JPH10505222A - グリア細胞分裂誘発因子とその調製および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 グリア細胞（特にシュワン細胞）の細胞分裂の刺激とグリア細胞の腫瘍の治療とに有用な様々なポリペプチドをコードするＤＮＡの特徴づけと精製とが開示される。更に、グリア細胞の細胞分裂の刺激およびグリア細胞の腫瘍の治療における利用可能性を有する新規なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列も開示される。グリア細胞に関連する疾病の治療において、治療および診断の補助手段としての利用のために公知および新規なポリペプチドを合成、精製およびテストをする方法も提供される。更に、グリア細胞の関する疾病における診断および治療に有用な抗体プローブを合成する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 グリア細胞分裂誘発因子とその調製および使用 関連出願の相互参照 本出願は、１９９３年３月２４日出願の出願番号第０８／０３６，５５５号と 、１９９２年１０月２３日出願の出願番号第０７／９６５，１７３号と、１９９ ２年９月３日出願の出願番号第０７／９４０，３８９号と、１９９２年６月３０ 日出願の出願番号第０７／９０７，１３８号と、１９９２年４月３日出願の出願 番号第０７／８６３，７０３号との一部継続出願である。 発明の背景 本発明は、脊椎類に見られ、シュワン細胞を含むグリア細胞の細胞分裂誘発成 長因子であるポリペプチドに関する。本発明は、更に、そのような因子を生成可 能な方法と、そのような因子の治療的利用とにも関する。 脊椎類のグリア細胞は、中枢および末梢神経システムの特殊化した接続組織を 構成している。重要なグリア細胞としてシュワン細胞があるが、これは、ニュー ロンの為の代謝支持体を提供するとともに、特定の末梢神経の神経軸索の周囲に 髄鞘（ミエリン鞘）を提供することに よって、個別の神経線維を形成する。シュワン細胞は、ニューロンを支持し、近 接する神経軸索の周囲において近接同心の膜層を形成し、その成長につれて前記 軸索の周囲において捻れながら形成されることにより、ミエリン鞘効果を提供す るものである。これらのミエリン鞘は、多くの神経線維の弱い部分であり、これ らシュワン細胞の損傷、発育および成長の不全が、数多くの末梢神経システムの 疾患と障害を特徴づける大幅な脱髄や神経退化に関連している可能性がある。神 経システムの発達において、その細胞がその分裂と成長を制御するのに様々な因 子を必要とすることが明らかになった。そして、近年、このような種々の因子が 同定され、これらの内のいくつかはシュワン細胞の分裂と発達に影響することが 判っている。 従って、ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，ｉｎｔｅｒａｌｉａ，ｉｎ Ｎｅ ｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，４（１９８４）７５〜８３は、ウシの脳と下垂体組織と からの抽出物質に存在するタンパク質成長因子について記載しており、これはグ リア細胞成長因子（ＧＧＦ）と命名された。この因子は、胎児子ウシ血清を１０ ％含有するバックグラウンド培地において、培養ラットのシュワン細胞を刺激 してこれを分裂させた。又、この因子は分子量３１，０００ダルトンであり、容 易にダイマー化することも記載されている。Ｉｎ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１４７ （１９８７），２１７〜２２５において、ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）は、Ｇ ＧＦの、シュワン細胞に基づく分析について記載している。 ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，上記、は、更に、ＧＧＦの外見上の均質状 態への精製方法についても記載している。要約すると、ここに記載された１つの 大規模精製方法は、凍結乾燥したウシの前頭葉の抽出と、それによって得られた 物質をＣＭセルロースからのＮａＣｌグラジエント溶出を使用したクロマトグラ フィーに関するものである。次に、ゲル濾過を、先ずウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏ ｇｅｌ）カラムで、次に、ホスホセルロースカラムで、そして最後に、小規模Ｓ ＤＳゲル電気泳動法で行う。あるいは、前記ＣＭセルロース物質を、ホスホセル ロースカラムに直接に適用し、このカラムからのフラクションをプールして、調 製天然ゲル電気泳動によって精製し、その後、最終的なＳＤＳゲル電気泳動にか ける。 ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他は、以前に報告されたゲル濾過実験（ブロッ クス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）８３ ７４〜８３７７）において、成長因子活性の大きなピークが、分子量５６，００ ０ダルトンで移動（ｍｉｇｒａｔｅ）することが観察され、これに対して、上述 の手法の最初のものにおいては、分子量３１，０００において主に活性が観察さ れた、と述べている。ＧＧＦダイマーは、この実験において、主として、ＣＭセ ルロースからのグラジエント溶出の生成物として除去されることが報告されてい る。 ベンヴェニスト（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ）他（ＰＮＡＳ，８２（１８８５）， ３９３０〜３９３４）は、Ｔリンパ球由来のグリア細胞発育誘発因子について記 載している。この因子は、還元状態において、ＳＤＳゲルの見かけ上の分子量の 変化を示す。 キムラ（Ｋｉｍｕｒａ）他（Ｎａｔｕｒｅ，３４８（１９９０），２５７〜２ ６０）は、自ら神経線維腫由来成長因子（ＳＤＧＦ）と呼称する座骨神経鞘腫瘍 から得られる因子について記載している。これらの著者は、 反対に部分的に精製された下垂体フラクション含有のＧＧＦが活性な状態におい ては、ＳＤＧＦは、トリチウム標識化ＴｄＲのシュワン細胞への結合を刺激しな いと述べている。ＳＤＧＦの見かけ上の分子量は３１，０００〜３５，０００で ある。 デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）とストローバント（Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ）（Ｊ．Ｃ ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１０（１９９０），１３５３〜１３６０）とは、多数の 候補細胞分裂誘発物質について記載している。ラットのシュワン細胞を使用し、 選択された候補物質が、ＦＣＳ（胎児子ウシ血清）が１０％存在して、フォルス コリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）が存在する場合と、存在しない場合とにおいて、 シュワン細胞へのＤＮＡ合成を刺激する能力をテストした。テストした因子の１ つは、ＧＧＦ−カルボキシメチルセルロースフラクション（ＧＧＦ−ＣＭ）であ り、これはＦＣＳが存在する場合、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）が存 在および不在の両方の場合において細胞分裂誘発作用を有していた。この研究に より、フォルスコリンの存在下において、特に血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ） が、シュワン細胞に対する潜在的細胞分裂誘発物質であることが判った。ＰＤＧ Ｆは、以 前には、シュワン細胞に影響しないと考えられていたものである。 ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：１２０５ 及びウェン（Ｗｅｎ）他，Ｃｅｌｌ（１９９２）６９：５５９は、レセプタ（ｐ １８５^erbB2）に結合するタンパク質をコードするＤＮＡ配列がいくつかのヒト の腫瘍に関連していることを示している。 前記ｐ１８５^erbB2タンパク質は、チロシンキナーゼ活動を備えた１８５キロ ダルトン膜長のタンパク質である。そしてこのタンパク質は、ｅｒｂＢ２プロト −癌遺伝子によってコードされる（ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）及びユルリック（ Ｕｌｌｒｉｃｈ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：４３３（１９８８） ）。前記ｅｒｂＢ２遺伝子は、ＨＥＲ−２（ヒト細胞）、あるいはｎｅｕ（ラッ ト細胞）とも呼称されるが、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）のレセプタに密接に関 連している。最近の証拠によれば、ｐ１８５^erbB2と作用する（そしてそのキナ ーゼを活性化する）タンパク質は、ｐ１８５^erbB2を有する細胞の増殖を誘発す ることが示されている（ホ ルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２０５（１９９２）； ドバシ（Ｄｏｂａｓｈｉ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８： ８５８２（１９９１）；ルプ（Ｌｕｐｕ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．８９：２２８７（１９９２））。更に、ｐ１８５^erbB2結合タンパク質 をコードする前記遺伝子が、それぞれ長さが異なり、かつ、いくつかの共通のペ プチド配列とユニークなペプチド配列とを含む一連のタンパク質を生成する多く の、大きさとスプライシングとが異なったＲＮＡ転写体を生成することが明らか である。これは、ヒトの乳ガン（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）から得られるスプライ シングが異なったＲＮＡ転写体によって証明されている（ホルムズ（Ｈｏｌｍｅ ｓ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２０５（１９９２））。更に、これは（こ こに記載されているように）ｐ１８５^erbB2レセプタのためのリガンドとして作 用する広範囲のタンパク質によっても証明されている（下記参照）。 発明の要旨 一般に、本発明は、グリア細胞（特に、シュワン細胞と中枢神経システムのグ リア）の分裂を刺激する方法と、更に、そのようなグリア細胞の分裂誘発活性を 示す新規 なタンパク質とに関する。更に、これらのタンパク質とこれらタンパク質と、関 連タンパク質とに結合する抗体をコードするＤＮＡも提供される。 本発明の新規なタンパク質は、公知のポリペプチドをコードする配列の別のス プライス生成物を含む。一般に、これらの公知タンパク質は、前記ＧＧＦ／ｐ１ ８５^erbB2族タンパク質のメンバーである。 より詳しくは、本発明は、所定の式のポリペプチドと、これらのポリペプチド をコードするＤＮＡ配列とを提供する。即ち、これらポリペプチドは、以下の式 を有する。 ＷＹＢＡＺＣＸ ここで、ＷＹＢＡＺＣＸは、図３１に示されるアミノ酸配列からなり（配列認 識番号１３６〜１３９，１４１〜１４７，１６０，１６１，１７３〜１７８，４ ２〜４４，７７）、Ｗは、ポリペプチドセグメントＦを有するか、あるいは有さ ず、Ｙは、ポリペプチドセグメントＥを有するか、あるいは有さず、Ｚは、ポリ ペプチドセグメントＧを有するかあるいは有さず、そして、ここにＸはポ リペプチドセグメントＣ／Ｄ ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｈ，Ｃ／Ｄ ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ ，Ｃ／Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ ／Ｄ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’ Ｄ’Ｈ，Ｃ ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／ Ｄ’Ｄ’ＨＬ，またはＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬを含み、 以下のいずれかの条件を満たす、 ａ）Ｆ、Ｙ、Ｂ、Ａ、Ｚ、Ｃ又はＸの少なくとも１つは、ウシ由来である、 ｂ）ＹはポリペプチドセグメントＥであるか、又は、 ｃ）ＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ，Ｃ／Ｄ’ＨＫ Ｌ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈ，またはＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬを含む。 更に、本発明は、コード・セグメント^5'ＦＢＡ^3'と、図３１に示されるアミノ 酸配列（配列認識番号１３６，１３８，１３９，１７３〜１７５）を有する対応 のポリペプチドセグメントを備えたＤＮＡ配列も含む。 前記ＤＮＡ配列は、コード・セグメント^5'ＦＢＡ’^3'と、図３１に示されるア ミノ酸配列（配列認識番号１３６，１３８，１４０，１７３，１７４）を有する 対応のポリペプチドセグメントを含む。 前記ＤＮＡ配列は、コード・セグメント^5'ＦＥＢＡ’^3'と、図３１に示される アミノ酸配列（配列認識番号１３６〜１３９，１７３〜１７５）を有する対応の ポリペプチド・セグメントを含む。 前記ＤＮＡ配列は、コード・セグメント^5'ＦＥＢＡ^3'と、図３１に示されるア ミノ酸配列（配列認識番号１３６〜１３８，１４０，１７３，１７４）を有する 対応のポリペプチド・セグメントを含む。そして、 前記ＤＮＡ配列は、ＣＧＦ２ＨＢＳ５ ｃＤＮＡクローンのポリペプチドコー ド・セグメントを含む（ＡＴＣＣ 寄託 Ｎｏ．７５２９８，１９９２年９月２日寄託された）。 本発明は、更に、式ＦＢＡ，ＦＥＢＡ，ＦＢＡ’，ＦＥＢＡ’のペプチドと、 これらペプチドをコードするＤＮＡ配列とを含み、前記ポリペプチドセグメント は、図３１において、それぞれ、配列認識番号（１３６，１３８，１３９，１７ ３〜１７５）、（１３６〜１３９，１７３〜１７５）と（１３６、１３８，１４ ０．１７３，１７４）、及び（１３６〜１３８，１４０，１７３，１７４）とで 示されるアミノ酸配列に対応する。精製ＧＧＦ−ＩＩポリペプチド（配列認識番 号１６７）である前記ポリペプチドも本発明の一部に含まれる。 更に、本発明の一態様は、中枢神経システムのグリア、特に乏突起膠細胞、小 グリア細胞および星状膠細胞、の治療に有用なペプチドと、これらのペプチドを コードするＤＮＡと、更にこれらのペプチドの投与方法を含む。 本発明には、更に、前記Ｎ末端信号配列を除いて、前記成熟ＧＧＦペプチドと 、このペプチドをコードするＤＮＡが含まれ、これは中枢神経系の症状の治療と 、前 記ペプチドに対して特異的な抗体の製造にも有用である。これら抗体は、こに記 載したペプチドの純化と、診断用途のために有用である。 本発明は、更に、前記定義のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むベク ターを含む。又、前述のアミノ酸配列をコードする単離ＤＮＡを含有するホスト 細胞も含まれる。本発明は、更に、前記ｐ１８５^erbB2レセプタを結合し、生体 内（インヴィヴォ）および／又は生体外（インヴィトロ）でグリア細胞分裂を刺 激する化合物を含む。 又、前述の新規なペプチドに対する抗体も本発明の一部として含まれる。更に 、ここに記載のすべてのペプチドに対する抗体は、ここに記載のポリペプチドの 精製に利用可能である。又、これらのポリペプチド対する抗体は、グリア細胞の 細胞分裂治療用インヒビタとしても利用可能である。 本発明は、更に、グリア細胞の細胞分裂を刺激する方法も提供し、この方法は 、グリア細胞を以下の式で定義されるポリペプチドに接触させる工程を有する、 即ち、 ＷＹＢＡＺＣＸ ここで、ＷＹＢＡＺＣＸは、図３１に示されるアミノ酸配列からなり（配列認 識番号１３６〜１３９，１４１〜１４７，１６０，１６１，１７３〜１７８，４ ２〜４４，７７）、Ｗは、ポリペプチドセグメントＦを有するか、あるいは有さ ず、Ｙは、ポリペフチドセグメントＥを有するか、あるいは有さず、Ｚは、ポリ ペプチドセグメントＧを有するか、あるいは有さず、そして、ここにＸはポリペ プチドセグメントＣ／Ｄ ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｈ，Ｃ／Ｄ ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ，Ｃ ／Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫ Ｌ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’ Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ ’ＨＬ，またはＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬを含む。 本発明は、更に、グリア細胞分裂誘発因子を合成する方法に関し、この方法は 、上記定義の変成ホスト細胞を、本発明のＤＮＡ配列の発現を許容する条件下に おいて培 養することから構成される。 本発明のペプチドは、薬用または獣医療用としての薬用調合物質または獣医療 調合物質の製造に利用可能である。オプションとして、前記調合物質は、許容可 能な希釈液、キャリア又は補形薬との併用で、及び／又は単位投与薬の形態とし て使用可能である。 グリア細胞を生体内または生体外において、グリア細胞分裂誘発物質としての 上述のポリペプチドと接触させることによって、グリア細胞の細胞分裂を刺激す る方法も、本発明の一態様を構成するものである。有効量の前述のポリペプチド を投与することによって、脊椎類（好ましくは哺乳類、更に好ましくはヒト）に おいてグリア細胞分裂効果を作り出す方法も本発明の一部である。 前述のポリペプチドを使用して様々な疾病および障害を治療する方法も本発明 の一部である。例えば、前述のポリペプチドによって、神経疾病または障害の治 療または予防方法を行うことができる。更に、前記ポリペプチドに対して敏感で あるか、又は反応する種類の細胞における神経系の病態生理学的症状を予防また は治療する方 法も、本発明の一部を構成する。 更に、本発明は、末梢神経の損傷、中枢神経系における神経損傷、神経性障害 、末梢または中枢神経系における脱髄、シュワン細胞の損傷または消失、乏突起 膠細胞、小グリア細胞、星状膠細胞に関連する病状の治療方法にも関する。例え ば、知覚神経線維または運動神経線維の神経障害や、神経変成性障害の治療が含 まれる。これらのいずれの場合においても、その治療方法は、有効量の前記ポリ ペプチドを投与する工程からなる。 本発明は、更に、有効量の前記ポリペプチドを投与することによって、神経の 再生および／又は修復する方法にも関する。そのような薬品は、前記ポリペプチ ドを薬剤的に有効なキャリアと共に投与することによって得られる。 本発明は、薬品の製造における前記ポリペプチドの使用にも関する。 本発明は、更に、前記定義のポリペプチドの以下に記載するような使用を含む 。 −選択的に治療または診断目的に利用可能な抗体を生成するために哺乳動物を 免疫化するのに利用すること。 −前記ポリペプチドのレセプタ結合特性に対応するレセプタ結合特性を有する 分子を同定したり定量化したりする競合アッセイに利用すること、及び／または 、 −前記ポリペプチドに特異的に結合可能なレセプタとともにこのポリペプチド にサンプルを接触させて、該ポリペプチドに対する結合の競合阻害を検出する目 的に利用すること、 −例えば、アフィニティークロマトグラフィ等のアフィニティー分離プロセス に使用して対応のレセプタを分離するのに利用すること、 本発明は、更に、グリア細胞腫瘍の予防または治療方法にも関する。この方法 は、前記ペプチドによって定義される因子の結合を抑止する物質の有効量を投与 することからなる。 更に、本発明は、以下に記載するものをグリア細胞に 適用することによってグリア細胞分裂誘発活性を刺激する方法にも関する、即ち 、 −ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト胸細胞ラインから分離された３０ｋＤのポリペプチ ド因子、又は −ラットＩ−ＥＪ形質転換線維芽細胞系からグリア細胞に分離された３５ｋＤ のポリペプチド因子、又は −ＳＫＢＲ−３ヒト胸細胞系から分離された７５ｋＤのポリペプチド因子、又 は −ラットＩ−ＥＪ形質転換線維芽細胞系から分離された４４ｋＤのポリペプチ ド因子、又は −活性化マウス腹膜マクロファージから分離された２５ｋＤのポリペプチド因 子、又は −ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト胸細胞から分離された４５ｋＤのポリペプチド因子 、又は −ＡＴＬ−２ヒトＴ−細胞ラインからグリア細胞に分 離された７〜１４ｋＤのポリペプチド因子、又は −ウシ腎臓細胞から分離された２５ｋＤのポリペプチド因子、又は −脳から分離された４２ｋＤのポリペプチド因子（ＡＲＩＡ）。 本発明は、更に、生体内及び生体外でのグリア細胞の細胞分裂誘発の刺激用の 、それぞれ図３８〜４３において配列認識番号１５４〜１５９によって示され、 ＥＧＦＬＩ、ＥＧＦＬ２、ＥＧＦＬ３、ＥＧＦＬ４、ＥＧＦＬ５、ＥＧＦＬ６ポ リペプチドの利用方法にも関する。 本発明には、更に、グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する図４５の、その配列 を示すＧＣＦ−ＩＩポリペプチドの投与も含まれる。 本発明の他の一態様は、上記のペプチドをシュワン細胞を刺激し、科学的用途 または治療用途に採取可能な成長因子を生成させる使用にも関する。 更に、ここに記載のペプチドは、再髄鞘形成が必要な、例えばＭＳ等の疾患の 治療のための、中枢グリア細胞の増殖および再髄鞘形成誘発に利用することも可 能である。 本発明の更に別の態様において、ここに記載の新規なポリペプチドは、アセチ ルコリンレセプタの合成を刺激するのに利用できる。 上述のように、本発明は、公知の因子とは異なった、ウシやヒトを含むほ乳類 源から得られる新規なグリア成長因子を提供するものである。これらの因子は、 胎児子ウシプラズマ（ＦＣＰ）をバックグラウンドとして、シュワン細胞に対し て細胞分裂誘発活性を有する。本発明は、更に、これらの因子の調合方法と、こ れら及びその他の因子の活性を定義する改良方法も提供するものである。これら 因子の治療への適用も本発明の重要な一態様である。 従って、本発明の重要な特徴は以下の通りである。 （ａ）胎児子ウシプラズマの存在下においてグリア細胞分裂誘発活性、特に、 シュワン細胞分裂誘発活 性を有し、分子量が約３０ｋＤ〜約３６ｋＤの範囲で、そのアミノ酸配列内に、 以下に記載のペプチド配列の１つ又は複数を有する基礎（ベーシック）ポリペプ チド因子、 ＦＫＧＤＡＨＴＥ ＡＳＬＡＤＥＹＥＹＭＸＫ ＴＥＴＳＳＳＧＬＸＬＫ ＡＳＬＡＤＥＹＥＹＭＲＫ ＡＧＹＦＡＥＸＡＲ ＴＴＥＭＡＳＥＱＧＡ ＡＫＥＡＬＡＡＬＫ ＦＶＬＱＡＫＫ ＥＴＱＰＤＰＧＱＩＬＫＫＶＰＭＶＩＧＡＹＴ ＥＹＫＣＬＫＦＫＷＦＫＫＡＴＶＭ ＥＸＫＦＹＶＰ ＫＬＥＦＬＸＡＫ、及び （ｂ）胎児子ウシプラズマの存在下において、グリア細胞の細胞分裂誘発、特 に、シュワン細胞の分裂誘発を刺激する基礎ポリペプチド因子であって、分子量 が約５５ｋＤ〜約６３ｋＤの範囲であり、 そのアミノ酸配列内において以下のペプチド配列のうちの１つ又は複数のものを 含む、 ＶＨＱＶＷＡＡＫ ＹＩＦＦＭＥＰＥＡＸＳＳＧ ＬＧＡＷＧＰＰＡＦＰＶＸＹ ＷＦＶＶＩＥＧＫ ＡＳＰＶＳＶＧＳＶＱＥＬＱＲ ＶＣＬＬＴＶＡＡＬＰＰＴ ＫＶＨＱＶＷＡＡＫ ＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭＸＫ ＤＬＬＬＸＶ ＥＧＫＶＨＰＱＲＲＧＡＬＤＲＫ ＰＳＣＧＲＬＫＥＤＳＲＹＩＦＦＭＥ ＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫ 分子量が小さなポリペプチド因子と、分子量が大きなポリペプチド因子とから 得られる上記の新規なペプチド配列も、それ自身本発明の権利の一部を構成する ものである。これらの配列は、本発明のポリペプチド因子について、広範囲の様 々な種からこのような因子（又は対応の遺伝子配列）を調査し、分離し、あるい は合成し、又 は、このような因子を遺伝子組替え技術によって合成するためのプローブ源とし て有用であり、更には、対応する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、であっ てそれ自身が有用な研究手段であり、また治療物質としての可能性も有する抗体 の、従来技術による合成にも有用である。本発明は、更に、本発明の新規なペプ チド配列のための前記の方法によって得られる、遺伝子配列またはそのフラグメ ントをコードする分離グリア細胞分裂誘発活性にも関する。 本発明における高度に精製された因子から得られる短いペプチドの使用により 、更に別の配列も特定することが可能になった（下記の例参照）。 従って、本発明は、更に、グリア細胞分裂誘発活性を有し、以下に記載するＤ ＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を備えたポリペプチド因子も含む。 即ち、 （ａ）図２８ａ，２８ｂ又は２８ｃのいずれかにおいてそれぞれ配列認識番号 １３３〜１３５で示されるＤＮＡ配列、 （ｂ）図２２において、配列認識番号８９によって示されるＤＮＡ配列、 （ｃ）図２８ａにおいて配列認識番号１３３によって示される配列のヌクレオ チド２８１〜５５７によって表されるＤＮＡ配列、 （ｄ）前記（ａ），（ｂ）又は（ｃ）によって、いずれかのＤＮＡとハイブリ ッド可能なＤＮＡ配列。 本発明は、更に、上述の配列に対して６０％以上、好ましくは８０％以上の相 同同一性を有する配列を含む。 本発明は、特定のハイブリッド形成条件に限定されるものではないが、以下の 実験記録は、便宜的に従われるガイダンスを提供するものである。 ＤＮＡプローブは、ショワルター（Ｓｃｈｏｗａｌｔｅｒ）及びゾマー（Ｓｏ ｍｍｅｒ）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７７：９０〜９４，１９８９）に 従い、ニックトランスレーションあるいはＰＣＲ反応によって、高比活性（約１ ０⁸〜１０^{9 32}Ｐｄｍｐ／μｇ）に標識化して、Ｇ−１５０セファーデックス（ Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラ ムでの脱塩によって精製できる。プローブは、変性し（沸騰水中で１０分間、そ の後、冷水に漬ける）、次に、１０⁶ｄｐｍ³²Ｐ／ｍｌにて１０％の硫酸デキス トランを含有する８０％のバッファＢ（ポリビニルピロリジン２ｇ、Ｆｉｃｏｌ ｌ−４００ ２ｇ，ウシ血清アルブミン２ｇ，１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣＬ（ｐｈ７ ．５）５０ｍｌ，ＮａＣｌ ５８ｇ，ピロ燐酸塩ナトリウム１ｇ、ドデシル硫酸 ナトリウム１０ｇ、Ｈ₂Ｏ ９５０ｍｌ）のハイブリッド化溶液に加え、６０℃ で一晩（約１６時間）培養することができる。次に、前記フィルタを、６０℃に て、先ず、バッファＢ中で１５分間、次に、２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で ２０分間洗浄を３回、１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２０分間の洗浄を１ 回行うことによって洗浄することができる。 その他の態様において、本発明は、以下記載のものを提供する、 （ａ）ウシ下垂体物質から得られた場合には、還元状態であるか否かに関わら ず、下記の分子量標準を使用したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動におい て、約３０ｋＤ〜約３６ｋＤの分子量が観 察される基礎ポリペプチド因子： リゾチーム（鶏卵白） １４，４００ 大豆トリプシン インヒビター ２１，５００ カルボニック アンヒドラーゼ（ウシ） ３１，０００ 卵白アルブミン（鶏卵白） ４５，０００ ウシ血清アルブミン ６６，２００ フォスフォリラーゼ Ｂ（ラビット筋肉） ９７，４００ そして当該因子は、胎児子ウシプラズマの存在下において、ラットシュワン細 胞の分裂を含むグリア細胞分裂誘発活性を有し、逆相ＨＰＬＣを使用して分離し た場合、４℃で０．１％のトリフルオロ酢酸中での１０週間の培養後においてそ の活性の少なくとも５０％を保持する。 そして、 （ｂ）ウシ下垂体物質から得られた場合に、非還元状態において、下記の分子 量標準を使用したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動において、約５５ｋＤ 〜約６３ｋＤの分子量が観察される基礎ポリペプチド因子： リゾチーム（鶏卵白） １４，４００ 大豆トリプシン インヒビター ２１，５００ カルボニック アンヒドラーゼ（ウシ） ３１，０００ 卵白アルブミン（鶏卵白） ４５，０００ ウシ血清アルブミン ６６，２００ フォスフォリラーゼ Ｂ（ラビット筋肉） ９７，４００ そして当該因子のヒトの等価物質は、ここに記載のＤＮＡクローンＧＧＦ２Ｈ ＢＳ５によってコードされ、また該因子は、胎児子ウシプラズマの存在下におい て、ラットシュワン細胞の分裂を含むグリア細胞分裂誘発活性を有し、逆相ＨＰ ＬＣを使用して分離した場合、４℃で０．１％のトリフルオロ酢酸中での１０週 間の培養後において、その活性の少なくとも５０％を保持する。 尚、便宜上、本発明の低い分子量の因子と高い分子量の因子とを、それぞれ、 ”ＧＧＦ−Ｉ”、”ＧＧＦ−ＩＩ”と称する。前記ＧＧＦ−ＩＩという表示は、 ＧＧＦ−ＩＩタンパク質由来のペプチド配列データで分離されたすべてのクロー ン（即ち、ＧＧＦ２ＨＢＳ５，ＧＧＦ２ＢＰＰ３）に使用される。 尚、前述の分子量範囲は、正確なものではなく、特定のポリペプチド因子のソ ースによって僅かに変化するものである。たとえば、別のソースからの物質にお いて約１０％の変化は不可能であろう。 本発明の別の重要な特徴は、グリア細胞分裂誘発20活性を有するポリペプチド をコードするＤＮＡ配列であって、以下のＤＮＡ配列である、 （ａ）図２８ａ，２８ｂ又は２８ｃのいずれかにおいてそれぞれ配列認識番号 １３３〜１３５で示されるＤＮＡ配列、 （ｂ）図２２において、配列認識番号８９によって示されるＤＮＡ配列、 （ｃ）図２８ａにおいて配列認識番号１３３によって示される配列のヌクレオ チド２８１〜５５７によって表されるＤＮＡ配列、 （ｄ）前記（ａ），（ｂ）又は（ｃ）により、他のＤＮＡとハイブリッド可能 なＤＮＡ配列。 本発明の別の態様は、グリア細胞因子とｐ１８５^erbB2リガンドタンパク質と が前記同じ遺伝子によってコードされるという事実を利用するものである。この 遺伝子から様々なメッセンジャＲＮＡスプライシング変異体が由来し、これらの 生成物質の多くが、ｐ１８５^erbB2結合および活性を示す。前記（ＧＧＦ−ＩＩ ）遺伝子生成物のいくつかを使用して、シュワン細胞分裂誘発活性が示された。 本発明は、前記ＧＧＦ／ｐ１８５^erbB2リガンド遺伝子のすべて公知の生成物（ 前記参考文献に記載されている）のシュワン細胞分裂誘発物質としの利用を提供 するものである。 本発明は、更に、その他のこれまで自然には分離されていないグリア成長因子 遺伝子のスプライシング変異体にも関する。図３０は、ポリメラーゼ連鎖反応実 験（逆転写ＲＮＡにおける）とｃＤＮＡクローン（ここに記載）の分析、更に、 ｐ１８５^erbB2リガンドをコードする配列として公開されているもの（ペレス（ Ｐｅｌｅｓ）他，Ｃｅｌｌ ６９：２０５（１９９２）及びウェン（Ｗｅｎ）他 ，Ｃｅｌｌ ６９：５５９（１９９２））からのスプライシングの公知のパター ンを示している。これらのパターンは、ここに記載のその他のパターンと ともに、存在する可能なスプライシング変異体を表すものである。従って、本発 明の別の態様は、この遺伝子から由来の新規なタンパク質因子をコードするヌク レオチド配列に関する。本発明は、更に、これらの因子の合成方法にも関する。 これらの新規な因子の治療への適用も本発明の更に別の態様を構成するものであ る。 従って、本発明の他の重要な特徴は以下の通りである、 （ａ）シュワン細胞の分裂の刺激を含むグリア細胞分裂誘発活性を有する一連 のヒト及びウシポリペプチド因子。これらのポリペプチド配列は、図３１，３２ ，３３及び３４において、それぞれ配列認識番号１３６〜１３７，１７３として 示されている。 （ｂ）シュワン細胞の分裂の刺激を含むグリア細胞分裂誘発活性を有する一連 のポリペプチド因子であって、以下の記載概要に基づいて精製され、特徴づけら れるもの、即ち、ルプ（Ｌｕｐｕ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５５２（１ ９９０）；ルプ（Ｌｕｐｕ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳ Ａ ８９：２２８７（１９９２）；ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２０５（１９９２）；ペレス（Ｐｅｌｅｓ）他，６ ９ ：２０５（１９９２）； ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）およびペレス（Ｐｅｌｅ ｓ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３５４３（１９９１）；ドバシ（Ｄｏ ｂａｓｈｉ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：８５８２（１ ９９１）；デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：１５３６（１９９１）；ビューモント（Ｂｅａｕ ｍｏｎｔ）他，特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３４４３（１９９０）；グリーン （Ｇｒｅｅｎ）他，特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２３３１（１９９０）、アス ディン（Ｕｓｄｉｎ）およびフィッシュバック（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ），Ｊ．Ｃ ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：４９３〜５０７（１９８６）； フォールズ（Ｆａ ｌｌｓ）他，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．５５：３９７〜４０６（１９９０）；ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）他，Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７６６４〜７６６８（１ ９９１）； 及びフォールズ（Ｆａｌｌｓ）他，Ｃｅｌｌ ７２：８０１〜８１５（１９９３ ）。 （ｃ）シュワン細胞の分裂の刺激を含むグリア細胞分裂誘発活性を有するポリ ペプチド因子（ＧＧＦＢＰＰ５）。そのアミノ酸配列は、図３２において配列認 識番号１４８によって示され、図３２において配列認識番号１４８によって示さ れるウシＤＮＡ配列によってコードされる。 上述の新規なヒトペプチド配列は、図３１，３２，３３，３４において、それ ぞれ配列認識番号１３６〜１５０，１７３〜１７６，１７８，４２〜４４，７７ として示され、これらは、天然ソース（適当な線維組織から得られるｃＤＮＡラ イブラリ）からの完全長の相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）として分離可能であり、あ るいは、当業者によって、個々のエクソン（例えば、分離エクソンとして得られ る）とのＤＮＡ構造物として組立可能である。 ｐ１８５^erbB2レセプタに特異的に結合する他の化合物、特に、ペプチドも、 本発明においては、グリア細胞 分裂誘発物質として利用可能である。候補化合物は、ｐ１８５^erbB2結合により ルーチン的にスクリーニングすることができ、もしも結合する場合には、ここに 記載の方法を使用してグリア細胞分裂誘発活性のスクリーニングを行うことがで きる。 本発明は、活性が大幅に減少したものでない、上記ポリペプチド因子のすべて の変成物質および等価物質も含む。 例えば、その活性に大きな悪影響を与えることなくアミノ酸内容又は配列を変 化させた変形物質が含まれる。例として、天然タンパク質のＥＰ−Ａ１０９７４ ８における突然変異が開示され、ここでは、生物学的反応には必要のない該天然 の配列中のシステインを中性アミノ酸に置換することによって、不要な二硫化物 結合の可能性を避けている。従ってここに含まれる効果および使用方法の記載は 、このような変形物質及び同等物質の効果および使用方法をも含むものであると 理解される。 本発明の新規な配列は、組替え技術の利点を新たに開くものである。従って、 本発明は、以下の態様を含む。 （ａ）前記コンストラクトによる形質転換後の選択されたホスト細胞のベクタ ー（前記配列の発現を許容すべく制御配列に対して位置決めされている）内の作 動読み取り枠における前述のＤＮＡ配列からなるＤＮＡコンストラクト（好まし くは、前記制御配列は、例えばＴｒｐ等の調節可能プロモータを有している）。 尚、プロモータと調節配列（あるとすれば）の選択は当業者における選択事項で ある。 （ｂ）前記ＤＮＡ配列が前記ホスト細胞において発現できるように上記（ａ） に定義されたコンストラクトを組み込むことによって変成されたホスト細胞─ホ ストの選択は重要でなく、選択される細胞は、原核生物あるいは真核生物のいず れであってもよく、公知の方法によって遺伝子的に変形して前記コンストラクト を組み込むことが可能である。そして （ｃ）ＤＮＡ配列の発現を許容する条件下において、変成されたホスト細胞を 培養することからなる上記因子の合成方法。前記条件は、ＤＮＡ組替え技 術の当業者によって実施態様に応じて容易に決定することが可能である。本発明 は、この手段によって合成されたグリア細胞分裂誘発物質を含む。 この技術において記載されているいずれの因子も、本発明の新規なポリペプチ ド因子が有する組合せの特性を有していない。 前述したように、本発明の因子を特徴づけるシュワン細胞分析は、バックグラ ンドとして胎児子ウシプラズマを使用する。その他すべての点においては、この 分析は、ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，ｉｎ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｓｕｐ ｒａと同じであってよいが、但し、１０％のＦＣＳを１０％のＦＣＰで置き換え る。この分析技術の違いは重要である。というのは、胎児子ウシプラズマにおい て血清由来の因子が不在にであることによって（血清に対抗するように）、その 他のいくつかの因子からの疑似効果を除去することにより、シュワン細胞に於け る活性を厳密に定義することが可能になるからである。 本発明は、更に、上述のポリペプチドを調製する方法 を含み、該方法は、タンパク質を得るために脊椎類の脳物質を抽出し、この抽出 物をハイドロキシアパタイトＨＰＬＣによってクロマトグラフィ精製し、次に、 これらのフラクションをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけること よりなる。約３０ｋＤの分子量が観察されたフラクション及び／又は約５５ｋＤ 〜６３ｋＤの分子量が観察されたフラクションを採取する。いずれの場合におい ても、このフラクションを、下記の分子量標準を使用してＳＤＳ−ポリアクリル アミドゲル電気泳動にかける。 リゾチーム（鶏卵白） １４，４００ 大豆トリプシン インヒビター ２１，５００ カルボニックアンヒドラーゼ（ウシ） ３１，０００ 卵アルブミン（鶏卵白） ４５，０００ ウシ血清アルブミン ６６，２００ フォスフォリラーゼ Ｂ（ラビット筋肉） ９７，４００ 分子量の小さなフラクションの場合には、前記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ルを、非還元条件下、あるいは還元条件下のいずれかでランさせ、分子量の大き なフラクションの場合には、該ゲルを非還元条件下でランさせる。 次に、これらのフラクションの、胎児子ウシプラズマのバックグラウンド下でラ ットシュワン細胞の分裂を刺激する活性についてテストする。 好ましくは、上記方法は、例えば、ウシ下垂体物質からのカルボキシルメチル セルロースクロマトグラフィによって得られた関連フラクションを分離すること によって始める。又、好ましくは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の 前に、ハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィ、ゲル 濾過、および／または逆相ＨＰＬＣを使用する。この方法の各段階において、上 述のブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）ｉｎ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，に一般的手段と して記載されている分析、但し、１０％ＦＣＰを１０％ＦＣＳに代えた分析、に より、放射性ヨウ化デオキシウリジンを標準として組み入れ、シュワン細胞を使 用することによって活性を測定することができる。 従って、本発明は、更に、分析対象の物質によって刺激された（もしあれば） グリア細胞におけるＤＮＡ合成を評価することに対して、バックグランドとして 胎児子ウシプラズマを使用するグリア細胞分裂誘発活性の分析 方法を含む。 本発明の更に別の態様は、オプションとして、許容可能な希釈液、キャリア又 は補形薬との併用により、及び／又は単位投与として使用される、薬用又は獣医 用として調合された前述のすべての因子からなる薬用または獣医療用調合物質に 関する。本発明の因子の使用においては、適当な調合または組成を提供するため 従来の薬学的または獣医学的慣用手段を利用することが出来る。 従って、本発明は、例えば、静脈内、皮下内、筋肉内、眼窩内、眼用、心室内 、頭蓋内、嚢内、髄腔内 槽内、腹膜内、鼻腔内、噴霧状、乱切の各投与、そし て又、経口、口内、直腸、又は膣への投与などの非経口投与法に適用可能である 。 本発明の調合物は、更に、本発明のＤＮＡを発現するホスト細胞の患者への移 植、あるいはこれら調合物を放出する外科移植によって投与することも可能であ る。 非経口調合物の形態は、溶液や懸濁液であってよく、又、経口投与調合物の形 態は、錠剤、カプセル等であり、 鼻腔内投与調合物の形態は、粉末、鼻腔点滴薬、エアロゾル等とすることができ る。 公知の調合方法は、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。非経口投与用調合物は、補 形薬として、例えば、滅菌した水または塩水、ポリエチレングリコール等のポリ アルキレングリコール、植物性オイル、水素化ナフタレン、生物学的適合性、生 物分解性ラクチドポリマ、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマ ー等を使用して本発明の因子の放出を調節することが可能である。他のこれら因 子の非経口投与システムとして可能なものとしては、エチレン−ビニルアセテー トコポリマー粒子、浸透ポンプ、移植可能注入システムやリポソーム等がある。 吸引用の調合物は、補形薬として、例えば、ラクトースを含有することが可能で あり、又は、例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココー ル酸塩やデオキシコール酸塩などを含有する水溶液にしたり、鼻腔点滴液投与用 としては油性溶液としたり、あるいは、ゲル状にしたりすることができる。非経 口投与用調合物としては、更に、口内投与用にはグリココール酸塩、直腸投与に はメトキシサリチル酸塩、 または膣投与用にはクエン酸などがある。 本発明の因子は、単独の活性薬剤として使用したり、あるいは他の活性成分、 例えば、神経疾患における神経生存を容易にする他の成長因子や、ペプチダーゼ 又はプロテアーゼインヒビタ等と組み合わせて使用することができる。 本発明の調合物における本発明の因子の濃度は、投与される量な投与経路など の多くの要因に応じて変化する。 一般に、本発明の因子は、非経口投与用としては水性生理バッファ溶液中に約 ０．１〜１０％ｗ／ｖ化合物を入れて提供することができる。一般的な投与量は 、体重当り、一日につき、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇの範囲である。好まし い投与量範囲は、体重当り、一日につき、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ ｋｇである。この好ましい投与量は、治療対象の病理状態の種類と程度、患者の 全体的健康状態、調合物の形態及び投与経路によって異なったものになる。 前述のように、シュワン細胞（末梢神経系のグリア細 胞）は、本発明の因子が存在することによって刺激され分裂する。末梢神経のシ ュワン細胞は、ニューロンの支持と、個々の神経線維の周りの髄鞘（ミエリン鞘 ）の形成に関連している。この鞘は、筋肉への電気パルスと知覚レセプタからの 電気パルスの適当な伝達にとって重要である。 一次的または二次的にシュワン細胞と神経線維が損傷を受ける数多くの種類の 末梢神経障害が存在する。又、知覚神経と運動神経の双方の神経障害も数多くの ものがある（アダムズ（Ａｄａｍｓ）およびヴィクター（Ｖｉｃｔｏｒ），Ｐｒ ｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）。これらの神経障害のなかで最 も重要なものは、恐らく、糖尿病、多発性硬化症、Ｌａｎｄｒｙ−Ｇｕｉｌｌｉ ａｎ−Ｂａｒｒ症候群、腫瘍によって発生する神経障害、及び毒物によって生じ る神経障害（これらの内のいくつかは腫瘍の治療に利用される）である。 しかしながら、本発明は、神経システムの損傷が、例えば、感染または怪我な どいかなる原因によって生じた場合においても使用できる治療方法と予防方法と を提供 するものである。従って、脱髄またはシュワン細胞の損失が存在する神経システ ムの障害又疾患の治療において本発明の因子を使用することに加えて、これらの グリア細胞成長因子は、末梢神経に対する損傷によって生じた神経系の障害の治 療においても有効である。末梢神経に対する損傷の後、シュワン細胞の成長また は再形成によって再生プロセスが誘発され、その後、神経線維がその目標に向か って再成長する。シュワン細胞の分裂を加速することによって、損傷後の再生プ ロセスを促進することができる。 中枢神経系（脳および脊髄）の損傷または神経退化疾患の治療にも類似の方法 を使用することができる。 更に、様々なグリア細胞の腫瘍があるが、それらの内で最も一般的なものは、 恐らく、神経線維腫であり、これはグリア細胞の過剰成長によって生じる斑状小 腫瘍である。又、いくつかのシュワン細胞腫瘍においてＧＧＦに非常に類似した 活性物質が見られることも知られており、従って、それらのレセプタに対する本 発明のインヒビタ活動によってグリア腫瘍を治療することができ、これは前述の ように、因子のレセプタへの結合を阻害するのに有効量の物質を投与することか らなる。 一般に、本発明は、因子−敏感性又は因子−反応性細胞が関連する神経系の病 態生理学的症状の予防または治療に本発明のポリペプチド因子を使用することを 含む。 本発明のポリペプチド因子は、更に、標準的技術に従って、モノクローナル抗 体等の抗体を作る免疫源としても利用可能である。このような抗体も本発明の範 囲に含まれる。又、これらの抗体を、治療や診断の目的のために利用することも 可能である。従って、恐らく因子が異常なレベルであることに関連する状態を、 このような抗体を利用して追求することができる。標準的方法により単離された サンプルの分析を利用し、インヴィトロ技術が使用できる。又、腫瘍画像化技術 を利用して抗体を、例えば、放射性アイソトープで標識化し、体外から画像化で きる画像化方法も、使用可能である。 本発明は、更に、前記因子をインヴィヴォ(in vivo)又はインヴィトロ(in vit ro)でグリア細胞分裂誘発物質として使用することと、そのような用途としての 因子とを含む。従って、１つの具体的実施例は、有効量の本発明の因子を投与す ることによって、脊椎類においてグリア細胞細胞分裂誘発効果を生成する方法に 関する。その ような方法の好適な実施例は、神経システム疾患または障害の治療方法または予 防方法である。 本発明の更に別の態様は、本発明の因子を、薬品の製造、好ましくは、神経疾 患または障害、あるいは神経再生又は修復のための薬品の製造に使用することで ある。 更に、本発明は、本発明の因子の、前記ポリペプチドに対応のレセプタ結合特 性を有する分子を同定、あるいは定量する競合アッセイへの利用も含む。これら のポリペプチドは、ラジアイソトープによって標識化してもよい。競合アッセイ は、関連するレセプタの拮抗薬と作用薬の両方を同定することができる。 別の態様において、本発明は、それぞれの対応レセプタを分離するために、例 えばアフィニティークロマトグラフィ等のアフィニティー分離プロセスにおける 本発明の因子の使用を提供する。このような特定のタンパク質に対応するレセプ タの分離のためのプロセスは、当該技術において公知であり、本発明の因子にお いても数多くの技術が適用可能である。例えば、ＩＬ−６とＩＦＮとに関して、 ノヴィック，ディ（Ｎｏｖｉｃｋ，Ｄ．）他， Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．（１９９０）５１０：３３１〜７が挙げられる。ゴ ナドトロピン放出ホルモンに関しては文献は以下のものである：ハザム，イー（ Ｈａｚｕｍ，Ｅ．），Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．（１９９０）５１０：２３３ 〜８。またＧ−ＣＳＦに関しては、フクナガ，アール（Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ． ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１３３８６〜９０がある。ＩＬ−２ に関しては、スマート，ジェイ，イー（Ｓｍａｒｔ，Ｊ．Ｅ．）他，（１９９０ ）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４：１５８Ｓ〜１６３Ｓがあり、 ヒトＩＦＮ−ガンマに関しては、ステファノス，エス（Ｓｔｅｆａｎｏｓ，Ｓ． ）他，（１９８９）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．，９：７１９〜３０が ある。 図面の簡単な説明 先ず、図面について説明する。図面 図１〜８は例１に関し、これらについて簡単に説明する。 図１はカルボキシルメチルセルロース・クロマトグラフィからの生成物のプロ フィール、 図２はハイドロキシルアパタイトＨＰＬＣからの生成物のプロフィール、 図３はモノ Ｓ ＦＰＬＣからの生成物のプロフィール、 図４はゲル濾過処理ＦＰＬＣの生成物のプロフィール、 図５及び６は逆相ＨＰＬＣからの２つの部分的に精製されたポリペプチド生成 物のプロフィールを示す、 図７及び８は胎児子ウシ血清または胎児子ウシプラズマのバックグランドを使 用した逆相ＨＰＬＣからのＧＣＦ−ＩＩ及びＧＣＦ−ＩＩの投与量−反応曲線を 示す、 図９〜１２はＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩ，配列認識番号１〜２０，２２〜２９ ，３２〜５３及び１６９から由来のペプチド配列を示し（後記の例２参照）、図 １０及び１２は、特に、新規な配列を示す、 図１０において、パネルＡは、退化オリゴヌクレオチドプローブと退化ＰＣＲ プライマとを構成するのに使用するＧＣＦ−Ｉペプチドの配列がリストされてい る（配列認識番号２０，１，２２〜２９及び１７）。パネルＡのこれらの配列の 内のいくつかは、合成ペプチドの構成にも使用された。パネルＢは、退化プロー ブと退化ＰＣＲプライマの構成には短すぎた（６アミノ酸以下）新規なペプチド の配列のリストである（配列認識番号１７及び５２）、 図１２において、パネルＡは、退化オリゴヌクレオチドプローブと退化ＰＣＲ プライマとを構成するのに使用するＧＣＦ−ＩＩペプチドの配列がリストされて いる（配列認識番号４５〜５２）。パネルＡのこれらの配列の内のいくつかは、 合成ペプチドの構成に使用された。パネルＢは、退化プローブと退化ＰＣＲプラ イマの構成には短すぎた（６アミノ酸以下）新規なペプチドの配列のリストであ る（配列認識番号５３）、 図１３〜２０は後記の例３に関し、本発明の因子の細胞分裂誘発活性を示し、 図２１〜２８（ａ，ｂ及びｃ）は後記の例４に関し、これらについて以下簡単 に説明する、 図２１は図１０のパネルＡ及び図１２のパネルＡに示された新規なペプチド配 列から構成された退化オリゴヌクレオチド（配列認識番号５４〜８８）のリスト である、 図２２（配列認識番号８９）は退化オリゴヌクレオチドプローブ６０９，６５ ０（それぞれ図２１，配列認識番号６９及び７２参照）の結合サイトを含有する 組替えウシゲノムファージＧＣＦ２ＢＧ１からの推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子配 列のストレッチを示す。同図は、ＤＮＡ配列のコード・ストランドと第３読み取 り枠の推定されたアミノ酸配列である。因子２（太字）からのペプチド１２の配 列は、６６アミノ酸転写解読枠（ヌクレオチド７５２７２）の一部である、 図２３は後部下垂体からのＲＮＡに存在するウシＧＧＦ−ＩＩコード下配列の セグメントを分離する実験に使用された退化ＰＣＲプライマ（パネルＡ，配列認 識番号９０〜１０８）とユニークなＰＣＲプライマ（パネルＢ，配列認識番号１ ０９〜１１９）である、 図２４は図７のパネルＡ，Ｂのプライマのリストを使用したＰＣＲ増幅実験に おいて得られた９つの別々の隣接したウシＧＧＦ−ＩＩ ｃＤＮＡコンストラク トと配列、および後部下垂体からのＲＮＡを示す。同図の最上ラインは、特徴づ けられたｃＤＮＡコンストラクトに寄与するコード配列の略図である、 図２５はＧＧＦ２ＢＧ１のウシ組替えファージの物理的地図である。前記ウシ フラグメントは、長さが約２０ｋｂであり、ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子の２つのエ クソン（太字）を有している。酵素Ｘｂａｌ，ＳｐｅＩ，Ｎｄｅｌ，ＥｃｏＲＩ ，Ｋｐｎｌ，ＳｓｔＩの制限サイトがこの物理的地図上に示されている。斜線部 分は、配列のためにサブクローンされたフラグメントに対応する、 図２６は前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子の３つの別の遺伝子生成物の構造の 略図である。エクソンはその発見の順番にＡ〜Ｅとしてリストされている。別の スプライシングパターン１，２及び３は、３つのオーバラップする推定タンパク 質コンストラクト（ＧＧＦ２ＢＰＰ１，２，３）を生成し、これらはそれぞれ別 の図２８ａ，ｂ，ｃ（下記）に示されている、 図２７（配列認識番号１２０〜１３２）は図２８ａ，２８ｂ，２８ｃ（下記） に示された推定タンパク質配列において同定されたＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩ と、図１０及び１２にリストされた新規なペプチド配列との比較である。同図は 、９つの新規なＧＧＦ−ＩＩペプチド配列の内の６つが、これらの推定タンパク 質配列に見られることを示している。ＧＧＦ−Ｉ配列に類似の２つのペプチド配 列も見られる、 図２８ａ（配列認識番号１３３）は図２６のスプライシングパターンＮｏ．１ から得られるコード・ストランドＤＮＡと推定アミノ酸配列のリストである。前 記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子のこの部分ｃＤＮＡは、２０６アミノ酸のタンパ ク質をコードする。太字のペプチドは、図１０及び１２に示したリストから同定 されたペプチドである。潜在的グリコシル化サイトがアンダーラインされている （ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡとともに）。 図２８ｂ（配列認識番号１３４）は図２６のスプライシングパターンＮｏ．２ から得られるコード・ストランドＤＮＡと推定アミノ酸配列のリストである。前 記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子のこの部分ｃＤＮＡは、２８１ アミノ酸のタンパク質をコードする。太字のペプチドは、図１０及び１２に示し たリストから同定されたペプチドである。潜在的グリコシル化サイトがアンダー ラインされている（ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡとともに）。 図２８ｃ（配列認識番号１３５）は図２６のスプライシングパターンＮｏ．３ から得られるコード・ストランドＤＮＡと推定アミノ酸配列のリストである。前 記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子のこの部分ｃＤＮＡは、２５７アミノ酸のタンパ ク質をコードする。太字のペプチドは、図１０及び１２に示したリストから同定 されたペプチドである。潜在的グリコシル化サイトがアンダーラインされている （ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡとともに）。 図２９は、下記の例６に関し、サザンブロット上の種々なほ乳類ＤＮＡに対す る推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子配列のクロスハイブリッド化分析のオートラジオ グラムである。前記フィルタは、同図にリストされた種からのＥｃｏＲＩ−消化 ＤＮＡ（各レーンにつき５μｇ）を含有する。前記プローブは、図２５の物理的 地図によって予測されるウシＤＮＡの４キロベースのフラグメントを含んで、各 ＤＮＡサンプルにおける単一の強力なバンド を検出する。より力の小さいバンドも観察され、これらは関連ＤＮＡ配列を示す 。他のほ乳類ＤＮＡサンプルからの強いハイブリッド化バンドは、これらの種の ＧＧＦ−ＩＩ相同体を示すものと考えられる。 図３０は種々なスプライシング変異体を示す図である。コード・セグメントは 、Ｆ，Ｅ，Ｂ，Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｃ／Ｄ，Ｃ／Ｄ’，Ｄ，Ｄ’，Ｈ，Ｋ及びＬによっ て示されている。精製タンパク質からのペプチド配列の位置は、”０”によって 示されている。 図３１（配列認識番号１３６〜１４７，１６０，１６１，１７３〜１７８，４ ２〜４４，７７）はＧＧＦのコード・セグメントのＤＮＡ配列と予想ペプチド配 列のリストである。ライン１は、ウシＧＧＦの予想アミノ酸配列のリストであり 、ライン２は、ウシＧＧＦのヌクレオチド配列のリストであり、ライン３は、ヒ トＧＧＦ（ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ））のヌクレオチド配列のリストで あり（ヌクレオチドベースのマッチングは縦線にて示してある）、ライン４は、 前記予想ウシ配列とは異なる場合におけるヒトＧＧＦ／ヘレグリンの予想アミノ 酸配列のリストである。コード・セグメントＥ、Ａ’及び Ｋは、ウシ配列のみを表す。コード・セグメントＤ’は、ヒト（ヘレグリン）配 列のみを表す。 図３２（配列認識番号１４８）はＢＰＰ５の予想ＧＧＦ２アミノ酸配列とヌク レオチド配列である。上方ラインは、ヌクレオチド配列であり、下方ラインは、 予想アミノ酸配列である。 図３３（配列認識番号１４９）はＧＧＦ２ＢＰＰ２の予想アミノ酸配列とヌク レオチド配列である。上方ラインは、ヌクレオチド配列であり、下方ラインは、 予想アミノ酸配列である。 図３４（配列認識番号１５０）はＧＧＦ２ＢＰＰ４の予想アミノ酸配列とヌク レオチド配列である。上方ラインは、ヌクレオチド配列であり、下方ラインは、 予想アミノ酸配列である。 図３５（配列認識番号１５１〜１５２）は２つのＧＧＦペプチド配列（ＧＧＦ ２ｐｐ４とＧＧＦ２ｐｐ５）のヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）との整合を示す。星印は 、保存されたシステインを示す。 図３６はＧＧＦの増加に対する、約２００ｋＤ（アンチ燐酸化ポリクローナル 抗体とともに現像したウエスタンブロット上における２００ｋＤバンドの強度） のタンパク質のＧＧＦ活性のレベル（シュワン細胞分裂誘発分析）と、チロシン 燐酸化を示す。 図３７は図３１の配列からのスプライシング変異体のリスト、 図３８はＥＧＦＬ１（配列認識番号１５４）の、予想アミノ酸配列を下部に、 核酸配列を上部に示す、 図３９はＥＧＦＬ２（配列認識番号１５５）の、予想アミノ酸配列を下部に、 核酸配列を上部に示す、 図４０はＥＧＦＬ３（配列認識番号１５６）の、予想アミノ酸配列を下部に、 核酸配列を上部に示す、 図４１はＥＧＦＬ４（配列認識番号１５７）の、予想アミノ酸配列を下部に、 核酸配列を上部に示す、 図４２はＥＧＦＬ５（配列認識番号１５８）の、予想 アミノ酸配列を下部に、核酸配列を上部に示す、 図４３はＥＧＦＬ６（配列認識番号１５９）の、予想アミノ酸配列を下部に、 核酸配列を上部に示す、 図４４はクローンのスケールコード・セグメントマップである。Ｔ３は、前記 クローンからｍＲＮＡを生成するのに使用するバクテリオファージプロモータを 示す。Ｒ＝隣接のＥｃｏＲＩ制限酵素サイト。５’ＵＴは、５’非翻訳領域を示 す。Ｅ，Ｂ，Ａ，Ｃ，Ｃ／Ｄ’及びＤは、コード・セグメントを示す。Ｏ＝翻訳 開始サイト。∧＝ウシＥセグメントに対して相同の領域の５’限界（例６参照） 、そして、３’ＵＴは３’非翻訳領域を示す。 図４５はＧＧＦ２ＨＢＳ５（配列認識番号１６７）の予想アミノ酸配列（中間 部）と、核酸配列（上部）とを示す。下部（中間）配列は、ＧＧＦ−ＩＩ調製物 （図１１及び１２参照）からのペプチド配列を示す。 図４６は組替えヒト及びウシグリア成長因子のシュワン細胞分裂誘発活性を示 すグラフ。 図４７はＣＨＯ細胞のならし培地の大きさの異なる部分標本（ａｌｉｑｕｏｔ ｓ）の投与から生じたシュワン細胞増殖活性物質の投与量−反応曲線である。 図４８はＧＧＦ２ＨＢＳ５ｃＤＮＡクローンを含有するバクロウィルスによっ て感染したＳＦ９昆虫細胞によって細胞外培地中に分泌されたシュワン細胞分裂 誘発活性物質の投与量−反応曲線、 図４９はＧＧＦペプチド抗体を使用した組替えＣＨＯ細胞のならし培地のウェ スタンブロット、 図５０（Ａ）は陽イオン交換カラムから溶出した組替え（ＣＯＳ細胞が生成） ヒトＧＧＦ−ＩＩ（ｒｈＧＧＦ−ＩＩ）ピークのシュワン細胞増殖活性のグラフ であり、（Ｂ）は、ｒｈＧＧＦＩＩの特定のペプチドに対して生成されたポリク ローナル抗体を使用した組替えＧＧＦＩＩピークに対する免疫ブロットである、 図５１（Ａ）はフラクションごとの陽イオン交換カラムでのｒｈＧＧＦ−ＩＩ （ＣＨＯ細胞が生成）の精製を示すグラフ、（Ｂ）は、（Ａ）に示されたフラク ション とｒｈＧＧＦ−ＩＩ特異抗体を使用したウエスタンブロットの写真である、 図５２は組替えグリア成長因子で処理したシュワン細胞におけるチロシン燐酸 化を示すゲルの写真、 図５３はＧＧＦＨＢＳ５，ＧＧＦＨＦＢ１及びＧＧＦＢＰＰ５ポリペプチド（ 配列認識番号１７０，１７１，と１７２）の配列、 図５４は前記ＣＨＯ細胞−発現ベクターｐｃＤＨＦＲｐｏｌｙＡのマップであ る。 図５５は成熟ｈＧＧＦ２をコードするｃＤＮＡの、アミノ酸配列である（配列 認識番号１７９） 詳細な説明 この発明は、新規なグリア成長因子の分離と精製、および、これら因子をコー ドするＤＮＡ配列のクローニングとに関する。この発明の他の組成物は、一連の グリア成長因子を潜在的にコードできるいくつかの遺伝子スプライシング変異体 、特に、ＧＧＦ２ＨＢＳ５、特にウシ ＧＧＦ−ＩＩのヒト等価物をコードする変異体である。ＧＧＦ's及びｐ１８５^{er bB2} 結合タンパク質をコードする遺伝子が、長さが異なりいくつかの共通のペプ チド配列といくつかのユニークなペプチド配列とを有する一連のタンパク質を生 み出すＲＮＡ転写体であって、様々な大きさとスプライス状態の異なったＲＮＡ 転写体を生成することは明らかである。これは、ウシ後方下垂体ＲＮＡ（ここに 開示される）、ヒトの乳ガン（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）（ホルムズ（Ｈｏｌｍｅ ｓ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１２０５（１９９２））や鶏の脳のＲＮＡ（フ ォールズ（Ｆａｌｌｓ）他，Ｃｅｌｌ ７２：１〜２０（１９９３））から回収 可能なスプライシングの異なる諸配列によって証拠付けられている。又、シュワ ン細胞に対する細胞分裂誘発物質（ここに開示）として、また、前記ｐ１８５^{er bB2} レセプタ（下記参照）のためのリガンドの両方として作用する広範囲のタン パク質によっても証拠づけられている。 前記ＧＧＦとｐ１８５^erbB2をコードする遺伝子が相同であるという事実の更 なる証拠は、ヌクレオチド配列の比較から得られる。Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６（ １９９２），（１２０５〜１２１０）ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他， は、前記レセプタタンパク質ｐ１８５^erbB2に特異的に反応し、いくつかのヒト の悪性腫瘍に関連する４５−キロダルトンのヒトタンパク質（ヘレグリン−α） の精製について記載している。ヘレグリン−αをコードするいくつかの補足性Ｄ ＮＡクローンが分離された。ペレス（Ｐｅｌｅｓ）他（Ｃｅｌｌ６９：２０５（ １９９２））及びウェン（Ｗｅｎ）他（Ｃｅｌｌ ６９：５５９（１９９２）） は、”ｎｅｕ分化因子”（ＮＤＦ）と称するタンパク質をコードするラット細胞 から分離された補足性ＤＮＡについて記載している。前記ＮＤＦｃＤＮＡのトラ ンスレーション生成物は、ｐ１８５^erbB2結合活性を有する。アスディン（Ｕｓ ｄｉｎ）及びフィッシュバック，ジェイ５（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｊ．）Ｃｅｌ ｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：４９３〜５０７（１９８６）；フォールズ（Ｆａｌｌｓ ）他，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏ ｌ．５５：３９７〜４０６（１９９０）；ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）他，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７６６４〜７６６８（１９９１ ）；及びフォールズ（Ｆａｌｌｓ）他，Ｃｅｌｌ ７２：８０１〜８１５（１９ ９３）は、レセプタタンパク質ｐ１８５^erbB2と作用する４２Ｋｄのグリコプロ テインの精製されたこと、 また、いくつかの補足性ｃＤＮＡが分離されたこと（フォールズ（Ｆａｌｌｓ） 他 Ｃｅｌｌ ７２：８０１：８１５（１９９３））を示している。その他のグ ループとしては、ルプ（Ｌｕｐｕ）他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２２８７；ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）とペレス（Ｐ ｅｌｅｓ）（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３５４３；ルプ（Ｌ ｕｐｕ）他（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５５２；ドバシ（Ｄｏｂａ ｓｈｉ）他（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ． １７９：１５３６；そしてフアング（Ｈｕａｎｇ）他（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．２５７：１１５０８〜１１５１２等が含まれる。 他の実施例 本発明は、図３１のコード・セグメント（配列認識番号１３６〜１４７，１６ ０及び１６１，１７３〜１７８，４２〜４４，７７）にほぼ相同のすべてのタン パク質と、自然発生ＧＧＦポリペプチドとを含む。更に、対立遺伝子変異体、自 然突然変異体、誘発突然変異体、自然発生の核酸に対する高厳密（ｈｉｇｈ ｓ ｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件または低厳密条件下においてハイブリッド化した ＤＮＡによってコードされたタンパク質（高厳密条件および低厳密条件の定義に 関しては、ここに参照文献として提示するＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ ｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９，６．３．１−６．３．６を参照）、そし て、抗血清によってＧＧＦポリペプチドに特異的に結合したポリペプチド又はタ ンパク質も含まれる。又、この用語は、図３１からの配列を有するＧＧＦ ポリ ペプチドを含むキメラポリペプチドも含む。 以下の例は、本発明を限定するものではなく、本発明を有用に例示する目的で 提供されるものであり、有効な調製技術に関するガイダンスを提供するものであ る。 下記の例３から理解されるように、本発明の因子は、ある範囲のタイプの細胞 に細胞分裂誘発活性を示す。線維芽細胞に関する活性は、傷修復能力があること を示し、本発明は、この利用方法も含むものである。上述の調合物及び／又は薬 品、およびその製造方法に関連の本発明の一般的記載は、適当な製造物とその使 用方法を含むものであると理解されるべきである。これは、線維芽成長 因子（ＦＧＦｓ）に対する類似の活性に関する報告に鑑みて、本発明に対し合理 的に期待されるものである。例えば、スポーン（Ｓｐｏｒｎ）他，”ペプチド成 長因子とそのレセプタＩ”３９６頁（Ｂａｉｒｄ ａｎｄ Ｂｏｈｌｅｎ）の” 傷の治癒と線維組織の修復におけるＦＧＦｓ”というタイトルを付けられた章を 参照。 例１ ウシ下垂体からのＧＧＦ−ＩとＧＧＦ−ＩＩとの精製 Ｉ．因子−ＣＭフラクションの調製 ４，０００の冷凍全ウシ下垂体（約１２ｋｇ）を一晩解凍し、先ず水で簡単 に洗浄し、次に、Ｗａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒによって各々同量の０．１５Ｍ 硫酸アンモニウムでバッチ処理によりホモジナイズした。このホモジナイズ化物 を１．０ＭのＨＣｌでｐＨ４．５に調節し、４，９００ｇで８０分間遠心分離機 にかけた。上清液中のすべての脂肪分を、グラスウールを通過させることによっ て除去した。前記上清液のｐＨを１．０ＭのＮａＯＨを使用して６．５に調整し た後、固体の硫酸アンモニウムを添加して３６％の飽和溶液となるようにした。 数時間の攪拌後、その縣濁液を４，９００ｇで８０分間遠心分離機にか け、沈澱物を取り除いた。グラスウールでのフィルタ処理後、更に前記上清液に 固体硫酸アンモニウムを追加し、７５％の飽和溶液となるようにし、数時間の攪 拌後、これを再び４，９００ｇで８０分間遠心分離機にかけた。そのペットを、 約２リットルのｐＨ６．０の０．１Ｍ燐酸ナトリウム中にて再縣濁し、３×４０ Ｌの同じバッファで透析した。透析物の導電性が２０．０μジーメンス以下であ ることを確認した後、毎分２ｍｌの流量で、カルボキシメチルセルロース（ＣＭ −５２，Ｗｈａｔｍａｎ）でパックしたバイオプロセスカラム（１２０×１１３ ｍｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷した。このカラムを、先ず、２倍量のｐＨ６ ．０の０．１Ｍ燐酸ナトリウムで、次に、２倍量の５０ｍＭＮａＣｌで、そして 最後に２倍量の０．２Ｍ ＮａＣｌで、同じバッファ中にて洗浄した。最終工程 中において、１０ｍＬ（５分間）のフラクションが収集された。フラクション７ ３〜１１８までをプールし、１０倍量のｐＨ６．０の１０ｍＭ燐酸ナトリウムで ２度、透析し、１００，０００ｇで６０分間の遠心分離によって浄化した。ＩＩ．ハイドロキシルアパタイトＨＰＬＣ ハイドロキシルアパタイトＨＰＬＣは、グリア成長因子の分離において従来 使用された技術ではないが、この発明において特に有効であることが判った。 前記ＣＭ−セルロースクロマトグラフィによって得られた物質を、０．２２ μｍのフィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ）によって濾過し、室温にて、ガードカラム（ １５×２５ ｍｍ，Ｂｉｏｒａｄ）を備えた高性能ハイドロキシルアパタイトカ ラム（５０×５０ｍｍ，Ｂｉｏｒａｄ）に負荷し、ｐＨ６．０の１０ｍＭの燐酸 カリウムで平衡させた。室温での抽出を、下記のプログラムされたリニアグラジ エントを使用して毎分２ｍｌの流量で行った。 ６．０ｍＬ（３分間）フラクションを、前記グラジエント溶出中に採取した 。フラクション３９〜４５をプールし、１０分量の５０ｍＭ燐酸ナトリウムｐＨ ６．０で透析した。ＩＩＩ．モノ Ｓ ＦＰＬＣ モノ Ｓ ＦＰＬＣにより、後のゲル濾過のためにより高濃度の物質を作る ことが可能となった。 前記ハイドロキシルアパタイト・カラムからのプールされた物質のすべての 粒状成分を、調製ＨＲ１０／１０モノ Ｓ 陽イオン交換カラム（１００ｘ１０ ｍｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかける前に、１０，０００ｇでの浄化スピンによ って、６０分間で除去し、次に、これを室温下で、毎分１．０ｍｌの流量でｐＨ ６．０の５０ｍＭ燐酸ナトリウムに再平衡させた。これらの条件下において、結 合したタンパク質を、下記のプログラムされた一次グラジエントを使用して溶出 した。 １．０ｍＬ（１分間）フラクションを、このグラジエントプログラム中に採 取した。フラクション９９〜１１５までをプールした。 ＩＶ．ゲル濾過 ＦＰＬＣ この工程は、最終精製処理の前に、この発明の２つの因子の分離より始め、 濃縮フラクションを作った。 この実験の目的のため、調製スペローズ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２ ＦＰＬ Ｃ カラム（５１０×２０ｍｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、その製造会社の指示 に従って充填した。このカラムを標準化するために、製造会社の指示にしたがっ て、理論段数測定を行い、９，７００理論段数という値を得た。 モノ Ｓ 溶出物質のプールを、室温において、２．５Ｍｌの部分標本ごと に、予めＣ１８逆相カラム（Ｓｅｐ−ｐａｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通過させ た５０ｍＭ燐酸ナトリウム、０．７５ ＮａＣｌ ｐＨ６．０中で毎分１．０ｍ Ｌの流量でこのカラムに適用した。各サンプルが該カラムに適用された後、３５ 分後から１ｍＬ（０．５分間）のフラクションが採取された。各実行（ラン）か らフラクション２７〜４１（ＧＧＦ−ＩＩ）及び４２〜５７（ＧＧＦ−Ｉ）まで がプールされた。 Ｖ．逆相ＨＰＬＣ 上記スペローズの１２回のランから得られたＧＧＦ−１とＧＧＦ−ＩＩとを 、それぞれ、３つの等しい部分標本に分割した。各部分を、ガードカートリッジ （ＲＰ−８，１５ｘ３．２ｍｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によ って保護され、４０℃に平衡させた、Ｃ８逆相カラム（Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ −３００ ７μ Ｃ８ ２２０ｘ４．６ｍｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ）にて、毎分０．５ｍＬの流量で通過させた。これらの条件下において、 下記のプログラムによるリニアグラジエントを 使用してタンパク質を溶出した。 ２００μＬ（０．４分間）のフラクションを前記プログラムグラジエントの 開始後からの１５．２分間でシリコン化チューブ（Ｍｕｌｔｉｌｕｂｅチューブ 、Ｂｉｏｑｕｏｔｅ）内に採取した。ＶＩ．ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 この工程においては、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｉ ｍｉｔｅｄ，Ｗａｔｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄのタンパク質分子量標準、低レン ジ、カタログＮｏ．１６１−０３０４を使用した。実際に使用されたタンパク質 とその分子量標準は、前述の通りであった。 前記逆相プログラムのランから得たフラクション４７〜５３（ＧＧＦ−Ｉ） とフラクション６１〜６７（ＧＧＦ−ＩＩ）を、個別にプールした。このプール した物質の７μＬを、０．０１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，４％ＳＤＳ，２０％グ リセロール、及びＧＧＦ−Ｉに対しては１０％のβ−メルカプトエタノールの等 量混合液中で、５分間沸騰させ、４％のスタッキングゲルを有する１１％ポリア クリルアミドＬａｅｍｍｌｉゲル中に充填し、５０Ｖの定電圧を１６時間かけた 。このゲルを、次に、固定し、銀着色キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して着 色した。これらの条件下において、前記因子は、分子量マーカを基準として、相 対分子量が３０，０００〜３６，０００ダルトン（ＧＧＦ−Ｉ）と５５，０００ 〜６３，０００ダルトン（ＧＧＦ−ＩＩ）の、幾分拡散したバンドとして観察さ れる。前記ゲル着色から、前記逆相プログラム実行からプールされた物質におい て前記ＧＧＦ−ＩとＧＧＦ−ＩＩと同等のレベルで、他のタンパク質が存在する ことが明らかである。ＶＩＩ．トリフルオロ酢酸中における安定性 トリフルオロ酢酸存在下における、この発明の因子 の安定性に関して得られたデータは以下の通りである。 ＧＧＦ−Ｉ： ０．１％ＴＦＡとアセトニトリルの存在下において、前記逆 相ＨＰＬＣから得た物質を、カラムランの完了後１２時間以内と、その４０℃で の１０週間の培養後とにおいて分析した。培養後、ＧＧＦ−Ｉは、カラム流出後 、直接にとって分析した物質の活性の少なくとも５０％を保持していた。 ＧＧＦ−ＩＩ： ０．１％ＴＦＡとアセトニトリルの存在下において、前記 逆相ＨＰＬＣから得て、−２０℃にて保存しておいて物質を、解凍後と、４０℃ で４日間の培養後とにおいて分析した。培養後、ＧＧＦ−ＩＩは、解凍直後の物 質の活性の少なくとも５０％を保持していた。 尚、上記研究において使用されたトリフルオロ酢酸濃度は、逆相クロマトグ ラフィにおいて最も一般的に使用されるものである。ＶＩＩＩ．活性分析条件(Activity Assay Conditions) 特に明記の無い限り、すべての作業は３７℃で行っ た。そして図１〜６に示されるように、各工程での活性は、下記の変更以外には 、ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，上述）の技術を使用し て測定された。従って、シュワン細胞の調製において、５μＭのフォルスコリン （ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）を、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅ ｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）、ＦＣＳ及びＧＧＦ以外に添加した。分析 に使用した細胞は、パッセージ番号（ｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ）が１０以 内の無線維芽細胞シュワン細胞であり、これらの細胞は、トリプシンとともにフ ラスコから除去され、１ミクロ・ウェル当り３．３ 千細胞の割合で平底９６− ウェル・プレートにプレート化した。 ［¹²⁵Ｉ］ＩＵｄＲを、テスト溶液の添加後の最後の２４時間後に添加した 。バックグラウンド（非刺激）の各分析に対する関与は、１００ｃｐｍ以下であ り、最大の組込みは、シュワン細胞のバッチとパッセージ番号（ｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ）とに応じて、２０〜２００倍（ｆｏｌｄ）であった。 上述の逆相ＨＰＬＣから得られるＧＧＦ−Ｉ及び ＧＧＦ−ＩＩフラクションの場合、各因子に対する一本の曲線について、全く同 じ前述の方法を使用して、２本の投与量−反応曲線が得られた。そして、この分 析実験において上記方法は、各因子についての他の曲線を得るために、胎児子ウ シプラズマを胎児子ウシ血清に代えた点のみ変更された。その結果は図７及び８ に示されている。 例２ 精製ＧＧＦ−ＩとＧＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列 高度に精製したウシ下垂体ＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩを使用してアミノ酸配 列分析研究を行った。これらの配列の記載には従来式の単一文字コードを使用し た。ペプチドは、還元されそしてカルボキシメチル化されたサンプルについて、 リシルエンドペプチダーゼとプロテアーゼＶ８による消化物として得られた。特 に前記ＧＧＦ−ＩＩのリシルエンドペプチダーゼの消化は、１１％ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ（前記マーカに対するＭＷ）の５５−６５ＲＤ領域において行った。 ＧＧＦ−Ｉに関して全部で２１のペプチド配列（図９、 配列認識番号１〜２０，１６９参照）が得られ、その内の１２のペプチド（図１ ０、配列認識番号１，２２〜２９，１７，１９及び３２）は現在のタンパク質デ ータベースには存在しないものであり、従って、新規な配列である。ＧＧＦ−Ｉ Ｉに関して全部で１２のペプチド配列（図１１、配列認識番号３３〜３９，５１ ，５２，１６４〜１６６参照）が得られ、その内の１０のペプチド（図１２、配 列認識番号４５〜５３）は現在のタンパク質データベースには存在しないもので あり、従って、新規な配列である（例外は、ペプチドＧＧＦ−ＩＩ ０６であり 、これは多くのタンパク質においても同じ配列を示しているが、これらはその残 基の数が小さいことから恐らく重要ではない）。これらの新規な配列が、ＧＧＦ −ＩとＩＩの真のアミノ酸配列の部分に対応するものである可能性は極めて高い 。 特に注目されるのはＧＧＦ−Ｉ ０７とＧＧＦ−ＩＩ１２とであって、これら は明らかに互いに密接に関連している。その類似性は、これらのペプチドの配列 がほぼ確実に指定されたＧＧＦ類のそれであることと、汚染タンパク質由来であ る可能性が非常に低いこととを示すものである。 更に、ペプチドＧＧＦ−ＩＩ ０２において、配列Ｘ Ｓ Ｓは、Ｘによって 示す位置におけるアスパラギンのＮ−結合の炭水化物モエティ（ｍｏｉｅｔｙ） の存在と一致している。 一般に、図９及び１１において、Ｘは、サイクル中に同じ大きさの信号が１つ 以上存在したか、あるいは、全く信号が無かったことによって１つの位置も確実 に呼び出すことができなかったシーケンスサイクルを表す未知の残基を示してい る。星印は、最後に呼び出したアミノ酸が、そのペプチドに存在する最後のアミ ノ酸に対応するペプチドを示す。その他のタンパク質において、最後に呼び出し たアミノ酸の後の信号強度では、そのペプチドの末端まで呼び出しを継続するの には不十分であった。右側のカラムは、ＮＢＲＦとＥＭＢＬ配列データベースを 分析するためにＧＣＧパッケージＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡプログラムを使用 して行ったコンピュータデータベースサーチの結果を示している。このカラムの タンパク質の名称は、その配列の一部の一致を示し、呼び出されたペプチドアミ ノ酸配列は最大２つのミスマッチを許容するものであった。疑問符（？）は、許 容された３つのミスマッチを示している。使用された略記は以 下の通りである。 ＨＭＧ−１ 高移動性グループタンパク質−１ ＨＭＧ−２ 高移動性グループタンパク質−２ ＬＨ−アルファ 黄体形成ホルモンアルファサブユニット ＬＨ−ベータ 黄体形成ホルモンベータサブユニット 例３ 精製ＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩの細胞分裂誘発活性 ＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩとの両方を含有する高度に精製したサンプルの細胞 分裂誘発活性の研究を、定量方法により行った。この方法は、単一のミクロ培養 による、ＤＮＡ合成、細胞組織形態、細胞数、細胞アンチゲンの発現の評価を可 能にするものである。この技術は、以前にミュール（Ｍｕｉｒ）他，Ａｎａｌｙ ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８５，３７７〜３８２，１９９０に よって報告された方法を変更したものである。主な変更点は、１）非被覆ミクロ タイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートの使用、２）一ウェル当りの細胞数 、３）１０％胎児子ウシ血清（ＦＣＳ）に代えての５％の胎児ウシプラズマ（Ｆ ＢＰ）の使用、 そして４）培養に同時に添加された細胞分裂誘発物質と臭化デオキシウリジン（ ＢｒｄＵ）の存在下における培養時間、である。更に、細胞の損失を避けるため に、前記細胞の単層は、固定前において洗浄しなかった。そして、モノクローナ ル・マウス 抗−ＢｒｄＵ抗体とペロキシダーゼ接合ヤギ 抗−マウス免疫グロ ブリン（ＩｇＧ）抗体とを、分析の感度を高めるために、２倍にした。ラットの 座骨神経シュワン細胞ように最適化した分析も、前記細胞培養条件に対して適当 な変更を施した後に、いくつかの細胞系に使用した。Ｉ．細胞分裂誘発テスト 第１日目に、精製したシュワン細胞を、５％ＥＢＰ／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（５，０００細胞 ／ウェル）中で、非被覆の９６ウェルのプレートにプレート化した。第２日目に 、ＧＧＦ又はその他のテスト因子を、１０ｐｍの最終濃度のＢｒｄＵとともに、 前記培養物に添加した。４８時間後（第４日目）、ＢｒｄＵ組み込みを、前記培 地を吸引することによって終わらせ、室温で２０分間、７０％エタノールを２０ ０μｌ／ウェル添加し、細胞を固定した。次に、これらの細胞を、 水及び３７℃で１０分間、１００μｌの２Ｎ ＨＣｌでの培養によって変質させ たＤＮＡで洗浄した。吸引後、残りの酸を、前記ウェルを０．１Ｍホウ酸塩バッ ファｐＨ９．０で満たすことによって中和し、細胞を燐酸バッファ塩水（ＰＢＳ ）で洗浄した。次に、細胞を、５０μｌのブロッキングバッファ（０．１％のト リトンＸ１００と２％の正常ヤギ血清とを含有するＰＢＳ）で３７℃にて１５分 間処理した。吸引後、モノクローナル・マウス 抗−ＢｒｄＵ抗体（ダコ・コー ポレイション（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．），カリフォルニア州，サンタ・バーバラ ）（５０μｌ／ウェル，ブロッキングバッファ中で１．４μｇ／ｍｌに希釈）を 添加し、３７℃で２時間培養した。非結合抗体を、０．１％トリトンＸ−１００ を含有のＰＢＳ中において３回の洗浄して除去し、ペロキシダーゼ−結合ヤギ・ 抗−マウスＩｇＧ抗体（ダコ・コーポレイション（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．），カ リフォルニア州，サンタ・バーバラ）（５０μｌ／ウェル，ブロッキングバッフ ァ中で２μｇ／ｍｌに希釈）を添加し、３７℃で１時間培養した。ＰＢＳ／トリ トンでの３回の洗浄と、ＰＢＳ中での最終すすぎ後、ウェルは、０．０５％の溶 解性クロモゲンＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ） と、０．０２％のＨ₂Ｏ₂とを含有する１００μｌ／ウェルの５０ｍＭのｐＨ５． ０燐酸／クエン酸塩バッファを受けた。室温で５〜２０分後、各ウェルから８０ μｌを、２Ｎ硫酸を４０μｌ／ウェル含有するクリーンなプレートにピペットで 移すことによって、前記反応をに終結させた。４９０ｎｍにおける吸光はプレー トリーダ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｓ）を使用して記録した。前記細胞単層を 含有する分析プレートを、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの基質ジア ミノベンジジン（ＤＡＢ）を加えてＢｒＤＵ−ＤＮＡについて免疫細胞化学的に 染色し、０．０２％のＨ₂Ｏ₂とを添加することによって溶解不能生成物とした。 １０〜２０分後、前記染色反応を、水で洗浄することによって終結させ、倒立型 顕微鏡（ｉｎｖｅｒｓｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用してＢｒｄＵ−ポジ ティブ細胞核を観察計数した。場合により、ネガティブ核を０．００１％のトル イジンブルーで対比染色し、上述と同じように計数した。ＩＩ．細胞分裂誘発分析に使用した細胞系 Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３ 線維芽細胞：Ｆｌｏｗ Ｌａｂｓからの細胞を、１０ ％ＣＯ₂の空気中で、加湿雰囲気 下、３７℃で、１０％のＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを補足したＤ ＭＥＭ中に保持した。細胞を、２日毎に供給又は二次培養した。細胞分裂誘発分 析のために、細胞を、完全培地にて５，０００細胞／ウェルの濃度でプレート化 し、細胞が融合性を得て、鎮静状態になるまで１週間培養した。血清を含有する 培地を除去し、細胞単層を、無血清培地で２回洗浄した。細胞分裂誘発物質を含 有する１００μｌの無血清培地と、１０μＭのＢｒｄＵとを各ウェルに添加し、 ４８時間培養した。ＧＧＦと血清又はＰＤＧＦ（ホジティブコントロールとして ）に対する投与量反応を行った。 ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）２１ Ｃ１３線維芽細胞：Ｅｕｒｏｐｅａ ｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＥＣＡＣＣ）からの細胞を、５％ＣＯ₂空気中、加湿雰囲気下、３７℃で、５ ％のＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを補足したＧｌａｓｇｏｗ Ｍｏ ｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）中で保持した。細胞を、 ２〜３日毎に供給又は二次培養した。細胞分裂誘発分析のために、細胞を、完全 培 地にて、２，０００細胞／ウェルの濃度で、２４時間プレート化した。血清を含 有する培地を除去し、無血清培地で２回洗浄した後、１００μｌの、０．１％の ＦＣＳを含有するＧＭＥＭあるいはＧＭＥＭのみで、置換した。ホジティブコン トロールとしてＧＧＦとＦＣＳ又はｂＦＧＦとを、１０μＭのＢｒｄＵとともに 、添加し、４８時間培養した。次に、細胞培養のシュワン細胞を、前述の方法で 処理した。 Ｃ６ ラット グリオーム細胞系：パッセージ３９から得た細胞を、１０％ ＣＯ₂空気中、加湿雰囲気下、３７℃で、５％のＦＣＳ、ウマ血清（ＨＳ）、ペ ニシリン、ストレプトマイシンを含有したＤＭＥＭ中で保持した。細胞を、３日 毎に供給又は二次培養した。細胞分裂誘発分析のために、細胞を、完全培地にて ２，０００細胞／ウェルの濃度でプレート化し、２４時間培養した。次に、培地 を、無血清培地中にて洗浄した後、ＤＭＥＭと０．１％のＦＣＳを含有するＦ１ ２の１：１の混合物にて置換した。次に、ＧＧＦ，ＦＣＳ及びαＦＧＦに対する 投与量反応を行い、細胞を、他のタイプの細胞に関して前述した方法でＥＬＩＳ Ａを通じて処理した。 ＰＣ１２（Ｒａｔ Ａｄｒｅｎａｌ Ｐｈｅｏ−ｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ 細胞）：ＥＣＡＣＣからの細胞を、５％ＣＯ₂空気中、加湿雰囲気下で３７℃ でコラーゲン被覆フラスコ内にて、１０％のＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマ イシンを補足したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。細胞を、３日毎に培地の８０ ％を置換することによって、供給した。細胞分裂誘発分析のために、細胞を、完 全培地にて３，０００細胞／ウェルの濃度でコラーゲン被覆プレート（５０μｌ ／ウェル コラーゲン、ヴィトロゲン・コラーゲン・コーポレイション（Ｖｉｔ ｒｏｇｅｎ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、１：５０に希釈、３７℃で３０ 分間）にプレート化し、２４時間培養した。次に、前記培地を、新たなＲＰＭＩ のみか、あるいは、１ｍＭのインシュリンを含有したもの、あるいは、１％のＦ ＣＳによって置換した。ポジィティブコントロールとしてのＦＣＳ／ＨＳ（１： ２）及びＧＧＦとに対する投与量反応を前述のように行った。４８時間後、細胞 を固定して、ＥＬＩＳＡを前述したように行った。ＩＩＩ．細胞分裂誘発分析の結果： この例におけるすべての実験は、セファローズ１２クロマトグラフィ精製工 程（例１のセクションＤ参照）からの、ＧＧＦ−１とＧＧＦ−ＩＩ（ＧＧＦｓ） との混合物を含有する高度に精製したサンプルを使用して行った。 先ず、ＢｒｄＵ組み込み分析によって得られた結果を、ジェイ・ピー・ブロ ックス（Ｊ．Ｐ．Ｂｒｏｃｋｅｓ）著（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４ ７：２１７，１９８７）に記載の、分裂細胞のＤＮＡへの［１２５］Ｉ−ＵｄＲ 組み込みに基づくシュワン細胞の古典的な細胞分裂誘発分析と比較した。 図１３は、同じ細胞培養条件（５，０００細胞／ウェル ５％ＦＢＰ／ＤＭ ＥＭ中、ＧＧＦｓ又の存在下で４８時間培養）で行われた２つの分析によって得 られた結果を比較して示したものである。同図に明らかに示されているように、 これらの結果は比較可能であるが、ＢｒｄＵ組み込み分析の方が、グラフにおい て曲線が左側、即ち、ＧＧＦＳの低い濃度の方へシフトしていることに示される ように、僅かに感度が高い。 ”細胞分裂誘発テスト方法”と題された章に記載されているように、免疫反 応性ＢｒｄＵ−ＤＮＡを、前記ＯＰＤペロキシダーゼ反応の溶解生成物強度を読 み取ることによって定量化した後、細胞単層を含有する元の分析プレートを、第 ２の反応をさせて、非溶解性ＤＡＢ生成物を得ることができ、これはＢｒｄＵポ ジティブ細胞核を染色する。次に、前記マイクロ培養を、倒立型顕微鏡で調べ、 細胞の形態と、ＢｒｄＵ−ポジティブ及びネガティブ細胞核の数を観察すること ができる。 図１４ａ及び図１４ｂにおいて、４９０ｎｍでの吸収の読み取りによって評 価されたＢｒｄＵ−ＤＮＡの免疫活性が、同じ培養内における、ＢｒｄＵ−ポジ ティブ細胞核の数と、ウェル当りのＢｒｄＵ−ポジティブ細胞核の百分率と比較 されている。標準偏差は、１０％以内であった。２つの評価方法は、ＧＧＦｓの 最大投与量における値の間の非常に良好な相関関係と不一致とが、ＢｒｄＵ−ポ ジティブとして検出された細胞におけるＤＮＡ合成の程度の違いによって説明可 能であることを示している。 従って、ＢｒｄＵ組み込み分析は、前記（１２５）Ｉ−ＵｄＲ組み込み分析 との比較した場合、シュワン細胞に対するポリペプチドの生物学的活性について の別の有用な情報を提供するものである。例えば、図１５に報告されるデータは 、ＧＧＦｓがシュワン細胞に作用して、ＤＮＡ合成を誘発することができるが、 より少ない投与量においては、４８時間後においてマイクロ培養中に存在するネ ガティブ細胞の数を増やすことを示している。 次に、前記分析を、起源の異なるいくつかの細胞系に使用した。図１６にお いて、ＧＧＦｓに対する、シュワン細胞とＳｗｉｓｓ線維芽細胞との細胞分裂誘 発反応が比較されており、３Ｔ３線維芽細胞においては弱い反応しか得られなか ったにも拘らず、これらの培養中においていくつかのはっきりとしたＢｒｄＵ− ポジティブ細胞核が検出された。コントロール培養を、ＦＣＳ又はヒト組替えＰ ＤＧＦの複数の投与量の存在下において平行に実行したところ、これら細胞が適 当な刺激に対して反応可能であることが判った（図示せず）。 線維芽細胞のＧＧＦｓに対する反応性を、更に、ＢＨＫ ２１ Ｃ１３細胞 系を使用して調べた。これらの腎臓から得た線維芽細胞は、接触阻止反応を示さ ず、あるいは、融合性状態の場合に鎮静状態には到らない。従って、細胞の生存 力を損なわない範囲で、バックグラウンドの増殖が非常に低くなるように実験条 件を調節した。ＧＧＦｓは、図１７及び１８に示すように、ＢＨＫ２１Ｃ１３細 胞において非常に顕著な細胞分裂誘発活性を有する。図１７は、０．１％のＦＣ Ｓの存在下においてＧＧＦＳによって刺激されたＢＨＫ２１ Ｃ１３細胞による 、ＢｒｄＵのＤＮＡへの組み込みを示している。ＦＣＳに対する良好な応答は、 細胞培養条件が限定的でなかったことを示している。図１８において、ＧＧＦｓ の細胞分裂誘発効果が、１ウェル当りに計測されたＢｒｄＵ−ポジティブ及びＢ ｒｄＵ−ネガティブ細胞の数として表されている。データは、全く同一条件で実 行された２つの実験を示すものであり、少なくとも１つのウェル毎に３つのフィ ールドが数えられた。シュワン細胞の観察において、低投与量における増殖性効 果に加えて、ＧＧＦｓは、非反応性細胞の生存数も増加させる。ＢｒｄＵ−ポジ ティブ細胞の率は、前記培養に添加されたＧＧＦｓの 増加量に比例する。高投与量のＧＧＦｓの存在下における４８時間後の細胞の総 数は、少なくとも２倍に増加し、これはＧＧＦｓがＢＨＫ２１ Ｃ１３細胞にお けるＤＮＡ合成と増殖とを誘発することを確証するものである。同じ条件下にお いて、２％のＦＣＳの存在下において４８時間維持した細胞は、約６倍の増加を 示した（図示せず）。 Ｃ６グリオーム細胞は、グリア細胞の特性の研究のための有用なモデルを提 供した。発現した表現型は、細胞パッセージに依存し、細胞は、初期段階におい ては星状膠細胞表現型に類似し、後期段階（パッセージ７０以降）においては乏 突起膠細胞表現型に類似するようである。これらの実験において使用されたＣ６ 細胞は、パッセージ３９からパッセージ５２からのものであった。Ｃ６細胞はき わめて増殖性の高い個体群であるので、ＢｒｄＵ組み込みのバックグランドを非 常に低くするように実験条件を最適化した。ＦＣＳに対する投与量反応に示され るように、細胞分裂誘発反応に大きく影響することなく細胞の生存力を維持する のに、０．１％の血清の存在が必要であった（図１９）。 図２０において、ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞成長因子）とＧＧＦｓとに対す る細胞分裂誘発反応が、ＦＣＳ（８％）の存在下において得られた最大のＢｒｄ Ｕ組み込みの百分率として表されている。値は、全く同一の条件で実行された二 つの実験の平均値である。ＧＧＦの効果は、ａＦＧＦの純粋調合物の効果と等価 である。Ｃ６細胞の独特の成長因子としてａＦＧＦが既に記載されており（リム ・アール（Ｌｉｍ Ｒ）他，１：７４１〜７４６，１９９０）、その理由で、こ れはポジティブコントロールとして使用された。ＢｒｄＵポジティブ及びネガテ ィブ細胞を直接に数えることは、マイクロ培養の細胞濃度が高かったために不可 能であった。これまでに報告された細胞系とは対照的に、ＰＣ１２細胞は、この ＰＣ１２が血清に対して反応可能な培養条件下（細胞の維持において通常に使用 されるＦＣＳとＨＳとの混合物）において処理された場合ＧＧＦ２に対してはっ きりとした反応を示さない。しかしながら、各ウェル毎のプレート化された細胞 の数は、ＰＣ１２細胞の挙動に影響するようである。従って、更に実験が必要で ある。 例４ ＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩペプチドを含有するタンパ ク質をコードするヌクレオチド配列の分離とクローン化 ＧＧＦ−ＩＩヌクレオチド配列の分離とクローン化とを、ペプチド配列情報と ライブラリスクリーニングとを使用した結果を外観し、そして以下に記載の方法 によって実際に行った。尚、図４及び５のペプチドは、下記の技術にしたがって ＧＧＦ−Ｉ配列を分離およびクローン化する出発点として利用することができる ことは評価されるであろう。即ち、図２１（配列認識番号５４〜８８）は、この 目的のために利用可能な退化オリゴヌクレオチドプローブを示し、図２３（配列 認識番号９０〜１１９）は、利用可能なＰＣＲプライマをリストアップしている 。ＤＮＡ配列とポリペプチド配列とは、ＧＧＦ−ＩＩと同様にこの手段によって 入手されるべきであり、更に、このようなＤＮＡ配列を組み込んだＤＮＡコンス トラクトと発現ベクター、このようなコンストラクト／ベクターを組み込むこと によって遺伝子的に変成されたホスト細胞、また、このようなホスト細胞を培養 することによって得られるタンパク質も同じである。本発明は、更に、これらの 物質をも含む。Ｉ．オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマの構成と分析 前記アミノ酸配列（精製ＧＧＦタンパク質からのペプチド由来のもの）をヌ クレオチド配列に逆転写（ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ）することによって退化 ＤＮＡオリゴマプローブを構成した。オリゴマは、前記ＤＮＡ配列のコード・ス トランド又は非コード・ストランドを表した。オリゴマ構成にセリン、アルギニ ン又はロイシンが含まれていた場合には、曖昧さをなくすために２つの別の合成 物を作った。例えば、セリンは、５３７及び５３８又は６０９及び６１０のＴＣ Ｎ又はＡＧＹのいずれかによってコードされた。アルギニン又はロイシン（例え ば、５４４，５４５）について類似のコドン分割を行った。ＤＮＡオリゴマを、 ０．２マイクロモルスケールでのβ−シアノエチル化学反応を使用してＢｉｏｓ ｅａｒｃｈ８７５０４−カラムＤＮＡシンセサイザーで合成した。オリゴマを、 前記カラム（５００オングストロームＣｐＧ樹脂）から切り離し、濃い水酸化ア ンモニウム中において５５〜６０℃で６〜２４時間保護解除（ｄｅ−ｐｒｏｔｅ ｃｔｅｄ）した。これら保護解除オリゴマを真空下で乾燥させ（Ｓｐｅｅｄｖａ ｃ）、７Ｍの尿 素を含有する、１５％アクリルアミド（２０モノ：１ビス）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ほう酸−ＥＤＴＡバッファのゲル中での電気泳動によって精製した。ＵＶ シ ャドウイング（ｓｈａｄｏｗｉｎｇ）によって、前記ゲル中に全長オリゴマが検 出され、次に、前記バンドを摘出し、ＤＮＡオリゴマを４〜１６時間のシェイキ ングによって、１．５ ｍｌｓ Ｈ２０に溶出した。この溶出液を乾燥し、０． １ｍｌ Ｈ₂Ｏ中に再溶解し、光吸収測定を２６０ｎｍで行った。 濃度は、次の式に基づいて測定した。 （Ａ ２６０ × 単位／ｍｌ）（６０．６／長さ＝ｘμＭ） すべてのオリゴマを、Ｈ₂Ｏの添加によって、５０μＭの濃度に調節した。 上記構成の退化プローブが、図２１，配列認識番号５４〜８８に示されてい る。 下記の変更を加えたうえでプローブに対して使用し たものと実質的に同じ手順によってＰＣＲプライマを作った。１３のヌクレオチ ド含有制限サイトのリンカーが、ベクターへのクローン化用の前記退化オリゴマ の５’末端に含まれていた。ＤＮＡ合成を、１，０００オングストロームＣｐＧ 樹脂を使用した１マイクロモルスケールで行い、すべての４つのヌクレオチドが 退化プローブに正常に取り込まれた位置においてはイノシンを使用した。ＰＣＲ プライマの精製は、前記ゲル電気泳動精製後にエタノール沈澱することを含むも のであった。ＩＩ．ライブラリ構築及びスクリーニング ウシゲノムＤＮＡライブラリを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｃａｔａｌｏｇｕ ｅ Ｎｕｍｂｅｒ：９４５７０１）から購入した。このライブラリは、ベクター ラムダダッシュＩＩにクローン化された、２ｘ１０⁶の１５〜２０ｋｂ Ｓａ ｕ３Ａｌ 部分ウシＤＮＡ２フラグメントを含有していた。ウシの全脳ＣＤＮＡ ライブラリを、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｎｕｍｂｅｒ：ＢＬ １０１３９）から購入した。全脳と、ウシ下垂体と、ウシ後部下垂体とから、調 製したｍＲＮＡから補足性ＤＮＡライブラリを構成した （Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ； Ｓｔｒａｇｅｎｅ）。Ｖｉｔｒｏｇｅｎは２つの ｃＤＮＡライブラリからなる：１つのライブラリは、ベクター ラムダ ｇ１０ であり、他方はベクター ｐｃＤＮＡＩである（プラスミドライブラリ）。前記 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅライブラリは、ベクターラムダ ユニザップ（ｕｎｉｚａ ｐ）よりなる。全体として、前記ｃＤＮＡライブラリは、１，４００万の一次組 替えファージを含有していた。 前記ウシゲノムライブラリを、各プレートにつき、１５０，０００〜２００ ，０００のファージプレークで、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ホスト株ＬＥ３９２で２ ３ｘ２３ｃｍのプレート（Ｎｕｎｃ）にプレート化した。各プレートは、約１つ のウシゲノム等価物を表した。３７℃での一晩の培養後、前記プレートを冷却し て、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他（１：６０〜８１）の手法に従って、 複製フィルタを作った。４つのプレークリフトを、各プレートから非チャージナ イロン膜に作った（Ｐａｌｌ Ｂｉｏｄｙｎｅ Ａ又はＭＳＩ Ｎｉｔｒｏｐｕ ｒｅ）。前記ＤＮＡを、紫外線下で５分間のクロスリンキングによって、又は、 ８０℃の真空下において２時間のベーキングで、前記 膜上に固定した。ＤＮＡプローブを、製造会社の指示に従って、ガンマ３２Ｐ ＡＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；６５００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ ）とともにＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ ｌａｂｓ）を使用して標識化した。簡単に説明すると、５０ｐｍｏｌｓの退化Ｄ ＮＡオリゴマを、３７℃で３０分間、６００μＣｉ ガンマ³²Ｐ−ＡＴＰと５単 位のＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼの存在下において培養した。反応を終結さ せ、ゲル電気泳動負荷バッファを添加し、次に、放射能標識化プローブを、電気 泳動によって精製した。３２Ｐ標識化プローブを、ゲルスライスから摘出し、水 に溶出した。別の方法として、ＤＮＡプローブを、ショウォルター（Ｓｃｈｏｗ ａｌｔｅｒ）及びソマー（Ｓｏｍｍｅｒ），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｅｍ １７７： ９０〜９４（１９８９）の実験記録にしたがって、α−３２Ｐ−ｄＡ５ ＴＰ又 はα−３２Ｐ ｄＣＴＰを組み込むことにより、ＰＣＲ増幅で標識化した。ＰＣ Ｒ反応において標識化したプローブを、セファーデックス Ｇ−１５０カラムで の脱塩によって精製した。 プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションを、ＧＭＣバッファ （０．５２ Ｍ ＮａＰｉ，７％ ＳＤＳ，１％ ＢＳＡ，１．５ｍＭ ＥＤＴ Ａ，０．１Ｍ ＮａＣｌ １０ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ）中で行った。洗浄は、オ リゴウォシュ（１６０ｍｌ １Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄，２００ｍｌ ２０％ ＳＤＳ ，８．０ｍｌ ０．５ Ｍ ＥＤＴＡ，１００ｍｌ ５Ｍ ＮａＣｌ，３６３２ ｍｌ Ｈ₂Ｏ）。通常は、１０のウシゲノム等価物の複写コピーを表す２０の フィルタ（それぞれ４００平方センチ）を、１００ｐｍｏｌｓの退化オリゴヌク レオチドプローブ（１２８〜５１２倍の退化）とともに２００ｍｌのハイブリッ ド化溶液中において培養した。ハイブリッド化は、前記退化プローブに対し算出 された最低溶融温度以下の５℃で、一晩、進行させるようにした。尚、最低溶融 温度の計算においては、ＡＴペアに対して２℃、ＧＣペアに対して４℃と仮定し た。 フィルタを、そのハイブリダイゼーション温度において、オリゴウォシュを 繰り返し交換して、４〜５時間にわたり洗浄し、最後に、ＤＮＡプローブの長さ に依存した温度において３０分間、３．２Ｍ テトラメ チルアンモニウムクロライド、１％ＳＤＳで２度洗浄した。２０量体の場合、最 終洗浄温度は６０℃であった。フィルタを取り付け、次に、強化スクリーン（デ ュポン社、Ｃｒｏｎｅｘ Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ）を使用してＸ線フ ィルム（コダック社ＸＡＲ５）に露光した。通常は、−８０℃において３〜５日 間の露光で、これらのライブラリスクリーン中の複製信号を検出するのに十分で あった。その結果の分析後、フィルタを取り外して、再プローブすることができ た。フィルタの取り外しは、１０ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８を含有する１％ＳＤＳの 溶液中で、フルパワー状態のマイクロウェーブオーブンで１５分間のサイクルを ２回行って培養することによって行われた。フィルタは、最低３〜４回のサイク ルを通じて取られ、様々なプローブで再プローブした。ＩＩＩ．組替えファージの分離、成長及びＤＮＡ調製 これらの手法は、組替えＤＮＡ（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他２： ６０−２：８１）に記載の標準実験記録に基づいて行われた。ＩＶ．ＤＮＡ消化とサザンブロットとを使用した分離クローンの分析 組替えファージＤＮＡサンプル（２マイクログラム）を、制限エンドヌクレ アーゼ製造会社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって推奨され た条件にしたがって消化した。３７℃に於ける４時間の培養後、反応生成物を、 ０．１Ｍ 酢酸ナトリウムと３倍量のエタノールとの存在下において沈澱させた 。沈澱ＤＮＡを、遠心分離によって採取し、７５％のエタノールですすぎ、乾燥 させた。すべての再懸濁サンプルを、アガロースゲル（通常、ＴＡＥバッファに おいて１％ ０．０４Ｍ Ｔｒｉｓアセテート、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ）にか けた。ゲルのランは、１センチメートル当り１ボルトで４〜２０時間行った。マ ーカーには、ラムダＨｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメント及び／又はΦＸ１７ ４ＨａｅＩＩＩ ＤＮＡフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ ｓ）が含まれていた。前記ゲルを、０．５マイクログラム／ｍｌの臭化エチディ ウムによって染色し、撮影した。サザンブロッティングのために、ＤＮＡを、先 ず０．１２５ Ｎ ＨＣｌでの処理によって、前記ゲル中にて脱プリンし、０． ５Ｎ ＮａＯＨで変成し、そ して２０ｘＳＳＣ（３Ｍ 塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）で 非チャージナイロン膜に移した。ブロッティングを、６時間から２４時間かけて 行い、次に、フィルタを、０．５Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５，０．１５Ｍ塩 化ナトリウム中で中和し、次に、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ほう酸 ＥＤＴＡ中で簡 単にすすいだ。 架橋するのために、前記フィルタを、先ず、透明プラスチックラップに包み 、次に、ＤＮＡ側を紫外線に５分間露光した。ハイブリッド化と洗浄を、ライブ ラリスクリーニングに関して説明したように行った（この実施例の第２節参照） 。類似の遺伝子が他の種に存在するか否かを調べるたハイブリッド分析において 、僅かな変成を行った。前記ＤＮＡフィルタは、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｃａｔａ ｌｏｇｕｅ Ｎｕｍｂｅｒ７７５３−１）から購入したもので、各レーン当り様 々な種に関しての５マイクログラムのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを含有している。前 記プローブを、前記セクション２に記載の方法で、ＰＣＲ増幅反応によって標識 化し、ハイブリッド化を、硫酸デキストランを１０％を含有する８０％バッファ Ｂ（２ｇのポリビニルピロ ロリジン、２ｇのＦｉｃｏＩＩ−４００、２ｇのウシ血清アルブミン、５０ｍｌ １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５８ｇ ＮａＣｌ，１ｇピロ燐酸ナト リウム、１０ｇのドデシル硫酸ナトリウム、９５０ｍｌの水）中で行った。前記 プローブを、１０分間の沸騰で変成させ、次に、氷水中にて急冷させた。このプ ローブを、ミリリットル当り１０⁶ｄｐｍ³²Ｐ で前記ハイブリッド化バッファ に添加し、６０℃で一晩培養した。前記フィルタを６０℃にて、先ずバッファＢ 中で、次に２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、その後、１ｘ ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳで洗浄した。厳密度を高くするために、実験、最終洗浄は、０．１ｘ Ｓ ＳＣ、１％ＳＤＳで、温度を６５℃に上げて行った。 前記ゲノムクローンの制限マップを作り、どのサブフラグメントが前記ＧＧ Ｆプローブ（サブクローニングの候補）にハイブリッドしたかを示すため、サザ ンブロットを使用した。Ｖ．ＤＮＡ相同体のセグメントのハイブリッド化プローブへのサブクローニング ＤＮＡ消化物（例えば、５マイクログラム）を、１％ のアガロースゲルに投入し、次に、適当なフラグメントを染色後、ゲルから摘出 した。前記ＤＮＡを、ガラスビーズへの吸着によって精製し、その後、製造会社 （Ｂｉｏ １０１）によって記載された実験記録を使用して溶出した。回収した ＤＮＡフラグメント（１００〜２００ｎｇ）を、Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、例えば、ｐＵＣ１８の派生物であるｐ Ｔ３Ｔ７（Ａｍｂｉｏｎ）等のリニア化された脱燐酸化ベクター中に結合した。 このベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ．βラクタマーゼ遺伝子を有しているので、形質 転換物質を、アンピシリンを含むプレート上で選別することが可能である。前記 ベクターは、更に、ホスト細胞へβ−ガラクトシダーゼ相補性を与えるので、非 −組替え（ブルー）を、イソプロピルチオガラクトシドとブルオーグ（Ｂｌｕｏ ｇ）他（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）とを使用して検出す ることができる。前記結合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物の一部を、使用して、Ｅ ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＸＬ１ブルー競合細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃａｔａ ｌｏｇｕｅ Ｎｕｍｂｅｒ：２００２３６）を形質転換し、次に、これらの形質 転換物質をアンピシリン１ｍｌ当り５０ マイクログラムを含有するＬＢプレート上にて選別した。ホワイトコロニーを選 別し、プラスミドミニプレップをＤＮＡ消化及びＤＮＡ配列分析のために調製し た。選別したクローンを、それらの挿入ＤＮＡが前記ＧＧＦプローブとハイブリ ッド化したか否かを確認するために再テストした。ＶＩ．ＤＮＡ配列決定 ２重ストランドプラスミドＤＮＡテンプレートを、標準実験記録に従って、 ５ｍｌの培養から調製した。製造業者の実験記録に従い、シーケナーゼ２．０と ジデオキシヌクレオチド配列キット（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）とを使用 したジデオキシチエーン終結法によって、配列決定を行った（サンガー（Ｓａｎ ｇｅｒ）他ＰＮＡＳ；ＵＳＡ ７４：５４６３（１９７７）の変形）。あるいは 、配列決定を、サイクル配列決定キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ ｂｓ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使 用した熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ｍｏｄｅｌ ４８００）中に おいて行い、５’−末端標識化プライマを使用した製造業者の指示にしたがって 行った。配列プライマ は、前記配列決定キットで供給されたものか、あるいは、前記クローンから決め られた配列によって合成されたものであった。配列決定用反応物を、６％ポリア クリルアミドの０．４ｍｍ厚さ配列決定用ゲル上に負荷（ｌｏａｄ）し、溶解し た。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに露光した。通常、標準配列決定キットが使用 された時は３５Ｓが組み込まれ、３２Ｐ末端標識化プライマをサイクル配列決定 反応に使用した。配列は、ゲルの底部から頂部の方向（５’より３’の方向に向 かって）にＤＮＡ配列エディタに読み込まれ、データを、ジェネティクス・コン ピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）（ ＧＣＧ，ウィスコンシン大学）によって供給されているプログラムを使用して解 析した。 ＶＩＩ．ＲＮＡの調製とＰＣＲ増幅 ゲノムＤＮＡ中に検出され、ＧＧＦペプチドをコードする配列を含む転写解 読枠を、下垂体ＲＮＡのＰＣＲ増幅によって拡張した。ＲＮＡは、グアニジン中 性−ＣｓＣｌ手法（チャーグウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）他 Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ １８：５２９４（１９７９））に従って冷凍ウシ線維組織 （Ｐｅｌｆｒｅｅｚｅ）から調製した。ポリアデニール化ＲＮＡは、オリゴ−ｄ Ｔセルロースカラムクロマトグラフィによって選別した（Ａｖｉｖ ａｎｄ Ｌ ｅｄｅｒ ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）６９：１４０８（１９７２））。 特定のＤＮＡ目標配列を、全ＲＮＡ、もしくは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＰＣＲ／ＲＮＡキットＮｏ．Ｎ８０８−００１７を使用してｃＤＮＡから変換 しておいたポリアデニール化ＲＮＡサンプルから始めて増幅した。第１ストラン ド逆転写反応は、１μｇのテンプレートＲＮＡ及び、制限酵素認識サイトリンカ ーを結合したオリゴｄＴのプライマーか、又は、制限サイトを結合したクローン 化配列から決められた特定のアンチセンスプライマのいずれかを使用した。第２ ストランドを作るために、前記プライマは、３’ＲＡＣＥ反応（フローマン（Ｆ ｒｏｈｍａｎ）他，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：８９９８（１９８８））において 使用されるプラスストランド特徴配列か、あるいは、第２目標サイトが、予め、 ｄＡＴＰを備えた第１ストランド反応生成物の後の終端トランスフェラーゼによ って添加された場合（例えば、５’のレース反 応、フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）他 ｉｂｉｄ）には制限サイトを取り付けた オリゴｄＴプライマのいずれかであった。あるいは、固定されたＰＣＲ反応物と 同様に、前記第２ストランドプライマは分解物であって、従って特定のペプチド 配列を示すものであった。 増幅プロフィールは、次の一般的手法に従った。１）９５℃で５分間の浸漬 ファイル；２）９５℃、１分間の熱サイクルファイル、１分間で４５℃、５０℃ 又は５５℃のアニーリング温度にまで下げ、このアニーリング温度を１分間維持 ；１分間以上で７２℃にまで温度を上げる；７２℃で拡張するか、あるいは、１ 分１０秒で自動拡張、３）７２℃での５分間の拡張サイクル、及び４）４℃で不 定時間の浸漬ファイル。熱サイクルファイル（＃２）は、通常、３０サイクルだ け実行した。各１００μｌの増幅反応の１６μｌサンプルを３時間、１センチメ ータ当り４ボルトの条件で、ＴＡＥバッファ中において２％Ｎｕｓｉｅｖｅ、１ ％アガロースゲルでの電気泳動法によって分析した。これらゲルを染色し、次に 、前記プライマの内部の標識化ＤＮＡプローブでプローブした非チャージナイロ ン膜にブロットした。 このブロッチング実験において、特定のセットのＤＮＡ増幅生成物を同定す ることができた。そして、その位置を、精製と再増幅のためのガイドとして使用 した。適当な場合、選別されたサンプルの残りの部分を、調製ゲルに負荷し、次 に、電気泳動を行い、前記ゲルから０．５ｍｍ厚さの４〜５のスライス（特定生 成物の予想位置をブラケット化する）を取り出した。前記アガロースを粉砕し、 次に、４０℃で２〜１６時間、０．５ｍｌの電気泳動バッファ中に浸漬した。粉 砕したアガロースを２分間遠心分離し、水相を新しい試験管に移した。 最初の反応と同じセットのプライマと反応プロフィールとを使用し、５μｌ （生成物の約１％）の溶出物質に対して再増幅を行った。再増幅反応が完了した とき、サンプルを、クロロフォルムで抽出し、新しい試験管に移した。リンカー 中に存在する制限サイトで切り離すために、濃縮制限酵素バッファと酵素とを、 反応物に添加した。消化ＰＣＲ生成物を、ゲル電気泳動によって精製し、次に、 前述のサブクローン化の章に記載のようにベクターにサブクローン化した。ＤＮ Ａ配列決定は、前述のように行った。ＶＩＩＩ．ＤＮＡ配列分析 フラグメントアセンブリ・プログラムを使用してＤＮＡ配列をアセンブルし 、アミノ酸配列を、ＧＣＧプログラム ＧｅｌＡｓｓｅｍｂｌｅ，Ｍａｐ ａｎ ｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｅによって推定した。これらの推定タンパク質配列を、質 問配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として使用して、ワード・サーチ（Ｗ ｏｒｄ Ｓｅａｒｃｈ）を使用してタンパク質配列データベースを検索した。分 析は、ＶＭＳ５．１で作動するＶＡＸステーション３１００ワークステーション にて行った。前記データベース検索は、ＧＣＧバージョン７．０を使用したＳｗ ｉｓｓＰｒｏｔｒｅｌｅａｓｅ Ｎｏ．２１にて行った。ＩＸ．ＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩをコードする遺伝子のクローン化と配列決定 の結果 前述のように、ウシＧＧＦ−ＩＩをコードするＤＮＡ配列を同定するために 、分解オリゴヌクレオチドプローブを、ＧＧＦ−ＩＩペプチド配列から構成した 。リシルエンドペプチダーゼによって消化された、精製ＧＧＦ−ＩＩ調合物のペ プチドであるＧＧＦ−ＩＩ １２（配列認識番号４４）（図１１及び１２参照） は、 精製ＧＧＦ−Ｉ調製物から調製されたトリプシンペプチドであるＧＧＦ−Ｉ ０ ７（配列認識番号３９）と強いアミノ酸配列相同性を示した。従って、１０個の 退化オリゴヌクレオチドプローブを作るためにＧＧＦ−ＩＩ １２を使用した（ 図２１の配列認識番号６９，７０，７１，７９として、それぞれ示されているオ リゴ６０９，６１０，６４９〜６５６参照）。フィルタの複製セットを、ＧＧＦ −ＩＩ １２の２つのオーバーラップする部分をコードする２セットのプローブ （セット１＝６０９，６１０；セット２＝６４９−５６５６）でプローブした。 ハイブリッド化信号が観察されたが、両方のプローブセットにハイブリッドした クローンは一つだけであった。このクローン（ＧＧＦ２ＢＧ１として指定）を精 製した。 前記ファージクローンＧＧＦ２ＢＧ１からのＤＮＡのサザンブロッチング分 析によって、両方のプローブセットが前記ウシＤＮＡ配列とハイブリッドしたこ とが確認されるとともに、更に、両方のプローブが、このクローン中において、 同じセットのＤＮＡフラグメントと反応していることが判った。これらの実験に 基づき、元のクローンの４ｋｂ Ｅｃｏ ＲＩサブ−フ ラグメントが同定され、サブクローン化され、部分的に配列決定された。図２２ は、前記ヌクレオチド配列配列認識番号８９とプローブ６０９及び６５０のハイ ブリダイゼーションサイトを含む初期ＤＮＡ配列解読の推定アミノ酸配列を示し 、更に、このウシゲノムＤＮＡの部分がペプチド１２（ＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭ ）をコードしたことを立証している。 更に配列分析をしたところ、前記ＧＧＦ−ＩＩ １２が、ウシＧＧＦ−ＩＩ 遺伝子とｃＤＮＡとを表すオーバーラップ配列の分離の開始点になった６６アミ ノ酸転写解読枠（下記参照）に位置することが判った。 いくつかのＰＣＲ手法を使用して、推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子の、更に別 のコード配列を得た。全部のＲＮＡ及びオリゴｄＴ−選択（ポリＡ含有）ＲＮＡ サンプルを、ウシの全下垂体、前方下垂体、後方下垂体、および視床下部から調 製した。図２３、配列認識番号１０９〜１１９に示すリストからのプライマを使 用して、片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ反応によって、３’と５’との両方 の方向において、ｃＤＮＡ末端を増幅し、固定ＰＣＲ反応を、別のＧＧＦ−ＩＩ ペプチ ドを表す退化オリゴヌクレオチドプライマにて行った。図２４は、これらの実験 において得られた隣接するＤＮＡコンストラクトと、配列とをまとめて示してい る。３’レース（ＲＡＣＥ）反応から、３つの交互にスプライスされたｃＤＮＡ 配列が生成され、これらをクローン化し配列決定した。５’レース反応によって 、少なくとも５２のアミノ酸のコード配列を含む別のエクソンが発見された。こ の推定アミノ酸配列の分析によって、ペプチドＧＧＦ−ＩＩ−６と、ＧＧＦ−Ｉ −１８に類似した配列とが明らかになった（下記参照）。固定化ＰＣＲ反応によ って、３００ｂｐの別のｃＤＮＡセグメント中に含有されるペプチドＧＧＦ−Ｉ Ｉ−１，２，３及び１０の（ｃＤＮＡ）コード配列が同定された。このセグメン トの５’境界（即ち、図３１のセグメントＥ）は、ペプチドＧＧＦ−ＩＩ−１を コードするとともに、前記ＰＣＲ反応において使用されたオリゴヌクレオチドに よって規定されている（例６のヒトクローンに関して記載されているように別の ５’配列データが存在する）。従って、このクローンは、既存の全部で９つの新 規なＧＧＦ−ＩＩペプチド配列の内の６つをコードするヌクレオチド配列を有す る。 前記クローン化遺伝子は、先ず、前記コード配列を、それらが見出された状 態（図２５参照）において位置決めすることを可能にするＧＣＦ２ＢＧ１の物理 的地図を構成することによって特徴づけられる。上述のコード配列からのＤＮＡ プローブを使用して、このファージクローンにおいて前記エクソンを含有する更 に別のＤＮＡフラグメントを同定するとともに、両方の方向においてオーバラッ プするクローンを同定した。前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子は、少なくとも５ つのコード・セグメントに分割される。コード・セグメントは、ユニバーサルな 遺伝子コードを使用してポリペプチド配列に翻訳可能な、個々の長さのＤＮＡ配 列であると定義される。図３１に示し、本出願において言及されるこれらコード ・セグメントは以下の通りである。１）ＧＧＦ遺伝子内に存在する特定のエクソ ン（例えば、コード・セグメントａ）、あるいは、２）各セットが図示の遺伝子 生成物と同様に特定のポリペプチドセグメントに翻訳可能な場合において、ｍＲ ＮＡｓの特定のサブーグループ中に現れる２つ又はそれ以上のエクソンのセット から派生するもの。請求の範囲において言及されているポリペプチドセグメント は、前記相同ＤＮＡコード・セグメントの翻訳生成物である。 これまで、コード・セグメントＡ及びＢのみが、エクソンとして定義され、配列 決定されマップ化された。図２６は、同定された隣接コード配列をまとめて示し ている。エクソンは、その発見の順序（アルファベット順）でリストされている 。そのイントロン／エクソン境界から、エクソンＢを、コード・セグメントＥと コード・セグメントＡとを接続するｃＤＮＡｓに含めることが出来ることが明ら かである。即ち、エクソンＢは、その読み取り枠を損なうことなく、スプライス することは出来ない。従って、我々は、３つのスプライシングパターンが、推定 ウシＧＧＦ−ＩＩ ｃＤＮＡ配列１，２及び３を生成することが出来ると示唆す る。それぞれ、ＧＧＦ２ＢＰＰ１．ＣＤＳ、ＧＧＦ２ＢＰＰ２．ＣＤＳ及びＧＧ Ｆ２ＢＰＰ３．ＣＤＳとされるこれらのコード配列は、図２８ａ（配列認識番号 １３３）、２８ｂ（配列認識番号１３４）及び２８ｃ（配列認識番号１３５）に それぞれ示されている。これら３つのｃＤＮＡの推定アミノ酸配列も、図２８ａ （配列認識番号１３３）、２８ｂ（配列認識番号１３４）及び２８ｃ（配列認識 番号１３５）にそれぞれ示されている。 これら３つの推定コンストラクトは、アミノ酸長さが２０６，２８１，２５ ７であるタンパク質をコードする。推定されたタンパク質配列の最初の１８３残 基は３つの遺伝子生成物において同一である。位置１８４において、前記クロー ンは大幅に異なっている。ＧＧＦ２ＢＰＰ１におけるグリシンＧＧＴ用に対する コドンは、又、ＧＧＦ２ＢＰＰ２とＧＧＦ２ＢＰＰ３に対するスプライスドナー としても作用し、これらは、それぞれ交互に、エクソンＣ，Ｃ／Ｄ，Ｃ／Ｄ’及 びＤ又はＣ，Ｃ／Ｄ及びＤに加わるものであり、図３３において、配列認識番号 １４９として示されている。ＧＧＦＩＩＢＰＰ１は、前記コード・セグメントＡ スプライス接合部を越えて、次の介在配列（イントロン）への読み取りによって 生成される裁頭遺伝子生成物である。これは、図３１におけるコード・セグメン トＡ’を示す（配列認識番号１４０）。前記転写体は、標準型ＡＡＴＡＡＡポリ アデニール化配列の隣で終端し、我々は、この裁頭遺伝子生成物が、真性成熟転 写体を表すものであると提案する。他の２つのより長い遺伝子生成物は、同じ３ ’非翻訳配列とポリアデニリン化配列を共有する。 これらの３つの分子は、すべて、９つの新規なＧＧＦ−ＩＩペプチド配列の 内の６つを有し（図１２参照）、もう１つのペプチドがＧＧＦ−Ｉ−１８に対し てきわめて高い相同性を有している（図２７参照）。この発見は、この組替え分 子が、ウシＧＧＦ−ＩＩの少なくとも一部分をコードしている可能性がきわめて 高いことを示している。更に、３つのペプチドの計算上の等電点は、ＧＧＦ−Ｉ とＩＩの物理的特性と一致している。ＧＧＦ−ＩＩの分子の大きさはおよそ６０ ｋＤであるので、これら３つのｃＤＮＡの最も長いものが、予想数のアミノ酸の １／２近くをコードしているはずである。 Ｂ及びＡエクソンを含むプローブを、ＰＣＲ増幅によって標識化し、ウシ後 部下垂体から分離されたＲＮＡから作られたｃＤＮＡライブラリのスクリーニン グに使用した。１つのクローン（ＧＧＦ２ＢＰＰ５）は、図３０に示すパターン を示し、コード・セグメントＡとＣとの間にもう１つのＤＮＡコード・セグメン ト（Ｇ）を有していた。核酸配列の全体が、図３２に示されている（配列認識番 号１４８）。最長転写解読枠からの予想翻訳生成物は、２４１のアミノ酸である 。 第２のｃＤＮＡの一部（ＧＧＦ２ＢＰＰ４）も、上述のプローブを使用してウシ 後部下垂体ライブラリから分離された。このクローンは、図３０に示すパターン を示した。このクローンは、５’の部分において不完全であるが、コード・セグ メントＧ及びＤを欠いているという意味においてこれはスプライシング変異体で ある。ＢＰＰ４も、領域Ｃ／Ｄ以降において領域Ｈ，Ｋ及びＬを備えた新規な３ ’末端を示す。ＢＰＰ４の配列は、図３４に示されている（配列認識番号１５０ ）。 例５ 様々な種におけるＧＧＦ配列 データベース検索によっては、予想ＧＧＦ翻訳生成物と公知のタンパク質配列 との間になんら有義な類似性は見つからなかった。これは、ＧＧＦ−ＩＩが、タ ンパク質の新規なファミリ又はスーパーファミリの最初のメンバであることを示 唆している。これまでに我々が示した、他のほ乳類ＤＮＡとの高厳密度のクロス ハイブリッド研究（ＤＮＡブロッチング実験）においては、はっきりと、このウ シ組替え分子からのＤＮＡプローブによって、テストされた様々なサンプルにお いて特定の配列が容易に 検出される。相同性の高い配列は、ヒトゲノムＤＮＡにも検出された。そのオー トラジオグラムを図２９に示す。ラットとヒトのＤＮＡを含むレーンの信号は、 ＧＧＦ遺伝子のラット及びヒト同等物を表し、この遺伝子によってコードされた 複数のｃＤＮＡの配列が、最近、ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２０５（１９９２））とウェン（Ｗｅｎ）他（Ｃｅｌｌ６９：５５ ９（１９９２））とによって報告されている。例６ ヒト配列エンコード・ヒトＧＧＦ２の分離 ウシＧＧＦＩＩコード・セグメントＥをからの配列を含む複数のヒトクローン を、脳幹から調製されたヒトｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによ って分離した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔａｌｏｇ＃９３５２０６）。この ストラテジーを、大半のＧＧＦ２ペプチド（ＧＧＦ２に特有）と、前記ウシＥセ グメントを含むクローンからの予想ペプチド配列との間の強い関連性に基づき、 追求した。このライブラリは、次にリストするオリゴヌクレオチドプローブ９１ ４〜９１９を使用した前述の例４、第ＩＩ章で記載したものと同様にス クリーニングした。 ９１４ＴＣＧＧＧＣＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＴＡ ９１５ＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＴＡＣＣＴＧＣＴ ９１６ＡＴＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＡ ９１７ＴＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＴＣＡ ９１８ＡＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＡ ９１９ＡＴＧＡＲＧＴＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＡＡＡ これらのプローブで検出されたクローンを、ハイブリッド化によって更に分析 した。セグメントＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物を標識化する ことによって生成された、コード・セグメントＡからのプローブ（図２１参照） は、一次ライ・ブラリをスクリーニングするのにも利用した。Ａ及びＥ由来のプ ローブとハイブリッド化した複数のクローンを選別し、１つの特定のクローン、 ＧＧＦ２ＨＢＳ５、を選別して更に分析した。このクローンは、コード・セグメ ントのパターン（図３１に示すＥＢＡＣＣ／Ｄ’Ｄ）によって表されている。こ のクローン中のＥセグメントは、図３７に示されるＥの裁頭化ウシ・バージョン のヒト等価物である。ＧＧＦ２ＨＢＳ５は、前述のすべての”推定”ＧＧＦ− ＩＩ候補の内で最も可能性の高い候補である。コード・配列セグメントＥの長さ は、７８６のヌクレオチドと非翻訳配列を有する２６４塩基のベースとである。 ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコードされるタンパク質の予想サイズは、約４２３ア ミノ酸であり（約４５キロダルトン、図４５，配列認識番号１６７参照）、これ はデグリコシル化状態のＧＧＦ−ＩＩ（例１６参照）のサイズに類似している。 更に、図２７にリストしたＧＧＦ−ＩＩペプチドのうちの７つは、領域Ｅから予 想されるタンパク質配列内に属する同等配列を有している。ペプチドＩＩ−６と ＩＩ−１２は例外であって、それぞれコード・セグメントＢ及びコード・セグメ ントＡに属する。ＧＦ２ＨＢＳ５タンパク質をコードするＲＮＡを、ＧＧＦ２Ｈ ＢＳ５挿入部を有するベクター（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ ［Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ Ｉｎｃ．］図４４参照）にあるバクテリオファージＴ７プロモータに よってドライブされたインヴィトロ転写システム中において生成した。このＲＮ Ａは、無細胞（ラビット網状赤血球）翻訳システムに翻訳され、そのタンパク質 生成物のサイズは４５ｋｄであった。更に、前記無細胞生成物を、シュワン細胞 分裂誘発分析において分離し、生物学的活性を確認した。調整培地によって処理 されたシュワン細胞は、¹²⁵Ｉ−ウリジンの組み込みによって測定した増殖度の 増加と、１８５キロダルトン領域のタンパク質のチロシンの燐酸化との両方を示 した。 従って、ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコードされた生成物のサイズと、図１２に 示したウシペプチドに対する相同性の高いヒトペプチドをコードするＤＮＡ配列 の存在とは、ＧＧＦ２ＨＢＳ５が、ウシＧＧＦ２のヒト等価物をコードすること を裏付けるものである。このクローンと形質変換した細胞から作られた調整培地 が、シュワン細胞分裂誘発活性を顕在化させるという事実から、ＧＧＦＩＩＨＢ Ｓ５遺伝子生成物（前記ＢＰＰ５遺伝子生成物とは違って）が分泌されるという ことが確かめられた。更に、ＧＧＦＩＩＢＰＰ５遺伝子生成物は、ｐ1８５^erbB2 等のレセプタチロシンキナーゼや、あるいは、密接に関連したレセプタ（図１４ 参照）を介してシュワン細胞増殖反応を仲介すると考えられる。例７ ほ乳類および昆虫細胞におけるヒト組替えＧＧＦ２の発現 ヒトＧＧＦ２をコードする前記ＧＧＦ２ＨＢＳ５ｃＤＮＡ（例６において記載 され、ここでＨＢＳ５と称される）を、ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９６にクロ ーン化し（タケベ（Ｔａｋｅｂｅ）他 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６ ６〜４７２（１９８８））、ＣＯＳ−７細胞を、ＤＥＡＥ−デクストラン法（サ ムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ． ＣＳＨ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ ＮＹ（１９８９））によって、１００ｍｍディシュにおいて移入さ せた。細胞溶解物又は一過的発現ＣＯＳ細胞からの調整培地を、移入の３又は４ 日後に収穫した。溶解物を調製するために、細胞単層を、ＰＢＳによって洗浄し 、１５０μｌの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中での３回の冷凍／解凍 サイクルによって溶解したディシュから掻き取った。細胞堆積物をペレットで取 り、上清を回収した。調整培地サンプル（７ｍｌ）を収集し、次に、濃縮し、製 造業者（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ），マ サチューセッツ州，ビヴァリー）によって記載されたようにＣｅｎｔｉｐｒｅｐ −１０とＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０ユニットを使用して、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ７．４とバッファ交換した。前述したように（例３参照）、ラットの神経シ ュワン細胞のＤＮＡ合成先駆体の組み込みを分析した。調整培地または細胞溶解 物サンプルを、例３において記載した方法で、シュワン細胞増殖分析においてテ ストした。その細胞分裂誘発活性データは、図４６に示されている。ＧＧＦ２を コードする、ｃＤＮＡ、ＧＧＦ２ＨＢＳ５は、タンパク質生成物の分泌を前記培 地に振り向けた。全活性の極く一部分が、細胞分解物を使用した分析によって、 細胞内に検出可能であった。ＧＧＦ２ＨＦＢ１とＧＧＦＢＰＰ５ ｃＤＮＡでは 、生成物の分泌を細胞外培地に振り向けることが出来なかった。これらのクロー ンからのＧＧＦ活性物質は、細胞分解物においてのみ検出可能であった（図４６ ）。 組替えＧＧＦ２も、ＣＨＯ細胞に発現された。ＧＧＦ２をコードするＧＧＦ２ ＨＢＳ５ ｃＤＮＡを、ベクターｐｃｄｈｆｒｐｏｌｙＡのＥｃｏＲＩサイトに クローン化し（図５４）、燐酸カルシウム共沈法（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａ ｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６〜４６７（１９７３））によってＤＨＦＲネガティブＣＨＯ細胞に 移入した。クローンを、９６−ウェルプレート中のヌクレオチド及び無ヌクレオ チドα媒体（Ｇｉｂｃｏ）内で選別した。３週間後、個々のクローンの調整培地 を、例３で記載したシュワン細胞増殖分析によって、ＧＧＦ発現のためにスクリ ーニングした。前記培地へかなり高いレベルのＧＧＦ活性物質を分泌した安定し たクローンが同定された。ＣＨＯ細胞調整培地の異なった分量の部分標本から得 られたシュワン細胞増殖活動データを使用して、図４７に示す投与量反応曲線を 得た（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２ ：４５６，１９７３））。この物質を、ＧＧＦ２特定ペプチドに対して生成した ポリクローナル抗血清によってプローブしたウェスタンブロッチングにて分析し た。約６９〜９０ｋｄ（下垂体および高分子量グリコフォームから抽出されたＧ ＧＦ２の予想サイズ）の広い範囲のバンドが特異的に標識化されている（図４９ ，レーン１２）。 組替えＧＧＦ２は、バクロウィルス発現を使用して昆虫細胞にも発現した。Ｓ ｆ昆虫細胞を、ＧＧＦ２ＨＢＳ５ ｃＤＮＡクローンを含有するバクロ ウィルスに、３〜５の多重度（１０⁶細胞／ｍｌ）で感染させ、そしてＳｆ９０ ０−ＩＩ媒体（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。シュワン細胞分裂誘発活性物質を、 前記細胞外媒体中に分泌させた（図４８）。異なった分量の昆虫細胞調整培地を 、フォルスクリン不存在の状態で、シュワン細胞増殖分析でテストし、そのデー タを使用して図４８に示す投与量反応曲線を得た。 この物質は、更に、前述のＧＧＦ ＩＩ特異性抗体でプローブしたウェスタン ブロッチング（図４７）でも分析した。４５ｋｄのバンド、デグリコシル化ＧＧ Ｆ−ＩＩ（例１６）のサイズが示されている。 この例で使用された方法は、次の通りである。 組替えヒト及びウシ・グリア成長因子のシュワン細胞分裂誘発活性を以下のよ うに測定した。培養シュワン細胞の細胞分裂誘発反応を、短命ほ乳類発現実験か ら得た粗組替えＧＧＦ生成物を使用して、５μＭのフォルスクリンの存在下にお いて測定した。［¹²⁵Ｉ］−ウリジンの組み込みを、前述の方法に記載の移入し た、あるいは疑似移入したＣＯＳ細胞から得た物質にたいして１８〜 ２４時間さらした後に行った。４セットのデータの平均及び標準偏差が図示され ている。部分的に精製された天然ウシ下垂体ＧＧＦ（カルボキシルメチル セル ロースフラクション：グッドアール（Ｇｏｏｄｅａｒｌ）他、提出）に対する細 胞分裂誘発反応が、１００パーセントの活性の標準として図示（ＧＧＦ）されて いる。 ｃＤＮＡ（図５３）を、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６にクローン化し（タケベ（Ｔ ａｋｅｂｅ）他，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：４６６〜４７２（１９８８ ））、ＣＯＳ−７細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラン法（サムブルック（Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ）他，Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ，ＮＹ，１９８９））によって１００ｍｍディシュ中で移入した。細胞溶解 物または調整培地を転写の３又は４日後に収穫した。溶解物を調製するために、 細胞単層をＰＢＳによって洗浄し、ディシュから掻き取り、１５０μｌの０．２ ５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中での３回の冷凍／解凍サイクルによって溶解し た。細胞堆積物をペレ ットとし、上清を回収した。調整培地サンプル（７ｍｌｓ）を採取し、次に、濃 縮し、製造業者（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ），マサチューセッツ州，ビヴァリー ）によって記載されたようにＣｅｎｔｉｐｒｅｐ−１０とＣｅｎｔｒｉｃｏｎ− １０ユニットを使用して、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４とバッファ交換した 。前述したように（デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）およびストローバント（Ｓｔｒｏ ｏｂａｎｔ），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１０：１３５３〜１３６０（１９９ ０）；ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１６５：１０５ 〜１１８（１９７９））、ラットの座骨神経シュワン細胞はＤＮＡ合成先駆体の 組み込みについて分析した。 組替えＣＨＯ細胞調整培地のウェスタンブロッチングは、以下のように行った 。１つのＣＨＯクローンを、７ｍｌのＭＣＤＢ３０２無タンパク質媒体中で３日 間、培養した。２ｍｌの調整培地を濃縮し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．４に対してバッファ交換し、凍結乾燥させた。そのペレットをＳＤＳ−ＰＡ ＧＥサンプルバッファ中で再懸濁し、還元性ＳＤＳゲル電気泳動にかけ、ＧＧＦ ペプチド抗体でのウェスタンブロッチン グによって分析した。ＣＨＯコントロールを、非移入ＣＨＯ−ＤＧ４４ホストか らの調整培地を使用して行い、ＣＨＯ ＨＢＳ５レベルを、組替えクローンから の調整培地を使用して分析した。例８ ウシＧＧＦに関連する他のヒト配列の分離 例５及び６の結果は、ヒトのソースからのＧＧＦ関連配列が、ウシＧＧＦ配列 由来のＤＮＡプローブを使用することによっても容易に分離可能であることを示 している。これに代えて、ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５ ６ ：１２０５（１９９２））によって記載された方法も利用可能である。この例 において、前記ｐ１８５^erbB2レセプタに結合し、これを活性化する（そしてＧ ＧＦに関係する）ヒトタンパク質（ヘレグリン α）が、腫瘍細胞系から精製さ れ、派生したペプチド配列を使用して、ｃＤＮＡコード・ヘレグリンをクローン 化するのに使用されたオリゴヌクレオチドプローブを生成する。ｐ１８５^erbB2 レセプタ活性の生化学的分析は、シュワン細胞の増幅とは異なる。これは、下垂 体ｃＤＮＡからＧＧＦ配列をクローン化するために 例１〜４において使用した方法に類似している。ヘレグリンタンパク質と補足性 ＤＮＡとは、次の手法に従って腫瘍細胞系から分離した。ヘレグリンは、Ｐｅｒ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ ミクロキャリア ビーズ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌ ａｂｓ）上で成長したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳ガン細胞（ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ２ ６）によって調整した培地から精製した。前記培地（１０リットル）は、膜（１ ０−ｋＤ カットオフ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によるフィルタ処理によって〜 ２５倍に濃縮し、遠心分離処理と、フィルター（０．２２μｍ）を通す濾過処理 とによって清浄化した。濾過物を、ヘパリンセファローズカラム（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）にかけ、そのタンパク質を、燐酸−バッファ化塩水中にて０．３、０． ６及び０．９ＭのＮａＣｌステップで溶出した。種々のクロマトグラフィック・ フラクション中の活性を、ＭＣＦ−７乳ガン細胞（ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ２２）中 におけるｐ１８５^erbB2のチロシン燐酸化の増加を定量化することによって測定 した。ＭＣＦ−７細胞を、血清（１０％）を含有した（ウェル当り１０⁵の細胞 ）、Ｆ１２（５０％）のＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培地（５０％）中にて２４ −ウェルＣｏｓｔａｒプレートにプレート化し、少なくとも２４時間付着させた 。分析の 前に、細胞を、少なくとも１時間、血清を含まない培地中に移した。カラムフラ クション（１０〜１００μｌ）を、３７℃で３０分間、培養した。次に上清を吸 引して、ＳＰＤ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（１００μｌ）を添加することによ って反応を終わらせた。サンプルを１００℃で５分間加熱し、一部分（１０〜１ ５μｌ）を、ｔｒｉｓ−グリシン ゲル（４〜２０％）（Ｎｏｖｅｘ）にかけた 。電気泳動後、タンパク質を、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に電子ブ ロッチングし、次に、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含有する（０．０５％） ｔｒｉｓ−バッファ化塩水（ＴＢＳＴ）中にてウシ血清アルブミン（５％）でブ ロックした。ブロットを、ホスホチロシン（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ）に対するモノクローナル抗体（１：１０００希釈）で、室温で最低 １時間、プローブした。ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、室温で最低３０分間、ア ルカリフォスホターゼと結合したマウスの免疫グロブリンＧに対する抗体（Ｐｒ ｏｍｅｇａ）（１：７５００に希釈）でプローブした。反応性バンドは、５−ブ ロモ−４−クロロ−３−インドイル−１−ホスフェートとニトロ−ブルーテトラ ゾリウムによって可視化された。免疫ブロットを、Ｓｃａｎ Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ （ヒューレットパーカード） 濃度計によって走査した。非刺激ＭＣＦ−７細胞の信号強度は、２０〜３０ユニ ットであった。完全に刺激したｐ１８５^erbB2は、１８０〜２００ユニットであ った。活性のほとんどを有する０．６Ｍ ＮａＣｌプールを、エタノール（３０ ％）を含有する１７ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ６．８）中で平衡されたポリア スパラギン酸（ＰｏｌｙＬＣ）カラムに適用した。前記平衡バッファ中で、０． ３から０．６Ｍ ＮａＣｌまでのリニアグラジエント使用して、結合タンパク質 を溶出した。活性のピーク（〜０．４５Ｍ ＮａＣｌにおける）を、ＴＦＡ（０ ．１％）とアセトニトリル（１５％）とを含有するバッファで平衡させたＣ４逆 相カラム（ＳｙｎＣｈｒｏｐａｃｋＲＰ−４）にて更にフラクション化した。こ のカラムから、２５から４０％のアセトニトリル・グラジエント範囲にて、６０ 分間にわたり、タンパク質が溶出した。フラクション（１ｍｌ）を採取し、その 活性を分析し、ｔｒｉｓ−グリシン ゲル（４〜２０％，Ｎｏｖｅｘ）上でＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥによって分析した。ＨＰＬＣ−精製したＨＲＧ−αを、ＳＤＳ（０ ．１％）、１０ｍＭジチオトレイトール、０．１Ｍ ＮＨ₄ＨＣＯ₃（ｐＨ８．０ ）中で、リシンＣにて、３７℃で２０時間にわたって消化させ、その結果得られ たフラグメントを、 Ｓｙｎｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム（４０００Å，０．２ｂｙ １０ｃｍ）上で溶解 させた。このカラムを、０．１％のＴＦＡ中で平衡させ、次いで０．１％ＴＦＡ 中で１−プロパノール使用グラジエントで溶出した（ダブリュ・ジェイ・ヘンゼ ル（Ｗ．Ｊ．Ｈｅｎｚｅｌ），ジェイ・ティ・スタルツ（Ｊ．Ｔ．Ｓｔｕｌｔｓ ），シー・スー（Ｃ．Ｈｓｕ），ディ・ダブリュ・アスワド（Ｄ．Ｗ．Ａｓｗａ ｄ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１５９０５（１９８９））。クロマト ログラフ・ランのピークを真空下において乾燥し、配列決定した。これらのペプ チドの１つ（〜２４％ １−プロパノールで溶出）の配列は、［Ａ］ＡＥＫＥＫ ＴＦ［Ｃ］ＶＮＧＧＥＸＦＭＶＫＤＬＸＮＰ（配列認識番号１６２）であった。 括弧内の残基は、不確定であり、Ｘは、アミノ酸の同定が不可能であったサイク ルを示している。最初の収量は、８．５ｐｍｏｌであり、その配列はいずれの公 知のタンパク質にも対応していなかった。残基１，９，１５及び２２は、後に、 ｃＤＮＡ配列中においてシステインとして同定された。これまで過負荷され（ｏ ｖｅｒ−ｌｏａｄｅｄ）、そしてＰＶＤＦにブロットされたゲルから得られた〜 ４５ｋＤバンドの直接的配列決定は、初期収量が極めて低い（０．２ｐｍｏｌ） 、低量（ｌｏｗ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）の配列、ＸＥＸＫＥ［Ｇ］［Ｒ］ＧＫ［Ｇ］Ｋ［Ｇ］ＫＫ ＫＥＸＧＸＧ［Ｋ］（配列認識番号３０）を示した。これは、ヘレグリン−α（ 図３１）のアミノ酸残基２〜２２に対応し、セリン２がｐｒｏＨＲＧ−αのＮＨ₂ 末端であることを示唆している。ＮＨ₂末端はブロックされているが、ときとし て少量の自然にブロックされたタンパク質は、翻訳後に変成されないこともある ことが観察された。前記ＮＨ₂末端指定は、臭化シアンとの消化後のタンパク質 のマススペクトル分析によって確かめられた。前記分離タンパク質のＣＯＯＨ− 末端は、はっきりとは同定されていなかったが、タンパク質分解消化物の混合配 列決定によって、成熟した配列は、残基２４１を越えて拡張しないようである。 アミノ酸残基の略称は以下の通りである。Ａ，Ａｌａ；Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ，Ｐｈｅ；Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ；Ｋ，Ｌｙｓ ；Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；Ｖ，Ｖａｌ；Ｗ，Ｔｒｐ；そしてＹ，Ｔｙｒ。 ｃＤＮＡクローンの源として、オリゴ（ｄＴ）−開始λｇｔ１０（ティ・ヴィ ・ハイン（Ｔ．Ｖ．Ｈｕｙｎｎ）， アール・エイ・ヤング（Ｒ．Ａ．Ｙｏｕｎｇ），アール・ダブリュ・デイヴィス （Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ），λｇｔ１０及びλｇｔ１１ ＤＮＡクローン化技術： ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（ＩＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，（１９８４））ｃＤＮＡライブラリを、ＭＤＡ− ＭＢ−２３１細胞からの、ｍＲＮＡ精製（ジェイ・エム・チャーウィン（Ｊ．Ｍ ．Ｃｈｉｒｗｉｎ），エイ・イー・プルズビラ（Ａ．Ｅ．Ｐｒｚｂｙｌａ），ア ール・ジェイ・マクドナルド（Ｒ．Ｊ．ＭａｃＤｏｎａｌｄ），ダブリュ・ジェ イ・ラッター（Ｗ．Ｊ．Ｒｕｔｔｅｒ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８，５２ ９４（１９７９）によって構成した（ユー・ガブラー（Ｕ．Ｇｕｂｌｅｒ）およ びビー・ジェイ・ホフマン（Ｂ．Ｊ．Ｈｏｆｆｍａｎ），Ｇｅｎｅ ２５，２６ ３（１９８３））。１３−アミノ酸配列ＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥ（配列認識 番号３１）（１３）をコードする下記の８重の退化アンチセンスデオキシオリゴ ヌクレオチドを、ヒトコドン周波数最適値（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｐｔｉｍａ ）（アール・ラテ（Ｒ．Ｌａｔｈｅ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３，１（１ ９８５））のベースに構成し、化学的に合成した。即ち、５’−ＣＴＣＧＣＣ（ Ｇ ＯＲ Ｔ）ＣＣ（Ａ ＯＲ Ｇ）ＴＴＣＡＣ（Ａ ＯＲ Ｇ）ＣＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣ ＴＣＡＧＣ−３’（配列認識番号４０）。プローブ構成の目的のため、システイ ンを前記アミノ酸配列中の未知の残基に指定した。このプローブを燐酸化により 標識化し、低−厳密度条件下におけるｃＤＮＡライブラリへのハイブリッド化し た。前記ｐｒｏＨＲＧ−αタンパク質を、このライブラリ中において同定した。 ＨＲＢ−β１ ｃＤＮＡは、ｐｒｏＨＲＧ−αの５’と３’との両方の末端から の配列とともに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ｍＲＮＡから作られた第２オリゴ（ ｄＴ）−開始λｇｔ１０ライブラリのプローブ化によって同定された。クローン １３（図２Ａ）は、プライム化（５’−ＣＣＴＣＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧ ＣＣＣＴＴＣ−３’プライマ（配列認識番号４１）；ｐｒｏＨＲＧ−αアンチセ ンスヌクレオチド３３〜５６）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ λｇｔ１０ライブラリを ５’ＨＲＧ−α配列によってスクリーニングすることによって得られた生成物で あった。前記プローブとしてのクローン１３の５’末端に対応する配列を使用し てＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ｍＲＮＡからの第３のオリゴ（ｄＴ）−開始λｇｔ １０ライブラリ中におけるｐｒｏＨＲＧβ２とｐｒｏＨＲＧβ３とを同定した。 ４つのＨＲＧのそれ ぞれをコードする２つのｃＤＮＡクローンを配列決定した（エフ・サンガー（Ｆ ．Ｓａｎｇｅｒ），エス・ミルケン（Ｓ．Ｍｉｌｋｅｎ），エイ・アール・カル ソン（Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ．Ｓ．Ａ．７４，５４６３１９７７））。別のｃＤＮＡ指定クローン８４は、ア ミノ酸数４２０を通じてｐｒｏＨＲＧβ２と同一のアミノ酸配列を有している。 位置４２１の終止コドンの後には、異なった３’−非翻訳配列が続く。 例９ 別のスプライシング変異体の分離 例６の方法によって、スプライシング変異の結果として４つの密接に関連した 配列（ヘレグリンα，β１，β２，β３）が作り出された。ペレス（Ｐｅｌｅｓ ）他（Ｃｅｌｌ ６９，２０５（１９９２））及びウェン（Ｗｅｎ）他（Ｃｅｌ ｌ ６９，５５９（１９９２））は、ｐ１８５^erbB2に結合するタンパク質に関 する例１〜４及び６に記載の方法に類似の精製方法とクローン化方法を使用して 別のスプライシング変異体を分離した（ラットから）。ｃＤＮＡクローンは次に ようにして得られ た（形質転換ラット線維芽細胞系からのｐ１８５^erbB2結合タンパク質の精製と 配列決定による）。 ｐ１８５^erbB2結合タンパク質は、以下のようにして調整培地から精製された 。５００のローラボトル（全部で１２０リットル）の３回の収穫からのプールさ れた調整培地を、０．２μのフィルタによる濾過によって浄化し、２０ｋｄ分子 径カットオフの膜によるＰｅｌｉｃｏｎ限外濾過システムによって３１倍に濃縮 した。すべての精製工程は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｆａｓｔ タンパク質液体ク ロマトグラフィーシステムを使用して行われた。前記濃縮物を、直接、ヘパリン −セファローズ（１５０ｍｌ，燐酸塩−バッファ化塩水（ＰＢＳ）によって予め 平衡化しておいたもの）に負荷した。カラムを、２８０ｎｍの波長において全く 吸収が検出されなくなるまで、０．２ＭＮａＣｌを含有のＰＢＳで洗浄した。結 合タンパク質を、次に、ＮａＣｌ（２５０ｍｌ）の連続グラジエント（０．２Ｍ から１．０Ｍ）で溶出し、５ｍｌのフラクションを採取した。サンプル（前記採 取フラクションの０．０１ｍｌ）を使用して、キナーゼ刺激活性の定量分析を行 った。３つのカラム・ラン（全容量＝３６０ｍｌ）からの活性フラクションを、 プールし、ＹＭ１０ 限外 濾過膜（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ），マサチューセッツ州，ダンヴァース）を使 用して２５ｍｌに濃縮し、１．７Ｍの濃度となるように硫酸アンモニウムを添加 した。遠心分離処理（１０，０００ｘｇ，１５分間）による浄化後、プールされ た物質をフェニール・スペローズカラム（ＨＲ１０／１０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）上に負荷した。前記カラムを、０．１ＭのＮａ₂ＰＯ₄（ｐＨ７．４）中で（Ｎ Ｈ₄）₂ＳＯ₄の４５ｍｌグラジエント（１．７Ｍから無塩状態まで）で展開し、 ２ｍｌのフラクションを採取してそのキナーゼ刺激を分析（一サンプルにつき０ ．００２ｍｌ）した（例６に記載のように）。活性の主なピークをプールし、５ ０ｍＭの燐酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．３）に対して透析した。１つのモノ −Ｓ陽イオン交換カラム（ＨＲ５／５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、５０ｍＭの燐 酸ナトリウムで予め平衡させた。活性物質（タンパク質の０．８８４ｍｇ；３５ ｍｌ）の負荷後、前記カラムを、開始バッファで洗浄し、次に、ＮａＣｌのグラ ジエントで１ｍｌ／分の速度で展開した。キナーゼ刺激活性は、０．４５〜０． ５５Ｍ塩で回復され、それぞれ２ｍｌづつの４つのフラクションにわたっていた 。これらをプールし、Ｃｕ⁺²キレート化カラムに直接負荷した（１．６ｍｌ，Ｈ Ｒ２／５キレート化スペローズ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。大半のタンパク質は樹脂に吸着されたが、これらは徐々 に塩化アンモニウムの３０ｍｌのリニアグラジエント（０−１Ｍ）によって溶出 した。前記活性物質は、０．０５〜０．２Ｍ ＮＨ₄Ｃｌの範囲の一つのタンパ ク質ピークで溶出した。様々な精製工程から得られたサンプルを、ゲル電気泳動 によって分離し、ＩＣＮ（カリフォルニア州，コスタ・メサ）のキットを使用し た銀着色後、それらのタンパク質内容を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（カリフォルニア州， リッチモンド）のキットを使用したコマーシブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌ ｕｅ）染色結合分析によって調べた。 前記ｐ４４タンパク質（１０μｇ）を、０．１Ｍ重炭酸アンモニウムバッファ （ｐＨ７．８）２００μｌ中で再構築した。Ｌ−１−トシル−アミド ２−フェ ニールエチル クロロメチル ケトン処理トリプシン（Ｓｅｒｖａ）による消化 を、１：１０の酵素対基質比で、３７℃で１８時間かけて行った。その結果得ら れたペプチド混合物を、Ｖｙｄａｃ Ｃ４マイクロカラム（２．１ｍｍ ｉ．ｄ ．ｘ１５ｃｍ，３００Å）と、ダイオードアレイ検出器とワークステーションと を備えたＨＰ１０９０液体クロマトグラフィシステムとを使用し、 ２１５ｎｍでモニタしつつ、逆相ＨＰＬＣで分離した。前記カラムを、０．１％ トリフルオロ酢酸（移動相Ａ）で平衡させ、０％から５５％の移動相Ｂ（０．１ ％のトリフルオロ酢酸中に９０％のアセトニトリル）のリニアグラジエントで７ ０分間にわたり溶出を行った。その流量は０．２ｍｌ／分で、カラム温度は、２ ５℃に制御された。前記ＨＰＬＣシステムから手作業によって採取されたペプチ ドのピークの１／３部分は、Ｅｄｍａｎ分解によるＮ−末端配列分析によって特 徴づけられた。２７．７分後（Ｔ２７．７）に溶出されたフラクションは、混合 アミノ酸配列を有し、還元後、つぎのようにして更に、再クロマトグラフされた 。前記ペプチドフラクションの７０％の部分を真空中で乾燥し、１００μｌの０ ．２Ｍ重炭酸アンモニウムバッファ（ｐＨ７．８）中で再構築した。前記溶液に ＤＴＴ（最終濃度２ｍＭ）を添加し、これを次に３７℃で３０分間培養した。次 に還元したペプチド混合物を、Ｖｙｄａｃカラム（２．１ｍｍｉ．ｄｘ１５ｃｍ ）を使用して逆相ＨＰＬＣによって分離した。溶出条件と流量は、前述したもの と同じであった。前記ペプチドのアミノ酸配列の分析を、オンライン・フェニル チオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸分析器を備えたモデル４７７タンパク質シ ーケンサ（アプライド・ バイオシステムズ・インコーポレイテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ，Ｉｎｃ．），カリフォルニア州，フォスター・シティ）と、モデル９００ データ分析システム（フンカピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ）他（１９８６） Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒ ｉｚａｔｉｏｎ ，Ｊ．ｅ．Ｓｈｉｖｅｌｙ，ｅｄ．（ニュージャージー州，クリ フトン： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ｐ．２２３−２４７）とによって行った 。前記タンパク質を、ポリブレンとＮａＣｌとでプレサイクルしたトリフルオロ 酢酸−処理グラスファイバーディスクに負荷した。ＰＴＨ−アミノ酸分析を、デ ュアルシュリンジポンプと逆相（Ｃ−１８）小口径カラムを使用したマイクロ液 体クロマトグラフィシステム（モデル１２０）で行った（アプライド・バイオシ ステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），２．１ｍｍ ｘ ２５０ ｍｍ）。 ＲＮＡを、標準手順（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他，Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２））によってラッ ト１−ＥＪ細胞から分離し、 ポリ（Ａ）⁺をｒＲＮＡ分離キット（クロンテック・ラボ・インコーポレイテッ ド，カリフォルニア州，パロ・アルト）を使用して選別した。ｃＤＮＡをＳｕｐ ｅｒｓｃｒｉｐｔキット（ビー・アール・エル・ライフ・テクノロジーズ・イン コーポレイテッド（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．） ，メリーランド州，ベテスダ）で合成した。カラム−細分化−二重ストランドｃ ＤＮＡをＳａｌ１及びＮｏｔ１−消化ｐＪＴ−２プラスミドベクター、ｐＣＤ− Ｘベクターの派生物に結合し（オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびベルク（Ｂｅ ｒｇ），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３））、電気泳動に よってＤＨ１０ＢＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した（ダウアー（Ｄｏｗｅｒ）他 、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７（１９８８））。約５ｘ１０⁵ の一次形質転換物が、Ｎ−末端のＮＤＦ（残基５−２４）とＴ４０．４トリプ シンペプチド（残基７−１２）のタンパク質配列から由来の２つのオリゴヌクレ オチドプローブによってスクリーニングされた。これらのそれぞれの配列は以下 の通りである（Ｎはすべての４ｎｔを示す）： 前記合成オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ヌクレオチドキナーゼにより、［γ−³² Ｐ］ＡＴＰによって末端標識化し、これらを使用してニトロセルロースフィルタ の複製セットをスクリーニングした。そのハイブリッド化溶液は、６ｘＳＳＣ， ５０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ６．８）と、０．１％のピロ燐酸ナトリウム、 ２ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡと、２０％のフォ ルムアミドを含有（プローブ１について）又はフォルムアミド０％（プローブ２ について）を含んでいた。フィルタを、５０℃で０．５ｘＳＳＣ，０．２％ＡＳ Ａ，２ｍＭＥＤＴＡによって（プローブ１について）、又は３７℃で２ｘＳＳＣ ，０．２％ＳＤＳ，２ｍＭ ＥＤＴＡによって（プローブ２について）、洗浄し た。これらフィル タのオートラジオグラフィは、両方のプローブとハイブリッドした１０のクロー ンを示した。これらのクローンを、前述のような再プレート化とプローブハイブ リッドによって精製した。アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサとＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｔａｑ ＤｙｅＤｏｘｙ^TM ターミネータサイクル配列決定キ ットとを、該製造業者の指示に従って使用して、前記ｃＤＮＡクローンの配列決 定をした。いくつかの場合においては、配列は、［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ）及びＵ．Ｓ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓのＳｅｑｕｅｎａｓｅ^TMキット を使用することによって得られた。ｃＤＮＡクローン４４の両方のストランドは 、合成オリゴヌクレオチドをプライマとして使用することによって配列決定され た。ほぼ５’３５０ｎｔの配列が、７つの独立したｃＤＮＡクローンにおいて決 定された。その結果、得られたクローンは、図３０示すパターンを示した（ＮＤ Ｆ）。 例１０ 他の可能なスプライシング変異体の検出戦略 ウシのｃＤＮＡクローンとＰＣＲ生成物の推定アミノ 酸配列、及び公表されているヒト（図３１）とラット配列との整合性は、高いレ ベルの類似性を示しており、これはこれらの配列が３つの種の中の相同遺伝子由 来のものであることを示している。ｃＤＮＡ／ＰＣＲ生成物レベルにおいて検出 可能なメッセンジャＲＮＡ転写体の数が変化するのは、恐らく、広範囲な組織− 特異スプライシングに依るものと思われる。得られた、そして図３０に示すパタ ーンは、その他のスプライシング変異体が存在することを示唆している。可能な スプライシング変異体のリストが図３７に示されている。これらの変異体の多く は、様々な組織から由来のｃＤＮＡライブラリのコード・セグメント特異なプロ ーブ化と、特定のコード・セグメントに特異的なプライマ対を使用したＰＣＲ実 験とによって得ることが出来る。あるいはこれに代えて、これら変異体は、当業 者の公知の切断およびスプライス技術により、特異なｃＤＮＡクローン、ＰＣＲ 生成物また又はゲノムＤＮＡ領域から組み立てることも可能である。例えば、共 通のコード・セグメント（例えば、Ａ）中の稀な制限酵素切断サイトを使用して 、ＧＧＦ２ＢＰＰ５のＦＢＡアミノ末端を、ＧＧＦ２ＢＰＰ１、ＧＧＦＢＰＰ２ 、ＧＧＦＢＰＰ３、又はＧＧＦＢＰＰ４のカルボキシ末端配列に接続することが できる。コード・セグメントＥ及 び／又はＧの存在または不在が、目的とし、又既述の用途のために有利である場 合には、これらのコード・セグメントを、発現コンストラクトに含ませることが できる。これらの変異体配列は、組替えシステム中に発現させることができ、そ の組替え生成物を分析して、そのシュワン細胞分裂誘発活性のレベルと、そのｐ １８５^erbB2レセプタに結合しこれを活性化する能力とを測定することができる 。 例１１ ＧＧＦの機能要素の同定 ＧＧＦ配列のファミリの推定構造は、その最長の形状（ＧＧＦ２ＢＰＰ４によ って表される）が、細胞外部分が上皮細胞成長因子に類似するドメインを含む場 合に、経膜タンパク質をコードすることを示している（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａ ｎｄ Ｗａｈｌ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎ ｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｉ ｐｐ．６９〜１３３，Ｓｐｒｉｎｇ ｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ １９９１参照）。コード・セグメントＣ及びＣ／Ｄ 又はＣ／Ｄ’ペプチド配列におけるシスチン残基の位置は、 上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ペプチド配列における相同残基に対して保存されて いる（図３５、配列認識番号１５１〜１５３参照）。これは、前記細胞外ドメイ ンが、レセプタ認識および生物学的活性サイトとして機能することを示唆してい る。変異体形状の内のいくつかは、Ｈ，Ｋ及びＬコード・セグメントを欠如して おり、従って、分泌、拡散可能生物学的活性タンパク質として発現可能である。 ＥＧＦ状ドメイン（ＥＧＦＬ）を含むポリペプチドをコードするＧＧＦ ＤＮＡ 配列は、グリア細胞分裂誘発活性を刺激するための十分な生物学的活性を有して いる可能性がある。 このタンパク質の膜結合バージョンは、胚形成中または、神経再生中（ニュー ロンの表面が増殖シュワン細胞の表面に密接に関連している場合）にニューロン の表面に発現された場合、シュワン細胞の増殖を誘発する可能性がある。 分泌（非膜結合）ＧＧＦは、シュワン細胞とその分泌位置からいくらか離れた 位置において作用することが可能な分類上拡散可能な因子として作用する可能性 がある。他の形態も、細胞の損傷や細胞の破壊を通じた源から細 胞内から放出される可能性がある。分泌ＧＧＦの一例は、ＧＧＦ２ＨＢＳ５によ ってコードされるタンパク質であり（例６参照）、これは細胞の外部に向けられ ることが判った唯一のＧＧＦである（例７）。分泌は、恐らく、ＧＧＦ２ＨＢＳ ５によってコードされる組替えＧＧＦ−ＩＩ中に含まれるＮ−末端ドメインであ って、領域Ｅにおいてのみ見られるＮ−末端疎水性配列によって仲介される。 他のＧＧＦは、分泌されるものではないように思える（例６参照）。これらの ＧＧＦは、組織の損傷の結果として放出される損傷反応形態であるのかもしれな い。 ＧＧＦ−ＩＩ（ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコードされる）の予想タンパク質構 造の他の領域と、領域Ｂ及びＡを含む他のタンパク質とは、ヒト基底膜ヘパラン 硫酸プロテオグリカン核タンパク質（ｒｅｆ．）に対する類似性を示す。これら のＧＧＦにおけるＣ２免疫グロブリンフォールドの第２システインの隣に位置す るペプチドＡＤＳＧＥＹは、基底薄膜タンパク質に見られる２２のＣ−２反復の 内の９つに発生する。この証拠は、これらのタンパク質が、ニューロンやグリア 等に関連するマト リックスタンパク質に関連していることを強く示唆するものであり、その目標サ イトとしてのグリア成長因子の隔離の方法を示唆している可能性がある。 例１２ 組替え細胞からのＧＧＦの精製 その生物学的活性を分析するべく完全長ＧＦＦあるいはＧＧＦの部分を得るた めに、タンパク質を、クローン化ＤＮＡを使用して過剰生産することができる。 いくつかの方法が使用可能である。前述の配列を有する組替えＥ．ｃｏｌｉ細胞 を構築することができる。ｐＮＨ８ａやｐＨＨ１６ａ（ストラトジェン・インコ ーポレイテッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．））等の発現システムをその 製造業者の指示に従ってこの目的のために使用することができる。あるいはこの 代わりに、これらの配列を、ほ乳類発現ベクターに挿入して、過剰生産細胞系を 構築することができる。例えば、この目的のために、ＧＧＦをコードするＤＮＡ 、クローンＧＧＦ２ＢＰＰ５を、ＣＯＳ細胞と、チャイニーズハムスタの卵巣細 胞との両方に発現させた（例７参照）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，３５ ２１〜３５２７（１９８１））。 このＧＧＧＦ ＤＮＡを有するベクターを、公知の手法を使用してホスト細胞に 移入することができる。 一過的発現を調べるか、もしくは、Ｇ４１８耐性クローンを、メトトレキサー トの存在下おいて成育させることにより、ｄｈｆｒ遺伝子（ｐＭＳＸＮＤベクタ ー上に含まれる）を増幅し、その過程において、隣接のＧＧＦタンパク質コード 配列を共増幅する細胞を選別することができる。全く血清やタンパク質を含まな い培地（ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）およびハム（Ｈａｍ），Ｉｎ Ｖｉｔ ｒｏ １３，５３７〜５４７（１９７７））中に、ＣＨＯ細胞維持することがで きるので、所望のタンパク質は、その培地から精製することが可能である。例９ において作られた抗血清を使用したウェスタン分析を使用して、前記過剰生産細 胞の調整培地中における所望のタンパク質の存在を検出することができる。 所望のタンパク質（ｒＧＧＦ−ＩＩ）を、次のようにして、ＣＯＳ細胞を一過 的に発現させることによって調整した培地から精製した。ｒＧＧＦ−ＩＩを、調 整培地から収穫し、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＰＯＲＯＳ−ＨＳ）を使用 して部分精製した。前記カラムを、 ３３．３ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０で平衡化した。調整培地を、１０ｍｌ／分の 流量で負荷した。シュワン細胞増殖活性と免疫反応性（ポリクローナル抗血清を 上述のようにＧＧＦＩＩペプチドに対して使用した）とを有するピークを、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ，１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．０で溶出した（それぞれ、図５０Ａ 及び５０Ｂ）。 ｒＧＧＦ−ＩＩも、安定したチャイニーズハムスタの卵巣細胞系を使用して発 現される。収穫された調整培地からのｒＧＧＦ−ＩＩを、陽イオン交換クロマト グラフィ（ＰＯＲＯＳ−ＨＳ）を使用して部分精製した。前記カラムを、ＰＢＳ ｐＨ７．４によって平衡化した。調整培地を、１０ｍｌ／分で負荷した。シュ ワン細胞増幅活性と免疫反応性（ＧＧＦ−ＩＩポリクローナル抗血清を使用）と を有するピークを、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０ で抽出した。増殖性と免疫反応性の両方を備えた別のピークが、５０ｍＭ Ｈｅ ｐｅｓ，１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．０で観察された。 ｒＧＧＦ−ＩＩは、高分解能工程として疎水性反応クロマトグラフィ（陽イオ ン交換／リザーブフェーズクロマトグラフィ（必要な場合には第２高分解能工程 として）、 陰イオン交換クロマトグラフィのようなウィルス不活性化工程およびＤＮＡ除去 工程、を使用することによって更に精製することができる。 使用した手法の詳細な記述は以下の通りである。 前記陽イオン交換カラムから抽出した組替えＧＧＦ−ＩＩピークのシュワン細 胞増幅活性は、以下のようにして測定した。培養シュワン細胞の細胞分裂誘発反 応を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ １Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．０によって抽出したピー クを使用して５Ｍ フォルスコリンの存在下において測定した。前記ピークは、 ２０ １，１０ １（１：１０）１０ １及び（１：１００）１０ １で添加し た。¹²⁵Ｉ−ウリジンの組み込みを測定し、１８〜２４時間の露光後に（ＣＰＭ ）として表現した。 ＧＧＦ−ＩＩのペプチドに対して発育させたポリクローナル抗体を使用した免 疫ブロットを、次のようにして行った。１０μｌの異なったフラクションを、４ 〜１２％のグラジエントゲルでランさせた。これらのゲルを、ニトロセルロース 紙に移し、このニトロセルロースブロッ トを５％のＢＳＡでブロックし、ＧＧＦ−ＩＩ−特異抗体（１：２５０希釈）で プローブした。¹²⁵Ｉ タンパク質Ａ（１：５００希釈、特異的活性＝９．０／ Ｃｉ／ｇ）を、二次抗体として使用した。前記免疫ブロットを、コダック社Ｘ線 フィルムに６時間露光した。１Ｍ ＮａＣｌで溶出したピークフラクションは、 ６５〜９０Ｋｄにおいて、ＧＧＦ−ＩＩと高分子量グリコフォームの予想サイズ 範囲である，広い免疫反応性バンドを示した。 陽イオン交換カラムでのＧＧＦ−ＩＩ精製は以下のように行った。ｒＧＧＦＩ Ｉを発現するＣＨＯ細胞調整培地を、１０ｍｌ／分で前記陽イオン交換カラムに 負荷した。このカラムを、ＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化した。溶出は、それぞれ 、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０と５０ｍＭ Ｈｅ ｐｅｓ １Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．０とで行った。すべてのフラクションを、こ こに記載のシュワン細胞増殖分析（ＣＰＭ）を使用して分析した。タンパク質濃 度（ｍｇ／ｍｌ）は、ＢＳＡを標準として使用したＢｒａｄｆｏｒｄ分析によっ て測定した。 １０μｌの各フラクションを使用したウェスタンブロ ットを行った。図５１Ａ及び５１Ｂに示すように、免疫反応性とシュワン細胞活 性とは相互移動する。 前述のシュワン細胞分裂誘発分析を使用して、完全長クローン又はその全ての 物学的活性部分からの発現生成物の分析を行った。完全長クローンＧＧＦ２ＢＰ Ｐ５が、ＣＯＳ細胞に一過的に発現された。移入されたＣＯＳ細胞の細胞内抽出 物は、例１に記載したシュワン細胞増殖分析により分析した時に生物学的活性を 示す。更に、ＧＧＦ２ＨＢＳ５を発現する完全長に近いものが、ＣＨＯと昆虫（ 例７）細胞とに一過的に発現された。この場合、細胞抽出物と調整培地との両方 が、例１に記載したシュワン細胞増殖分析において生物学的活性を示す。当業者 によって、ＧＧＦ（ヘレグリンを含む）からのスプライシング変異体補足性ＤＮ Ａのファミリのすべてのメンバを、このようにして発現させ、シュワン細胞増殖 分析において分析することができる。 あるいは、組替え物質を、ＣＯＳ−７細胞においてスプライシング変異体Ｎｅ ｕ分化因子（ＮＤＦ）を発現させたウェン（Ｗｅｎ）他（Ｃｅｌｌ ６９，５５ ９（１９９２））に従って、他の変異体から分離すること ができる。ｐＪＴ−２真核生物プラスミドベクターに挿入したｃＤＮＡクローン は、ＳＶ４０初期プロモータのコントロール下にあり、ＳＶ４０終結およびポリ アデニール化信号に３’で挟まれている。ＣＯＳ−７細胞は、以下のようにして 、電気ポレーションによって、ｐＪＴ−２プラスミドＤＮＡで移入された。即ち 、６ｘ１０⁶の細胞を（０．８ｍｌのＤＭＥＭと１０％のＦＥＢＳにおいて）、 ０．４ｃｍのキュベットに移し、１０μｌのＴＥ溶液中（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）にて２０μｇのプラスミドＤＮＡと 混合した。電気ポレーションは、パルスコントローラユニットを２００オームに 設定したＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｕｌｓｅｒ装置を使用して、室温で、１６００Ｖ、 ２４μＦで行った。次に、細胞を、２０ｍｌのＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ中に希釈 し、Ｔ７５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中に移した。３７℃における１４時間の培 養後、培地を、ＤＭＥＭ，１％ ＦＢＳと置換し、培養を更に４８時間継続した 。細胞から収穫した組替えタンパク質を含む調整培地は、このタンパク質のレセ プタを発現する細胞系において生物学的活性を示した。この細胞系（ヒト乳ガン 細胞ラインＡＵ５６５）を、組替え物質で処理した。処理された細胞は、ｅｒｂ Ｂ２レセプタの活性化に特徴 的な形態変化を示した。このタイプの調整培地も、シュワン細胞増殖分析におい てテストすることが出来る。 例１３ ｐ１８５^erbB2レセプタに結合する 他のタンパク質の精製と分析 Ｉ．ｇｐ３０とｐ７０との精製 ここに参考文献として提示するルプ（Ｌｕｐｕ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４ ９ ，１５５２（１９９２））及びリップマン（Ｌｉｐｐｍａｎ）およびルプ（Ｌ ｕｐｕ）（特許出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３４４３（１９９０））は、以 下のようにして、ヒト乳ガン細胞ラインＭＤＡ−ＭＢ−２３１の調整培地からタ ンパク質を精製した。 調製培地採取を、周知の方法を用いて行った。培地を、Ａｍｉｃｏｎ 限外 濾過フィルタセル（ＹＭ５膜）（Ａｍｉｏｎ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）中にて１ ００倍に濃縮した。浄化し濃縮した後、培地を、−２０℃で保存し、一方、連続 採取を以後数日の間に行った。濃縮培地を、４℃で２日間にわたり、１００容量 の０．１Ｍの ービング（スペクトラム・メディカル・インダストリーズ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ），カリフォルニア州，ロス・アンジェ ルス）を使用して透析した。透析中に沈澱した物質を、４℃で３０分間、４００ ０ｒｐｍでの遠心分離処理によって除去し、プロテアーゼインヒビタを添加した 。次に、浄化したサンプルを凍結乾燥した。 凍結乾燥した調整培地を、全タンパク質が約２５ｍｇ／ｍｌの最終濃度とな るように、１Ｍの酢酸中に溶解させた。不溶性物質は、１０，０００ｒｐｍで１ ５分間の遠心分離処理によって除去した。次に、このサンプルをセファーデック ス Ｇ−１００カラム（ＸＫ １６，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａ ｙ，ＮＪ）に負荷し、平衡化し、更に、これに、４℃で１Ｍの酢酸を３０ｍｌ／ 時間の流量で上方に流すことによる溶出を行った。４ｍｌの１００倍濃縮培地か ら、１００ｎｇのタンパク質が処理された。３ｍｌの溶出物を含むフラクション を、凍結乾燥させ、分析用に３００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させ、更なる精製の ための原料として利用した。 セファーデックス Ｇ−１００精製物を、逆相高圧液体クロマトグラフィ（ ＨＰＬＣ）でランした。第１の工程には、急勾配のアセトニトリルグラジエント を使用した。急勾配アセトニトリルグラジエントと他のすべてのＨＰＣＬ工程と は、Ｃ３−逆相カラムを、水中（ＨＰＬＣ−グレード）０で０．０５％のＴＦＡ （トリフルオロ酢酸）によって平衡化した後に、室温で行った。これらのサンプ ルを負荷し、フラクションは、１ｍｌ／分の流量で３０分間に渡って、リニアグ ラジエント（０．０５％のＴＦＡ中で０−４５％のアセトニトリル）で溶出した 。２８０ｎｍで吸収が観察された。１ｍｌのフラクションを採取し、ＥＧＦレセ プタ−競合活性の分析の前に凍結乾燥させた。 第２のＨＰＬＣ工程には、緩勾配アセトニトリルグラジエントを使用した。 前のＨＰＬＣ工程からの活性フラクションのプールを、同じカラムに関して再び クロマトグラフィ分析した。０．０５％のＴＦＡ中で５分間の０−１８％アセト ニトリルグラジエント後に、０．０５％のＴＦＡ中で３０分間のリニアな１８− ４５％アセトニトリルグラジエントにて、溶出を行った。流量は１．０ｍｌ／分 で、１ｍｌのフラクションが採取された。ヒトＴＧＦα− 状因子が、３０〜３２％のアセトニトリル濃度で、ＲＲＡによる検出可能な１つ のピークとして溶出した。 ルプ（Ｌｕｐｕ）他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９，２２ ８７（１９９２））は、ｐ１８５^erbB2レセプタに結合する別のタンパク質を精 製した。この特定のタンパク質、ｐ７５、は、１０％の胎児ウシ血清（ＧＩＢＣ Ｏ）を補足した改良Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＩＭＥＭ： ＧＩＢＣＯ）中で繁殖さ せたＳＫＢｒ−３（ヒト乳ガン細胞系）の成長に使用される調整培地から精製さ れたものである。タンパク質ｐ７５は、ｐ１８５^erbB2アフィニティーカラムを 使用した濃縮（１００倍）調整培地から精製された。ｐ１８５^erbB2の９４キロ ダルトン細胞外ドメイン（ｐ７５に結合）を、組替え発現によって生成し、ポリ アクリルアミドヒドラジド−セファローズアフィニティークロマトグラフィマト リックスに結合させた。結合後、前記マトリックスを、氷冷した１．０Ｍ ＨＣ ｌ中で十分に洗浄し、そのビーズを０．５Ｍ ＮａＮＯ₂で活性化させた。温度 は２０分間、０℃に維持し、その後に、濾過と、氷冷した０．１Ｍ ＨＣｌでの 洗浄を行った。５００ｍｌの濃縮調整培地を、重力によって前記ビーズに流した 。カラム を洗浄し、１．０Ｍのクエン酸で、４．０から２．０のｐＨ値で（ｅｒｂＢ２と ｐ７５を分離させるため）ステップ的に溶出させた。すべてのフラクションを、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ１０カラム上で脱塩させた。精製によって、３．０〜 ３．５溶出ｐＨで７５ｋＤａの均一なポリペプチドが得られた（銀着色によるＳ ＤＳ／ＰＡＧＥでの分析によって確認）。ＩＩ．ｇｐ３０のｐ１８５^erbＢ２への結合 精製ｇｐ３０タンパク質を、それがｐ１８５^erbB2に結合したか否かを調べ る分析においてテストした。ｐ１８５^erbB2に対するモノクローナル抗体を備え た競合アッセイ。ｇｐ３０タンパク質は、ＳＫ−ＢＲ−３及びＭＤＡ−ＭＢ−４ ５３細胞（ｐ１８５^erbB2レセプタを発現するヒト乳ガン細胞系）中でＰ１８５^{e rbB2} に結合する抗体を置換した。ｇｐ３０のシュワン細胞増殖活性は、さらに、 シュワン細胞培養物を、例１〜３に記載の分析手法を使用して、精製ｐｇ３０に よって処理することによっても示すことができる。ＩＩＩ．ｐ７５のｐ１８５^erbB2への結合 ＳＫＢｒ−３調整培地から得た７５ｋＤａのポリペ プチド（ｐ７５）が実際に、ＳＫＢｒ−３細胞中のｅｒｂＢ２ガン・タンパク質 のためのリガンドであるのか否かを分析するために、ｇｐ３０のための前述の競 合アッセイを使用した。ｐ７５が結合活性を示すことが判ったが、これに対して 、他のクロマトグラフィフラクションからの物質はそのような活性を示さなかっ た（データは図示せず）。通過物質は、いくらかの結合活性を示した。これは、 抜け出たｅｒｂＢ２ ＥＣＤの存在によるものであろう。ＩＶ．他のｐ１８５^erbB2リガンド ペレス（Ｐｅｌｅｓ）他（Ｃｅｌｌ ６９，２０５（１９９２））は、更に 、ラット細胞（ＮＤＦ，その方法については例８参照）からのｐ１８５^erbB2刺 激リガンドをも精製した。ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５ ６ ，１２０５（１９９２））は、ｐ１８５^erbB2に結合し、これを刺激する、ヒ ト細胞からのヘレグリンαを精製した（例６参照）。ここに参考として提示する 、タラコフスキー（Ｔａｒａｋｏｖｓｋｙ）他Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：２１８（ １９９１）は、活性化マクロファージから分離された２５ｋＤのポリペプチドの 、ｐ１８５^erbB2 相同体である、Ｎｅｕレセプタへの結合を示した。ＶＩ．ＮＤＦの分離 ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）およびペレス（Ｐｅｌｅｓ）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ ３０，３５４３（１９９１））は、ｐ１８５^erbB2レセプタを刺激す るであろう３５キロダルトンのグリコタンパク質を同定した。このタンパク質は 、次の手法に従って調整された培地中において同定された。ラットＩ−ＥＪ細胞 を、１７５−ｃｍ²フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中で集合成長させた。単層を、Ｐ ＢＳで洗浄し、無血清培地中にて１０〜１６時間放置した。前記培地を廃棄し、 新たな無血清培地によって置換し、３日間の培養後に採取した。調整培地を、低 速遠心分離によって浄化し、ＹＭ２膜（分子量２０００でカットオフ）を備えた Ａｍｉｃｏｎ 限外濾過セル中で１００倍に濃縮した。調整培地におけるｎｅｕ 刺激活性の生化学的分析は、前記リガンドが、熱に対しては安定しているが還元 に対しては敏感な３５−ｋＤグリコタンパク質であることを示している。該因子 は、高い塩濃度か、酸性アルコールのいずれかによって沈澱させることができる 。選択的沈澱、ヘパリン−アガロースクロマトグラフィ、 及び希釈酸中でのゲル濾過によって前記分子を部分精製することにより活性リガ ンドが得られ、これはがん原遺伝子のレセプタを刺激することが出来るが、構造 的に活性ながん遺伝子ｎｅｕタンパク質に対しては無効果であった。しかしなが ら、この精製されたフラクションは、ＥＧＦのための関連レセプタをも刺激する 能力を保持しており、これはこれらの２つのレセプタが、双方向メカニズムを介 して機能的に結合していることを示唆するものである。あるいは、前記推定リガ ンドは、同時に２つのレセプタと反応する。該因子の、提示された生化学的特徴 を利用して、これらの可能性が探求される完全に精製された因子を達成すること ができる。 他の出版物において、デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）他（Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉ ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９，１５３６（１９９１），Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，８５８２（１９９１）およびグリーン（ Ｇｒｅｅｎ）他，ＰＣＴ特許出願 ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２３３１（１９９０） ）は、ヒトＴ−細胞（ＡＴＬ−２）系の調整培地からのタンパク質の精製につい て記載している。 ＡＴＬ−２細胞系は、ＩＬ−２独立ＨＴＬＶ−１（＋）Ｔ細胞系である。無 マイコプラズマＡＴＬ−２細胞を、５％のＣＯ₂を含む加湿雰囲気中において３ ７℃で、培養培地として１０％のＦＣＢを含有するＲＰＭＩ １６４０（１０％ ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０）培地中に保持した。 タンパク質物質の精製のために、ＡＴＬ−２細胞を、１ｘＰＢＳで２回洗浄 し、７２時間、無血清ＲＰＭＩ １６４０培地／２ｍＭ Ｌ−グルタミン中で３ ｘ１０⁵ｍｌで培養し、その後、前記細胞をペレット化した。このように生成し た培養上清を、”調整培地”（Ｃ．Ｍ．）と称する。 Ｃ．Ｍ．を１０００ｄカットオフのＹＭ−２Ｄｉａｆｌｏ膜（アミコン（Ａ ｍｉｃｏｎ），マサチューセッツ州，ボストン）を使用して、１リットルから１ ０ｍｌへと濃縮した。いくつかの分析用に、１０００ＭＷ以上の成分を含有する 濃縮Ｃ．Ｍ．を、ＲＰＭＩ培地によって、もとの容量に再希釈した。ポリアクリ ルアミドグラジエントゲル（インテグレイテッド・セパレーション・システムズ （Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ），メリーランド州，ハイド・パーク又 はフォアキャスト・システム・バイ・アマーシャム（Ｐｈｏｒｅｃａｓｔ Ｓｙ ｓｔｅｍ ｂｙ Ａｍｅｒｓｃｈａｍ），イリノイ州，アーリントン・ハイツ） を使用してゲル電気泳動にかけ、その後、前記１リットルの調合物からのこの２ つのカラム精製物資の幾らかを銀着色したところ、少なくとも４〜５のバンドが 現れ、これらの内、１０ｋＤと２０ｋＤとのバンドがこの物質に特有のものであ った。通過した、１０００ ＮＷ以下のＣ．Ｍ．含有成分は希釈せずに使用した 。 濃縮調整培地を、．４５μ ユニフロフィルタ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａ ｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）でフィルタ殺菌し、次に、予め１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．１で平衡化させておいたＤＥＡＥ−ＳＷ陰イオ ン交換カラム（ウォーターズ・インコーポレイテッド（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ． ），マサチューセッツ州，ミルフォード）への適用によって更に精製し、一ラン のＨＰＬＣ当り１リットルの元のＡＴＬ−２調整培地を表す濃縮Ｃ．Ｍ．タンパ ク質を、前記カラムに吸着させ、次に、４ｍｌ／ 分の流量で、０ｍＭから４０ｍＭのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出した。 フラクションを、１０％の適当なＤＥＡＥフラクション（１カラム精製物）又は １％の適当なＣ１８フラクション（２カラム精製物）に対するインヴィトロ免疫 複合体キナーゼ分析を使用して、分析した。このインヴィトロ免疫複合体キナー ゼ分析を使用して投与量−依存的にｐ１８５ｃ−ｎｅｕのチロシンキナーゼ活性 を増加させた活性物質は、２２０〜２４０ｍＭのＮａＣｌの近辺での４〜５のフ ラクション（３６〜４０）に渡って１つの主要ピークとして溶出した。ＨＰＬＣ −ＤＥＡＥ精製後、前記活性フラクション中のタンパク質を、濃縮、プールして 、更に濃縮し、その後、Ｃ１８（百万マトリクス）逆相クロマトグラフィ分析し た（ウォーターズ・インコーポレイテッド（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．），マサチ ューセッツ州，ミルフォード）（Ｃ１８＋１工程または２カラム精製物と称する ）。溶出は、０．１％のＴＦＡに対する２−プロパノールのリニアグラジエント で行った。すべてのフラクションを、ＲＰＭＩ１６４０培地に対して透析して２ −プロパノールを除去し、下記のように、前記インヴィトロ免疫複合体キナーゼ 分析と、適当なフラクションの１％濃縮物を使用して分析 した。ｐ１８５ｃ−ｎｅｕのチロシンキナーゼ活性を増加させる活性物質は、２ つのピークで抽出された。１つはフラクション１１〜１３において溶出し、第２ 番目の僅かに低い活性の活性物質ピークは、フラクション２０〜２３において溶 出した。これらの２つのピークは、それぞれ、約５〜７％のイソプロパノールと 約１１〜１４％のイソプロパノールとに対応している。Ｃ１８＃１発生フラクシ ョン１１〜１３を、特徴づけ研究に使用した。第２クロマトグラフィ工程から得 られた活性フラクションをプールし、タンパク質物質サンプルに指定した。 ２０リットルの調合も同じ精製戦略を使用した。前記ＤＥＡＥ活性フラクシ ョン３５〜４１をプールし、前述のようにしてｃ１８クロマトログラフィ分析に かけた。Ｃ１８＃１フラクション１１〜１３と２１〜２４との両方が、投与量− 依存活性を有していた。フラクション１１〜１３のプールを、更にＣ１８クロマ トグラフィ分析工程にかけた（Ｃ１８＃２又は３カラム精製物と称する）。ここ でも再び、フラクション１１〜１３と２１〜２４とが活性を有していた。例８で 記載のインヴィトロ免疫複合体キナーゼ分析において測定 されたフラクション２３の投与量反応は、フラクション２３を容量で０．００５ ％、フラクション２３を容量で０．０５％添加することによって得られる。これ は達成された最も高い純度である。 分子量の範囲を、ゲル濾過クロマトグラフィ分析と限外濾過膜分析とに基づ いて測定した。ほぼ同じ量のチロシンキナーゼ活性を、保持し、１０，０００分 子量カットオフフィルタにより通過した。ほとんどすべての活性物質が、３０， ０００分子量カットオフフィルタを通過した。活性物質クロマトグラフフラクシ ョンの分子量範囲を、投与量−依存ｎｅｕ−活性化活性物質を含むフラクション を、同じ実行条件を使用して発生された一組のタンパク質分子量標準（シグマ・ ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ミズーリ州， セント・ルイス）の溶出プロフィールと比較することによって決定した。活性物 質の低分子量の領域が、７，０００と１４，０００ダルトンの間に見つかった。 活性物質の第２の範囲は、約１４，０００から約２４，０００ダルトンの間であ った。 ポリアクリルアミドグラジエントゲル（インテグレイテッド・セパレーショ ン・システムズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｓ，メリーランド州，ハイド・パーク又はフォアケース・システム・バイ・アマ ーシャム（Ｐｈｏｒｅｃａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ Ａｍｅｒｓｃｈａｍ）， イリノイ州，アーリントン・ハイツ）を使用した電気泳動後、３−カラム精製物 質（ｃ１８＃２）の銀着色を、市販の銀着色キット（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｏｃｋｖ ｉｌｌｅ Ｃｅｎｔｒｅ，ＮＹ）を使用して行った。２０リットルの調合物のｃ １８＃２精製から得られたフラクション２１，２２，２３及び２４を、マーカと ともにランさせた。フラクション２２と２３とが、１８５^erbB2（ｎｅｕ）キナ ーゼ分析（下記参照）において最も強力な投与量反応を示した。選択された分子 量フラクションがｐ１８５^erbB2と作用するという事実が、免疫複合体キナーゼ 分析によって示された。 ここに参考文献として提示するフアング（Ｈｕａｎｇ）他（１９９２，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１１５０８〜１１５１２）は、ウシの腎臓から別 の ｎｅｕ／ｅｒｂ Ｂ２リガンド成長因子を分離した。２５ｋＤのポリペプチド因 子が、カラム分別の手法によって分離され、次いで、ＤＥＡＥ／セルロース（Ｄ Ｅ５２）、Ｓｕｌｆａｄｅｘ（硫酸エステル化されたセファーデックス Ｇ−５ ０）、ヘパリン−セファローズ４Ｂ、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５（高速タン パク質液体クロマトグラフィ）で連続カラムクロマトグラフィ分析された。前記 因子、ＮＥＦ−ＧＦ、は、ｎｅｕ／ｅｒｂ Ｂ２遺伝子生成物のチロシン−特異 性自己燐酸化を刺激する。ＶＩＩ．ｐ１８５^erbＢ２に結合するリガンドに対する 免疫複合体分析ＮＤＦ この分析は、ＡＴＬ−２調整培地（Ｃ．Ｍ．）又はタンパク質物質を変量さ せながらＰＮ−ＮＲ６細胞溶解物の予備培養によって推進した、免疫沈降したｐ １８５の自己燐酸化活性物質における相違を示すものであって、これをここでｎ ｅｕ−活性化活性物質と称する。 免疫複合体キナーゼ分析において使用した細胞系は、ここにその全部を参考 文献として添付する、コカイ （Ｋｏｋａｉ）他，Ｃｅｌｌ ５５，２８７〜２９２（Ｊｕｌｙ ２８，１９８ ９）と、これもその全部を参考文献として提示する、マーク・アイ・グリーン（ Ｍａｒｋ Ｉ．Ｇｒｅｅｎ）の名のもとに”アンチ−レセプタ抗体によってがん 細胞を治療する方法”という名称で１９８９年７月２７に出願された米国出願第 ３８６，８２０号とに記載の方法によって、入手、調合、培養したものである。 細胞ラインは、すべて、５％のＣＯ₂を有する加湿雰囲気中において、培養 培地として５％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地（５％ ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）中 に維持した。 １５０ｍｍディシュ中の細胞の濃縮培養物を、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、 １０ｍｌの冷凍−解凍バッファ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ₂， ２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．２，１０％グリセロール，１ｍＭ ＥＤＴＡ， １％アプロチニン）中に掻き入れ、遠心分離（６００ｘ６，１０分間）した。細 胞ペレットを、１ｍｌの溶出（Ｌｙｓｉｓ）バッファ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ， ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３％ Ｂｒｉｊ ３５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，１％アプロチニン，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２０μＭ Ｎａ₃ＶＯ₄，１０％ グリ セロール）中で再懸濁させ、４℃で３０分間回転させた。すべての化学物質は、 特に明記のない限り、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏ．），ミズーリ州，セント・ルイスからのものであった。非溶解物 質を、４０，０００ｘｇで３０分間の遠心分離によって除去した。次に使用する クリアな上清を、細胞溶出物と指定する。 前記細胞溶出物を、５０μｌの５０％（容量／容量）タンパク質Ａ−セファ ローズ（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ ．），ミズーリ州，セント・ルイス）と、１５分間培養し、２分間の遠心分離で 、溶出物を予備浄化した。この予備浄化細胞溶出物の５０μｌ部分を、調整培地 、タンパク質物質、または特定の他の因子とともに、溶出バッファと１ｍｌの最 終容量で、氷上で１５分間培養した。次に、サンプルを、ｐ１８５ｎｅｕ及びｐ １８５ｃ−ｎｅｕを認識する５μｇの７．１６．４モノクローナル抗体または他 の適当な抗体と共に、氷上で２０分間 培養し、その後４℃で回転させながら、５０μｌの５０％（容量／容量）タンパ ク質Ａ−セファローズで培養した。免疫複合体を、遠心分離によって収集し、５ ００μｌの洗浄バッファ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ．７．５、０．１％，Ｂ ｒｉｊ ３５、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ アプロンチニン 、３０μｍ Ｎａ₃ＶＯ₄）で４回洗浄し、更に、反応バッファ（２０ｍＭ Ｈｅ ｐｅｓ（ｐＨ７．４）、３ｍＭ ＭｎＣｌ₂、及び０．１％ Ｂｒｉｊ ３５、 ３０μｍ Ｎａ₃ＶＯ₄）で２回洗浄した。ペレットを、５０μｌの反応バッファ 中で再懸濁させ、（ガンマー³²Ｐ）−ＡＴＰ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ），イリノイ州，アーリントン・ハイツ）を添加して０．２μｍの最終濃度を得 た。これらのサンプルを、２７℃で２０分間、又は純粋サンプルとともに４℃で ２５分間培養した。２ｍＭ ＡＴＰと２ｍＭ ＥＤＴＡとを含有する３ｘＳＤＳ サンプルバッファを添加することによって反応を終結させ、次に、これらを１０ ０℃で５分間培養した。これらのサンプルを、次に、１０％のアクリルアミドゲ ル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。ゲルを着色、乾燥し、強化スクリーンを 備えたＫｏｄａｋ ＸＡＲまたはＸＲＰフィルムに露光した。ＶＩＩＩ．活性を有するアセチルコリンレセプタ（ＡＲＩＡ）の精製 ＡＲＩＡ、即ち、アセチルコリンレセプタの合成を刺激する４２ｋＤのタン パク質が、Ｇｅｒａｌｄ Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ（フォールズ（Ｆａｌｌｓ）他Ｃ ｅｌｌ ７２：８０１〜８１５（１９９３））の実験室にて分離された。ＡＲＩ Ａは、ｐ１８５^erbB2に類似の１８５Ｋｄａ筋肉経膜タンパク質のチロシン燐酸 化を誘発し、培養胚筋管内のアセチルコリンレセプタ合成を刺激する。ＡＲＩＡ をコードするｃＤＮＡクローンの配列分析は、ＡＲＩＡが、タンパク質のＧＧＦ ／ｅｒｂＢ２リガンドグループのメンバであることを示しており、これは、グリ ア細胞分裂誘発を刺激や、ここに記載の例えばＧＧＦ２の適用に潜在的に有効で ある可能性を有している。 例１４ シュワン細胞中のＧＧＦによって仲介されたタンパク質チロシン燐酸化 増殖を誘発するための十分なレベルのグリア成長因子での処理の後、ラットシ ュワン細胞は、タンパク質チロシンの燐酸化の刺激を示す（図３６）。様々な量 の部分 精製ＧＧＦを、例３に概述した手法に従ってラットシュワン細胞の一次培養に適 用した。シュワン細胞を、ポリＤ−リジン被覆した２４のウェルプレート内の、 １ｍＬのＧＧＦ−ＣＭにつき（１ウェル当り０．５ｍＬ）ＤＭＥＭ／１０％胎児 子ウシ血清／５μＭ フォルスコリン／０．５μｇ中で発育させた。集合状態に おいて、前記細胞に、ウェル当り０．５ｍＬでＤＭＥＭ／１０％の胎児子ウシ血 清を供給し、培養器内に一晩放置して鎮静化させた。次の日、前記細胞に、０． ２ｍＬのＤＭＥＭ／１０％胎児子ウシ血清を供給し、培養器内で１時間放置した 。つぎに、テストサンプルを、必要に応じて、様々な濃度と長さで、前記培地に 直接添加した。次に、細胞を、沸騰している溶解バッファ（燐酸ナトリウム、５ ｍＭ，ｐＨ６．８； ＳＤＳ，２％，β−メルカプトエタノール、５％；ジチオ トレイトール、０．１Ｍ；グリセロール、１０％；ブロモフェノール ブルー， ０．４％；バナジウム酸ナトリウム，１０ｍＭ）中で溶解し、沸騰水浴中で１０ 分間培養し、次に、直接に分析するか、あるいは、−７０℃で冷凍した。サンプ ルは、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのランによって分析し、トウビン（Ｔ ｏｗｂｉｎ）他（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４３５０〜 ４３５４に記載の標準手法を使用してニトロセルロース上にエレクトロブロッチ ングした。ブロットされたニトロセルロースを、Ｋａｍｐｓ ａｎｄ Ｓｅｌｔ ｏｎ（１９８８） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２：３０５〜３１５に記載されている標 準方法を使用して、アンチホスホチロシン抗体でプローブした。プローブされた ブロットを、一晩オートラジオグラフィに露光し、標準実験室手法を使用して現 像した。濃度測定を、ウルトラスキャンＸＬ強化レーザ濃度計（ＬＫＢ）を使用 して行った。分子量指定は、予備染色高分子量標準（Ｓｉｇｍａ）に対して行わ れた。タンパク質燐酸化とシュワン細胞増殖の投与量反応は非常に類似している （図３６）。燐酸化バンドの分子量は、ｐ１８５^erbB2の分子量に非常に近い。 シュワン細胞を、ＧＧＦ２ＨＢＳ５クローンによってＣＯＳ細胞翻訳物から調整 した培地によって処理した場合にも類似の結果が得られた。これらの結果は、予 想されていた、ＧＧＦｓとの相互作用および１８５^erbB2の活性化とよく相関し ている。 この実験を組替えＧＧＦ−ＩＩで繰り返した。ＧＧＦ−ＩＩクローンで安定的 に形質転換したＣＨＯ細胞系（ＧＧＦ２ＨＢＳ５）からの調整培地は、上述の分 析を 使用して、タンパク質チロシン燐酸化を刺激する。疑似移入されたＣＨＯ細胞系 ではこの活性を刺激することは出来なかった（図５２）。 例１５ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系からのタンパク質因子によるシュワン細胞増殖の分 析 シュワン細胞の増殖は、ヒト乳ガン細胞ラインＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来の調 整培地によって媒介される。分析の第１日目、１０⁴個の一次ラットシュワン細 胞を、９６ウェル・ミクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレート中に、ウ ェル当り５％の胎児ウシプラズマを補足した１００μｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地内にプレート化した。分析の第２日目 、１０μｌの調整培地（例６に記載のように培養された、ヒト乳ガン細胞ライン ＭＤＡ−ＭＢ−２３１からのもの）を、前記ミクロタイタープレートの各ウェル に添加した。第６日目、各プレート当りのシュワン細胞の数を、酸ホスファター ゼ分析（コノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）他 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２ ：１３６（１９８６）の手法に従って）によって測定した。前記 プレートを、１００μｌの燐酸塩バッファ化塩水（ＰＢＳ）と１００μｌの反応 バッファ（０．１ｍ 酢酸ナトリウム，（ｐＨ５．５））と０．１％のトリトン （Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で洗浄し、各ウェル毎に、１０ｍＭの燐酸ｐ−ニト ロフェニルを添加した。プレートを３７℃で２時間培養し、１０μｌの１Ｎ Ｎ ａＯＨを添加することによって反応を終結させた。各サンプルの光濃度を、分光 光度計で４１０ｎｍで読み取った。コントロール細胞系（ＨＳ−２９４Ｔ，ｅｒ ｂＢ−２リガンドの非プロデューサ）からの調整培地によって処理したシュワン 細胞において細胞数の３８％の刺激が観察された。この結果は、ＭＤＡ−ＭＢ− ２３１細胞ライン（ｐ１８５^erbB2結合活性を刺激する）によって分泌されたタ ンパク質が、シュワン細胞の増殖を刺激することを示すものである。 例１６ ＧＧＦのＮ−グリコシル化 ＧＧＦ−ＩＩ候補クローンＧＧＦ２ＢＰＰ１，２及び３のｃＤＮＡ配列から予 測されるタンパク質配列は、多数のコンセンサスＮ−グリコシル化モチーフを有 している。ＧＧＦＩＩ０２ペプチド配列におけるギャップは、 これらのモチーフの１つにおけるアスパラギン残基に一致し、これは、このサイ トにおいて恐らく炭水化物が結合していることを示している。 ＧＧＦのＮ−グリコシル化を、タンパク質中において炭水化物とアスパラギン 残基との間の共有結合を切断する酵素であるＮ−グリカナーゼとの培養後におい てＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の移動度の変化を観察することによって調べた。 ＧＧＦ−ＩＩのＮ−グリカナーゼ処理によって、ＭＷ４０−４２ｋＤａの主要 なバンドと、４５−４８ｋＤａの副バンドとが得られた。非還元条件下における 活性物質溶出実験は、約４５−５０ｋＤａにおける１つの活性脱グリコシル化種 を示した。 ＧＧＦ−Ｉの活性物質溶出実験も、Ｎ−グリカナーゼによって処理された場合 に、ＭＷ２６−２８ｋＤａの活性種を生ずることにより、電気泳動的移動度の増 加を示している。銀着色によって、移動度のシフトがあることが確認されたが、 使用されたサンプルのバックグラウンドの着色によってＮ−脱グリコシル化バン ドを指定する ことが出来なかった。 例１７ 成熟ＧＧＦ２タンパク質が発現され、移入細胞から分泌されたところで、この タンパク質を測定するために更にテストを行った。 前記ｃＤＮＡコード・ヒトＧＧＦ２を、増幅ベクターｐｃｄｈｆｒｐｏｌｙＡ にクローン化し、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞に移入して安定的に発現させた。ｒｈＧ ＧＦ２を前記調整培地中に分泌させた。前記組換えＧＧＦ２が分泌される能力は 、前記Ｎ−末端疎水性区間（ストレッチ）、即ち信号配列、を介して仲介される 。信号仮説に依れば、信号配列は、一旦ラフ型（ｒｏｕｇｈ）小胞体を介した成 長タンパク質鎖の放出（ｅｘｐｏｒｔ）を開始すると、特定部位において成熟タ ンパク質から切断される。発現され純化されたｒｈＧＧＦ２のＮ末端の分析は、 この切断部位がＡ₅₀とＧ₅₁との間であることを示している。最初の５０のアミノ 酸残基が成熟タンパク質から切断され、従って、ｒｈＧＧＦ２は３７３個のアミ ノ酸からなる。ｃＤＮＡ個ｈＧＧＦ２のアミノ酸配列は、図５５に見られる。 前記タンパク質のＮ末端の最初の１５のアミノ酸残基は、次の表１に示すＮ末 端配列分析によって確認された。 寄託 Ｔ７プロモータのコントロール下におけるプラスミドｐブルースクリプト５ｋ 中の核酸コード・ＧＧＦ−ＩＩ（ｃＤＮＡ，ＧＧＦ２ＨＢＳ５）タンパク質（例 ６）を、１９９２年９月２日、米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），メリーランド州ロックスビルに寄 託し、ＡＴＴＣ番号７５２９８を与えられた。本出願人は、もしもこのプラスミ ドが、本件が特許となったときにこの特許の権利期間が終結するまでに生存不能 となった場合には、これを取り替える義務と、更に、そのような特許が発行され たことをＡＴＴＣに通知し、その発行時にこの寄託物を公衆に利用可能とする義 務があることを認識するものである。それ以前においては、この寄託物は、３７ ＣＦＲ１．１４条および３５ ＵＳＣ １１２条の規定に従って特許庁長官に利 用可能とされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/22 ＡＥＳ Ｃ１２Ｐ 21/08 39/395 ＡＡＲ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ０７Ｋ 14/46 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 16/18 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＤＵ Ｃ１２Ｎ 5/10 ＡＡＱ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＥＳ 21/08 ＡＢＡ Ｇ０１Ｎ 33/566 ＡＡＢ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，Ｔ Ｊ，ＴＴ，ＵＡ (72)発明者 ストローバント，ポール イギリス国 ロンドン エヌ８ ９エイエ ス クラウチ・エンド セシル・パーク 52エイ (72)発明者 ミンゲッティ，ルイザ イタリア国 イ−48012 バナキャヴァッ ロ ヴィア・ストラデッロ 22 (72)発明者 ウォーターフィールド，マイケル イギリス国 バークシャー アールジー13 １アールエヌ ニューベリー スピーン スピーン・レーン シャンターマーク （無番地) (72)発明者 マルキオニ，マーク アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02174 アーリントン トゥイン・サーク ル・ドライブ 24 (72)発明者 チェン，メイオー，スー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02174 アーリントン デカッター・スト リート 65 (72)発明者 ハイルズ，イアン イギリス国 ロンドン ダブリュ１ピー ８ビーティ ライディング・ハウス・スト リート 91

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． シュワン細胞分裂誘発活性を有する基礎ポリペプチド因子であって、前記 ポリペプチド因子は、Ｎ末端信号配列を欠如している。 ２． 請求項１の基礎ポリペプチド因子であって、前記ポリペプチド因子は、図 ５５においてアミノ酸位置５１〜アミノ酸位置４２２として定義されるアミノ酸 配列（配列認識番号１７９）を有する。 ３． シュワン細胞分裂誘発活性を有するポリペプチド因子をコードする単離Ｄ ＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列は、Ｎ末端信号配列を欠如している。 ４． 請求項２のポリペプチド因子をコードする単離ＤＮＡ配列。 ５． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、前記方法は、前記グ リア細胞を、有効量の請求項１のポリペプチドに接触させる工程を有する。 ６． ほ乳類の神経系の生態病理学的症状の予防または治療方法であって、この 症状は、請求項１のポリペプチドに対する敏感性または反応性を有するタイプの 細胞に関連し、前記方法は、有効量の前記ポリペプチドを前記ほ乳類に投与する 工程を有する。 ７． グリア細胞分裂誘発活性を有するポリペプチドであって、このポリペプチ ドは請求項３のＤＮＡ配列によってコードされたものであり、前記ポリペプチド は、前記ＤＮＡ配列の発現を許容する条件下において変成ホスト細胞を培養する 工程を有する方法によって得られたものである。 ８． サンプル中で請求項１のポリペプチドのためのレセプタの存在を同定する 方法であつて、前記サンプルを前記ポリペプチドに接触させ、これらの間の結合 を決定する工程を有し、前記結合は前記レセプタの存在を示すものである。 ９． 患者のグリア腫瘍を予防または治療する方法であって、この方法は、前記 患者に、請求項１のポリペプチドのそのレセプタへの結合を阻止する物質の有効 量 を投与する工程を有する。 １０．許容可能希釈物、キャリア又は補形剤とともに、および／又は単位投与形 態により、それぞれ薬用または獣医療用に調合された請求項１のポリペプチドを 有する薬剤用または獣医療用調剤。 １１．ほ乳類の末梢神経損傷に関連する症状を治療する方法であって、この方法 は、前記末梢神経を、請求項１のポリペプチドの有効量に接触させる工程を有す る。 １２．ほ乳類の症状を予防または治療する方法であって、前記症状は、脱髄また は損傷またはシュワン細胞の損失に関連し、前記方法は、前記シュワン細胞を、 請求項１のポリペプチドの有効量に接触させる工程を有する。 １３．請求項１２の方法であって、前記症状は、知覚または運動神経の神経傷害 である。 １４．ほ乳類の神経退化傷害の予防または治療方法であって、この方法は、ほ乳 類のグリア細胞を、請求項１のポリペプチドの有効量に接触させる工程を有する 。 １５．ほ乳類の神経再生および／又は修復を誘発する方法であって、この方法は 、ほ乳類のグリア細胞を、請求項１のポリペプチドの有効量に接触させる工程を 有する。 １６．線維芽細胞増殖を誘発する方法であって、この方法は、前記線維芽細胞を 請求項１のポリペプチドに接触させる工程を有する。 １７．ほ乳類の傷を修復する方法であって、この方法は前記傷を請求項１のポリ ペプチドに接触させる工程を有する。 １８．薬品を製造する方法であって、請求項１のポリペプチドを薬剤的に許容可 能なキャリアと混合する方法を有する。 １９．抗体を生成する方法であって、ほ乳類を請求項１のポリペプチドで免疫化 する工程を有する。 ２０．請求項１のポリペプチドに結合可能なレセプタを検出する方法であって、 この方法は、前記ポリペプチ ドを親和性リガンドとして使用し、前記サンプルにおいて親和分離を行う工程を 有する。 ２１．患者のグリア腫瘍を予防または治療する方法であって、この方法は、前記 患者に対して、請求項１のポリペプチドのそのレセプタへの結合を阻止する物質 の有効量を投与する工程を有する。 ２２．グリア細胞分裂誘発物質または、このグリア細胞分裂誘発物質をコードす る遺伝子を調査、分離または調合する方法であって、この方法は、組織調製物ま たはサンプルを、請求項１９の記載の抗体と接触させる工程を有する。 ２３．グリア細胞分裂誘発活性を有する分子をコードする核酸配列を単離する方 法であって、この方法は、サンプルを含む細胞を、グリア細胞分裂誘発物質特異 抗体と接触させ、前記サンプル中における前記細胞分裂誘発物質の発現を測定す る工程と、前記核酸配列を、前記発現を示す細胞から単離する工程とを有する。 ２４．神経細胞のシュワン細胞による髄鞘形成を誘発する方法であって、この方 法は、前記シュワン細胞を請求項１のポリペプチドに接触させる工程を有する。 ２５．細胞におけるアセチルコリンレセプタ合成を誘発する方法であって、この 方法は、前記細胞を請求項１のポリペプチドと接触させる工程を有する。 ２６．請求項１に記載のポリペプチドに対する抗体。 ２７．グリア細胞分裂誘発活性を備えたタンパク質を精製する方法であって、こ の方法は、細胞抽出物を請求項２６の抗体と接触させる工程を有する。 ２８．グリア細胞増殖の疾病を有するほ乳類を治療する方法であって、この方法 は、前記ほ乳類に請求項２６の抗体を投与する工程を有する。 ２９．請求項３のＤＮＡ配列を有するベクター。 ３０．請求項３の単離ＤＮＡを含有するホスト細胞。 ３１．グリア細胞分裂誘発因子を製造する方法であって、この方法は、請求項３ ０のホスト細胞を、前記ＤＮＡ配列の発現を許容する条件下において培養する工 程を有する。 ３２．グリア細胞分裂誘発物質としての請求項１のポリペプチド。 ３３．患者の多発性硬化症を予防または治療する方法であって、この方法は、前 記患者に請求項１のポリペプチドのそのレセプタに対する結合を阻止する物質の 有効量を投与する工程を有する。 ３４．グリア細胞分裂誘発物質であるポリペプチドであり、このポリペプチドは 請求項３に記載のＤＮＡ配列によってコードされるものであり、前記ポリペプチ ドは、グリア細胞分裂誘発因子を製造する方法によって得られるものであり、更 に、前記方法は、変成ホスト細胞を、前記ＤＮＡ配列の発現を許容する条件下に おいて培養する工程を有する。