JPH10504202A - 自原性置換身体部分の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 複数の異なる組織を含む自原性置換身体部分のインビボでの製造のためのマトリックス材料、方法、およびデバイスを開示する。ある実施態様において、置換身体部分は、骨格連結であり、そして新規の複数の異なる組織は骨および関節軟骨を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 自原性置換身体部分の製造関連出願に関して 本出願は、1994年６月３日に出願されたUSSN 08/253,398号の一部継続出願で あり、この開示は、参考として本明細書中に援用される。発明の分野 本発明は、哺乳動物の単一欠損部位における複数の異なる組織の修復および再 生のための材料および方法に関する。さらに詳細には、本発明は、インビボでの 自原性置換身体部分の製造のための材料および方法に関する。この自原性置換身 体部分は、靭帯、関節軟骨、および骨組織のような複数の異なる組織を含む哺乳 動物の骨格連結(skeletal joint)を包含する。発明の背景 骨格連結は、２種またはそれ以上の骨の可動性結合を提供する。滑膜性連結は 、自由運動を可能とする関節連結(articulating joint)を著しく発達させた形態 である。哺乳動物の後肢は、歩行に関連し、そして前肢は、運動の可転性を提供 するものであるので、四肢のたいていの連結は滑膜性型である。滑膜性連結には 種々の型がある。その分類は、それらが可能とする活動的な運動(active motion )の型 (一軸、二軸、多軸)に基づいている。これらは基本的な形態的特徴(ちょ うつがい、合釘、顆状物)に従ってさらに区別される。骨の末端が介在組織と連 続して見出される線維性連結および軟骨性連結と比較して、滑膜性連結における 骨の末端は、接触しているが、分離している。骨は、内部で結合しないので、滑 膜性連結の完全性は、その靭帯および包(capsule)(関節と外部で結合する)から 得られ、そしてある程度は周囲の筋肉から得られる。滑膜性連結では、隣接する 骨表面は関節軟骨または硝子軟骨で被覆され、そして関節腔(joint cavity)は、 周囲の血管化環境から関節を分離する線維性膜により囲まれている。包の内部表 面は、滑膜性層または粘性の潤滑性滑液の分泌に関わる細胞を含有する「膜」に より被覆されている。Gray，Anatomy of the Human Body、312；333-336頁(第13 版；C．C．Clemente，編、(1985))。 特定の滑膜性連結において、関節腔または滑膜腔(synovial cavity)は、線維 軟骨の半月により分割され得る。２つの骨と関連し、かつ単一の関節腔を含有す る滑膜性連結は、単関節と呼ばれる。２つの関節腔を形成する半月を含む関節は 、複関節(composite joint)と呼ばれる。複関節(compound joint)との用語は、 １つ以上の関節表面対が存在する関節について用いられる。 連結置換、特に関節連結置換は、整形外科において一般に行われる手法である 。しかし、置換連結のための理想的材料は、捕らえ所のない状態である。典型的 に、関節再構成は、骨欠損、関節軟骨および、加えて１つまたはそれ以上の連結 靭帯(joining ligament)の修復を必要とする。今日まで、生育可能(viable)な完 全機能性重量支持関節(fully-functional weight-bearing joint)を確実に生じ る関節内の関節軟骨および骨欠損の両方を容易に修復するための満足のいく臨床 的手段は、未だ存在しない。内因性関節組織の全てを置換する人工関節は、これ らの問題のいくつかを回避する。しかし、人工関節は、特に若くて、非常に活動 的な患者において、多くの十分に証明された制限を有する。さらに、ある場合に は、人工関節置換は可能ではなく、そして修復の選択物は骨軟骨性同種移植片(o steochondroallograft)材料に限定される。 関節連結骨の末端で見出される関節軟骨または硝子軟骨は、特殊化された組織 学的に異なる組織であり、そして圧縮力に対する負荷耐性の分配および関節機能 の一部分である平滑な滑走を担う。関節軟骨は、自己再生性をほとんど有してい ないか、または全く有していない。従って、もし関節軟骨が、引き剥がされるか または厚さがすり減らされるか、あるいはさもなくば時間、疾患または外傷の関 数として損傷を受けると、その下の骨表面を保護する能力は損なわれる。 骨格連結における他の型の軟骨は、線維軟骨および弾性軟骨を包含する。二次 軟骨性連結は、脊柱における脊椎を結合する線維性軟骨板により形成されている 。線維軟骨では、ムコ多糖網が隆起コラーゲン束とからみ合わされ、そして軟骨 細胞が硝子軟骨におけるよりも広範に分散される。弾性軟骨は、エラスチン線維 と 組織学的に同様であるコラーゲン線維を含有する。他の結合組織と同様に、軟骨 性組織の形成は、複雑な生化学的プロセスであり、このプロセスは、独自の生化 学的環境における細胞とコラーゲン線維との相互作用を包含する。 軟骨組織(関節軟骨を含む)は、他の結合組織と異なり、血管、神経、リンパ管 および基底膜を欠く。軟骨は、軟骨細胞からなる。この軟骨細胞は、水、コラー ゲン、プロテオグリカン、および非コラーゲン性タンパク質ならびに脂質からな る豊富な細胞外環境を合成する。コラーゲンは、プロテオグリカンを捕捉し、そ して引張力を組織に提供するのに役立つ。II型のコラーゲンは軟骨組織における 主要コラーゲンである。プロテオグリカンは、種々の多くのグリコサミノグリカ ン鎖、ケラチン硫酸、コンドロイチン硫酸および／またはデルマタン硫酸、なら びにタンパク質核(protein core)と共有結合したN-結合オリゴ糖およびO-結合オ リゴ糖からなる。硫酸化グリコサミングリカンは負に荷電しており、水中に引っ 張られる浸透膨圧(osmotic swelling pressure)を生じる。 対照的に、瘢痕組織において生ずる線維性軟骨性組織のような特定のコラーゲ ンは、例えば、ケロイドおよび瘢痕型組織の典型であり、すなわち、Ｉ型および II型のコラーゲンの毛管および豊富で不規則な分裂束からなる。 組織学的に、関節軟骨または硝子軟骨は、その形態および生化学の両方により 他の形態の軟骨とは区別され得る。形態的には、関節軟骨は、表面対中間対深層 「域」により特徴づけられる。これは、組織の表面から骨に近接する組織の基部 までの部分の特徴的なグラデーションを示す。表面域では、例えば、軟骨細胞は 平らにされ、そして正接配置コラーゲンおよびわずかなプロテオグリカンを含む 細胞外網に埋め込まれた表面に平行に置かれる。中間域では、軟骨細胞は、球状 であり、そしてプロテオグリカンおよび斜組織化コラーゲン線維に富む細胞外網 により囲まれている。骨に近い深層域では、コラーゲン線維は、垂直に配向して いる。ケラチン硫酸の豊富なプロテオグリカンは、軟骨表面からの距離が増すに 従って濃度が上昇する。関節軟骨の微細構造の詳細な記載については、例えば、 以下を参照のこと（AydelotteおよびKuettner、(1988)、Conn ．Tiss．Res. 18:2 05；Zanettiら、(1985)、J ．Cell Biol. 101：53；およびPooleら(1984)．J ．An at. 138：13。 生化学的には、関節コラーゲンは、II型およびIX型のコラーゲンの存在、なら びに十分特徴づけられたプロテオグリカンの存在、および軟骨内骨形成に関連す るX型コラーゲンの不在により同定され得る。 正常の関節軟骨では、上記細胞外網の合成と破壊との間に均衡が存在する。し かし、例えば、互いに接触する整然と並んでいない骨の間の摩擦によりくり返し 外傷を受けた組織において、あるいは関節軟骨の正味の欠損により特徴づけられ る関節疾患(例えば、変形性関節症)において、不均衡が合成と分解との間に生ず る。 ２つの型の欠損が、関節表面において認められる（すなわち、全層欠損(full- thickness defect)および表面欠損）。これらの欠損は、軟骨に与える物理的損 傷の程度のみでなく、各型の病巣(lesion)が誘起し得る修復応答性においても異 なる。 関節表面の全層欠損は、硝子軟骨、石灰化軟骨層、および血管と骨髄とを有す る肋軟骨下骨組織に対する損傷を包含する。全層欠損は、骨板が感覚神経末端を 含有するので、激しい痛みを生じ得る。このような欠損は、一般的に、重篤な外 傷から、および／または骨関節炎のような変性性関節疾患の末期段階の間に発生 する。全層欠損は、時折、出血および肋軟骨下骨(subchondral bone)からの修復 反応の誘導を導き得る。しかし、このような状況において、形成された修復組織 は、不十分な生体力学的性質しか有さない軟骨の血管化線維型であり、そして長 期間にわたって持続しない。 これに対して、関節軟骨組織における表面欠損は、軟骨組織自体に制限されて いる。このような欠損は、治癒せず、かつ修復反応のための性向を全く示さない ことで、周知である。表面欠損は、軟骨の表面において裂溝、はぎ取り(divots) 、または中裂として現れ得るか、またはこれらは、罹患組織において「カニ肉」 状の外観を有し得る。これらは、全層欠損においてみられるような出血血管（血 斑）を全く含有しない。表面欠損はよく知られた原因を有し得ない。しかし、こ れらは、しばしば軟骨性組織のすり減りを導く機械的障害(mechanical derangem ent)の結果である。このような機械的障害は、関節に対する外傷（例えば、引き 剥がされた半月組織の関節への置き換え、半月炎、靭帯剥離、関節の列不正また は骨折によるか、または遺伝病による関節の弛緩）より生じ得る。表面欠損はま た、変性性関節疾患の早期段階（例えば、骨関節炎）に特有である。軟骨組織は 、神経支配または血管化されていないので、表面欠損は治癒せず、かつしばしば 全層欠損へと変性する。 人工関節との置換は、近年、関節軟骨の喪失を包含する関節機能の重篤な変性 性について好まれる選択枝である。関節軟骨の再生および修復を包含する、関節 複合体の機能的再構成の手段は、無生物材料関節置換外科および変性性関節疾患 の処置に十分な極めて低い効果を有することが予期されている。 関節軟骨のように、関節内で相互作用する骨の連結を与える連結靭帯は、自己 再生性をほとんど有さないか、または全く有さない。靭帯は典型的に、白色線維 組織の実質的に平行な束からなる。これらは、しなやかで、かつ屈曲性であり、 実質的に完全な自由運動を可能とする。しかし、非伸張性であり、関節における 相互作用骨の過伸張を防ぐ。軟骨のように、靭帯組織は、実質的に血管を有して おらず、そして自己再生性をほとんど、または全く有さない。引き剥がされた、 または損傷を受けた靭帯組織の外科的修復は今日まで、自原性移植片の使用か、 または骨の関節端に外科的に取り付けられる合成材料の使用に制限されている。 同種靭帯は、典型的に機械的特性を欠く。これは、恐らく、これらの材料を生体 適合性にするために必要とされる処理に起因する。同様に、腱は、骨または軟骨 に筋線維を結合し、かつ白色結合組織の実質的に平行な線維状物から形成される ロープ状構造である。滑液包(synovial capsule)は、靭帯組織の薄層からなる。 これは、関節を包囲し、かつ潤滑性滑液中に関節を浴している。関節包の内部は 、滑液膜を規定する分枝結合組織小体を有し、かつ主に滑液をその腔内に分泌す る役割がある結合組織の薄膜で被覆されている。従って、この膜の完全性は、潤 滑性滑液の起源を維持するのに重要である。整形外科の領域におけるこれらの組 織の修復は、典型的に、実在組織の回復に制限される。 骨組織は、本明細書上記に記載される他の組織（軟骨組織を包含）とは有意に 異なる。具体的には、骨組織は、細胞、ならびに無機質化無機成分（主にヒドロ キシアパタイト結晶）および主にＩ型コラーゲンからなる有機成分からなる二相 性媒体の両方からなる血管組織である。グリコサミノグリカンは、２％未満のこ の有機成分と１％未満の二相性媒体自体、または骨組織自身を構成する。さらに 、軟骨組織と比較して、骨組織に存在するコラーゲンは、高度に組織化された平 行配置で存在する。 変性性、外傷性、またはガン性の病因由来のものであるかを問わず、骨欠損に は、再構成手術に対し、過剰な抗原投与がなされる。特に困難なのは、多組織複 合体(例えば、哺乳動物関節に生じるような)の１部分を含む骨格部の再構成また は修復である。 哺乳類の骨組織は、成長時および軟骨内骨形成を生じる細胞事象の発達カスケ ードを誘導し得る自然骨治癒時に恐らく活性となる１つまたはそれ以上のタンパ ク質性材料を含有することが公知である。発達カスケードは、間葉細胞の化学走 性、始原細胞から軟骨細胞および骨芽細胞への増殖、軟骨の分化、血管侵入、骨 形成、改造、ならびに最終的な骨髄分化からなる軟骨内骨分化に包含される。 軟骨内骨形成を生じる上記カスケードの事象を誘導し得る真の骨形成因子は、 今や同定され、単離され、そしてクローン化されている。これらのタンパク質( ジスルフィド結合二量体タンパク質として天然に生ずる)は、「骨形成」タンパ ク質、「骨誘導(osteoinductive)」タンパク質、および「骨形態発生」タンパク 質と当該分野では呼ばれている。これらの骨形成タンパク質は、天然発生的か、 または合成的に調製されるかに関わらず、基本的に移動性前駆細胞の付着、増殖 、および分化を可能とする基質と共に哺乳動物中に移植される場合、接近性前駆 細胞(accessible progenitor cell)の補充を誘導し得、かつこれらの増殖を刺激 し得、軟骨細胞および骨芽細胞への分化を誘導し得、そしてさらに中間軟骨の分 化、血管新生、骨形成、改造、および最終的な骨髄分化を誘導し得る。これらの タンパク質は、構造的に関連したタンパク質のTGFβスーパー遺伝子ファミリー のVgr-1/OP1タンパク質サブファミリーのメンバーと呼ばれている。メンバーは 、OP1(BMP-7)、OP2(BMP-8)、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、60A、DPP、Vgr-1 およびVglとして当該分野で記載されるタンパク質を包含する。例えば、米国特 許第5,011,691号；米国特許第5,266,683号、Ozkaynakら、(1990)EMBO J. 9：208 5-2093、Whartonら、(1991)PNAS 88：9214-9218)、(Ozkaynak(1992)J ．Biol．Ch em．267 ：25220-25227および米国特許第5,266,683号)；(Celesteら、(1990)PNAS 87： 9843-9847)；(Lyonsら、(1989)PNAS 86：4554-4558)を参照のこと。これらの開 示は、アミノ酸配列およびDNA配列、ならびにこれらのタンパク質の化学的性質 および物理的性質を記載している。(Wozncyら、(1988)Science 242；1528-1533) ；BMP 9(1993年1月７日に公開されたWO93/00432号)；DPP(Padgettら、(1987)Nat ure 325；81-84；およびVg-1(Weeks(1987)Cell 51：861-867)もまた参照のこと 。 本発明の目的は、哺乳動物における２種またはそれ以上の機能的および構造的 に関連するさらに異なる置換組織を含む、再生身体部分に適した生体吸収性マト リックスおよびデバイスを提供することである。他の目的は、人工デバイスに依 存することなく、哺乳動物における機械的および機能的に生育可能な骨格連結（ 特に関節連結または滑膜性連結、ならびに骨および真の硝子軟骨を含む他の身体 部分）の修復または完全な再構成のための組成物および方法を提供することであ る。他の目的は、骨および関節軟骨、靭帯、腱、滑液膜、および滑液包組織を含 む機械的および機能的に生育可能な連結を形成するために、哺乳動物関節連結に おける組織欠損の修復のための材料および方法を提供することである。本発明の 他の目的は、その中に無血管組織を含む骨格連結における機能性非無機質化組織 を回復させるための手段を提供することである。 発明の要旨 本発明に従って、方法およびデバイスは、複数の異なる組織を含む生自原性置 換部分の作製のために提供される。ある局面において、置換身体部分は、関節連 結または滑膜性連結を含む哺乳動物の骨格連結の１部分または全てを含む。本願 明細書中以下に記載のように、本発明の方法および組成物は、骨（および骨髄） 、関節軟骨、靭帯、腱、滑液包および滑液膜組織を含む骨格連結に関連する機械 的および機能的な生育可能組織を回復させるのに十分である。従って、本願発明 は、哺乳動物の骨格連結を規定する複数の異なる組織のうちの１種またはそれ以 上の置換のための方法および組成物を提供する。 従って、ある局面において、本発明は、複数の異なる組織を含む機械的および 構造的に機能性の哺乳動物置換身体部分を形成するための新規マトリックスを提 供する。このマトリックスは、置換身体部分の少なくとも２種の異なる組織に特 異的な完全な残留物、または置換身体部分の少なくとも２種の異なる組織に特徴 的な完全な残留物、および／または置換身体部分の少なくとも２種の異なる組織 に由来する完全な残留物を含む。本明細書中以下に提供される記載から認められ るように、このマトリックスは、４種またはそれ以上の異なる組織に特異的な残 留物を含み得る。このマトリックスは、生体適合性であり、かつ生体吸収性であ る。特に、病原および移植片拒絶を生じ得る抗原刺激をほとんど含まない。好ま しくは、このマトリックスは、同種身体部分または異種身体部分由来である。好 ましくは、哺乳動物のドナー（例えば、死体）由来である。身体部分は、残留細 胞代謝物が全く残らないように、脱水（例えば、エタノール抽出および凍結乾燥 により）により不活性にされ得るか、または「失活」され得る。しかし、内因性 成長因子の機能などは、内因性体液によるインサイチュでの再構成時に回復され 得る。現在抗原性成分および病原性成分が実質的に涸渇され、かつ現在生体適合 性である処置後の身体部分は、置換が考えられる身体部分を構成する複数の異な る組織に特異的な残留物を残している。これらの残留物は、置換される身体部分 の残留物を模倣する大きさおよび互いに対する構造関係を有する複数の異なる組 織の残留物を包含する。 本発明の方法およびデバイスにおいて有用性を有する、このように処理された マトリックスは、天然組織と比較して十分な機械的完全性を欠いており、そして それ自身のみでは、移植される場合、置換身体部分または組織の再生を誘導する のに十分でない。しかし、タンパク質がマトリックスの表面に配置されるかまた は吸着されるように、骨形成タンパク質をマトリックスの間隙に浸透させるか、 さもなくば注入することにより、本発明のデバイは形成され、そして機械的およ び機能的に生育可能な置換身体部分の再生がインサイチュで生ずるように、イン ビボで新組織の形成を誘導するに十分である。 １つの好ましい実施態様では、このデバイスは、被移植者(donee)に対して同 種または異種の哺乳動物ドナーから切り出された骨格連結の１部分または全てを 含む。本明細書において記載されるように処置されると、同種骨格連結または異 種骨格連結を含むデバイスは、(1)生体適合性である、すなわち非病原性および インビボでの移植片拒否反応を防ぐに十分に非抗原性であり、そして(2)インビ ボでの機能性生育可能自原性置換連結の形成を誘導するに十分であり、この形成 は、構造的および機械的に機能的な置換連結が生ずるようにお互いに正しい関係 で機能性骨、関節軟骨、靭帯および包組織を生成することを包含する。 他の実施態様では、本願発明は、複数の異なる組織を含む骨格滑膜性連結の１ 部分または全てをインビボで形成するためのテンプレートとして働き、かつモル フォゲンシグナルに応答して、滑液環境において存在する反応性細胞からの新し い関節軟骨組織を包含する新しい組織の形成を誘導するデバイスを提供する。こ の新しく形成された組織は、骨格連結において、元の組織の形状および機能を呈 する。 他の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、欠損身体部分を置換す るための方法を提供する：欠損身体部分を切り出す工程、および本発明のデバイ スを移植する工程。１つの実施態様において、この方法はまた、デバイスのくぼ み部分に血液供給と予め融合した筋肉弁を通すこと、または他の様式で提供する ことによるように、移植されたデバイスへの間葉細胞の供給を提供する工程とい う更なる工程を包含する。他の実施態様では、このデバイスは、欠損部位と異な るが、置換身体部分の生成を可能とする、個体の身体の位置に移植される。次い で、このようにして形成された自原性身体部分は、欠損部位にて移植され得る。 本願明細書中に提供される記載から認識されるように、他の局面では、本発明 は、その中に非無機質化組織および無血管組織を含む哺乳動物骨格連結における １種またはそれ以上の個々の組織の機能的および機械的回復のためのデバイスお よび方法を提供する。従って、１つの実施態様では、本発明は、機能性関節軟骨 、靭帯、滑液膜および滑液包組織に制限されることなく、これらを回復させるた めに十分な方法およびデバイスを提供する。本願明細書において記載される方法 およびデバイスは、例えば、関節における表面関節軟骨欠損を矯正する、引き剥 がされたかまたは弱体化された(compromised)靭帯および／または腱を置換する 、および滑液包または滑液膜組織における欠損を修復するために用いられ得る。 個々の骨格連結組織を修復するためのデバイスは、回復される型の骨格連結組 織に特異的な残留物または、それに由来する残留物を含有するマトリックス上に 配置される骨形成タンパク質を含む。この骨格連結組織は、軟骨、靭帯、腱、滑 液包、または滑液膜組織を包含するが、これらに限定されない。デバイスは固体 形態を取り得るか、またはそれは、ペーストまたはゲルの物理的性質を有し得る 。好ましくは、マトリックスは、同種組織または異種組織に由来し、そして本願 明細書中に記載されるように処理されて生体適合性失活化マトリックスを形成す る。 他の実施態様では、マトリックスは、合成および／または天然由来成分から新 規に処方され得る。このマトリックスは、(a)特定の組織に特異的な残留物また は特定の組織に特徴的な残留物、および(b)細胞に湿潤し、かつ所望の置換組織 の大きさを模倣する３次元構造を規定する一時的な足場を作製するのに十分な材 料の両方を含む。このような有用な材料は、本明細書中以下に記載する。適切な 組織特異的残留物は、失活化同種組織または異種組織から得られ得、そして本明 細書中に記載されるような構造材料と組み合わせて合成マトリックスを作製する 。他の実施態様では、このマトリックスは、失活化非無機質化組織を含む。ある 場合では、肋軟骨下骨上の関節軟骨の形成におけるように、浸潤細胞の付着を可 能とする３次元構造を規定する非無機質化マトリックス材料は、骨形成タンパク 質と共に、新しい組織の形成を誘導するに十分であり得る。 上記のように、好ましい実施態様において、本発明は、インビボで置換骨格連 結を形成させるためのテンプレートとして適切なデバイスを意図しており、一方 、当業者により認識されるように、本発明は、骨格連結以外の機能性置換身体部 分をインビボで形成するためのテンプレートとして適切なデバイスであって、複 数の異なる組織を含むデバイスを意図し、そしてその開示はそれらを可能にする 。 本発明の方法に従って用いられる場合、本発明のデバイスおよび／またはそれ らの適用から得られる組織は、好ましい移植材料の以下の基準を本質的に満たす ： １．これらは、その部位にて通常存在する機械的および機能的に生育可能な組 織の形成を生じる。これらの組織は、機能性身体部分を生じるように、適切な大 きさを有し、かつ正確な構造関係を有している。特に、多組織置換部分（意図さ れた使用の部位にてインサイチュでまたは隔たった部位で生成される）は、レシ ピエント部位において存在する条件に関わらず、近接組織と結合し、本質的にそ の形状を維持し、かつ異常吸収を避けながら、組み込まれる。Weilandら、(1983 )Clin ．Orthop. 174:87(1983)。 ２．このデバイスは、置換が意図されるどんな複雑な骨格または器官の形状で あっても、任意の欠損に正確に適合するよう正確に輪郭が作られ得、かつ形状化 され得る。 ３．このデバイスは、実際的に無制限の供給を有し、かつ得るのが比較的容易 である。 ４．このデバイスは、ドナー部位に最小限の罹患を有する。 さらに、本発明は、その中に存在する骨および関節軟骨の修復を包含する骨格 連結修復のための材料および方法を実施者に提供し、そしてそれは、当該分野の 方法およびデバイスを用いて生ずる問題を解決する。例えば、本願発明は、欠損 部位における線維軟骨よりむしろ真の(bona fide)硝子軟骨の形成を誘導し得る 。本願明細書に開示される材料および方法を用いて、機能性硝子軟骨が、欠損部 位における骨の関節表面上に形成し、そして、時間がたっても線維軟骨まで変性 しない。対照的に、軟骨欠損を修復する先行技術方法は、一般に最終的には欠損 部位に線維軟骨の発達を生じる。硝子軟骨とは異なり、線維軟骨は、関節連結を それらの完全な性能まで回復する生理学的能力を欠いている。従って、本発明の 材料が本発明の方法に従って使用される場合、実施者は、関節連結（特に表面関 節軟骨欠損）における軟骨欠損を実質的に機能的に回復させ、そして先行技術方 法に一般的にみられる線維軟骨の所望でない形成または「全層欠損」への変性を 実質的に避け得る。本発明はまた、先行技術方法、そしてある場合には、全関節 の人工デバイスとの既に保証された置換を用いて個々に容易に修復可能でない関 節の各組織を修復する手段を提供する。本発明はさらに、骨格連結において無血 管組織を修復し、そして連結部位(locus)に機械的および機能的に生育可能な置 換組織の形成を生じる同種置換材料の使用を可能とする。図面の簡単な説明 本明細書は、本発明を構成すると考えられる主題を詳細に記載し、そして具体 的に請求する請求の範囲で終結するが、本発明は、添付の図面と合わせて示され る以下の好適な実施態様からより良く理解される。ここで： 図１は、哺乳動物の膝関節の部分正面図であり、大腿骨顆上の関節軟骨、靭帯 、滑液膜、関節包を示すために十分な組織が取り除かれており、さらに、修復を 必要とする関節軟骨中の損傷領域を示す； 図２Ａ〜図２Ｄは、本発明の１つの実施態様における生育可能かつ機能的な上 腕関節の半関節(hemi-joint)を作製するために用いるエレメントを概略的に表し ている。図２Ａは凍結乾燥した同種移植片を表す；図２Ｂは、図２Ａの凍結乾燥 した同種移植片に適用する骨形成タンパク質を表す；図２Ｃは、凍結乾燥した同 種移植片の軸の内側に通す最年長皮筋(cutaneous maximus muscle)の筋肉弁を表 す；そして図２Ｄは、図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃのエレメントを組み合わせて できる生育可能かつ機能的な半関節を表す。図２Ｄは、本発明のデバイスの１つ の実施態様である； 図３Ａ〜図３Ｄは、実施例２(５週間)の半関節のうち試験した４つの同種移植 片を概略的に表したものである：そして 図４Ａ〜図４Ｄは実施例３(６ヶ月)の半関節のうち試験した４つの同種移植片 を概略的に表したものである。発明の詳細な説明 本発明により、複数の異なる組織の修復および再生のために、新規な材料およ び方法が提供され、これは、複数の異なる組織を含む生自原性置換部分の製造を 包含する。１つの実施態様において、置換身体部分は骨格連結、具体的には関節 連結であり、そして骨、軟骨、靭帯、腱、滑液包および滑液膜組織に特異的であ るか、または由来する残留物を含むが、これらに限定されない。 より具体的には、１つの局面において、本発明は、複数の組織を含む機能的な 哺乳動物の置換身体部分を形成するための、マトリックスまたは基質の表面に配 置される骨形成タンパク質を含むデバイスを提供する。本明細書中で使用される 用語「マトリックス」とは、浸潤細胞の付着、増殖、および分化のための溝を有 する構造を定義することが理解される。これは、置換される組織に特異的である 残留物および/または同じタイプの組織に由来する残留物を含有し、そして移植 される場合、所望の置換組織の形状と大きさと実質的に類似する形状と大きさと を有する。 本明細書で使用される用語「残留物」とは、所定の組織の構成物を意味する。 残留物は、所定の組織に対し特異性を有するかまたは所定の組織に特徴的であり 、そして所定の組織の生育できない構成物に由来し得る。これらの残留物(１種 または複数)を含有するマトリックスは、骨形成タンパク質と組み合わされ、そ して生理的条件下の組織の局部環境を模倣する環境中で哺乳動物に移植される場 合、特異的な機械的かつ機能的に生育可能な置換組織を十分に形成し得る。 用語「複数の異なる組織」とは、解剖学的に類似した位置に存在する、生化学 的または超微細構造的に区別可能な組織のような、生理学的に区別可能な組織を 意味する。節となる置換連結デバイスにおいて、例えば、マトリックスは、骨組 織、軟骨組織、靭帯組織、腱組織および滑液膜組織に特異的であるかまたは由来 する残留物を含有し得る。従って、本発明のマトリックスの重要な局面は、複数 の異なる組織の残留物を含有する単一構造であり、これは本明細書で定義される 骨形成タンパク質と組み合わされると、インビボで一定期間にわたって機械的か つ機能的に生育可能な身体部分の修復または再生の誘導に適する。 本明細書で使用される用語「骨」および「関節軟骨」は以下のものを意味する ：骨とは、ヒドロキシアパタイトの形態の沈着カルシウムおよびリン酸の組成物 、コラーゲン(主にI型コラーゲン)および骨芽細胞、骨細胞(osteocyte)および破 骨細胞のような骨細胞(bone cell)を主に含有する石灰化(無機質化)結合組織、 ならびに真正軟骨(true endochondral bone)の内部に形成される骨髄組織をいう 。軟骨とは、コラーゲン(主にII型コラーゲンと他の少数の型、例えばIX型およ びXI型)の原線維、種々のプロテオグリカン(例えば、コンドロイチン硫酸、ケラ タン硫酸、およびデルマタン硫酸プロテオグリカン)、他のタンパク質および水 を含む細胞外網中に埋め込まれた軟骨細胞を含むタイプの結合組織をいう。関節 軟骨とは、関節の骨の部分の節となる表面を覆い、そして骨と骨とが直接的に接 触しないように関節中で動き、それ故対向する骨の表面の磨耗および損傷を防ぐ 、無血管非無機質化組織である硝子軟骨または関節軟骨をいう。ほとんどの正常 で健康な関節軟骨は、「硝子軟骨」(すなわち特徴的な霜状のガラス様の外観を 有 する)と呼ばれる。生理的条件下で、関節軟骨組織は、下に存在する無機質化骨 表面である肋軟骨下骨(これは高度に血管化した小骨を含む)上に存在する。これ らの高度に血管化した小骨は、上層の軟骨には拡散可能な栄養を供給し得るが、 間充織幹細胞(mesenchymal cell)には栄養を供給し得ない。 「靭帯」とは、強固な(intracting)骨の前部末端に結合した、ロープ様構造の 白色線維状結合組織と、滑液包を規定する組織との両方を意味する。「滑液膜」 とは、滑膜腔の内部を裏打ちし、そして滑液分泌に関係する結合組織膜と定義さ れる。「腱」とは、筋肉を骨と連結させる結合組織構造と定義される。置換身体部分 本明細書で開示されるように、本発明は欠損身体部分を置換および修復するた めの方法および組成物を提供する。この方法は、欠損身体部分を外科的に切除す る工程、上記タイプのマトリックスを含むデバイスを切除部位に移植する工程、 および必要に応じて本明細書中以下で記載する切除部位に隣接する組織を外科的 に修復する工程を包含する。例えば、滑膜性連結置換については、滑液膜および 靭帯を含む関節包を修復し、生理的条件で起こるように関節構造を外科的に矯正 し、それにより滑膜腔であり、そして滑液に浸されている無血管環境を再生する ことが望ましい。縫合するか、あるいはそうでなければ移植したデバイスを、機 械的に一時的に周囲の組織に連結することもまた好ましい。 １つの実施態様において、デバイスは哺乳動物の骨格連結構造の一部または全 部を置換するよう構築され、そして骨、軟骨、靭帯、腱、滑液包および/または 滑液膜組織のうちの２つ以上を含む複数の異なる組織についての残留物を有する マトリックスを含む。 別の実施態様において、デバイスは、個々の無血管および/または非無機質化 組織を包含する哺乳動物の骨格連結の個々の組織を置換するよう構築される。本 明細書で示されるように、デバイスは、滑膜環境を含む局部環境中に存在する反 応性細胞からの関節軟骨を包含する機能的な置換組織形成を誘導でき、そして血 管形成した筋肉弁からの間充織細胞の細胞浸潤を必要としない。この実施態様の マトリックスは、置換される個々の組織と同じタイプの組織に特異的であるか、 または特徴的であるか、および/または由来する残留物を含有する。別の実施態 様において、マトリックスは失活化無機質化組織を含有する。好適な実施態様に おいて、置換組織は関節軟骨、靭帯、骨、腱または滑液包組織を包含し得る。 部分的または完全な関節置換において、方法を実施する際、移植されるデバイ スの中空部分に筋肉弁を通すさらなる工程を含めることが好ましいが、必ずしも 必要ではない。例えば、Khouri、米国特許第5,067,963号(この開示は本明細書中 で参考として援用され、かつ以下に記載される)に記載される方法を用いて、そ れ自体が骨形成タンパク質で前処理され得る筋肉弁を、失活化した骨の髄腔のよ うな移植したマトリックスの腔に外科的に導入し、血液供給を提供して血管化組 織の形態発生を促進し、そして間充織幹細胞の迅速な供給を提供し得る。 本発明のマトリックスは、骨形成タンパク質が各々の置換組織の形成を誘導す るのに十分な量で存在するマトリックスの表面に配置されたときに、移植可能な デバイスとしての有用性を有する。これにより、適切なサイズ、相互関係および 機能を有する複数の組織を含む身体部分を哺乳動物内で再生することが可能にな る。本発明において有用であることが意図される骨形成タンパク質は以下に記載 されるが、以前に、例えば米国特許第4,968,590号、同第5,258,499号および同第 5,266,683号(これらの開示は本明細書中で参考として援用する)に記載されてい る。例えば、骨形成タンパク質は、本明細書および/または当該分野で記載され る任意の公知の骨形態形成タンパク質および/またはその等価物であり得、そし て組織形態形成を誘導し得る、天然源の材料、組換え材料、およびそれ以外の方 法で生成された任意の材料を包含する。 本発明の方法および材料は、哺乳類の身体関節の修復および/または部分的ま たは完全な置換に特に有用であり、この関節は、関節連結（特に靭帯包(ligamen tous capsule)により取り囲まれ、かつ滑液に浸された関節）を包含するが、こ れらに限定されない。 いくつかの滑膜性連結では、運動は単軸性である。すなわち、すべての運動が １つの軸を中心として起こる：これらのうちには、運動の軸が骨の軸を横切る蝶 番関節(ginglymusまたはhinge joint)および軸が長軸方向である車軸(trochoid またはpivot)関節がある。２軸性関節の場合、運動は互いに直角または他の任意 の角度をなす２つの軸を中心とする。これらは、顆状関節、楕円関節、および鞍 関節を包含する。第３の型の滑膜性連結として、運動が多軸性である(すなわち 、無数の軸における運動が可能である)、球(spheroidalまたはball-and-socket) 関節が存在する。最後に、平面(planeまたはgliding-type)滑膜性連結が存在す る。 蝶番関節(hinge joint)において、関節の表面は、横断軸を含む１平面におい てのみ動作が可能となるように互いに対して成型されている。肘関節の屈曲部が その例である：他の例として、手と足の両方の指の指関節が挙げられる。車軸関 節においては、車軸関節中の運動もまた、１つの軸を中心にして起こるが、それ は長軸である。ヒトの身体には、近位側の橈骨尺骨節のような、数個の車軸関節 が存在する。顆状関節においては、運動は主に１つの平面で起こる。膝関節の脛 大腿節が例である。楕円関節において、運動は、互いに直角である２つの主要軸 を中心に起こる。これらの関節の例として、撓骨手根骨関節および中手指関節が 挙げられる。鞍関節において、近位側の骨の関節末端は一方の軸方向にくぼんで おり、そして直交する軸方向に凸状である。これらの表面は、遠位側の骨の表面 の凸凹に互いに適合する。鞍関節の最良の例は親指の手根中手骨関節である。球 (ball-and-socket)関節においては、遠位側の骨は１つの共通の中心を有する無 数の軸を中心として動作が可能である。この形態の関節の例は、臀部関節および 肩関節に見られる。平面(planeまたはgliding-type)関節は、一方の骨を他方の 骨に対して軽く滑らせるかまたはスライドさせることが可能である。上記の関節 とは異なり、表面間の動作の量は、関節を取り囲む靭帯または骨の突起(process e)により制限される。これは、ある種の脊椎動物の手根間関節および中足骨間骨 関節の関節突起間の接合に存在する形態である。 本発明は、哺乳動物の他の部位の骨および軟骨を含む欠損の修復に使用可能で あることが意図されるが、本発明の局面は、図１に説明される膝関節１０におけ る大腿骨の関節表面に関連して説明する。 図１は、大腿骨の下部１１および脛骨の上部１２の間の膝関節１０を図示する 。図面を明確にするため、大腿骨１１を下にある脛骨１２および腓骨１５と運動 可能に結びつける中間の、横に平行する靭帯部分１３および１４のみを図１に示 した。同様に関節包を外側の黒線２５により表し、滑膜腔の沿って広がり、そし て 潤滑性滑液を分泌する滑液膜を内側の黒線２６により表す。通常、大腿骨１１お よび脛骨１２の対向する表面の間に入るのは、横半月軟骨および中間半月軟骨（ １６および１７）および前部および後部十字靭帯(示さず)である。大腿骨１１の 下部末端の、凸曲線状の顆２０および２１は、それぞれ通常、半月軟骨１６およ び１７により脛骨１２の上部末端上に支えられる。通常、顆２０および２１を含 む大腿骨１１の下部末端は、関節軟骨２２と呼ばれる硝子軟骨物質の層２２によ り覆われる。関節軟骨２２は、一般的に、大腿骨１１の下部末端の表面に固定さ れる弾力のあるパッドを形成し、大腿骨１１を磨耗と機械的衝撃から防御する。 さらに、関節軟骨２２は、膝関節１０中の滑液により潤滑化される場合、膝関節 １０の関節運動(articulation)の際に、下の半月軟骨１６および１７の表面で( あるいは、半月軟骨１６または１７の１つまたは両方が部分的または全体的にな い場合、脛骨１２の上部表面で)、容易にスライド可能な表面を提供する。 関節軟骨の１部は外傷または疾患により損傷を受け得るか、または過剰に磨耗 し得る。図１は損傷を受けた領域２３の一例を示す。マトリックスの考察 当業者に明らかなように、提供されるマトリックスは、細胞を浸潤させるため の足場として作用するのに十分な３次元構造を有し、そして修復される組織と同 じタイプの組織に特異的であるか、または特徴的であるか、そして/または由来 する残留物を含有する。本明細書中で開示されるマトリックスに使用される基質 自体の正確な性質は、置換組織を修復し、そして再生するマトリックスの最終的 な能力に関しては決定的ではない。本発明において、基質は、骨形成タンパク質 により仲介されるある種の細胞事象が必然的に生じる足場としての役割を果たす 。骨形成タンパク質に対する特異的な応答は、最終的に移植部位の内因性微細環 境および反応性細胞の形態形成能力により決定される。これもまた当業者により 理解されるように、本明細書中に開示されるマトリックスに利用される基質の正 確な選択は、修復されるべき欠損のタイプ、欠損部位の血管形成の拡大のような 解剖学的考察などに一部左右される。 本発明のマトリックスは以下のようにして得られる。置換身体部分として使用 され、そして身体部分の形成に関連する少なくとも２つの異なる組織を含む置換 組織または置換身体部分は、死体または骨バンク(bone bank)などから提供され 、そしてエタノール処理などにより処理され、そして凍結乾燥により脱水される 。その結果、残存物質は非病原性であり、そして十分に非抗原性であり移植片拒 絶を防ぐ。上記のように処理された本発明のデバイスにおける有用性を有する物 質は、抽出組織の残留物またはそれが由来する組織をさらに含む。このように処 理された置換身体部分マトリックスは、大きさを決めて、残留物が修復されるべ き身体部分の構造的相互関係と類似する構造的相互関係を有するようにする。天然源のマトリックス 適切な同種または異種マトリックスは、当該分野で周知の方法を用いて本明細 書中以下に記載するように作製される。好ましくは、置換身体部分または組織は 、死体または組織バンクから新たに得られ、採取の際にその組織を凍結させる。 全ての場合、当業者に理解されるように、組織を即座に使用する場合でない限り 、いずれの組織も採取の際に凍結することが好ましい。使用の前に、組織は適切 な薬剤で処理して、組織の細胞非構造成分を抽出し、組織を失活化させる。この 薬剤はまた、組織に関連するすべての成長阻害成分を抽出し得るべきであり、そ してすべての病原体を抽出、そうでなければ破壊し得るべきである。得られる物 質は、細胞により浸潤され得る溝を規定し、そして実質的に非構造関連成分を含 まない非細胞(asellular)マトリックスである 現在の好ましい手順において、組織を固定するために当該分野で使用されるよ うな方法論に従って組織は失活化される。組織の水分を実質的にエタノールと置 換し、そして組織の細胞構造を破壊するのに十分な時間、100％(200標準(200 pr oof))エタノールのような非極性溶媒に組織を曝露する。典型的には、組織を約 ４℃〜40℃の範囲の温度で数日間、200標準エタノールに曝露する。この際、組 織の液体含有物が70％〜90％のエタノールを含有するまで、６時間〜12時間ごと に注意深く溶液を新しいエタノールと交換する。典型的には、３日〜４日間の処 理が適切である。添加する液体の量は組織を浸すのに十分な量より多くあるべき である。次いで、処理された組織を凍結乾燥する。得られた乾燥マトリックスは 、 実質的に非構造成分を含まないが、組織に由来する細胞外および細胞内マトリッ クス成分の両方は保持する。 骨のような無機質化組織を包含する組織を抽出し、そしてこれらの組織を同種 または異種移植片として生体適合性にするために、当該分野において多くの他の 方法が記載されている。例えば、Sampathら、(1983)PNAS 80:6591-6595、米国特 許第5,011,691号および米国特許第4,975,526号および同第5,171,574号を参照の こと。これらの刊行物には、４M グアニジン-HCl、50mM Tris-HCl、pH7.0を４℃ で16時間用いる抽出、および脱グリコシル化剤およびコラーゲン線維改変剤（こ れはフッ化水素、トリフルオロ酢酸(trifluorocetic acid)、ジクロロメタン、 アセトニトリル、イソプロパノール、加熱酸性水溶液、およびこれらの試薬の種 々の組み合わせを包含する）を用いる抽出が記載されている。これらの特許の開 示は、本明細書中で参考として援用する。そこに記載され、そして以下に記載さ れるように、マトリックスが線維改変剤で処理される場合、処理されたマトリッ クスは、以下に記載される手順に従って、洗浄し、すべての抽出された成分を除 去し得る。 １．マトリックス調製物をTBS(Tris緩衝化生理食塩水)中に懸濁させ(１ｇ/200 ml)、そして４℃で２時間撹拌する：あるいは、６M 尿素、50mM Tris-HCl、500m M NaCl、pH7.0(UTBS)または水中に懸濁させ、そして室温(RT)で30分間(pHを中和 させるのに十分な時間)撹拌する； ２．遠心分離および繰り返し洗浄する工程；および ３．遠心分離：上清を捨てる；残留物を水で洗浄する；次いで凍結乾燥する。 処理した同種または異種マトリックスは、複数の異なる組織を含む置換身体部 分を形成するためのデバイス、および靭帯、関節軟骨組織のような個々の関節組 織を置換するためのデバイスを作製するための特別な有用性を有することが予想 される。例えば、置換靭帯デバイスは、同種靭帯マトリックスおよび骨形成タン パク質から形成され得、そして自原性靭帯置換のための標準的な手術手順に従っ て骨格連結位置に移植される。同様に、同種関節軟骨デバイスは、失活化軟骨組 織または他の不活性非無機質化マトリックス物質および骨形成タンパク質から形 成され得、そしてこのデバイスはシートとして肋軟骨下表面に配置される。ある いは、処方されたデバイスを粉末化するか、そうでなければ機械的に研磨して、 骨表面への適用のために本明細書中で記載されるようにペーストまたはゲルに処 方され得る粒子を生成する。合成マトリックス 天然源のマトリックスの代用物として、あるいは天然源のマトリックスと組み 合わせて使用される補充物として、以下のものを用いて適切なマトリックスがま た処方され得る；(1)修復される組織と同じタイプの組織に由来する、そして/ま たは特徴的な、あるいは特異的な残留物、および(2)所望の置換組織の大きさに 合うように形成または成型され得る３次元足場構造を作製する役割を果たす１つ 以上の物質。肋軟骨下表面上で関節軟骨を形成する場合のようないくつかの状況 においては、３次元足場構造を規定して浸潤細胞の付着を可能にし、そして非無 機質化物質から構成されるマトリックスと組合わせた骨形成タンパク質で十分で あり得る。コラーゲン：グリコール酸、乳酸、および酪酸(これらの誘導体を包 含する)のホモポリマーまたはコポリマー：およびヒドロキアパタイト、リン酸 三カルシウム、および他のリン酸カルシウムのようなセラミックおよびそれらの 組み合わせを包含する、任意の１種の物質あるいは任意の物質の組み合わせが有 利に用いられ得る。 合成マトリックスの組織特異的成分は、上記のように同種または異種組織を失 活化させ、次いで残った不溶性マトリックスを粉末化(pulerizing)するか、そう でなければ機械的に破壊することにより容易に得ることができる。次いで、この 微細な物質を、本明細書で記載する物質を包含する１つ以上の構造物質と合わせ 得る。あるいは、当該分野で良く特徴付けされた標準的な抽出手順、および各精 製工程で抽出された物質の組織特異性能力について試験し得る標準的な分析手順 を用いて、組織特異的成分を、処理したマトリックスからさらに精製し得る。例 えば、組織抽出プロトコルの例として、Sampathら、(1987)PNAS 78:7599-7603お よび米国特許第4,968,590号を参照のこと。 例えば、合成マトリックスが所望され得るが、それは存在する関節において、 置換関節軟骨が、例えば組織中の磨耗または限られた表面的な欠損を矯正するか 、 または今までに老化、疾患または外傷により磨耗した関節軟骨表面の厚みを増や すことが所望される場合である。このような関節軟骨層の「表面再形成(resurfa cing)」は、本発明の方法および組成物を用いて、１つの実施態様においては、 本明細書中で記載される同種関節軟骨組織または異種関節軟骨組織のシートを処 理する工程、得られたマトリックスを骨形成タンパク質でコートする工程、処方 されたデバイスを、標準的なオルソスコピー(orthoscopic)による手術技法を用 いて関節中に導入されるように移動させる(roll up)工程、一旦デバイスが部位 に提供されたならば、関節軟骨上の層としてデバイスを固定する(unroll)工程に より、達成され得る。別の実施態様において、デバイスは、標準的なオルスコピ ーによる手術技法を用いて、関節中の関節骨表面上に注入され得るペーストまた は注入可能なゲル状基質として処方される。この実施態様において、処方物は、 粉末化するかそうでなければ機械的に分解したデバイスを含み、これらはマトリ ックスと骨形成タンパク質の両方、そしてさらにこれらの粒子をペースト様また はゲル様基質に結合する役割を果たす１つ以上の成分を含む。結合物質として、 当該分野で良く特徴付けされている、例えば、カルボキシメチルセルロース、グ リセロール、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。あるいは、デバイスは 、所望の生理的特性を提供する合成マトリックス中に分散された骨形成タンパク 質を含み得る。例として、軟骨および骨に対する組織特異性を有する合成マトリ ックスは、1991年12月21日に公開されたWO91/18558および本明細書に以下に記載 される。簡単に説明すると、マトリックスは、生体適合性の多孔性架橋構造ポリ マー、生分解性コラーゲンおよび組織特異的細胞付着因子としての適切な組織特 異的グリコサミノグリカンを含有する。多くの供給源に由来するコラーゲンを使 用し得、これは不溶性コラーゲン、酸可溶性コラーゲン、中性または塩基性水溶 液に可溶性のコラーゲン、ならびに市販のコラーゲンを包含する。 グリコサミノグリカン(GAG)またはムコ多糖は、ヘキソサミンを含有する動物 起源の多糖であり、組織に特異的に分布しており、それ故、形態形成刺激された 分化細胞の組織特異性の決定を補助するために使用され得る。GAGとの反応はま た、コラーゲンに別の有益な特性、すなわち動物宿主からの免疫反応(外来物反 応)の惹起を阻害するという特性を与える。 化学的に、GAGは、ヘキスロン酸またはヘキソース部位のどちらかとより規則 的な様式またはより規則的でない様式でグリコシド的に結合し、変化するヘキソ アミンの残基からなる(例えば、Dodgsonら、Carbohydrate Metabolism and its Disorders （Dickensら編）第１巻、Academic Press(1968)を参照のこと)。有用 なGAGとして、ヒアルロン酸、ヘパリン、硫酸ヘパリン、コンドロイチン 6-硫酸 、コンドロイチン 4-硫酸、デルマタン硫酸、およびケラチン硫酸が挙げられる 。他のGAGもまた、本明細書中で記載されるマトリックスを形成するために用い られ得、他の適切なGAGは、当業者に公知であるか、または単に通常の実験を用 いて確認し得るかのいずれかである。ムコ多糖のより詳細な説明は、Aspinall、Polysaccharides 、Pergamon Press，Oxford(1970)を参照のこと。 コラーゲンは、酸性水溶液中、好ましくは希釈酢酸溶液中でGAGと反応し得る 。水性コラーゲン分散体にGAGを滴下することにより、GAGでコートされた絡み合 ったコラーゲン線維の共沈殿物が生じる。次いで、この絡まった線維の塊をホモ ジナイズして、均質な細かい線維の分散体を形成し得、次いで濾過して乾燥する 。 コラーゲン-GAG産物の不溶性は、これらの物質を共有結合的に架橋することに より、所望の程度にまで上昇させ得る。この架橋はまた、これらの物質の再吸収 に対する耐性を上昇させる役割を果たす。脱水加熱プロセスによる架橋が好まし いが、一般に、コラーゲンを架橋するのに適したいずれの共有結合的架橋方法も これらの複合物質を架橋するのに適している。処方の考察 本発明のデバイスは、骨形成デバイスを処方するために当該分野で記載された 任意の方法を用いて処方され得る。例えば、米国特許第5,266,683号(この開示は 本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。簡単に説明すると、骨形成 タンパク質を、典型的には、適切な溶媒中に溶解し、そしてマトリックスと組み 合わせる。この成分は会合させることが可能である。典型的には、次に、組み合 わせた物質を凍結乾燥する。その結果、骨形成タンパク質はマトリックスの表面 に配置されるかまたは吸着される。有用な可溶化溶媒としては、エタノールトリ フルオロ酢酸溶液(例えば、47.5％ EtOH/0.01％ TFA)；およびアセトニトリル/T FA溶液、エタノールまたはエタノール水溶液、および生理学的に緩衝化した生理 食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。酸性緩衝液中の処方物は、マト リックス表面へのOP1の吸着を促進し得る。本発明の置換身体部分デバイスにつ いては、一般的に好ましい処方プロトコルは、エタノール/TFA溶液(例えば、30 ％〜40％ EtOH/0.01％〜0.1％ TFA)中でのマトリックスと骨形成タンパク質との 24時間のインキュベーションおよび続く凍結乾燥である。この手順は、70％〜90 ％のタンパク質をマトリックス表面に吸着または沈殿させるのに十分である。 使用される骨形成タンパク質の量は、使用される置換デバイスのサイズおよび 骨形成タンパク質の比活性に左右される。典型的には、マトリックスの乾燥重量 10ｇあたり0.5mg〜100mgが有利に使用され得る。 骨形成タンパク質に加えて、種々の成長因子、ホルモン、酵素、治療組成物、 抗体または他の生物活性剤もまた、基質上に吸着させるかまたは基質中に浸潤さ せ得、そして移植された場合、一定の時間にわたって放出される。そしてマトリ ックスは徐々に吸収される。従って、EGF、PDGF、IGF、FGF、TGF-aおよびTGF-b のような種々の公知の成長因子がインビボで放出され得る。マトリックスはまた 、化学療法剤、インスリン、酵素、酵素インヒビターまたは走化性化学誘引因子 を放出するためにも使用され得る。タンパク質の考察 本明細書中で定義したように、本発明の組成物および方法において有用な骨形 成タンパク質は、マトリックスと組み合わせて哺乳類に移植されるときに軟骨内 骨活性を有するダイマータンパク質のファミリーを包含し、そのファミリーは「 TGFβ様」タンパク質の「スーパーファミリー」のサブクラスを包含する。成熟 した天然形態の、天然起源の骨形成タンパク質は、SDS-PAGEにより決定されるよ うに、約30〜36kDaの見かけの分子量を有する典型的なグリコシル化ダイマーで ある。還元すると、30kDaのタンパク質は、約16kDaおよび18kDaの見かけの分子 量を有する２つのグリコシル化されたペプチドサブユニットを生じる。還元状態 では、タンパク質は、検出し得る骨形成活性を有しない。グリコシル化されてい ないタンパク質(これもまた骨形成活性を有するが)は、約27kDaの見かけの分 子量を有する。還元すると、この27kDaのタンパク質は、約14kDaおよび16kDaの 見かけの分子量を有する、哺乳動物において軟骨内骨形成を誘導し得る、２つの グリコシル化されていないポリペプチドを生じる。有用な配列は、以下のタンパ ク質のＣ末端102アミノ酸配列を包含し、そのタンパク質はDPP(Drosophiaより) 、Vg1(Xenopusより)、Vgr-1(マウスより)、OP1およびOP2タンパク質(米国特許第 5,011,691号およびOppermannら参照)、ならびにBMP2、BMP3、BMP4、(WO 88/0020 5、米国特許第5,013,649号およびWO 91/18098参照)、BMP5およびBMP6(WO 90/113 66、PCT/US90/01630参照)およびBMP8およびBMP9として示されるタンパク質であ る。 このファミリーのタンパク質群のメンバーは、Ｃ末端領域に保存された６個ま たは７個のシステイン骨格を共有する。例えば、配列番号１の335〜431およびそ の配列は、本明細書で「OPS」と呼ばれる６個のシステイン骨格残基、または102 個のアミノ酸およびその配列が７個のシステイン骨格を定義する配列番号１の33 0〜431残基参照。 このタンパク質のファミリーは、与えられたタンパク質のより長い形態、およ び系統発生的タンパク質（例えば、種および対立遺伝子変異体および生合成変異 体）を包含する。この変化により尚、マトリックスと一緒に哺乳動物に移植した とき、タンパク質が哺乳類での骨形成を誘導し得るコンホーメーションを有する ダイマー種を形成し得るとすれば、保存されたＣ末端システイン骨格を変化させ 得るような付加および欠失変異体および遺伝子変異体を包含する。さらに、本発 明のデバイスで有用な骨形成タンパク質は、変化するグリコシル化パターンおよ び変化するＮ-末端を有する形態を包含し得、自然に起こるかまたは生合成的に 誘導され得、および原核または真核宿主細胞中の組換えDNAの発現により生成さ れ得る。これらのタンパク質は単一の種(例えば、ホモダイマー)として活性であ り、またはヘテロダイマーを含む混合種として組合せられる。 一つの実施様態では、本明細書中で意図する骨形成タンパク質は、OP1およびO P1関連配列を包含する。有用なOP1配列は、米国特許第5,011,691号；第5,108,75 3号および第5,266,683号；Ozkaynakら(1990)EMBO J ９:2085-2093;およびSampat hら(1993)PNAS 90:6004-6008に示されている。OP-1関連配列は異種相同体(例え ばDrosophilaからの60A、Whartonら(1991)PNAS 88:9214-9218)、およびＣ末端の ７つのシステインドメインにおいて、OP1と60％を超える同一性、好ましくは少 なくとも65％の同一性を共有するタンパク質を包含する。OP-1関連配列の例とし ては、以下が挙げられる；BMP5、BMP6(およびその種の相同体であるVgr-1、Lyon sら、(1989)PNAS 86:4554-4558)、Celesteら(1990)PNAS 87 9843-9847、およびP CT国際出願WO 93/00432；OP-2(Sampathら、(1990)J.Biol.Chem 267:13198-13205 )。当業者により認められるように、キメラ構造は、標準的な分子生物学および 変異誘発技法により、新規な配列を作るために異なる別の形態形成タンパク質の 種々の部分を組み合わせて、容易に作り得、タンパク質のこれらの形態もまた、 本明細書で意図される。 他の好ましい局面では、本発明は、本明細書で「OPX」と呼ばれる属の(generi c)アミノ酸配列を有する数種のポリペプチド鎖を包含する。その「OPX」は、種 々の同定された種類の骨形成OP1タンパク質と骨形成OP2タンパク質との間の相同 性を適応させ、それは以下に示されるアミノ酸配列および配列番号３で記載され る。 およびここで、残基２におけるXaaは(LysまたはArg)；残基３におけるXaaは(Lys またはArg)；残基11におけるXaaは(ArgまたはGln)；残基16におけるXaaは(Glnま たはLeu)；残基19におけるXaaは(IleまたはVal)；残基23におけるXaaは(Gluまた はGln)；残基26におけるXaaは(AlaまたはSer)；残基35におけるXaaは(Alaまたは Ser)；残基39におけるXaaは(AsnまたはAsp)；残基41におけるXaaは(TyrまたはCy s)；残基50におけるXaaは(ValまたはLeu)；残基52におけるXaaは(SerまたはThr) ；残基56におけるXaaは(PheまたはLeu)；残基57におけるXaaは(IleまたはMet)； 残基58におけるXaaは(AsnまたはLys)；残基60におけるXaaは(Glu、AspまたはAsn )；残基61におけるXaaは(Thr、AlaまたはVal)；残基65におけるXaaは(Proまたは Ala)；残基71におけるXaaは(GlnまたはLys)；残基73におけるXaaは(AsnまたはSe r)；残基75におけるXaaは(IleまたはThr)；残基80におけるXaaは(PheまたはTyr) ；残基82におけるXaaは(AspまたはSer)；残基84におけるXaaは(SerまたはAsn)； 残基89におけるXaaは(LysまたはArg)；残基91におけるXaaは(TyrまたはHis)；残 基97におけるXaaは(ArgまたはLys)。 さらに他の好ましい局面では、骨形成に活性なダイマーのポリペプチド鎖サブ ユニットの１つまたは両方は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件 下でOP1の活性領域をコードするDNAまたはRNA配列にハイブリダイズする核酸に よりコードされる。本明細書で用いられているように、ストリンジェントなハイ ブリダイゼーションは、40％ホルムアミド、5X SSPE、5X Denhardt's溶液、およ び0.1％SDS中に37℃で一晩ハイブリダイズし、そして0.1X SSPE、0.1％ SDS中50 ℃で洗浄することとして定義される。 前述のアミノ酸およびDNA配列情報、当該分野の技術レベルおよび骨形成タン パク質に関する多数の出版物の開示（米国特許第5,011,691号および公開されたP CT明細書US89/01469(1989年10月19日公開)）が与えられれば、本発明のデバイス で有用な骨形成タンパク質の活性ドメインを少なくともコードする種々のDNA、 およびそれらの種々のアナログ(種および対立遺伝子変異体および遺伝的に設計 された変異を含むものを包含する)、ならびに融合タンパク質、成熟タンパク質 の短縮形、欠失および付加変異体および本発明のデバイスおよび方法で用いられ る同様の構成物が作製され得る。さらに、DNAハイブリダイゼーションプローブ は、任意のこれらのタンパク質のフラグメントから作製され得、または属の配列 から新規設計される。これらのプローブは、本発明の人工デバイスで有用な付加 される骨形成タンパク質を同定するするために、種々のゲノムおよびcDNAライブ ラリーをスクリーニングするのに用いられ得る。 DNAは、ゲノムおよびcDNAの単離、合成されたオリゴヌクレオチドからの合成D NAの構築、およびカセット変異誘発技術を包含する周知のDNA操作技術を用いて 当業者によって生成され得る。15-100マーのオリゴヌクレオチドは、DNAシンセ サイザーで合成され得、Tris-ホウ酸-EDTA緩衝液中でポリアクリルアミドゲル電 気泳動(PAGE)で生成され得る。次いでDNAが、ゲルから電気溶出され得る。重複 するオリゴマーは、T4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化され得、そして PAGEにより精製され得るより大きいブロックに連結され得る。 次いで適切に同定されたクローン由来のDNAが、単離され、サブクローン化(好 ましくは発現ベクター中へ)され、そして配列決定され得る。次いで目的の配列 を含むプラスミドが、タンパク質発現および更なる特徴付けのために適切な宿主 細胞中へトランスフェクトされ得る。宿主は原核細胞でも真核細胞でもあり得る 。というのは前者がタンパク質をグリコシル化できないことが、タンパク質の形 態発生活性を破壊しないからである。有用な宿主細胞は、E.coli、Saccharomyce s 、昆虫／バキュロウイルス細胞系、骨髄腫細胞、CHO細胞、および種々の他の哺 乳動物の細胞を包含する。加えてベクターは、組換えタンパク質の正しい発現を 促進する種々の配列をコードし得、この配列は、転写プロモーターおよび終結配 列、エンハンサー配列、好ましいリボソーム結合部位配列、好ましいmRNAリーダ ー配列、タンパク質分泌のための好ましいシグナル配列などを包含する。 目的の遺伝子をコードするDNA配列はまた、潜在的な阻止配列を除去し、また は望まない２次構造形成を最小にするように操作され得る。組換え骨形成タンパ ク質はまた、融合タンパク質として発現され得る。翻訳された後、タンパク質は 細胞それ自身から精製され得、または培地から回収され得る。すべての生物学的 活性タンパク質形態は、ジスルフィド結合により連結され、またはそうでなけれ ば会合されたダイマー種を含有し、このダイマー種は、個々のサブユニットの発 現の後、適切な真核細胞内またはインビトロで１つまたはそれ以上の種々の組換 えポリペプチド鎖をフォールディングし、酸化することで生成される。 E.coli 中または多くの他の哺乳動物の細胞中で、組換えDNAから発現される骨形成タン パク質の詳細な記述は、米国特許第5,266,963号で開示されており、この開示は 、本明細書中で参考として援用する。 あるいは、骨生成ポリペプチド鎖は、当業者に周知の従来のペプチド合成法を 用いて、化学的に合成され得る。例えば、タンパク質は、固相ペプチドシンセサ イザーで標準的な操作法を用いて、完全または一部合成され得る。次いで完成さ れた鎖は、脱保護され、そしてHPLC(高速液体クロマトグラフィー)により精製さ れる。もしタンパク質が部分的に合成されたら、その部分を標準的な方法を用い てペプチド結合して、完全なタンパク質を形成し得る。概して、骨形成タンパク 質を作る方法は、従来のものであり得、本発明の一部をなさない。実施例 本発明のマトリックスおよびデバイスを作製および使用するための手法、およ びこれらの構成物の性質および利用に関する他の材料の局面（請求される主題の 作製法および使用法を含む）は、本発明を実施するために現在意図された最良の 態様を構成する以下のことからさらに理解されるであろう。本発明は、このよう な典型的な研究またはこれらの実施例で記述した詳述に限られないことが認めら れる。 例証では、関節の滑膜性連結の半関節再構成は、既存の関節位置に切除される 。当業者によって認められるように、本発明の方法および構成物は、骨格連結以 外の置換身体部分の形成、ならびに関節連結または滑膜性連結以外の骨格連結に 応用される。さらに、望まれるなら、置換自原性癒着結合は、本発明のデバイス を欠損部位に遠位の他の好都合な位置に、置換身体部分の形成を誘導するのに十 分な時間の間配置することで、まずレシピエントにおいて構成され得、次いでこ のように形成された自原性身体部分が、使用のための関節位置に縫合される。実施例１ 哺乳類の半関節(hemi-joint)の再構成 ニュージーランド白ウサギを実験モデルとして用いた。標準的な整形外科の器 具および手法を用いた。 図2Aで描かれているように、関節欠損を、上腕骨の近位３分の２で上腕関節窩 の半関節複合体全体を外科的に切除することで、レシピエントの中に作出した。 移植のための同種移植片を、上腕関節窩の関節表面でドナー動物より切り取った 半関節から調製した。全ての同種移植片を、エタノール中で抽出し、標準的な手 法を用いて凍結乾燥し、本明細書で上述したように、材料の病原性および抗原性 を破壊した。特に、完全な(intact)関節複合体を切り取り、脱骨髄処理(demarra owed)し、200ml〜500mlの200標準エタノールに40℃で72時間曝すことでエタノー ル処理した。６〜８時間毎に新しいエタノールを供給した。エタノール処理に続 いて、マトリックスを凍結乾燥し、骨形成タンパク質の存在または非存在下でエ タノール／TFA中で再水和した。処理した半関節は、失活骨、関節軟骨、靭帯、 腱、滑液包(synovialcapsule)および滑液膜組織を含んでいた。 図2Bに図解したように、凍結乾燥し、骨形成タンパク質処理した全ての同種移 植片を、米国特許第5,011,691号に記述されたように、OP-1でコートした。特に 、成熟したダイマー組換えOP-1(rhOP1)を、凍結乾燥した同種移植片と組み合わ せてアセトニトリルトリフルオロ酢酸溶液に可溶化し、移植した。15〜20mgタン パク質／8〜10ｇマトリックス(乾燥重量)を用いた。全ての同種移植片の遠位骨 部分を、四つ穴チタンミニプレートで正しい場所に固定した。関節包の綿密な外 科的再構成を、当該分野で十分に確立している標準的な外科的手法を用いて、凍 結乾燥した包の端と内生の包とを縫合することで実施した。これは、完全な包と 滑膜内層(linig)を再生成し、従って移植された関節表面の滑液環境(synovial m illeu)を回復させた。手術のほぼ直後には、運動が可能となり、再び通常の関節 の状態に回復した。 いくつかの動物において、局所筋肉弁(最年長皮筋；図2C)を、図2Dに示された 同種移植片の骨髄腔の中へ筋肉を通すことで、欠損部に組み入れた。これは、米 国特許第5,067,963号に記載されたKhouriの方法を用いて行い、この開示は、本 明細書中で参考として援用する。簡単に言えば、血管化された好都合な筋肉弁を 、灌流血液供給を維持するように、再建手術において開業医に周知の標準的手法 を用いて切開し、そして同種移植片の骨髄腔内部に通した。 再構成された半関節の予備評価を、一週間を通してのＸ線を用いた連続放射線 写真および／または磁気共鳴イメージング(MRI)により得た。組織的および機械 的な確証的評価は、手術後５週間および６ヶ月に屠殺の上、行った。 機械的評価は、屠殺まで連続的に得られる標準的な運動範囲(ROM)の測定を包 含した。組織的評価は、標準的技法を用いて、採取した同種移植片全体について 矢状切断を染色することを包含した。 簡単に言えば、真の関節軟骨の確認は、超微細構造および／または生化学のパ ラメーターを用いて、達成され得る。例えば、関節軟骨は、確認可能な域(zone) を有する軟骨組織の連続層を形成する。表面域は平坦化された形態および細胞外 網を有する軟骨細胞によって特徴づけられ、この域はトルイジンブルーで染色さ れないかまたはわずかにしか染色されず、硫酸プロテオグリカンが相対的に存在 しないことが示される。中間および深層域の軟骨細胞は、球形の外見を有し、そ してマトリックスは、トルイジンブルーでの染色によって証明されるように、多 量の硫酸プロテオグリカンを含有している。コラーゲン線維は、マトリックス全 体に広く存在している。軟骨細胞は、多量の粗面小胞体を有し、細胞外網に囲ま れている。細胞周囲網は、多数の薄い帯のないコラーゲン線維を含有している。 テリトリー間(interterritorial)網内のコラーゲンは、あまり緻密化されておら ず、関節軟骨と同様、電子半透明非晶質材料に埋め込まれている。網のテリトリ ー間部内のコラーゲン線維は、軟骨組織のテリトリー間領域内のコラーゲン線維 に特有の周期的な帯形成を示す。 生化学的には、軟骨組織中のII型およびIX型コラーゲンの存在は、軟骨細胞の 特殊化された表現型の指標である。II型および／またはIX型コラーゲンの存在は 、標準的なゲル電気泳動、ウエスタンブロット分析、および／または、例えば、 市販の抗体を用いた免疫組織化学染色で決定し得る。他の生化学的なマーカーは 、ヘマトキシリン、エオシン、ゴルドナートリクローム(Goldner's Trichrome) およびサフラニン-Ｏを包含する。 関節軟骨再生を、グリコサミノグリカン特異的染色および当該分野で周知の技 法を用いて、本明細書中の実施例において組織学的に評価した。初期組織評価で は、欠損部位を、欠損の中央が通るように縦に２等分した。得られた半片および 周囲組織を、パラフィン中に包埋し、欠損の中心を横切るように薄く切った。そ れぞれの欠損の一つの半片を、トルイジンブルーおよび／またはヘマトキシンな らびにエオシン、ゴルドナートリクロームおよびサフラニン-Ｏでの組織学的染 色に使用した。もう一つの半片は、免疫染色のための切片の調製に使用した。組 織学的な評価は、以下の評価を包含した：修復軟骨中のグリコサミノグリカン含 有量；軟骨および軟骨細胞の形態；ならびに欠損界面における構造の完全性およ び形態。修復軟骨の形態は、グリコサミノグリカン含有量、軟骨沈着(dipositio n)の程度などの評価により、形成された軟骨のタイプ(関節対線維)を示した。 当該分野で十分に特徴づけられている標準方法を用いた組織学的評価により、 新しい骨および骨髄形成についての評価が可能となる。例えば、米国第5,266,68 3号参照(この開示は本明細書中で参考として援用する)。同様に、靭帯および滑 液包の完全性は、MRIおよび屠殺の上での組織学によりモニターされ得る。実施例２ 期間５週間（短期間） ５週間の研究では、１グループあたり10羽のウサギを有する４グループに凍結 乾燥した同種移植片を移植した。図3A、3B、3C、および3D参照。グループ１では 、骨形成タンパク質のないコントロール凍結乾燥同種移植片30を移植した(図3A) 。グループ２では、実験凍結乾燥同種移植片31に、移植の前にOP-1を浸透させた (図3B)。グループ３では、骨形成タンパク質のないコントロール凍結乾燥同種移 植片30を、骨髄腔33に通した筋肉弁32と共に移植した(図3C)。グループ４では、 実験凍結乾燥同種移植片31に、移植の前にOP-1を浸透させ、そして筋肉弁32を骨 髄腔33内に通した(図3D)。 上記のように、移植片治癒を、連続Ｘ線および標準MRI(磁気共鳴イメージング )により非侵襲的に追跡した。Ｘ線評価によって、骨形成タンパク質で処理され た同種移植片は、薄い卵殻状の皮質のみを示したコントロール同種移植片(グル ープ1、3)と比べて、術後１週間で、著しく肥厚した皮質を有した。４週間まで に、大部分のコントロール同種移植片は、破損し不安定となった。対照的に、OP -1処理同種移植片(グループ2、4)は、安定を保った。 MRIはまた、同種移植片中の関節軟骨再形成を追跡するための非侵襲性手法と しても用いた。MRIの出す暗い信号は、軟骨が存在しないまたは成育不能である ことを表し、明るい信号は、生きている生育可能な軟骨を示す。コントロール同 種移植片は、術後1、3、および5週間で試験したとき、暗い信号しか出さなかっ た。これらのMRI所見は、術後５週間で行った組織学的分析により確認した。コ ントロール同種移植片の矢状切断は、生細胞のない変性した関節表面を示した。 対照的に、OP-1処理同種移植片からの関節帽のMRI所見は、術後３週間までに 明るい信号を示し、生育可能な関節軟骨の再生を示した。５週間でのOP-1処理同 種移植片の組織学的分析では、同種移植片マトリックスの上部に新しく生成した 関節軟骨の層を明らかにした。グループ４の同種移植片は、グループ２の同種移 植片より幾分厚い軟骨層を示し、筋肉弁の付加が、関節再生の速度をさらに高め 得ることを示唆した。 さらに、OP-1処理同種移植片により再生した関節は、再構成後５週間に同種移 植片を採取するまでに、ほぼ正常な運動範囲を回復した。運動範囲がほぼ正常で あることはまた、滑剤となる滑液の存在を示している。対照的に、取り出された コントロール同種移植片は、堅く、採取時に収縮した。このように、本発明の半 関節置換デバイスは、完全な包、および滑膜、および機能する靭帯、骨および関 節軟骨組織と共に、機械的および機能的に生育可能な置換関節の形成に成功した 。骨形成タンパク質が存在しない場合、同種移植片は、ドナーによる拒絶はない が、機能性重量支持関節を生成するには単独では不十分である。実施例３ 期間６ヶ月(長期間) ６ヶ月の研究では、凍結乾燥した同種移植片中の古い軟骨帽を削り取る(shavi ng off)ことでの変化(valiable)を導入した。簡単に言えば、これは関節表面の 関節軟骨帽を機械的に削る(sharing)ことで達成した。 以下のグループを、１グループあたり４羽のウサギで用いた；グループ５では 、削った関節表面を有する凍結乾燥同種移植片34および筋肉弁32を移植した(図4 A参照)；グループ６では、削っていない関節表面を有するコントロール凍結乾燥 同種移植片30および筋肉弁32を移植した(図4B参照)；グループ７では、削った関 節表面を有しかつOP-1を含む凍結乾燥同種移植片35およびOP-1で処理した筋肉弁 36を移植した(図4C参照)；グループ８では、削っていない関節表面を有しかつOP -1を含む凍結乾燥同種移植片37およびOP-1で処理した筋肉弁36を移植した(図4D 参照)。グループ５〜８の移植片を、術後６ヶ月で採取した。 採取前イメージングの研究に基づいて、術後３ヶ月までに集められた結果は、 ５週間で集められた上記の結果と一致する。OP-1で処理した完全な同種移植片( グループ８)は、MRIを用いて評価した３週間までに、生きた軟骨の関節表面を再 生した。この関節帽は、依然存在し、３ヶ月でよりずっと良好に発達した。同種 移植片のOP-1処理を行わないと(グループ６)、OP-1処理グループに比べて無視し 得る程度の軟骨の再生しかなかった。 同様に、グループ８のウサギ(同種移植片＋OP1、削らない)は、再構成された 関節でほぼ正常な運動範囲(80％を超える)を回復した。グループ７のウサギ(同 種移植片＋OP1、削る)は、50％の運動範囲しか達さず、そしてグループ５および ６のウサギ(OP-1なし)は、30％未満しか達しなかった。 組織学により決定されたように、本発明のデバイスは、長期(６ヶ月より長い) 研究において、互いに適切な環境(context)下で骨と関節軟骨との両方の形成を 誘導し、維持するのに十分であった。特に、グループ８のウサギは、休止中の中 央またはより深い域の軟骨細胞の存在により形態学的に証明されるように、骨の 表面に関節軟骨の形成を実証した。対照的に、筋肉弁でのみ処理されたグループ (グループ５および６)では、筋肉は、瘢痕組織に置き換わった。削られた骨マト リックスで処理されたグループでは、有意な軟骨再生は確認されず、非血管化環 境では、関節軟骨形成において軟骨特異的残留物が必要なことが実証された。 短期間および長期間両方の研究において、機械的および機能的に生育可能な滑 膜性連結は、形態学および生化学により証明されるように、骨形成タンパク質で 処理された再構成半関節から生じた。さらに、形状、種類、および構造関係にお いて、デバイスのマトリックスを形成する失活組織中の残留物に一致する、関節 軟骨を含む新しい組織が形成された。まとめると、これらの実施例は、骨形成タ ンパク質を含有するデバイスおよび既製の成育不能な凍結乾燥失活マトリックス が、生育可能な機械的および構造的に機能的な置換身体部分構造に転換され得、 この構造は、元の組織の形状および機能をなす複数の異なる新しく形成された組 織を含有する。このデバイスは、破損した骨格連結を含む破損した身体部分に正 常な機能を修復させ、機械的および機能的に生育可能な複数の異なる組織（骨お よび骨髄、関節軟骨、靭帯、腱、滑液包および滑液膜組織を包含する）を修復さ せる。さらに、これらの組織は実質的に生理的な条件下で修復され、その条件は 、例えば、滑膜の周囲に存在する反応性細胞から、および無血管化筋肉弁に曝さ ないことを包含する。 本明細書で開示したように、凍結乾燥同種移植片または異種移植片を含む、骨 形成タンパク質処理されたマトリックスを含有するデバイスは、機械的、構造的 、および機能的に生育可能な置換組織を形成させ得、そして宿主細胞より集めら れた複数の異なる組織を含有し、そして人工材料の有するいくつかの制限がない 置換身体部分となり得る。 当業者は、本明細書に記載した本発明の詳細な実施様態に対する多くの等価物 を理解し、またはさらなる日常の実験なしに確かめ得る。以下の請求の範囲によ り、このことおよび他の全ての等価物が包含されることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 サンパス， クバー ティー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02053， メッドウェイ，シックス スプ リング ストリート （番地なし) (72)発明者 ルージャー， テイビッド シー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01748， ホプキントン，ダウニー スト リート 19

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．テンプレートとして作用して、複数の異なる組織を含む機能的置換骨格連結 をインビボで形成する、哺乳動物における移植のためのデバイスであって、ここ で少なくとも１つの該複数の異なる組織が非無機質化組織であり、該デバイスが 以下を含む、デバイス： ａ） 浸潤細胞の付着を可能にする単一の構造を規定し、そして骨格連結の複数 の異なる組織（該組織の少なくとも１つが非無機質化組織である）に対して特異 性を有する残留物または骨格連結の複数の異なる組織（該組織の少なくとも１つ が非無機質化組織である）由来の残留物を含み；そして 置換しようとする骨格連結の大きさおよび形状を模倣する大きさおよび形状を 有し、そして該マトリックスの表面上に配置される、 生体適合性、生分解性マトリックス、 ｂ） 置換しようとする骨格連結を模倣する大きさおよび形状を有する新たな該 複数の異なる組織（該新たな組織のうち少なくとも１つが非無機質化組織である ）の形成を誘導し、それゆえ機能的置換骨格連結の再生を可能にするに十分な量 の骨形成タンパク質。 ２．前記マトリックスが哺乳動物ドナー由来の失活化組織を含む、請求項１に記 載のデバイス。 ３．前記マトリックスが関節軟骨の残留物および骨の残留物を含む、請求項１に 記載のデバイス。 ４．前記マトリックスが脱水した哺乳動物組織を含む、請求項１に記載のデバイ ス。 ５．前記置換非無機質化組織が、関節軟骨、靭帯、腱、滑液包、および滑液膜組 織からなる群より選択される、請求項１に記載のデバイス。 ６．前記骨格連結が滑膜性連結または関節連結を規定する、請求項１に記載のデ バイス。 ７．前記デバイスが失活化した無傷の骨格連結構造を規定する、請求項１に記載 のデバイス。 ８．骨格連結内に関節軟骨置換組織をインビボで形成する、哺乳動物における移 植のためのデバイスであって、該デバイスが以下を含む、デバイス： 生体適合性、生体吸収性マトリックスの表面上に配置される骨形成タンパク質で あって、該マトリックスが、浸潤細胞の付着を可能にし、そして関節軟骨組織に 特異的な残留物または関節軟骨組織に由来する残留物を含む構造を規定する、骨 形成タンパク質。 ９．骨格連結内に置換非無機質化組織をインビボで形成する、哺乳動物における 移植のためのデバイスであって、該デバイスが以下を含む、デバイス： 生体適合性、生体吸収性マトリックスの表面上に配置される骨形成タンパク質で あって、該マトリックスが浸潤細胞の付着を可能にし、そして非無機質化骨格連 結組織（置換しようとする該組織に本質的に対応する）に特異的な残留物または 非無機質化骨格連結組織（置換しようとする該組織に本質的に対応する）由来の 残留物を含む構造を規定する、骨形成タンパク質。 １０．前記非無機質化組織が無血管組織である、請求項９に記載のデバイス。 １１．前記非無機質化組織が関節軟骨、靭帯、滑液膜、および滑液包組織からな る群より選択される、請求項８に記載のデバイス。 １２．前記マトリックスが失活化同種組織または失活化異種組織を含む、請求項 ８または９に記載のデバイス。 １３．前記マトリックスが、コラーゲンと、乳酸、グリコール酸、酪酸およびこ れらの組み合わせのモノマーを含むポリマーと、ヒドロキシアパタイトと、リン 酸三カルシウムと、それらの混合物とからなる群より選択される材料を含む、請 求項８または９に記載のデバイス。 １４．微粒子物質に結合して成型可能な固体を形成するに適した材料をさらに含 む、請求項８または９に記載のデバイス。 １５．前記骨形成タンパク質がOP-1、OP-2、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、OP X、またはそれらの機能的等価物のホモダイマーまたはヘテロダイマーを含む、 請求項１、８、または９に記載のデバイス。 １６．哺乳動物において、複数の異なる組織（ここで、該複数の異なる組織の少 なくとも１つが非無機質化組織である）を含む自家移植置換骨格連結の形成を誘 導する方法であって、該方法が以下の工程を包含する、方法： ａ） 生体吸収性、生体適合性マトリックスの表面上に配置される骨形成タンパ ク質を含むデバイスを提供する工程であって、該マトリックスが 浸潤細胞の付着を可能にし、そして骨格連結の該複数の異なる組織（該組織の 少なくとも１つが非無機質化組織である）に対して特異性を有する残留物または 、骨格連結の該複数の異なる組織（該組織の少なくとも１つが非無機質化組織で ある）に由来する残留物を含む単一構造を規定し、そして 置換しようとする骨格連結の大きさおよび形状を模倣する大きさおよび形状を 有する（該新しい組織の少なくとも１つが非無機質化組織である）、工程；およ び ｂ） 哺乳動物の部位に該デバイスを移植し、それにより機能性骨格連結の形成 を誘導する工程。 １７．前記哺乳動物の前記部位が置換しようとする内因性身体部分を規定する、 請求項１６に記載の方法。 １８．前記マトリックスが、形状および構造的関係において、置換しようとする 前記複数の異なる組織に対応するような大きさである残留物をさらに含む、請求 項１６に記載の方法。 １９．前記複数の異なる組織が骨および軟骨を含む、請求項１６に記載の方法。 ２０．前記マトリックスが失活化同種組織または失活化異種組織を含む、請求項 １６に記載の方法。 ２１．前記複数の異なる組織の１つが無血管組織である、請求項１６に記載の方 法。 ２２．骨表面上の関節軟骨をインビボで修復する方法であって、該方法が以下の 工程を包含する、方法： 哺乳動物の部位で該骨表面上に、生体適合性、生体吸収性マトリックスの表面 上に配置される骨形成タンパク質を含むデバイスを提供する工程であって、該マ トリックスが、軟骨組織に特異的な残留物または軟骨組織由来の残留物を含み、 そして浸潤細胞の付着を可能にする構造を規定する、工程。 ２３．前記部位が滑膜腔に生じる、請求項２２に記載の方法。 ２４．哺乳動物において骨格連結内の非無機質化組織を回復する方法であって、 該方法が以下の工程を包含する、方法： 哺乳動物の該骨格連結に、生体適合性、生体吸収性マトリックスの表面上に配 置される骨形成タンパク質を含むデバイスを提供する工程であって、該マトリッ クスが、組織（置換しようとする該非無機質化組織に本質的に対応する）に特異 的な残留物または組織（置換しようとする該非無機質化組織に本質的に対応する ）由来の残留物を含み、そして浸潤細胞の付着を可能にする構造を規定する、工 程。 ２５．回復させようとする前記非無機質化組織が無血管組織を含む、請求項２４ に記載の方法。 ２６．回復させようとする前記非無機質化組織が、関節軟骨、腱、靭帯、滑液包 、および滑液膜組織からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。 ２７．前記マトリックスが同種関節軟骨または異種関節軟骨由来である、請求項 ２２または２４に記載の方法。 ２８．前記デバイスが成型可能な固体を含む、請求項２２または２４に記載の方 法。 ２９．前記デバイスが可撓性シートを含む、請求項２２または２４に記載の方法 。 ３０．前記デバイスが、コラーゲンと、乳酸、酪酸、グリコール酸およびそれら の混合物を含むポリマーと、ヒドロキシアパタイトと、それらの組み合わせとを 含む、請求項２２または２４に記載の方法。 ３１．前記骨形成タンパク質がOP-1、OP-2、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、OP Xのホモダイマーまたはヘテロダイマー、あるいはそれらの機能的等価物を含む 、請求項１６、２２、または２４に記載の方法。