16B) neutrofili CD11b<hi>CD14<lo>HLADR<-ve>CD16<-ve>CD19<-ve>. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi iz tri majmuna su izolovani iz gradijenta Fikola za analizu (Slika 16C) CD4+ T ćelija (TCRα/β<+ve>CD4<+ve>) i (Slika 16D) CD8+ T ćelije (TCRα/β<+ve>CD8<+ve>).
Slika 17: Grafik koji pokazuje apsolutne vrednosti ekspresije oVISTA RNK u Heme ćelijskim linijama.
Slika 18: Mišje A20 ćelije su stabilno transfektovane sa ili GFP ili humanim VISTA. Inkubirane su sa ova peptidom i sa DO11.10 T ćelijama. Ekspresija CD25 od strane T ćelija je merena 24 h nakon započete inkubacije. A20-huVISTA ćelije suprimiraju CD25 ekspresiju od strane T ćelija, ali ovo očitavanje je značajno obnovljeno inkubacijom sa VSTB95.
Slika 19A-19F: Grafik koji pokazuje Human VISTA ELISA results.
Slika 20A-20F: Humani VISTA FACS rezultati, koji pokazuju vezivanja anti-VISTA antitela za ćelije koje eksprimiraju humani VISTA.
Slika 21A-21D: Studija razblaženja 6 kandidata anti-VISTA antitela u reakciji pomešanih limfocita od 30 µg/ml do 0.0 µg/ml.
Slika 22A-22B: Studije razblaženja 6 kandidata anti-VISTA antitela u SEB testu (individualna CPM brojanja i koncentracije IFN-g) od 30 µg/ml do 0.0 µg/ml.
Slika 23: Grafikon senzorgrama korišćenjem anti-VISTA antitela VSTB85 obloženog na Proteon SPR čipu i VISTA proteinom sa označenim kompetitorima nanetim preko čipa (kompetitori naznačeni u Tabeli 16).
Slika 24: Dizajn eksperimenta za MB49 model tumora bešike miša
Slika 25A-25B: Rast MB49 tumora kod ženki C57Bl/6 miševa. Grafici ilustruju tumorski rast kod individualnih miševa koji su tretirani sa anti-mišjim VISTA antitelom (Slika 25B) ili kontrom IgG (Slika 25A).
Slika 26: Aminokiselinska sekvenca humanog VISTA (SEQ ID NO:46).
Slika 27: Višestruko poravnanje sekvenci VISTA ortologa
Slika 28: Regioni humanog VISTA vezanog sa VSTB50 i VSTB60 antiteloma (vrh) ili VSTB95 i VSTB112 antitelima (dno), kao što je određeno sa HDX
Slika 29: VISTA Epitop vezan sa VSTB112. (Vrh) VISTA je prikazan na crtežu sa obeleženim lancima. Ostaci koji imaju bar jedan atom unutar 5 Å VSTB112 u kompleksu su obojeni plavo. Plave i oranž sfeer označavaju prekid lanca, i cijano i zelene sfere obeležavaji N- i C-krajeve VISTA strukture, redom. (Dno) Sekvenca VISTA konstrukta korišćena u određivanju struktre. Krugovi ispod sekvence su korišćeni da bi se označili ostaci koji ostvaraju kontakte samo glavnog lanca sa VSTB112, trouglovi označavaju kontakt bočnog lanca, i kvadrati označavaju kontakt bočnog lanca rezultuje rezultuje u ili vodoničnoj vezi ili interakciji mosta soli kao što je izračunato sa PISA. Oblici su obojeni da označe to CDR sa najvećim brojem atoma u kontaktu sa datim ostatkom sa bojama definisanim CDR na Slici 59. Sekundarni strukturalni elementi su kao što je definisano u programu MOE sa žutim strelicama koje predstavljaju β-lance i crvenim trouglovima koji označavaju α-helikse.
Slika 30: VSTB112 Paratop. (Vrh) VISTA antigen je prikazan u ilustraciji i VSTB112 unutar 5 angstroma (Å) VISTA je prikazan na površini sa bojama koje su korišćene da označe identitet CDR kao što je označeno u sekvenci ispod. Ostataci kontakta regiona okvira koji su susedni sa CDR su obojeni slično sa odgovarajućim CDR (Dno) Sekvenca VSTB112 Fv regiona. Obojene pozadine označavaju CDRs u skladu sa Kabat definicijama. Krugovi ispod sekvence su korišćeni da bi se označili ostaci koji mogu ostvariti samo kontakte glavnog lanca sa VISTA, trouglovi označavaju kontakt bočnog lanca, i kvadrati označavaju kontakt bočnog lanca rezultuje u ili vodoničnoj vezi ili interakciji mosta soli kao što je izračunato sa PISA.
Slika 31: Poređenje regiona epitopa koji su identifikovani kristalografijom izmenom vodonika deuterijumom (HDX). Sekvenca VISTA konstrukta koja je korišćena u određivanju strukture. Krugovi ispod sekvence su korišćeni da bi se označili ostaci koji ostvaraju kontakte samo glavnog lanca sa VSTB112, trouglovi označavaju kontakt bočnog lanca, i kvadrati označavaju kontakte bočnog lanca rezultuje u ili vodoničnoj vezi ili interakciji mosta soli kao što je izračunato sa PISA.
Slika 32: Aktivacija CD14<+>monocita u punim PBMC sa VSTB174 (izvedeno od VSTB112). U svakom delu eksperimenta, ćelije su inkubirane sa PBS, IgG1 kontolnim antitelom, ili VSTB174 u 1, 0.1 ili 0.01 ug/ml. Levi panel pokazuje CD80 MFI; desni panel pokazuje HLA-DR MFI (prikazana su dva ispitana donora sa reprezentativnim rezultatima).
Slika 33: Grafik koji pokazuje ADCC aktivnost VSTB174 usmerenu protiv K562-VISTA ćelija.
Slika 34: Grafik koji ADCP aktivnost VSTB174 usmerenu protiv K562-VISTA ćelija. Oba prikazana antitela imaju isti Fab, ali VSTB174 ima IgG1 Fc i VSTB140 ima Fc tihi IgG2.
Slika 35: Grafik koji pokazuje fagocitozu posredovanu sa VSTB174, VSTB149 ili VSTB140 mAt-a protiv K562-VISTA. Svako mAt je ispitano sa 7 pola log doza, opsega od 0.0008 µg/ml do 0.56 ug/ml.
Slika 36: Grafik koji pokazuje fagocitozu posredovanu sa VSTB174, VSTB149 ili VSTB140 mAt-a protiv ćelija K562 linije ćelija mijeloma. Svako mAt je ispitano sa 7 pola log doza, opsega od 0.0008 µg/ml do 0.56 ug/ml.
Slika 37: Studija efikasnosti tumora MB49 koja procenjuje VSTB1231, 5, 7.5, i 10 mg/kg kod ženki VISTA-KI miševa. Zapremine tumora bile su približno 50 mm<3>kada se počelo sa doziranjem u danu 6 nakon implanta. VSTB123 je VSTB112 Fab koji je presađen na mišju Fc skelu i vezuje se za humani VISTA u VISTA-KI mišu.
Slika 38: Grafik koji pokazuje da CD14<+>ćelije koje eksprimiraju visok/srednje nivoe VISTA su pronađeni kod 13/13 uzorcima kancera pluća, kao i u udaljenom plućnom tkivu i perifernoj krvi pacijenata.
Slika 39: IHC bojenje za VISTA kod kancera pluća korišćenjem GG8.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0025] U nastavku sledi opis primera izvođenja iz pronalaska.
[0026] Prikaz se odnosi na antitela specifična za novi ligand familije imunoglobulina koji je označen V-domenom Imunoglobulina Supresora T ćelijske Aktivacije (VISTA) (Genbank: JN602184) (Wang et al., 2010, 2011). VISTA poseduje homologiju sa PD-L1 ali ispoljava jedinstveni obrazac ekspresije koji je ograničen na hematopojetski odeljak. Specifično, VISTA je konstitutivno i visoko eksprimiran na CD11b<visoko>mijeloidnim ćelijama, i eksprimiran je u nižim nivoima na CD4<+>i CD8<+>T ćelijama. Humani homolog deli približno 85% homologije sa mišjim VISTA ii ma slične obrasce ekspresije (Lines et al., Cancer Research 74:1924, 2014). VISTA eksprimiran na antigen prezentujućim ćelijama (APCs) suprimira proliferaciju CD4<+>i CD8<+>T ćelija i proizvodnju citokina preko srodnog receptora nezavisno od PD-1. U pasivnom EAE (eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis) modelu bolesti, VISTA specifično monoklonsko antitelo je pojačalo imune odgovore zavisne od T ćelija i pogoršalo je bolest. Prekomerna VISTA ekspresija na ćelijama tumora oslabila je zaštitni imunitet protiv tumora u domaćinima koji nose tumor. Ispitivanja humanog VISTA potvrdila su njegovu supresivnu funkciju na humanim T ćelijama (Lines et al Cancer Research 74:1924, 2014,. Ispitivanja od strane Flies et al. takođe su identifikovala VISTA (nazvana PD-1H) kao potentni imuni supresivni molekul (Flies et al., 2011). VISTA je dalje detaljno opisan u U.S. objavljenoj prijavi US 20130177557 A1 i U.S. Patent Br-a.
7,919,585 i 8,236,304.
[0027] VISTA je novi negativni regulator kontrolne tačke koji suprimira imune odgovore. Kao što je ovde opisano u Primeru 12, pokazano je da je tretman sa VISTA-specifičnim monoklonskim antitelom u modelima tumora kod miša preokrenuo supresivni karakter tumorskog imunskog mikrookruženja i pojačava zaštitni anti-tumorski imunitet, prema tome, pokazujući potencijal VISTA monoklonskog antitela kao novog terapeutika za imunoterapiju kancera.
ANTITELA I FRAGMENTI IZ PREDMETNOG PRONALASKA
[0028] Termin "antitelo" je namenjen da uključi poliklonska antitela, monoklonska antitela (mAt-a), himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela i anti-idiotipska (anti-Id) antitela, ka oi njihove fragmente, regione ili derivative, koji su obezbeđeni bilo kojom poznatom tehnikom, kao što je, ali nije ograničeno na, enzimsko cepanje, peptidnu sintezu ili tehnike rekombinacije. Anti-VISTA antitela iz predmetnog pronalaska su sposobna da se vežu za delove VISTA koji modulišu, regulišu, ili pojačavaju imuni odgovor. Ovde prikazana ali nisu zahtevana su antitela koja kompetitivno inhibiraju jedno ili više od ovde opisanih anti-VISTA antitela. Postupci za određivanje da li su dva ili više antitela u kompeticiji za vezivanje za istu metu su poznati u oblasti tehnike. Na primer, test kompetitivnog vezivanja može se koristiti da bi se odredilo da li jedno antitelo blokira vezivanje drugog antitela za metu. Obično, test kompetitivnog vezivanja uključuje upotrebu prečišćenog ciljnog antigena (npr., PD-1) koji je vezan ili za čvrsti supstrat ili ćelije, ispitivanjem vezivanja neobeleženog molekula, i obeleženog referentnog molekula. Kompetitivna inhibicija je merena određivanjem količine vezanog obeleživača za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu ispitivanog vezujućeg molekula. Obično ispitivani vezujući molekul se nalazi u višku. Obično, kada je kompetitivni vezujući molekul prisutan u višku, inhibiraće specifično vezivanje referentnog vezujućeg molekula za zajednički antigen najmanje 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, ili više. Kompetitivna inhibicija se može odrediti korišćenjem ELISA testa kompetitivne inhibicije.
[0029] Poliklonska antitela su heterogene populacije molekula antitela koje su izvedene iz seruma životinja imunizovanih sa antigenom. Monoklonsko antitelo sadrži u suštini homogenu populaciju antitela specifičnih za antigene, gde populacija sadrži u suštini slična mesta vezivanja epitopa. Monoklonska antitela se mogu dobiti korišćenjem postupaka koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Videti, kao primer Kohler i Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); U.S. Pat. No. 4,376,110; Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); i Harlow i Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993). Takva antitela mogu biti bilo koje klase imunoglobulina uključujući IgG, IgM, IgE, IgA, GILD i bilo koju njihovu podklasu. Hibridom koji proizvodi monoklonsko antitelo iz predmetnog pronalaska može se kultivisati in vitro, in situ ili in vivo.
[0030] Takođe prikazani ali nisu zahtevani digestioni fragmenti, određeni delovi i njihove varijante, uključujući mimetike antitela ili sadrži delove antitela koji imitiraju strukturu i/ili funkciju antiela ili određenog fragmenta ili njegovog dela, uključujući jednolančana antitela i njihove fragmente. Funkcionalni fragmenti uključuju fragmente koji vežu antigen koji se vežu za sisarski VISTA protein. Na primer, fragmenti antitela koji su sposobni da se vežu za VISTA ili njihove delove, uključujći, ali bez ograničenja na Fab (npr., digestijom papainom), Fab’ (npr., digestijom pepsinom i parcijalnom redukcijom) i F(ab’)2(npr., digestijom pepsinom), facb (npr., digestijom plazminom), pFc’ (npr., pepsinom ili digestijom plazminom), Fd (npr., digestijom pepsinom, parcijalnom redukcijom i reagregacijom), Fv ili scFv (npr., molekularno biološkim postupcima) fragmenti, su obuhvaćeni pronalaskom (videti, npr., Colligan, Immunology, supra). Fragmenti antitela iz predmetnog pronalaska takođe uključuju one koji su razmatrani i opisani u Aaron L. Nelson, mAbs 2:1, 77-83 (January/February 2010).
[0031] Takvi fragmenti mogu biti proizvedeni, na primer, enzimskim cepanjem, sintetskim ili rekombinantnim postupcima, kao što je poznato u oblasti tehnike i/ili kao što je ovde opisano. Antitela takođe mogu biti proizvedena u različitim prekinutim oblicima korišćenjem gena antitela u Kojima su jedan ili više stop kodona uvedeni uzvodno od prirodnog stop mesta. Na primer, kombinovani gen koji kodira deo F(ab’)2 teškog lanca može biti modifikovan da ukljući sekvence DNK koje kodiraju CH1 domen i/ili region zgloba u teškom lancu. Različiti delovi antitela mogu hemijski biti spojeni zajedno sa uobičajenim postupcima, ili mogu biti pripremljeni kao susedni protein korišćenjem korišćenjem tehnika genetičkog inženjerstva.
[0032] Takođe ovde prikazano ali nije zahtevano su aminokiselinske sekvence imunoglobulinskog lanca, ili njegova porcija (npr., varijabilni region, CDR) koji ima oko 70-99% identiteta (npr., 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu) na sekvencu aminokiselina odgovarajućeg lanca varijabilne sekvence koja je ovde opisana. Poželjno, 70-99% identitet aminokiselina (npr., 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu) je određen korišćenjem odgovarajućeg kompjuterskog algoritma, kao što je poznato u oblasti tehnike.
[0033] Ovde su obezbeđeni primeri sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca.
1
[0034] Antitela iz predmetnog pronalaska, ili njihove specifične varijante, mogu sadržati bilo koji broj susednih aminokiselinskih ostataka iz antitela prema predmetnom pronalasku, pri čemu je taj broj izabran iz grupe celih brojeva koji se sastoje iz 10-100% broja susednih ostataka u anti-TNF antitelu. Opciono, ova podsekvenca susednih aminokiselina je bar oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 ili više aminokiselina u dužini, ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu. Dalje, broj takvih podsekvenci može biti bilo koji ceo broj izabran iz grupe koja se sastoji iz 1 do 20, kao što je bar 2, 3, 4, ili 5.
[0035] Kao što će stručnjak iz oblasti tehnike razumeti, predmetni pronalazak uključuje bar jedno biološki aktivno antitelo iz predmetnog pronalaska. Biološki aktivna antitela imaju specifičnu aktivnost od bar 20%, 30%, ili 40%, i poželjno bar 50%, 60%, ili 70%, i najpoželjnije 80%, 90%, ili 95%-100% od nativnog (ne-sintetičkog), endogenog ili povezanog i poznatog antitela. Postupci testiranja i kvantifikovanja mera enzimske aktivnosti i specifičnosti prema supstratu, dobro su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike.
[0036] Suštinska sličnost se odnosi na jedinjenje koje ima bar 85% (npr., bar 95%) identiteta i bar 85% (npr., bar 95%) aktivnosti nativnog (ne-sintetičkog), endogenog ili povezanog i poznatog antitela.
[0037] Kao što je ovde korišćeno, termin "humano antitelo" odnosi se na antitelo u kome u suštini svaki deo proteina (npe., CDR, region okvira, CL, CH domeni (npr., CH1, CH2, CH3), zglob, (VL, VH)) je u suštini ne-imunogen kod humanih bića, sa samo manjim promenama u sekvenci ili varijacijama. Slično tome, antitela koja označavaju primate (majmuna, babuna, šimpanzu, i slično), glodara (miša, pacova, i slično) i drugih sisara označavaju takve vrste, pod-rod, rod, pod-familiju, antitela specifična za familiju. Dalje, himerna antitela mogu uključiti bilo koju od gore navedenih kombinacija. Takve promene ili varijacije opciono ili poželjno zadržavaju ili smanjuju imunogenost kod humanih bića ili drugih vrsta u odnosu na ne-modifikovana antitela. Prema tome, humano antitelo je različito od himernog ili humanizovanog antitela. Ističe se da se humano antitelo može proizvesti sa ne-humanom životinjom ili prokariotskom ili eukariotskom ćelijom koja je sposobna da eksprimira funkcionalne preuređene humani imunoglobulin (npr., težak lanac i/ili laki lanac) gene. Dalje, kada je humano antitelo jednolančano antitelo, može sadržati linker peptid koji se ne može naći u nativnim humanim antitelima. Na primer, Fv može sadržati linker peptid, kao što je dva do oko osam glicina ili drugih aminokiselinskih ostataka, koji povezuju varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca. Takvi linker peptide se smatraju da su humanog porekla.
[0038] Bispecifična, heterospecifična, heterokonjugati ili slična antitela koja se takođe mogu koristiti koja su monoklonska, poželjno humana ili humanizovana, antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za bar dva različita antigena. U ovom slučaju, jedno od specifičnosti vezivanja je za bar jedan VISTA protein, drugo je za bilo koji drugi antigen. Postupci za dobijanje bispecifičnih antitela su poznati u oblasti tehnike. Rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela može biti zasnovana na istovremnoj ekspresiji dva para teški lanac-laki lanac imunoglobulina, gde dva teška lanca imaju različite specifičnosti (Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)). Videti takođe WO 93/08829, U.S. Pat. Nos.
6,210,668, 6,193,967, 6,132,992, 6,106,833, 6,060,285, 6,037,453, 6,010,902, 5,989,530, 5,959,084, 5,959,083, 5,932,448, 5,833,985, 5,821,333, 5,807,706, 5,643,759, 5,601,819, 5,582,996, 5,496,549, 4,676,980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J.10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
[0039] U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje cilja VISTA, kao što je definisano u pridruženim zahtevima, i drugi ciljni protein (npr., protein imunske kontrolne tačke), takvi primeri bispecifičnih antitela uključuju bispecifično antitelo koje uključuje VISTA i PD-L1 i bispecifično antitelo koje cilja VISTA i PD-L2.
[0040] Humana antitela koja su specifična za humane VISTA proteine ili njihove fragmente mogu biti podignuti protiv odgovarajućeg imunogenog antigena, kao što je VISTA protein ili njegov deo (uključujići sintetičke molekule, kao što su sintetičke peptide).
[0041] Druga specifična ili opšta sisarska antitela mogu se dobiti na sličan način. Preparati imunogenih antigena i proizvodnja monoklonskih antitela može se izvesti korišćenjem bilo kog pogodnog postupka.
[0042] Na primer, hibridom se proizvodi spajanjem pogodne besmrtne ćelijske linije npr., ćelijske linije mijeloma kao što je, ali nije ograničeno na, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, ili slično, ili heteromilomi, njihove proizvode spajanja, ili bilo koje ćelije ili spojene ćelije koja se od njih dobija, ili bilo koje druge pogodne ćelijske linije koja se od njih dobija kao što je poznato u oblasti tehnike, Videti, npr., www.atcc.org, sa ćelijama koje proizvode antitela. Ćelije koje proizvode antitela mogu uključiti izolovanu ili kloniranu slezinu, perifernu krv, limfu, krajnik, ili druge imune ćelije (npr., B ćelije), ili bilo koje druge ćelije koje eksprimiraju sekvence konstantne ili varijabilne ili regiona okvira teškog ili lakog lanca teškog ili lakog lanca ili regione koji određuju komplementarnost (CDR). Takve ćelije koje proizvode antitela mogu biti rekombinantne ili endogene ćelije, i mogu takođe biti prokariotske ili eukariotske (npr., sisara, kao što je, glodar, konj, govedo, koza, ovca, primat),. Videti, npr., Ausubel, supra, i Colligan, Immunology, supra, poglavlje 2.
[0043] Ćelije koje proizvode antitela mogu se takođe dobiti iz periferne krvi ili, poželjno slezine ili limfnih čvorova, humanih bića ili drugih poželjnih životinja koji su imunizovani sa antigenom od interesa. Bilo koja druga pogodna ćelija domaćina može takođe biti korišćena za ekspresiju heterologne ili endogene nukleinske kiseline koja kodira antitelo, određeni fragment ili njegovu varijantu, iz predmetnog pronalaska. Spojene ćelije (hibridomi) ili rekombinantne ćelije mogu biti izolovane upotrebom selektivnih uslova kulture ili drugih pogodnih poznatih postupaka, i klonirane by ograničenim razblaženjem ili ćelijskim sortiranjem, ili drugim poznatim postupcima. Ćelije koje proizvode antitela sa željenom specifičnosti mogu biti odabrana u pogodnom testu (npr., enzimskim imunosorbentnim testom (ELISA)).
[0044] Drugi pogodni postupci za proizvodnju ili izolovanje antitela potrebne specifičnosti mogu se koristiti, uključujući, ali bez ograničenja na, postupke kojima se selektuje rekombinantno antitelo od proteinske ili peptidne biblioteke (npr., ali bez ograničenja na, bakteriofag, ribozom, oligonukleotid, RNK, cDNK, ili slično, biblioteku prikaza; npr., kao što je dostupno Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; Bioinvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, Calif.; Ixsys. Videti, npr., PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; ; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; PCT/U594/1234; WO92/18619; WO96/07754; EP 614989; WO95/16027 ; WO88/06630; WO90/3809 ; U.S. Pat. No. 4,704,692 ; PCT/US91/02989 ; WO89/06283; EP 371998; EP 550400; ; EP 229046; PCT/US91/07149; ili nasumično generisani peptidi ili proteini--U.S. Patent Nos.5,723,323; 5,763,192; 5,814,476; 5,817,483; 5,824,514; 5,976,862;WO 86/05803, EP 590 689, ili koji se oslanjaju na imunizaciju transgenih životinja (npr., SCID miševi, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol.16:95-118 (1996); Eren et al., Immunol.93:154-161 (1998)) koji su sposobni za proizvodnju repertoara humanih antitela, kao što je poznato u oblasti tehnike i/ili kao što je ovde opisano. Takvi postupci, uključuju, ali nisu ograničeni na, ribozomski prikaz (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (May 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (November 1998)); tehnologije proizvodnje antitela jedne ćelije (U.S. Pat. No.
5,627,052, Wen et al., J. Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996)); gel mikrokapljica i protočna citometrija (Powell et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, Mass.; Gray et al., J. Imm. Meth.182:155-163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13:787-790 (1995)); selekcija B-ćelija (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands (1988)).
[0045] Postupci za modifikovanje ili humanizaciju ne-humanih ili humanih antitela mogu se takođe koristiti i dobro su poznati u oblasti tehnike. Generalno, humanizovano ili modifikovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka iz izvora koji je ne-humani, npr., ali nije ograničen na miša, pacova, zeca, ne-humanog primata ili drugog sisara. Ovi humani aminokiselinski ostaci su često naznačeni kao "uvezeni" ostaci, koji su obično uzeti iz "uvezenih" varijabilnih, konstantnih ili sdrugih domena poznate humane sekvence. Prikazane su poznate humane Ig sekvence, npr., www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query. fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html.
[0046] Takve uvezene sekvence se mogu koristiti za smanjenje imunogenosti ili smanjenje, pojačanje ili modifikovanje vezivanja, afiniteta, aviditeta, specifičnost, polu-život, ili bilo koje druge pogodne karakteristike, kao što je poznato u oblasti tehnike. Generalno ceo ili cele nehumane ili humane CDR sekvence su održavane dok ceo ili cele ne-humane sekvence regiona okvira i/ili konstantni regioni su zamenjeni sa humanim ili drugim aminokiselinama. Antitela mogu takođe biti po potrebi humanizovane sa zadržavanjem visokog afiniteta za antigen i druga poželjna biološka svojstva korišćenjem tri-dimenzionih imunoglobulinskih modele koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Dostupni su računarski programi koji ilustruju i prikazuju moguće tri-dimenzione konformacione strukture odabranih kandidata imunoglobulinskih sekvenci. Pregled ovih prikaza dozvoljava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidata imunoglobulinske sekvence, tj., analiza ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da se veže za njegov antigen. Na ovaj način, ostaci regiona okvira (eng. framework, FR) mogu biti odabrani i kombinovani sa konsenzusa i uključiti sekvence tako da željene karakteristike antitela, kao što je povećani afinitet za ciljni antigen(e), je postignut. Uopšteno, CDR ostaci su direktno i najvećim delom uključeni u uticaj na vezivanje antigena. Humanizacija ili modifikovanje antigena iz predmetnog pronalaska može se sprovesti korišćenjem bilo kog poznatog postupka, kao što je ali bez ograničenja na one koji su opisani u, na primer, Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol.151:2623 (1993), U.S. Pat. Nos. 5,723,323, 5,976862, 5,824514, 5,817483, 5,814476, 5,763,192, 5,723,323, 5,766,886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567.
[0047] Anti-VISTA antitelo takođe može biti opciono generisano imunizovanjem transgene životinje (npr., miša, pacova, zeca, hrčka, ne-humanog primata, i slično) koja je sposobna za proizvodnju repertoara humanih antitela, kao što je ovde opisano i/ili kao što je poznato u oblasti tehnike. Ćelije koje proizvode humano anti-VISTA antitelo mogu se izolovati iz takvih životinja i imortalizovati korišćenjem pogodnih postupaka, kao što su postupci koji se ovde opisuju.
[0048] Transgene životinje koje mogu proizvoditi repertoar humanih antitela koji se vežu za humane antigene mogu se proizvesti korišćenjem poznatih postupaka (npr., ali bez ograničenja na, U.S. Pat. Nos.5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, 5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 i 5,789,650 izdato od Lonberg et al.; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463151 B1, Kucherlapate et al. EP 0710719 A1, Surani et al. U.S. Pat. No.5,545,807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438474 B1, Lonberg et
1
al. EP 0814259 A2, Lonberg et al. GB 2272440 A, Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994), Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green et al, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995) and Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996)). Generalno, ovi miševi sadrže bar jedan transgen koji sadrži DNK iz bar jednog humanog lokusa imunoglobulina koji je funkcionalno preuređen, ili koji se može izložiti funkcionalnom preuređenju. Endogeni imunoglobulinski lokusi kod ovih miševa mogu biti narušeni ili uklonjeni da se eliminiše sposobnost životinje da proizvodi antitela kodirana endogenim genima .
[0049] Skrining antitela za specifično vezivanje sa sličnim proteinima ili fragmentima može se pogodno postići korišćenjem biblioteka peptidnog prikaza. Ovaj postupak uključuje skrining velikih kolekcija peptida za individualne članove sa željenom funkcijom ili strukturom. U oblasti tehnike je dobro poznat skrining antitela biblioteka za prikaz peptida. Prikazane peptidne sekvence mogu biti od 3 do 5000 ili više aminokiselina u dužini, često od 5-100 aminokiselina dužine, i često od oko 8 do 25 aminokiselina dužine. Pored direktnih hemijskih sintetičkih postupaka za generisanje peptidnih biblioteka, opisano je nekoliko postupaka rekombinantne DNK. Jedan tip uključuje prikaz peptidne sekvence na površini bakteriofaga ili ćelije. Svaki bakteriofag ili ćelija sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira određenu prikazanu peptidnu sekvencu. Takvi postupci su opisani u PCT objavi patenta br.91/17271, 91/18980, 91/19818, i 93/08278. Drugi sistemi za generisanje biblioteka peptida imaju aspekte i in vitro hemijske sinteže i rekombinantnih postupaka. Videti, PCT objave patenta br.92/05258, 92/14843, i 96/19256. Videti takođe, U.S. Patent br. 5,658,754; i 5,643,768. Biblioteke peptidnog prikaza, vektor, i skrining kitovi su komercijalno dostupni od takvih dobavljača kao što je Invitrogen (Carlsbad, Calif.), i Cambridge antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Videti, npr., U.S. Patent Nos. 4,704,692, 4,939,666, 4,946,778, 5,260,203, 5,455,030, 5,518,889, 5,534,621, 5,656,730, 5,763,733, 5,767,260, 5,856,456; 5,223,409, 5,403,484, 5,571,698, 5,837,500, assigned to Dyax, 5,427,908, 5,580,717; 5,885,793, preneto na Cambridge antibody Technologies; 5,750,373, preneto na Genentech, 5,618,920, 5,595,898, 5,576,195, 5,698,435, 5,693,493, i 5,698,417.
[0050] Antitela iz predmetnog pronalaska takođe se mogu dobiti korišćenjem bar jedne nukleinske kiseline koja kodira anti-VISTA antitela da bi se dobile transgene životinje, kao što su koze, krve, ovce, i slično, da bi se takva antitela proizvela u njihovom mleku. Takve životinje se mogu dobiti korišćenjem poznatih postupaka. Videti, npr., ali nije ograničeno na, U.S. Pat. Nos.5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362; 5,304,489, i slično.
[0051] Anti-VISTA antitela iz predmetnog pronalaska se takođe mogu proizvesti korišćenjem transgenih biljaka, prema dobro poznatim postupcima. Videti takođe, npr., Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem.30:99-108 (October, 1999), Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol.240:95-118 (1999); Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans.22:940-944 (1994).
[0052] Antitela iz pronalaska mogu vezati humani VISTA sa širokim opsegom afiniteta (KD). U poželjnom izvođenju, bar jedno humano monoklonsko antitelo iz predmetnog pronalaska može opciono vezati humani VISTA sa visokim afinitetom. Na primer, humano monoklonsko antitelo može se vezati za humani VISTA sa KDjednako sa ili manjom od 10<-7>M, kao što je ali bez ograničenja na, 0.1-9.9 (ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu) x 10-<7>, 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>, 10<-12>, 10<-13>ili bilo koji opseg ili vrednost u njemu. U nekim izvođenjima, antitelo ili fragment antitela može se vezati za humani VISTA sa afinitetom od bar 1x10<-7>litra/molu, na primer, bar 1x10<-8>litra/molu, na primer, bar 1x10<-9>litra/molu litra/molu.
[0053] Afinitet ili aviditet antitela za antigen se može eksperimentalno odrediti korišćenjem bilo kog pogodnog postupka. (Videti, na primer, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); and methods described herein). Izmereni afinitet određene interakcije antitelo-antigen može se razlikovati ukoliko je meren pod različitim uslovima (npr., koncentracija soli, pH). Prema tome, merenja afiniteta i drugi parametri vezivanja antigena (npr., KD, Ka, Kd) su poželjno dobijeni sa standardizovanim rastvorima antitela i antigena, i standardizovanim puferom.
MOLEKULI NUKLEINSKE KISELINE
[0054] Korišćenjem ovde obezbeđene informacije, kao što su nukleotidne sekvence koje kodiraju bar 70-100% od susednih aminokiselina najmanje jednog od navedenih fragmenata, varijanata ili njihovih konsenzusnih sekvenci ili deponovani vektor koji sadrži bar jednu od ovih sekvenci, molekul nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska kao što je definisano u zahtevima koji kodira bar jedno anti-VISTA antitelo koje sadrži sve varijabilne CDR regione teškog lanca SEQ ID NOS:1, 2 i 3 i/ili sve varijabilne CDR regione lakog lanca SEQ ID NOS:4, 5 i 6 može se dobiti korišćenjem postupaka koji su ovde opisani ili su poznati u oblasti tehnike.
[0055] Molekuli nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu biti u obliku RNK, kao što je iRNK, hnRNK, tRNK ili bilo koji drugi oblik, ili u obliku DNK, uključujući, ali bez ograničenja na, cDNK i genomsku DNK koja je dobijena kloniranjem ili proizvedena sintetski, ili bilo koju njihovu kombinaciju. DNK može biti trolančana, dvolančana ili jednolančana, ili bilo koja njihova kombinacija. Bilo koji deo bar jednog lanca DNK ili RNK može biti kodirajući lanac, takođe poznat kao sens lanac, ili može biti nekodirajući lanac, takođe označen kao anti-sens lanac.
[0056] Izolovani molekuli nukleinskih kiselina iz predmetnog pronalaska mogu uključiti molekule nukleinskih kiselina koji sadrže otvoreni okvir čitanja (ORF), na primer, molekule nukleinskih kiselina koji sadrže kodirajuću sekvencu za anti-VISTA antitelo ili fragment, npr., fragment koji sadrži varijabilni region; i molekule nukleinskih kiselina koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja se razlikuje od onih koje su gore opisane ali koja, zbog degenerisanosti genetičkog kod, i dalje kodira bar jedno anti-VISTA antitelo kao što je ovde opisano i/ili kao što je poznato u oblasti tehnike. Za stručnjaka iz oblasti tehnike generisanje takvih degenerisanih varijanti nukleinskih kiselina koje kodiraju za specifična anti-VISTA antitela iz predmetnog pronalaska predstavljaće rutinu .Videti, npr., Ausubel, et al., supra, i takve varijante nukleinskih kiselina su uključene u predmetni pronalazak.
[0057] Kao što je ovde naznačeno, molekuli nukleinskih kiselina iz predmetnog pronalaska koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira anti-VISTA antitelo može uključiti, ali nije ograničeno na, one koji kodiraju aminokiselinsku sekvencu fragmenta antitela; kodirajuću sekvencu za puno antitelo ili njegov deo; kodirajuću sekvencu za antitelo, fragment ili deo, kao i dodatne sekvence, kao što je kodirajuća sekvenca najmanje jednog signalnog vodiča ili spojenog peptida, sa ili bez prethodno pomenutih kodirajućih sekvenci, kao što je bar jedan intron, zajedno sa dodatnim, ne-kodirajućim sekvencama, uključujući ali bez ograničenja na, ne-kodirajuće 5’ i 3’ sekvence, kao što su prepisane, netranslatirane sekvence koje imaju ulogu u transkripciji, obradi iRNK uključujući spajanje i signale za poliadenilaciju (na primer—vezivanje ribozoma i stabilnost iRNK); dodatna kodirajuća sekvenca koja kodira za dodatne aminokiseline, kao što su one koje obezbeđuju dodatne funkcionalnosti. Prema tome, sekvenca koja kodira antitelo može se spojiti sa marker sekvencom, kao što je sekvenca koja kodira peptid koji olakšava prečišćavanje spojenog antitela koji se sastoji iz fragmenta antitela ili dela.
1
[0058] Humani geni koji kodiraju konstantne (C) regione antitela, fragmente i regione iz predmetnog pronalaska mogu se dobiti iz biblioteke humane fetalne jetre, korišćenjem poznatih postupaka. Humani geni C regiona mogu se dobiti iz bilo koje humane ćelije uključujući one koje eksprimuju i proizvode humane imunoglobuline. Humani CH region može se dobiti iz bilo koje od poznatih klasa ili izotipova humanih H lanaca, uključujući γ, m, α, δ ili ε i njihovih podtipova, kao što su G1, G2, G3 i G4. S obzirom da je izotip H lanca odgovoran za različite efektorske funkcije antitela, izbor CH regiona će biti vođen željenim efektorskim funkcijama, kao što je fiksiranje komplementa, ili aktivnost u ćelijskoj citotoksičnosti koja zavisi od antitela (ADCC).
KOMPOZICIJE
[0059] Ovde prikazane farmaceutske kompozicije dobijene su u skladu sa standardnim postupcima i davani su u dozama koje su odabrane za lečenje, npr., smanjenje, prevenciju, ili ublažavanje, ili da uspori ili zaustavi napredovanje, stanja koje se leči (Videti, npr., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, and Goodman and Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., za opšti opis postupaka za davanje različitih sredstava za humanu terapiju). Kompozicije koje se sastoje prikazanih antitela i sredstava mogu se isporučiti korišćenjem kontrolisanih ili sistema za isporuku sa odloženim oslobađanjem (npr., kapsule, biorazgradive matrice). Primeri sistema sa odloženim oslobađanjem za isporuku leka koji mogu biti korisni za davanje kompozicija prikazanih jedinjenja opisane su u, npr., U.S. Patent Br-a. US 5,990,092; 5,039,660; 4,452,775; i 3,854,480.
[0060] Za dobijanje farmaceutskih kompozicija iz anti-VISTA antitela i/ili fragmenata iz predmetnog pronalaska, farmaceutski prihvatljvi nosači mogu biti čvrsti ili tečnost. Preparati u čvrstom obliku uključuju praškove, tablete, pilule, kapsule, kesice, supozitorije, i disperzibilne granule. Na primer, jedinjenja iz predmetnog pronalaska mogu biti u obliku praška za rekonstituciju u vremenu isporuke. Čvrsti nosač mogu biti jedna ili više supstanci koje takođe deluju kao razblaživači, sredstva za davanje arome, solubilizatori, lubrikanti, sredstva za suspenziju, sredstva za vezivanje, konzervansi, sredstva za dezintegraciju tableta, ili materijal za inkapsulaciju. U praškovima, nosač je fino podeljena čvrsta supstanca koja je mešavina sa fino podeljenim aktivnim sastojkom.
[0061] Praškovi i tablete povoljno sadrže od oko jednog do oko sedamdeset procenata aktivnog sastojka. Pogodni nosači su magnezijum karbonat, magnezijum stearat, talk, šećer, laktoza, pektin, dekstrin, skrob, želatin, tragakant, metilceluloza, natrijum kaboksimetilceluloza, vosak sa niskim topljenjem, kakao puter, i slično. Tablete, praškovi, kesice, lozenge, trake koje se brzo tope, capsule i pilule mogu se koristiti kao čvrsti dozni oblici koji sadrže aktivni sastojak koji je odgovarajući za oralno davanje.
[0062] Preparati u tečnom obliku uključuju rastvore, suspenzije, retencione klizme, i emulzije, na primer, voda ili rastvore propilen glikola u vodi. Za parenteralne injekcije, tečni preparati mogu biti formulisani u rastvoru u rastvoru polietilen glikola u vodi.
[0063] Farmaceutska kompozicija može biti u jediničnom doznom obliku. U takvom obliku, kompozicija je podeljena u jedinične doze koji sadrže odgovarajuće količine aktivnog sastojka. Jedinični dozni oblik može biti upakovani preparat, paket koji sadrži diskretne količine jediničnih doza. Doze se mogu razlikovati u zavisnosti od potreba pacijenta, težine stanja koje se leči, jedinjenja i načina davanja koje je korišćeno. Određivanje odgovarajuće doze za određenu situaciju je u okviru stručnjaka iz oblasti tehnike.
[0064] Takođe, farmaceutska kompozicija može sadržati, ukoliko je poželjno, druga kompatibilna sredstva, npr., farmaceutska, terapeutska ili profilaktička sredstva. Terapeutska ili profilaktička
1
sredstva uključuju, ali nisu ograničena na, peptide, polipeptide, proteine, fuzione proteine, molekule nukleinske kiseline, male molekule, mimetička sredstva, sintetičke lekove, inorganske molekule, i organske molekule. Primeri klasa takvih sredstava (npr., sredstava protiv kancera) uključuju, ali nisu ograničeni na, citotoksine, inhibitore angiogeneze, imunomodulatorna sredstva, imuno-onkološka sredstva, i sredstva koja su korišćena za oslobađanje od bola ili da bi se nadoknadili štetni efekti jednog ili više terapeutskih sredstava (npr., korišćenjem bisfosfonata da bi se smanjili hiperkalcemijski efekti glukokortikoida).
[0065] Inhibitori angiogeneze, sredstva i terapije koji su pogodni za upotrebu u kompozicijama i upotrebe koje su ovde korišćene uključuju, ali nisu ograničene na, angiostatin (fragment plazminogena); antiangiogeni antitrombin III; angiozim. Bisfosfonati uključuju, ali nisu ograničeni na, alendronat, klodronat, etidronat, ibandronat, pamidronat, risedronat, tiludronat, i zoledronat.
[0066] Imunomodulatorna sredstva i terapije koja su pogodna za upotrebu u kompozicijama i ovde opisanim upotrebama uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela protiv receptora T ćelija kao što su anti-CD3 antitela (npr. Nuvion (Protein Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson), ili anti-CD20 antitela Rituksan (IDEC)), anti-CD52 antitela (npr. CAMPATH 1H (Ilex)), anti-CD1 1a antitela (npr. Xanelim (Genentech)); antitela protiv citokina ili protiv receptora citokina i antagonisti kao što su antitela protiv receptora za IL-2 (Zenapax (Protein Design Labs)), antitela protiv receptora za IL-6 (npr. MRA (Chugai)), i antitela protiv IL-12 (CNTO1275(Janssen)), antitela protiv TNFalfa (Remicade(Janssen)) ili antagonist TNF receptora (Enbrel (Immunex)), antitela protiv IL-6 (BE8 (Diaclone) i siltuksimab (CNTO32 (Centocor)), i antitela koja se imunospecifično vežu za antigene koji su povezani sa tumorom (npr., trastuzimab (Genentech)).
[0067] Imuno-onkološka sredstva koja su pogodna za upotrebu u kompozicijama i upotrene koje su ovde korišćene uključuju, ali nisu ograničene na, ipilimumab (anti-CTLA-4), nivolumab (anti-PD-1), pembrolizumab (anti-PD-1), anti-PD-Ll antitela, i anti-LAG-3 antitela.
[0068] Kompozicija je poželjno dobijena u obliku dozne jedinice koja sadrži terapeutski efikasnu količinu antitela ili fragmenta. Primeri doznih jedinica su tablete i kapsule. Za terapeutske svrhe, tablete i capsule mogu sadržati, pored aktivnog sastojka, konvencionalne nosače kao što su sredstva za vezivanje, na primer, akacija gumu, želatin, polivinilpirolidon, sorbitol, ili tragakant; punioce, na primer, kalcijum fosfat, glicin, laktoza, kukuruzni skrob, sorbitol, ili saharozu; lubrikante, na primer, magnezijum stearat, polietiilen glikol, silicijum dioksid, ili talk; dezintegrante, na primer krompirov skrob, sredstva za aromu ili bojenje, ili prihvatljiva sredstva za vlaženje. Oralni tečni preparati generalno u obliku vodenih ili uljnih rastvora, suspenzije, emulzije sirupi ili eliksiri mogu sadržati konvencionalne aditive kao što su sredstva za suspenziju, sredstva za emulgovanje, ne-vodena sredstva, konzervanse, sredstva za bojenje i sredstva za aromu. Primeri aditiva za tečne preparate uključuju akaciju, ulje badema, etil alkohol, frakcionisano kokosovo ulje, želatin, glukozni sirup, glicerin, hidrogenizovane jestive masti, lecitin, metil celulozu, metil ili propil parahidroksibenzoat, propilen glikol, sorbitol, ili sorbinsku kiselinu.
[0069] Drugi opšti detalji u pogledu postupaka izrade i korišćenja jedinjenja i ovde opisanih kompozicija su dobro poznati u oblasti tehnike. Videti, npr., U.S. Patent Br.7,820,169.
TRETMANI
[0070] Stručnjak iz oblasti tehnike, npr., klinički lekar, može definisati odgovarajuću dozu i način davanja za određeno antitelo, fragment ili kompoziciju za davanje individui, uzimajući u obzir odabrana sredstva, farmaceutsku kompoziciju i način davanja, različiti faktori pacijenta i druga razmatranja. Poželjno, doza ne uzrokuje ili proizvodi minimalne ili bez neželjenih sporednih efekata.
1
U standardnom režimu višestrukog doziranja, farmakološko sredstvo može se davati u doznom režimu koji je označen da održi prethodno određenu ili optimalnu koncentraciju u plazmi u subjektu koji prolazi kroz tretman. Antitela, fragmenti i kompozicija mogu se dodati u bilo kojim odgovarajućim doznim opsezima ili terapeutskoj efikasnoj količini, na primer, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 5.0 mg/kg, 6.0 mg/kg, 7.0 mg/kg, 8.0 mg/kg, 9.0 mg/kg, 10.0 mg/kg, 11.0 mg/kg, 12.0 mg/kg, 13.0 mg/kg, 14.0 mg/kg, 15.0 mg/kg, 16.0 mg/kg, 17.0 mg/kg, 18.0 mg/kg, 19.0 mg/kg, 20.0 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg i 100 mg/kg. U jednom izvođenju, doza davanog jedinjenja, antitela ili fragmenta je 0.1-15 mg/kg po davanju.
[0071] Antitelo ili fragment se može davati jednom, bar jednom, dva puta, bar dva puta, tri puta, ili bar tri puta dnevno. Antitelo ili fragment mogu se davati jednom, bar jednom, dva puta, bar dva puta, tri puta, bar tri puta, četiri puta, bar četiri puta, pet puta, bar pet puta, šest puta nedeljno, ili bar šest puta nedeljno. Antitelo ili fragment mogu se davati jednom mesečno, bar jednom mesečno, dva puta mesečno, bar dva puta nedeljno, tri puta nedeljno u mesec dana ili bar tri puta u mesec dana. Antitelo ili fragment antitela mogu se davati jednom u godinu dana, bar jednom u godinu dana, dva puta godišnje, bar dva puta godišnje, tri puta godišnje, bar tri puta godišnje, četiri puta godišnje, bar četiri puta godišnje, pet puta godišnje, bar pet puta godišnje, šest puta godišnje ili bar šest puta godišnje.
[0072] Anti-VISTA antitela, fragmenti i kompozicije mogu, na primer, da se daju kroz parentalne ili neparentalne načine davanja, uključujući, ali bez ograničenja na, intravenozno, subkutanozno, oralno, rektalno, intramuskularno, intraperitonealno, transmukozalno, transdermalno, intratekalno, nazalno, ili lokalno. Osobа koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike će prepoznati da sledeći dozni oblici mogu sadržati aktivni sastojak, ili jedinjenja ili odgovarajuće farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja iz predmetnog pronalaska. U nekim izvođenjima, dozni oblici mogu sadržati kao aktivni sastojak, ili jedinjenje ili odgovarajuću farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja.
[0073] Anti-VISTA antitela iz predmetnog pronalaska mogu se davati kao deo kombinovane terapije (npr., jedan sa drugim, ili jednim ili više drugih terapeutskih sredstava). Jedinjenja iz pronalaska mogu se davati pre, nakon ili istovremeno sa jednim ili više drugih terapeutskih sredstava. U nekim izvođenjima, jedinjenje iz pronalaska i drugo terapeutsko sredstvo mogu se istovremeno zajedno davati (npr., uporedo) ili kao odvojene formulacije ili kao zajednička formulacija. Alternativno, sredstva se mogu davati uzastopno, kao odvojene kompozicije, u odgovarajućem vremenskom okviru, kako je odredio stručni kliničar (npr., vreme koje je dovoljno da se omogući preklapanje farmaceutskih efekata terapija). Jedinjenje iz pronalaska i jedno ili više drugih terapeutskih sredstava mogu se davati u pojedinačnoj dozi ili u višestrukim dozama, u redosledu i po rasporedu pogodan za postizanje željenog terapeutskog efekta.
[0074] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili fragment antitela ili kompoziciju kao što je definisano u pratećim zahtevima za upotrebu u modulaciji ili lečenju bar jedne maligne bolesti u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu. U nekim izvođenjima, jedinjenja i kompozicije iz predmetnog pronalaska su korišćene za lečenje ili prevenciju kancera. Kancer može uključiti bilo koji maligni ili benigni tumor bilo kojeg organa ili sistema organa tela. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: kancere dojke, digestivne/gastrointestinalne, endokrine, neuroendokrine, očne, genitourinarne, germinativne ćelije, ginekološke, glave i vrata, hematološke/krvi, mišićnoskeletne, neurološke, respiratorne/grudnog koša, bešike, debelog creva, rektalne, plućne, endometrijuma, bubrega, pankreasa, jetre, stomaka, testikularne, jednjaka, prostate, mozga, grlića materice, jajnika i tiroidee. Drugi kanceri mogu uključiti leukemije, melanome, i limfome, i bilo koji drugi ovde opisani kancer. U nekim izvođenjima, solidni tumor je infiltriran sa mijeloidnim i/ili T-ćelijama. U nekim
1
izvođenjima, kancer je leukemija, limfom, mijelodisplastični sindrom i/ili mijelom. U nekim izvođenjima, kancer može biti bilo koje vrste ili tip leukemije, uključujući limfocitnu leukemiju ili mijelogenu leukemiju, kao što je, npr., akutna limfoblastna leukemija (ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL), akutna mijeloidna (mijelogena) leukemija (AML), hronična mijelogena leukemija (CML), leukemija dlakastih ćelija, T-ćelijska prolimfocitna leukemija, velika granularna limfocitna leukemija, ili T-ćelijska leukemija kod odraslih. U nekim izvođenjima, limfom je histiocitni limfom, folikularni limfom ili Hodčkinov limfom, i u nekim izvođenjima, kancer je multipli mijelom. U nekim izvođenjima, kancer je solidni tumor, na primer, melanom, ili kancer bešike. U posebnom izvođenju, kancer je kancer pluća, kao što je kancer nemalih ćelija pluća (NSCLC).
[0075] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili fragment antitela ili kompoziciju kao što je definisano u pridruženim zahtevima za upotrebu u modulaciji ili lečenju bar jedne maligne bolesti u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, ali bez ograničenja na, bar jednu od: leukemije, akutne leukemije, akutne limfoblastne leukemije (ALL), B-ćelijskog, Tćelijskog ili FAB ALL, akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične mijelocitne leukemije (CML), hronična limfocitna leukemija (CLL), leukemija dlakastih ćelija, mijelodisplastični sindrom (MDS), limfom, Hodčkinova bolest, maligni limfom, ne-hodčkinov limfom, Burkitov limfom, multipli mijelom, Kaposijev sarkom, kolorektalni karcinom, karcinom pankreasa, nazofaringealni karcinom, maligna histiocitoza, paraneoplastični sindrom/hikalcemija maligniteta, solidni tumori, adenokarcinomi, sarkomi, maligni melanom, hemangiom, metastatska bolest, kancer povezan sa resorpcijom kosti, bol u kostima povezan sa kancerom, i slično. U nekim izvođenjima, solidni tumor je infiltriran sa mijeloidnim i/ili T-ćelijama. U posebnom izvođenju, solidni tumor je kancer pluća, kao što je kancer nemalih ćelija pluća (NSCLC).
[0076] U nekim izvođenjima, jedinjenja i terapije iz pronalaska su istovremeno davane sa vakcinom (kao što je vakcina virusnog vektora, bakterijska vakcina, vakcina zasnovana na ćeliji, DNK vakcina, RNK vakcina, peptidna vakcina, ili proteinska vakcina). Takve vakcine su dobro poznate u oblasti tehnike. Videti, npr., Jeffrey Schlom, "Therapeutic Cancer Vaccines: Current Status and Moving Forward," J Natl Cancer Inst; 104:599-613 (2012).
[0077] U nekim izvođenjima, jedinjenja i terapije iz predmetnog pronalaska istovremeni su davani sa sredstvima za hemoterapiju, hormonske terapije i biološke terapije, i/ili bisfosfonati. U nekim izvođenjima, sredstvo(a) za hemoterapiju uključuju jedno ili više od sledećih: arboplatin (Paraplatin), cisplatin (Platinol, Platinol-AQ), ciklofosfamid (Cytoxan, Neosar), doksorubicin (Adriamycin), etopozid (VePesid), fluorouracil (5-FU), gemcitabin (Gemzar), irinotekan (Camptosar), paklitaksel (Taxol), topotekan (Hycamtin), vinkristin (Oncovin, Vincasar PFS), vinblastin (Velban).
[0078] U drugim izvođenjima, anti-VISTA jedinjenja i terapije iz pronalaska su zajedno davani sa jednim ili više antitela imunih kontrolnih tačaka, kao što su, na primer, nivolumab, pembrolizumab, tremelimumab, ipilimumab, anti-PD-Ll antitelo, anti-PD-L2 antitelo, anti-TIM-3 antitelo, anti-LAG-3v, anti-OX40 antitelo i anti-GITR antitelo.
[0079] U drugom izvođenju anti-VISTA jedinjenja i terapije su zajednički davani sa malim molekulom inhibitorom indolamin 2,3-diokdigenaze (IDO).
[0080] Anti-VISTA jedinjenja i kompozicije iz pronalaska mogu se davati subjektu kome je potrebno da bi se sprečilo (uključujući sprečavanje ponovnog pojavljivanja kancera) ili lečenje (npr., održavanje ili ublažavanje kancera ili jednog ili više od njegovih simptoma) kancera. Bilo koje sredstvo ili terapija (npr., hemoterapije, terapija zračenjem, ciljanih terapija, kao što su imatinib, sorafenib i vemurafenib, hormonalne terapije, i/ili biološke terapije ili imunoterapije) za koje je poznato da su korisni, ili koji su korišćeni ili se trenutno koriste za prevenciju, tretman, održavanje ili ublažavanje kancera ili njegovog
1
jednog ili više simptoma koji se može koristiti u kombinaciji sa ovde opisanim jedinjenjem ili kompozicijom iz pronalaska. Sredstva protev kancera, ali bez ograničenja na: 5-fluoruracil; acivicin; aldesleukin; altretamin; aminoglutetimid; amsakrin; anastrozol; antramicin; asparaginaza; azacitidin; azetepa; azotomicin; batimastat; bikalutamid; bleomicin sulfat; natrijum brekvinar; bropirimin; busulfan; karboplatin; karmustin; karubicin hidrohlorid; karzelesin; cedefingol; hlorambucil; cirolemicin; cisplatin; kladribin; krisnatol mezilat; ciklofosfamid; citarabin; dakarbazin; daktinomicin; daunorubicin hidrohlorid; decitabin; deksormaplatin; dezagvanin; dezagvanin mezilat; diazihion; docetaksel; doksorubicin; doksorubicin hidrohlorid; droloksifen; droloksifen citrat; dromostanolon propionat; duazomicin; edatreksat; eflornitin hidrohlorid; enloplatin; enpromat; epipropidin; epirubicin hidrohlorid; erbulozol; esorubicin hidrohlorid; estramustin; natrijum fosfat estramustin; etanidazol; etopozid; etopozid fosfat; fazarabin; fenretinid; floksuridin; fludarabin fosfat; fluorouracil; flurocitabin; fosidon; fostriecin natrijum; gemcitabin; gemcitabin hidrohlorid; hidroksiurea; idarubicin hidrohlorid; ifosfamid; ilmofosin; interleukin II (uključujući rekombinantni interleukin II, ili rIL2) , interferon alfa-2a; interferon alfa-2b; interferon alfa-m; interferon alfa-n3; interferon beta-I a; interferon gama-I b; iproplatin; irinotekan hidrohlorid; lanreotid acetat; letrozol; leuprolid acetat; liarozole hidrohlorid; lometreksol natrijum; lomustin; losoksantron hidrohlorid; mazoprokol; mehloretamin hidrohlorid; megestrol acetat; melengestrol acetat; melfalan; menogaril; merkaptopurin; metotreksat; metotreksat natrijum; metoprin; meturedepa; mitomicin; mitosper; mitotan; mitoksantron hidrohlorid; mikofenolna kiselina; nokodazol; ormaplatin; paklitaksel; pegaspargaza; porfromicin; prednimustin; prokarbazin hidrohlorid; puromicin; rogletimid; safingol hidrohlorid; semustin; simtrazen; sparfosat natrijum; sparsomicin; spiromustin; spiroplatin; streptonigrin; streptozocin; sulofenur; talisomicin; tegafur; teloksantron hidrohlorid; temoporfin; tenipozid; teroksiron; testolakton; tiamiprin; tiogvanin; tiotepa; tiazofurin; tirapazamin; topotekan; trimetreksat; trimetreksat glukuronat; triptorelin; uramustin; uredepa; vapreotid; verteporfn; vinblastin sulfat; vinkristin sulfat; vindezin; vindezin sulfat; vinepidin sulfat; vinglicinat sulfat; vinleurozin sulfat; vinorelbin tartrat; vinrozidin sulfat; vinzolidin sulfat; vorozol; zeniplatin; zinostatin; zorubicin hidrohlorid. Ciljane terapije uključuju, ali nisu ograničene na, inhibitore tirozin kinaze (npr., imatinib, sorafenib, i vemurafenib). Pronalazak takođe obuhvata davanje anti-VISTA jedinjenja iz pronalaska u kombinaciji sa terapijom zračenjem koja obuhvara upotrebu x-zračenja, gama zračenja i drugih izvora zračenja da bi se uništile ćelije kancera. Tretmani kancera su poznati u oblasti tehnike i opisani su u takvoj literaturi predstavljenoj u Physician’s Desk Reference (57. izdanje., 2003).
[0081] Ovde opisana anti-VISTA antitela su takođe korisna, na primer, u lečenju hroničnih infektivnih bolesti, kao što su HIV, HBV, HCV, i HSV, između ostalih.
[0082] Različita svojstva i informacija sekvence za odabrana anti-VISTA antitela ovde su obezbeđena u Tabelama 1A, 1B i 2.
2
Tabela 1B: Sekvence teškog i lakog lanca odabranih punih humanih ili humanizovanih anti-humanih VISTA antitela
2
Tabela 2: Konstanta disocijacije (KD) za odabrana anti-VISTA antitela
2
(nastavak)
2 PRIMERI
PRIMER 1: ANALIZA VISTA EKSPRESIJE NA HUMANIM HEMATOPOJETSKIM ĆELIJAMA
Postupci:
Dobijanje i bojenje svežih humanih PBMCs za VISTA ekspresiju
[0083] Ekspresija VISTA je ispitana na sveže izolovanim humanim PBMCs (mononuklearnim ćelijama iz periferne krvi) iz nekoliko donora. Anti-Humani VISTA-biotin (GA-1) je korišćen za bojenje (5 µg/ml). Mišji IgG1, K-biotin (Klon MOPC- 21 na 5 µg/ml) je korišćen kao kontrola izotipa.
Donorski materijal
[0084] Uzorci krvi su dobijeni iz Biological Specialty Corp. (Colmar, PA) i sakupljeni su i analizirani u istom danu.10 ml pune krvi koja sadrži heparin sulfat je preneto za analizu.
Priprema uzorka
[0085] Krv je razblažena 1:1 u sterlnom PBS-u.22 ml razblažene krvi iz pupčane vrpce je u slojevima naneto na 20ml sterilnog Ficoll-Hypaque Ficoll-Hypaque (GE Healthcare Cat# 17-144003) u konusnim epruvetama zapremine 50 ml. Epruvete su centrifugirane na 1800 oum tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon centrifugiranja mononuklearne ćelije na površini su sakupljene korišćenjem 1 ml pipetora i kombinovane su u dve epruvete sa konusnim dnom 50 ml zapremine. U svaku epruvetu je dodat sterilan PBS kako bi se dobila zapremina od 50 ml i ćelije su centrifugirane ne 300g tokom 10 minuta na 4°C. Supernatant je odliven. Ćelije su resuspendovane u 50 ml sterilnog PBS-a i epruvete su obrnute na 300g tokom 10 minuta na 4°C. Supernatant je odliven. Ćelije su kombinovane i resuspendovane u 50 ml sterilnog PBS-a pre bojenja.
[0086] Protokol za bojenje: Zamrznuta bočica koja sadrži 53107 PBMCs je korišćena za kompenzacione kontrole i kao kontrola za bojenje.
[0087] Korišćeni su sledeći reagensi i/ili potrošni materijali:
[0088] FACS pufer za bojenje (BSA) od BD Biosciences (Kat# 554657) koji je dopunjen sa 0.2% EDTA; slanim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) (Gibco kat#14190); polipropilenska ploča sa 96-bunarića sa zaobljenim dnom (BD #3077); 1.2 ml polipropilenske klaster epruvete (Coming #4451); biotinilovani Anti-VISTA klon GA-1 iz ImmunoNext serije# 080612B (korišćen u 5 µg/ml); biotinilovana mIgG1, K kontrola izotipa (Klon MOPC-21); Biolegend kat#400104, serija#B116649 (korišćen u 5 µg/ml); antihumana antitela (videti tabelu za bojenje ispod); bliska infracrvena živa/mrtva boja (Invitrogen, kat# L10119); i reagensi streptavidina uključujući STP-APC (BD Biosciences kat#554067, Lot#04251) (korićen u 1:200 razblaženju u FACS puferu), STPPE (Biolegend kat# 405203, Serija#B139688) (korišćen u 1:200 razblaženju u FACS puferu), STP-PE Cy7 (pokazalo je nespecifčno vezivanje u kontrolnim uzorcima izotipa), STP-Q605 (Invitrogen kat# Q10101MP, Serija#53449A) (korišćen u 1:200 razblaženju u FACS puferu).
Protokol za bojenje površine ćelija
[0089] Pre bojenja, 1X10<6>ćelija je preneto na ploče sa 96-bunarića sa zaobljenim dnom i isprane su sa 150 µl PBS. Ploče su nakon toga centrifugirane na 1300 oum na 4°C tokom 3 minuta.
[0090] Nakon toga, ćelije su ponovo isprane u PBS-u i centrifugirane su kao što je gore opisano.
2
[0091] Bojenje živih/mrtvih ćelija je nakon toga sprovedeno u 50 µl PBS koji sadrži 0.25 µl blisko infracrveno žive/mrtve boje. Nakon 10 minuta na sobnoj temperaturi bunarići su isprani sa 150 µl FACs pufera za bojenje i centrifugirani su na 1300 oum na 4°C tokom 3 minuta. Supernatant je odliven.
[0092] Ćelije su blokirane sa humanim serumom na 1:100 u 50 µl FACS puferu za bojenje. Ploče su inkubirane na 4°C tokom 15 minuta. Bunarići su zatim isprani sa 150 µl FACs pufera za bojenje i centrifugirani su na 1300oum na 4°C tokom 3 minuta. Supernatant je odliven.
[0093] Nakon toga u svaki bunarić se dodaje koktel koji se sastoji iz sledećih antitela za površinsko bojenje: Kokteli su opisani u Tabelama 3-6 u tekstu ispod. Svaki koktel će se koristiti odvojeno od drugih u zavisnosti od populacija od interesa.
2
j<a>
lini
ej
ojen
3:B
a
bel
Ta
lj<a>će T
e nj je Bo 4:la be Ta
je ojen 5: elaa
adi ij<e>lo m njeje
6:Bo ale
Tab
[0094] Nakon površinskog bojenja, ćelije su isprane dva puta kao što je prethodno opisano sa FACS puferom za bojenje i centrifugirane su na 1300 oum na 4°C tokom5 minuta. Uzorci su resuspendovani u 50 ml FACS pufera za bojenje koji sadrži odgovarajući fluorescentno-obeleženi streptavidin. Uzorci su inkubirani na 4°C u trajanju od 30 minuta. Ćelije su isprane sa 150 ml FACS pufera za bojenje i centrifugirane su na 1300 oum na 4°C tokom 5 minuta. Ovaj korak ispiranja je ponovljen pre nego što su uzorci resuspendovani u 250 ml FACS pufera za bojenje. Uzorci su analizirani na BD LSRFortessaTM ćelijskom analizeru (BD Biosciences) istog dana.
Analiza podataka
[0095] Podaci protočne citometrije su ponovo analizirani korišćenjem using FlowJo Version 9 softvera da bi se podesila specifična fenotipska populacija. Nabrajanje geometrijske sredine je korišćeno za poređenje VISTA ekspresije u različitim ćelijskim podsetovima. Svaka populacija je normalizovana za pozadinu oduzimanjem vrednosti kontrole izotipa od srednjih vrednosti uzoraka koji su tretirani sa anti-VISTA. Grafici su pripremljeni u Prism i statistička ispitivanja su izvedena korišćenjem ili Studentovnog T-testa ukoliko su upoređena samo dva uzorka, ili ANOVA jednog smera sa Bonferroni post-testovima.
Rezultati:
Ekspresija VISTA na humanim mijeloidnim i limfoidnim podsetovima:
[0096] Kao što je prikazano na slikama 2A-2E, 3A-3G, 4, 5A-5B and 6A-6C, VISTA ekspresija na CD14<+>monocitima značajno se razlikovala od svih drugih populacija (p < 0.001). Nije bilo značajnih razlika između drugih populacija. Monociti koji su eksprimirali najviše nivoe VISTA u perifernoj krvi, sa CD14<+>CD16<->podsetom imaju značajno veću ekspresiju od CD14<lo>CD16<+>ćelija. Dok su APCs pokazale umerenu ekspresiju VISTA, limfoidni podsetovi su pokazali niže nivoe ekspresije.
Ekspresija VISTA na humanim T i NK podsetovima:
[0097] Kao što je prikazano na slikama 7A-7E, 8A-8G i 9, sa NK podsetovima, CD56<lo>ćelije ispoljile su značajno veće nivoe ekspresije VISTA u odnosu na CD56<Hi>NK ćelije. T ćelijskih podsetova, CD8<+>memorijske ćelije eksprimirale su najveće nivoe ekspresije iako nisu bili značajno veći u odnosu na CD8<+>naivne ili CD4<+>T ćelije.
Ekspresija VISTA na podsetovima humanih dendritičnih ćelija:
[0098] Kao što je prikazano na slikama 10A-10D, 11A-11C i 12, nije bilo značajnih razlika u uočenoj VISTA ekspresiji; DCs i bazofili ispoljili su nižu ekspresiju VISTA, sa plazmacitoidnim dendritičnim ćelijama (pDCs) koje su generalno imala najveću ali ne u značajnoj meri.
[0099] Zaključak: Ovi rezultati pokazuju ekspresiju VISTA na različitim podsetovima imunih ćelija, i time što je VISTA najviše eksprimirana izražena na monocitima, sa nekom ekspresijom na različitim podsetovima T ćelija i NK ćelija, i bez do malo ekspresije na B ćelijama.
PRIMER 2: VISTA EKSPRESIJA NA ĆELIJAMA PERIFERNE KRVI
Postupci:
[0100] Bojenje pune krvi: Sveže izolovana cela krv (100 ml) je bojena sa koktelima antitela kao što je označeno u tekstu ispod inkubacijom od 30 minuta na 4°C. Crvene krvne ćelije (eng. RBCs) su lizirane sa RBC puferom za lizu crvenih krvnih ćelija i preostale ćelije su isprane 1x sa puferom za bojenje. Ćelije su resuspendovane u 200 ml pufera za bojenje. Podaci su sakupljeni korišćenjem MACSQuant protočnog citometra i analizirani su korišćenjem FlowJo softvera za analizu.
[0101] Bojenje mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMCs): Mononuklearne ćelije periferne krvi su 6
izolovane iz pune krvi upotrebom gradijenta Fikola. Sveže izolovane 1X10 PBMCs su bojene sa koktelom antitela u 100 ml pufera za bojenje. Uzorci su inkubirani u trajanju od 30 minuta na 4°C nakon čega su jednom isprani sa puferom za bojenje. Ćelije su resuspendovane u 100 ml pufera za bojenje. Podaci su sakupljeni korišćenjem MACSQuant<®>protočnog citometra (Miltenyi Biotec) i analizirani su upotrebom FlowJo softvera za analizu.
[0102] Korišćena antitela bila su CD11b, CD33, CD177, CD16, CD15, CD14, CD20, HLADR, CD3, CD4, CD8, CD127, CD69, i FOXP3 antitela (Biolegend, San Diego, CA). APC-konjugovani mišji anti-humani VISTA (klon GG8) je napravljen od ImmuNext (Lebanon, NH).
Zaključci:
Ekspresija VISTA na zdravim ćelijama humane periferne krvi
[0103] Cela krv i mononuklearne ćelije periferne krvi su analizirane za VISTA ekspresiju korišćenjem multikolorne protočne citometrije. Kao što je prikazano na Sl.15A i 15B, najveći nivo VISTA ekspresije je detektovan na monocitima koje prate neutrofili. I CD4+ i CD8+ T ćelije eksprimirale su nizak nivo VISTA u poređenju sa Slikom 13C i 13D.
Ekspresija VISTA na ćelijama periferne krvi pacijenta koji ima kancer
[0104] Kao što je prikazano na slikama 14A-C, analizirane su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) iz pluća pacijenata koji imaju kancer. Slika 14A je reprezentativni dijagran toka koji pokazuje analizu CD14<+>monocita i CD15<+>supresivnih ćelija izvedenih iz mijeloida (MDSCs). Ovi rezultati ukazuju na to da fenotipske CD15<+>ćelije su MDSCs izvedeni iz neutrofila. Dodatno, ove ćelije su odsutne u zdravim uzorcima krvi. Slika 14B je reprezentativni histogram VISTA ekspresije na zdravim i i monocitima koji su dobijeni od pacijenta koji ima kancer, ukazujući na visok nivo VISTA ekspresije na ćelijama pacijenata koji imaju kancer u poređenju sa zdravim kontrolama. Slično tome visok nivo VISTA je pronađen na MDSCs kod pacijenata koji imaju kancer, kao što je prikazano na slici 14C.
[0105] Slika 15A je reprezentativni FACS dijagram koji pokazuje prisustvo neutrofila izvedenih iz MDSCs u krvi pacijenata sa kancerom debelog creva. Slika 15B i 15C su reprezentativni histogrami koji pokazuju viši nivo VISTA ekspresije na monocitima pacijenata koji imaju kancer u poređenju sa uzorcima krvi zdravog donora.
Ekspresija VISTA na ćelijama periferne krvi cinomolgus majmuna
4
[0106] Kao što je prikazano na Slici 16A i 16B analiza protočnom citometrijom pune krvi majmuna otkrila je da obrazac VISTA ekspresije je sličan sa humanim ćelijama. I monociti i neutrofili su eksprimirani na najvišem modelu VISTA u poređenju sa CD4<+>(Slika 16C) i CD8<+>(Slika 16D) T ćelija. PRIMER 3: VISTA EKSPRESIJA U ĆELIJSKIM LINIJAMA HEME MALIGIGNITETA NA RNK NIVOU I PROTEINSKOM NIVOU
[0107] Zbog toga što je VISTA eksprimirana u heme malignitetima, anti-VISTA antitelo bi potencijalno moglo ciljati maligne ćelije za destrukciju, kao i blokirati VISTA i promovisati imune odgovore protiv tumora.
[0108] Podaci uključuju RNAseq analizu ~140 ćelijskih linija heme maligniteta (neke ćelijske linije su ponovljene u analizi). Podaci su prikazani na Slici 17.
[0109] Vrednosti RNAseq su naznačene sa FPKM (Fragmenti po kilobazi egzona na milion mapiranih fragmenata) vrednostima.
[0110] U suštini, ovo znači da su sva očitavanja koja spadaju u egzonske regione gena prebrojana i normalizovana dužinom gena i ukupnim brojem očitavanja po uzorku (da bi se uzele u obzir razlike između uzoraka). Granična vrednost je 1; iznad 1 je pozitivan za VISTA ekspresiju (na RNK nivou), ispod 1 je negativan za VISTA ekspresiju.
[0111] Rezultati su pokazali da su mnoge linije ćelija pozitivne na RNK nivou, primarno akutne mijeloidne leukemije i hronične mijelogene leukemije. Ovo može biti očekivano s obzirom da je VISTA visoko eksprimiran u normalnim mijeloidnim ćelijama, i zbog toga se veruje da njegova funkcija ublažava imune odgovore, uključujući imune odgovore protiv tumora.
PRIMER 4: DOBIJANJE MONOKLONSKIH ANTITELA PROTIV VISTA
Postupak afinitetne selekcije (eng. „panning“) faga
[0112] Izvedena su dvadeset i četiri eksperimenta sa afinitetnom selekcijom faga da bi se obogato sa fagom koji reaguje na Cino VISTA-His. Protein Cinomolgus VISTA je korišćen za ovde eksperimente zbog toga što je pokazao bolju konjugaciju biotina u odnosu na humani VISTA protein. Da bi se odredio uspeh eksperimenata sa fagom, skupovi faga iz pojedinačnih krugova afinitetne selekcije su dodati u neutravidinske ploče obložene sa cino VISTA-His i detektovane sa HRP-konjugovanim anti-M13 antitelom. Pojedinačne kolonije su sakupljene iz krugova selekcije faga i and Fabs proteini su proizvedeni u pločama sa 96 bunarića. Eksprimirani Fab supernatanti su testirani za vezivanje sa biotinilovanim cino VISTA-His. Rezultiralo je sa više od 200 pogodaka.
[0113] VH i VL regioni iz Fab ploča su umnoženi, podvrgnuti sekvencioniranju DNK i izvedeni su kao FASTA datoteke. Prilikom odabira klonova koji bi trebalo da se konvertuju i testiraju kao MABs, klonovi su izabrani na osnovu raznolikosti u sekvenci kao i da imaju ograničene rizike post-translacionih modifikacija i što je moguće manje hidrofobnih ostataka.
[0114] VH i VL iz klonova faga su sub-klonirani u sisarske IgG1/kapa ekspresione vektore i transfektovani su u HEK293 ćelije. Antitela su prečišćena na Protein A Sepharose Fast Flow afinitetnoj smoli. Koncentracija MABs faga je određena kvantitativnom ELISA korišćenjem Nanodrop merenja, Panel antitela je eksprimiran na visokim nivoima. SDS-PAGE analiza je pokazala integritet eksprimirane varijante antitela.
[0115] In-line sazrevanje antitela faga je obavljeno umnožavanjem domena VH iz mešavina poliklonskih antitela iz poslednje runde afinitetne selekcije za kloniranje u vekore faga koji imaju diverzitet u VL. Ovo je rezultovalo obogaćenim VH skupom koji je uzorkovan za dodatni diverzitet u VL. Fag je prošao kroz 1-2 runde stroge selekcije sa očekivanjem za identifikovanje visoko afinitetnih vezivanja za VISTA ECD His protein. Izvršena je monoklonska Fab ELISA da bi se odredio uspeh sazrevanja. ELISA i podaci za ekspresiju su normalizovani na postavku referentnog klona na 100% od originalnog de novo eksperimenta afinitetne selekcije i klonovi sa sazrelim afinitetom sa većim signalom vezivanja za cino VISTA antigen u odnosu na referentni klon su identifikovani. Ovaj proces je generisao nekoliko klonova koji su pokazali vezivanje do 200% kada je izvršen skrining na niskoj koncentraciji antigena (1 nM), klonovi sa najvećim afinitetom su sekvencirani i proizvedeni kao MABs. Dobijanje hibridoma
[0116] Jedna grupa BALB/cAnNCrl miševa dobila je jednu intraperitonealnu (IP) injekciju od 50 µg Hu VISTA-Ig rekombinantnog proteina (Sino) emulgovanog u kompletnom Freundovom Adjuvansu praćeno dve nedelje kasnije sa jednom IP injekcijom od 50 µg Hu VISTA-Ig rekombinantnim proteinom emulogovanim u nekompletnom Freundovom Adjuvansju. Dve nedelje kasnije miševi su primili jednu IP injekciju od 50 µg cino VISTA-Fc rekombinantnog proteina emulgovanog u nekompletnom Freundovom Adjuvansu. Svi miševi su primili finalnu injekciju od 25 µg humanog i 25 µg cino VISTA u bazi repa u PBS, pet dana pre sakupljanja slezine sa spajanje.
[0117] Druga grupa BALB/cAnNCrl miševa primila je jednu IP injekciju od 50 µg Hu VISTA-His rekombinantnog proteina emulgovanog u kompletnom Freundovom Adjuvansu. Dve nedelje kasnije miševi su primili jednu IP injekciju od 50 µg Hu VISTA-His rekombinantnog emulgovanog u nekompletnom Freundovom Adjuvansu. Dve nedelje kasnije miševi su primili jednu IP injekciju 50 µg Cino VISTA-His rekombinantnog proteina emulgovanog u nekompletnom Freundovom Adjuvansu. Dve nedelje kasnije svi miševi su primili finalnu koncentraciju 25 µg Hu VISTA-His i 25 µg Cyno VISTA-His u PBS, tri dana pre sakupljanja slezine sa spajanje.
[0118] U danu spajanja, miševi su eutanizovani asfiksacijom CO2, ćelije su uklonjene i postavljene u 10 mL hladnog rastvora soli puferovanog fosfatom. Pojedinačna ćelijska suspenzija splenocita je pripremljena mlevenjem slezina kroz fino sito sa malim tučkom i ispiranjem sa PBS na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane jednom sa PBS iz izložene lizi crvenih krvnih zrnaca (eng.RBC). Ukratko, ćelije su resuspendovane u 3mL pufera za lizu RBC (Sigma #R7757) po svakoj slezini i postavljeni su na led tokom 5 minuta. Ćelije su ponovo jednom isprane u PBS na sobnoj temperaturi i obeležene su za magnetno sortiranje. Prema instrukcijama proizvođača, ćelije su obeležene sa anti-mišjim Thy1.2, antimišjim CD11b i anti-mišjim IgM magnetnim perlama (Miltenyi Biotec # 130-049-101, 130-049-601 i 130-047-301 redom) zatim su sortirane korišćenjem MS kolone sa Midi MACS. Negativne frakcije ćelija (pozitivne frakcije ćelije su odbačene) su spojene sa FO ćelijama. Spajanje je izvedeno u 1:1 odnosu mišjih ćelija mijeloma prema vijabilnim ćelijama slezine. Ukratko, ćelije slezine ćelije i mijeloma su pomešane zajedno, peletirane i isprane jednom u 50 mL PBS. Pelet je resuspendovan sa 1 mL rastvora polietilen glikola (PEG) (2 g PEG molekularna težina 4000, 2 mL DMEM, 0.4 mL DMSO) po 10e8 splenocita na 37°C tokom 30 sekundi. Smeša ćelija/spajanje je nakon toga uronjena u 37°C vodeno kupatilo za približno 60 sekundi sa nežnim mešanjem. Reakcija spajanja je zaustavljena laganim dodavanjem 37°C DMEM tokom 1 minuta. Spojenim ćelijama je dozvoljeno da se odmore 5 minuta na sobnoj temperaturi i nakon toga su centrifugirane 150 X g tokom 5 minuta. Ćelije su nakon toga resuspendovane u Medijumu E-HAT (MediumE (StemCell Technologies cat#03805) koji sadrži HAT (Sigma kat#H0262) i zasejane u polistirensku ploču za kulturu tkiva od 96-bunarića (Corning # 3997).
[0119] EIA za hvatanje je korišćen za skrining supernatanta hibridoma za antitela koja su specifična cino VISTA. Ukratko, ploče (Nunc-Maxisorp #446612) su obložene sa 4 µg/ml za bar 60 minuta sa kozjim anti-mišjim IgG (Fc) antitela (Jackson #115-006-071) u puferu za oblaganje (Thermo 28382). Ploče su obložene sa 200 µl/bunariću 0.4% (w/v) goveđeg albumina iz seruma (BSA) u PBS tokom 30 minuta na ST. Ploče su jednom isprane i 50 µl/bunariću supernatanta hibridoma je dodato i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom bar 30 minuta. Ploče su isprane jednom i 50 µl/bunariću 0.1 µg/mL cino VISTA-huIg je dodato i inkubirano na ST tokom 30 minuta. Ploče su isprane jednom i 1:40,000 Streptavidin HRP (Jackson 016-030-084) u 0.4% BSA/PBS je dodato u ploče i inkubirano u trajanju od 30 minuta na RT. Ploče su isprane 3x i nakon toga su razvijene korišćenjem 100µl/bunariću TMB Turbo supstrata (Thermo Scientific 34022) inkubacijom od približno 10 minuta na ST. Reakcija je zaustavljena korišćenjem 25µl/bunariću 4N sumporne kiseline i apsorbanca je merena na 450 nm korišćenjem automatizovanog spektrofotometra na ploči. Od primarnih pogodaka petnaest je izabrano za subkloniranje ograničenim razblaženjem i izvršen je skrining u istom formatu primarnog skrininga.
[0120] Izvršen je unakrsni skrining svih cino VISTA reaktivnih linija ćelija hibrodoma korišćenjem humanog VISTA-Ig da bi se ispitala unakrsna reaktivnost. Ukratko, ploče (Nunc-Maxisorp #446612) su obložene na 4µg/mL sa kozjim anti-ms Fc (Jackson#115-006-071) u 0.1M natrijum karbonat-
TM
bikarbonatnom puferu, pH 9.4 (Pierce 28382 BupH ) O/N na 4°C. Bez ispiranja, bunairći su blokirani sa 200 µl bloka (0.4% BSA (Sigma) (mas/v) u PBS (Invitrogen)) preko noći na 4°C. Nakon uklanjanja rastvora za blokiranje, nerazblaženi supernatanti hibridoma su inkubirani na obloženim pločama tokom 30 minuta na ST. Ploče su jednom isprane sa PBST (0.02% Tween 20 (Sigma) (mas/v) u PBS), i zatim su inkubirane u trajanju od 30 minuta sa Hu VISTA-Ig razblaženim do 100 ng/ml u bloku. Ploče su jednom isprane sa i ispirane sa kozjim antihumanim-Fc-HRP (Jackson #109-036-098) razblaženo 1:10,000 u bloku tokom 30 minuta na ST. Ploče su ponovo isprane i naknadno razvijene korišćenjem 100µl/bunariču TMB Turbo supstrata (Thermo Scientific 34022) inkubiranjem približno 10 minuta na ST. Reakcija je zaustavljena korišćenjem 25µl/bunariću 4N sumporne kiseline i apsorbanca je merena na 450 nm automatizovanog spektrofotometra na ploči.
[0121] Hibridomi za koje je pokazano da su reaktivni i za humani i cinomolgus VISTA imali su klonirane sekvence V regiona antitela. Ćelije hibridoma su pripremljene pre reakcija reverznom transkriptazom (RT) sa Invitrogen’s SuperScript III ćelija Direktnim cDNK Sistemom. Ukratko, medijum kulture je odbačen i ploča je postavljena na led i resuspendovana u 200 µl hladnog PBS. Četrdeset mikrolitara je preneto na MicroAmp fast 96 bunarića Reaction PCR ploču i ploča je postavljena na podlogu od hladne metalne ploče, zatvorena sa plastičnim filmom i obrnuta na 700 oum tokom 3 minuta. PBS je odbačen i u svaki bunarić, 10 µl pufera za resuspenziju i 1 µl pojačivača lize je dodato. Ploča je zatvorena i inkubirana na 75°C tokom 10 min i skladištena na -80°C.
[0122] Za RT reakciju, svaki bunarić je sadržai 5 µl vode, 1.6 µl 10X Dnaza pufer, 1.2 µl 50 mM EDTA, 2 µl Oligo(dT)20 (50 mM) i 1 µl10 mM dNTP Mešavine. Ploča je inkubirana na 70°C tokom 5 min, nkon čega sledi inkubacija na ledu od 2 min, zatim su sledeći reagensi dodavani u svaki bunarić; 6 µl 5X RT TM
Pufer, 1µl RNazaOUT (40 U/µl), 1 µl SuperScript<TM>III RT (200 U/µl) i 1 µl od 0.1M DTT. Ploča je zatvorena i postavljena na termički ciklus prethodno zagejan na 50°C i inkubirana je 50°C tokom 50 minuta, praćeno inaktivacijom (5 min inkubacija na 85°C). Reakcija je ohlađena na ledu i jednolančana cDNK je skladištena na - 80°C do daljeg korišćenja.
[0123] Za umnožavanje V regiona, postavljeno je 20 µl PCR reakcija. Svaki bunarić je sadržao 16.2 µl vode, 2.0 µl 10X PCR Reakcionog pufera, 0.8 µl MgSO4 (50 mM), 0.4 µl 10mM dNTP, 0.15 µl 100 uM Miks prednjeg prajmera 0.05 µl 100 uM Reverzni prajmer, 0.2 µl HiFi Tag enzim cDNK, pripremljeno kao što je gore opisano, je preneto u (2 µl/bunariću) u mešavinu PCR komponenti, ploča je zatvorena i pokrenuta je reakcija umnožavanja; za VH program je bio (i) 94°C tokom 1 min (ii) 94°C tokom 15 sek (iii) 55°C tokom 30 sek (iv) 68°C tokom 1 min. Koraci (ii - iv) su ponavljani za ukupno 35 ciklusa praćeno konačnom ekstenzijom na 68°C tokom 3 min. za VL program je bio (i) 94°C tokom 1 min (ii) 94°C tokom 15 sek (iii) 55°C tokom 30 sek (iv) 65°C tokom 30 sek, (v) 68°C tokom 1 min. Koraci (ii - v) su ponavljani za ukupno 35 ciklusa praćeno konačnom ekstenzijom na 68°C tokom 3 min.
[0124] Prednji prajmeri su prethodno pomešani i takva mešavina je korišćena u odnosu 3:1 sa reverznim prajmerom. PCR proizvodi su potvđeni na agaroznom gelu. Reakcije su pripremljene za infuziono kloniranje dodavanjem pojačivača (In-Fusion HC kit za kloniranje, kat #639650, Clontech). Pet mikrolitara od svake PCR reakcije je preneto na svaku PCR ploču praćeno sa transferom 2 µl pojačivača/bunariću. Ploča je zatvorena i inkubirana u termičkom ciklusu (15 min na 37°C i 15 min na 80°C). Vektor destinacije (vDR243 ili vDR301) je pripremljen digestijom Esp3I; (1.5µg vektora je digestirano u 3 µl Tango oufera, 2 l Esp3I i voda u 30 µl reakciji na 37°C tokom 2 h).
[0125] Za kloniranje infuzijom, 2 µl PCR proizvoda tretiranog pojačivačem je pomešan sa 100 ng Esp3I digestiranog vektora i 2 µl 5X enzima za infuziju (Clontech). Reakcija infuzije je sprovedena na PCR formatu ploče sa 96-bunarića. Ploča je inkubirana tokom 15 min na 50°C na PCR mašini i Stella kompetentne ćelije su transformisane sa toplotnim šokom tokom 40 sekundi na 42°C bez mešanja i raspoređene su na ploče sa LB agrom sa odabranim antibiotikom i inkubirane su preko noći na 37°C. Sledećeg dana, kolonije su sakupljene u duboke ploče sa 96-bunarića koje sadrže LB/karbenicilin medijumu i gajene su preko noći na 37°C. Zamrznuti štokovi su napravljeni od prekonoćne kulture mešanjem sa jednakom zapreminom 30% mas/v glicerola. V regioni su sekvencirani korišćenjem prajmera za sekvencioniranje SPF0052. Sekvence su analizirane, jedan pozitivni bunarić po hibridomu vH i vL je izabran, ponovo je nanet u nove ploče i gajeno je preko noći u bogatom medijum sa ampicilinom. Klonovi su zatim imali miniprep DNK pripremljen za transfekciju malog obima u ploču sa 96-bunarića.
[0126] Četrdeset osam izabranih sekvenci mišjih hibridoma i za težak i laki lanac su humani regioni okvira koji su prilagođeni korišćenjem internog računarskog programa. Jedan humani region okvira je izabran za svaki od mišjeg vH ili vL. DNK sekvence V regiona su dobijene kroz povratnu translaciju. Sintetski regioni DNK koji odgovaraju sa HFA aminokiselinskim sekvencama su naručeni od Integrisanim DNK Tehnologija (Coralville, IA). Kloniranje je izvedeno u prethodno isečenim vDR149 i vDR157, humanog IgG1 i humanog kapa redom. Qiagen Endo-free Maxi-prep kitovi su korišćeni za pripremu DNK. Expi293 (100 ml) kulture su korišćene za ekspresiju panela ovog antitela.
PRIMER 5: PROTOKOL ZA ISPITIVANJE SUPRESIJE T ĆELIJA HUMANIM VISTA-IG IN VITRO
[0127] Mišje A20 ćelije su stabilno transfektovana sa ili GFP ili humanim VISTA. Inkubirani su sa ova peptidom i sa DO11.10 T ćelijama. Ekspresija CD25 od strane T ćelija je merena 24 h nakon započete inkubacije. A20-huVISTA ćelije suprimiraju CD25 ekspresiju sa T ćelijama, ali ovo očitavanje je značajno obnovljeno inkubacijom sa VSTB95 (Slika 18).
PRIMER 6: ADAPTACIJA ANTI-VISTA ANTITELA HUMANIM REGIONIMA OKVIRA
[0128] Sekvence mišjeg hibridoma i za težak i laki lanac su humanog regiona okvira prilagođen sa presađivanjem CDR (Jones, et al. Nature, 321: 522-525 (1986) korišćenjem internog računarskog programa. Program ocrtava regione koji određuju komplementarnost (CDRs) sekvenci V regiona prema Kabat definicijama (Wu, T. T. & Kabat, E. A. (1970). J Exp Med, 132, 211-50) i poredi regione okvira sekvenci sa humanim germinativnim genima korišćenjem Blast. Humana germinativna linija sa najvećim identitetom sekvence sa mišjim regionima okvira je izabran kao akceptorski gen za prilagođavanje humanog regiona okvira (HFA). U nekoliko slučajeva, blisko povezana humani germinativni geni su izabrani između, na osnovu prethodnog iskustva sa dobro eksprimiranim humanim regionima okvira. Sekvence DNK za humane regione okvira su izabrane za svaki od mišjih vH ili vL V regiona dobijeni su kroz povratnu translaciju. Sintetski regioni DNK koji odgovaraju HFA aminokiselinskim sekvencama naručeni su od Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Kloniranje je sprovedeno u humanom IgG1 i humanom kapa, redom.
PRIMER 7: KONSTRUKTI ANTI-VISTA ANTITELA
[0129] Plazmid i sekvenca informacije za molekule za razvoj ćelijske linije: Plazmidni konstrukti su generisani za anti-VISTA antitela koji imaju VSTB112 varijabilne regione i IgG1κ konstantne regione (VSTB174, nov broj usled zbog alotipske promene u konstantnom regionu), IgG2sigma konstantni region (VSTB140) ili konstantni region otporan na IgG1 proteazu (VSTB149).
Lonza Vektori
[0130] pEE6.4 i pEE12.4 ekspresioni sistem vektora jajnika kineskog hrčka(CHO) (Lonza Biologics, PLC) je uspostavljen u Biologics Research (BR) i Pharmaceutical Development & Manufacturing Sciences (PDMS) kao primarni ekspresioni sistem za dobijanje terapeutskih mAt-a u sisarskim ekspresionim ćelijskim linijama. Svaki vektor sadrži promotor humanog citomegalovirusa (huCMV-MIE) da bi se pokrenula ekspresija teškog lanca (HC) ili lakog lanca (LC) i sadrži gen na rezistenciju na ampicilin. pEE12.4 vektor takođe uključuje gen koji kodira za enzim glutamin sintetaze (GS). Uslovi rasta koji zahtevaju aktivnost glutamin sintetaze postavljaju selektivni pritisak na ćelije da bi se održao ekspresioni vektor (GS Gene Expression System Manual Version 4.0). pEE6.4 je korišćen za kloniranje HC gena i pEE12.4 da bi se klonirao LC gen kao pojedinačni genski vektori. Dvostruki genski plazmid Lonza je kreiran iz ova dva pojedinačna Lonza genska vektora.
Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca odabranih VISTA mAt-a
[0131] > VSTB112 težak lanac (SEQ ID NO:37)
[0132] > VSTB50 težak lanac (SEQ ID NO:38)
[0133] > VSTB53 težak lanac (SEQ ID NO:39)
[0134] > VSTB95 težak lanac (SEQ ID NO:40)
Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca odabranih VISTA mAt-a
[0135] >VSTB50 laki lanac (SEQ ID NO:41)
[0136] >VSTB53 laki lanac (SEQ ID NO:42)
[0137] >VSTB95 laki lanac (SEQ ID NO:43)
[0138] >VSTB112 laki lanac (SEQ ID NO:44)
[0139] >VSTB116 laki lanac (SEQ ID NO:45)
PRIMER 8: ELISA I FACS SKRINING ANTI-VISTA ANTITELA
[0140] Ovi eksperimenti si izvedeni da bi se odredila sposobnost proizvedenih antitela da se vežu za humani ili cinomolgus VISTA protein u ELISA, kao i da bi se odredilo, korišćenjem FACS skrininga, sposobnost antitela da se vežu za VISTA protein na površini K562 ćelija (linija ćelija humane mijelogene leukemije) koja eksprimira humane ili cinomolgus VISTA proteine.
Postupci:
[0141] Pregled ELISA postupka: Ploče su preko noći obložene na 4°C sa 1 µg/ml SB0361 (humanim) ili SB0361 (cino (cinomolgus)) proteinima, koji su vanćelijski domeni VISTA iz odgovarajućih vrsta. Antitela su razblažena do 1 µg/ml kao početna koncentracija sa 1:4 postepenim razblaženjima za ukupno 4 koncentracije i inkubrana su na sobnoj temperaturi (ST) u trajanju od 2 h. Mišji anti-humano IgG1-HRP (peroksidaza rena) je korišćen za detekciju i inkubiran u trajanju od 1 h na ST. Sva ispiranja su izvedena korišćenjem PBS-Tween (0.05%).
4
[0142] Pregled FACS postupka: 2 x 10<5>K562-G8 (humane) ili K562-C7 (cino) ćelije su bojene sa 5 µg/ml svakog ispitivanog antitela i inkubirane su u trajanju od 30 minuta na 4°C. Kozje anti-humano IgG1-PE (fikoeritrin) antitelo je korišćeno antitelo za sekundarnu detekciju na 5 µg/ml. Ćelije su nanete na BD Fortessa i analizirane su korišćenjem FlowJo softvera (Tree Star, Inc., Ashlang, OR) za MFI (srednja vrednost intenziteta fluorescencije) vijabilne populacije.
[0143] Analiza podataka/Rezultati: Za svako antitelo, subjetivni rezultat (Da/Ne) je davan u odnosu na to da li se antitelo vezalo snažno ili nije i za ELISA i FACS analizu za svaki od 4 testova. Ukoliko je antitelo dalo rezultat "Ne" za vezivanje u svakom testu, ponovljen je da bi se potvrdilo da je negativno. Rezultati su prikazani ispod u Tabeli 7 i na Slikama 19A-19F i 20A-20F.
Tabela 7.
(nastavak)
PRIMER 9: REZULTATI SKRINIGA ANTI-HUMANIH VISTA ANTITELA KORIŠĆENJEM REAKCIJE POMEŠANIH LIMFOCITA (MLR) I STAPHYLOCOCCUS ENTEROTOKSIN B (SEB) TESTOVA AKTIVACIJE [0144] Cilj ove studije je da se predstave podaci koji podržavaju identifikaciju višestrukih funkcionalnih α-VISTA antitela koja pojačavaju ćelijske imune odgovore u testu reakcije pomešanih limfocita (MLR), kao i staphylococcus enterotoksin B testu aktivacije (SEB).
[0145] Reakcija pomešanih limfocita (MLR) je standardni imunološki test koji zavisi od nepodudaranja MHC klase I i II da bi se pokrenuo odgovor alogene T ćelije. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi su su izolovane iz dve individue koje se ne podudaraju, inkubirani su zajedno i kao rezultat ovih nepodudaranja, dešava se proliferacija limfocita i proizvodnja citokina.
Materijal i Postupci:
[0146] 10% AB Medijum je pripremljen kombinovanjem 500 ml RPMI sa 50 ml humanog AB seruma, 5 ml penicilina/streptomicina (10,000 U/ml), 5 ml L-glutamina (100x) i 10 ml HEPES (1M). Medijum je skladišten ne duže od 14 dana. 1 mCi tricijanog timidina je pripremljeno razblaženjem 0.2 ml štoka timidina (1 mCi/ml) u 9.8 ml of RPMI.
[0147] Rastvorljiva VISTA antitela su razblažena do 20 µg/ml u 10% medijumu AB seruma. 100 µl odgovarajućeg rastvora antitela je dodato u odgovarajuće bunariće ploče sa U dnom sa 96 bunarića (Falcon proizvod #353077 ili ekvivalent). Nakon dodavanja različitih populacija ćelija, finalna koncentracija je bila 10 µg/ml.
[0148] Izolovanje belih krvnih zrnaca: Donori su imali bar 18 godina, generalno zdravi i slučajno odabrani iz lokalne populacije. Donorska krv je preneta iz epruveta za izolovanje u epruvete sa konusnim dnom od 50 ml. Pažljivo je položeno je 15 ml Fikola 1077 na 25 ml krvi da ne bi došlo do mešanja sa krvi. Ćelije su centrifugirane 1250g tokom 25 minuta na sobnoj temperaturi bez pauze. Bela krvna zrnca su izolovana na međufazi Fikola i seruma i ćelije su razblažene u 40 ml Henkovog balansiranog rastvora soli (HBSS). Ćelije su centrifugirane na 453g (1500 oum) tokom 10 minuta na 4°C. Ćelije su resuspendovane u 50 ml HBSS i izbrojane prenošenjem 500 µl u odvojenu epruvetu.
[0149] Postavka ploče sa 96 bunarića reakcije pomešanih limfocita (MLR): Odrediti odgovarajući broj "ćelija stimulatora" i "ćelija respondera" koji su neophodni za test na osnovu broja uzorka koji će se analizirati. Populacija stimulatora je zasejana na 0.5 x 10<5>ćelija/bunariću i populacija respondera je zasejana na 1.0 x 10<5>ćelija/bunariću na ploči sa U dnom sa 96 bunarića. Svi uslovi moraju biti sprovedeni u triplikatu. Odgovarajući broj "stimulatorskih ćelija" je pipetiran u nove epruvete sa koničnim dnom i centrifugiran kao što je prethodno opisano. Resuspendovati ćelije u 10 ml i ozračiti sa 4000 rada. Centrifugirati ćelije kao što je prethodno opisano i resuspendovati u koncentraciji od 1 x 106/ml u 10% medijumu AB seruma i dodati 50 µl u odgovarajuće bunariće. Izolovati odgovarajući broj responderskih ćelija i centrifugirati kao što je prethodno opisano i resuspendovati u koncentraciji 6
od 2 x 10 /ml u 10% medijumu AB seruma i dodati 50 µl u odgovarajuće bunariće. Inkubirati ćelije tokom 5 dana na 37°C i 5% CO2. U petom danu, ukloniti 30 ml supernatanta za analizu proizvodnje (IFN-γ). U petom danu, dodati 25 µ od 40 µCi/ml rastvora tricijanog timidina u svaki bunarić i inkubirati u trajanju od 8 h na 37°C i 5% CO2. Preneti ćelije na mikro scintilacionu ploču sa 96 bunarića prema instrukcijama proizvođača. Izbrojati korišćenjem mikro scintilacionog brojača prema instrukcijama proizvođača. Koncentracija IFN-γ je određena sa ELISA (eBioscience kat# 88-7316-88) korišćenjem protokola proizvođača.
[0150] Analiza podataka: Izračunati srednji broj u minuti (CPM) koncentracije IFN-γ za netretirane bunariće. Izračunati srednji broj CPM ili IFN- γ za svaku od ispitivanih grupa. Log10transformiše skup podataka. Korišćenjem 12 MLR puta rezultata za svako jedinjenje, izračunati srednju vrednost za skup od 12 ispitivanih grupa svakog jedinjenja Srednji rezultat za 12 eksperimenata = Σ [(log10(Srednja vrednost CPM triplikata za ispitivano jedinjenja)) - (log10(Srednja vrednost CPM triplikata za Br Tretmana))]/12
[0151] Kriterijum prihvatanja: Svi test reagensi i odgovarajuće kontrole su ispitane na endotoksin pre pokretanja testa i imaju nivoe od < 0.1 EU/mg. Samo ćelije responderi koje su imale CPM brojanja ispod 700 CPM u proseku što ukazuje da su ćelije mirovale kada su same inkubirane. CPM za MLR grupu bio je 2 puta veći u odnosu na CPM za responderske ćelije koje su same inkubirane što ukazuje na to da se reakcija pojavila i da se donori ne podudaraju. Svi MLR testovi uključivali su humani IgG1 protein negativne kontrole. Rezultat humanog IgG1 negativne kontrole nije se statistički razlikovao od ne-tretiranih uzoraka na osnovu upotrebe studentovog t-testa.
[0152] Skrining anti-VISTA antitela u MLR: Početni skrining svih jedinjenja. Pre pokretanja MLR sa anti-VISTA antitelima, potvrđeno je da antitela vežu i VISTA vezan za ćeliju putem FACS analize i VISTA protein putem ELISA. Antitela S26 (VSTB77), S30 (VSTB86), S31 (VSTB88), S32 (VSTB90) i S39 (VSTB74) nisu prošla ovaj početni skrining ali su još uvek ispitana u testu. Za svrhu početnog skrininga, sva antitela su ispitana na 10 µg/ml u MLR sa proliferacijom i IFN-γ kao parаmetrima merenja (Slike 21A-21D i 22A-22B).
4
[0153] Selekcija šest vodećih antitela. Iz početnog skrininga, šest kandidata je izabrano za dalju analizu: VSTB112 (S2), VSTB116 (S5), VSTB95 (S16), VSTB50 (S41), VSTB53 (S43) i VSTB60 (S47).
[0154] Studije razblaženja šest najboljih kandidata u MLR: Prilagođavanja protokola. Protokol je identičan kao što je prethodno opisano sa prilagođavanjima u kojima su antitela razblažena do sledećih koncentracija: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01 i 0 µmg/ml.
[0155] Određivanje IC50 vrednosti: Neobrađena CPM brojanja i IFN-γ koncentracije su korišćene za određivanje IC50za svako antitela. Izračunavanja IC50su određena kroz upotrebu programa "EZ-R stats." Šest individualnih respondera je korišćeno da bi se odredile IC50vrednosti. Individualna CPM brojanja i IFN-γ koncentracije u MLR sa titracijama doze vodećih kandidata.
Tabela 8: IC50vrednosti za oba CPM i IFN-γ u MLR
[0156] Zaključak: Početni skrining ukazuje na to da višestruka VISTA specifična antitela su sposobna da pojačaju ćelijski imuni odgovor MLR. Antitela su rangirana na osnovu efikasnosti i varijanse i na osnovu ovih rezultata, VSTB112, VSTB116, VSTB95, VSTB50, VSTB53 i VSTB60 su izabrani za procenu u eksperimentima titracije doze. VSTB60 je indukovao slabiji odgovor u odnosu na ostalih pet antitela u eksperimentima titracije doze.
[0157] Test aktivacije stafilokoknog enterotoksina B (SEB): SEB je bakterijski super-antigen koji indukuje aktivaciju specifičnih Vβ+ T ćelija. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi su izolovane i inkubirane sa SEB antigenom u kulturi, koji indukuju snažnu proizvodnju citokina. Ovaj test je sproveden na pet vodećih kandidata.
[0158] Priprema 10% AB Medijuma, priprema 1 mCi tricijanog timidina, priprema rastvorljivih VISTA antitela, i izolovanje belih krvnih zrnaca su svi sprovedeni kao što je gore prethodno opisano u MLR.
[0159] Postavka SEB ploče sa 96 bunarića: Odrediti odgovarajući broj ćelija respondera koje su potrebne za test na osnovu uzoraka koje treba analizirati. Populacija respondera je zasejana na 2.0 x 10<5>ćelija/bunariću u ploči sa U dnom sa 96 bunarića. Svi uslovi moraju biti izvedeni u triplikatu. Ćelije su centrifugirane kao što je prethodno opisano i resuspendovane su u koncentraciji od 4 x 106/ml u 10% medijumu AB seruma i dodato je 50 µl u odgovarajuće bunariće. Dodati 50 µl 10% medijuma AB seruma koji sadrži SEB antigen u koncentraciji od 40 ng/ml. U opisanim eksperimentima, SEB je dobiven od Sigma Aldrich (kat# S0812). Finalna koncentracija u bunariću bila je na 10 ng/ml. Ćelije su inkubirane tokom 3 dana na 37°C i 5% CO2. U trećem danu, uklonjeno je 30 µl supernatanta za analizu proizvodnju IFN-γ. Dodati 25 µl od 1 mCi/ml rastvora tricijanog timidina u svaki bunarić i inkubirati tokom 8 h na 37°C i 5% CO2. Ćelije su prenete u mikro scintilacionu ploču sa 96 bunarića u skladu sa instrukcijama proizvođača. Brojanje je izvršeno korišćenjem mikro scintilacionog brojača prema instrukcijama proizvođača. Koncentracija IFN-γ je određena sa ELISA (eBioscience kat # 88-7316-88) korišćenjem protokola proizvođača.
[0160] Protokol: Analiza podataka. Izračunati prosečan broj u minuti (CPM) ili koncentraciju IFN-γ za svako od antitela na svim koncentracijama. Kriterijum prihvatanja je izveden kao što je prethodno opisano. Određivanje IC50vrednosti je izvedeno kao što je prethodno opisano. Individualna CPM brojanja i koncentracije IFN-γ u SEB testu sa titracijama doze vodećih kandidata.
Tabela 9: IC50vrednosti CPM i IFN-γ u SEB.
[0161] Zaključci: VISTA specifična antitela su pojačala proizvodnju citokina i proliferaciju na dozno zavisan način u SEB testu. IC50vrednosti u SEB studiji generalno su bile slične sa rezultatima iz serija razblaženja MLR.
PRIMER 10: TEST „EPITOPE BINNING“
[0162] Postupci: ProteOn XPR36 sistem (BioRad) je korišćen za sprovođenje postupka kojim se karakteriše vezivanje mAt za metu (eng. epitope binning). ProteOn GLC čipovi (BioRad, Cat#176-5011) su obloženi na skupa od 6 monoklonskih antitela (mAt-a) korišćenjem instrukcija proizvođača za hemiju kuplovanja amina (BioRad, cat #176-2410).
[0163] Kompetitivna mAt-a su prethodno inkubirana u višku (250 nM finalna koncentracija) sa humanim VISTA (25 nM finalna koncentracija) za 4 h na sobnoj temperaturi i 6 u vremenu su naneti na čip koji je obložen sa panelima obloženih mAt-a sa vremenom vezivanja od 4 minuta nakon čega sledi disocijacija od 5 minuta. Nakon svakog nanošenja, čipovi su regenerisani sa 100 mM fosforne kiseline.
[0164] Analiza podataka uključila je grupisanje svih sezograma po ligandu i primenom čarobnjaka za poravnanje, koji automatski sprovodi poravnanje X i Y ose, i uklanjanje artefakta. Zatim je na podatke primenjena Interspot korekcija.
[0165] mAt koja nisu u kompeticiji su definisana da imaju signal vezivanja isti ili > A1 signala (vezivanje samo za humani VISTA).
[0166] Kompetitivna mAt su definisana da imaju signal vezivanja << A1 signala (tj., vezivanje samo za humani VISTA).
[0167] Rezultati: U primeru senzograma prikazanom na Slici 23, VSTB85 antitelo je obloženo na Proteon SPR čipu i VISTA protein je prethodno inkubiran sa naznačenim kompetitorima je nanet na čip. VSTB50 je primer nekompetitivnog antitela, kao pozitivni odogovor je uočen kada je VISTA/VSTB50 kompleks pokrenut. GG8, VSTB49 i VSTB51 u kompleksu sa VISTA nije se vezao za VSTB85 obloženom na čipu i prema tome su klasifikovani kao u kompeticiji za isto mesto vezivanja na VISTA kao VSTB85.
4
Tabela 10:
4
PRIMER 11: ODREĐIVANJE AFINITETA PROTEONA
[0168] Antitela su uhvaćena na ProteOn čipovima korišćenjem anti-IgG Fc obloženih površina. Antitela su ispitana za vezivanje humanih i cinomolgus (cino) VISTA vanćelijskih domena (ECDs) u koncentracijama VISTA proteina opsega od 0.39 nM do 100 nM. Antigenima je dozvoljeno da se vežu/udruže sa čipovima koji su obloženi antitelima za 4 minuta nakon čega je vreme disocijacija praćeno tokom 30 minuta. Čipovi su regenerisani sa dva tretmana od 100 mM fosforne kiseline tokom 18 sekundi. Svi eksperimenti su izvedeni na 25°C i podaci su podešeni sa 1:1 Langmuir modelom vezivanja.
PRIMER 12: EFEKTI ANTI-VISTA TRETMANA U MODELU MB49 TUMORA BEŠIKE KOD MIŠA Postupci:
[0169] C57Bl/6 miševima su ubrizgane MB49 tumorske ćelije. Jednom kada su tumori uspostavljeni, započet je anti-VISTA tretman. Zatim je rast tumora praćen 3 puta/nedeljno. Miševi su eutanizovani, u skladu sa IACUC regulativom, kada su tumori dostigli 15 mm u bilo kojoj dimenziji.
[0170] Za svaki eksperiment, zamrznuta bočica sa MB49 ćelijama je otopljena i uzgajana u RPMI 1640 (+ L-Glut) sa 10% serumum i penicilin/streptomicin antibioticima. Nakon tri dana ćelije su sakupljene korišćenjem StemPro Accutase i resuspendovane u RPMI u koncentraciji od 5x10<6>ćelija/ml i 50 ml ubrizganih po mišu.
[0171] Ženski C57Bl/6 miševi, starosti 6-8 nedelja su kupljeni od National Cancer Institute. Po dolasku im je dozvoljeno da se aklimatizuju jedan dan pre nego što su im obrijali desne bokove i istetovirali njihove repove. Nakon toga, primili su injekciju tri do pet dana kasnije.
4
[0172] Injekcija tumora (Intradermalna): Miševima je intradermalno ubrizgano (i.d.) na njihovom desnom boku 50 µl MB49 ćelijske suspenzije (~250,000 ćelija).
[0173] Praćenje rasta tumora: Tumorski rast je meren korišćenjem elektronskih kalipera prvo preko najšire dimenzije (L) i drugo na uglu od 90° u odnosu na prvo merenje (W). Zapremina tumora je izvedena na sledeći način:
Zapremina
[0174] Smatralo se da su tumori uspostavljeni onda kada su dostigli ~5mm u prečniku (~60 mm3 zapremine). Jednom kada su uspostavljeni, tretman je započet. Rast tumora je meren tri puta nedeljno tokom trajanja tretmana i dok eksperiment nije prekinut.
[0175] Anti-VISTA Tretman: Himerizovano 13F3-mIgG2a monoklonsko antitelo je intraperitonealno ubrizgano u dozi od 10 mg/kg. Raspored injekcija bio je tri puta nedeljno u trajanju od četiri nedelje.
[0176] Eutanazija miševa: Prema IACUC zahtevima, životinje su eutanazirane onda kada su njihovi tumori dostigli 15mm u najdužoj dimenziji
[0177] Analiza efikasnosti: Zapremine tumora miševa su analizirane korišćenjem Excel-a za upravljanje podacima, i GraphPad Prism za grafički prikaz. Statistička analiza je sprovedena korišćenjem makroa za R statistički računarski softver.
[0178] Eksperimentalni dizajn je prikazan na Slici 24.
Rezultati:
[0179] Ch13F3-mIgG2a tretman kod ženskih miševa je doveo do potpunog odbacivanja tumora (CR) kod 70% životinja i parcijalne remisije (PR) kod 30% (n=7) (Tabela 13 i Slika 25B). Suprotno tome, svi miševi tretirani kontrolnim mIgG2a pokazali su progresivni rast tumora (6/6)(Slika 25A). Ovi podaci pokazuju da anti-VISTA tretman može imati dubok uticaj na rast tumora.
Tabela 11: Potpuna remisija (CR) u odnosu na parcijalnu remisiju (PR)
[0180] Humana VISTA sekvenca je prikazana na Slikama 26 i 27, prilagođena iz Wang et al., 2011, supra.
PRIMER 13: MAPIRANJE EPITOPA ANTI-VISTA ANTITELA KORIŠĆENJEM ISPITIVANJA RAZMENE VODONIK/DEUTERIJUM (H/D)
[0181] Da bi se identifikovali epitopi za VSTB50, 60, 95 i 112 na humani VISTA, izvedena je masena spektrometrija izmene vodonik/deuterijum (HDX-MS) korišćenjem odgovarajućeg Fat-a. Za H/D izmenu, postupci koji su korišćene da bi se analizirala Fat perturbacije bile su slične sa onim koje su prethodno (Hamuro et al., J. Biomol. Techniques 14:171-182, 2003; Horn et al., Biochemistry 45:8488-8498, 2006) sa nekim modifikacijama. Fat-a bili su pripremljeni sa IgGs sa digestijom papainom i hvatanjem Proteina A korišćenjem Pierce Fab kita za pripremu (Thermo Scientific, Cat# 44985) .
4
Sekvenca humanog VISTA proteina sadrži šest N-vezanih mesta glikozilacije. Da bi se poboljšala pokrivenost sekvence, protein je deglikozilovan sa PNGazom F. Deglikozilovani VISTA protein je inkubiran u deuterisanom vodenom rastvoru tokom unapred određenog vremena što je prethodno rezultiralo ugradnjom deutrijuma na izmenjivim atomima vodonika. Deuterisani VISTA protein je bio u kompleksu sa ili Fab od VSTB50, VSTB60, VSTB95 ili VSTB112 u 46 mL deuterijumovog oksida (D2O) na 4 °C tokom 30 sek, 2 min, 10 min i 60 min. Reakcija izmene je zaustavljena sa niskom pH i proteini su razgrađeni pepsinom. Nivoi deuterijuma u identifikovanim peptidima su praćeni sa masenim pomakom na LC- MS. Kao referentna kontrola, VISTA protein je slično obrađen osim toga što nije bio u kompleksu sa Fab molekulima. Za regioni koji su vezani za Fab se zaključilo da su ona mesta koja su relativno zaštićena od izmene i, prema tome, sadrže veću frakciju deuterijuma u odnosu na referentni VISTA protein. Oko 94% proteina bi se moglo mapirati specifičnim peptidima.
[0182] Rešenja HDX-MS mapa perturbacija VISTA sa VSTB50 / VSTB60, i VSTB95 / VSTB112 su prikazana na Slici 28 redom na vrhu i dnu. Idenifikovane su dve grupe epitopa. Anti-VISTA VSTB50 prepoznaje isti epitop kao VSTB60; VSTB95 veže se za drugi region epitopa kao što se VSTB112 veže na VISTA. Anti-VISTA VSTB50 i 60 imaju zajednički isti epitop koji sadrži segmente, 103NLTLLDSGL111 (SEQ ID NO:62), i 136VQTGKDAPSNC146(SEQ ID NO:63) (Slika 28 vrh). Izgleda da anti-VISTA VSTB95 i 112 ciljaju slične epitope, koji sadrže segmente27PVDKGHDVTF36(SEQ ID NO:75), i54RRPIRNLTFQDL65(SEQ ID NO:65) (Slika 28 dno). Postoje druga dva segmenta koja pokazuju slabu perturbaciju od VSTB95 i 112, uključujući 39-52 i 118-134. Međutim, nivoi smanjenja nisu tako jaki kao u prethodnim regionima (27-36 i 54-65) na diferencijalnoj mapi. Iako jedan peptid,100TMR102koji pokazuje jaku perturbaciju od strane VSTB95 i 112, se nalazi na drugoj strani VISTA površine, udaljen je od regiona epitopa, 27-36 i 54-65. Ova perturbacija može biti zbog alosteričnog efekta. Ovi HDX-MS rezultati obezbeđuju epitope na nivou peptida za anti-VISTA antitela. Nije bilo preklapajućih regiona epitopa za ove dve grupe epitopa. Ovi rezultati su u skladu sa prethodnim podacima kompetitivnog vezivanja po tome što oni nisu u međusobnoj kompeticiji.
PRIMER 14: ODREĐIVANJE STRUKTURE HUMANOG VISTA ECD:VSTB112 FAB KOMPLEKSA PROTEINSKOM KRISTALOGRAFIJOM
[0183] U nastojanju da se utvrdi struktura VISTA i da se razgraniče epitop i paratom koji definišu interakciju između VISTA vanćelijskog domena (ECD) i Fab fragmenta vodećeg antitela VSTB112, kompleks je kristalizovan i struktura je određena da bude na rezoluciji od 1.85 Å. Struktura ECD humanog VISTA u kompleksu sa Fab fragmentom antitela VSTB112 utvrđen je i u nastojanju kako da se odredi sama struktura VISTA ECD i da se definiše epitop/paratop za ovu interakciju. Struktura otkriva VISTA usvaja IgV navoj sa topologijom lanca koja je slična sa TCR Vα lancem. Pored kanonskog premošćavanja disulfidnim vezama B i F lanaca na zadnjim i prednjim površinama β-sendviča, struktura otkriva da ECD ima dve dodatne disulfidne veze, jedan vezuje CC’ petlju sa prednjom ravni i drugi između A’ i G’ lanaca. Iako su prisutni kristalni kontakti između VISTA molekula, oni su manji i nema dokaza za dimer VISTA ECDs zasnovano na strukturi. Pokazano je da VSTB112 epitop sadrži porcije VISTA BC, CC’, i FG petlji zajedno sa ostacima prednje beta ravni (C’CFG) najbliže tim petljama. Paratop je u velikoj meri usmeren prema interakcijama teškog lanca sa CDR L3 ostvarujući minimalni kontakt.
Definisanje epitopa/paratopa VISTA:VSTB112 interakcije
[0184] VSTB112 Fab zauzima oblast povriše 1024.3 Å2 nakon vezivanja VISTA ECD, sa zauzimanjem povšine teškog lanca koja čini 715.3 Å2 od ukupnog. Sedam vodoničnih veza i 4 interakcije mosta soli su obrazovane između VISTA i VSTB112 lakog lanca i 10 vodonika i 2 interakcije mosta soli između VISTA i VSTB112 teškog lanca. VSTB112 prepoznaje ostatke u prednjoj ravni lanaca C’, C, F, i G na
4
krajevima u blizini FG petlje kao i ostacima u BC, FG, i CC’ petljama (Slike 29 i 30). Interakcije sa CC’ petljom čine većinu kontakata sa Fab lakim lancem sa samo ostacima E125 i R127 u FG petlji koji čine dodatne interakcije lakog lanca. Ostaci 119 do 127 koji odgovaraju VISTA FG petlji čine 38% od ukupno 1034.8 Å2 oblasti površine zauzete nakon vezivanja VSTB112. Kao što se može primetiti, ova petlja je visoko polarna, sastoji se iz sledeće sekvence -IRHHHSEHR- (SEQ ID NO:76). Dodatno, W103 u VSTB112 CDR H3 se lepo pakuje u odnosu na okosnicu VISTA ostataka H122 i H123, i VISTA H121 čini kraj na interakciju sa aromatičnim prstenom F55 u CDR H2.
[0185] Poređenje regiona epitopa identifikovano kristalografijom i HDX je prikazano na Slici 31. PRIMER 15: AKTIVACIJA T ĆELIJA I MONOCITA SA ANTI-VISTA ANTITELIMA
[0186] Funkcionalni efekat anti-VISTA antitela je procenjen u dva in vitro testa, reakcijom pomešanih leukocita (MLR) i SEB (Staphylococcus enterotoksin B). Oba testa mere proliferaciju T ćelija i indukciju citokina kao njihova primarna očitavanja, ali ovi efekti su usled različitih mehanizama. U MLR, mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMCs) iz dva različita humana dono su inkubirane zajedno, i nepoklapanja u glavnom kompleksu tkvine podudarnosti (MHC) između T ćelija jednog donora i dendritičnih ćelija iz drugog donora dovode do proliferacije T ćelija i proizvodnje interferona (IFNγ). U testu SEB, PBMCs iz pojedinačnog donora su inkubirane sa bakterijskim superantigenom, koji direktno veže protein MHC klase II na površini antigen prezentujućih ćelija (APC) sa receptorom T-ćelija (TCR) na T ćelijama, uzrokujući aktivaciju T ćelija, proliferaciju, i lučenje citokina. U oba testa, VSTB112, koji je matični molekul VSTB174, pokazao je indukciju proliferacije T ćelija koja zavisi od doze i proizvodnju citokina, i bio je najpotentniji među kandidatima (Slike 21A-21D, Tabela 12).
Tabela 12. EC50 vrednosti za očitavanja testa MLR. VSTB112 (matični od VSTB174) bio je najpotentniji molekul.
Testovi aktivacije monocita
[0187] Podaci testa, prikazani u Tabeli 12, generisani su sa VSTB112, matičnim molekulom VSTB174. Da bi se bolje razumela aktivnost VSTB174, sprovedeni su testovi aktivacije monocita. Rezultati su pokazali da je inkubacija VSTB174 sa celim PBMCs indukovala pojačanu regulaciju markera aktivacije (CD80 i HLA-DR) na CD14+ monocitima, što ukazuje na efekat vezivanja antitela sa podsetom imunoh ćelija za koje je poznato da eksprimiraju visoke nivoe VISTA (Slika 32). Dalje pitanje je da li efekti na aktivaciju monocita u celim PBMC mogu biti olakšani sa bilo kojim antitelom koje veže VISTA i ima IgG1 Fc. Antitela VSTB103 i VSTB63 vežu se za VISTA sa visokim afinitetom (KD 6.36E-10 i 8.30E-10 redom) i za ćelije koje eksprimiraju VISTA protein, slično sa VSTB112 i VSTB111. VSTB103 je u istom delu za epitope kao VSTB112, dok VSTB63 je u različitom delu za epitope; nijedno antitelo nije omogućilo aktivaciju monocita. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da jedan mehanizam pomoću koga VSTB174 može ispoljiti svoj efekat na aktivaciju/proliferaciju T limfocita je preko aktivacije monocita koju omogućavaju NK ćelije.
Priprema medijuma
[0188] 500 ml of RPMI 1640 (Coming, 10-040-CV) je kombinovano sa 50 ml humanog AB seruma (Valley Biomedical, Inc, Lot # 3C0405), 5 ml Penicilin/Streptomicin (Lonza, 17-602E) 10,000 U/ml, 5 ml L-glutamina (100x) (Gibco, 25030-081) i 10 ml HEPES (1M) (Fisher BP299-100, Lot#-1). Medijum je skladišten ne duže od 14 dana na 4°C.
Dobijanje rastvorljivog VISTA i kontrolnih antitela
[0189] Antitela su razblažena do 2X željene koncentracije u 10% AB medijumu seruma: VSTB174: serija VSTB174.003
[0190] Dodato je 100 µl odgovarajućeg rastvora antitela u odgovarajuće bunariće ploče sa U dnom sa 96 bunarića (Falcon, 353077). Nakon dodavanja različitih populacija ćelija u 100 µl, finalna koncentracija svakog antitela bila je 1, 0.1 ili 0.01 g/ml. IgG1 kontrolno antitelo CNTO 3930 (Serija 6405, ENDO <0.1 EU/mg) je dodato u finalnoj koncentraciji od 1 µg/ml.
Izolovane su PBMC
[0191] Donori su bili bar 18 godina starosti, generalno zdravi i slučajno odabrani iz lokalne populacije.
[0192] Donorska krv je preneta iz epruvete za izolovanje u 50 ml konusnih.
[0193] 15 ml Fikol 1077 (SIGMA, 10771) je položeno pažljivo da se ne bi mešao sa krvlju. Ovo je bilo na 25 ml krvi.
[0194] Ćelije su centrifugirane na 1250g tokom 25 minuta na sobnoj temperaturi bez pauze.
[0195] Bele krvne ćelije su izolovane na međufazi Fikola i seruma i ćelije su razblažene u 40 ml Henkovog balansiranog rastvora soli (HBSS).
[0196] Ćelije su centrifugirane na 453g (1500 oum) tokom 10 minuta na 4 C.
[0197] Ćelije su resuspendovane u 50 mls HBSS i izbrojane su prenošenjem 5001 u odvojenu ependorf epruvetu.
[0198] Dodatno, Pan Monocitni kit za izolaciju od Miltenyi je korišćen u skladu sa uputstvima proizvođača (kat# 130-096-537) da bi se izolovane CD14+ ćelije sa negativnom selekcijom u nekoliko grupa koje primaju tretman.
Postavka In vitro kulture
[0199] Odgovarajući broj potrebnih ćelija je određen za test koji je zasnovan na broju uzoraka za analizu. Populacija koja reaguje je zasejana na 2.0x10<5>ćelija/bunariću na ploču sa 96-bunarića U-dna. Za CD14 negativno selektovanu populaciju, zasejano je 0.5x10<5>ćelija. Svi uslovi su izvedeni u triplikatu.
1
[0200] Ćelije su centrifugirane kao što je gore opisano i resuspendovane su u koncentraciji od 2x10 /ml 6
za punu PBMC populaciju i 0.5x10 /ml za CD14 negativno selektovanu populaciju u 10% AB serumskom medijumu i dodato je 100 l antitela koje se ispituje u odgovarajućim bunarićima dovodeći ukupnu zapreminu u svakom bunariću do 200 l.
[0201] Ćelije su inkubirane tokom 1, 2, ili 3 dana na 37° C i 5% CO2.
[0202] Bojenje antitelom i protočna citometrija
[0203] Ploča sa U dnom sa 96 bunarića je centrifugirana u trajanju od 5 minuta na 453g i supernatant je uklonjen.
[0204] Ćelije su isprane sa 200 µl PBS i centrifugirane kao u koraku 5.5.1.
[0205] Supernatant je odliven i and resuspendovan u 50 µl PBS-a koji sadrži antitela u nastavku:
● CD14-APC (klon HCD14) 1:250 (Biolegend kat #325608)
● HLA-DR-PE Cy7 (klon L243) 1:250 (Biolegend kat # 307616)
● CD80-PE (klon 2D10) 1:250 (Biolegend kat # 305208)
● Hu FcR inhibitor vezivanja (eBioscience kat # 14-9161-73)
[0206] Inkubiran je u trajanju od 20 minuta na vlažnom ledu u mraku.
[0207] 150 µl PBS je dodato i centrifugirano kao u koraku 5.5.1.
[0208] 150 l PBS pufera je dodato i sprovedena je analiza FACS.
[0209] Uzorci su naneti na Miltenyi MACSQuant 10-parametarski protočni citometar i analizirani su korišćenjem FlowJo 9.7.5 za ekspresiju HLA-DR and CD80 na populaciji CD14+. Geometrijska srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI), statistika koja definiše centralnu tendeciju skupa brojeva, je korišćena kao definišuća statistika za poređenje tretmana.
Statistička analiza
[0210] Svi statistički testvoi su izvedeni u Prism GraphPad, verziji 6. Poređenja u parovima između grupa su napravljena u svakoj od vremenskih tačaka korišćenjem jednosmerne ANOVA sa Tukey korekcijom za višestrukost. P-vrednosti manje od 0.05 za sve testove i poređenja su smatrane značajnim. Za sve grafike i tabele,<∗>p<0.05,<∗∗>p<0.01,<∗∗∗>p<0.001,<∗∗∗∗>p<0.0001.
PRIMER 16: ADCC I ADCP AKTIVNOSTI ANTI-VISTA ANTITELA
[0211] VSTB174 ima IgG1 Fc, koji može dati aktivnost citotoksičnosti posredovanu ćelijama koja zavisi od antitela (ADCC) i fagocitozu posredovanu ćelijama koja zavisi od antitela (ADCP). Oba tipa testa su sprovedena i pokazano je da bi VSTB174 mogao lizirati ili fagocitovati K562-VISTA ćelije (Slike 33-34), ali ne parentalne ćelije ćelijske linije K562 mijeloma (podaci nisu prikazani). Dodatni mehanizam delovanja VSTB174 za modulaciju inhibitornog dejstva VISTA može biti liza ili gutanje ćelija koje eksprimiraju visoke nivoe VISTA, time ih uklanjajući iz lokalnog mikrookruženja.
PRIMER 17: ADCP AKTIVNOSTI DODATNIH ANTI-VISTA ANTITELA
2
[0212] Test in vitro fagocitoza je korišćen za isptivanje pojačanja fagocitoze koja je posredovana makrofagima ćelija koje ektopično eksprimiraju VISTA od strane anti-humanih VISTA mAt-a (VSTB173 i VSTB174). Ova mAt-a su klonirana u različite Fc okosnice (IgG1 WT (divlji tip), IgG1 PR (otporan na proteazu), i IgG2σ) i pretpostavljeno je da potencijalno imaju različite aktivnosti u odnosu na pojačanje fagocitoze. Okosnice IgG1 i IgG1 PR su sposobne da se vežu za Fc receptore i imaju potencijal da uzrokuju ADCP, dok IgG2σ se ne vezuje za Fc receptore i ne treba da posreduje ADCP.
[0213] Anti-VISTA antitela su ispitana u ADCP testovima sa K562 parentalnum i K562-VISTA ciljnim ćelijama. Kao što je prikazano na slikama 35-36, VSTB174, VSTB149, VSTB173 i VSTB145 pojačali su hMac fagocitozu K562-VISTA ćelija. VISTA antitela VSTB140 ili VSTB132, sa IgG2σ Fc koja se nisu vezala za Fc receptore, nisu pojačala fagocitozu kao što je očekivano. VISTA mAt-a VSTB174 i VSTB173 sa IgG1 Fc pokazala su izraženiju fagocitozu u odnosu na VSTB149 i VSTB145 sa IgG1PR Fc (videti Tabele 13 i 14 za EC50vrednosti).
Tabela 13. EC50vrednosti Anti-humana VISTA mAt.
Tabela 14. EC50vrednosti Anti-humana VISTA mAt.
[0214] VSTB174 i VSTB173 su pokazali slabo pojačanje fagocitoze K562 parentalnih ćelija na najvećoj koncentraciji (Slike 35-36), koja može biti zbog niže ekspresije VISTA od strane K562 ćelija. Druga anti-VISTA antitela nisu pojačala fagocitozu K562 ćelija.
[0215] Antitela negativne kontrole su svaka ispitana u dve različite koncentracije u K562-VISTA testu fagocitoze, ali nisu indukovala bilo koju fagocitozu. Ovaj rezultat ukazuje na to da je fagocitoza specifično posredovana sa anti-VISTA antitelima i zbog ekspresije VISTA antigena od strane K562-VISTA ćelija.
PRIMER 18: ADCC AKTIVNOSTI DODATNIH ANTI-VISTA ANTITELA
[0216] Da bi se ispitala njihova sposobnost za indukovanje ADCC, ispitana su sledeća tri humana anti-VISTA antitela:
VSTB174 (IgG1)
VSTB149 (IgG1 PR)
VSTB174.LF (IgG1 LF (niska fukoza)).
[0217] Svako antitelo je ispitano na šest različitih koncentracija u istoj ploči, u triplikatu u odnosu na dva odvojena eksperimenta za ukupno šest tačaka podataka.
Tabela 15. EC50vrednosti (µg/mL) tri ispitana anti-VISTA antitela kao što je određeno ADCC analizom.
[0218] VSTB174, VSTB149, i VSTB174.LF su svaki pokazali merljivu ADCC aktivnosti na 10, 1, 0.1 i 0.01 µg/mL, dok je samo LF antitelo pokazalo merljivu ADCC aktivnost na 0.001 µg/mL; nijedno od antitela nije pokazalo ADCC na 0.0001 µg/mL. Kao što svako od ovih antitela ima IgG1 ili IgG1 varijantu Fc, ovaj rezultat je očekivan. LF antitelo pokazalo je povećanu ADCC potenciju kao što je dokazano manjom EC50vrednosti za LF krivu antitela (0.002293 µg/mL) u poređenju sa regularnom krivom IgG1 antitela (0.02381 µg/mL). IgG1 PR kriva antitela imala je EC50vrednost sličnu sa krivom regularnog IgG1 (0.01846 µg/mL).
[0219] Humana IgG1, humana IgG1 PR i humana IgG1 LF antitela su sva pokazala merljivo ADCC posredovano ubijanje na koncentracijama 10, 1, 0.1 i 0.01 µg/mL antitela, dok je samo LF antitelo pokazalo ubijanje na koncentraciji antitela od 0.001 µg/mL. Nijedno od anti-VISTA antitela nije pokazalo ubijanje na koncentraciji antitela od 0.0001 µg/mL.
[0220] LF antitelo je pokazalo približno 10 puta potentnije ADCC ubijanjeu odnosu na ili regularno IgG1 antitelo ili IgG1 PR antitelo, kao što se može videti u EC50 vrednostima.
PRIMER 19: AFINITET VSTB174 ZA HUMANI I CINOMOLGUS VISTA
[0221] Afinitet VSTB174 za VISTA vanćelijski domen (eng. ECD) čoveka i cinomolgus majmuna određen je postupcima površinske plazmonske rezonance (SPR) na ProteOn instrumentu. VSTB174 ispoljio je veoma slične KD vrednosti za svaki protein, 1.56E-10 M za humani VISTA ECD i 8.66E-11 M za cinomolgus VISTA.
PRIMER 20: VISTA ANTITELA ISPOLJAVAJU EFIKASNOST U MODELIMA TUMORA KOD MIŠA
Mišji sojevi, reagensi i modeli tumora
[0222] Za in vivo studije, korišćeni su miševi sa izbačenim humanim VISTA (VISTA-KI) su povratno ukršteni sa C57Bl/6 pozadinom osnove.
[0223] Anti-humano VISTA antitelo je generisani da bi se omogućilo ispitivanje kod VISTA-KI miševa, korišćenjem VSTB174 varijabilnog regiona koji je prenet na mišji Fc IgG2a (VSTB123).
[0224] MB49 kancer bešike je ispitan kod VISTA KI miševa,
[0225] Pored objavljenih studija koje pokazuju da terapija anti-VISTA antitelom inhibira tumorski rast kod miševa divljeg tipa (Le Mercier et al., 2014), anti-tumorska efikasnost je pokazana sa surogatnim antitelima hrčka kod miševa divljeg tipa korišćenjem različitih doznih rasporeda, i u VISTA-KI miševima koji su tretirani sa VSTB123.
4
In Vivo studije efikasnosti u MB49 modelu tumora u VISTA-KI miševima
[0226] Studije MB49 efikasnosti su sprovedene kod ženki VISTA-KI miševa, ispitivanjem VSTB123 u nekoliko doza opsega od 1- 10 mg/kg. Miševima su intradermalno ubrizgane 250,000 MB49 ćelije tumora u danu 0. U danu 6, doziranje je započeto kao što je naznačeno na Slici 37 (ili 10 mg/kg kontrolnog izotipa mIgG2a, ili naznačenim dozama VSTB123; 10 miševa/grupi).
[0227] VSTB123 bio je efikasniji na većim u odnosu na nižim dozama, kao što je prikazano na Slici 37. Doze od 10 mg/kg i 7.5 mg/kg bile su ekvivalentne, dok su tumori rasli brže u miševima koji su dozirani sa 5 ili 1 mg/kg.
PRIMER 21: DETEKCIJA VISTA EKSPRESIJE U HUMANIM TUMORIMA SA ANTI-VISTA ANTITELIMA [0228] Slika 1 pokazuje VISTA ekspresiju od strane AML tumorske ćelijske linije tumora ovi i podaci o ekspresiji RNK sekv na Slici 17 podržavaju ideju da je VISTA eksprimiran od strane AML ćelija i anti-VISTA lek će biti efikasan kroz direktno ciljanje ovih ćelija za imunu modulaciju ili ubijanje posredovano antitelom.
[0229] Podaci da bi se ispitala ekspresija VISTA u kanceru pluća su dobijeni iz uzoraka tumora pluća iz hirurških resekcija. Ćelije su razdvojene i karakterisane su za ekspresiju VISTA i mnoge druge markere. Rezultati su pokazali da 13/13 tumora pluća (skvamozni ili adenokarcinomi) su sadržali CD14+ VISTA+ mijeloidne ćelije, (Slika 38).
PRIMER 22: DETEKCIJA EKSPRESIJE VISTA U TUMORIMA PLUĆA KORIŠĆENJEM ANTI-VISTA ANTITELA [0230] Imunohistohemijski test je razvijen upotrebom klona GG8, anti-humanog VISTA mišjeg IgG1. Ovo mAt je korišćeno da bi se ispitalo bojenje VISTA u FFPE presecima tumora nemalih ćelija kancera pluća (NSCLC).
[0231] FFPE preseci tumora su tretirani sa standardnim postupcima uzimanja antigena pre bojenja. GG8 mišje anti-humano VISTA antitelo je korišćeno u 1:500 razblaženju. GG8 vezivanje je detektovano korišćenjem zečjeg anti-mišjeg poliklonskog antitela, praćeno sa anti-zečijim polimerom HRP. Nakon toga sledi kontra bojenje sa hematoksilinom, nakon čega su bodovani preseci tumora.
[0232] VISTA ekspresija u kanceru pluća je uglavnom ograničena na imunski infiltrat (primer je predstavljen na Slici 39) i visoki nivoi VISTA pozitivnih ćelija su prisutni u mnogim uzorcima kancera pluća
PRIMER 23: STRUKTURA VANĆELIJSKOG DOMENA (VĆD) HUMANOG VISTA U KOMPLEKSU SA FAB FRAGMENTOM VSTB174
[0233] Varijante VISTA antigena su generisane i prečišćene kristalografski. Rekombinantni his-tagovani VSTB174 Fab je interno eksprimiran i prečišćen. Kristali su generisani i korišćeni su za sakupljanje podataka veće rezolucije VISTA ECD:VSTB174 Fab kompleksa korišćenjem sinhrotronskog zračenja i strukturalnog određivanja je rešeno korišćenjem kombinacija modelovanja homologije i analiza elektronske gustine (Slika 29(Vrh)).
[0234] Struktura VISTA ECD:VSTB174 Fab kompleksa rendgenskog kristalografijom do rezolucije od 1.85Å, obezbeđujući prvu strukturu VISTA ECD i razgraničenjem VSTB174 epitopa i paratopa. VISTA ECD usvaja IgV navoj sa topologijom koja je slična sa CTLA-4 ECD, ali sadrži sličan G’ lanac koji se proteže do prednje ravni β-sendviča. A’ i G’ su dalje vezani hemijski preko disulfidne veze koja je obrazovana između ostataka C12 u A’ lancu i C146 u G’ lancu. Pronađeno je da su šest cisteina angažovana u tri intramolekularne disulfidne veze, i, zasnovano na kontaktima kristala, ne postoji dokaz za dimerni VISTA.
[0235] VSTB174 prepoznaje ostatke u prednjim ravnima lanaca C’, C, F, i G na krajevima u blizini FG petlje kao i ostacima u BC, FG, i CC’ petljama.

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo ili njegov fragment antitela koji se veže za V-domen Ig supresora aktivacije T ćelije (VISTA), gde pomenuto antitelo ili njegov fragment antitela sadrži varijabilni polipeptid teškog lanca SEQ ID NO: 37 i varijabilni polipeptid lakog lanca SEQ ID NO: 44.
2. Antitelo ili fragment antitela prema zahtevu 1, koji dalje sadrži:
(a) humani konstantni region teškog lanca, koji je opciono humani konstantni region IgG1; i/ili
(b) humani konstantni region lakog lanca, koji je opciono humani konstantni region kapa lakog lanca.
3. Antitelo ili fragment antitela prema zahtevu 2, gde pomenuti humani konstantni region teškog lanca sadrži humani konstantni region teškog lanca IgG1 koji je modifikovan da poveća otpornost na proteazu antitela ili fragmenta antitela.
4. Antitelo ili fragment antitela prema zahtevu 1, koje sadrži bar jedan težak lanac i bar jedan laki lanac.
5. Antitelo ili fragment antitela prema zahtevu 1, koje sadrži:
(a) polipeptid teškog lanca SEQ ID NO: 60 ili 61; i
(b) polipeptid lakog lanca SEQ ID NO: 56.
6. Antitelo ili fragment antitela prema zahtevu 1, koje sadrži:
(a) polipeptid teškog lanca SEQ ID NO: 55 ili 59; i
(b) polipeptid lakog lanca SEQ ID NO: 56.
7. Antitelo ili fragment antitela prema zahtevu 1, koje je celo IgG antitelo, gde:
(i) polipeptid teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 55 i polipeptid lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 56; (VSTB112);
(ii) polipeptid teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 59 i polipeptid lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 56; (VSTB140);
(iii) polipeptid teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 60 i polipeptid lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 56; (VSTB149); ili
(iv) polipeptid teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 61 i polipeptid lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 56 (VSTB174).
8. Antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu je antitelo ili fragment antitela eksprimiran u ćeliji koja ima nedostatak enzima fukozilacije, opciono gde je ćelija ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO).
9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži terapeutski efikasnu količinu antitela ili fragmenta antitela prema bilo kom od zahteva 1-8 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
10. Nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1-8, opciono u ekspresionom vektoru.
11. Rekombinantna ćelija koja sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 10.
12. Postupak za ekspresiju antitela ili fragmenta antitela prema bilo kom od zahteva 1-8, koji obuhvata kultivisanje ćelije prema zahtevu 11 pod uslovima koji promovišu ekspresiju pomenutog antitela ili fragmenta antitela.
13. Antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1-8, za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu tretman sadrži davanje pomenutog antitela ili fragmenta antitela subjektu kome je to potrebno.
14. Antitelo ili fragment antitela za upotrebu prema zahtevu 13, pri čemu je pomenuti kancer leukemija, limfom, mijelodisplastični sindrom, mijelom, ili solidni tumor,
opciono gde je solidni tumor kancer bešike ili kancer pluća, opciono kancer nemalih ćelija pluća (NSCLC),
dalje opciono gde je solidni tumor okružen sa tumorskom stromom koja se sastoji iz mijeloidnih ćelija, T-ćelija, ili kombinacije mijeloidnih ćelija i T-ćelija ili je infiltriran sa mijeloidnim ćelijama, T ćelijama ili kombinacijom mijeloidnih ćelija i T-ćelija,
dalje opciono gde je pomenuta leukemija limfocitna leukemija, mijelogena leukemija, akutna limfoblastna leukemija (ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL), akutna mijeloidna (mijelogena) leukemija (AML), hronična mijelogena leukemija (CML), leukemija dlakaste ćelije, T-ćelijska prolimfocitna leukemija, velika granularna limfocitna leukemija, ili leukemija T-ćelija kod odraslih, i dalje opciono gde je subjektu dalje davana vakcina i/ili drugi tretman kancera.
RS20220562A 2013-12-24 2014-12-22 Anti-vista antitela i fragmenti RS63295B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361920695P 2013-12-24 2013-12-24
US201462085086P 2014-11-26 2014-11-26
EP20159500.6A EP3712174B1 (en) 2013-12-24 2014-12-22 Anti-vista antibodies and fragments

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63295B1 true RS63295B1 (sr) 2022-06-30

Family

ID=52444326

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220562A RS63295B1 (sr) 2013-12-24 2014-12-22 Anti-vista antitela i fragmenti

Country Status (34)

Country Link
US (3) US10273301B2 (sr)
EP (3) EP4043493A1 (sr)
JP (4) JP6590810B2 (sr)
KR (2) KR102534681B1 (sr)
CN (3) CN119775416A (sr)
AU (4) AU2014372309C1 (sr)
BR (1) BR112016014966B1 (sr)
CA (2) CA3190821A1 (sr)
CL (3) CL2016001646A1 (sr)
CY (1) CY1125398T1 (sr)
DK (2) DK3087098T3 (sr)
DO (1) DOP2016000153A (sr)
EA (1) EA201691323A1 (sr)
EC (1) ECSP16062894A (sr)
ES (1) ES2920677T3 (sr)
HR (1) HRP20220748T1 (sr)
IL (3) IL290972B2 (sr)
LT (1) LT3712174T (sr)
MX (2) MX369173B (sr)
MY (1) MY182431A (sr)
NI (1) NI201600090A (sr)
NZ (1) NZ721866A (sr)
PE (1) PE20170254A1 (sr)
PH (1) PH12016501244A1 (sr)
PL (1) PL3712174T3 (sr)
PT (1) PT3712174T (sr)
RS (1) RS63295B1 (sr)
SA (2) SA521430032B1 (sr)
SG (4) SG10201805933TA (sr)
SI (1) SI3712174T1 (sr)
SM (1) SMT202200233T1 (sr)
UA (1) UA125490C2 (sr)
UY (1) UY35961A (sr)
WO (1) WO2015097536A2 (sr)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
MX374075B (es) 2010-03-26 2025-03-05 Dartmouth College Proteina mediadora de celula t regulatoria vista, agentes de enlace de vista y uso de los mismos.
JP6285923B2 (ja) 2012-06-22 2018-02-28 トラスティーズ・オブ・ダートマス・カレッジ 新規ＶＩＳＴＡ−Ｉｇコンストラクト及び自己免疫、アレルギー性及び炎症性障害の処置のためのＶＩＳＴＡ−Ｉｇの使用
US9381244B2 (en) 2012-09-07 2016-07-05 King's College London VISTA modulators for diagnosis and treatment of cancer
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
WO2015097536A2 (en) * 2013-12-24 2015-07-02 Janssen Pharmaceutical Nv Anti-vista antibodies and fragments
US11123426B2 (en) 2014-06-11 2021-09-21 The Trustees Of Dartmouth College Use of vista agonists and antagonists to suppress or enhance humoral immunity
CA2969730A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Immunext, Inc. Identification of vsig8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/vsig8 modulators
SG11201708804WA (en) 2015-05-07 2017-11-29 Agenus Inc Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
CA2990360C (en) * 2015-06-24 2024-02-13 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-vista antibodies and fragments
CA2994241A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Hematopoietic stem cells in combinatorial therapy with immune checkpoint inhibitors against cancer
CN108883173B (zh) 2015-12-02 2022-09-06 阿吉纳斯公司 抗体和其使用方法
CN109069627A (zh) 2016-01-14 2018-12-21 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 对foxp3衍生肽特异性的t细胞受体样抗体
WO2017137830A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-vista (b7h5) antibodies
SG10201601719RA (en) 2016-03-04 2017-10-30 Agency Science Tech & Res Anti-LAG-3 Antibodies
KR20230119259A (ko) * 2016-04-15 2023-08-16 이뮤넥스트, 인크. 항-인간 vista 항체 및 이의 용도
WO2017181109A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Michael Molloy Anti-human vista antibodies and use thereof
SG10201603721TA (en) 2016-05-10 2017-12-28 Agency Science Tech & Res Anti-CTLA-4 Antibodies
EP3464360B1 (en) 2016-05-27 2025-11-12 Agenus Inc. Anti-tim-3 antibodies and methods of use thereof
RU2769282C2 (ru) 2016-06-20 2022-03-30 Кимаб Лимитед Анти-PD-L1 и IL-2 цитокины
EP4101447A1 (en) * 2016-06-30 2022-12-14 Nant Holdings IP, LLC Nant cancer vaccine
WO2018014001A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Multiple bi-specific binding domain constructs with different epitope binding to treat cancer
WO2018027042A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Bio-Techne Corporation Identification of vsig3/vista as a novel immune checkpoint and use thereof for immunotherapy
RU2721582C1 (ru) * 2016-08-05 2020-05-20 И-Байолоджикс Инк. Антитела против лиганда-1 запрограммированной смерти (PD-L1) и их применение
US11672771B2 (en) 2016-11-04 2023-06-13 Aximmune, Inc. Beta-alethine, immune modulators, and uses thereof
MA46770A (fr) 2016-11-09 2019-09-18 Agenus Inc Anticorps anti-ox40, anticorps anti-gitr, et leurs procédés d'utilisation
WO2018098352A2 (en) 2016-11-22 2018-05-31 Jun Oishi Targeting kras induced immune checkpoint expression
WO2018119142A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
KR20250159733A (ko) 2017-01-11 2025-11-11 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Psgl-1 길항제 및 그의 용도
PE20250933A1 (es) 2017-03-14 2025-04-02 Five Prime Therapeutics Inc Anticuerpos de union a vista a ph acido
US20200010528A1 (en) 2017-03-15 2020-01-09 Cue Biopharma, Inc. Methods for modulating an immune response
WO2018237287A1 (en) * 2017-06-22 2018-12-27 Apexigen, Inc. Anti-vista antibodies and methods of use
BR112020007755A2 (pt) * 2017-10-20 2020-10-20 Pharmabcine Inc. anticorpo anti-vista e uso do mesmo
MY206121A (en) 2017-11-03 2024-11-29 Aurigene Discovery Tech Ltd Dual inhibitors of tim-3 and pd-1 pathways
AU2018360389B2 (en) 2017-11-06 2024-09-19 Aurigene Oncology Limited Conjoint therapies for immunomodulation
US11787857B2 (en) 2018-02-02 2023-10-17 Bio-Techne Corporation Compounds that modulate the interaction of VISTA and VSIG3 and methods of making and using
CN118236374A (zh) 2018-03-14 2024-06-25 奥瑞基尼肿瘤有限公司 使用1,2,4-噁二唑化合物调节tigit和pd-1信号传导途径的方法
BR112020019083A2 (pt) 2018-03-21 2020-12-29 Five Prime Therapeutics, Inc. Anticorpos, ácido nucleico, composições, célula e métodos para preparar um anticorpo, para tratar câncer, para tratar uma doença infecciosa, para tratar uma inflamação, para a identificação de um anticorpo, para melhorar a eficácia antitumoral de um anticorpo, para melhorar a farmacocinética de um anticorpo, para selecionar um anticorpo, para melhorar a eficácia de anticorpos, para isolar anticorpos, para detectar vista em uma amostra e para tratar câncer
GB201814562D0 (en) 2018-09-07 2018-10-24 Hummingbird Bioscience Pte Ltd Vista antigen-binding molecules
WO2019185163A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Holdings Pte. Ltd. Vista antigen-binding molecules
US20190300610A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Vista antigen-binding molecules
CN108640972B (zh) * 2018-05-17 2021-07-30 中国药科大学 与vista具有亲和力的短肽及其用途
PE20210687A1 (es) 2018-07-11 2021-04-08 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos de union a vista a ph acido
CN112740043A (zh) 2018-07-20 2021-04-30 皮埃尔法布雷医药公司 Vista受体
JP2021534196A (ja) * 2018-08-23 2021-12-09 シージェン インコーポレイテッド 抗ｔｉｇｉｔ抗体
US10577424B1 (en) * 2019-08-15 2020-03-03 Beijing Mabworks Biotech Co., Ltd. Antibodies binding VISTA and uses thereof
CA3149719A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies binding to vista at acidic ph
IL294557A (en) 2020-01-07 2022-09-01 Univ Texas Improved human methylthioadenosine/adenosine depleting enzyme variants for cancer therapy
CN115362270A (zh) 2020-01-29 2022-11-18 得克萨斯州大学系统董事会 Egfr/her2酪氨酸激酶抑制剂和/或her2/her3抗体在具有nrg1融合的癌症的治疗中的用途
JP7777533B2 (ja) 2020-01-29 2025-11-28 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム Ｎｒｇ１融合体を有するがんの治療のためのポジオチニブの使用
DK4172199T3 (da) * 2020-06-26 2025-08-18 Bioarctic Ab Alfa-synuklein-protofibril-bindende antistoffer
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
US20240209094A1 (en) 2021-04-30 2024-06-27 Pierre Fabre Medicament New stable anti-vista antibody
CN119384293A (zh) 2021-09-16 2025-01-28 蜂鸟生物科技私人有限公司 使用vista抗原结合分子治疗和预防癌症
WO2023046979A1 (en) 2021-09-27 2023-03-30 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Treatment and prevention of cancer using vista antigen-binding molecules
WO2023056361A1 (en) 2021-09-29 2023-04-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-hsp70 antibodies and therapeutic uses thereof
CN119698431A (zh) 2022-05-02 2025-03-25 皮埃尔法布雷医药公司 新的抗vista抗体制剂
US20260098093A1 (en) 2022-09-22 2026-04-09 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Treatment and prevention of cancer using vista antigen-binding molecules
WO2024121380A1 (en) 2022-12-08 2024-06-13 Pierre Fabre Medicament Vaccinal composition and adjuvant
US20240190965A1 (en) * 2022-12-09 2024-06-13 Vanderbilt University Targeting anti-human pd 1h/vista to treat hematologic disorders
CN118515760B (zh) * 2023-07-28 2024-11-12 北京亦庄国际蛋白药物技术有限公司 抗vista的抗体或其抗原结合片段及其用途
EP4560319A1 (en) 2023-11-24 2025-05-28 Pierre Fabre Medicament Immune and tumour cells expression of vista in a panel of cancer indications
WO2025125495A1 (en) 2023-12-13 2025-06-19 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Treatment and prevention of cancer using vista antigen-binding molecules
CN119306839B (zh) * 2024-12-03 2025-10-14 重庆市畜牧科学院 一种抗vista全人源单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (301)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3854480A (en) 1969-04-01 1974-12-17 Alza Corp Drug-delivery system
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
NO812612L (no) 1980-08-06 1982-02-08 Ferring Pharma Ltd Enzym-inhibitorer.
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4517288A (en) 1981-01-23 1985-05-14 American Hospital Supply Corp. Solid phase system for ligand assay
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4452775A (en) 1982-12-03 1984-06-05 Syntex (U.S.A.) Inc. Cholesterol matrix delivery system for sustained release of macromolecules
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US5288641A (en) 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
DE229046T1 (de) 1985-03-30 1987-12-17 Marc Genf/Geneve Ballivet Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3689123T2 (de) 1985-11-01 1994-03-03 Xoma Corp Modulare einheit von antikörpergenen, daraus hergestellte antikörper und verwendung.
CA1291031C (en) 1985-12-23 1991-10-22 Nikolaas C.J. De Jaeger Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
DE122007000007I2 (de) 1986-04-09 2010-12-30 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
ATE114723T1 (de) 1987-03-02 1994-12-15 Enzon Lab Inc Organismus als träger für ''single chain antibody domain (scad)''.
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
ATE243754T1 (de) 1987-05-21 2003-07-15 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
CA1341235C (en) 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
EP0396612B1 (en) 1988-01-11 1996-07-24 Xoma Corporation Novel plasmid vector with pectate lyase signal sequence
US5039660A (en) 1988-03-02 1991-08-13 Endocon, Inc. Partially fused peptide pellet
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US4987893A (en) 1988-10-12 1991-01-29 Rochal Industries, Inc. Conformable bandage and coating material
WO1990006952A1 (fr) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Facteur de stimulation de colonies de granulocytes modifies chimiquement
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
AU652539B2 (en) 1989-05-16 1994-09-01 Medical Research Council Co-expression of heteromeric receptors
US5763266A (en) 1989-06-15 1998-06-09 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietics cells
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
DE3923279A1 (de) 1989-07-14 1990-01-18 Will W Prof Dr Minuth Minusheets ist ein neues produkt, um zellen in beliebigen behaeltnissen in hochdifferenzierter form auf einer moeglichst natuerlichen unterlage zu kultivieren
AU638762B2 (en) 1989-10-05 1993-07-08 Optein Inc Cell-free synthesis and isolation of novel genes and polypeptides
EP0945515A3 (en) 1989-11-06 2002-08-21 Cell Genesys, Inc. Production of proteins using homologous recombination
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US6641809B1 (en) 1990-03-26 2003-11-04 Bristol-Myers Squibb Company Method of regulating cellular processes mediated by B7 and CD28
TW212184B (sr) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
DK0600866T3 (da) 1990-06-01 1998-03-09 Chiron Corp Præparater og fremgangsmåder til identifikation af biologisk aktive molekyler
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
WO1992000373A1 (en) 1990-06-29 1992-01-09 Biosource Genetics Corporation Melanin production by transformed microorganisms
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
WO1992008802A1 (en) 1990-10-29 1992-05-29 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
JPH06508022A (ja) 1991-02-21 1994-09-14 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 生体分子に特異的なアプタマーおよび生産方法
US5747469A (en) 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
SG47766A1 (en) 1991-03-12 1998-04-17 Biogen Inc CD2-binding domain of lymphocyte function associated antigen 3
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
EP0571613B1 (en) 1991-12-13 2003-09-17 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
WO1994008038A1 (en) 1992-10-02 1994-04-14 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
WO1994010300A1 (en) 1992-10-30 1994-05-11 The General Hospital Corporation Interaction trap system for isolating novel proteins
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
GB9302660D0 (en) 1993-02-10 1993-03-24 Sihra Kirpal S A building system
EP0614989A1 (en) 1993-02-17 1994-09-14 MorphoSys AG A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
AU6445894A (en) 1993-03-19 1994-10-11 Duke University Method of treatment of tumors with an antibody binding to tenascin
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
ATE293686T1 (de) 1993-06-04 2005-05-15 Us Navy Verfahren zur selektiven stimulierung der t- zellproliferation.
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
ATE247128T1 (de) 1993-09-03 2003-08-15 Isis Pharmaceuticals Inc Aminoderivatisierte nukleoside und oligonukleoside
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
SE9304060D0 (sv) 1993-12-06 1993-12-06 Bioinvent Int Ab Sätt att selektera specifika bakteriofager
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
AU692239B2 (en) 1994-03-07 1998-06-04 Medarex, Inc. Bispecific molecules having clinical utilities
DE69534530T2 (de) 1994-08-12 2006-07-06 Immunomedics, Inc. Für b-zell-lymphom und leukämiezellen spezifische immunkonjugate und humane antikörper
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5801155A (en) 1995-04-03 1998-09-01 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5985653A (en) 1995-06-07 1999-11-16 Aastrom Biosciences, Inc. Incubator apparatus for use in a system for maintaining and growing biological cells
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US6096532A (en) 1995-06-07 2000-08-01 Aastrom Biosciences, Inc. Processor apparatus for use in a system for maintaining and growing biological cells
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
GB9517779D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
GB9517780D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US6444806B1 (en) 1996-04-30 2002-09-03 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Conjugates and methods of forming conjugates of oligonucleotides and carbohydrates
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
DK0826695T3 (da) 1996-09-03 2002-04-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Tilintetgørelse af kontaminerende tumorceller i stamcelletransplantater med bispecifikke antistoffer
WO1998010090A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Gata-6 transcription factor: compositions and methods
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
ATE336240T1 (de) 1996-11-13 2006-09-15 Cold Spring Harbor Lab Therapeutische verwendung von stickstoffmonoxydinhibitoren
US6593372B2 (en) 1996-11-13 2003-07-15 Cold Spring Harbor Laboratory Therapeutic uses for nitric oxide inhibitors
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US20060084082A1 (en) 1997-03-07 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
WO1999026657A1 (en) 1997-11-25 1999-06-03 Musc Foundation For Research Development Inhibitors of nitric oxide synthase
US6982323B1 (en) 1997-12-23 2006-01-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins for diagnosis and treatment of diabetes
US6006758A (en) 1998-02-03 1999-12-28 University Of Maryland Method and device for the detection and removal of head lice
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
DK1100811T3 (da) 1998-07-28 2007-11-05 Univ California Nucleinsyrer, som koder for en G-protein-koblet receptor involveret i sensorisk transduktion
US6936697B2 (en) 1998-09-01 2005-08-30 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030096955A1 (en) 1998-09-01 2003-05-22 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
DK1133517T3 (da) 1998-11-24 2009-11-23 Bristol Myers Squibb Co Intranuklear målrettet transport af forbindelser ved hjælp af 70 kd varmeshock-protein
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
US6696686B1 (en) 1999-06-06 2004-02-24 Elgems Ltd. SPECT for breast cancer detection
CA2377513A1 (en) 1999-06-25 2001-01-04 Universitat Zurich Hetero-associating coiled-coil peptides
WO2001001137A1 (en) 1999-06-30 2001-01-04 Children's Medical Center Corporation Fusion protein and uses thereof
US7754855B1 (en) 1999-07-13 2010-07-13 Bolder Biotechnology, Inc. Immunoglobulin fusion proteins
PL354286A1 (en) 1999-08-23 2003-12-29 Dana-Farber Cancer Institutedana-Farber Cancer Institute Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor
EP1212422B1 (en) 1999-08-24 2007-02-21 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
US6395437B1 (en) 1999-10-29 2002-05-28 Advanced Micro Devices, Inc. Junction profiling using a scanning voltage micrograph
GEP20094625B (en) 2000-03-24 2009-03-10 Pharmacia Corp Amidino compound and salts thereof useful as nitric oxide synthase inhibitors
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
US6545170B2 (en) 2000-04-13 2003-04-08 Pharmacia Corporation 2-amino-5, 6 heptenoic acid derivatives useful as nitric oxide synthase inhibitors
US6559279B1 (en) 2000-09-08 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing peptide derivatized oligomeric compounds
EP1332209B1 (en) 2000-09-08 2009-11-11 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
EP1373501A2 (en) 2000-10-06 2004-01-02 Novartis AG Targeting molecules for adenoviral vectors
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
US6562576B2 (en) 2001-01-04 2003-05-13 Myriad Genetics, Inc. Yeast two-hybrid system and use thereof
US20050063948A1 (en) 2001-03-08 2005-03-24 Dickerson Erin B. Methods for targeting interleukin-12 to malignant endothelium
AU2002338265A1 (en) 2001-03-28 2002-10-15 Incyte Genomics, Inc. Molecules for disease detection and treatment
ITTV20010035A1 (it) 2001-03-30 2002-09-30 Bettio Group Srl Zanzariera con dispositivo di aggancio e sgancio rapido della barra maniglia
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
BRPI0209933B8 (pt) 2001-05-24 2021-05-25 Zymogenetics Inc proteína de fusão, e, molécula de ácido nucleico
US20030031671A1 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Sydney Welt Methods of treating colon cancer utilizing tumor-specific antibodies
TWI334439B (en) 2001-08-01 2010-12-11 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
PT1419179E (pt) 2001-08-10 2010-03-16 Univ Aberdeen Domínios de ligação de antigenes
US6797493B2 (en) 2001-10-01 2004-09-28 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
NZ553470A (en) 2002-03-15 2008-10-31 Schering Corp Methods of modulating CD200 receptors
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
EP1506302A4 (en) 2002-05-23 2006-02-08 Cognis Ip Man Gmbh CANDIDA TROPICALIS BLOCKED BY OXIDATION BETA NON REVERSIBLE
AU2003281200A1 (en) 2002-07-03 2004-01-23 Tasuku Honjo Immunopotentiating compositions
GB2392158B (en) 2002-08-21 2005-02-16 Proimmune Ltd Chimeric MHC protein and oligomer thereof
BRPI0315666B8 (pt) 2002-10-23 2021-05-25 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd dna de a34 e a33 do tipo 3, proteínas, seus anticorpos e métodos de tratamento usando os mesmos
MXPA05005051A (es) 2002-11-12 2006-03-10 Albert B Deisseroth Vacuna de vector adenoviral.
CN101899114A (zh) 2002-12-23 2010-12-01 惠氏公司 抗pd-1抗体及其用途
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
CA2531238C (en) 2003-07-04 2015-02-24 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for her2
WO2005019255A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
US20060134105A1 (en) 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
EP1711196A4 (en) 2003-12-05 2011-09-14 Bristol Myers Squibb Co INHIBITORS OF TYPE-2 VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR RECEPTORS
US20050256576A1 (en) 2004-05-13 2005-11-17 Moskowitz Nathan C Artificial expansile total lumbar and thoracic discs for posterior placement without supplemental instrumentation and its adaptation for anterior placement of artificial cervical, thoracic and lumbar discs
EP2194064A1 (en) 2004-05-13 2010-06-09 Eli Lilly &amp; Company FGF-21 fusion proteins
PT1781682E (pt) 2004-06-24 2013-05-14 Mayo Foundation B7-h5, um polipéptido coestimulante
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
US7807619B2 (en) 2004-11-01 2010-10-05 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modification of biomolecules
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
US8236304B2 (en) 2005-04-25 2012-08-07 Trustees Of Dartmouth College Use of PD-L3 proteins and PD-L3 specific antibodies or antibody fragments to regulate CD4+ and CD8+ T cell immunity
US8231872B2 (en) 2005-04-25 2012-07-31 The Trustees Of Dartmouth College Regulatory T cell mediator proteins and uses thereof
CA2611861C (en) 2005-06-08 2017-11-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for the treatment of persistent infections
US20070009880A1 (en) 2005-07-11 2007-01-11 Toledo Luis H Methods And Solutions For Storing Donor Organs
US7531164B2 (en) 2005-10-21 2009-05-12 Duke University Preventing bacterial or viral infectivity and composition containing infection preventing additive
US7655778B2 (en) 2006-02-28 2010-02-02 Curonix Co., Ltd. SISP-1, a novel p53 target gene and use thereof
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
CA2732574A1 (en) 2008-07-28 2010-02-04 Philip Tan Multi-specific binding proteins targeting b cell disorders
JP2012500855A (ja) 2008-08-25 2012-01-12 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−１アンタゴニストおよび感染性疾患を処置するための方法
CA2739454C (en) 2008-10-03 2018-05-01 Emory University Methods for the treatment of graft-versus-host disease
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
ES2722300T3 (es) 2009-12-10 2019-08-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen preferentemente al dominio extracelular 4 de CSF1R y su uso
WO2011090492A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Immunomedics, Inc. Novel class of monospecific and bispecific humanized antibodies that target the insulin-like growth factor type i receptor (igf-1r)
MX374075B (es) 2010-03-26 2025-03-05 Dartmouth College Proteina mediadora de celula t regulatoria vista, agentes de enlace de vista y uso de los mismos.
US20180237525A9 (en) 2010-03-26 2018-08-23 Randolph J. Noelle VISTA Agonist and Methods of Use
US10745467B2 (en) 2010-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders
US20150231215A1 (en) 2012-06-22 2015-08-20 Randolph J. Noelle VISTA Antagonist and Methods of Use
US20110243943A1 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Athena Discovery, Inc. Treatment using relaxin-fusion proteins with extended in vivo half-lives
JP5155355B2 (ja) 2010-04-07 2013-03-06 レノボ・シンガポール・プライベート・リミテッド 無線基地局の自律的な負荷調整が可能な無線端末装置
ES2813415T3 (es) 2011-08-10 2021-03-23 Lankenau Inst Medical Res Métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias
EP3202419A1 (en) 2012-06-06 2017-08-09 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Pvrig binding agents that modulate the hippo pathway and uses thereof
US9890215B2 (en) 2012-06-22 2018-02-13 King's College London Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
JP6285923B2 (ja) 2012-06-22 2018-02-28 トラスティーズ・オブ・ダートマス・カレッジ 新規ＶＩＳＴＡ−Ｉｇコンストラクト及び自己免疫、アレルギー性及び炎症性障害の処置のためのＶＩＳＴＡ−Ｉｇの使用
US9619256B1 (en) 2012-06-27 2017-04-11 EMC IP Holding Company LLC Multi site and multi tenancy
US9381244B2 (en) * 2012-09-07 2016-07-05 King's College London VISTA modulators for diagnosis and treatment of cancer
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
BR112015029395A2 (pt) 2013-05-24 2017-09-19 Medimmune Llc Anticorpos anti-b7-h5 e seus usos
SG11201509982UA (sr) 2013-06-06 2016-04-28 Igenica Biotherapeutics Inc
US11014987B2 (en) 2013-12-24 2021-05-25 Janssen Pharmaceutics Nv Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same
WO2015097536A2 (en) * 2013-12-24 2015-07-02 Janssen Pharmaceutical Nv Anti-vista antibodies and fragments
EP3094346B1 (en) 2014-01-14 2019-12-11 The Trustees Of Dartmouth College Vista antagonist and methods of use
SG11201608303QA (en) 2014-04-04 2016-11-29 Del Mar Pharmaceuticals Use of dianhydrogalactitol and analogs or derivatives thereof to treat non-small-cell carcinoma of the lung and ovarian cancer
US11123426B2 (en) 2014-06-11 2021-09-21 The Trustees Of Dartmouth College Use of vista agonists and antagonists to suppress or enhance humoral immunity
CA2969730A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Immunext, Inc. Identification of vsig8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/vsig8 modulators
CA2990360C (en) 2015-06-24 2024-02-13 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-vista antibodies and fragments
WO2017137830A1 (en) * 2016-02-12 2017-08-17 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-vista (b7h5) antibodies
WO2017181109A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Michael Molloy Anti-human vista antibodies and use thereof
KR20230119259A (ko) * 2016-04-15 2023-08-16 이뮤넥스트, 인크. 항-인간 vista 항체 및 이의 용도
WO2018027042A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Bio-Techne Corporation Identification of vsig3/vista as a novel immune checkpoint and use thereof for immunotherapy

Also Published As

Publication number Publication date
CN106661107B (zh) 2021-12-24
PH12016501244A1 (en) 2016-08-15
ECSP16062894A (es) 2017-01-31
SG10201912793RA (en) 2020-02-27
MX2016008193A (es) 2016-12-16
UY35961A (es) 2016-06-30
CN106661107A (zh) 2017-05-10
BR112016014966A2 (pt) 2017-09-19
US11242392B2 (en) 2022-02-08
NZ721866A (en) 2017-10-27
IL301714A (en) 2023-05-01
WO2015097536A3 (en) 2015-11-12
CN119775416A (zh) 2025-04-08
EP3087098A2 (en) 2016-11-02
AU2014372309C1 (en) 2017-12-14
CA2935378A1 (en) 2015-07-02
JP6924234B2 (ja) 2021-08-25
JP2017502667A (ja) 2017-01-26
IL290972B2 (en) 2023-10-01
PT3712174T (pt) 2022-05-27
PE20170254A1 (es) 2017-04-12
ES2920677T3 (es) 2022-08-08
SA521430032B1 (ar) 2025-05-06
IL290972A (en) 2022-05-01
AU2021215226A1 (en) 2021-09-02
CL2021000353A1 (es) 2021-08-27
SMT202200233T1 (it) 2022-07-21
CA3190821A1 (en) 2015-07-02
EA201691323A1 (ru) 2016-11-30
JP7559126B2 (ja) 2024-10-01
CN114163529A (zh) 2022-03-11
BR112016014966B1 (pt) 2024-03-05
EP3712174A1 (en) 2020-09-23
US12516122B2 (en) 2026-01-06
CA2935378C (en) 2023-04-18
MX369173B (es) 2019-10-30
AU2017228688B2 (en) 2019-08-22
JP2019214619A (ja) 2019-12-19
NZ760319A (en) 2024-04-26
CN114163529B (zh) 2024-12-13
CL2019002428A1 (es) 2020-02-07
NZ735662A (en) 2020-11-27
SG11201605200XA (en) 2016-07-28
AU2019213384A1 (en) 2019-08-29
NI201600090A (es) 2019-02-26
AU2014372309A1 (en) 2016-07-21
CL2016001646A1 (es) 2017-06-09
KR102534681B1 (ko) 2023-05-18
UA125490C2 (uk) 2022-04-13
IL290972B1 (en) 2023-06-01
NZ747770A (en) 2024-04-26
NZ760318A (en) 2024-04-26
IL246401B (en) 2022-04-01
MX2019012714A (es) 2019-12-05
KR102344991B1 (ko) 2021-12-28
SG10201805933TA (en) 2018-08-30
AU2019213384C1 (en) 2021-12-16
EP3087098B1 (en) 2020-04-08
SG10201912797XA (en) 2020-02-27
JP2021167359A (ja) 2021-10-21
AU2014372309B2 (en) 2017-07-06
DOP2016000153A (es) 2017-08-15
EP4043493A1 (en) 2022-08-17
US20170051061A1 (en) 2017-02-23
JP7256238B2 (ja) 2023-04-11
IL301714B1 (en) 2026-02-01
US10273301B2 (en) 2019-04-30
JP6590810B2 (ja) 2019-10-16
EP3712174B1 (en) 2022-03-16
DK3087098T3 (da) 2020-06-08
JP2023073449A (ja) 2023-05-25
EP3712174A9 (en) 2021-05-12
IL246401A0 (en) 2016-08-31
SI3712174T1 (sl) 2022-06-30
SA516371402B1 (ar) 2022-03-09
WO2015097536A2 (en) 2015-07-02
HRP20220748T1 (hr) 2022-09-02
CY1125398T1 (el) 2025-05-09
KR20160124086A (ko) 2016-10-26
PL3712174T3 (pl) 2022-07-04
DK3712174T3 (da) 2022-04-25
LT3712174T (lt) 2022-05-25
MY182431A (en) 2021-01-25
KR20210158435A (ko) 2021-12-30
US20220144954A1 (en) 2022-05-12
WO2015097536A8 (en) 2016-08-04
US20200017589A1 (en) 2020-01-16
AU2019213384B2 (en) 2021-08-26
AU2017228688A1 (en) 2017-10-05
AU2021215226B2 (en) 2025-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7256238B2 (ja) 抗ｖｉｓｔａ抗体および断片
TWI770455B (zh) 抗vista抗體及片段
HK40079362A (en) Anti-vista antibodies and fragments
HK40036877B (en) Anti-vista antibodies and fragments
HK40036877A (en) Anti-vista antibodies and fragments
EA043336B1 (ru) Анти-vista антитела и фрагменты антител, содержащие их композиции и их применение для стимуляции иммунитета и лечения рака
HK1227891B (en) Anti-vista antibodies and fragments
HK1227891A1 (en) Anti-vista antibodies and fragments
EA050681B1 (ru) Анти-vista антитела и фрагменты