JPH10504717A - 肺炎双球菌感染症に対する免疫化のための肺炎双球菌多糖−組み換えニューモリシン結合体ワクチン類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ストレプトコッカル ニューモニエ(Streptococcal pneumoniae)の莢膜多糖由来のある酸化された多糖および組み換え的に発現されるＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)のニューモリシンタンパク質を有する、免疫原性の多糖−タンパク質結合体類が創製される。当該ニューモリシンは前記酸化された多糖との結合に先立ちトキソイド化されない。当該免疫原性結合体類は、Ｓ．ニューモニエ(S．pneumoniae)の莢膜多糖および組み換えニューモリシンに対する抗体応答を導き出し、かつ、Ｓ．ニューモニエ(S．pneumoniae)が原因の疾患に対して免疫化するためのワクチンとして使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 肺炎双球菌感染症に対する免疫化のための肺炎双球菌多糖−組み換え ニューモリシン結合体ワクチン類 発明の分野 この発明は、ストレプトコッカル ニューモニエ(Streptococcal pneumoniae) の莢膜多糖由来のある酸化された多糖および組み換え的に発現されるＳ．ニュー モニエ(S．pneumoniae)のニューモリシンタンパク質を含む、免疫原性の多糖− タンパク質の結合体に関する。ここで、前述のニューモリシンは、前述の酸化さ れた多糖との結合に先立ちトキソイド化されず、もしくは部位特異的突然変異誘 発により産生されていない。 発明の背景 ストレプトコッカル ニューモニエ(Streptococcal pneumoniae；S.pneumonia e))は細菌性肺炎の最も普遍的な病因であり、かつまた細菌性の中耳炎（中耳の 感染症）、髄膜炎および菌血症の主要原因のひとつでもある。少なくとも83タイ プの肺炎双球菌生物体があり、それぞれが莢膜多糖の異なる化学構造をもつ。莢 膜多糖は肺炎双球菌の重要な毒性因子であり、また成人において抗体応答を誘導 する。現在、23価の多糖ワクチン（ニューイミューン〔PnuImune〕（商標）など 、アメリカン シアナミド カンパニー(American Cyanamid Company)、ウェイ ン(Wayne)、ニュージャージー州(NJ)）が、成人および２歳以上の小児に対して 利用し得る。この精製された肺炎双球菌多糖ワクチンの調製法は、米国特許第4, 242,501号、同4,221,906号および同4,686,102号（引用文献番号１、２、３）に 開示される。しかしながら、２歳未満の幼児はこのタイプのワクチンに対する良 好な免疫応答を誘導しない。 免疫学的特徴を修飾しかつ２歳未満の幼児において当該多糖の免疫原性を強化 するために、当該多糖は、多糖−タンパク質の結合体を形成するためにあるタン パク質担体に共有結合的に結合されている。この多糖−タンパク質結合体ワクチ ンの調製法は米国特許第6,473,574号（４）に開示される。当該特許は、還元性 基（一種もしくは複数）含有するＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)もしくはヘ モフィラス インフルエンゼ(Haemophilus influenzae)タイプｂの莢膜ポリマー 由来のある多糖断片およびタンパク質担体としてのある細菌性毒素もしくはトキ ソイド、とりわけ非毒性のジフテリアトキシン（ＣＲＭ₁₉₇など）を含む免疫原 性結合体類の調製に関する。 ある多糖の免疫原性を強化するための一つの試みが報告されており、そこでは 部位特異的突然変異誘発がＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)の毒性タンパク質 、ニューモリシンの非毒性トキソイド類を創製するために使用された。得られる 変異ニューモリシントキソイド類は、リンカーもしくはスペーサー、６−アミノ ヘキサン酸の使用によりタイプ１９Ｆ肺炎双球菌莢膜多糖に結合された。当該結 合体は、結合されない多糖の免疫原性に比較してタイプ１９Ｆ多糖部分の免疫原 性を強化した（５、６）。ある追跡調査は、トキソイド化されない天然のニュー モリシンはその毒性のためにワクチン中へ含めるのに適さないことを指摘した（ ７）。 しかしながら、これらおよび他の試みにもかかわらず、２歳未満の幼児のため のＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)に対する効率的なワクチンはない。したが って、かかるワクチンに対するニーズがある。 発明の要約 Ｓ．ニューモニエ(S．pneumoniae)の莢膜多糖由来のある酸化された多糖、お よびタンパク質担体すなわち組み換え的に発現されるＳ．ニューモニエ(S．pneu moniae)のニューモリシンタンパク質を含む、免疫原性の多糖−タンパク質結合 体類を提供することがこの発明のひとつの目的である。ここで、前述のニューモ リシンは、前述の酸化された多糖との結合に先立ちトキソイド化されず、もしく は部位特異的突然変異誘発により産生されない。当該ニューモリシンはトキソイ ド化されないが、それにもかかわらず得られる結合体は大きく低減された毒性を 有する。 この発明のひとつの態様においては、その酸化された多糖はニューモリシンタ ンパク質に直接結合される。この発明の他の態様においては、当該ニューモリシ ンタンパク質はまずあるスペーサーに連結され、そしてその後この酸化された多 糖に結合される。 これらの結合体類をワクチンとして使用することがこの発明のさらなる目的で ある。これらのワクチンは温血動物においてＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae) の莢膜多糖に対する抗体応答を導き出すのに有用である。 これらのワクチンを筋肉内もしくは皮下注入により免疫原性の量において投与 することにより、温血動物においてＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)が原因の 疾患に対して免疫化するためにこれらのワクチンを使用することが、この発明の さらにもうひとつの目的である。 この発明の付加的な態様においては、当該ワクチンは異なるタイプのＳ．ニュ ーモニエ(S．pneumoniae)の莢膜多糖由来の酸化された多糖との免疫原性結合体 の最低２個の混合物を含む。 この発明のさらなる局面においては、Ｓ．ニューモニエ(S.pneumonia e)のタイプ１８Ｃ多糖は、組み換えニューモリシン（「ｒＰＬ」）との結合がう まく実施されることができるようにするために、酸化に先立ち弱酸で処理され、 当該多糖が部分的に解重合される。 この発明の結合体ワクチン類は温血動物において高度に免疫原性である。当該 ワクチン類は、当該多糖および当該タンパク質すなわち組み換えニューモリシン の双方に対する抗体を導き出す。 この発明の結合体類は先に記述されたそれらに優る特徴的な利点を有する。当 該結合体類においてはタンパク質担体はニューモリシン由来であり、ニューモリ シンは肺炎双球菌感染症における１種の毒性因子であると報告されている（８） 。この発明の結合体ワクチン類は、当該多糖および当該ニューモリシンの双方（ これらの双方とも毒性因子である）に対する抗体を導き出し、そしてＳ．ニュー モニエ(S．pneumoniae)により引き起こされる疾患に対する免疫を賦与する。当 該結合体類は、先に記述されたあるスペーサーもしくはあるリンカー（５、６） が使用されることができるとはいえ、こうしたスペーサー類に対する要求なしに 当該毒素の溶血性および細胞毒性の活性を中和することができる、ニューモリシ ンに対する抗体を誘導する。当該組み換えニューモリシンは非毒性にされている がその立体配座を保持する。 当該ワクチン類が２歳未満の幼児において免疫を賦与することを許容するのに 加え、当該担体タンパク質、ｒＰＬはそれ自身免疫を賦与することができ、かつ 、単に酸化された多糖のための担体として作用しない。最後に、当該結合体ワク チン類は完全なＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)生物体の使用を包含しないた め、当該ワクチン類の投与はＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)が原因の疾患を 誘発しない。 図面の簡単な説明 第１図はＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)タイプ１８Ｃおよび２０からのニ ューモリシン遺伝子（ｐｌｙ）を包含するクローン類の物理的地図を図示する。 制限酵素切断部位は以下のように略記される。すなわち、Ｂｓ＝BstYI、Ｓｌ＝S alI、Ｈｄ＝HindIII、ＥＶ＝EcoRV。 第２図はｐＧＥＸ−ＰＬ １８Ｃ−３１を創製するための、発現ベクターｐＧ ＥＸ−２Ｔ中へのＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)タイプ１８Ｃからのｐｌｙ 遺伝子のサブクローニングのための計画を図示する。制限酵素切断部位は以下の ように略記される。すなわち、ＥＩ＝EcoRI、Ｂｓ＝BstYI、Ｈｄ＝HindIII、Ｅ Ｖ＝EcoRV、ＢＨ＝BamHI。 第３図は組み換え的に発現されるｒＰＬを精製するために使用される方法を図 示する。 第４Ａ図は精製の各段階におけるｒＰＬ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシー ブルーで染色された８〜16％のアクリルアミド）を図示する。レーンは以下のよ うである。すなわち、１．ＩＰＴＧ誘導前のＥ．コリ（E.coli)細胞、２．ＩＰ ＴＧ誘導45分後のＥ．コリ(E．coli)細胞、３．ＩＰＴＧ誘導２時間後のＥ．コ リ(E．coli)細胞、４．誘導されたＥ．コリ(E．coli)の細胞ライセート全体、５ ．アフィニティーゲルカラム（ＧＳＴ−ｒＰＬがカラムに結合する）により結合 されないＥ．コリ（E.coli)タンパク質類、６．溶出後の精製された融合タンパ ク質ＧＳＴ−ｒＰＬ、７．融合タンパク質のトロンビン切断後のＧＳＴおよびｒ ＰＬの混合物、８．精製されたｒＰＬ（ＧＳＴおよびトロンビンを含まない）、 ９．以下のような分子量マーカー類（それぞれｋＤで表す）：97.4−ホスホリラ ーゼＢ、66−ウシ血清アルブミン、45−卵白アルブミン、31−炭 酸デヒドラーゼ、21.5−トリプシンインヒビター、14.5−リゾチーム。 第４Ｂ図は精製の各段階におけるｒＰＬ調製物のイムノブロットを図示する。 天然のニューモリシンに対するウサギ抗血清がイムノブロットにおいて使用され る。レーン１〜８は第４Ａ図のレーン１〜８に対応する。 発明の詳細な記述 長さが471残基でスルフヒドリル基が活性化された溶血性毒素ニューモリシン は、Ｓ．ニューモニエ(S．pneumoniae)のあらゆるタイプにより産生され、かつ 、肺炎双球菌感染症における推定の毒性因子と考えられる。この毒素はおよそ53 ,000ダルトン（53kD）の分子量を有する。不活性化されたニューモリシンを注入 されたマウスおよびラットは、Ｓ．ニューモニエ(S．pneumoniae)生菌で攻撃さ れる場合に強化された生存を表す（９、１０）。従って、ニューモリシンは潜在 的なワクチン候補のひとつであり、また、この発明において示されるように、あ る結合体ワクチンの調製のための有用なタンパク質担体のひとつである。天然の ニューモリシンはＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)において低濃度で産生され るため、ｒＰＬを過発現する組み換えＥ．コリ(E．coli)の構築が企てられる。 ニューモリシン遺伝子は、すでにＳ．ニューモニエ(S.pneumoniae)タイプ１（１ １）、２（１２）および１９Ｆ（１３）からクローニングされ、配列が決定され 、そしてＥ．コリ(E．coli)においてならびにバチルス スブチリス(Bacillus s ubtilis)（１３Ａ）において発現されている。ニューモリシンはＳ．ニューモニ エ(S．pneumoniae)細菌により分泌されないが、見たところシグナル配列の欠如 のためであるらしい（１２）。 この発明の局面のうち、以下に例示されるのは、Ｓ．ニューモニェ(S.pneumon iae)からのニューモリシン遺伝子のクローニングおよびグルタチオンＳ−トラン スフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合システムを使用する融合タンパク質としての Ｅ．コリ(E．coli)におけるニューモリシンの数倍の過発現、ならびに、グルタ チオンーアガロースカラムでのアフィニティークロマトグラフィー、および部位 特異的タンパク質分解酵素トロンビンを使用することによるＧＳＴ−ｒＰＬを含 有する当該融合タンパク質におけるＧＳＴの切断、を使用する53キロダルトン(k D)のｒＰＬの精製、を包含する工程である。当該ｒＰＬのアミノ酸組成、末端ア ミノ酸配列および免疫学的反応性が決定される。この様式において得られるｒＰ Ｌは、融合タンパク質のＧＳＴが切断分離された後にｒＰＬのアミノ末端に２個 の付加的なアミノ酸が存在することを除いては、天然のタンパク質と同様である 。 以下の実施例１において詳述されるように、タイプ１８Ｃからのニューモリシ ン遺伝子もしくはタイプ１８Ｃおよびタイプ２０からの当該遺伝子の一部の融合 からの１個のハイブリッドニューモリシン遺伝子を含有する発現ベクター類が調 製され、そしてＥ．コリ(E．coli)宿主内に挿入される。他のタイプのＳ．ニュ ーモニエ(S．pneumoniae)もまたニユーモリシン遺伝子の適切な供給源である。 他の従来からの宿主細胞が当該ｒＰＬの発現に適する。 組み換えプラスミドｐＧＥＸ−ＰＬ １８Ｃを有するＥ．コリ（E．coli）株 ＳＣＳ１の試料は、出願人によりアメリカン タイプ カルチャー コレクショ ン(American Type Culture Collection)、12301 パークローン ドライヴ(Park lawn Drive)、ロックヴィル(Rockville)、メ リーランド(Maryland)20852、ＵＳＡに寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号６９ ６５４を指定されている。 組み換えプラスミドｐＧＥＸ−ＰＬ １８Ｃ／２０を有するＥ．コリ(E．coli) 株ＳＣＳ１の試料は、出願人によりアメリカン タイプ カルチャー コレクシ ョン、12301 パークローン ドライヴ、ロックヴィル、メリーランド 20852、 ＵＳＡに寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号６９６５５を指定されている。 ＡＴＣＣに寄託された材料はまた、従来からの遺伝子工学技術とともに天然の ニューモリシンタンパク質を創製するために使用されることもできる。天然のニ ューモリシンタンパク質は、トロンビン切断後にＮ末端に残存する付加的なグリ シンおよびセリン残基を欠く。 この発明において使用される様々な肺炎双球菌のタイプの莢膜多糖類は、共通 に譲渡された米国特許第4,242,501号および4,686,102号（１、３）において記述 されており、これらは引用することにより組み込まれられる。このように得られ る精製された肺炎双球菌多糖類は相対的に大きな分子サィズを有し、50％以上が セファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア ＬＫＢ バイ オテクノロジー(PharmaciaLKBBiotechnology)、ピスカタウェイ(Piscataway)、 ニュージャージー州(NJ)）のカラム上で0.3未満の溶出係数（Ｋ_av）値をもつ。 この値は６×10⁵ダルトンより大きな分子量に対応する。 その天然の形態においては、肺炎双球菌生物体からの多糖類は反応性の還元性 基を含有しない。還元性基を含有するそれぞれの反応性の多糖を創出するために 、当該多糖は調節された量の過ヨウ素酸ナトリウムで部分的に加水分解され、過 ヨウ素酸塩で酸化することによる当該多糖の cis-ビシナルのヒドロキシル基の切断により還元性基が生成し、パリク(Parihk) ら（１４）の工程に従いアルデヒド官能基が創製される。精製された肺炎双球菌 多糖類は、４℃もしくは室温にて、様々な時間、暗黒下に0.2〜50mMの過ヨウ素 酸ナトリウムで処理される。好ましい態様においては、当該多糖はpH4.0〜5.0で 処理される。過ヨウ素酸ナトリウムの使用が好ましい。 この発明のもうひとつの局面は、過ヨウ素酸塩を使用する弱酸のもしくは酸化 的な切断により酸化されたタイプ６Ｂ、１４および１８Ｃのような肺炎双球菌多 糖（［Ｏ］６Ｂ、［Ｏ］１４および［Ｏ］１８Ｃ）の反応性の基を創出する、当 該多糖類の調製のための工程である。 酸化の後、この酸化された多糖（「［Ｏ］ＰＳ」）を、それから発熱物質を含 まない水に対して広範囲に(extensively)透析し、低分子サイズの素材を除去す る。あるいは、セファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂのようなゲル濾 過カラムが当該［Ｏ］ＰＳの精製のために使用されることができる。ゲル濾過カ ラムが使用される場合は、そのフラクションを、精製された対応する多糖を標準 品として使用するフェノール硫酸比色法（１５）により［Ｏ］ＰＳの存在につい てアッセイする。精製された生成物はその後、濃縮および凍結乾燥することによ り回収される。得られる［Ｏ］ＰＳは約15〜800モノマー単位の鎖長を有する。 ある新規の方法がタイプ１８Ｃにおいて反応性の基を創出するために使用され る。すなわち、当該多糖を部分的に解重合し、中間の大きさの分子を産生するよ う切断し、そしてその後酸化する。 この酸化が部分的解重合の非存在下に実施される場合は使用できないゲル様素 材が得られる。この問題を克服するため、当該タイプ１８Ｃ多 糖をまず、酢酸処理のような弱酸により部分的に解重合し、多糖をおよそ10,000 〜600,000の分子サイズ（セファロース〔Sepharose〕^TM ＣＬ−４Ｂカラム上で 0.3〜0.7のＫ_av）に縮小する。その後にのみ、当該タイプ１８Ｃ多糖は上述され るような過ヨウ素酸酸化を受け、機能を有する還元性基を創出する。以下に記述 されるようにｒＰＬに結合される場合、当該生成物はワクチンの使用に適する形 態にある。 当該［Ｏ］ＰＳは直接的もしくは間接的のいずれかの結合を使用してタンパク 質担体としてのｒＰＬに結合される。直接的結合のためには、当該［Ｏ］ＰＳは 、従来の手段による還元的アミノ化のためにシアノトリヒドロホウ酸塩を使用し て当該ｒＰＬに結合される。 当該［Ｏ］ＰＳ中の機能を有するアルデヒド基類はｒＰＬと反応される。この ｒＰＬはシッフ塩基を形成するアミノ基類（とりわけリジン基）を含有する。あ るシアノトリヒドロホウ酸塩のような穏やかな選択的還元剤の存在下においては 、安定な、共有結合的に結合される結合体が形成される。当該反応は好ましくは pH５ないし９で実施される。使用するタンパク質への［Ｏ］ＰＳの結合について の方法論はパリクら（１４）およびシュヴァルツ(Schwarz)とグレイ(Gray)（１ ６）により記述されている。 肺炎双球菌タイプ６Ｂ、１４もしくは１８Ｃの［Ｏ］ＰＳ（濃度１〜10mg/ml ）を、室温もしくは37℃にて、0.2Mリン酸カリウム緩衝液もしくはリン酸ナトリ ウム緩衝液(pH6.0〜8.0)中のｒＰＬ（濃度１〜10mg/ml）と混合する。 穏やかに混合しながらの30分のインキュベーションの後、シアノトリヒドロホ ウ酸ナトリウム0.1〜2.0mMを添加する。この混合物を25〜37℃ にて穏やかに混合しながら１〜８日間インキュベートし、［Ｏ］ＰＳ−ｒＰＬ結 合体を形成する。当該結合体をセファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂ のようなゲル濾過カラム上で精製する。フラクションを、ウシ血清アルブミンを 標準品として使用するバイオラド(Bio-Rad)タンパク質ァッセィ試薬でのブラッ ドフォード(Bradford)法（１７）によりタンパク質についてアッセイし、かつ、 先に記述されたように［Ｏ］ＰＳについてアッセイする（１５）。当該結合体を 含有するフラクションを合わせ、透析しそして透析濾過および／もしくは凍結乾 燥する。 あるいは、当該ｒＰＬを、当該［Ｏ］ＰＳとの結合に先立ちまずあるスペーサ ーに連結する。こうしたスペーサーの例はアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）お よび６−アミノヘキサン酸てある。ＡＤＨは好ましいスペーサーである。 この発明に従い処理された結合体類は、Ｓ．ニューモニエ(S．pneumoniae)が 引き起こす疾患に対する温血動物の保護を賦与するワクチン類の調製において好 ましく使用される。当該ｒＰＬの溶血活性（毒性）は、それが［Ｏ］ＰＳに結合 される場合（単独でもしくはスペーサーとともに）には、単独で投与されるニュ ーモリシンに比較して大きく低減される。 当該結合体類は、従来からの様式で免疫学的に許容しうる希釈剤もしくは担体 に添加され、注入可能な液体の溶液もしくは懸濁液を調製することができる。加 えて、当該結合体類は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム(alum)、もし くは、ＱＳ−２１（１８）、モノホスホルリピドＡおよび３−Ｏ−デアクリルモ ノホスホルリピドＡ（３ＤＭＰＬ）のような製薬学的に許容しうる他の補助剤に 結合されることができる。 例えば、［Ｏ］ＰＳおよびｒＰＬを含有するある結合体ワクチン、もしくは、 それぞれがｒＰＬおよび異なるタイプの１個の［Ｏ］ＰＳを含有するいくつかの 結合体の混合物を含有するあるワクチンを調製するためには、当該結合体調製物 （一種もしくは複数）が、１mlあたりの多糖が１〜100μgの濃度でリン酸ナトリ ウムで緩衝化された生理的食塩水（「ＰＢＳ」）（pH7.0〜8.0）に懸濁される。 この発明の結合体ワクチン類は、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注入のような従 来からの様式における温血動物体内への注入により投与され、病原体Ｓ．ニュー モニエ(S．pneumoniae)により引き起こされる全身性感染症に対する保護のため の活性の免疫応答を誘導する。投与されるべき投与量は当業者に既知の手段によ り決定される。保護はワクチンの一回用量により賦与されることができるか、も しくは数回の追加抗原刺激用量の投与を必要とすることがある。 ｒＰＬはそれ自身保護的ではないとはいえ、ｒＰＬを単独で投与される(recei ving)マウスは［Ｏ］１８Ｃ多糖を単独で投与されるマウスより長期間生存する ことは注目すべきである。かように、当該結合体の保護効果は、［Ｏ］ＰＳのた めの担体として作用するｒＰＬおよびｒＰＬそれ自身の機能としてのｒＰＬの双 方のためであるようにみえる。 この発明がよりよく理解されるために以下の実施例が述べられる。当該実施例 は具体的な説明の目的のためのみであり、かつ、本発明の範囲を制限するように 解釈されるものではない。 実施例 実施例１ ｒＰＬ遺伝子のクローニングおよび発現 １個のタイプ１８Ｃ／２０ｒＰＬハイブリッド遺伝子を含有する発現ベクターの 構築 ある融合ｐｌｙ遺伝子がタイプ１８Ｃおよび２０から構築され、適切な発現ベ クター中にサブクローニングされ、そしてハイブリッドｒＰＬが発現される。当 該遺伝子の３’末端はタイプ２０から得られ、一方、当該遺伝子の５’末端はタ イプ１８Ｃから得られる。 タイプ２０のｐｌｙ遺伝子のクローニングのための適切な制限酵素切断部位を 決定するために、３’末端をラベルしたオリゴヌクレオチドプローブ（ＰＬ２０ と命名される）を使用するサザンブロット法を実施する。このプローブは、スル フヒドリル基が活性化されたヘモリシン類中の高度に保存された領域（第1484− 1503ヌクレオチド；１２）とハイブリッド形成する。当該プローブはビオチンも しくはジゴキシゲニンのいずれかでラベルされる。1.3kbのSalI−EcoRV断片が、 当該遺伝子の５’末端を除いてｐｌｙ遺伝子の大部分を含むと同定される。この 1.3kbの断片を、ｐＢＲ３２２（ベーリンガー マンハイム カンパニー(Boehri nger Mannheim Co.)、インジアナポリス(Indianapolis)、インジアナ州(IN)）中 のSalIおよびEcoRV切断部位に挿入する。Ｅ．コリ(E.coli)株ＳＣＳ１（ストラ タジーン(Stratagene)、ラホヤ(La Jolla)、カリフォルニア州(CA)）のコンピテ ント細胞を宿主として使用する。アンピシリン耐性かつテトラサイクリン感受性 の形質転換細胞をＰＬ２０プローブを使用するコロニーハイブリッド形成法によ りスクリーニングする。ｐＳＥ２−２、３および２８と命名される３個の同一の 組み換え体が単離される（第１図）。 ｐＳＥ２のSalＩ-EcoRV断片を取り出し、そしてｐＵＣ１９（ニュー イングランド バイオラブス(New England Biolabs)、ビバリー(Beverly)、マサ チューセッツ州(MA)）のSalIおよびSmaI切断部位に挿入する。アンピシリン耐性 でラクトース陰性（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴ Ｇ」）により誘導される場合にＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−イン ドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含有するプレート上で無色のコロニー ）の形質転換細胞を制限酵素分析によりスクリーニングする。陽性の組み換え体 のひとつがｐＳＥ３−５と命名される。 タイプ２０からのｐｌｙ遺伝子の５’末端のクローニングに適した制限酵素切 断部位がないため、サザンブロット法をタイプ１８ＣからのゲノムＤＮＡで実行 する。混合プライマーラベル法によりラベルされるｐＳＥ２−２からの1.3kbのS alI-EcoRV断片をプローブとして使用する。2.8kbのBstYI断片が５’および３’ のフランキング領域と一緒に完全なｐｌｙ遺伝子を含有すると同定される。この BstYI断片をHindIIIで切断し、そしてプロモーター選択ベクター、ｐＫＫ２３２ −８（１９：ファルマシア）のBamHIおよびHindIII切断部位に挿入する。Ｅ．コ リ(E．coli)株ＳＣＳ１を宿主として使用する。 ｐｌｙ遺伝子のプロモーターを含有する形質転換細胞を選択するために、アン ピシリン耐性（100μg/ml）かつクロラムフェニコール耐性（５μg/ml）の形質 転換細胞を制限酵素分析およびサザンブロット法によりスクリーニングする。ｐ ＢＨ１−３２、３５、３６、３７、３８および３９と命名される６個の同一の組 み換え体が、タイプ１８Ｃからのｐｌｙ遺伝子の５’上流の非翻訳領域および５ ’領域にわたる１kbのBstYI-HindIII断片を含有することが見出される（第１図 ）。 その後、機能を有する組み換えタンパク質を産生するために、上述されるタイ プ１８Ｃおよび２０からクローニングされた肺炎双球菌のＤＮＡ断片を融合し、 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質システム（２０）を使用 してプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア）中にハイブリッドｐｌｙ遺伝子 を構築する。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を当該遺伝子の５’末端のサブクローニング を容易にするために実行する。２種のプライマーが合成される。すなわち、クロ ーニングを容易にするよう開始コドンのすぐ上流に導入されたBamHI切断部位を もつコード配列のはじめのセンスプライマー（第208−231ヌクレオチド；１２） 、および当該遺伝子中の唯一のEcoRI切断部位を包含する領域とハイブリッド形 成するアンチセンスプライマー（第709−733ヌクレオチド；１２）である。ｐＢ Ｈ１−３７（タイプ１８Ｃ）からの0.7kbのBstYI-EcoRI断片がベント〔Vent〕^TM ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー イングランド バイオラブス、ビバリー、マサ チューセッツ州）により増幅されるべき鋳型としてはたらき、それにより0.5kb の断片を創製する。 ＰＣＲ実験は以下のように実行される。すなわち、ベント〔Vent〕（商標）Ｄ ＮＡポリメラーゼの添加に先立ちＤＮＡを95℃にて５分間変性し、そして30サイ クルの変性（95℃にて30秒間）、アニーリング（50℃にて30秒間）および複製（ 72℃にて1.5分間）を実施する。 増幅されたＤＮＡ断片をBamHIおよびEcoRIで切断し、そしてその後ｐＧＥＸ− ２Ｔ中のBamHIおよびEcoRI切断部位に挿入する。ランダムに拾い上げたアンピシ リン耐性の形質転換細胞を制限酵素分析により望まれる挿入物の存在について試 験する。ｐＢＥ０．５１４と命名される１個 の組み換え体が陽性と同定される（第２図）。次に、ｐＳＥ３−５（タイプ２０ ）からの1.0kbのEcoRI（当該遺伝子内の唯一の切断部位）-EcoRI（ｐＵＣ１９ベ クター（ニュー イングランド バイオラブス）由来）断片を、ｐＢＥ０．５１ ４中の増幅されたＤＮＡの下流に挿入する。 陽性の組み換え体をウサギ赤血球オーバーレイ(overlay)法（１２）により同 定する。これは以下のように遂行する。ＬＢアガープレート上のアンピシリン耐 性の形質転換細胞上に2.5％ウサギ血球（１mMＩＰＴＧおよび１mMＤＴＴを含有 するＰＢＳ中の0.7％溶融アガー中）５mlを広げ、そして37℃にて３時間インキ ュベートする。組み換えプラスミドを有するコロニーは溶血の円形の帯を示す。 ４個の個々のコロニー（ｐＧＥＸ−ＰＬ １８Ｃ／２０−１、２、３および１ １）が溶血の円形の帯を示す。制限酵素分析がｇｓｔ遺伝子の３’末端に融合さ れる完全なｐｌｙ遺伝子の存在を確かにする。 １個のタイプ１８ＣｒＰＬ遺伝子を含有する発現ベクターの構築 上述されるように、タイプ１８Ｃの染色体ＤＮＡの2.8kbのBstYI断片のHindII Iでの切断は、タイプ１８Ｃからのｐｌｙ遺伝子の５’上流の非翻訳領域および ５’領域にわたる１kbの断片を産生する。この切断はまた、コロニーハイブリッ ド形成法により同定されるように、ｐｌｙ遺伝子の３’領域および３’非翻訳領 域にわたる1.8kbの断片も産生する（第１図）。アンピシリン耐性かつクロラム フェニコール感受性の形質転換細胞のスクリーニングが、ｐＨＢ２−１、２６お よび３２と命名される３個の同一の組み換え体を同定する。 ｐＧＥＸ−２Ｔにおけるタイプ１８Ｃからの完全なｐｌｙ遺伝子の構築は３個 の断片の連結を必要とする。サブクローニングにおいて用いら れるべき制限酵素部位の不足のため、一連のクローニング段階が実行される。 最初に、ｐＨＢ２−３２をHindIIIおよびEcoRVで切断し0.7kbの断片を産生す る。この断片をｐＵＣ１９中に挿入し、ｐＨＶ３−２、４および６と命名される ３個の組み換え体を創製する。二番目に、ｐＢＨ１−３５をEcoRIで切断して0.5 kbの断片を産生し、この断片をｐＵＣ１９中に挿入してｐＩＩ３−１、２、３、 ４および５と命名される５個の組み換え体を創製する。三番目に、ｐＩＩ３−１ およびｐＨＶ３−２もしくは６のいずれかをHindIIIで切断する。四番目に、ｐ ＩＩ３−１からの0.3kbのHindIII断片のｐＨＶ３−２もしくは６のいずれかのHi ndIII切断部位へのクローニングを実施し、ｐＨＨＶ３−３１、５４および５５ と命名される３個の組み換え体を創製する。五番目に、ｐＨＨＶ３−３１および ｐＢＥ０．５１４をEcoRIで切断する。最後、六番目に、ｐＨＨＶ３−３１から の1.0kbのEcoRI断片をｐＢＥ０．５１４のEcoRI切断部位に挿入する。ｐＧＥＸ −ＰＬ １８Ｃ−３１ないし３９と命名される９個の同一の組み換え体がウサギ 赤血球オーバーレイ法により単離される。 さらに特定しては、上述されるＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)タイプ１８ Ｃからの染色体ＤＮＡの2.8kbのBstYI断片をHindIIIで切断し、そして記述され るように（２１）ｐＫＫ２３２−８（１９）のBamHIおよびHindIII切断部位に連 結する（第２図はHindIII切断部位を指す）。 Ｅ．コリ(E．coli) ＸＬ１−ブルー(Blue)（２２）のコンピテント細胞（スト ラタジーン クローニング システムズ(Stratagene Cloning Systems)、ラホヤ 、カリフォルニア州）を形質転換し、そして、クロラ ムフェニコール（10μg/ml）の存在もしくは非存在下にアンピシリン（50μg/ml ）を含有するルリア・ベルタニ(Luria-Bertani)（ＬＢ）アガープレート（２１ ）上に植え付ける。アンピシリン耐性の形質転換細胞をクロラムフェニコール耐 性、およびプローブすなわち0.9kbのEcoRI-EcoRV断片でのコロニーハイブリッド 形成（２１）によりスクリーニングする。この断片はタイプ２０のｐｌｙ遺伝子 （２３）由来である。正しい断片を含有することが同定されるいくつかの組み換 え体のうち、ｐＢＨ１−３５およびｐＨＢ２−３２と命名される２個がサブクロ ーニングのために使用されるべきものとして選択される。 完全なｐｌｙ遺伝子をその後、従来からのクローニング法（２１）およびベン ト〔Vent〕（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー イングランド バイオラブス 、ビバリー、マサチューセッツ州）でのポリメラーゼ連鎖反応により、ｐＧＥＸ −２Ｔ（２０；ファルマシア ＬＫＢ バイオテクノロジー、ピスカタウェイ、 ニュージャージー州、から入手できる）中、ｇｓｔ遺伝子の３’末端に同じ読み 枠で構築する。Ｅ．コリ（E.coli)ＳＣＳ１（２４）のコンピテント細胞（スト ラタジーン）を使用する。アンピシリン耐性の形質転換細胞をウサギ赤血球オー バーレイ法（２１）によりスクリーニングする。すなわち、組み換えプラスミド を有するコロニーは溶血の円形の帯を示す。ｐＧＥＸ−ＰＬ １８Ｃ−３１と命 名される、類似の性質の９個の単離物のうちのひとつがさらなる特徴づけのため に選択される（第２図）。 ｒＰＬの発現、精製および特徴づけ タイプ１８Ｃ／２０もしくは１８Ｃからのｐｌｙ遺伝子をクローニングし、そ してグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タ ンパク質（２０）としてＥ．コリ(E．coli)において過発現する。得られる融合 タンパク質は水性溶液に可溶であり、かつ、非変性条件下で粗細菌ライセートか ら精製される。これらの条件は精製後のｒＰＬの抗原性を保存する。当該ＧＳＴ −ｒＰＬ融合タンパク質はアフィニティクロマトグラフィーのような簡単な手段 により精製されることができる。 ｒＰＬの十分量を精製するために、以下のアフィニティクロマトグラフィー処 置を実施する。ｒＰＬの精製のための作業工程図を第３図に示す。アンピシリン （100μg/ml）を含有する50mlの１×ルリア培地もしくは１×テリフィック(Terr ific)培地（２５）中のｐＧＥＸ−ＰＬ １８ＣもしくはｐＧＥＸ−ＰＬ １８ Ｃ／２０のいずれかを含有するＥ．コリ(E．coli)ＳＣＳ１の一夜培養系を同培 地１１に添加する。組み換えＥ．コリ(E．coli)をその後、活発に振盪しながら 、600nmでの１の吸収に到達するまで37℃にて増殖させる。ＩＰＴＧを誘導物質 として培養系に添加（１mMの濃度まで）し、そしてＥ．コリ(E．coli)細胞を継 続して２時間増殖させる。非常に少量の当該ＧＳＴ−ｒＰＬ融合タンパク質が誘 導前に産生されるが（第４Ｂ図のレーン１を参照）、ＩＰＴＧは短時間のうちに （30分ないし２時間）大量での融合タンパク質の発現を誘導する。当該融合タン パク質、ＧＳＴ−ｒＰＬは過発現され、かつ、クマシーブルーで染色されるＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ上の総細菌性タンパク質の10％以上を構成する（第４図）。 細胞を４℃にて10,000×ｇで５もしくは10分間遠心分離し、リン酸ナトリウム で緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ：150mM塩化ナトリウム、16mMリン酸二水 素カリウム、４mMリン酸水素二カリウム、pH7.3）で１回洗浄し、そして1/50体 積量のＰＢＳに再懸濁する。トリトンＸ−１０ ０を１％の最終濃度まで添加し、そして細胞を穏やかな音波処理もしくはフレン チプレス（12,000ポンド）の２回通過により溶解する。当該ライセートを４℃に て10,000×ｇで10分間遠心分離し、そして細胞破片をＴＰＢＳ（ＰＢＳ中１％ト リトンＸ−１００）で１回洗浄する。上清を合わせ、そして透明な細胞ライセー ト200mlをＴＰＢＳで平衡化した10もしくは50mlのグルタチオン−アガロースゲ ル（シグマ ケミカル カンパニー(Sigma Chemical Co.)、セントルイス(St．L ouis)、ミズーリ州(MO)）カラムに負荷する(apply)。当該カラムをカラム床体積 の５倍量のＴＰＢＳ、カラム床体積の２倍量のＰＢＳおよびカラム床体積の１倍 量の50mMトリス塩酸、pH8.0で洗浄し、不必要な素材を除去する。当該融合タン パク質、ＧＳＴ−ｒＰＬを５もしくは10mMグルタチオン／50mMトリス塩酸、pH8. 0で溶出する。溶血性アッセイおよびタンパク質アッセイにより示されるような 溶血活性を示すフラクションを合わせる。フラクションは溶血性であることを以 下のように同定する。すなわち、各フラクション１μlを10mMＤＴＴ／ＰＢＳ50 μlに添加し、そしてその後マイクロタイタープレート上で５％ウサギ赤血球25 μlと混合し、そして室温にて15分間インキュベートする。溶血は目視により同 定する。ＧＳＴ−ｒＰＬをその後タンパク質分解酵素トロンビンにより切断する 。トロンビンはＧＳＴとｒＰＬの間に唯一の認識部位を有する（２０）。 当該融合タンパク質をウシ血漿トロンビン（シグマ）（タンパク質１mgあたり ５単位）と混合し、そしてその後トロンビン切断緩衝液（50mMトリス塩酸、pH8. 3、150mM塩化ナトリウム、2.5mM塩化カルシウム）に対し室温にて一夜透析する （分子量カットオフ：12,000〜14,000）。ＧＳＴ、ｒＰＬおよび若干量の未切断 のＧＳＴ−ｒＰＬの混合物を、アミ コン(Amicon)セントリプレップ〔Centriprep〕（商標）−１０（ビバリー、マサ チューセッツ州）（分子量カットオフ：10,000）を使用して20℃にて3,000×ｇ で遠心分離して濃縮し、そして緩衝液をＰＢＳに交換し、そしてその後グルタチ オン−アガロースカラム上に負荷する(apply)。ＧＳＴおよびいかなる未切断の ＧＳＴ−ｒＰＬも特異的に当該カラムに結合するため、ｒＰＬは自由に当該カラ ムを通過しそしてＰＢＳ溶出液中に収集される。ｒＰＬを含有する溶血性フラク ションを合わせる。緩衝液をセントリプレップ〔Centriprep〕（商標）−１０を 使用して10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に交換する。トロンビンを、10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化した１mlのヘパリン−セファロース〔S epharose〕（商標）ゲル（ファルマシア）のカラムを通過することによりｒＰＬ から除去する（２６）。精製されたｒＰＬを４℃にて保存する。この精製からの 収量は培養液１１あたりおよそ６〜10mgである。 精製されたｒｐＬは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシーブルー染色により示される ように、ゲル上に53,000ダルトンの分子量の単一のバンドを表す。当該ゲルのデ ンシトメトリーのスキャンはｒＰＬの純度が95％より高いことを明らかにする。 上述される方法は95％より高い純度のｒＰＬを産生するとはいえ、ヒドロキシ アパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーの最終段階を添加することにより、より 高い純度さえ得られることができる。この段階はＨＡ−ファスト フロー(Fast Flow)の1.6×8.0mmのカラム（カルバイオケム コーポレーション(Calbiochem． Corp.)、ラホヤ、カリフォルニア州）を使用して実行される。当該カラムを10mM リン酸ナトリウム緩衝液 （pH6.8）で平衡化する。ｒＰＬの10ml（およそ10mg）の部分をＨＡカラムに添 加し、そして、タンパク質を10mMないし200mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8） の直線濃度勾配100mlで溶出する。カラム溶出液はおよそ1.5ml/minの流速にて2. 0mlのフラクションずつ収集する。フラクションは先に記述されたように（１１ ）アッセイする。ｒＰＬを含有するフラクションを合わせ、そしてタンパク質濃 度、溶血活性およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度について分析する。当該ｒＰＬ はおよそ85〜115mMのリン酸緩衝液で単一ピークとして溶出される。溶出された タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるようにほぼ均一であり、また、実 際上は汚染するリポ多糖（エンドトキシン）を含まない。 ｒＰＬの分子質量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマトリックス補助(matrix assi sted)ＵＶ−レーザーディソープション／イオン化質量分析計により決定される ように、53,000ダルトンである。 精製されたｒＰＬはウサギ赤血球に対しタンパク質１mgあたり３×10⁵溶血単 位の特異的活性を有する（２７）。これは天然のＰＬ１mgあたりおよそ10⁶溶血 単位に匹敵する（９、２７）。当該特異的溶血活性はペイトン(Paton)ら（９） の方法のわずかな修飾により測定される。試料は1.7％ウサギ赤血球と混合する 前に10mMＤＴＴで活性化する。上清の吸光度は550nmで測定する。 化学ルミネセンス検出のためのルミフォス〔Lumi-Phos〕（商標）５３０（ベ ーリンガー マンハイム カンパニー、インジアナポリス、インジアナ州）を使 用するイムノブロットにおいて、ＧＳＴ−ｒＰＬ融合タンパク質およびｒＰＬの 双方が天然のＰＬに対する抗体を含有する抗血清と反応する（第４Ｂ図）。見た ところ、より分子量の大きい融合タ ンパク質は、ｒＰＬおよび当該抗体によりなお認識されることができる分解生成 物に比較して、ナイトラン(Nytran)メンブレン（シュライヒャー アンド シュ エル インク(Schleicher & Schuell Inc.)、キーン(Keene)、ニューハンプシャ ー州(NH)）に非効率的に転写されるようである。オクタロニー免疫拡散法は、ｒ ＰＬが抗ＰＬ抗体および抗ｒＰＬ抗体と全く同じに反応することを明らかにする 。このことは、ｒＰＬが天然のＰＬと同じ抗原決定基を有することを示唆する。 アミノ酸分析およびＮ末端配列の決定（40残基まで）が精製されたｒＰＬで実行 される。ｒＰＬのＮ末端配列は、２個の付加的残基（グリシンおよびセリン）を 除いては、天然のＰＬのそれ、およびタイプ２のｐｌｙ遺伝子のヌクレオチド配 列から推論される予想配列（１１、１２）と同一である。この付加的残基はトロ ンビン切断後にｒＰＬ上のＮ末端に残存する（２０）。ｒＰＬのアミノ酸組成は タイプ２のｐｌｙ遺伝子のヌクレオチド配列から推論されるそれとよく一致する （１２）。 実施例２ Ｓ．ニューモニエ(S．pneumoniae)莢膜多糖の調製 この発明において使用される様々な肺炎双球菌のタイプの莢膜多糖は共通に譲 渡された米国特許第4,242,501号（１）および第4,686,102号（３）において記述 されている。これらは引用することにより組み込まれられる。こうして得られる 精製された肺炎双球菌多糖類は比較的大きな分子サイズを有し、50％以上がセフ ァロース〔Sepharose〕（商標） ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア ＬＫＢ バイオ テクノロジー、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）のカラム上で0.3未満の 溶出係数（Ｋ_av）値を有する。この値は６×10⁵ダルトンより大きな分子量に対 応する。 実施例３ 還元性基を含有する反応性の酸化されたタイプ１４多糖の調製 肺炎双球菌タイプ１４多糖の100mgの試料を0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0 ）20mlに溶解する。過ヨウ素酸ナトリウムの４mgの部分（１mMの最終濃度まで） を暗黒下に添加し、そして当該混合物をアルミ箔で包んだふたをした三角フラス コ中で室温にて10分間穏やかに攪拌する。過剰の過ヨウ素酸ナトリウムは0.5Mエ チレングリコール１mlとの室温での10分間の反応により破壊する。得られる酸化 されたタイプ１４（「［Ｏ］１４」）多糖を含有する反応混合物を、室温にて、 3,500ダルトンのカットオフのメンブランのアミコン（ビバリー、マサチューセ ッツ州）濃縮器で広範囲にわたって(extensively)透析濾過しそして濃縮する。 透析濾過された［Ｏ］１４多糖を凍結乾燥し、そして使用するまで−20℃にて保 存する。 実施例４ 還元性基を含有する反応性の酸化されたタイプ１８Ｃ多糖の調製 実施例３において記述されるタイプ１４多糖を酸化するための処置を、過ヨウ 素酸酸化に先立ち当該タイプ１８Ｃ多糖を１M酢酸により部分的に解重合してｒ ＰＬに結合される場合に当該多糖のゲル化することを防ぐことを除き、タイプ１ ８Ｃについて繰り返す。タイプ１８Ｃ多糖の500mgの試料を50mlの酢酸（最終のp H2.5）に懸濁し、そして60℃にて40時間インキュベートする。その後、２M酢酸 ナトリウム６mlを添加する（最終のpH4.0）。当該混合物をアミコン攪拌セル（ ＹＭ10）を使用しておよそ12mlまで濃縮する。当該濃縮物を、セファロース〔Se pharose〕（商標） ＣＬ−４Ｂカラム上におきかつ10mMＰＢＳおよび0.01％ア ジ化ナ トリウムで溶出することによるカラムクロマトグラフィーにかける。４mlずっフ ラクションを収集し、そしてKdが0.3〜0.7(10〜60kD)のフラクションを合わせる 。当該フラクションを、12〜14kDの分子量カットオフで水に対して透析し、水は 毎日変える。過ヨウ素酸酸化の段階をその後実行し、酸化されたタイプ１８Ｃ（ 「［Ｏ］１８Ｃ」）多糖を生成する。実施例５ ［Ｏ］１４多糖−ｒＰＬ結合体の調製 実施例３において作成される［Ｏ］１４多糖を６mg/mlの濃度で0.2Mリン酸カ リウム緩衝液（pH8.0）に溶解する。実施例１に従い作成されるｒＰＬ（Ｅ．コ リ(E．coli)においてＡＴＣＣ ６９６５４もしくはＡＴＣＣ ６９６５５のい ずれかから発現される）もまた、別個の容器中において約２mg/mlの濃度で同緩 衝液に溶解する。［Ｏ］１４多糖溶液（0.5ml）およびｒＰＬ溶液（0.5ml）を室 温にて混合する。30分後、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（2.5mg）を添加 し、そして反応混合物を室温にて５日間インキュベートする。当該混合物をセフ ァロース〔Sepharose〕（商標） ＣＬ−４Ｂのカラム上でクロマトグラフィー を行う。このカラムは最初に10mMＰＢＳ（pH7.0）で平衡化される。当該結合体 材料を濃度勾配なしに同緩衝液で溶出する。当該結合体を含有するピークのフラ クションを多糖およびタンパク質についてアッセイする（１５、１７）。当該結 合体を含有するフラクションを合わせ、特徴づけし、そしてワクチンの調製のた めに使用する。当該［Ｏ］１４多糖−ｒＰＬ結合体は、約７：１の炭水化物／タ ンパク質の重量／重量比を有する。当該結合体ワクチン調製物は使用するまで４ ℃にて保存する。 実施例６ スペーサーアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を含む［Ｏ］１４多糖−ｒＰＬ結 合体の調製 ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体の調製 実施例１に従い作成されるｒＰＬ（タイプ１８Ｃもしくはタイプ１８Ｃ／２０ のいずれか）の３ml（９mg）を0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH5.5）中におく。 緩衝液で処理したｒＰＬをＡＤＨ（20mg）およびカルボジイミド（20mg）と混合 し、そして室温にて３時間インキュベートする。反応混合物を、3,500ダルトン のカットオフのメンブランを用いスペクトラポール(Spectorapor)メンブランチ ュービング(tubing)中で４℃にて0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に対して 透析することにより、pHを7.0に変える。当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体を含有する 透析された材料をセファロース〔Sepharose〕（商標） ＣＬ−４Ｂのカラム上 でのクロマトグラフィーにより特徴づけする。タンパク質の含有量をブラッドフ ォード法（１７）によりアッセイし、また、ＡＤＨを、標準品としてＡＤＨを用 いる２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸の反応（２８）により測定する 。当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体（液体）は使用するまで４℃にて保存する。 ［Ｏ］１４多糖−ＡＤＨ−ｒＰＬ結合体の調製 実施例３に従い作成される［Ｏ］１４多糖を６mg/mlの濃度で0.1Mリン酸カリ ウム緩衝液（pH8.0）に溶解し、そして当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体もまた別個の 容器中において３mg/mlの濃度で同緩衝液に溶解する。当該［Ｏ］１４多糖の2.5 mlの試料および当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体の2.5mlの試料を室温にて混合する。 ２時間後、水中のシアノトリヒドロホ ウ酸ナトリウム（12.5mg）を添加し、そして反応混合物を37℃にて穏やかに混合 しながら４日間インキュベートする。当該混合物をセファロース〔Sepharose〕 （商標） ＣＬ−４Ｂのカラム上でクロマトグラフィーを行う。このカラムは最 初に10mMＰＢＳ（pH7.0）で平衡化される。当該結合体材料を同緩衝液で溶出す る。当該結合体を含有するピークのフラクションを上述されるように同定し、そ してその後合わせ、特徴づけし、そしてワクチンの調製に使用する。銀染色した ＳＤＳ−ＰＡＧＥは大きな分子量の素材が当該結合体中に存在することを示す。 プール１と命名される合わせたフラクションの最初のグループ（セファロース〔 Sepharose〕（商標） ＣＬ−４Ｂから）の結合体は0.08〜0.20のＫavを有する 。一方、プール２と命名される合わせたフラクションの二番目のグループは0.21 〜0.34のＫ_avの素材を含有する。結合体プール１の炭水化物：タンパク質の比率 は11：１であり、結合体プール２の比率は13：１である。当該結合体調製物類は ワクチン類の調製のために使用される。当該結合体調製物類は４℃にて保存する 。 実施例７ ［Ｏ］１８Ｃ多糖−ｒＰＬ結合体の調製 結合体の使用に適したこの多糖の中間的長さを調製するために、実施例４の方 法の小さな修飾が使用される。タイプ１８Ｃ多糖の500mg分を１M酢酸（pH2.3）5 0mlに溶解しそして60℃にて40時間インキュベートする。処理された多糖を２M酢 酸ナトリウムでpH4.5に調整する。当該試料をセファロース〔Sepharose〕（商標 ） ＣＬ−４Ｂのカラム上で分子量で分類する。0.3ないし0.7のＫ_avで溶出する 多糖（分子量15,000〜600,000）を合わせる。合わせたフラクションを４℃にて 発熱物質を含まな い水に対して広範囲に(extensively)透析し、そしてその後凍結乾燥する。当該 材料は［Ｏ］１８Ｃ多糖の調製のための使用まで−20℃にて保存する。 タイプ １８Ｃ多糖の中間的サイズの50mg分を0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）10ml に溶解し、そして、暗黒下、室温にて10分間、過ヨウ素酸ナトリウム４mg（最終 濃度２mM）で酸化する。過剰の過ヨウ素酸ナトリウムは0.5Mエチレングリコール 50μl（最終濃度25mM）との10分間の反応により破壊する。［Ｏ］１８Ｃ多糖を 含有する反応混合物を広範囲に(extensively)透析し、そしてその後凍結乾燥す る。当該材料を−20℃にて保存し、そしてｒＰＬとの結合体の調製のために使用 する。 当該［Ｏ］１８Ｃ多糖を６mg/mlの濃度で0.2Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に 溶解する。実施例１に従い作成されるｒＰＬ（Ｅ．コリ（E.coli)においてＡＴ ＣＣ ６９６５４もしくはＡＴＣＣ ６９６５５のいずれかから発現される）も また、別個の容器中において３mg/mlの濃度で同緩衝液に溶解する。［Ｏ］１８ Ｃ多糖溶液１mlおよび当該ｒＰＬ溶液0.5mlを室温にて混合する。１時間後、シ アノトリヒドロホウ酸ナトリウム（３mg）を添加し、そして反応混合物を37℃に て８日間インキュベートする。当該混合物をセファロース〔Sepharose〕（商標 ）ＣＬ−４Ｂのカラム上でクロマトグラフィーを行う。このカラムは最初に10mM ＰＢＳ（pH7.0）で平衡化され、そしてその後同緩衝液で溶出される。当該結合 体を含有するピークのフラクションを上述されるように同定し、合わせそして特 徴づけを行う。当該［Ｏ］１８Ｃ多糖−ｒＰＬ結合体は、約0.76：１の炭水化物 ／タンパク質比を有する。銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは大きな分子量の素材が 存在することを示す。当該結合体はワク チンの調製のために使用するまで４℃にて保存する。 実施例８ スペーサーＡＤＨを含む［Ｏ］１８Ｃ多糖−ｒＰＬ結合体の調製 ［Ｏ］１８Ｃ多糖の調製 当該［Ｏ］１８Ｃ多糖は実施例７に従い調製し、−20℃にて保存しそしてｒＰ Ｌ−ＡＤＨ誘導体との結合体の調製のために使用する。 ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体の調製 実施例１に従い作成されるｒＰＬ（タイプ１８Ｃもしくはタイプ１８Ｃ／２０ のいずれか）の10ml分（12mg）を0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH5.4）中におく 。緩衝液で処理したｒＰＬを0.3mlのＡＤＨ（30mg）およびカルボジイミド0.1ml （30mg）と混合し、そして穏やかに混合しながら室温にて３時間インキュベー トする。反応混合物を、3,500ダルトンのカットオフのメンブランを用いスペク トラポール メンブランチュービング中で４℃にて２日間0.1Mリン酸カリウム緩 衝液（pH7.0）に対して透析することにより、pHを7.0に変える。当該ｒＰＬ−Ａ ＤＨ誘導体を含有する透析された材料を、アミコン セントリプレップ〔Centri prep〕（商標）（10,000ダルトンのカットオフ）で約４mlにまで濃縮し、そして セファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂのカラム上でクロマトグラフィ ーを行う。タンパク質およびＡＤＨの含有量を先に記述されたようにアッセイす る。当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体は使用するまで４℃にて保存する。 ［Ｏ］１８Ｃ多糖−ＡＤＨ−ｒＰＬ結合体の調製 当該［Ｏ］１８Ｃ多糖を６mg/mlの濃度で0.2Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に 溶解し、また、ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体もまた別個の容器中 において約2.7mg/mlの濃度で同緩衝液に溶解する。［Ｏ］１８Ｃ多糖の2.5ml部 分および当該ｒＰＬ−ＡＤＨ誘導体の2.5mlを室温にて混合する。２時間後、水 中のシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（12.5mg）を添加し、そして反応混合物 を37℃にて穏やかに混合しながら４日間インキュベートする。当該混合物を最初 に10mMＰＢＳ（pH7.0）で平衡化されるセファロース〔Sepharose〕（商標） Ｃ Ｌ−４Ｂのカラム上でクロマトグラフィーを行う。当該結合体材料を同緩衝液で 溶出する。当該結合体を含有するピークのフラクションを上述されるように同定 し、合わせ、特徴づけし、そしてワクチンの調製のために使用する。銀染色した ＳＤＳ−ＰＡＧＥは大きな分子量の素材が結合体中に存在することを明らかにす る。当該結合体におけるｒＰＬに対する当該［Ｏ］１８Ｃ多糖の比は約1.8：１ である。当該結合体材料は４℃にて保存する。 実施例９ 当該結合体ワクチン類に対する抗体応答 上記の実施例の処置により調製される結合体類はアメリカ食品医薬品局（21 Ｃ．Ｆ．Ｒ．§ 610.11；1993年４月１日）により要求されるマウスおよびモル モットにおける一般安全性試験に合格する。当該結合体類はその後、マウスにお いて抗体を生じるその能力について試験される。当該結合体類を、0.2mlの用量 が多糖１もしくは５μgを含有するように0.01％チメロサールを含有する無菌の ＰＢＳ（pH7.0）で希釈する。当該結合ワクチン類を0.2μのゲルマン(Gelman)フ イルターでのメンブレン濾過により滅菌する。当該無菌ワクチンは使用するまで ４℃にて保存する。 ＣＤ−１（スイス(Swiss)）マウス（８週齢）に、補助剤としてのリ ン酸アルミニウム上に吸収させた（１mg/ml）ワクチン0.2ml（１回用量当たり１ 〜５μg）を復腔内に注入する。２週間の間隔で、マウスに当該ワクチンの２回 の付加的注入を与える。血液試料を各注入後２週間に眼窩静脈穿刺により収集す る。７匹のマウスをＥＬＩＳＡ法により当該多糖およびｒＰＬに対する抗体価に ついてアッセイする。アッセイの結果は第１表（［Ｏ］１４／ｒＰＬ結合体につ いて）ならびに第２表および第３表（［Ｏ］１８Ｃ／ｒＰＬ結合体に対する２個 の別個の実験）に示される。 実施例１０ 中和抗体に対する溶血性アッセイ 中和抗体に対する溶血性アッセイは以下のように遂行する（９、１２、２９） 。すなわち、96穴（Ｕ型）マイクロタイタープレート中で、ｒＰＬに対する抗体 を含有する動物（マウスもしくはウサギ）からの血清の希釈物をｒＰＬ１μgと 混合する。37℃にて15分間インキュベートした後、10mMジチオスレイトールを添 加する。37℃にて15分間インキュベートした後、ウサギ赤血球（1.7％の最終濃 度）を添加し、そして同じ様式でさらに30分間インキュベートする。150×ｇで ５分間遠心分離した後、ペレットの有無に注意する。赤血球の50％溶解を表す希 釈物を視覚的に決定する。中和抗体が存在する場合はペレットが見られるが、抗 体が存在しない場合には赤血球が溶解される。２回の溶血性アッセイの結果が第 ４表および第５表に示される。 実施例１１ 内皮細胞の細胞毒性のアッセイ 内皮細胞の細胞毒性のアッセイはルビンスら（３０）の方法に従い実行する。 無傷の細胞を放射性ラベルするために、細胞が集密状態に到達した後培地を除去 し、ＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、新鮮な培養培地で２回洗浄し、20 0μlのＰＢＳおよび300μlの⁵¹Ｃｒ（300μCi）に再懸濁し、そして37℃、５％ ＣＯ2にて90分間インキュベートする。細胞を５％ＢＳＡおよび２％Ｄ−グルコ ースを含有するＰＢＳで２回洗浄し、そして0.5％ＢＳＡおよび0.2％Ｄ−グルコ ースを含有するＰＢＳに再懸濁する。細胞を１mlあたり２×10⁵個に調整する。9 6穴（Ｕ型）マイクロタイタープレート中で、ｒＰＬに対する抗体を含有する動 物（マウスもしくはウサギ）からの血清の希釈物をｒＰＬ５ngと混合する。37℃ 、５％ＣＯ₂にて15分間インキュベートした後、10mMジチオスレイトールを添加 する。37℃、５％ＣＯ₂にて30分間インキュベートした後、細胞（２×10₄個）を 添加し、そして同じ様式でさらに２時間インキュベートする。150×ｇで３分間 遠心分離した後、上清のアリコート中の放射活性を液体シンチレーション法によ りカウントし遊離された⁵¹Ｃｒのパーセントを測定する。残存する細胞性の⁵¹Ｃ ｒを測定するため、１N水酸化ナトリウムを添加し、当該溶液を混合し、そして アリコート中の放射活性をカウントする。遊離された⁵¹Ｃｒのパーセントは、溶 媒中の１分あたりの総カウントを溶媒および細胞層中の１分あたりの総カウント で割ったパーセントとして決定される。当該アッセイの結果は第６表に表される 。ここでは値は１穴あたり２×10⁴個の細胞の３穴の⁵¹Ｃｒ細胞培養系（24,000c pm／200μl）由来の平均値および標準偏差を指 す。当該細胞は10mMジチオスレイトール存在下に、示されるような物質の存在ま たは非存在下で37℃にて２時間インキュベートする。遊離の⁵¹Ｃｒのパーセント ＝100×（２Ａ／（Ａ＋Ｂ））；ここでＡ＝上清100μl中のcpm、Ｂ＝100μlの水 酸化ナトリウムが添加されるペレット100μl中のcpm。 実施例１２ ｒＰＬもしくは結合されたワクチン類でワクチン接種したマウスにおけるＳ．ニ ューモニエ(S．pneumoniae)生菌での攻撃に対する保護 10匹のグループの雌性の８週齢ＣＤ−１マウスに２週間隔で様々なワクチン0. 2mlを復腔内に注入する。これらのワクチン類はｒＰＬ、［Ｏ］１８Ｃ−ｒＰＬ および［Ｏ］１８Ｃ−ＡＤＨ−ｒＰＬを包含する。コン トロールのワクチン、［Ｏ］１８Ｃはこれらのマウスにおいて抗体応答を誘導し ない。各マウスに、多糖１μg、もしくはｒＰＬのみを含有するワクチンの場合 にはタンパク質１μgを含有するワクチン１回用量を注入する。すべてのワクチ ン類はまた１mg/mlのリン酸アルミニウムも含有する。代表するマウスからの血 清を、最初のワクチン接種に先立ち、ならびに最初のワクチン接種の２および４ 週間後に収集する。全マウスからの血清は最後のワクチン接種の11日後に収集す る。当該血清はｒＰＬおよび［Ｏ］１８Ｃに対する抗体を測定するために使用す る。最後のワクチン接種の２週間後に、マウスに異なる用量のタイプ１８ＣのＳ ．ニューモニエ(S．pneumoniae)（ＡＴＣＣ ６３１８）を注入する。当該細菌 は５％ヒツジ血小板を含むトリプティケース〔Trypticase〕（商標）大豆アガー （ＢＢＬ、コッキースヴィル(Cockeysville)、メリーランド州(MD)；ベクトン ディッキンソン アンド カンパニー(Becton，Dickinson and Co.)の登録商標 ）上で37℃にて一夜培養し、その後、５％脱線維ヒッジ血および１％グルコース を含有するトリプティケース〔Tripticase〕（商標）大豆培地（ＴＳＢ）（ＢＢ Ｌ：ベクトン ディッキンソン アンド カンパニーの登録商標）に接種し、そ して振盪せずに37℃にて６時間インキュベートする。生育物をＴＳＢで適切に希 釈する。１mlあたりのＣＦＵ数はプレートのカウントにより測定する。復腔内に 注入される細菌の用量はおよそ０、５、25、125および625×ＬＤ₅₀となるように 計算する。ここでＬＤ₅₀は１回用量あたり３ＣＦＵより少ないかもしくは等しい 。従って、細菌の用量は１回用量あたり０、23、115、575および2875ＣＦＵであ る。動物は１日に２回チェックしそしていかなる死亡も記録する。 当該結果は第７表に示される。ＴＳＢのみで細菌を投与されない、ネガティヴ コントロールとしてはたらくすべてのマウスは、14日後も健在である。抗体応答 を誘導しないポジティヴコントロールの［Ｏ］１８Ｃでワクチン接種されたすべ てのマウスは、Ｓ．ニューモニエ(S．pneumoniae)の４種の用量のいずれかでの 攻撃後４日以内に死亡する。ｒＰＬに対しかなりの抗体応答を誘導する、ｒＰＬ ワクチンを単独で投与されるマウスは、ポジティヴコントロールよりもより長期 間生存する。［Ｏ］１８Ｃおよびスペーサーとともにもしくはスペーサーなしか のいずれかのｒＰＬを含有するこの発明の結合体ワクチン類は、細菌の攻撃前に 与えられる場合には、タイプ１８Ｃ肺炎双球菌による致死的感染症に対し、2.9 ×10³ＣＦＵ（625×ＬＤ₅₀）の最も大きい攻撃用量であっても、マウスを保護す ることにおいて最も有効である。 これらの結合体ワクチン類はまた、タイプ１８Ｃ多糖およびｒＰＬの双方に対 しかなりの抗体応答も導き出す（第２表および第３表を参照）。 実施例１３ 各種のアジュバンドを含む結合体ワクチン類に対する抗体応答 実施例９のアッセイが、アジュバンドとして（１）リン酸アルミニウム200μg （１mg/ml）、（２）３ＤＭＰＬ25μg、（３）３ＤＭＰＬ100μg、もしくは（４ ）リン酸アルミニウム200μgと３ＤＭＰＬ25μgの配合剤、のいずれかを使用し て繰り返された。アッセイの結果は第８表に示される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年３月１４日 【補正内容】 精製された生成物はその後、濃縮および凍結乾燥することにより回収される。得 られる［Ｏ］ＰＳは約15〜800モノマー単位の鎖長を有する。 ある新規の方法がタイプ１８Ｃにおいて反応性の基を創出するために使用され る。すなわち、当該多糖を部分的に解重合し、中間の大きさの分子を産生するよ う切断し、そしてその後酸化する。 この酸化が部分的解重合の非存在下に実施される場合は使用できないゲル様素 材が得られる。この問題を克服するため、当該タイプ１８Ｃ多糖をまず、酢酸処 理のような弱酸により部分的に解重合し、多糖をおよそ10,000〜600,000の分子 サイズ（セファロース〔Sepharose〕（商標）ＣＬ−４Ｂカラム上で0.3〜0.7の Ｋ_av）に縮小する。その後にのみ、当該タイプ１８Ｃ多糖は上述されるような過 ヨウ素酸酸化を受け、機能を有する還元性基を創出する。以下に記述されるよう にｒＰＬに結合される場合、当該生成物はワクチンの使用に適する形態にある。 当該［Ｏ］ＰＳは直接的もしくは間接的のいずれかの結合を使用してタンパク 質担体としてのｒＰＬに結合される。直接的結合のためには、当該［Ｏ］ＰＳは 、従来の手段による還元的アミノ化のためにシアノトリヒドロホウ酸塩を使用し て当該ｒＰＬに結合される。 当該［Ｏ］ＰＳ中の機能を有するアルデヒド基類はｒＰＬと反応される。この ｒＰＬはシッフ塩基を形成するアミノ基類（とりわけリジン基）を含有する。あ るシアノトリヒドロホウ酸塩のような穏やかな選択的還元剤の存在下においては 、安定な、共有結合的に結合される結合体が形成される。当該反応は好ましくは pH５ないし９で実施される。ヒドロホウ酸塩を使用するタンパク質への［Ｏ］Ｐ Ｓの結合についての方法論はパリクら（１４）およびシュヴァルツ(Schwarz)と グレイ(Gray)（１６） により記述されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 14/315 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）ストレプトコッカル ニューモニエ(Streptococcal pneumoniae；S． pneumoniae)の莢膜多糖由来の１個の酸化された多糖、および （ｂ）組み換え的に発現されるＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)のニューモリ シンタンパク質であって、前記酸化された多糖との結合に先立ちトキソイド化さ れず、もしくは部位特異的突然変異誘発により産生されないニューモリシンタン パク質を含んで成る、免疫原性の多糖−タンパク質のある結合体。 ２．Ｓ．ニューモニエ(S．pneumoniae)の莢膜多糖がタイプ１４もしくはタイプ １８Ｃ由来である請求の範囲１の結合体。 ３．組み換え的に発現されるニューモリシンがＥ．コリ(E．coli)において発現 される請求の範囲１の結合体。 ４．組み換え的に発現されるニューモリシンがＳＣＳ１と命名されるＥ．コリ(E ．coli)株において発現され、当該株がｐＧＥＸ−ＰＬ １８Ｃと命名されるプ ラスミド（ＡＴＣＣ ６９６５４）およびｐＧＥＸ−ＰＬ １８Ｃ／２０と命名 されるプラスミド（ＡＴＣＣ ６９６５５）を含んで成るグループから選択され る１個のプラスミドを宿す請求の範囲３の結合体。 ５．組み換え的に発現されるニューモリシンが、Ｓ．ニューモニエ(S.pneumonia e)の莢膜多糖由来の酸化された多糖との結合に先立ち、まずあるスペーサーに連 結されている請求の範囲１の結合体。 ６．スペーサーがアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）および６−アミノヘキサン 酸を含んで成るグループから選択される、請求の範囲５の結合体。 ７．請求の範囲１の免疫原性結合体を含むワクチン。 ８．免疫学的に許容しうるある希釈剤、担体もしくは補助剤のひとつもしくはそ れ以上をさらに含む請求の範囲７のワクチン。 ９．異なるタイプのＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)の莢膜多糖由来の酸化さ れた多糖との免疫原性結合体の最低２個の混合物を含む請求の範囲７のワクチン 。 １０．温血動物においてＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)の莢膜多糖に対する 抗体応答を導き出すある方法であって、請求の範囲７のワクチンの免疫原性の量 を前記動物に投与することを含んで成る方法。 １１．温血動物におけるＳ．ニューモニエ(S．pneumoniae)が原因の疾患に対す る免疫化のある方法であって、請求の範囲７のワクチンを免疫原性の量において 筋肉内、腹腔内もしくは皮下注入により前記動物に投与することを含んで成る方 法。 １２．Ｓ．ニューモニエ(S．pneumoniae)のタイプ１８Ｃ多糖の酸化された断片 の調製方法であって、前記多糖を弱酸で処理して前記多糖を10,000ないし600,00 0ダルトンの分子量にまで部分的に解重合し、その後、前記部分的に解重合され た多糖を、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムおよび過ヨウ素酸を含ん で成るグループから選択される過ヨウ素酸塩で処理し、発熱物質を含まない水に 対して透析するかもしくはゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製し、そ の後酸化された多糖を濃縮しそして凍結乾燥することを含んで成る方法。