JPH10504289A

JPH10504289A - ヒト血清アルブミンの分離

Info

Publication number: JPH10504289A
Application number: JP8504861A
Authority: JP
Inventors: ニューエンス，ヤン，エイチ．; コーヴェン，エミール，ジェイ．，ジェイ．，エム．ファン
Original assignee: ファーミングビーブィ
Priority date: 1994-07-20
Filing date: 1995-07-20
Publication date: 1998-04-28
Also published as: AU2989495A; WO1996002573A1; EP0773961A1; CA2195202A1; GB9414651D0

Abstract

(57)【要約】トランスジェニックウシ動物からのミルクは、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）および内因性のウシ血清アルブミン（ｂＳＡ）を含む。ｈＳＡは、界面活性剤の存在中でのアフィニティクロマトグラフィー（アフィニティリガンドはトリアジン染料分子）を含む分離方法によって、少なくとも９８％純度に精製される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびラジオイムノアッセイにより決定されるような、本質的に純粋な組み換えｈＳＡを提供するために、アフィニティクロマトグラフィー段階が、プロトコールに挿入され得る。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト血清アルブミンの分離本発明は、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）の分離（精製）に関し、トランスジェニック動物のミルクからｈＳＡを分離することに適用され得る。分子生物学の分野における最近の進歩は、トランスジェニック動物、すなわち、ヒトが介入して誘導された動物の生殖細胞系および体細胞に外因性ＤＮＡを含む動物を産出させている。異なる細胞タイプにおいてこれらの異種遺伝子(forei gn gene)の調節における差は、異種遺伝子によりエンコードされた蛋白質の分離に楽なように、選ばれた組織の遺伝子産物の所望の活性のために、または他の理由のために、予め選ばれた組織において異種遺伝子の差別的発現を促進することを可能にする。トランスジェニック動物および差別的遺伝子発現の利点は、重要な蛋白質を大量に生産することである。そのような蛋白質は、トランスジェニック動物に対して典型的には外因性であり、薬、栄養等を含み得る。しかしながら、外因性蛋白質は好ましくは、それらが自然に発現されるところのものに類似の組織に発現される。例えば、外因性ミルク蛋白質は好ましくは、トランスジェニック動物のミルク形成細胞に発現される。その結果、しばしば非常に類似の物理化学的特性を有するその内因性の対応物と同じ組織または体液に、その外因性の蛋白質が存在するので、困難な全く新たな分離の問題が存在する。ＤＮＡの特定の調節片の使用は、乳腺のような予め選択された組織において異種のＤＮＡの発現を誘発することを可能にする。ヒト蛋白質は、他の脊椎動物、例えばマウス［Gordonら，Biotechnology 5(1987年):1183-1187；Pittius ら、P roc Natl．Acad．Sci．USA 85（1988年）:5874-5878；Archibald ら，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 87（1990 年）:5178-5182；Simonsら，Nature 328（1987年）:530-532；Meade ら，BioTechnology 8（1990 年）:443-446］、ヒツジ［Simo nsら，BioTechnology 6（1988 年）:179-183；Clark ら，BioTechnology 7（198 9 年）:487-492］、ウサギ［Buhlerら，BioTechnology 8（1990 年）:140-143］、ブタ［Bremら、Zuchthygiene 20（1985 年）:251-252；Wallら、Proc．Natl． Acad．Sci．USA 88（1991 年）:1696-1700］および雌牛［Krimpenfort ら、BioT echnology 9(1991 年):844-847］のミルクにおいて生産され得る。低い費用で、１リットル当たり約35グラムの蛋白質を含む［Swaisgood，Developments in Dai ry Chemistry-1，Ed．Fox，Elsevier AppliedScience Publisher，ロンドン（19 82年）:1-59］大量（＞10,000リットル／年）のミルクを産生するので、トランスジェニック雌牛が特に興味深い。ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）は、５８５個のアミノ酸からなる［Minghetti ら、J．Biol．Chem．261（1986年）:6747-6757］、約68000 ドルトンの分子量を有する蛋白質である。それは、最も豊富なヒト血漿蛋白質である。ｈＳＡの主な機能の１つは、血液浸透性調節である。他の血液蛋白質と比較して、ｈＳＡは、全血液浸透性の約８０％の責任を負う。ｈＳＡの第２の機能は、脂肪酸、ビリルビンおよび血液中に存在する他の蛋白質を、脊椎動物における脂肪組織および他の組織および器官の間で運ぶことである。ｈＳＡは、血液欠乏またはショック状態の患者に血液量を復帰させるために使用され得る。大量のｈＳＡが、患者の処置において必要とされる。限られた量のヒト血液しか入手できないので、ヒト血液の他にｈＳＡの他の供給源を持つことが有用である。ヒト血液はまた、肝炎のようなウィルスで汚染されていることがあり得る。乳分泌細胞(mammary secreting cell)における発現の標的にされたヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）をエンコードするトランスジーンを含むトランスジェニックウシ動物の産生が、ＰＣＴ公開WO 91/08216 に記載されている。しかし、ヒト血清アルブミンの精製は、ウシのミルク中に存在することが知られており、かつヒト血清アルブミンに類似の物理化学的特性を有するところの内因性ウシ血清アルブミン（ｂＳＡ）の存在により複雑化される。ｈＳＡは、高度に精製されたｈＳＡを必要とする潜在的薬剤用途を有するので、トランスジェニックミルクからｈＳＡを精製する方法を開発することが肝要である。ｂＳＡは、肝臓で産生される蛋白質であり、血液からミルクへと、乳腺の上皮を経て漏れ出る。乳房での細菌感染のために、雌牛は（無症状の）乳腺炎にかかり得る。これは、増加した体細胞数および、ミルク中に存在するｂＳＡの増加したレベルに関連する［Smith ら、J．Dairy Res．46（1979 年）:547-550；Fox ら、J．Dairy Sci．64（1981年）:2258-2261；Honkanen-Buz alski ら、J．Dairy Res．48（1981年）:213-223；Poutrel ら、J．Dairy Sci． 66(1983年):535-541；McFaddenら、J．Dairy Sci．71（1988年）:826-834］。血清から血清アルブミンを精製することについて、多くのプロトコールが報告されている。すなわち、東ドイツ国特許出願DD 213 222は、シバクロンブルー(Cibacron Blue)Ｆ３Ｇ−Ａを用いて、ヒト血清からのヒト血清アルブミンの分離を報告している。アルブミンは、染料‐セルロースカラムにｐＨ５〜９で吸着され、１〜２ＭＮａＣｌまたは0.2 〜１ＭＫＳＣＮのいずれかを用いて脱着された。東ドイツ国特許出願DD 225 996は、シバクロンブルーカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによる、血清から血清アルブミンの分離を報告している。アルブミンは３．５ＭのＮａＣｌで溶離された。日本国特開昭63-179255 号公報では、シバクロンブルー‐樹脂ポリマーカラムに、ラジオイムノアッセイのためにヒト血清アルブミンを結合することが報告された。カラムはｈＳＡ含有試料と接触され、還元剤が加えれらた。カラムは洗浄され、そして¹²⁵Ｉで標識された、ｈＳＡに対する抗体と接触された。日本国特開平2-203933号公報では、染料を含有するアフィニティ吸着剤を製造する方法を報告しており、ウシ血清アルブミンは、シバクロンブルー‐セルロースカラムに結合された。科学文献はまた、染料コンジュゲート(conjugate)を用いて血漿からｈＳＡを分離することについてのプロトコールを報告する。Travisら、Biochemical Jour nal ，157 (2)(1976 年)301-306 は、ヒト血漿から血清アルブミンを分離するために、シバクロンブルー‐セファロースカラムの使用を報告している。血清アルブミンは、ｐＨ８．０で、０．２ＭＮａＳＣＮを用いての脱着によって回収される。Kelleherら、Journal of Chromatography ，173（1979年）415-418は、血漿から、マウス、ラット、ウシおよびヒトアルブミンを分離するために、シバクロンブルー‐アガロースカラムの使用を報告している。Leatherbarrow an d Dean，Biochemical Journal,189（1980 年）27-34は、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ウシまたはヒトの血漿からのアルブミンの、シバクロンブルー‐セファロースへの結合の機構について研究した。蛋白質は、ｐＨ８．０で、０．５ＭＮａＳＣＮを用いてコンジュゲートから溶離された。 Metcalf ら、Biochemical Journal,199（1981 年）465-472は、アルブミンと、固定化されたシバクロンブルーとの相互作用を研究した。ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシおよびヒトの血清アルブミンが、凍結乾燥した粉末として得られ、または１つのヒト試料の場合にはヒト血漿から分離された。Miribel ら、Journal of Bio chemical and Biophysical Methods ，16（1988年）1-16は、ヒト血漿蛋白質の精製のための染料‐リガンドアフィニティクロマトグラフィーの使用について短い総説を提示する。本発明より前には、ｈＳＡの精製は、困難な多段階工程を必要とした。最近の分離法は、血漿または血清からｈＳＡを分離するのに有用であるが、より多くの体積から、または他の供給源、特にトランスジェニックミルクまたはミルクホエイからの蛋白質の分離（ここでは、とりわけ、類似の内因性蛋白質から外因性蛋白質を分離する上で、独特の分離の問題が生じる）には容易に適合されない。（供給源としてトランスジェニックミルクを用いることにより引き起こされる複雑化を無視しての）通常のヒトミルクからのｈＳＡの精製は、全乳から脂肪および／またはカゼインを除去することによる、加工ミルクまたはミルクホエイの調製、次いでマルチカラムクロマトグラフィーによる精製工程を行って他の蛋白質を除去しｈＳＡを分離することを必要とする。クロマトグラフィー技術が、最近では、ミルクから血清アルブミンを精製するのに好ましい。この取組みは、報告されたところでは、エタノール分別法［Curl ing,（1980年）、"Methods of Plasma Protein Fractionation"，Curling Ed.， Academic Press ロンドン、英国；Curling ら、J. Parenteral Sci ．Technol ．36,（1982 年）59；Berglof ら、およびNartinache ら、（1982 年）Joint Meeting IHS-IBST，ブダペスト］に比べて、より良い回収率およびより高いアルブミン純度、ならびにアルブミンポリマーのより低い含量を生じる。ｈＳＡの特異的な輸送の役割、ならびに血管内浸透圧を維持する上でのその主な役割がまた、クロマトグラフィー精製すると、より良く保存され得る［Steinbruch（1982年）、Joint Meeting ISH-ISBT，ブダペスト］。血漿からｈＳＡの精製についてのプロトコールが、以前に報告されていた。特に、アガロースまたはセファロースのビーズに結合させた、ポリスルホン化した染料、例えばシバクロンブルーが見込みがあるように思われる。というのは、それらは種々の程度で血清アルブミンに結合することが知られているからである［Travisら、Biochem．J．157（1986 年）:301-306；Kelleherら、J．Chromat． 173(1979 年):415-418；Leatherbarrow ら、Biochem．J．189（1980 年）:27-34 ；Metcalf ら、Biochem．J．199（1981 年）:465-472；Gianazzaら、Biochem．J ．201（1982 年）:129-136；Chiggeriら、Clin．Chim．Acta 145（1985年）:205 -211］。他のアルブミンと比べて、ｈＳＡはシバクロンブルーと非常に強く相互作用する［Kelleherら、J．Chromat．173（1979 年）:415-418；Leatherbarro w ら、Biochem．J．189（1980 年）:27-34；Metcalf ら、Biochem．J．199（198 1 年）:465-472］。本発明は、分離技術の新規な組合せと共に、他の種の血清アルブミンよりも、あるトリアジン染料分子に対してｈＳＡのより大きい親和性を利用することによって、高度に精製されたヒト血清アルブミンを得ることが可能であるという発見に基づく。結果として、ｈＳＡは、例えばトランスジェニック動物のミルクから現在得ることができ、かつ薬剤、栄養補足剤等に使用できる。したがって、本発明は、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）を、非ヒト種に対して内因性の血清アルブミンおよび、非ヒト種のミルクホエイ中に通常見出される少なくとも１種の他の蛋白質をまた含むところの、該ｈＳＡの供給源から分離する方法であって、 (a) 該供給源を、界面活性剤の存在中で、該内因性血清アルブミンより強くｈＳＡを結合するリガンドと接触させ、それによってｈＳＡ‐リガンド複合体を製造すること； (b) 該ｈＳＡ‐リガンド複合体を分離すること；および (c) 該分離したｈＳＡ‐リガンド複合体から、ｈＳＡを遊離させることを含む方法を提供する。非ヒト種は、例えばウシであり得る。別の面において、本発明は、非ヒト種アルブミンおよび、該非ヒト種のミルクホエイ中に通常見出される少なくとも１種の他の蛋白質をまた含むところの、その供給源からｈＳＡを分離する際に、界面活性剤ならびに、ｈＳＡと、非ヒト種からの血清アルブミン例えばウシ血清アルブミン（ｂＳＡ）との間に、差別的結合特性を示すリガンドを使用することを提供する。本発明によれば、雌牛のミルクからｈＳＡを精製するための、１つの可能なプロトコールは次のようである。まず、ミルクの皮膜を除き(skimmed)、次いで酸沈殿させてカゼインを除去する。所望ならば、陽イオンビーズ（例えばＦＡＳＴ −Ｓ）をホエイ画分に加えて、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、免疫グロブリンおよび他の微量の陽イオン性蛋白質を除去することができる。得られるホエイを次に、シバクロンブルー‐セファロースカラムに入れる。残るｂＳＡの結合を、例えば０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１％エタノールによって、ｈＳＡの大きな損失なしに、防ぐことができる。ｈＳＡの完全な溶離は、２．５ＭＫＣｌ、１０％エタノール、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．０の存在中で得ることができる。この蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびラジオイムノアッセイによれば、本質的に純粋である。別法において、ｈＳＡおよびｂＳＡを含むホエイ画分または他の供給源は、該リガンドに直接適用でき、カプリレートまたは他の短鎖（例えば炭素原子１２未満の）脂肪酸での、または官能性が同等のもの例えばサリチレートでの溶離を用いて、ｈＳＡがそこから差別的に除去され得る。このように、例えばｈＳＡおよびｂＳＡを含む物質は、緩衝液中で、ブルーセファロースと直接接触されて、ｂＳＡの結合を防ぎ（例えば低い塩濃度、ｐＨ８．０、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）、ブルーセファロースに結合したｈＳＡをカプリレートで溶離することができる。結合したままの物質、例えばｂＬＦ、ラクトペルオキシダーゼは、その後高い塩濃度（例えば２．５ＭＮａＣｌまたはＫＣｌ）で溶離され得る。より一般的な語において、本発明の好ましい実施態様においては、ｈＳＡは、哺乳類のミルクへのｈＳＡの分泌を標的にするＤＮＡを含むトランスジェニック哺乳類のミルクから精製される。そのような哺乳類は好ましくは、ウシである。ｈＳＡが薬剤的に使用されることを意図されるときは、最も高い可能な純度、すなわち好ましくは約９８％を超える純度、より好ましくは９９％を超える純度をもたらす方法が必要とされる。本発明は、そのような要求に合うことを意図する。ここで使用しているとき、「ヒト血清アルブミン」または「ｈＳＡ」は、Ming hetti ら、上記；Lawnら、（1981 年） Nucl ．Acids Res., 9，6103に記載されたのと実質的に同じアミノ酸シーケンスを有し、かつｈＳＡ機能を示すポリペプチドを意味する。したがって、１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換され、挿入され、または除去されている、またはその順序が変えられているが、該機能は保持されているところのシーケンス変更物が包含される。そのミルク中にｈＳＡを発現するように処理された動物からのトランスジェニックミルクは、まず前処理して脂肪を除去してスキムミルクを生成し、または脂肪およびカゼインを除去してホエイを生成する。ウシミルクは大量の脂肪を含み、これは好ましくは、まずカゼインと共にミルクから除去されてホエイ画分を生成する。ミルクから脂肪の除去については、種々の方法が当業者に公知である。特に、例えば濾過または遠心分離により、または伝統的な乳業の実践に従い、冷蔵後に創り出される脂肪の上部層を除去することによって、脂肪をミルクから除去して「スキムミルク」を生成することができる。スキムミルクまたは低脂肪ミルクは次に、好ましくは処理されてカゼインを除去される。ミルクからカゼインの除去については、種々の方法が当業者に公知である。そのような方法のうちの２つは、遠心分離と組合せた酸沈殿およびキモシンを用いた蛋白質分解である。ミルクからカゼインの除去は、好ましくは酸沈殿により行ってホエイを生成する。カゼインが除去された後、種々の他の蛋白質がなお、ホエイまたはホエイ画分中に存在する。ラクトフェリンは、１つのそのようなミルク蛋白質であり、いくつかの実施態様においては、ホエイまたはホエイ画分からｈＳＡを分離するための次の段階が、とりわけラクトフェリンの除去である。しかしながら、本発明によれば（すでに述べたように）、最後の溶離にカプリレートを使用するなら、そのような分離なしに進行することがまた可能である。ラクトフェリンならびに他の陽イオン性ホエイ蛋白質例えば免疫グロブリン、ラクトペルオキシダーゼおよびリゾチームは、ホエイを強カチオン交換樹脂と接触させることによりホエイから除去することができる。「強カチオン交換樹脂」は、広いｐＨ範囲にわたって完全にイオン化される、負に帯電した基を有するクロマトグラフィー樹脂として定義される。これらの基は、増加されたイオン強度で対イオンに交換され得るところの正に帯電した分子（または分子の部分）に結合することができる。種々のそのような樹脂が当分野で知られており、例えばセファロースＢに付けられたサルフェートまたはサルファイト結合基を有するものを包含する。適当な強カチオン交換樹脂は、ＭＯＮＯＳ（商標）またはＦＡＳＴＳ（商標）（ファルマシア(Pha rmacia)）である。カチオン交換樹脂はホエイ中に懸濁させることができ、またはカラムまたはベッドの形状で、または何か他の所望の形状で使用することができる。樹脂で処理した後に残留する画分は、陽イオン性蛋白質を含まないホエイとして集められる。ホエイは、交換樹脂と接触され、続いて陽イオン交換樹脂を、陽イオン性蛋白質を含まないホエイから、例えば遠心分離または重力濾過により、分離することができる。大部分のミルク蛋白質をホエイから除去してしまうと、残留する蛋白質は実質的に、α‐ラクトアルブミン、β‐ラクトグロブリン（ＡおよびＢ）および、血清アルブミン、ｈＳＡおよびｂＳＡである。この段階で、ｈＳＡは、適当なリガンド、例えば担体に結合した染料と接触させることにより分離することができる。有用な染料分子は、トリアジン染料、例えばシバクロンブルー、プロシオンレッド(procion Red)、グリーンフラクトゲル( Green Fractogel)、ラムゾルイエロー(Ramzol Yellow)およびプロシオンターコイズ(Procion Turquoise)である。内因性ｂＳＡからｈＳＡを分離するのに、シバクロンブルーが好ましく使用される。示したように、トリアジン染料は、担体、すなわちゲル物質または固体担体例えばセファロース、紙、シリカ、または当業者に公知の種々の他の物質に結合させた染料として、使用され得る。他の可能なマトリックスは、例えばデキストラン、ポリアクリルアミド、アガロース‐ポリアクリルアミド共重合体、セルロースおよびガラスを包含する。担体物質またはマトリックスは、カラムまたはベッドを含む種々の形に形成され得る。界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ−２０またはカプリレート）の添加は、ｈＳＡおよび内因性ｂＳＡの分離性を改善するのに重要である。界面活性剤は、約０．０５％〜０．２％の濃度で好ましく添加される。界面活性剤は、例えば約０．０５％の濃度で使用され得る。Ｔｗｅｅｎ−２０または他の界面活性剤が、染料‐ 担体複合体と接触する前のホエイに添加され得る。所望なら、緩衝液（例えばバッファーＡ(Buffer A)）中に希釈した後、ホエイを、担体に結合したトリアジン染料と接触させることにより、ｈＳＡ‐染料‐担体複合体を形成させる。残りのホエイは、フロー‐スルー(flow-through)として、例えば染料保持カラムの底で集めることができる。フロー‐スルーは、実質的にすべてのｂＳＡを含み、実質的に全くｈＳＡを含まない。得られるｈＳＡ‐染料‐担体複合体を次に、洗浄溶液と接触させて、ゆるく結合したまたは非特異的に結合した、または結合していない蛋白質をすべて除去することができる。洗浄段階の後、ｈＳＡを溶離することができる。エタノールが溶離溶液に添加される（溶離ピークがより鋭い）なら、結合したｈＳＡの溶離のより大きい効率がしばしば染料複合体から達成される。かくして、溶離溶液は好ましくは約５〜２０％のエタノール、より好ましくは約５〜１５％のエタノールを含む。しかし、これはいつも必要なわけではない。例えば、本明細書の他で述べたカプリレート溶離工程では、そのようなエタノールの添加は必要とされない。溶離溶液中に集められたｈＳＡは、所望ならばさらに、種々の公知法による脱塩および濃縮、例えば透析、限外濾過および凍結乾燥に供することができる。ゲル濾過の使用により、ｈＳＡのダイマーおよびポリマーを除去することができる。したがって、本発明の方法を使用することにより、まず第１に、トランスジェニック動物のミルクから、精製したｈＳＡを得ることが可能である。そのようなｈＳＡは、例えば薬剤組成物または栄養補足剤の処方において有用である。そのような組成物および栄養補足剤およびそれらの製造は、本発明の他の面である。さらに、本発明の方法により製造されたｈＳＡは、血液増量剤または血漿増量剤等として有用である。そのような使用は、本発明の他の面である。実施例の形での以下の記載は、本発明を説明するためにさらに与えられたものであり、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例において、添付図面の種々の図を参照し、かつこれらの実施例の解釈において、以下の情報およびこれらの図に留意した基本的記載を考慮に入れなければならない。図１ラジオイムノアッセイで測定した、ｈＳＡ（Ａ，Ｃ）およびｂＳＡ（Ｂ，Ｄ）の、ブルーセファロースへの結合および溶離（以下の実施例１をみよ）。結合実験（Ａ，Ｂ）：ブルーセファロースＣＬ−６Ｂビーズ（１ｇ／５００ｍｌ）を、示したように、特定のｐＨを有し、異なる量のＫＣｌを含む５０ｍＭトリス‐マレート緩衝液中で洗浄した（３回）。¹²⁵Ｉ‐ｈＳＡまたは¹²⁵Ｉ ‐ｂＳＡを加え、６時間インキュベートし、インキュベーション緩衝液で洗浄（５回）し、そして計数した。溶離実験（Ｃ，Ｄ）：ビーズを洗浄（３回）し、¹²⁵Ｉ‐ｈＳＡまたは¹²⁵Ｉ‐ ｂＳＡの存在中で、０．１ｍＫＣｌ、５０ｍＭトリス‐マレートｐＨ７．０中で、６時間インキュベートした。ビーズを、異なるｐＨを有しかつ種々の量のＫＣｌを含む、５０ｍＭトリス‐マレート緩衝液で洗浄（４回）し、（回転させながら）室温で１時間インキュベートした。ビーズを再び、最後のインキュベーション緩衝液で洗浄（５回）し、計数した。種々の緩衝液での溶離後のヨウ素化された血清アルブミンの結合のパーセントを、ｙ軸に与える。トリス‐マレート緩衝液は、蛋白質の結合特性におけるいかなる変化もなしに、トリス‐ＨＣｌの代りに用いることができる。図２ブルーセファロースカラムでのｈＳＡ（Ａ）およびｂＳＡ（Ｂ）の溶離パターン。純粋な蛋白質（１００μｇ）を、０．１ＭＫＣｌ、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０（バッファーＡ）で予め平衡にされたブルーセファロースカラムに入れた（１ｍｌ／分）。１０分後、３分間で塩濃度を増加させて、０．３８ＭＫＣｌ、１．５％エタノール（１５％バッファーＢ）とし、次いで４分間で、２．５ＭＫＣｌ、１０％エタノール、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０（１００％バッファーＢ）とした。その後、カラムをバッファーＡで再び平衡にした。図３ブルーセファロースカラムでのｈＳＡ（Ａ）およびｂＳＡ（Ｂ）の溶離パターンに対する、Ｔｗｅｅｎ−２０の影響。溶離条件は、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０をバッファーＡに添加し、流速を１ｍｌ／分に増加した以外は、図２の説明文に記載されたのと同じである。図２Ａにおいて、（１５％バッファーＢで溶離している）ｈＳＡの「肩」を最小にするために、第１段階を、０．２５ＭＫＣｌ、１．０％エタノール、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０（１０％バッファーＢ）に減少させた。図４ｈＳＡの不在（Ａ）または存在（Ｂ）中で、（ＦＡＳＴ−Ｓで処理した）雌牛ホエイのブルーセファロースカラムでの溶離パターン。未処理の雌牛ミルクに純粋なｈＳＡを加えた（１ｍｇ／ｍｌ）ものを、実施例で記載したように、脱脂し、カゼインおよび陽イオン性蛋白質を除去した。得られたホエイ画分を、バッファーＡ（０．１ＭＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ− ２０、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０）で希釈（５倍）し、ブルーセファロース６ファストフローカラム（流速１ｍｌ／分）に入れた。第１段階は、１０％バッファーＢで７分間であった。最終段階は、１００％バッファーＢ（２．５ＭＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％エタノール、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０）中で４分間の後、バッファーＡでカラムを再平衡した。図５ｈＳＡ（Ａ）またはｂＬＦ（Ｂ）の不在または存在中で、（ＦＡＳＴＳ処理していない）雌牛ホエイのブルーセファロースカラムでの溶離パターン。未処理の雌牛ミルクに、純粋なｈＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）またはｂＬＦ（１ｍｇ／ｍｌ）のいずれかを加えたものを、脱脂し、カゼインを除去し、ブルーセファロース６ファストフローカラム（流速１ｍｌ／分）に直接入れた（０．４５ｍｌ）。カラムをバッファーＡ（０．１ＭＫＣｌ、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した。１０分後、カラムを１００ｍＭカプリレート、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０で１０分間洗浄し、バッファーＡで６分間再平衡し、そして残りの結合蛋白質を、２．５ＭＫＣｌ、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０、１０％エタノールで溶離した（１０分間）。実施例物質ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ、ブルーセファロース６ファストフロー、Ｓ−セファロース６ファストフロー、ＣＮＢｒ‐活性化セファロース、キレート性セファロース、ＣｏｎＡセファロース、およびヘパリンセファロースを、ファルマシア(Pharmacia)（ウプサラ、スウェーデン）から得た。ｓｓＤＮＡウルトロゲル(ultrogel)は、ＩＢＦビオテクニクス(biotechnics)（ヴィルヌーブーラ- ガレネ(Villeneuve-la-Garenne)、フランス）から得た。ヒトから（Ａ−３７８２）およびウシから（Ａ−０２８１）の血清アルブミン（両方共、本質的に脂肪酸を含まず、かつグロブリンを含まない）、α‐ラクトアルブミン、β‐ラクトグロブリンＡおよびＢは、シグマ(Sigma)（セントルイス、ミズーリ州）から得た。ウシラクトフェリンは、以下に記載したように、ウシのミルクから精製した。Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリ-(オキシエチレン)20 ソルビタン‐モノラウリエート）は、ベイカー(Baker)（デヴェンタール、オランダ）から得た。クロラミンＴおよびＮａ₂Ｓ₂Ｏ₅は、メルク(Merck)（ダルムシュタット、ドイツ）から得た。ｈＳＡに対するモノクローナル抗体は、シダー(Cedar)（ホーンビー、カナダ）から得た。ｈＳＡおよびｂＳＡに対するポリクローナル抗体、ｂＳＡモノクローナル抗体（ｂＳＡ３３）およびテトラグロノロブスプルプレアス(Tetra glonolobus purpureas)からのレクチン(Tetra)、アンギラアンギラ(Anguilla anguilla)からのレクチン(Ali)およびウレックスユーロペウス(Ulex europaeu s)からのレクチン(UEA)は、シグマ(Sigma)（セントルイス、ミズーリ州）から得た。Ｎａ¹²⁵Ｉ（５Ｃｕ／ミリモル）は、アメルシャム(Amersham)（英国）から得た。他のすべての試薬は、少なくとも分析のグレードであった。ウシミルクからウシラクトフェリンの精製ウシラクトフェリンを、ウシミルクから、バッチ抽出法により精製した。固体ＮａＣｌを添加して最終濃度０．４Ｍとし、Ｔｗｅｅｎ−２０を添加して最終濃度０．０２％（体積／体積）とした。リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて２０ｍＭ最終濃度としたが、最終ｐＨは７．５に調整しなかった。ベックマンＪＡ− １０ローター中で、５００ｍｌのポリアロマーチューブで、１６００×ｇにて１０分間遠心分離することにより、ミルク脂肪を除去した。出発緩衝液（０．４ＭＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて平衡にした、パックドＳセファロース(Packed S Sephar ose)（商標）ファストフローを、加工したミルクに、加工したミルク中のラクトフェリン５〜１０ｍｇ当たり充填した樹脂ビーズ約１ｍｌの割合で、加えた。混合物を２０時間撹拌し、そして樹脂ビーズを１６００×ｇにて５分間遠心分離することにより分離した。上澄を除去し、そしてビーズを出発緩衝液の１体積で３回洗浄した。次に樹脂をカラムに注ぎ入れ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．４ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５の１体積で洗浄した。流速１０ｍｌ／分で、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５の（カラムの）１．２５（倍）体積中の、０．４〜１．０ＭＮａＣｌ勾配を用いて、ラクトフェリンをカラムから溶離した。ｂｌＦ調製の純度は９９％より良く、回収率は８０％であった。純度は、ＳＤＳＰＡＧＥ分析および分光分析にて測定した。放射能標識(radiolabelling) クロラミンＴ法、本質的にはハンター(Hunter)とグリーンウッド(Greenwood )［Hunterら、Nature 194（1962年）:495-497］により記載されたようにして、ｈＳＡおよびｂＳＡを放射能標識した。短く言えば、１００μｇのｈＳＡまたはｂＳＡを、１５０μｌのホスフェートで緩衝された塩水中に溶解した。クロラミンＴ（５０μｌ；ホスフェートで緩衝された塩水中０．４ｍｇ／ｍｌ）およびＮａ¹²⁵Ｉ（１０μｌ）を加え、１分間インキュベートし、そしてＮａ₂Ｓ₂Ｏ₅（５０μｌ；ホスフェートで緩衝された塩水中１ｍｇ／ｍｌ）を用いて標識を停止した。担体蛋白質として、ｈＳＡの標識のために２％ｂＳＡ溶液または、ｂＳＡの標識のために２％ｈＳＡ溶液（１００μｌ）を加えた。試料をゲル濾過カラム（２５×１．５cmカラム；３５ｍｌのＳ−３００の頂上に５ｍｌのＧ２５ビーズ；ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）に入れた。カラムを、ホスフェートで緩衝された塩水、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．３％ｂＳＡ（またはｈＳＡ）、１ＭＮａＣｌで洗浄し、１ｍｌの画分を集めた。標識効率は＞８５％であった。抗ｈＳＡおよびｂＳＡＰｏＡｂは、標識の前に最初に精製された：ＰｏＡｂを含む血清を、アンモニウムサルフェート（５０％）沈殿させ、上澄をＰＢＳに対して透析（１晩）した。抗ｈＳＡおよびｂＳＡが結合したセファロースをそれぞれ、アフィニティ精製した後、抗ｈＳＡおよびｂＳＡＰｏＡｂを、通常ウシ血清が結合したセファロースまたは通常ヒト血清が結合したセファロースを用いてバッチ式でインキュベートして、交差反応しているＡｂを除去した。得られたＰｏＡｂは、抗ｈＳＡＰｏＡｂ（ＡｂＮＢＳ）または抗ｂＳＡＰｏＡｂ（ＡｂＮＨＳ）と呼ばれる。蛋白質（１００μｇ）を、２％の通常ウサギ血清を担体蛋白質として添加した以外は、上記したように標識し、蛋白質をＰＤ１０ゲル濾過カラムにて、ＰＢＳ、０．３％通常ウサギ血清、０．０２％ＮａＮ₂緩衝液で溶離した。種々のセファロースの調製抗ｈＳＡ（Ｃｅｄａｒ）Ａｂを含む腹水を、アンモニウムサルフェート（５０％）沈殿させ、上澄をＰＢＳに対して透析（１晩）した。抗ｂＳＡ（ＢＳＡ３３）腹水を、０．１Ｍトリス‐ＨＣｌｐＨ８．９で、プロテインＡセファロースカラムに入れた。カラムをまず、０．１Ｍクエン酸ＮａｐＨ５．５で洗浄して、汚染しているＡｂを除去した。ＢＳＡ３３Ａｂを０．１Ｍクエン酸ＮａｐＨ４．５で溶離し、そしてＰＢＳに対して透析した。抗ｈＳＡまたはｂＳＡＰｏＡｂを含む血清を、アンモニウムサルフェート（５０％）沈殿させ、上澄をＰＢＳに対して透析（１晩）した。抗ｈＳＡおよびｂＳＡＰｏＡｂを、通常ウシ血清が結合したセファロースまたは通常ヒト血清が結合したセファロースのいずれかを用いてバッチ式でインキュベートして、交差反応しているＡｂを除去した。抗体およびレクチンを、次のようにしてセファロースに結合させた：ＣＮＢｒ活性化セファロース（０．５ｇ）を、５０ｍｌの１ｍＭＨＣｌｐＨ３．０に溶解し、そして１５分間（回転させながら）インキュベートした。ビーズを、同じ溶液（５０ｍｌ）で洗浄し、そしてホスフェートで緩衝した塩水（５０ｍｌ）で洗浄した。抗体またはレクチンを加え（〜２ｍｇ）、４℃で１晩（回転させながら）インキュベートし、そしてホスフェートで緩衝した塩水で洗浄した（３回）。その後、ビーズを、０．５ＭグリシンｐＨ８．５で洗浄し、同じ溶液（５０ｍｌ）で２時間インキュベートした。ビーズを、ホスフェートで緩衝した塩水で洗浄し（５回）、最終的に２５０ｍｌのホスフェートで緩衝した塩水、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０２％ＮａＮ₃中に取って、４℃で貯蔵した。金属セファロースを次のように調製した：３ｍｌのキレート性セファロースを、（２回蒸留した）水で２回、１ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＥＤＴＡｐＨ７．４で２回洗浄し、そして室温で、同じ緩衝液中で１５分間（回転させながら）インキュベートした。ビーズを再び水で洗浄（６回）した。３０ｍＭ金属塩化物溶液３０ｍｌを加え、４℃で１晩（回転させながら）インキュベートした。ビーズを水で（３回）洗浄し、そしてホスフェートで緩衝した塩水、０．１％Ｔｗｅｅｎ −２０、０．０２％ＮａＮ₃で洗浄した。ビーズを最後の緩衝液２００ｍｌ中に取り、４℃で貯蔵した。アルブミンラジオイムノアッセイｈＳＡＲＩＡ：ＣｎＢｒ活性化セファロース（１１ｍｇ蛋白質／ｇセファロース／１リットルのＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）に結合した、０．５ｍｌのＣｅｄａｒ抗ｈＳＡモノクローナルＡｂを、力価測定された標準ｈＳＡ溶液（５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ等）または試験すべき試料の５０μｌで１晩インキュベートした。ＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄した後、¹²⁵Ｉ‐抗ｈＳＡＰｏＡｂ（ＡｂＮＢＳ）を加え（〜２０，０００ｃｐｍ）、６時間インキュベートし、再び洗浄（４回）し、そしてビーズに結合した放射能活性を測定した。ｂＳＡ（５０μｌ、５ｍｇ／ｍｌ）は、このアッセイでは結合しない。ｂＳＡＲＩＡ：ＣｎＢｒ活性化セファロース（１．３ｍｇ蛋白質／ｇセファロース／５００ｍｌのＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）に結合した、０．５ｍｌの抗ｂＳＡモノクローナルＡｂ（ｂＳＡ３３）を、力価測定された標準ｂＳＡ溶液（５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ等）または試験すべき試料の５０ μｌで１晩インキュベートした。ＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄した後、¹²⁵Ｉ‐抗ｂＳＡＰｏＡｂ（ＡｂＮＢＳ）を加え（〜２０，０００ｃｐｍ）、６時間インキュベートし、再び洗浄（４回）し、そしてビーズに結合した放射能活性を測定した。ブルーセファロースラジオイムノアッセイ結合実験：アフィニティセファロースビーズ（０．５ｍｌ）を、上記した図の説明に示したように種々の緩衝液で洗浄（３回）した。¹²⁵Ｉ−ｈＳＡまたは¹²⁵Ｉ−ｂＳＡ（５０μｌ；〜１０，０００ｃｐｍ）を加え、室温で（回転させながら）６時間インキュベートした。ビーズを、インキュベーション緩衝液１ｍｌで洗浄（５回）し、そしてビーズに結合した放射能活性を、ＬＫＢワレス (Wallace) １２６１マルチガンマシンチレーションカウンターで測定した。溶離実験：¹²⁵Ｉ−ｈＳＡまたは¹²⁵Ｉ−ｂＳＡを、（上記の図の説明に示した）最適条件下で、（回転させながら）室温で６時間、ビーズに結合させた。次に、ビーズを、他に示さなければ種々の量のＫＣｌの存在または不存在中で、１ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄（４回）し、１時間インキュベートし、そして最後のインキュベーション緩衝液で洗浄（５回）した。ビーズに結合した放射能活性を上記したように測定した。ブルーセファロース６ファストフローカラムクロマトグラフィー蛋白質を濾過（０．４５μｍ、シュライヒャーアンドシェル(Schleicher and Schull)）し、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア）を用いて、ブルーセファロース６ファストフローＨＲ５／５カラム（樹脂１ｍｌ）に施与した。カラムを種々の量のバッファーＡ（組成：実施例参照）で洗浄した後、バッファーＢ（組成：実施例結果参照）の１ブロックまたは直線状の勾配を適用して結合蛋白質を溶離した。流速は、他に示さなければ、１ｍｌ／分であった。０．５ｃｍのフローセルを用いて２８０ｎｍにて吸収測定することによりピークを監視し、ファルマシア、ウプサラ、スウェーデンのプログラムＦＰＬＣディレクター（バージョン１．０３）を用いてコンピュータ分析した。実施例１ｈＳＡおよびｂＳＡのセファロースへの結合放射能標識したｈＳＡおよびｂＳＡの、ブルーセファロースおよび他のセファロースへの結合を、ラジオイムノアッセイで測定した（表２）。セファロースビーズに結合したｈＳＡおよびｂＳＡに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、ｈＳＡおよびｂＳＡを非常に特異的に結合する。グリシンセファロースおよびヘパリンセファロースへは、結合が観察されなかった。血清アルブミンはグリコシル化されていないので、レクチンセファロースへの結合の不在が予測された。試験した金属セファロースのうち、Ｃｕ²⁺−セファロースのみが、ｈＳＡおよびｂＳＡの両方に結合する。（高価な）抗体セファロースの他に、ｈＳＡに対して高い親和性を有し、かつｂＳＡに対してより低い親和性を有する唯一のセファロースが、ブルーセファロースである（表２−以下を見よ）。このように、ブルーセファロースは、ｈＳＡおよびｂＳＡの分離のための理想的候補である。ブルーセファロースクロマトグラフィーはまた、大規模化が容易である。放射能標識したｈＳＡおよびｂＳＡの、ブルーセファロースビーズへの結合特性をラジオイムノアッセイで測定した。０．１ＭＫＣｌ、ｐＨ７．０の塩濃度にて、約８５％の¹²⁵Ｉ−ｈＳＡがマトリックスに結合した（図１Ａ）。この条件下で、¹²⁵Ｉ−ｂＳＡの結合は、約３０％であった（図１Ｂ）。¹²⁵Ｉ−ｈＳＡの結合は特異的にかつ完全に、「低温(cold)」ｈＳＡにより妨げられることができ、一方、過剰の「低温(cold)」」ｂＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）の阻害効果はたった１２％であった（結果は示されていない）。ｈＳＡおよびｂＳＡの相互作用は部分的に、静電気的性質を有する。塩濃度を２．５ＭＫＣｌ（ｐＨ７．０）に増加させると、ほぼ完全に（８７％）ｂＳＡ結合を妨げるが、ｈＳＡ結合を２９％減少させる（図１Ａ）。しかしながら、最適条件（５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ７．０、０．１ＭＫＣｌ）下でｈＳＡがビーズに結合させられ、次いでビーズが、増加する塩強度を有する緩衝液で洗浄されるとき、最大で約７０％の結合したｈＳＡが溶離される（図１Ｃ）。対照実験において、ＮａＣｌは、ＫＣｌと比べて、ビーズから蛋白質を除去することに効率が小さいことがわかった（表３−以下を見よ）。 Leatherbarrow とDean［Biochem．J．189（1980年）:2 7-34］によりまた観察されたように、ｈＳＡおよび特にｂＳＡの結合は、ｐＨに依存する。低い塩濃度では、ｐＨの影響（ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５で試験した）はｈＳＡの結合については最小である（図１Ａ）。ｐＨ８．５では、ｈＳＡの結合はいくらか減少される。しかし、ｂＳＡの結合はｐＨ６．０〜６．５で最適であり、ｐＨ８．５では６５％について妨げられる（図１Ａ，Ｂ）。ｐＨが増加すると、ｈＳＡの結合および溶離における塩の影響が明らかに減少し、ｈＳＡとシバクロンブルーとの相互作用において疎水性の部位が重要な役割を演じることを示唆する（図１Ａ，Ｃ）。ｂＳＡについてはそのような影響は観察されない（図１Ｂ，Ｄ）。疎水性の相互作用を減少するために、エタノールを緩衝液に加えた。表４に示したように、２．５ＭＫＣｌと一緒の１０％エタノールは、ビーズからｈＳＡおよびｂＳＡを完全に溶離したが、１％エタノールは効率が小さかった。これらの結果は、ｐＨ８．０、０．１ＭＫＣｌで、ｈＳＡがシバクロンブルーに最大に結合するが、ｂＳＡの全結合はたった１５％であることを示す。２．５ＭＫＣｌおよび１０％エタノールの存在中で、すべてのｈＳＡが染料から溶離するであろう。これらの結果は、シバクロンブルーセファロースカラムで、ｈＳＡおよびｂＳＡの分離についての出発点として使用された。カラムクロマトグラフィー図２Ｂに示したように、注入したｂＳＡの部分は、ブルーセファロース６ファストフローカラムに結合しない。予期されないことに、ほとんどのｂＳＡが１．５％エタノール、０．３８ＭＫＣｌ（５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０中）で溶離し、一方、いくらかのｂＳＡは、１０％エタノール、２．５ＭＫＣｌを用いて溶離する。ラジオイムノアッセイと比べたこの差異はおそらく、アッセイが行われる異なるやり方によるものである：カラムクロマトグラフィーでの比較的多量の蛋白質と比べて、少量の標識された蛋白質をラジオイムノアッセイで使用した。そしてさらに、ＲＩＡではより多い洗浄段階が適用された。ｈＳＡは、カラムに強固に結合している（図２Ａ）。ｈＳＡのほとんどが、１０％エタノール、２．５ＭＫＣｌで溶離され；少量が結合しない、または１．５％エタノール、０．３８ＭＫＣｌで溶離する。手順は、次のやり方が最適であった：０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を注入前の蛋白質、およびカラムの平衡に使用する初期の低塩緩衝液（バッファーＡ）に加えた。非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０は、疎水性相互作用を壊す。図３Ｂに示したように、ｂＳＡのほとんどがフロースルー中に検出されるので、Ｔｗｅｅｎ−２０は、ｂＳＡのカラムへの結合を著しく減少させる。引き続く１．０％エタノール、０．２５ＭＫＣｌの段階は、残りの結合ｂＳＡを容易に溶離する。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０の存在は、ｈＳＡの結合にほとんど影響しない；少量のｈＳＡのみが結合せず、または１．０％エタノール、０．２５ＭＫＣｌで溶離する（図３Ａ）。この結果は、ｈＳＡおよびｂＳＡは、ブルーセファロースカラムを用いて分離できることを示す。ブルーセファロースカラムでの精製した蛋白質のスパイクＦＰＬＣシステム（ファルマシア）に接続したブルーセファロースカラムにおけるいくつかの（精製した）蛋白質の結合特性を、より詳細に研究した。５００μｇのｈＳＡおよびｂＳＡ（両方共、本質的に脂肪酸を含まず、グロブリンを含まない）および他のミルクおよび血漿蛋白質を、バッファーＡ（０．１ＭＫＣｌ、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０、０．２０％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で、カラムに入れ、結合した蛋白質を、バッファーＢ（２．５ＭＫＣｌ、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０、１０％エタノール）の直線状の勾配（３０ｍｌ、０．２ｍｌ／分）で溶離した。表１でわかるように、ヒトおよびウシのラクトフェリン（それぞれｈＬＦおよびｂＬＦ）は、ブルーによく結合する：カラムからトップフラクション(top fraction)を溶離するのに、約０．９Ｍおよび１．４ＭＫＣｌが必要である。ラクトフェリンが関連する分子、ヒトトランスフェリンは、これらの条件下ではカラムに結合しない。ウシラクトペルオキシダーゼは、カラムに結合し、０．３３ＭＫＣｌで溶離する（トップフラクション）。ｈＬＦ、ｂＬＦおよびウシラクトペルオキシダーゼのブルーへの結合、および塩を用いてのこれらの蛋白質の溶離は、先に報告されている（Bezwod a ら、Clin．Chim．Acta 157（1986年）:89-94；Bezwoda ら、Biomed．Chromat ． 3（1989年）:121-126；Furmanski ら、J．Exp．Med. 170（1989年）:415-429 ；Shimazaki ら、J．Dairy Sci 74（1991年）:404-408）。ｈＳＡ（トップフラクション）の溶離のために、約０．４３〜０．４６ＭＫＣｌが必要とされる（表１）。ヒト免疫グロブリン画分（ＩｇＧ）はまた、ブルーと弱く相互作用し、低い塩濃度で溶離される（表１）。延ばされた時間カラムをバッファーＡで洗浄すると、ＩｇＧはおそらく、もはや結合しないであろう。３つの主なミルク蛋白質、ウシαラクトアルブミン、βラクトグロブリンＡおよびＢは、ブルーに結合しない。ウシのαＳカゼイン、βカゼインおよびκカゼインの結合は、より複雑である。βカゼインは、ブルーと非常に弱く相互作用する。カラムをより長い時間バッファーＡで洗浄すると、この相互作用は、おそらく妨げられ得る。αＳおよびκカゼイン調製品の両方が、部分的にブルーに結合しているが、これらの蛋白質は他のミルク蛋白質で汚染されるので、溶離プロファイルの説明は困難である。バッファーＢ（２．５ＭＫＣｌ、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０±１０％エタノール）中のエタノールは、精製した蛋白質の溶離に必要とされる塩の量に少し影響を及ぼす：約６％（ｈＬＦ）、１７％（ｂＬＦ）および９％（ｈＳＡ）より多い塩が、エタノール不在の場合、これらの蛋白質を溶離するのに必要とされる。一般に、蛋白質はまた、エタノールの存在中で、より鋭いピークで溶離する（〜１０％さらに鋭い；示されていない）。１．４倍（ｈＬＦ、ｂＬＦ）〜１．６倍（ｈＳＡ）多いＮａＣｌが、溶離に必要とされる（示されていない）けれど、ＫＣｌをＮａＣｌの代わりに用いることができる。ｂＳＡ‐ブルー相互作用は、Ｔｗｅｅｎ−２０に対して非常に敏感である（図２および３を見よ）。Ｔｗｅｅｎ−２０が不在のとき、約４０％のｂＳＡがブルーカラムに結合しなかった。Ｔｗｅｅｎ−２０の濃度を０．０５％（〜０．４ｍＭ）に増加すると、非結合ｂＳＡのパーセンテージが約９６％に増加した。ｈＳＡ‐ブルー相互作用は、Ｔｗｅｅｎ−２０に対してほとんど敏感でなかった：約２％ｈＳＡが、Ｔｗｅｅｎ−２０が不在のときブルーに結合せず、バッファーＡ中に０．０５〜０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０が存在するとき、約１４％が結合しなかった。バッファーＡ中のＴｗｅｅｎ−２０の濃度を０．５％に上げると、約４４％のｈＳＡが少しも結合せず、さらに３０％のｈＳＡが、たった５％のバッファーＢ（０．１２５ＭＫＣｌ、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌｐＨ８．０、０．５％エタノール）で溶離される。Ｔｗｅｅｎ−２０は、ラウレート、ミリステート、およびパルミテートのような長鎖脂肪酸基を含む。長鎖脂肪酸について高い親和性結合部位が、アルブミンに存在することが知られている（Ｋａ：10⁶〜10⁸ Ｍ^-1 ；総説、Spector，J．Lipid Res. 16（1975 年）165-179 ；Richieriら、Bioc hem. 32（1993 年）7574-7580 ；総説Carter and Ho，Adv．Prot．Chem．45（19 94年）153-203）。興味深いことに、短鎖脂肪酸カプリル酸（オクタノエート）は、ブルーに結合したｈＳＡおよびｂＳＡの両方を特異的に溶離した（表１；バッファーＡは、ｂＳＡにブルーへの結合を許すために、５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０を含むのみであることに注意）。試験した他の蛋白質については、効果は見出されなかった（表１）。ｂＳＡの溶離を始めるのに必要とされるカプリレートの濃度は、０．３〜０．５ｍＭであり、一方、ｈＳＡは２〜８ｍＭカプリレートで溶離し始めた。トップフラクションは、ｂＳＡおよびｈＳＡについてそれぞれ、４〜５ｍＭおよび１４〜１５ｍＭカプリレートで溶離した。おそらく、カプリレートは非常に速くアルブミンに結合し、そして直接的または間接的にアルブミン‐ブルー相互作用を阻害する。カプリレートは、シバクロンブルーからｈＳＡを溶離する前に使用されてきた（Harveyら、In:Separation of Plasma Proteins．Ed．Cu rling J.M.,ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン（1983年）pp79-88）。種々のセファロース500 μｌへの、¹²⁵Ｉ−ｈＳＡおよび¹²⁵Ｉ−ｂＳＡ（10,0 00 cpm）の結合を、いずれかのホスフェートで緩衝した塩水、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０５％ポリブレン(polybrene)中で、αｈＳＡＭｏＡｂ-（Cedar，0.5g/500ml）、αｈＳＡＰｏＡｂ（ＡｂＮＢＳ）（＋１％通常のウシ血清；0.5g/500ml）、およびαｂＳＡＰｏＡｂ（ＡｂＮＨＳ）（＋１％通常のヒト血清；0.5g/500ml）セファロースについて測定した。ホスフェートで緩衝した塩水、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中の、グリシン‐（1g/500ml）セファロースおよびヘパリンセファロース（1g/500ml）。０．１ＭＫＣｌ、１０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．０中の、ブルーセファロースＣＬ６−Ｂ（0.5g/500ml）。０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０中で：Ｆｅ²⁺‐（1.7g/125ml）、Ｆｅ³⁺‐（1.7g/125ml）、Ｃｕ²⁺‐（1.7g/500ml）、Ｚｎ²⁺（1.25g/125ml）セファロース。ホスフェートで緩衝した塩水、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０中で：ＣｏｎＡ‐（2ml ビーズ／25 0 ml）、ｓｓＤＮＡ‐（2ml ビーズ／250ml）、Ａｌｉ‐（0.5gセファロース／250 ml）、ＵＥＡ‐（2ml ビーズ／250 ml）およびＴｅｔｒａ‐（2ml ビーズ／250 ml）セファロース。（回転しながら）６時間インキュベーション後、ビーズをインキュベーション緩衝液で洗浄（５回）し、計数した。結合パーセントは、加えた、標識したｈＳＡまたはｂＳＡの全量に対してである。結合実験：ブルーセファロースＣＬ−６Ｂビーズ（１ｇ／５００ｍｌ）を、図に示した種々の量のＫＣｌまたはＮａＣｌの存在中、５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．０で洗浄（３回）した。¹²⁵Ｉ−ｈＳＡまたは¹²⁵Ｉ−ｂＳＡを加え、室温で（回転させながら）６時間インキュベートした。ビーズをインキュベーション緩衝液で洗浄（５回）し、ビーズに結合した放射能活性を測定した。溶離実験：¹²⁵Ｉ−ｈＳＡまたは¹²⁵Ｉ−ｂＳＡを、最適条件（５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．０、０．１ＭＫＣｌまたはＮａＣｌ）下で、（回転させながら）室温で６時間ビーズに結合させた。ビーズを次に、種々の量のＫＣｌまたはＮａＣｌの存在中、５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．０で洗浄（４回）し、１時間インキュベートし、そしてインキュベーション緩衝液で洗浄（５回）した。ビーズに結合した放射能活性を測定した。結合実験：ブルーセファロースＣＬ−６Ｂビーズ（１ｇ／５００ｍｌ）を、種々の量のＫＣｌおよびエタノールの存在中、０．１ＭＮａＰｉｐＨ７．０で洗浄（３回）した。¹²⁵Ｉ−ｈＳＡまたは¹²⁵Ｉ−ｂＳＡを加え、室温で（回転させながら）６時間インキュベートした。ビーズをインキュベーション緩衝液で洗浄（５回）し、ビーズに結合した放射能活性を測定した。溶離実験：¹²⁵Ｉ−ｈＳＡまたは¹²⁵Ｉ−ｂＳＡを、最適条件（０．１ＭＮａＰｉｐＨ７．０、０．１ＭＫＣｌ）下で、（回転させながら）室温で６時間ビーズに結合させた。ビーズを次に、種々の量のＫＣｌおよびエタノールの存在中、０．１ＭＮａＰｉｐＨ７．０で洗浄（４回）し、３０分間インキュベートし、そしてインキュベーション緩衝液で洗浄（５回）した。ビーズに結合した放射能活性を測定した。エタノール不在で、０．１ＭＫＣｌ、０．１ＭＮａＰｉｐＨ７．０緩衝液を用いた対照実験は、７９％のｈＳＡおよび４６％のｂＳＡがビーズに結合し、同じ緩衝液での溶離後、７９％のｈＳＡおよび４０％のｂＳＡがビーズに結合したままであったことを示した。実施例２この実施例は、未処理の雌牛ミルク中でスパイク(spike)されたｈＳＡを精製するやり方を記載するが、より有効なやり方（Ｓ−セファロースを省略）は、引き続く実施例で与えられる。ｈＳＡ‐スパイクされた未処理のウシミルクからｈＳＡ画分の精製新たに受け取った未処理のウシミルクを等分し、-８０ ℃で凍結させた。解凍した後、１ｍｇ／ｍｌのｈＳＡ単独、１ｍｇ／ｍｌのｂＳＡ＋１ｍｇ／ｍｌのウシラクトフェリン、ｈＳＡ、ｂＳＡおよびウシラクトフェリンの組合せ、またはホスフェートで緩衝した塩水のみのいずれかを、１０ｍｌのミルクに加え、渦巻撹拌し、そして室温で３０分間インキュベートした。ミルクを、１０℃で遠心分離する（１５，０００ｒｐｍ、１５分）ことにより脱脂した。スキムミルクをＨＣｌでｐＨ４．７にし、４０℃で３０分間インキュベートし、そして４℃で遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、３０分）した。固体Ｎａ₂ＨＰＯ₄を用いて（最終濃度５０ｍＭ）、上澄のｐＨを６．０に調整し、そして再び４℃で遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分）した。上澄に、水で２倍に希釈したＳセファロースファストフロービーズ（ＦＡＳＴ−Ｓ）２ｍｌを加え、（回転させながら）室温で３０分間インキュベートし、そして遠心分離（１０００ｒｐｍ、２分）した。得られたホエイ画分を、バッファーＡ（上記の図の説明を見よ）で５倍に希釈し、濾過（０．４５μｍ、シュライヒャーアンドシェル）し、２ｍｌを上記したように、ブルーセファロース６ファストフローカラムに注入した。実施例３雌牛ミルクからｈＳＡの精製過剰のｂＳＡおよびウシラクトフェリン（共に１ｍｇ／ｍｌ）の存在中または不在中で、ｈＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を未処理の雌牛ミルクに加えた。室温で３０分間のインキュベーションの後、ミルクを脱脂した。スキムミルクをｐＨ４．７にしてカゼインを沈殿させた。得られたホエイ画分をｐＨ６．０にし、強カチオン交換樹脂（ＦＡＳＴ−Ｓ）をバッチ式に加えて、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、免疫グロブリンのような陽イオン性蛋白質および少量で存在する他の陽イオン性蛋白質を除去した。ヒトおよびウシのラクトフェリンは共に、シバクロンブルーに強く結合することが知られている［Bezwoda ら、Clin．Chim．Acta 157（1986年）:89-94；Bezw oda ら、Biomed．Chromat．3（1989年）:121-126；Furmanski ら、J．Exp．Med ．170（1989年）:415-429；Shimazaki ら、J．Dairy Sci．74（1991年）:404-40 8］。残存するホエイ画分中に、α‐ラクトアルブミンおよびβ‐ラクトグロブリン（ＡおよびＢ）がなお存在する。しかし、純粋なα‐ラクトアルブミンおよびβ ‐グロブリンＡおよびＢは、使用した条件下では、ブルーセファロース６ファストフローに結合しない。かくして、残存するホエイ画分を、バッファーＡ（０．１ＭＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０）の４体積で希釈し、ブルーセファロースカラムに直接入れた。対照ホエイ（ｈＳＡ不在）の典型的ランを図４Ａに示す。ほとんどの蛋白質はカラムに結合しない；少量が、１％エタノール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２５ＭＫＣｌｐＨ８．０で溶離する。このピークは部分的にいくらかｂＳＡを含む（結果は示されていない）。他の蛋白質が何であるかは現在のところ不明である。しかし、いくつかのホエイ蛋白質が、２．５ＭＫＣｌ、１０％エタノール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いてカラムから溶離する。これを防ぐために、０．２５ＭＫＣｌ、１．０％エタノールの段階の長さを増加させることにより、および／またはバッファーＡ中の界面活性剤および／または塩（の量）を変化させることにより、手順を最適化することができる。ｈＳＡを含むホエイにおいて、１つのピークが、１０％エタノール、２．５ＭＫＣｌで溶離する（図４Ｂ）。このピークは、ｂＳＡのような他の蛋白質で汚染されるであろう。完全な分離を得るために、上記したように手順を最適化することができ、または試料をブルーセファロースに再ランすることができる。実施例４雌牛ミルクからｈＳＡの精製のためのさらなる方法ｈＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を未処理の雌牛ミルクに加え、４℃で１晩インキュベートした。対照として、未処理のミルクを、１ｍｇ／ｍｌのｂＳＡまたはｂＬＦのいずれかを用いてスパイク(spike)した、または全くスパイクしなかった。低速遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）によりミルクを脱脂し、高速遠心分離（１７，０００ｒｐｍ、６０分）によりカゼインを除去した。試料を濾過（０．４５μ ｍ）し、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア）に接続したブルーセファロースカラムに入れた。（ほとんどの）ｂＳＡのカラムへの結合を防ぐために、バッファーＡは、０．１ＭＫＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含んでいた。結合した蛋白質をまず、１００ｍＭのカプリレート、５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０で溶離した（バッチ式）。カプリレートで溶離されなかった蛋白質は、２．５ＭＫＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０、１０％エタノールを含む緩衝液で溶離された（バッチ式）。図５Ａに示したように、対照（スパイクされていない）ホエイは、ほとんどの蛋白質がカラムに結合せず、少量の蛋白質がカプリレートで溶離し（おそらく残りの結合したｂＳＡを示す）、かつかなりの量の蛋白質が２．５Ｍの塩段階で溶離するところの溶離パターンを示す。高い塩濃度で溶離する蛋白質はおそらく、ｂＬＦ、ラクトペルオキシダーゼ、および免疫グロブリン（およびもしかするといくらかの残りのカゼイン）である。カプリレートがここで、結合したｈＳＡを溶離する（図５Ａ）以外は、同じ溶離プロファイルが、ｈＳＡ‐スパイクされたミルクについて得られた。このＡ２８０ピークにおけるｈＳＡの量の計算（０．５３のｈＳＡのＡ２８０吸光係数（１ｃｍ、０．１％）について補正した）は、ｈＳＡの＞９０％がカラムに結合し、カプリレートで溶離され得ることを示す。対照ホエイについて、カプリレートで溶離された少量の蛋白質が（残りの）ｂＳＡであるなら、約２０μｇのｂＳＡがこの画分に存在することが計算され得る（０．６６７のｂＳＡのＡ２８０吸光係数（１ｃｍ、０．１％）について補正したＡ２８０ピーク）。（ＲＩＡの）厳密な測定がなおなされなければならないけれど、これらの実験は、雌牛ミルクから精製したｈＳＡは５％未満のｂＳＡを含むであろうこを示す。ブルーカラムからカプリレートで溶離された、ｈＳＡ‐スパイクされたミルクのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１２．５％、ファストゲル(Fastgel)）は、優勢なｈＳＡモノマーおよびいくらかの（＜５％）ダイマーを示した。モノマー‐ダイマー比は、スパイク実験で使用した（シグマの）精製されたｈＳＡ調製物と等しく、ブルーカラムは、モノマーおよびダイマーの両方を結合することを示した。カプリレートで溶離されたｈＳＡはなお、少量の汚染のｂＳＡ（対照ホエイ）およびいくらかのより低分子量蛋白質を含む。ｂＳＡ‐スパイクされたホエイの溶離パターンは、対照ホエイに比べて、カプリレートで溶離される蛋白質の量に少しの増加を示す（示されていない）。この増加が、単にスパイクしたｂＳＡによるなら、ｂＳＡのこの量は、カラムに入れた量の＜１０％であることが計算され得る（定量的ＲＩＡがなお行われなければならない）。ｂＳＡ結合は、バッファーＡでのより大量の洗浄によって、またはＴｗｅｅｎ−２０および／または塩の量を少し変更することによって、またはカプリレートをｍＭ量添加することによって、おそらく減らされ得る。ｂＬＦ‐スパイクされたホエイの溶離パターンは、ここでｂＬＦが高い塩濃度の段階で溶離する以外は、スパイクされていない対照ミルクと正確に同じである（図５Ｂ）。溶離プロファイルに従って、約５４％のｂＬＦをこの段階で回収することができた（１．１のａｐｏ−ｂＬＦのＡ２８０吸光係数（１ｃｍ、０．１％）について補正したＡ２８０ピーク）。ｂＬＦはκカゼインに結合するようなので、残存するｂＬＦはおそらく、カゼイン沈殿段階で除去される。（ｈＳＡおよびｂＳＡについての）ＲＩＡがなお行われなければならないけれど、ｈＳＡを含むホエイを適当な条件下でブルーセファローズビーズに直接接触させて、ｈＳＡをｂＳＡおよび他の蛋白質から、単一のクロマトグラフィー段階で分離できると思われる。汚染物はおそらく、ブルーカラムへの再ラン、次いでゲル濾過によって除去できる。・・・・・・・・・・・上記の実施例からの結果は、ｈＳＡは、ｂＳＡより著しく強固にシバクロンブルーに結合することを示す。ｂＳＡの結合は、ｈＳＡに比べて、ｐＨ、塩強度、Ｔｗｅｅｎ−２０およびカプリレートにおける変化を受けやすかった。ｈＳＡに位置していたいくつかの部位が、金属、脂肪酸（長鎖）、ビリルビン、およびいくつかの他の有機分子の結合に影響を与え（CarterとHoによる総説、Adv．Prot．Chem. 45（1994 年）153-203）：ドメインＩＩＡはビリルビンの結合のための第１の部位であり；ドメインＩＩＩＡは（ＩＩＡと共に）小さい複素環式および芳香族のカルボキシレートの結合のための第１の部位であり；そして、長鎖脂肪酸のための高い親和性結合部位はドメインＩＢおよびＩＩＩＢ、およびもしかするとＩＩＩＡに位置すると思われる。最後の３つの部位の正確な位置については論争があるけれども。ビリルビンが、ｂＳＡ‐ブルー相互作用には影響を及ぼさないが、ｈＳＡ‐ ブルー相互作用を妨げることが示唆されてきた（Leatherbarrow とDean、Bioche m．J．189（1980 年）27-34）。しかしながら、同じグループは、これらの結果を再度生じることができなかった（Metcalf ら、Biochem．J．199（1981 年）46 5-472）。明らかに、この部位は、血清アルブミンとブルー染料との相互作用に影響を与えない。ｂＳＡのブルーへの結合は、長鎖脂肪酸（パルミテート、ミリステートおよびラウレート）でアルブミンを前インキュベーションすることにより、広い範囲に妨げることができ、一方、ｈＳＡの結合はほとんど影響されないことが報告されてきた（Leatherbarrow とDean、Biochem．J．189（1980 年）27 -34；Metcalf ら、Biochem．J．199（1981 年）465-472）。ブルーセファロースで、ｈＳＡ‐スパイクされた雌牛ミルク（〜１５μＭ）から精製したｈＳＡの我々の結果は、これらの発見を確認した。雌牛のホエイ中の遊離の脂肪酸濃度（第１に長鎖脂肪酸）は、約３０〜１２５μＭであり（Edelstenによる総説、Meat Science ，Milk Science，and Technology．Eds．H.R．Cross & A.J．Overby．Elsevier, アムステルダム(1988 年)pp.175-199）、脂肪酸‐アルブミン相互作用がミリセカンド（1/1000秒）で生じる（トリプトファン蛍光の消光により測定；Richieri ら、Biochem．32（1993 年）7574-7580）ので、スパイクされた脱脂ｈＳＡ分子上の理論的にすべてまたはほとんどの高親和性の脂肪酸結合部位が、ブルー染料と接触する前に占有されることが、推断され得る。なお、ほとんどすべての（＞９０％）ｈＳＡがブルーカラムに結合する（実施例を見よ）。ｈＳＡと比べて、ｂＳＡのブルーへの結合はまた、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０に著しく敏感であった（〜４００μＭ未満のＴｗｅｅｎ−２０はすでにほぼ完全に、ｂＳＡのブルーへの結合を妨げる；我々の結果）。Ｔｗｅｅｎ−２０はおそらく、その脂肪酸（主としてラウレートおよびミリステート）側鎖を通してアルブミンに結合する。これらの結果は、ｂＳＡが、高親和性長鎖脂肪酸結合部位の１つを経てブルーに結合することを示唆する。ｈＳＡの結合は、主としてこれらの部位を経て生じないが、ｈＳＡ‐ブルー相互作用は、高濃度の長鎖脂肪酸とＴｗｅｅｎ−２０の結合による、ｈＳＡの配座の変化に影響され得る。興味深いことに、ｂＳＡ‐ブルー相互作用は、４〜５ｍＭのカプリレートで完全に妨げられ、ｈＳＡ‐ブルー相互作用は、１４〜１５ｍＭのカプリレートで完全に妨げられた（実施例を見よ）。この効果は、ホエス(hoese)血清アルブミンについて特異的である。というのは、試験した他の（ミルク）蛋白質（ｂＬＦ、ｈＬＦ、ウシラクトペルオキシダーゼおよびトランスフェリン）のブルーへの結合は、カプリレート不感応性だからである。短鎖脂肪酸カプリレートによるブルーセファロースからｈＳＡの溶離は、先に報告されており（Harveyら、In: Separation of Plasma Proteins．ed．Curing J.M.ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン（19 83 年）pp.79-88；独自の結果）、ブルー染料は、¹²⁵Ｉ−カプリレートのｈＳＡへの結合を減少させる（Lagercrantz とLarson，Biochem．J．213（1983年）387 -390）。これらの結果は、ドメインＩＩＩＡが直接的または間接的に、両アルブミンのブルーへの結合に影響を与えることを示唆する。この部位はまた、サリチレートやトリプトファンのような種々の有機分子の結合のための主な部位であると考えられる（CarterとHo，Adv．Prot．Chem. 45（1994 年）153-203）。シバクロンブルーからｈＳＡの完全な溶離は、ＮａＳＣＮで達成された［Tr avisら、Biochem．J．157(1986年):301-306；Kelleherら、J．Chromat．173（19 79 年）:415-418；Leatherbarrow ら、Biochem．J．189（1980 年）27-34 ；Met calf ら、Biochem．J．199（1981 年）465-472］。しかしながら、ｈＳＡのＮａＳＣＮでの長くされた処理は、ダイマーおよびオリゴマーを誘導することが報告され、これは、シバクロンブルーにあまりよく結合しないと考えられている（Leatherbarrow ら、Biochem．J．189（1980 年）27-34）。Travi sらは、回収されたアルブミンの２．４％はダイマーであり；市販のアルブミン（シグマ）ですら、より多くのダイマーと他の少量の汚染物を含むことを見出した［Travisら、Biochem．J．157(1986年):301-306］。市販のアルブミンは、エタノール沈殿の段階を含むコーンの分別法(Cohn's fractionation)により得られる［Cohnら、J．Amer．Chem．Soc．68（1946年）:459-475］。雌牛ミルクにスパイクされたｈＳＡを結合し、溶離するために、我々が使用した手順において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したダイマーとオリゴマーの量は、スパイクされていないｈＳＡと同じである。このように、この手順は、ｈＳＡのダイマー／オリゴマー形成を引き起こさない。ヒトおよび種々の動物例えば雌牛、ブタ、ヤギからのミルクの組成について、多くが知られている。主なミルク蛋白質画分は、カゼインの族であり、異なる種間で、量および組成に変化がある：雌牛ミルクの蛋白質総量の〜８０％がカゼインであり、一方、ヒトのミルクではこれは〜２５％である（総説として、Hambra eus，In: Nutrition Abstracts and Reviews in Clinical Nutrition-Series A ，Wiley Ltd（1984年）pp219-236 ；Lonnerdal，B．Amer．J．Clin．Nutr．42（ 1985 年）1299-1317）。カゼインは、単純な沈積法、ｐＨ４．６での等電沈殿法またはキモシンでの処理のいずれかにより、ミルクから容易に除去できるが、限られた蛋白質分解により、カゼインミセルの凝集を引き起こす［Swaisgood、Developments in Dairy Chemistry-1，Elsevier Applied S cience Publisher,ロンドン（1982年）:1-59］。得られるホエイ画分は、主としてα‐ラクトアルブミン、β‐ラクトグロブリンＡおよびＢ、血清アルブミン、ラクトフェリン、免疫グロブリンおよびラクトペルオキシダーゼから成る。イオン性相互作用クロマトグラフィーは、溶液から陰イオン性蛋白質または陽イオン性蛋白質を特異的に抽出するのに有効な方法である。カルボキシメチル‐セルロース、ＭＯＮＯ−ＳまたはＦＡＳＴ−Ｓビーズのようなカチオン交換体が、特異的かつ効率的に、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼおよび免疫グロブリンを結合することが知られている［Bezwoda ら、Clin．Chim．Acta 157（19 86年）:89-94；Bezwoda ら、Biomed．Chromat．3（1989年）:121-126；Furmansk i ら、J．Exp．Med．170（1989年）415-429 ；Ekstrandら、J．Chromat．358 （ 1986年）:429-433］。ホエイに残留する蛋白質は、アルキル鎖逆相カラム［Pear ce，Aust．J．Dairy Technol．112? （1983年）:114-117］またはアニオンカラム［Humphreyら、New Zealand J．Dairy Sci．Tech．19（1984年）197-204 ；An drews ら、J．Chromat．348 （1985年）:177-185］で分離できる。β‐ラクトグロブリンＡおよびＢは、アニオン交換体であるＭＯＮＯ−Ｑに強く結合し、α‐ ラクトグロブリンおよび血清アルブミンもそうである［Humphreyら、New Zealan d J．Dairy Sci．Tech．19（1984年）197-204 ；Andrews ら、J．Chromat．348 （1985年）:177-185］。溶離プロファイルに差があるので、血清アルブミンを２つの他の蛋白質から分離することが技術的に可能である。しかし、アルブミンを精製するために、塩勾配が必要であり、ヒト種とウシ種は分離しない。ヒト血清アルブミンを（トランスジェニック）ウシミルクから精製するときに、アニオン交換の段階は厳密には必要ではない。というのは、ラクトアルブミンもラクトグロブリンもシバクロンブルーに結合しないからである。塩および有機溶媒を除去するために、シバクロンブルー精製したｈＳＡを透析、限外濾過、またはゲル濾過に供することができる。Ｔｗｅｅｎ−２０のような界面活性剤が、これらの手順を用いて除去されないならば、血清アルブミンを脱脂するために使用したチェン(Chen)の方法［J．Biol．Chem．242 （1967年）:173-181］が適用できる。全精製工程は、大規模化が比較的容易である。あるいは、ファストＳセファロースを用いて、ホエイ画分の前インキュベーションを省略できる。（トランスジェニック）ｈＳＡを含むウシホエイは、ｂＳＡ結合を防ぐために、約０．１Ｍの塩、ｐＨ８．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ− ２０を含む緩衝液中で、ブルーセファロースを用いて（バッチ式で）直接インキュベートされ得る。結合したｈＳＡは、カプリレート（好ましくは１〜１００ｍＭ）で溶離でき、結合したウシラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、残留する免疫グロブリンは、２．５ＭＫＣｌ（またはＮａＣｌ）、５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０（以下の実施例をまた見よ）で溶離できる。厳密に言えば、アルブミンに結合したカプリレートを除去する必要はない。というのは、この化合物は、熱処理（アルブミン調製におけるウィルスの除去）中、安定化のために、アルブミンにしばしば結合されるからである。汚染しているｂＳＡを除去する必要があるなら、カプリレートはおそらく、ブルーセファロースに再ランする前にまず、アルブミン試料から除去（例えばチェンの方法、J．Biol．Chem．242（1967年）17 3-181）されなければならない。ウシミルク中のｂＳＡの通常の濃度は、約０．１〜０．２ｇｒ／Ｌである［Sm ith ら、J．Dairy Res．46（1979年）:547.550；Fox ら、J．Dairy Sci．64（19 81年）:2258-2261；Honkanen-Buzalski ら、J．Dairy Res．48（1981年）:213-2 23；Poutrel ら、J．Dairy Sci．66（1983年）:535-541］。アメリカ合衆国では、非経口的使用のために、100,000 kg／年を超えるｈＳＡの年間需要があるので、約１０，０００のミルク生成ｈＳＡトランスジェニックク雌牛（約１ｇｈＳＡ／Ｌの発現）が、合衆国市場に出ることが必要とされると計算され得る［２．５ｇｒ／Ｌの、トランスジェニックマウスのミルク中のｈＳＡの発現レベル［Sh ani ら、Transgenic Res．1 （1992年）:195-208］およびそれより多く［Hurwit z ら、国際特許出願WO 93/03164 （1993年）］が報告されている］。このように、経済的に可能な方法でｈＳＡを製造するためには、ミルク中のｈＳＡの濃度はｂＳＡの濃度よりずっと高いであろう。このことは、ｈＳＡ精製を促進する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）を、非ヒト種に対して内因性の血清アルブミンおよび、該非ヒト種のミルクホエイ中に通常見出される少なくとも１種の他の蛋白質をまた含むところの、該ｈＳＡの供給源から分離する方法であって、 (a) 該供給源を、界面活性剤の存在中で、該内因性血清アルブミンより強くｈＳＡを結合するリガンドと接触させ、それによってｈＳＡ‐リガンド複合体を製造すること； (b) 該ｈＳＡ‐リガンド複合体を分離すること；および (c) 該分離したｈＳＡ‐リガンド複合体から、ｈＳＡを遊離させることを含む方法。２．該内因性血清アルブミンがウシ血清アルブミン（ｂＳＡ）である請求項１記載の方法。３．該供給源が、トランスジェニックミルクホエイまたはトランスジェニックミルクホエイ画分である請求項１または２記載の方法。４．トランスジェニックミルクホエイまたはミルクホエイ画分が、カチオン交換樹脂にさらされて、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、免疫グロブリンおよび他の陽イオン性蛋白質を除去する請求項３記載の方法。５．該リガンドがトリアジン染料である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。６．該トリアジン染料が、シブラコンブルーである請求項５記載の方法。７．該界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ−２０を包含するＴｗｅｅｎである請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。８．段階(b)におけるｈＳＡ‐リガンド複合体の分離が、固定化された形で該リガンドを使用することにより達成される請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。９．該固定化された形が、それに結合した該リガンドを有するクロマトグラフィー物質を含む請求項８記載の方法。 10．該クロマトグラフィー物質がセファロースである請求項９記載の方法。 11．段階(c)の遊離が、該ｈＳＡ‐リガンド複合体を溶離溶液と接触させることにより成される請求項９または10記載の方法。 12．溶離溶液がエタノールを含む請求項11記載の方法。 13．溶離溶液が、５〜１５％のエタノールを含む請求項12記載の方法。 14．該少なくとも１種の他の蛋白質が、ラクトフェリン、ラクトアルブミンおよびラクトグロブリンから選ばれる請求項１〜13のいずれか１項記載の方法。 15．該供給源が、段階(a)に先立ち処理されて、該少なくとも１種の他の蛋白質が実質的に除去される請求項14記載の方法。 16．非ヒト血清アルブミンおよび、非ヒト種のミルクホエイ中に通常見出される少なくとも１種の他の蛋白質をまた含むところの、ｈＳＡの供給源からｈＳＡを分離する際に、界面活性剤ならびに、ｈＳＡと非ヒト種からの血清アルブミンとの間で差別的結合特性を示すリガンドを使用する方法。 17．該供給源が、トランスジェニックミルクホエイまたはトランスジェニックミルクホエイ画分である請求項16記載の方法。 18．該リガンドがトリアジン染料である請求項16または17 記載の方法。 19．該トリアジン染料が、シバクロンブルーである請求項18記載の方法。 20．界面活性剤が、短鎖脂肪酸または、その官能的に同等なものである請求項17 〜19のいずれか１項記載の方法。 21．脂肪酸がカプリレートである請求項20記載の方法。 22．官能的に同等なものが、サリチレートである請求項20記載の方法。 23．非ヒト種からの血清アルブミンをまた含む物質からｈＳＡを分離する方法であって、該物質を、ｈＳＡと該非ヒト種からの血清アルブミンとの間で差別的結合特性を示すリガンドと接触させて、それによって複合体を形成すること、および短鎖脂肪酸またはその同等物で処理することにより、該複合体からｈＳＡを遊離させることを含む方法。 24．該短鎖脂肪酸が、１２未満の炭素原子を有する請求項23記載の方法。 25．該短鎖脂肪酸がカプリレートである請求項24記載の方法。 26．該その同等物が、サリチレートである請求項23記載の方法。 27．該リガンドがトリアジン染料である請求項23〜26のいずれか１項記載の方法。 28．該トリアジン染料が、シバクロンブルーである請求項27記載の方法。 29．該リガンドが、固定化された形で存在する請求項23〜28のいずれか１項記載の方法。 30．該不動化された形が、それに結合した該リガンドを有するクロマトグラフィー物質を含む請求項29記載の方法。 31．該クロマトグラフィー物質がセファロースである請求項30記載の方法。 32．該短鎖脂肪酸またはその同等物が、該複合体の形成後に、該クロマトグラフィー物質からｈＳＡを溶離するのに使用される請求項30または31記載の方法。 33．ｈＳＡの溶離後、該非ヒト種からの血清アルブミンを、高い塩濃度条件を用いて溶離する請求項32記載の方法。