JPH0284192A - 哺乳動物の１４―β―ｇａ１レクチン類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、糖結合タンパク類を細胞の分化および免疫性
の調節物質として使用することに関する。

特に２本発明は、ラクトースまたは界面活性剤で抽出可
能な分子１約１２〜１８ｋＤａの哺乳動物レクチン類（
好ましくは、グリコシル化部位を含む）と。

ヒトのＨＬ−６０細胞および胎盤組織に由来する特異な
１４ｋＤａ　レクチンと、約１７〜２０ｋＤａの分子量
範囲を有するこの特異なレクチンのグリコシル化形とに
関する。これらはすべて１組換え技術により。

生産し９診断および治療に使用することができる。

（従来の技術） レクチン類は、様々なタイプのｔｌ！類と特異的に結合
するタンパクとして定義される。初期の頃には、コンカ
ナバリンＡやリシン凝集素のように植物から単離された
レクチン類に関心が寄せられた。

これらレクチン類は、対象となる数多くのタンパク類が
グリコシル化された状態にあるので、タンパクの精製法
に有用であることが認められた。しかしながら、最近で
は、ある種のβ−Ｄ−ガラクトシド含有成分と特異的に
結合し、広範囲の哺乳動物、無を椎動物、鳥類、さらに
は微生物源においても見い出されている。ラクトースで
抽出可能なレクチン類に興味が集中している。この種の
レクチン類はすべて、１２〜１８ｋＤａ程度のサブユニ
ットを含むと思われる。簡単な診断試験により、容易に
分類し得るトリプシン処理したウサギ赤血球を凝集させ
るそれらの能力は、ある種のβ−Ｄ−ガラクトース含有
成分により２特異的に阻害される。従って、レクチン自
体はトリプシン処理したウサギ赤血球を凝集させるが、
その凝集反応は。

例えばラクトース、チオガラクトシド、およびある種の
β−Ｄ−ガラクトース含有成分により、阻害され得る。

他の一般的な特性には、凝集を行なう際に金属イオンを
必要としないこと、およびチオールのような還元剤の存
在が必要であることが含まれる。

Ｇｉ　ｔｔ、　Ｍ、Ａ、ら（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃ
ａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８６）８３　：　７６０
３〜７６０７　）は、ヒト肺レクチンに特異的な抗血清
を用いてヒト肝癌ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グすることにより、２つのｃＤＮＡクローンを得た。こ
れらのｃＤＮＡは、他の数多くの研究者が様々な組織に
おいて発見したものと類似するタンパクをコードしてい
た。例えば、特許公開公報昭６０−１８４０２０におい
て、にａｓａｉ、　Ｋ、らは、約１４　ｋ　Ｄ　ａのヒ
ト胎盤レクチンについて述べている；このレクチンの配
列は、同研究グループにより、ヒナ組織から分離された
ものに多少類似していることが示された（Ｏｈｙａｍａ
、　Ｙ、　　ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　
Ｃｏｍｍｕｎ（１９８６）　ｉ３４　：　５１〜５６）
。ヒナに由来するレクチンは、細胞性枯菌Ｄｉｃ　ｔｏ
ｓｔｅｌｉｕｓ　ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの増殖段階にお
いて認められるレクチンであるジスコイジンＩと構造が
類似していることが明らかになった。

Ｃａｒｏｎ、　Ｍ、ら、　　（Ｂｉｏｃｈｅａｉ　Ｂｉ
ｏ　ｈ　ｓ　Ａｃｔａ　（１９８７）％臣：　２９０〜
２９６）は、ラットおよびウシの脳組織に由来する類似
レクチンの精製および特徴付けについて述べている。　
ｄｅ　Ｃａｂｕｔｔｉ、　Ｎ、Ｂ、Ｆ、ら（ＦＥＢＳ農
工１■（１９８７）９矧；３３０〜３３４）は１両生類
の卵巣に由来する類似レクチンについて述べている。

類似の「電気レクチン（ｅｌｅｃｔｒｏｌｅｃｔｉｎ　
）　１をウナギから単離することは、すでに＋、ｅＶ１
＋　ｃ、ら（ムＢｉｏｌ　Ｃｈｅｓ＋　（１９８１）　
３５６　：　５７３５〜５７４０）により述べられてい
る。さらに他の類似１４ｋＤａレクチンが、　Ｒａｚ。

Ａ、ら（Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　（１９８７）　１７３　：１０９〜１１６
）により、様々なマウス線維肉腫細胞系から誘導された
ｃＤＮＡをクローニングおよび発現することによって生
産された。ラット肺１４ｋＤａレクチンおよびそれをコ
ードするｃＤＮ＾は、　Ｃ１ｅｒｃｈ。

Ｌ、Ｂ、ら（Ｂセ貝閂畦桂■（１９８８）　２７　：　
６９２〜６９９）により述べられた。Ｊｏｕｂｅｒｔ　
、　Ｒ，ら（傾■旦り−Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　（１９８
７）　３６　：　１４６〜１５０　）は、脳細胞を凝集
させ得る。ラットの脳由来のレクチンを単離することに
ついて述べている。　Ｒａｙ、　Ａ、う（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（１９８１）　４１　：　３６４２
〜３６４７）は、様々な哺乳動物種の新生細胞に由来す
る様々なレクチンについて述べている。

レクチン（ヒナ、ウナギ、ヒト胎盤、ヒト肺などに由来
するものを包含する）と、２種の肝癌由来のレクチンと
の間の相同性に関する比較が。

Ｐａｒｏｕｔａｕｄ＋　Ｐ、ら（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　
Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　［ＩＳＡ　（１９８７）　８４　：
　６３４５〜６３４８　）により行われた（これらのレ
クチンはすべて上で引用した文献に記載されている）、
これらのタンパクの特定のアミノ酸位置（２３位、３２
位、３５位、３７位、４３位、４５位、７０位。

７１位、７６位、９０位、９１位２１０２位、１０３位
、１０５位、１０９〜１１１位を包含する）は、比較し
たすべての種において完全に保持されているようである
。

この系列のうち、ただ１つのレクチン（すなわち。

ニワトリから得られたレクチン）だけが　ｒＮ結合グリ
コシル化部位」を含むが、この部位は糖類に結合してい
ない。当該技術分野においてこれまでに特徴付けられた
この種のいずれの哺乳動物レクチンも、Ｎ結合グリコシ
ル化部位を有していない。

可溶性レクチンには、様々な分子量および／または糖特
異性を持った数多くの変種が存在すると思われる。Ｓｐ
ａｒｒｏｗ、　Ｃ，Ｐ、ら（Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ（
１９８７）％５２　：　７３８３〜７３９０　）は、ヒ
ト肺に由来する３種の可溶性レクチン（それぞれ、　１
４ｋＤａ　、　２２ｋＤａ　、およ１Ｊ２９ｋＤａの分
子量を有するレクチン）について述べている。これらは
すべて、β−Ｄ−ガラクトシドに特異的である。１４ｋ
Ｄａのレクチン類の糖特異性は大体類似しているが１分
子量がより大きい種は異なる特異性を持つ傾向がある。

他の種も、１つより多くの可溶性のβ−Ｄ−ガラクトシ
ド結合レクチンを含むことが知られている［例えば、マ
ウス（Ｒａｆｆ、　Ｃ，Ｆ、ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈ
ｅｍ（１９８３）２５８：１０６３７−１０６６３）　
；ラット（Ｃｅｒｒａ、Ｒ，Ｆ、ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ
　ＣｈｅＩｌｌ（１９８５）％曳：　１０４７４−１０
４７７）　、およびニワトリ（Ｂｅｙｅｒ＋　Ｅ、Ｃ，
ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ（１９８０）２５５　：
　４２３６−４２３９）　］。β−Ｄ−ガラクトシドに
特異的な種々の可溶性レクチンにおいては、受容体特異
性がかなり異なっており、約１４ｋＤａのレクチン群は
。

Ｓｐａｒｒｏｗ、ら（前出）により述べられた２２ｋＤ
ａおよび２９ｋＤａの代表的なレクチン類とは別個のも
のであると思われる。

本発明の好ましいレクチン類は、ヒト前骨髄細胞性白血
病細胞系ＨＬ−６０またはヒト胎盤組織から単離される
。他の研究者らにより、　ＨＬ−６０細胞からレクチン
が単離されているが、それらのレクチンはこの種のレク
チンには相当しない。Ｐａ１ｅｔｔａ。

Ｅ、ら（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８８
）　４８　：　２８０−２８７）は。

分岐状オリゴ糖構造の末端にあるＮ−アセチルノイラミ
ン酸およびガラクトースを認識する膜結合（可溶性では
ない）レクチンについて推定的に述べている。その活性
はカルシウムには依存しない。

見かけの分子量は１７ｋＤａである。従って、特異性お
よび可溶性に関する点では１本発明のレクチンタンパク
とは著しく異なる。

（以下余白） （発明の要旨） 免疫系を調節し、他の形態の細胞間伝達を媒介するレク
チン類の活性は、実際上極めて鋭敏であり、宿主環境に
極めて厳密に同調するので、広範囲のこのような調節物
質が治療および診断の用途に使用できることが重要であ
る。上で述べたように、β−Ｄ−ガラクトースが結合し
た約１４ｋＤａの可溶性レクチン類の数多くのメンバー
が当該技術分野において知られている。しかしながら、
これらのレクチン類は互いに類似する特性を有している
が、治療あるいは診断に用いる場合には交換可能ではな
い。さらに、これらのレクチン類がグリコシル化され得
る場合、グリコシル化のレベルおよび性質は、その分子
の特異性（例えば、循環半減期、インビボでの代謝、可
溶性、安定性、あるいは比活性）を変化させるように処
理されると考えられる。本発明は、このような処理を行
なうことができるレクチン類と、このレクチン類の特定
メンバーであるレクチンを提供するものである。

これらはすべて治療用および診断用の手段のレパートリ
−を拡大する。本発明はまた。このレパートリ−に包含
されるこれらの新しい特定メンバーを生産するための組
換え用材料および方法を提供する。

ある局面では２本発明は、β−Ｄ−ガラクトシドが結合
した１４ｋＤａの哺乳動物レクチン（１４−β−ｇａｌ
　レクチン）を目的とする。該１４一β−ｇａｌレクチ
ンは、好ましくは少なくとも１つのグリコシル化部位を
有する。他の局面では１本発明は。

第１図Ａにアミノ酸２〜１３５として示されたアミノ酸
配列から実質的になる１４−β−ｇａｌ　′哺乳動物レ
クチンを目的とする。１位のアミノ酸であるメチオニン
は、このタンパクが哺乳動物細胞において組換え技術に
より生産される場合には通常除去され、細菌細胞におい
て組換え技術により生産される場合には除去されること
がある。また、このメチオニンは、自然界では存在せず
、活性にとって必須ではない。他の局面では２本発明は
、　ＨＬ−６０および胎盤に由来する分子量１４ｋＤａ
のレクチン類ならびに分子量が１７〜２０ｋＤａの範囲
にあるそれらのグリコシル化形を目的とする。

他の局面では１本発明は、Ｎ結合グリコシル化を行ない
得る１４−β−ｇａｌ　哺乳動物レクチン類をコードす
るＤＮＡ配列と、特に第１図のタンパク。

あるいは他のＨＬ−６０またはヒト胎盤由来のレクチン
類をコードするＤＮＡ配列とを目的とする。これらのＤ
Ｎ＾配列は、単離および精製された形であるか、および
／または組換え発現に適した異種制御配列に連結されて
いる。他の局面では１本発明は。

これらのＤＮＡ配列により形質転換される宿主細胞。

および所望のレクチンタンパクを生産するための方法を
目的とする。また９本発明のレクチンと特異的に反応す
る抗体も目的としている。

さらに他の局面では９本発明は哺乳動物の疾患（例えば
、自己免疫疾患１重症筋無力症、および多発性硬化症）
を治療するのに適した薬剤組成物およびそれを用いた治
療方法を目的としている。

哺乳動物の疾患を治療するのに適した本発明の薬剤組成
物は、少なくとも１つのグリコシル化部位を有する哺乳
動物１４−β−ｇａｌ　レクチンを、薬学的に許容され
る賦形剤と混合された形で含有する。

（発明の構成） Ａ、ｌｉ 一般に、タンパクは、様々な実質的に等価な形（酸性塩
および塩基性塩の形、側鎖の官能基が修飾された形、脂
質および膜に結合した形、ならびに所望のレクチンをコ
ードするＤＮＡを発現する細胞の翻訳後のプロセッシン
グにより形成される他の修飾形を包含する）で存在し得
ることが知られてる。以下で説明するタンパクは、すべ
てこれらの様々な形のものを含む。

ここで使用されるように、　　ｒＨＬ−６０レクチン」
は、以下で説明するレクチン類を表わす。１化−６０レ
クチンは、　ＨＬ−６０細胞に由来するレクチンならび
にヒト胎盤組織に由来するレクチンを包含する。

ある実施態様は、グリコシル化部位を与える少なくとも
１つのトリペプチド配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒあるいは
Ａｓｎ−Ｘ−５ｅｔ　）を含む、　　２〜１３５の番号
を付した第１図Ａのアミノ酸から実質的になる。ＨＬ−
６０細胞および胎盤組織による自然の産生においても。

ＨＬ−６０レクチンのＮ末端メチオニンは切断され。

残りのタンパクがアセチル化され得ると考えられている
。タンパクを産生ずる細胞によっては、様々な形の翻訳
後プロセッシングが予想され、プロセッシングを受けた
タンパクは、もちろん本発明の範囲内に含まれる。

特に、タンパク配列が知られている類似の哺乳動物レク
チンとは異なり、　ＨＬ−６０レクチンは、好ましくは
９６位を先頭とするグリコシル化部位Ａｓｎ〜Ｌｅｕ−
Ｔｈｒを含むことに留意しなければならない。

天然物質は明らかに、少なくとも部分的には、この部位
がグリコシル化されていない：しかしながら、他の組換
え宿主において適切に産生された場合には、この部位は
グリコシル化され得る。従って、グリコシル化形は、そ
のグリコシル化が活性を損なわない限り１本発明に包含
される。

さらにまた、第１図Ａに示すような、　　ｒＨＬ−６０
レクチン」の実施態様は、他の既知の同種動物レクチン
よりも多くのシスティン残基（６）を含む。本発明はそ
れに限定されるものではなく、活性が保持される限り、
どのような数のシスティン残基を持つもの、あるいは全
くシスティン残基を持たないものも包含することに留意
しなければならない。

ｒＨＬ−６０レクチン」はさらに、第１図への２〜１３
５位のアミノ酸を含むペプチド、あるいはその天然に存
在する変異体または対立変異体を包含する。生物により
産生されるタンパクが、検討される形において必ずしも
安定なままではないこと。

またそれらをコードする遺伝子が自然の変異および変化
を受けやすいことは、広く理解されている。

従って、これ・らは本発明に包含される。

ＨＬ−６０レクチンが、　ＨＬ−６０細胞あるいは胎盤
組織の天然環境で産生される場合に、それ自体で分泌さ
れるのかどうか、あるいはＩ化−６０レクチンが細胞の
細胞質または核の可溶性またはタンパク結合の細胞質タ
ンパクであるのかどうかは、現在のところ不明である。

ＨＬ−６０レクチンは、既知のシグナル配列を組換え技
術を用いて付加することにより、確実に分泌するように
生産され得る。培地からのタンパクの回収は、もちろん
細胞溶解を必要とする回収よりも簡単である。

ここでは、　ＨＬ−６０細胞および胎盤組織が１４ｋＤ
ａβ−ｇａｌ結合レクチンを産生ずることが示されてい
る。

上に述べた「ＩＬ−６０」レクチンは、好ましくは少な
くとも１つのグリコシル化部位を有する１４−β−ｇａ
ｌ　哺乳動物レクチン類の代表例である。ここで使用さ
れるように、「少なくとも１つのグリコシル化部位を含
む１４−β−ｇａｌ哺乳動物レク千ンしという文言は、
グリコシル化部位を与える少なくとも１つのトリペプチ
ド配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒあるいは＾５ｎ−Ｘ−Ｓｅ
ｔ　）を含む第１図の１化−６０１／クチンにより例示
されるレクチン群の特性を持ったペプチド類を表わす。

しかしながら、上で述べたように１本発明はグリコシル
化部位を有さない１４−β−ｇａｌ　Ｉｌｌ乳動物レク
チンを包含する。

少なくとも１つのグリコシル化部位を含む１４−β−ｇ
ａｌ哺乳動物レクチン類に包含されるためには、以下に
挙げる生物学的特性を示すペプチドでなければならない
：グリコシル化されていない場合の分子量が約１４ｋＤ
ａであり、実際に測定した場合の分子量が約１２〜１８
ｋＤａであること。このレクチンは、特定のβ−Ｄ−ガ
ラクトシド含有成分（すなわち、ラクトース）を結合す
ることができなければならない。また、標準的なレクチ
ン分析において、トリプシン処理したウサギ赤血球の血
球凝集を特異的に生じさせなければならない。ただし、
この凝集は、ラクトースやチオガラクトシドのようなβ
−Ｄ−ガラクトシド結合を含む特定成分により阻害され
る。血球凝集を生じさせる能力には９例えばチオール基
およびトリプトファン残基を還元された形で保持し得る
還元剤の存在が必要である。しかし、その活性は、金属
イオンには依存しない。典型的には、この活性を有する
本発明のペプチドは、少な（とも１つのグリコシル化部
位が存在するということをさらに条件として。

上で述べた動物レクチンに対して広範囲にわたる相同性
を示す。

上記のレクチン類は、第１図Ａの１１１．−６０　レク
チン類と少なくとも４０％、好ましくは７５％、そして
最も好ましくは９０％以上の相同性を有する。グリコシ
ル化部位の好ましい配置は、第１図Ａのレクチンの場合
のように、９６〜９９位の残基あるいは。

多くとも４個のアミノ酸だけ上流から３個のアミノ酸だ
け下流（すなわち、９２〜１０１残基（両端を含む）ま
での間）の範囲内である。他の好ましい配置には、動物
レクチン類のいずれかにおいて。

保存されない領域にＡｓｎ、Ｘ　　（任意のアミノ酸）
。

およびＳｅｔ／Ｔｈｒ残基を有する配置が包含される。

特に好ましい実施態様は、上で述べた既知の哺乳動物レ
クチンと少なくとも９５％の相同性を持つが２天然の形
とは異なり、少なくとも１つのグリコシル化部位が配列
に含まれるペプチドである。

これらの好ましい実施態様においては、また、グリコシ
ル化部位の好ましい位置は、９６〜９９位あるいは少な
くとも９２〜１０１位の間（両端を含む）である。グリ
コシル化部位を含む１４−β−ｇａｌ　レクチンの最も
好ましい実施態様は、第１図ＡのＨＬ−６０レクチン（
ＨＬ−６０細胞源あるいは胎盤組織源に基づ（もの、な
らびに天然に存在するその変異体および対立変異体）で
ある。

（以下余白） Ｂ　　ＨＬ−６０レクチン　コード　るｃＤＮＡのａ、
　ＨＬ−６０細胞からの単離 ＨＬ−６０細胞、＾ＴＣＣＣＣＬ２４０をＩｌｌ？ＩＳ
Ｏの存在下で４０時間培養した。次に、これらの細胞を
溶解し、標準的な方法を用いてｍＲＮＡを単離し、そし
てＨｕｙｎｈ。

Ｔ、Ｖ、ら（ＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　Ｉ、　Ｄ、Ｍ、
　Ｇｌｏｖｅｒ　４１集、　Ｉｌｌ。

Ｌ、　Ｐｒｅｓｓ　（１９８５）　ｐ、４９　７８）の
方法に従って、λ−ＧＴＩＯでｃＤＮΔライブラリーを
構築した。このライブラリーを以下に示す２組の１４量
体プローブで調べた： および これらのプローブは、既知のレクチン配列、特にＣ末端
近くの保存領域の配列に基づいて設計された。これらの
プローブは、アミノ酸配列Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−１、ｙｓ−
Ｐｈｅ−Ｐｒｏ　　（ＨＬ−６０レクチンの１０６〜１
１０位に存在する）およびＡｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−１
１ｅ−Ｌｙｓ　　（ＨＬ−６０レクチンの１２６〜１３
０位に存在する）をコードする。これらのプローブは、
　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび〔γ−”Ｐ）Ａ
ＴＰを使用して、末端をｘｔｐで標識した。

３７°Ｃで２〜４時間プレハイブリダイズした２ｍのニ
トロセルロースフィルターを用いて、　ＬＰ５９をハイ
ブリダイズさせることにより、ファージコロニーをスク
リーニングした。ハイブリダイゼーション用の緩衝液は
、　　５　Ｘ５ＳＣ、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）
、２Ｘデンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、　　２ｍＭ　
ＥＤＴＡ　、および１００μｇ／成酵母ＲＮＡを含有し
ていた。次いで、これらのフィルターを、室温にて、ｄ
ＸＳＳＧ中で洗浄した。

約１０６のファージコロニーから、　ＬＰ５９にハイブ
リダイズする１７個の陽性クローンを検出した；これら
のうち９個は、　ＬＰ６０プローブともハイブリダイズ
した。これらの９個のクローン全部が、「短い」断片お
よび「長い」断片を与える内部Ｅ　ｃｏＲ１部位を含ん
でいた。両方のプローブとハイブリダイズするクローン
のうちの３個について、ジデオキシ法により配列決定を
行ったところ、オープンリーディングフレームの５゛側
延長部分および３°側延長部分においてのみ異なる同一
のＤＮＡ配列が得られた。

これらのクローンの１つについて決定された５０７ｂｌ
）の配列を第１図Ａに示す。１４．７４４ダルトンの理
論的分子量を有する１３５アミノ酸のタンパクをコード
する４０５塩基対（クローン１１）のオープンリーディ
ングフレームを示す。Ｎ末端メチオニンを含めずに計算
した場合には、このタンパクは１４，６１３ノ理論的分
子量を有する。このタンパクは、ラット肺レクチンのよ
うな他の動物の１４−β−ｇａｌ　レクチンと相同であ
る。他の既知の動物レクチンタンパクの配列に対する相
同性は、　４０％（マウス肝癌）から９６％（ヒト肺ペ
プチド）の範囲である。

ｂ、ヒト胎盤組織からの単離 λ−ＧＴＩＯにおけるヒト胎盤ポリ　（Ａ”）　ＲＮＡ
からヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを構築した。この構
築は、第１のｃＤＮＡ鎖合成を開始させるために、オリ
ゴＤＴではなく、３°側非翻訳領域（ＨＬ−６０ｃＤＮ
Ａクローン１１のヌクレオチド４８６〜５０２）に相補
的な合成プライマー（３’−ＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡ
ＧＡＣＧＡ−５’　）を用いて、　Ｔａｒａｎｔｉｎｏ
　、　Ａ、Ｌ、ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　（１９
８５）　２４　：　４６６５−４６７１）が述べている
ように行った。

レクチンをコードする配列の大部分を含むが３°側非翻
訳プライマ一配列を全く含まない、　ＨＬ−６０の標識
化３１１ｂＰ断片（クローン２）（第１図Ｂ）を用いて
、このライブラリーをスクリーニングした、　ＨＬ−６
０ライブラリーのスクリーニングについて述べたように
して、このプローブを用いて、４つの陽性クローンを単
離した。

グリコシル化部位Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒが第１図Ａの
ＨＬ−６０レクチンの９６〜９８位に存在することは、
推定アミノ酸配列から明ら゛かである。これはグリコシ
ル化部位を含む最初の既知哺乳動物レクチンであり。

その存在は、β−Ｄ−ガラクトシド化合物に結合する能
力を損なわずに、レクチンの糖結合能力。

可溶性、循環半減期、インビボでの代謝、安定性。

あるいは比活性を潜在的に変化させる可能性を提供する
。

さらに、第１図Ａに示すＤＮＡ配列、ならびに上で述べ
た他の哺乳動物レクチンに対するｃＤＮＡ配列の有用性
は、グリコシル化部位が天然では全く存在しない場合で
もグリコシル化部位を与えうるように遺伝子を操作する
可能性を提供する。従って。

本発明の好ましい実施態様であるレクチン類を調製する
ためのあるアプローチにおいては、９２〜１０１位の間
のトリペプチド配列を１部位特異的変異誘発法により、
グリコシル化部位に変換することができる。この位置に
グリコシル化部位を与えることは、このペプチドの１４
−β−ｇａｌ　レクチン活性を損なわないと予想される
。

他のアプローチでは１回収されたＨＬ−６０および胎盤
ｃＤＮＡを、他の起源に由来する１４−β−ｇａｌ　レ
クチン配列との相同性をより高め、同時にグリコシル化
部位をコードする配列を保持するように操作することが
できる。

Ｃ，ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの ＨＬ−６０細胞およびヒト胎盤組織から単離されたヒト
ゲノムＤＮＡのサザンプロット分析は、第２図に見られ
るように、　ＢａｍＨｌ、　Ｈｉｎｄｌ［［、またはＥ
ｃｏＲＩで消化した後に、　ＨＬ−６０ｃＤＮＡクロー
ン２（第１図Ｂ）の４４５　ｂｐ　Ｓｍａ　Ｉ　／Ｎｃ
ｏｌ断片をプローブとして行った。）ＩＩｎｄＤＩで消
化したＤＮＡ　　（レーン１．胎盤由来；レーン２．　
ＨＬ−６０由来）あるいはＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ
　　（レーン３．胎盤由来；レーン４゜ＨＬ−６０由来
）については、約７．５あるいは１５ｋｂｐの１つのハ
イブリダイゼーションバンドが存在した；　ＥｃｏＲ１
による消化（レーン５．胎盤由来；レーン６、　ＨＬ−
６０由来）は、内部ＥｃｏＲ１部位と一敗する５、１　
ｋｂｐおよび３．２ｋｂｐの２つのハイブリダイゼーシ
ョンバンドを与えた。

ＨＬ−６０細胞（レーン１，５．および６）、正常ヒト
胎盤（レーン３つ、ヒトＳＫ肝癌細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ
２４６０１）　　（レーン４）、ヒト赤白血病性白血病
にＧ−ＬＡ細細胞ＡＴＣＣＨＴＢ５２）　　（レーン７
）、およびヒト繊毛癌ＪＥＧ−３細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ
３６）　　（レーン２）に由来するｍＲＮＡ調製物に対
して、クローン２の３１１ｂｐＥｃｏＲＩ　ｃＤＮＡ断
片（第１図Ｂ）をプローブとして得られたノーザンプロ
ット（第２図Ｂ）は、検討したすべての細胞に対して類
似の長さあるいは同−の長さを有するｍＲＮＡメツセー
ジを与える約７００個のヌクレオチドからなる１つのハ
イブリダイゼーションバンドの存在を示した。

Ｄ、　　　　のレクチン　と　　　の　る本発明のレク
チン類は、従来の方法により、これらのレクチン類と反
応性があり、かつこれらのレクチン類に特異的な抗血清
を調製するために使用できる。ＨＬ−６０レクチン類に
「特異的な」抗体とは、このレクチンと、あるいはその
遺伝子の天然に存在する変異体および対立変異体により
コードされるタンパクと免疫反応性があるが、他のレク
チン類とは免疫反応性がない抗体を意味する。

第１図ＡのＨＬ−６０レクチンと、他の１４−β−ｇａ
ｌレクチン類とには広範囲にわたる相同性が存在するた
めに、　ＨＬ−６０レクチンに対して生じた抗体は。

実際には、このレクチンに対して必らずしも特異的なわ
けではない。しかしながら、　ＨＬ−６０レクチンに対
するモノクローナル抗体を生産することにより、特異的
抗体を生成させることができる。さらに２種々のグリコ
シル化形に対して特異的な抗体も調製することができる
。

同様に、非グリコシル化形および特にグリコシル化形の
、少なくとも１つのグリコシル化部位を含むか、あるい
は含まない２本発明の１４−β−ｇａｌレクチンのいず
れかの特定メンバーに対して特異的な抗体を調製するこ
とができる。

つまり１本発明の範囲内の抗体は１本発明のレクチンの
１つまたはそれ以上のメンバーと反応性であるが、当該
技術分野において現在知られているレクチン類と交差反
応性ではないモノクローナル抗体系である。同様に１本
発明のレクチン類のいずれかにより生じた抗血清は、既
知のレクチン類と交差反応性の抗体をいくらか含む場合
でも。

これらの抗血清はこれらのレクチン類に特異的であるの
で９本発明の範囲内に含まれる。

（以下余白） Ｅ、ＨＬ−６０レクチンの組換え生産 第１図へのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡまたはそ
の合成もしくは半合成変異体、あるいは１４ｋＤａ札−
６０をコードするｃＤＮＡは、各種の系でＨＬ−６０レ
クチンを組換え生産するのに利用することができる。他
の１４−β−ｇａｌ　レクチン類（例えば、少なくとも
１つのグリコシル化部位を有するもの）をコードするの
に適したＤＮＡも１組換え技術により発現させ得る。イ
ントロンのない適切な配列を連結して発現を調節する配
列を制御し、得られた発現系を適切な宿主にトランスフ
ェクトし、そして形質転換もしくはハランスフェクトさ
れた宿主を。

ＤＮＡを発現させるのに好ましい条件下で培養すること
により、レクチンをコードするＤＮＡを起動させる。Ｈ
Ｌ−６０レクチンと胎盤レクチンとをコードするゲノム
ＤＮＡ　、ならびにその天然に存在する変異体および対
立変異体は、上記のｃＤＮＡをプローブとして用いて、
　ＨＬ−６０もしくは胎盤のゲノムから回収することが
できる。このゲノムＤＮＡは、イントロンをプロセッシ
ングし得る真核生物系にも使用できる。レクチンをコー
ドする配列を、　ＡＴＧが先行する発現系に連結して、
成熟タンパクとしてレクチンを得ることができる。ある
いは、目的とする宿主内で作動可能なことが知られてい
るシグナル配列（例えば、細菌中のベニシリナーゼもし
くはアルカリホスフゲターゼ系、酵母内のα−因子系、
もしくは哺乳類細胞中の各種ホルモンのシグナル配列）
“を使用して、レクチンＤＮＡを有する読取り領域内に
シグナルをコードするＤＮＡを挿入するように発現系を
構築することにより１分泌を起こさせることができる。

また、レクチンは、所望により、コーディング配列を、
追加のコーディング配列を有する読取り枠に連結するこ
とにより。

融合タンパクとして生産することも可能である。

適切な制御系を有する各種の宿主系は、従来。

当該技術分野ではよく知られている。例えば、原核生物
宿主中、エセリヒア・コ！Ｊ　　（Ｂ、ｃｏｌｉ）が好
ましいが、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　、　　シュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、または他の
細菌株のような他の種も使用できる。適当な制御系には
、β−ラクタマーゼおよびラクトース（Ｉａｃ　）のプ
ロモーター系〔チャンら（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、）
、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）。

１９８　：　１０５６〕；　）リプトファン（ｔｒｐ）
プロモーター系〔ゴデルら（Ｇｅｏｄｄｅｌ　ｅｔ　ａ
ｌ、）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓモーターとＮ−
遺伝子リポソーム結合部位系〔シマタケら（Ｓｈｉｍａ
ｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８１
）、　２９２：　１２８３のような細菌タンパクに関連
するプロモーターが包含される。このリストには、原核
生物において最も一般的に用いられているプロモーター
が与えられているが、必ずしも全部を含んでいるわけで
はない。

同様に、酵素系では、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ
のプロモーター〔ヒララマンら（Ｈｉｔｚｅｍａｎｅｔ
　ａｔ、）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　（
１９８０）、　　２５５：２０７３）；エノラーゼ遺伝
子プロモーター〔ハランド１Ｍ。

Ｊ、ら（Ｈｏｌｌａｎｄ、　Ｍ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ
、）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

（１９８１）、　２５６　：　１３８５：］またはＹＩ
ｌ！ｐ１３から得た］ｅｕ２遺伝子〔ブローチ、Ｊ、ら
（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、）。

−およびプロモーターが知られている。

高等生物の細胞での発現に対し、このような細胞で作動
するプロモーターには、　ＳＶ４０プロモーター〔フィ
アーズら（Ｆｉｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｎａｔｕｒ
ｅ　（１９７８）。

２７３　：ｌ］もしくはアデノウィルス、ウシ乳頭腫ウ
ィルス、ラウス肉腫ウィルスなどに由来するプロモータ
ーのようなウィルスプロモーターが挙げられる。また、
メチロチオネインＩまたはメタロチオネイン■のプロモ
ーターのような調節可能なプロモーターも有用である。

例えば、Ｂ、スリンジエンシス（Ｂ、　　ｔｈｕｒｉｎ
ｇｉｅｎｓｉｓ）の結晶タンパク遺伝子に関連するレト
ロ調節を行う制御配列も利用できる。昆虫細胞および植
物細胞中で組換えタンパクを産生ずる系も、現在利用で
きるが、植物細胞系は現在のところ余り便利ではない。

しかし、植物細胞系が不便なのは、現在の技術水準が原
因であり、この宿主細胞系と１本発明のタンパクをコー
ドする遺伝子とは９本来不適合なものではない。

適当なコーディング配列は１作動可能な構造で。

目的とする宿主にトランスフェクトするために適切なベ
クター中の制御配列に連結される。ベクターとしては、
目的とする宿主と形質転換の方法とによるが、プラスミ
ド、ウィルス粒子、またはファージが１通常台まれる。

本願で用いられる「形質転換」という用語は、宿主細胞
によって引き起こされるあらゆる形態の異種ＤＮＡの取
込みを包含する。例えば、ウィルス感染、形質導入、接
合。

またはおそらく最も一般的なものであるが、トランスフ
エフティング剤（宿主に依存して１例えば塩化カルシウ
ム、もしくはＤ巳へε／デキストラン）を用いてトラン
スフェクトすることによるインビトロでの取り込みの誘
発が包含される。

次いで、形質転換された細胞を、所望のＤＮＡを含有す
る細胞についてスクリーニングし、成功裏に形質転換さ
れた細胞を、コーディング配列を発現させる条件下で培
養する。次に、産生されたレクチンを、培地（生成物が
分泌される場合）または溶解された細胞（生成物が細胞
内タンパクの場合）から精製される。

いずれの場合も、レクチンは、ラクトース溶液もしくは
他の溶液（緩衝液、トリトンＸ−１００）で抽出し１次
いでクロマトグラフィーに付すという標準的な方法で精
製される。便利なりロマトグラフィーには、ラクトース
・セファロースゲル（ｌａｃｔｏｓｅ　５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　ｇｅｔ　）　ｌこよるクロ７トグラフイーがある
。この方法では、抽出物をゲルに添加し、ゲルを洗浄し
１次いで、１００ｍＭのラクトースを含有する平衡緩衝
液を、−度にもしくは徐々に加えることによって溶離を
行う。活性画分中に該タンパクが存在していることは、
ラクトースを除去した後１両分がトリプシン処理したウ
サギ赤血球を凝集させることができるかどうかにより、
容易に検出できる。なお、この赤血球凝集性は、数ミリ
モルの濃度のラクトースもしくはチオジガラクトシドで
阻害される。

用途 本発明によるレクチンは、治療および診断の用途に有用
である。レビー、シイら（Ｌｅｖｙ、　Ｇ、　ｅｔ　ａ
ｌ、）。

ベられた電気レクチンと類似の方法で１本発明のグリコ
シル化部位を有する１４−β−ｇａｌ　哺乳動物レクチ
ンは２重症筋無力症のような自己免疫疾患の治療に使用
することができる。これらのレクチンにより治療する必
要がある他の自己免疫疾患には、リウマチ様関節炎、全
身性エリテマトーデス。

若年型糖尿病、および多発性硬化病が包含される。

これらのタンパクは、免疫系の調節物質であるから、一
般に移植片対宿主病の予防および移植組織に対する拒絶
反応の阻害にも有用である。さらに、これらタンパクに
対して免疫活性を有する調製された抗体は、腫瘍の診断
に有用である。その理由は、細胞表面に？けるこれらレ
クチンの濃度が、転移性癌と相関関係があるからである
。また。

薬剤をレクチンに結合させると、薬剤を適切な標的に向
わせるのに有用であるので１本発明のレクチンは、薬剤
投与法の応用に有用である。本発明のレクチンは、同様
にある種の細胞毒性分子に結合させて、ターゲツティン
グ剤として使用することができる。

治療用途に用いる場合、該タンパクは、当該技術分野で
公知の製剤法（例えば、　Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐ
ｈａｒ−ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　、
最新版、　Ｍａｃｋ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ、　、
　　ペンシルバニア州、フィラデルフィアに記載）を用
いてその投与法に適した様式で製剤される。典型的な注
射用処方物としては、ハンクス液もしくはリンガ−溶液
のような注射用の生理学的緩衝液との混合物；リポソー
ム類または他の薬剤投与に適した乳化剤によりカプセル
化したものなどが包含される。

本発明のレクチンの投与量および投与方法は。

症状、患者、および治療する疾患の重さにより決定され
る。好ましい投与量は、約０．００４　ｍｇ／　ｋｇ／
日〜約２ｍｇ／ｋｇ／日である。好ましい投与法は。

静脈投与、皮下投与、および経口投与が含まれる。

（以下余白） 次に実施例によってこの発明を説明するがこの発明を限
定するものではない。

実施例１ 上記のλｇｔｌｏライブラリー由来のＬＰ５９／ＬＰ６
０雑種形成りローンの挿入物を、細菌クローニングベク
ターに連結することによって、プラスミドｐＨＬＩＩを
構築した。従って、　ｐＨＬｌｌは、全コード配列と。

５°および３°の非翻訳領域とを有する。

この遺伝子を１発現ベクタープラスミドル１フ１に。

２つのセグメントで結合させた。プラスミド１７１は、
ネズミのＤ）ＩＦＲと、　ＳＶ４０プロモーターと、　
）ＩｉｎｄｌｌＩおよびＨａ品旧制限部位を含むポリリ
ンカーで分離されたポリアデニル化部位と、を含む発現
系を有する。

ＨＬ−６０レクチン配列の５°部分は、　ｐＨＬｌｌを
Ｂ、ｃｏＲＩとＳｍａｌとで消化し、得られた断片をＥ
ｃｏＲＩ／Ｓｍａ［で消化したｐｆｌ（、＋３に連結し
、　Ｂ、ｃｏｌｉ内で複製することによってクローン化
され、ｐシ１が得られる。その下流部分の増幅は次のよ
うにして行われる。つまり、　ｐＨＬｌｌをＮｃｏＩで
消化し、クレノーで平滑末端とし、　ＢｃｏＲＩで消化
し、　　１４０ｂｐ　ＢｃｏＲＩ／平滑末端断片を単離
し、この断片をＢ、ｃｏＲｆ／Ｓｍａｌで消化したｐＨ
ｃ１３に連結し１次いで巳、ｃｏｌｉ内で増幅すること
によってｐＬ２が得られる。

上流部の断片は、　ＨｉｎｄＩＩ［とＥｃｏＲＩとで消
化し。

３７０ｂｐの断片を単離することによって、　ｐＨ１１
から単離され、下流のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ１１５０ｂ
ｐ断片はｐＨ１２から単離される。単離された断片を、
　Ｂａｍ）ＩＩ／）ＩｉｎｄｌｌＩで切断した発現ベク
ターｐ１７１に連結し、得られた連結混合物をＥ、ｃｏ
ｌｉに形質転換し、満足すべき形質転換体を選択する。

ＳＶ４０プロモーターの制御下にあるＨＬ−６０レクチ
ン遺伝子とボリアデニシル化部位とを有するプラスミド
　（ｐＳＶ／ＩＬＬ−６０）が単離された。次いで単離
されたベクターを、　ｆｌＨＦＲを欠いたチャイニーズ
ハムスター卵巣（Ｃ’ＨＯ）を細胞系を形質転換するの
に用い１次にグリシン、ヒボキサンチンおよびチミジン
を欠いたＦ１２培地中で増殖しうる満足すべきコロニー
を単離し１選択培地中で増殖させた。

選択した細胞を９次に、Ｆ１２培地で１−当り２Ｘ　１
０’の細胞数で４８時間培養し、採集した。得られた細
胞を溶解し、ウサギ赤血球凝集を検定法を用いて、得ら
れた溶解物がＨＬ−６０レクチンを含有していることを
確認した。

実施例２ Ｃｌａ　Ｉ制限部位を、開始コドンを保持し、下流のコ
ード配列を維持する第１図のアミノ酸１のコドンのすぐ
上流に導入した。この上流の配列を。

Ｃ１ａｌ／ＢｃｏＲＩによる消化によって取り出し、　
３１０ｂｐ／Ｃａｌ／ＢｏＲＩ断片として単離した。こ
の断片を、上記のｐＨＬ２から単離されかつ下流の断片
を有する１５０ｂρＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片ととも
に、　Ｃ１ａ／ＢａｍＨ１で消化した発現ベクターに連
結した。この発現ベクターは。

ＳＶ４０プロモーターの制御下にある疎水性分泌タンパ
クシグナル配列と１該シグナルの３゛末端におけるＣｌ
ａｌ部位とを有する。この発現ベクターはまた。ネズミ
叶ＰＲの発現系を有する。

得られた連結混合物を、上記のように、　ＤＩＩＦＲを
欠いたＣＨＤ細胞に形質転換し、実施例１と同様にして
培養した。Ｆ１２　（ｇｌｌＴ−）培地中で４８時間培
養後。

培養を採集し、　ＢＬＩＳＡ法を用いてＨＬ−６０のレ
クチン産生を検定した。

・実施例３ １１Ｌ−６０レクチンのＨＬ〜６０細胞からの単離天然
のＨＬ−６０レクチンを、　ＨＬ−６０細胞溶解物から
次のようにして単離した。ラクトースまたはトリトンＸ
−１００溶液で処理することによって、溶解物中の該タ
ンパクを可溶化し、得られた可溶化レクチンを、ラクト
ース・セファロースカラム又はアシアロフェチュイン・
セファロースカラムによるアフィニティー法によって精
製した。

ラクトース・セファロースのグラジェント溶離によって
得たタンパク含有画分は、　５Ｏ５−ＰＡＧＥに付した
ところ、　　１４　ｋＤａと１７ｋＤａとの位置にピー
クを示しく第３図のレーン４）、これらのピークは適当
なレクチン活性を示す。アシアロフェチュインセファロ
ースカラム由来のタンパク含有ピークは。

１４ｋＤａのレクチンを含有しくレーン２）、そレテ３
ＱｋＤａの位置に少量のレクチンを含有している。

同様の処理を受けたヒト胎盤から単離されたレクチンは
、アフィニティ力ラムにかかわらず（レーンｌ、アシア
ロフェチュイン；レーン３．ラクトース）、１４ｋＯａ
主ピークと、　３０ｋ［］ａにおける少量のピークを示
し１７ｋＤａの種類は全く存在しなかった。

アフィニティクロマトグラフィに続いて、アセトニトリ
ル／水−ＴＦＡ溶媒系を使う［：４１（ＰＬＣカラムを
用いて、　ＨＬ−６０レクチンを均質に精製した。第４
図Ａおよび第４図Ｂは、アセトニトリル／ＴＦＡを用い
た濃度勾配溶出の結果；および両分の５Ｏ３−ＰＡＧＥ
分析を示す。１４ｋＤａレクチンは、　５Ｏ３−ＰＡＧ
Ｅの結果でわかるように９画分２に現れている。

１４ｋＤａおよび１７ｋＤａのタンパクが、赤血球凝集
活性に関与しているということが、ラクトース−セファ
ロースアフィニティークロマトグラフィーで溶離したＨ
Ｌ−６０タンパクの両分をＨＰＬＣで分析することによ
って決定された。１４ｋＤａのレクチンが。

１７ｋＤａのタンパクから分離されたとはいっても。

１７ｋＤａ型を含有する画分は、かなりの量の１４ｋＤ
ａレクチンを含有していた。第４図Ｂでわかるように、
　１４ｋＤａのタンパクは、赤血球凝集活性ピークに対
応する。さらに、精製１４ｋＤａの胎盤レクチンに対し
て生じたウサギ抗血清を用いて、　１４ｋＤａおよび１
７ｋＤａのタンパクをウェスタンプロット分析した結果
、　１４ｋＤａのタンパクには交差免疫反応性が認めら
れたが１７ｋＯａのレクチンには認められなかった（第
５図参照）。

１７ｋＤａのタンパクが、　１４ｋＯａタンパクのグリ
コシル化されたものである可能性について９両タンパク
をＮ−グリカナーゼ（Ｎ　−ｇｌｙｃａｎａｓｅ）　（
Ｇｅｎｚｙｍｅ）で処理して試験した。このＮ−グリカ
ナーゼは。

糖タンパク由来のＮ−アスパラギン結合オリゴ糖を加水
分解する。精製レクチン試料（２μｇ）を。

１０μｌの０．５％５Ｏ３−０，ＬＭ　　２−メルカプ
トエタノールに溶解し、０．１５単位のＮ−グリカナー
ゼで処理した。第５図に示すように、この酵素は、オロ
ソムコイドおよびフェチコイン両糖タンパクが脱グリコ
シル化される条件下では、いずれのＨＬ−６０タンパク
にも全く効力がなかった。レーン１は。

Ｎ−グリカナーゼを含み；レーン２はヒトオロソムコイ
ドを含み；レーン３はオロソムコイドとＮ−グリカナー
ゼとを含み；レーン４はウシフェチュインを含み；レー
ン５はウシフェチュインとＮ−グリカナーゼとを含み；
レーン６はラクトース・セファロースで精製されたＨＬ
−６０レクチンを含み；レーン７は１比−６０レクチン
とＮ−グリカナーゼを含む。１４ｋＤａはレクチンにつ
いて観察された分子量は、予想された分子量にほとんど
一致する。

１４、６１３ダルトンであるから、　　１４ｋＤａのレ
クチンはグリコシル化されていないようである。

精製した１４ｋＤａおよび１７ｋＯａのＨＬ−６０のタ
ンパクを、　５Ｏ５−ＰＡＧＥ分析に付した後、アミノ
酸配列を決定した。アミノ末端および１４ｋＤａレクチ
ンをブロックするには、レクチンを臭化シアンで処理し
て９分子内のメチオニンの位置でレクチンを切断する必
要がある。その断片のアミノ酸配列は、１２１位におけ
るメチオニンの開裂で得た。　１４ｋＤａ胎盤レクチン
の１４残基Ｃ末端断片の配列と同一であった。Ｆ７ｋＤ
ａ　ＨＬ−６０タンパクもまた。Ｎ末端でブロックされ
ており、臭化シアン処理で得た断、　１４ｋＤａＨＬ−
６０タンパクとは無関係の独特のアミノ酸配列となった
。さらにこの断片は、スイスタンパクデータバンク　（
Ｓｗｉｓｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ）の
他のいずれのタンパクとも有意な相同性を示さなかった
。

従って、　１７ｋＤａのタンパクは、Ｎ−グリカナーゼ
によって影響されず、赤血球凝集活性に関与しておらず
、　１４ｋＤａ胎盤レクチンに対して特異的なポリクロ
ーナル抗体とは反応せず（後述の第６図参照）、そのア
ミノ酸配列は、　１４ｋＤａの配列とは大きく異なる。

（以下余白） 実新Ｉ生先 新鮮なまたは凍結したヒト胎盤を、３倍容量（■／ｇ）
のホモジナイジング緩衝液中で均質化し。

得られたホモジネートを１０，０ＯＯＸ　ｇで１５分間
遠心分離した。次いで、得られたベレットを２倍容量の
ホモジナイジング緩衝？ａ　（もとの組織の重量に対し
て）と、　０．１　Ｍβ−ラクトースとの混合物中で、
４”Ｃで１時間撹拌して懸濁させ、　１０，０ＯＯＸ　
ｇで１時間遠心分離した。得られた上澄み液に固体の硫
酸アンモニウムを、　５０％飽和度まで添加し。

得られた溶液を４°Ｃで３時間インキュベートした。

次に、得られた溶液を３０，０ＯＯＸ　ｇで１５分間遠
心分離し、ベレットを廃棄し、得られた上澄み液に固体
の硫酸アンモニウムを添加して飽和させた。次に、得ら
れた溶液を４“Ｃで１６時間インキュベートし、　３０
，０ＯＯＸ　ｇで１時間遠心分離し、得られたベレット
を、　１／１０倍容量（もとの組織の重量に対して）の
１０＋ｗＭ　トリス−１ｗＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５
に熔解し。

ホモジナイジング緩衝液に対して透析した。得られたレ
クチンを、ラクトース・セファロースカラムもしくはア
シアロフェチュインカラムによるアフイニテイクロマト
グラフイによって精製した。

Ｅ、ｃｏｌｉ内で用いる発現ベクターを、イソプロピル
チオガラクトシド（ＩＰＴＧ’）誘発性ｔｒｐ−１ａｃ
　（ｔａｃ）プロモーターを含有するベクターｐＫＫ２
２３−３　＜ファルマシア社）を用いて構築した。レク
チンｃＤＮＡを。

コード配列の５゛末端で変異させて、レクチン＾ＴＧコ
ドンに接してＣ１ａｌ制限部位を導入した。この処理は
、バイオ−ラド　ムタジーンＭ１３キット（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ　Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ　Ｍ１３にｉｔ　）を用い、
オリゴヌクレオチドダイレクチイド変異誘発法により行
なった。

用いた合成オリゴヌクレオチドは下記の配列を有する。

５’　−ＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＴ
ＴＧＴＧＧＴ−３’ｌａｌ クローン１１の変異誘発したレクチンｃＤＮＡの４２１
ｂｐＣ１ａｌ／Ｎｃｏｌ断片（第１図Ｂ）を平滑末端と
し、　Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ベクター中の平滑
末端としたＥｃｏＲ１部位に連結した。Ｅ、ｃｏｌｉ　
ＪＭＩＯＩを標準法で形質転換し、得られたクローンを
、レクチンｃＤＮＡプローブと雑種形成させることによ
って試験した。クローンの構造を制限部位分析法で確認
した。雑種形成法で試験して陽性のクローンを選択して
、大量に増殖させた。

レクチンのｃＤＮＡを発現させるために、　５００　ｄ
のＬＢ培地に、　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ形質転換体
の一夜培養物２．５　ｄを接種した。９０分後、細胞に
１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって誘発し、３７
“Ｃにて６．０時間増殖させた。次いで細胞を採集し、
２０ｍＭ）リス−〇ＣＩ　、　ｐＨ７，４、２ｍＭ　Ｅ
ＤＴ＾、　１５０　ｍＭ　ＮａＣ１、４ｍＭ２−メルカ
プトエタノールおよび１　ｍＭ　ＰＭＳＦの混合物２５
Ｉ１１で洗浄した。次に、得られた細胞を、５分間の音
波処理を２回行って溶解し、得られた細胞溶解物を、１
０分間、　２５，０ＯＯＸ　ｇの遠心分離にかけて透明
にした。

得られたレクチン含有上澄み液を、ビニルスルホンで活
性化したセファロースに結合させたβ−ラクトースのカ
ラムを用い、　０．１　Ｍ　　β−ラクトース含有ホモ
ジナイジング緩衝液で溶離するアフィニティークロマト
グラフィーで精製した。得られた全両分を、標準法を用
いて５ＯＳ−ＰＡＧＥ法、免疫プロッティング法および
赤血球凝縮活性法で分析した。Ｎ末端アミノ酸配列分析
法によってＮ末端がアラニンであることがわかり、これ
は、細菌がイニシャルメチオニンを分解することによっ
て。

タンパクをプロセッシングすることを示す。Ｎ−末端ア
ラニンは１例えばアセチル化することによって修飾する
ことができることもまた。明らかである。

精製Ｅ、ｃｏｌｉのレクチンをウェスタンプロット分析
に付したところ、このレクチンが胎盤レクチンおよびＨ
Ｌ−６０レクチンと同じ電気泳動度および免疫反応性を
有することが分かった。第６図は、い（つかの１４ｋＤ
ａ　レクチンの５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析およびウェスタン
プロット分析の結果を示すラバネルＡでは、各レクチン
を、電気泳動法に付し、コマシー・ブルーＲ−２５０で
染色した；パネルＢでは、各レクチンは、Ｐｖ叶膜に移
して、抗胎盤レクチン抗体およびＨＲＰを結合したヤギ
抗ウサギＩｇＧで処理して可視化した。

両ボリルの各レーンは次のとおりである：レーンＡ　１
　、　ＪＭＩＯＩ　Ｅ、ｃｏｌｉｌ解物５０μｇ；レー
ンＡ２゜ＨＬ−６０レクチン発現プラスミドを含有する
Ｅ、ｃｏｌｉ由来の溶解物５０μｇ　；レーンＡ３．胎
盤レクチン。

５μｇ　；レーンＡ　４　、　ＨＬ−６０レクチン５μ
ｇ　；レクチンＡ　５　、　Ｅ、ｃｏｌｉ由来レクチン
５μｇ　；レーンＢ　１　、　ＪＭＩＯＩ溶解物１０μ
ｇ　；レーンＢ　２　、　ＨＬ−６０レクチン発現プラ
スミドを含有するｆ！、ｃｏｌｉ由来の溶解物１０μｇ
；レーンＢ３．胎盤レクチン０．２μｇ；レーンＢ　４
　、　ＭＬ−６０レクチン０．２　μｇ　：レクチンＢ
　５　、　Ｅ、ｃｏｌｉ由来レクチン０．２　／／ｇ　
、さらに、赤血球凝縮検定法に付したＥ、ｃｏｌｉ由来
のレクチンは。

ＨＬ−６０レクチンおよび胎盤レクチンと類似の活性を
示した。

Ｅ、ｃｏｌｉ由来のレクチン、　ＨＬ−６０レクチン、
および胎盤レクチンの分析により、　Ｅ、ｃｏｌｉで発
現されたレクチンが、胎盤レクチンおよびＨＬ−６０レ
クチンとほぼ同じ比活性を有することが分かった（第１
２図、後記）。上記のことは１組換え体レクチンが、生
物学的に活性であり、　ＨＬ−６０細胞および胎盤のよ
うな天然の起源から単離されたレクチンと類似のもので
あることを示している。

（以下余白） 実施例６ ＣＩＩＯ細胞は、レクチンｃＤＮＡを含むベクター（ｃ
ＤＮＡベクター）、もしくはレクチンｃＤＮＡおよび作
動可能に結合した分泌シグナルを含むベクター（分泌ベ
クター）でトランスフェクトされた。第７図は。

免疫沈降反応し１代謝的に標識されたレクチンの５Ｏ３
−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。このレクチンは、
後述のようにトランスフェクトし、ならびに処理された
ＣＨＯ細胞によって生成する。レーン２は、　Ｐ−１８
（ｃＤＮＡベクター）形質転換細胞の上清と免疫血清と
を含み；レーン３は、　Ｐ、−１８の上清と正常なウサ
ギの血清（ＮＲ３）とを含み；レーン４は。

ＰＳ−２（レクチン分泌ベクター）の上清と、免疫血清
と、Ｎ−グリカナーゼとを含み；レーン５は。

ＰＳ−２の上清と免疫血清とを含み；レーン６は、ＰＳ
−２の上清とＮＲ３とを含み；レーン７は、　ＰＳ−２
の抽出物と免疫血清とを含み；レーン８は、　ＰＳ−２
の抽出物とＮＲ３とを含み；レーン９は、　ＰＳ−２の
抽出物と、免疫血清と、Ｎ−グリカナーゼとを含み；レ
ーン１０は、　Ｐ−１８の抽出物とＮＲＣとを含み：そ
してレーン１１は、　Ｐ−１８の抽出物と免疫血清とを
含む。

数種のレクチン（１８〜２０ｋＤａ型および１４ｋＤａ
型のレクチン）は免疫沈降反応した。レーン５に見られ
るように、大きな型のレクチンは１分泌シグナルと作動
可能にして結合したｃＤＮＡによりトランスフェクトさ
れた細胞によってのみ分泌される。

しかし、そのレクチンは、細胞溶解産物中では見い出さ
れない（レーン７）。大きな型のレクチンは、Ｎ−グリ
カナーゼで処理すると、　１４ｋＤａ型に変化する（レ
ー、ン４）。

免疫沈降反応し９代謝的にラベルされたレクチン（この
レクチンは、いくつかの他の細胞系の溶解産物から得ら
れた）の５Ｏ３−ＰＡＧｆ！分析を第８図に示す。レー
ン３および４はそれぞれＮＲ３および免疫血清で処理し
たヒトの包皮繊維芽細胞の溶解産物から得られたレクチ
ンを含む。レーン５および６は、それぞれＮＲ３および
免疫血清で処理された。

トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の溶解産物から得ら
れたレクチンを含む。レーン７および８は。

それぞれＮＲ３および免疫血清で処理したＨＬ−６０細
胞の溶解産物から得られたレクチンを含む。レーン９お
よび１０は、それぞれＮＲ５および免疫血清で処理した
Ｕ９３７細抱の溶解産物から得られたレクチンを含む。

レーン１１および１２は、それぞれＮＲ３および免疫血
清で処理したＫＧＩａ細胞溶解産物から得られたレクチ
ンを含む。レーン１３および１４は。

それぞれＮＲ３および免疫血清で処理したＰＢＬ細胞の
溶解産物から得られたレクチンを含む。細胞溶解産物中
には、レクチンの１４ｋＤａ型のみが存在し。

このことは、第７図に示される結果と−・致する。

上清の免疫沈降反応において、いくつかの分泌されたレ
クチンが示されていない。

第９図には、免疫沈降反応し代謝的にラベルされたレク
チン（レクチンｃＤＮＡは１分泌シグナルと作動可能に
結合したレクチンｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣ
ＨＤ細胞によって分泌される）の５Ｏ３−ＰＡＧＥ！分
析が示されている。レーン１および２は。

それぞれＰＳ−２（レクチン分泌ベクター）上清および
ＮＲ３；およびＰＳ−２および血清を含む。レーン３お
よび４は、それぞれＰＳ−２上清、　２００　ｎｇ／ｍ
ｔ２のレクチン、および免疫血清：およびＰＳ−２上清
、２００ｎｇ／μｍのレクチンおよびＮＲ３を含む。レ
ーン２および３は、　１４ｋＤａおよび１８ｋＤａ型の
分泌を示す。

分泌シグナルと作動可能に結合したレクチンｃＤＮＡに
よりトランスフェクトされたＣ）１０細胞によって分泌
されたレクチンを、Ｎ−グリカナーゼで処理し、　５Ｏ
３−ＰＡＧＥにかけた。その結果を第１０図に示す。レ
ーン１．２．５および６は、　ＰＳ−２（レクチン分泌
ベクター）の上清と免疫血清とを含む。レーン３および
４は、Ｎ−グリカナーゼで処理された。　ＰＳ−２の上
清を含む。レーン３と４において。

１８〜２０ｋＤａレクチンが存在しないということは。

１８〜２０ｋＤａレクチンが１４ｋＤａレクチンのグリ
コシル化された形のものであることを示す。

分泌シグナルに作動可能に結合したレクチンｃＤＮＡに
よりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞により分泌され
たレクチンを、ラクトース・セファロースカラムで精製
し、そしてその溶質画分をＳＯ３−ＰＡＧＥにかけた。

第１１図に示されるように、大型レクチンおよび小型レ
クチンのいずれもがラクトースと結合し、そして９次の
実施例に示されるように。

凝集分析において活性を有する。

実施例７ レクチンのβ−ガラクシド結合活性に関する分析 １４ｋＤａレクチンの生物的活性を、トリプシンで処理
したウサギの赤血球の凝集反応によって確か約だ。上記
１４ｋＤａレクチンは、　）Ｉｔ、−６０細胞、胎盤の
組織、そして１分泌シグナルと作動可能に結合したレク
チンｃＤＮへでトランスフェクトされたＥ、ｃｏｌｉ細
胞から得られた。第１２図に示されるように、−番上の
列は、コンカナバリンＡのコントロールであり、凝集の
エンドポイントは１．５μｇ／ｒｄ、である。

その下の６列は、３種の精製された１４ｋＤａのレクチ
ンを種々の濃度の完全糖（ｃｏｍｐｌｅｔｉｎｇ　ｓｕ
ｇａｒ）とともにインキコベートした結果を示す。上記
完全糖は、　１４ｋＤａ胎盤レクチンの強力なインヒビ
ターとして知られているβ−ラクトースおよびチオジガ
ラクトシドである。チオジガラクトシドは。

０、３１ｄを越える濃度のときに赤血球のひ集反応を阻
害し、そしてβ−ラクトースは、　　１．２５ｍＭを越
える濃度のときに赤血球の凝集反応を阻害した。

実施例８ シビレエイ　（ｒａｙ　Ｔａｒｐｅｄｏ　Ｍａｒｍｏｒ
ａｔａ　）の電気器官から得られたアセチルコリンレセ
プターを。

ナジャ　ナジャ　シアメンシス（Ｎａｊａ　ｎａｊａ　
ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）の神経毒を用いたアフィニティク
ロマトグラフィーによって精製した。破傷風毒素は、ス
ウェーアン国立微生物研究所から人手し、該毒素は、ホ
ルマリンで処理された破傷風毒素（通常、ワクチンとし
て使われている）でなる。肺炎連鎖球菌の２３種の異な
る血清型から抽出した莢膜多糖類抽出物の混合物は、マ
ーク　シャープ　ドーム（ｌＪｅｒｃｋ３ｔ＋ａｒｐｅ
　Ｄｏｍｅ　）　Ｉｎｃ、から入手した。ＢＡＬＢ／ｃ
およびＣ５６ＢＬ／６マウスの若い成体の雌（生後２〜
４ケ月）を使用した。マウスに、完全７０インドＴシユ
バント中に１０μ８の精製されたアセチルコリンレセプ
ター、または破傷風毒素、または肺炎双球菌の多糖類の
いずれかを含み、かっＨＬ−６０レクチンを含むかまた
は含まない混合物を注射した。これらの予備実験で注射
するレクチン量はマウス１匹あたり０．１から２５μｇ
の間であった。血液を３日後。

１週間後、２週間後、３週間後および４週間後に採取し
た。アセチルコリンレセプターを注射されたマウスにお
いて、実験的自己免疫重症筋無力症を発現させるために
、マウスを、神経筋の機能障害の微行について毎日観察
した。１０日後には、このマウスは、くりかえして物を
つかむこと、泳ぐこと、および逆さにぶらさがる運動が
強いられた。

なお、これらの運動は、熱ランプで３５℃にて５分間あ
たためた後１ｍり返して行われた。これらの観察の結果
を表１に示す。表１から、高投与量でテストされた両系
統のマウスにおいて１組み換え型のＨＬ−６０レクチン
は、神経筋の機能障害を遅延されるのに明らかに有益な
効果をもたらすことがわかる。

表１ マウスの系統 Ｂ＾しＢ／ｃ Ｃ５７Ｂ／６ レクチン０．１〜５μｇ ± レセプター レクチン１５〜２５μｇ ＋ レセプター １ル レセプターのみ 観察した後、動物を殺し、皮膚をはぎ、そして。

内臓を摘出し、そして、コリン作動性のレセプターの抽
出物を動物の胴体全体から調製した。

表２ 本実施例Ａ項で調製したのと同様の方法で調製されたレ
セプター抽出物の既知の部分を定量のために該レセプタ
ーをラベルする目的で、３７℃で１時間、１０倍過剰量
のＩ２Ｓ■−α−ブンガロトキシンとともにインキュベ
ートした。その混合物をセファクリルＧ２００でゲルろ
過し、遊離の、ならびに結合した毒素を分離した。マウ
スの胴体中に存在するレセプターの量を同時に投与され
た組み換えＨＬ−６０レクチンの量とともに表２に示す
。これらのデータにより、約１５〜２５μｇの投与量に
おいて。

組み換えＨＬ−６０レクチンが、注射されたアセチルコ
リンレセプターの生体内での影響を妨げることが示され
る。

（以下余白） （注射後１０日後に測定） 正常マウス へＣｈＲ＋レクチン （０，１μｇ） ＡＣｈＲ＋レクチン （ｌμｇ） ＡＣｈＲ＋レクチン （５μｇ） （ｍｏｌＸ　１０−”　） ３．９±０．７ ０．８±０．４ １．４±０．３ ０．９±０．５ く％） ４８±６．０ ５２±２．０ ４４±５．０ ＡＣｈＲ＋レクチン （１５Ｍｇ）　　　　　　３．５±０．４　　　　１１
±１０．７ＡＣｈＲ＋レクチン （２５μｇ）　　　　　　３．２±０．６　　　　１１
±７．８＾ＣｈＲのみ　　　　　　　１．５±０．２　
　　　　６５±２．６［ＡＣｈＲニアセチルコリンレセ
プター〕Ｃ，シビレエイ　（Ｔｏｒｐｅｏ）およびマウ
スのレセプＤ、　アセチルコリンレセプター、破傷風毒
素およこれらの測定は、レセプター抽出物を１０倍過剰
量の標識ブンガロトキシンとともに一晩、４℃にインキ
ユペートシ、沈澱を分離し、洗浄し、そして放射能を計
数することにより行なわれた。表２の結果により、レク
チン処理されたマウスにおいては、約１５〜２５μ乙の
投与量が、免疫グロブリン（Ｉｇ）と結合した筋肉アセ
チルコリンレセプターの量を減少させるのに効果のある
ことが示される。

（以下余白） ３匹のＢＡＬＢ／Ｃ難マウス（ツマウス）のそれぞれに
、完全フロインドアジュバント中５μｇのレセプター抗
原、破傷風毒素もしくは肺炎球菌多糖類を腹腔的注射し
、そして２週間後に、　０．１５Ｍ　ＩＪン酸す）　＋
Ｊウム緩衝液、　ｐＨ７，４中の同量の抗原を静脈注射
した。同じ株の３匹のマウスに、これらの抗原と１５Ｍ
ｇのｌ化−６０レクチンとを組み合わせて免疫した。動
物を、ブースター注射４日後に殺し。

膵臓細胞（１０ａ細胞）を非分泌型Ｂ　ＩＪンパ細胞腫
細胞系５Ｐ２−０＾ｇ１４　　（２ｘｌＯ’細胞）と融
合させた。

細胞混合物を、２Ｘ１０’細胞／ウエルの割合で。

６Ｘ９６コスター（Ｃｏｓｔａｒ）　　）レーのウェル
内に。

マウスの腹膜マクロファージのフィーダー層（５Ｘ１０
５細胞／ウエル）とともに分配した。培養の３日目から
ＨＡＴ　　（ヒボキサチンーアミノプテリン−チミジン
）培地を加えた。

１０〜１４日後に、上澄みを分析し、免疫化に使用した
各抗原に結合している否かを調べた。前述の通り、　Ｂ
ＬＩＳＡを使用した。

表３の結果から、抗体とともにレクチンを与えた場合に
は、投与したタンパク抗原に対する特異的な抗体を産生
ずるＢ細胞レパートリ−が初期免疫後に減少することが
わかる。

表３ （以下余白） 実施例９ る抗体の決定 実施例８．　Ａ項と同様にして調製した精製レセプター
５μｇ／−を含有する溶液１００μｌでマイクロタイタ
ーのウェルを一晩コートし、血清（１／２５に希釈）を
用いて、３７℃で３時間インキュベートした。洗浄後、
アルカリフォスファターゼ接合ヤギ抗マウスの免疫グロ
ブリンを用いて、３７℃で３時間プレートをインキュベ
ートした。次に。

プレートをよぐ洗浄し、ｐ−フェニルリン酸エタノール
アミン緩衝液を用いて３７℃で１時間インキュベートし
た。３Ｍ　ＮａＯＨ２５μｌを添加して反応を停止させ
、そして、ラベルした抗体の結合をＥＬＩＳＡマイクロ
リーダーを用いて４０５ｎｍで測定した。５０匹を越え
る数のマウス由来の正常マウス血清プールを負のコント
ロールとする。遮断限界（ｃａｔ−ｏｆｆｌｉｍｉｔ）
は正常血清プールで得られた累積値の平均値＋４ＳＤで
あった。結果を、放射性免疫分析によって得られた結果
と比較し、正常固体群（５０匹を越えるマウス）からの
累積結果の平均値＋４ＳＤを差し引いた後、血清ＩＩ！
で沈澱するトキシンレセプターのモル数で表わした。

Ｂ、マウスアセチルコリンレセプターに対する抗体 抗体は抗原として部分的に精製した正常マウスの骨格筋
レセプターと１２５１−α−ブンガロトキシンとの複合
体を用いて決定された。結果は、正常個体群（５０匹を
越えるマウス）からの累積結果の平均値＋４ＳＤを差し
引いた後、血清１１で沈澱するトキシンレセプターのモ
ル数で表わした。

Ｃ０破傷風毒素および莢膜多糖類に対する抗体抗体は、
酵素結合免疫分析法（ＢＬＩＳＡ）で決定した。抗原の
５μｇ／−を含有する溶液１００μｍでマイクロタイタ
ーのウェルを一晩コートし、血清（１／２００に希釈）
を用いて３７℃で３時間・インキュベートした。洗浄後
、アルカリフォスファターゼ接合ヤギ抗マウスの免疫グ
ロブリンを用いて３７℃で３時間プレートをインキュベ
ートした。次に。

プレートをよく洗浄し、ｐ−フェニルリン酸エタノール
アミン緩衝液を用いて３７℃で１時間インキュベートし
た。３Ｍ　ＮａＯＨ２５μβを添加して反応を停止甘さ
、そして、ラベルした抗体の結合をＥＬＩＳＡマイクロ
リーダーを用いＣ４０５ｎｍで測定した。５０匹を越え
る数のマウス由来の正常マウス血清プールを負のコント
ロールとする。遮断限界は（ｃｕｔ−ｏｆｆ　１１ｍ１
ｔ）は正常血清プールで得られた累積値の平均値＋４Ｓ
Ｄであった。値は正常血清プールの平均値＋４ＳＤを差
し引いた後のミリ吸光度単位で表した。

ＢＡＬＢ／ｃマウス群は、破傷風毒素、肺炎球菌多糖類
、シビレエイレセプターおよびマウスレセプターで免疫
された。この時、　ＨＬ−６０レクチンを添加せずに、
あるいは抗原に加えて種々の量のＨＬ−６０レクチンを
添加して免疫を行った。

３日後に血液を採取し、再び１．　２．　３および４週
間後に採取して、抗体量を決定した。この結果を第１３
図Ａ、第１３図Ｂ、第１３図Ｃおよび第１３図りに示す
。第１３図Ａ、第１３図Ｃおよび第１３図りに示すよう
に、Ｔ型依存抗原に対する初期免疫反応はレクチンを高
濃度に投与した場合、有意に低くなる。同様の結果は、
Ｔ型部依存抗原である肺炎球菌多糖類では観測されなか
った（第１３図Ｂ）。

実施例１０ ラットに組み変え型ＨＬ−６０レクチンを静脈注射した
場合の結果を表４および表５に示す。レクチンの静脈投
与は０日目に開始し、４日目および６日目に追加レクチ
ンの処理を行った。このことにより、疾患の発生にわず
かな遅延を生じた。疾患はレクチン処理をしなかった場
合に比べ軽症で。

疾患期間が短く、ならびに体重の減少も少なかった。

表５より、免疫される３日前からレクチンを投与し、７
日目まで毎日注射することによって、病気の発生は完全
に防止されたことがわかる。

（以下余白） 実施例１１ 表６Ａはレクチン処理したラット由来のラットリンパ節
、サプレッサーＴ細胞〔モノクローナル抗体ＯＸ　８　
（Ｓｅｒｏｔｅｃ−Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　インデ
イアナポリス、インデイアナ州）と反応する〕の数が２
８％増加することを示している。

表６Ｂは、膵臓サプレッサーＴ細胞の数が３２％増加し
、そして、ヘルパーＴ細胞（Ｗ３／２５抗体反応性、　
５ｅｒｏｔｅｃ−Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、）および全
Ｔ細胞（Ｗ３／１３抗体反応性、　５６ｒＯｊｅ（−１
３ｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、）の数がそれぞれ１９％およ
び２４％減少することを示している。

（以下余白） ＼ ＝″′）１−口 ＝Δ二口 実施例１２ 表７の結果は組み換えヒトレクチンが特異的にヒトのマ
クロファージと反応することを示している。ヒトの血液
細胞をＨＬ−６０レクチンで前処理し。

その後特異的な抗体く螢光標識化）で螢光を発するよう
にした場合に、　　ＣＤ３＋、　　ＣＤ４＋、　ＮＫ（
Ｌ−Ａ）またはＨＬＡ−ＯＲ細細胞−カ＝（Ｂｅｃｔｏ
ｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）については、有意な変化が認
められなかった。しかし、　ＭｌおよびＭ３マクロファ
ージでのレクチン処理の効果は重要であり、陽性の細胞
の割合がＭｌおよびＭ３で、それぞれ３３％右よび２６
％減少していることから、！４１およびＭ３抗体で認識
されるエピトープとレクチンとの相互作用が示唆される
。

（以下余白） （発明の要約） 他の既知の動物レクチン類とは異なるアミノ酸配列を有
するヒトＨＬ−６０レクチンが開示されている。このヒ
トＨＬ−６０レクチンは、ラクトースまたは界面活性剤
で抽出可能であり、かつβ−Ｄ−ガラクトシドに特異的
な哺乳動物レクチン類の１種である（少なくとも１つの
グリコシル化部位を有する１４−β−ｇａｌ　レクチン
）。さらに、哺乳動物の１４−β−ｇａｌ　レクチン類
（特に、　ＨＬ−６０レクチン）を種々の宿主で生産す
るための組換え方法およびその材料、そして得られたレ
クチン類の利用方法についても記載されている。ヒ）　
ＨＬ−６０レクチンはＨＬ−６０細胞や胎盤組織中に存
在する。

【図面の簡単な説明】

第１図ＡはヒトＨＬ−６０レクチンおよび胎盤レクチン
の両方に対するｃＯＮ＾配列および推定アミノ酸配列を
示す図である。図中、配列の上側に付記された数字は対
応するヌクレオチドに関するものであり、枠で囲まれた
部分は開始コドンおよび終止コドンを示す。また、星印
はＮ結合によるグリコシル化が可能な部位を示す。 第１図Ｂは２つのＨＬ−６０ｃＤＮＡクローンに対する
制限酵素切断地図を示す図である。図中、コード領域は
白抜きの枠部分で示されており、用いた配列決定の方針
も併せて示されている。 第２図Ａは、　ＨＬ−６０ｃＤＮＡをプローブとして用
いた。　ＨＬ−６０細胞およびヒト胎盤細胞に由来のＤ
ＮＡに対するサザンプロット分析結果を示す図である。 この図は、　１４ｋＤａのレクチンに対する１つの遺伝
子の存在を示している。 第２図Ｂは、　ＨＬ−６０ｃＤＮＡをプローブとして用
いたノーザンプロット分析の結果を示す図である。 この図は、様々な細胞系に含まれ、レクチンをコードす
ると推定されるｍＲＮＡのメツセージが、同じ長さであ
り、かつ相同性を有することを示している。 第３図は精製されたレクチン調製物に対する５Ｏ５Ｐ八
ＧＥへ析結果を示す図である。 第４図Ａは、　ＨＬ−６０レクチンのＨＰＬＣ精製にお
ける溶出画分の５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析結果を示す図であ
る。 第４図Ｂは、各両分の凝集活性と、　２１４ｎｍにおけ
る吸光度とを重複させて示した図である。 第５図は、Ｎ−グリカナーゼで処理されたＨＬ−６０レ
クチンに対する銀染色５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析の結果を示
す図である。 第６図ＡおよびＢは、レクチンｃＤＮＡでトランスフェ
クトされたＩＩ！、ｃｏｌｉ細胞に由来するレクチンを
含む、様々な１４ｋＤａのレクチンに対する５Ｏ３−Ｐ
ＡＧＢ分析およびウェスタンプロット分析の結果を示す
図である。 第７図は、　ＨＬ−６０レクチンｃＤＮＡでトランスフ
ェクトされるか１．あるいはＨＬ−６０レクチンｃＤＮ
Ａおよび作動可能なように連結された分泌シグナルでト
ランスフェクトされたＣＨＤ細胞により産生される。 免疫沈降反応を起こし９代謝的に標識されたＩ（Ｌ−６
０／胎盤レクチンに対する５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析結果を
示す図である。 第８図は、数種の細胞系に由来する。免疫沈降反応を起
こし１代謝的に標識されたレクチンに対する５Ｏ３−Ｐ
ＡＧＥ分析結果を示す図である。 第９図は９分泌シグナルに作動可能なように連結された
ＨＬ−６０レクチンｃＤＮＡでトランスフェクトされた
ＣＨＯ細胞により分泌される。免疫沈降反応を起こした
レクチンに対する５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析結果を示す図で
ある。 第１０図は１分泌シグナルに作動可能なように連結され
たＨＬ−６０レクチンｃＤＮＡでトランスフェクトされ
、かつＮ−グリカナーゼで処理されたＣＨＯ細胞により
分泌される。免疫沈降反応を起こしたレクチンに対する
５Ｏ５−ＰＡＧＥ！分析結果を示す図である。 第１１図は１分泌シグナルに作動可能なように連結され
た１化−６０レクチンｃＤＮＡでトランスフェクトされ
たＣＨＯ細胞により分泌されるレクチンのラクトース・
セファロース精製における溶出画分の５Ｏ８ＰＡＧＥ分
析結果を示す図である。 第１２図は、レクチンｃＤＮＡと９作動可能なように連
結された分泌シグナルとを有するベクターでトランスフ
ェクトされた。ヒト胎盤、　ＨＬ−６０細胞。 およびＥ、ｃｏｌｉ細胞に由来する精製されたレクチン
の血球凝集に関する生物学的分析結果と、糖類によるＶ
集阻害とを示す図である。 第１３図Ａは、破傷風トキソイドに対する一次免疫反応
に及ぼす）比−６０レクチンの影響を示すグラフである
。 第１３図Ｂは、肺炎°球菌多糖体に対する一次免疫反応
に及ぼすＨＬ−６０レクチンの影響を示すグラフである
。 第１３図Ｃは、　Ｔｏｒｐｅｄｏ受容体に対する一次免
疫反応に及ぼすＨＬ−６０レクチンの影響を示すグラフ
である。 第１３図りは、　Ｔｏｒｐｅｄｏ受容体で免疫された動
物におけるマウス、受容体に対する一次免疫反応に及ぼ
すＨＬ−６０レクチンの影響を示すグラフである。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、哺乳動物の１４−β−ｇａｌレクチン。 ２、少なくとも１つのグリコシル化部位を有する哺乳動
   物１４−β−ｇａｌレクチン。 ３、前記グリコシル化部位が９２位〜１０１位の範囲内
   にある、請求項２に記載の哺乳動物１４−β−ｇａｌレ
   クチン。 ４、前記グリコシル化部位で糖に結合している、請求項
   ２に記載の哺乳動物１４−β−ｇａｌレクチン。 ５、約１７ｋＤａと２０ｋＤａとの間の分子量を有する
   、請求項４に記載の哺乳動物１４−β−ｇａｌレクチン
   。 ６、純粋な形態のヒトＨＬ−６０レクチンであって、第
   １図Ａに配列２〜１３５として示されたアミノ酸配列を
   有するタンパクを包含する、請求項２に記載の哺乳動物
   １４−β−ｇａｌレクチン。 ７、組換え技術により製造される、請求項２に記載の哺
   乳動物１４−β−ｇａｌレクチン。 ８、分子量１４ｋＤａのヒトＨＬ−６０レクチンである
   、請求項２に記載の哺乳動物１４−β−ｇａｌレクチン
   。 ９、胎盤組織から産生される、請求項８に記載の哺乳動
   物１４−β−ｇａｌレクチン。 １０、ＨＬ−６０細胞から産生される、請求項８に記載
   の哺乳動物１４−β−ｇａｌレクチン。 １１、組換え技術により製造される、請求項８に記載の
   ＨＬ−６０レクチン。 １２、Ｎ末端アミノ酸がメチオニン、アラニン、または
   アセチル化アラニンであるアミノ酸配列を有する、請求
   項１１に記載のＨＬ−６０レクチン。 １３、請求項１の哺乳動物１４−β−ｇａｌレクチンを
   コードする、単離された純粋な形態の組換えＤＮＡ配列
   。 １４、請求項２の哺乳動物１４−β−ｇａｌレクチンを
   コードする、単離された純粋な形態の組換えＤＮＡ配列
   。 １５、請求項８のＨＬ−６０レクチンをコードする、単
   離された純粋な形態の組換えＤＮＡ配列。 １６、請求項１４のＤＮＡ配列を有する発現系であって
   、 該ＤＮＡ配列が適切な宿主細胞中でその発現を起こさせ
   得る制御配列に作動可能なように連結されている、発現
   系。 １７、請求項１５のＤＮＡ配列を有する発現系であって
   、 該ＤＮＡ配列が適切な宿主細胞中でその発現を起こさせ
   得る制御配列に作動可能なように連結されている、発現
   系。 １８、前記宿主細胞が￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥細胞である、請
   求項１６に記載の発現系。 １９、前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１６に
   記載の発現系。 ２０、前記宿主細胞が￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥細胞である、請
   求項１７に記載の発現系。 ２１、前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１７に
   記載の発現系。 ２２、請求項１４のＤＮＡ配列でトランスフェクトされ
   た細胞または細胞培養物。 ２３、請求項１５のＤＮＡ配列でトランスフェクトされ
   た細胞または細胞培養物。 ２４、請求項１６の発現系でトランスフェクトされた細
   胞または細胞培養物。 ２５、請求項１７の発現系でトランスフェクトされた細
   胞または細胞培養物。 ２６、請求項１８の発現系でトランスフェクトされた細
   胞または細胞培養物。 ２７、請求項１９の発現系でトランスフェクトされた細
   胞または細胞培養物。 ２８、請求項２０の発現系でトランスフェクトされた細
   胞または細胞培養物。 ２９、請求項２１の発現系でトランスフェクトされた細
   胞または細胞培養物。 ３０、少なくとも１つのグリコシル化部位を有する組換
   え１４−β−ｇａｌレクチンを製造する方法であって、 請求項２４の細胞を培地中にて４−β−ｇａｌレクチン
   の産生に適した条件下で培養すること、および該培地か
   ら１４−β−ｇａｌレクチンを回収すること、を包含す
   る組換え１４−β−ｇａｌレクチンの製造方法。 ３１、組換えＨＬ−６０レクチンを製造する方法であっ
   て、 請求項２５の細胞を培地中にてＨＬ−６０レクチンの産
   生に適した条件下で培養すること、および該培地からＨ
   Ｌ−６０レクチンを回収すること、を包含する組換えＨ
   Ｌ−６０レクチンの製造方法。 ３２、哺乳動物の自己免疫疾患を治療するのに適した薬
   剤組成物であって、 薬学的に許容される賦形剤と混合された請求項２の哺乳
   動物１４−β−ｇａｌレクチンを含有する、薬剤組成物
   。 ３３、哺乳動物の自己免疫疾患を治療するのに適した薬
   剤組成物であって、 薬学的に許容される賦形剤と混合された請求項８のＨＬ
   −６０レクチンを含有する、薬剤組成物。 ３４、哺乳動物の自己免疫疾患を治療する方法であって
   、 このような治療を必要とする哺乳動物に請求項３２の薬
   剤組成物の有効量を投与すること、を包含する治療方法
   。 ３５、哺乳動物の自己免疫疾患を治療する方法であって
   、 このような治療を必要とする哺乳動物に請求項３３の薬
   剤組成物の有効量を投与すること、を包含する治療方法
   。 ３６、哺乳動物の疾患を治療する方法であって、該哺乳
   動物に、該疾患を治療するのに有効な量の薬剤組成物を
   投与することを包含し、 該薬剤組成物自体が、細胞毒性分子に結合した請求項８
   のＨＬ−６０レクチンを含有する、治療方法。 ３７、哺乳動物の重症筋無力症を治療する方法であって
   、 このような治療を必要とする哺乳動物に請求項３２の薬
   剤組成物の有効量を投与すること、を包含する治療方法
   。 ３８、哺乳動物の重症筋無力症を治療する方法であって
   、 このような治療を必要とする哺乳動物に請求項３３の薬
   剤組成物の有効量を投与すること、を包含する治療方法
   。 ３９、哺乳動物の多発性硬化症を治療する方法であって
   、 このような治療を必要とする哺乳動物に請求項３２の薬
   剤組成物の有効量を投与すること、を包含する治療方法
   。 ４０、哺乳動物の多発性硬化症を治療する方法であって
   、 このような治療を必要とする哺乳動物に請求項３３の薬
   剤組成物の有効量を投与すること、を包含する治療方法
   。