JPH10505231A

JPH10505231A - Ｂ細胞リンパ腫細胞および白血病細胞に特異的な免疫結合体およびヒト化抗体

Info

Publication number: JPH10505231A
Application number: JP8507371A
Authority: JP
Inventors: リュン，シュイ−オン; ハンセン，ハンス
Original assignee: イムノメディクス，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-08-12
Filing date: 1995-08-11
Publication date: 1998-05-26
Anticipated expiration: 2015-08-11
Also published as: CA2195557C; EP0771208A1; US5789554A; JP3053873B2; WO1996004925A1; EP0771208B1; EP0771208A4; IL114909A; US6187287B1; CA2195557A1; US20070172920A1; US20020102254A1; US20040013607A1; ATE306930T1; AU3272695A; DE69534530T2; US20050106108A1; DE69534530D1; IL114909A0; ES2251723T3

Abstract

(57)【要約】キメラＬＬ２モノクローナル抗体、ヒト化ＬＬ２モノクローナル抗体、これらの抗体をコードする分離ＤＮＡ、ＤＮＡを含むベクター、およびキメラＬＬ２抗体およびヒト化キメラＬＬ２抗体と細胞障害剤またはＢ細胞リンパ腫および白血病の治療および診断に使用する標識との結合体。

Description

【発明の詳細な説明】Ｂ細胞リンパ腫細胞および白血病細胞に特異的な免疫結合体およびヒト化抗体発明の背景本発明は一般に癌の診断用および治療用に使用する免疫結合体に関する。詳細には、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫細胞および白血病細胞に対して向けられ、組換えにより生産されたキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体(humanized mAb )に関し、その抗体は診断用試薬または治療用試薬に共有結合することができ、その際に、抗体結合機能およびインターナリゼーション機能を喪失せず、しかもヒト抗マウス抗体の産生が少ない。非ホジキン型悪性リンパ腫（NHL）および慢性リンパ性白血病は、依然として癌死亡率の重要な一因であるＢ細胞悪性腫瘍である。このような悪性腫瘍は、種々の治療に対して様々に応答する。化学療法に対する応答はかなり良好であり、ＮＨＬの臨床的病期を適切に分類できる場合、限局性疾患患者に関しては、部分放射線治療を使用して満足な治療を提供することが可能である（Hall et al.，R adiology for the Radiologist（放射線医師のための放射線医学）、Lippincott , Philadelphia，1989，pp 365-376）。しかし、化学療法に付随する中毒性の副作用や、全身放射線療法はもとより、局所放射線療法による造血系に対する毒性のため、このような治療方法の使用は制限を受ける。患者の約半数が病気で死亡する（Posner et al.，Blood，61: 705(1983)）。放射性核種や他の細胞毒性試薬に結合したターゲッティング・モノクローナル抗体を使用すると、このような試薬を腫瘍部位に直接送達することが可能になり、その結果、正常組織の有毒試薬被曝が制限される(Goldenberg，Semin，Nucl． M ed.，19:332(1989))。近年、抗体を基礎とする療法の可能性および、腫瘍関連抗原を正確に定位できる可能性が実験的試験と臨床試験の両者で証明された（例えば、Thorpe，TIBTECH，11: 42(1993); Goldenberg，Scientific American，Scie nce & Medicine，1: 64(1994); Baldwinら、米国特許第4,925,922号および第4,9 16,213号; Young、米国特許第4918163号;米国特許第5,204,095号; Irieら、米国特許第5,196,337号; Hellstromら、米国特許第5,134,075号および第5,171,665号を参照されたい）。腫瘍による抗体取り込みは一般に低く、総注入量の0.01％から0.001%にすぎないということもあって、腫瘍関連マーカーに対する放射標識抗体または放射標識抗体フラグメントの使用は、一般に治療より腫瘍の定位の目的で成功をおさめてきた(Vaughan et al.，Brit．J．Radiol.，60: 567(1987))。腫瘍への投与量を増加させるために放射標識濃度を上昇させると、健常な組織への放射能被曝も増加することになるため、一般に逆効果である。ＬＬ−２（ＥＰＢ２）は、Ｂ細胞リンパ腫細胞およびリンパ性白血病細胞により速やかにインターナライズ（内在化）され、前述の困難の一部を克服することができる極めて特異的な抗Ｂ細胞リンパ腫細胞および抗リンパ性白血病細胞ネズミ・モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である(Shih et al.，Int．J．Cancer，56: 538(1994))。ＬＬ２は、IgG2a抗体型であり、Raji Ｂリンパ腫細胞株を抗原の起源として使用して開発された(Pawlak-Byczkowska et al.，Cancer Res.，49: 45 68(1989))。ネズミＬＬ２（ｍＬＬ２）はＣＤ２２のエピトープと反応することが判明している(Belisle et al.，Proc Amer．Assn．Clin．Res.，34: A2873(19 93))。ＣＤ２２分子は前駆細胞および初期前Ｂ細胞の細胞質に発現され、成熟Ｂ細胞の細胞表面に出現する。ｍＬＬ２は、組織切片の免疫染色により、試験したＢ細胞リンパ腫５１中５０と反応することが証明された。ｍＬＬ２は、放射免疫検出法で決定されるため、 in vivoでＢ細胞リンパ腫細胞を検出する極めて高感度の手段である(Murthy et al.，Eur．J．Nucl．Med.，19: 394(1992))。⁹⁹mＴｃで標識ｍＬＬ２のFabフラグメントは、Ｂ細胞リンパ腫に罹患しているフェーズII治験患者の既知病変６５中６３を定位した(Mills et al.，Proc．Amer．Assn．Cancer Res.，14: A2857( 1993))。さらに、¹³¹Ｉ標識されたｍＬＬ２は、Ｂ細胞リンパ腫患者で治療上有効であった(Goldenberg et al.，J．Clin．Oncol.，9: 548(1991))。外毒素PE38 KDELに結合したｍＬＬ２ Fabは、ヌードマウスで成長している測定可能なヒト・リンパ腫異種移植片（ＣＡ−４６）を完全緩解させた(Kreitman et al., Canc er Res.，53: 819(1993))。ｍＬＬ２の臨床使用は、他のほとんどの有望なネズミ抗体の場合とちょうど同じ様に、ヒトでＨＡＭＡ応答が発生することによって制限されてきた。ＨＡＭＡ応答はｍＬＬ２の注射後に必ず見られるわけではないが、かなりの数の例で、ｍＬＬ２の単回投与後に患者にＨＡＭＡが発生した。ＨＡＭＡ応答は、アナフィラキシの問題があるばかりではなく、循環結合体の大部分が循環抗マウス抗体と複合体を形成し、循環抗マウス抗体によって封鎖されるため、このような抗体結合体の診断上および治療上の有用性が制限される可能性がある。このことは、約６ mgのｍＬＬ２ ¹³¹Ｉ−ＩｇＧを単回注射後に、患者の約３０％に低レベルのＨＡＭＡ応答が発生し、追加の注射によってほぼ全例に強いＨＡＭＡ応答が発生した１つの試験によって例証される。一方、^99mＴｃで標識したｍＬＬ２ Fabでは、ＨＡＭＡ応答は認められなかった。一般に、このようなＨＡＭＡ応答によって、ｍＬＬ２抗体の診断能力および治療能力の完全実現の障害になる可能性がある。上記の通り、F(ab)₂やFabのようなｍＬＬ２のフラグメントを使用すると、特にこれらの免疫原性の問題が緩和または回避されるが、治療に向けて細胞免疫性を誘導するときや、生存期間を増大した抗体が必要な場合など、ＩｇＧ全体の方が望ましい情況もある。本発明の目的は、治療モダリティまたは診断モダリティとしてのｍＬＬ２ＩｇＧ抗体の価値を最大限に高めるために、また多回投与モダリティまたは持続投与モダリティでの有用性を高めるために、ｍＬＬ２の抗原結合特性を保持するか、同じ物を受けた被験でのＨＡＭＡ誘発がより少ないｍＬＬ２関連のマウス／ヒト・キメラｍＡｂ（ｃＬＬ２）およびヒト化ｍＡｂ（ｈＬＬ２）を生産することにある。本発明のまたの目的は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含め、ｃＬＬ２ｍＡｂおよびｈＬＬ２ｍＡｂの軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を提供することにある。本発明の目的は、治療モダリティまたは診断モダリティを含むｈＬＬ２ｍＡｂおよびｃＬＬ２ｍＡｂの結合体を提供することにもある。さらに、本発明の目的は、本発明のヒト化キメラｍＡｂを使用する治療方法および診断方法を提供することにある。以上の目的は、明細書および付属の特許請求の範囲に後述する発明によって達成されている。発明の概要本発明の１つの態様で、ネズミ軽鎖可変領域（ＶＫ）および重鎖可変領域（ＶＨ）がヒト定常軽鎖（κ）および重鎖（ＩｇＧ₁）に連結されるｍＬＬ２ｍＡｂ関連のｃＬＬ２ｍＡｂが得られる。このキメラｍＡｂは、親ｍＬＬ２のＢリンパ腫細胞および白血病細胞のターゲッティング特性およびインターナリゼーション（内在化）特性を保持する。本発明のまたの態様で、ｍＬＬ２ｍＡｂの軽鎖および重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、それぞれヒトＶＫ領域およびＶＨ領域のフレームワーク（ＦＲ）配列に連結され、その後で、それぞれヒトκ定常部ドメインおよびＩｇＧ₁定常部ドメインに連結されるｍＬＬ２ｍＡｂ関連のｈＬＬ２ｍＡｂが得られる。このヒト化抗体は、親ｍｍＬＬ２ｍＡｂのリンパ腫細胞および白血病細胞のターゲッティング特性およびインターナリゼーション特性を保持し、より低いＨＡＭＡ反応を示すと考えられる。また別の態様では、それぞれｈＬＬ２ｍＡｂおよびｃＬＬ２ｍＡｂの、可変軽鎖および可変重鎖のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む分離されたポリヌクレオチドが得られる。それ以外の態様で、ＶＫ鎖およびＶＨ鎖のＣＤＲのアミノ酸配列が得られる。さらに別の態様で、ｈＬＬ２ｍＡｂまたはｃＬＬ２ｍＡｂが診断用試薬または治療用試薬に共有結合している諸結合体が得られる。さらに別の態様で、前述のｍＡｂ結合体を使用してＢ細胞リンパ腫およびリンパ性白血病を診断することができる方法が得られる。本発明の以上その他の態様および実施例は、以下の明細書および添付の特許請求の範囲を検討することによって明確になるであろう。図面の説明第１図は、ネズミＬＬ２ＶＫドメインと、ヒト化ＬＬ２ＶＫドメイン（第１図Ａ配列識別番号２および６）およびＶＨドメイン（第１図Ｂ配列識別番号４、９および８）とを比較する図である。ｍＦＲ配列（ネズミと呼ばれる）と異なるｈＦＲ配列（ＲＥＩｈｕＶＫおよびＥＵＨｕＶＨと呼ばれる）のみを示し、星印で明示してある。これらの位置でより多くの残基がヒト化構造に保持されていた。ＣＤＲを枠で囲ってある。コンピュータモデルリングによるＣＤＲ接触を示すＦＲ残基を下線で示す。第２図は、ＬＬ２ＣＤＲとそのフレームワーク領域（ＦＲ）の隣接関係を示す図である。ｍＬＬ２のＶＬドメインおよびＶＨドメインのエネルギー最小化モデルを別個に構築し、半径４．５Å以内のすべてのＦＲ残基またはあらゆるＣＤＲ原子を潜在的ＣＤＲ−ＦＲ接触と認定した。軽鎖のＣＤＲ（第２図Ａ、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３）および重鎖（第２図Ｂ、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）を、それぞれ空間充填フレームワーク上に重なった「ボールと棒」として表現されている。第３図は、軽鎖ステージングベクター（ＶＫｐＢＲ）および哺乳類発現ベクター（ｐＫＨ）（第３図Ａ）、ならびに重鎖ステージングベクター（ＶＨｐＢＳ）および哺乳類発現ベクター（ｐＧ１ｇ）（第３図Ｂ）を示す図である。第４図は、ＬＬ２ＶＫドメインの二本鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列（第４図Ａ配列識別番号１および２）ならびにＬＬ２ＶＨドメイン二本鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列（第４図Ｂ配列識別番号３および４）を示す図である。対応するＤＮＡ配列にコードされているアミノ酸配列を１文字コードとして示す。ＣＤＲアミノ酸配列を枠で囲ってある。ＬＬ２ＶＫのＦＲ１に位置するＡｓｎ−グリコシル化部位（第４図Ａ配列識別番号２）を、下線付きＮＶＴ配列として示す。第５図Ａは、ｈＬＬ２ＶＫドメインの二本鎖ＤＮＡおよび対応するアミノ酸残基（配列識別番号５および６）を示す図である。ＣＤＲアミノ酸配列を枠で囲ってある。対応するＶＨドメインのデータを第５図Ｂに示す（配列識別番号７および８）。第６図は、ヒト化ＶＨ領域のＰＣＲ／遺伝子合成およびステージングベクターＶＨｐＢＳへのサブクローニングを表す略線図である。第７図は、非還元条件（レーン６〜８）および還元条件（レーン３〜５、軽鎖および重鎖）でのｍＬＬ２抗体およびｃＬＬ２抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン３およびレーン６はコントロール抗体を含む。第８図は、還元条件（レーン３〜５）および非還元条件（レーン６〜８）でのｃＬＬ２抗体およびｈＬＬ２抗体の異なるバージョンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。第９図は、還元条件（レーン３〜６）および非還元条件（レーン７〜１０）での混合適合化(mix-and-match)ｃＬＬ２抗体およびｈＬＬ２抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ析を示す図である。ｃＬＬ２はコントロールの役割をする。第１０図は、トレーサー放射標識ｍＬＬ２と細胞への結合を競うｍＬＬ２抗体およびｃＬＬ２抗体を含む比較Raji細胞競合抗体結合分析の結果を示す図である。第１１図は、ヒト化ＬＬ２／キメラＬＬ２混合物をｃＬＬ２と比較した比較Ra ji細胞競合抗体結合分析の結果（第１１図Ａ）、および２つのバージョンのｈＬＬ２をｃＬＬ２と比較した比較Raji細胞競合抗体結合分析の結果（第１１図Ｂ）を示す図である。第１２図は、抗体インターナリゼーション：表面結合の比率を、ｃＬＬ２抗体、ｃＬＬ２抗体（ＱからＶへの突然変異誘発）、ｈＬＬ２抗体およびｍＬＬ２抗体の時間の関数として比較した図である。第１３図は、エンドグリコシダーゼＦによる脱グリコシル化後のｍＬＬ２およびｃＬＬ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。第１４図は、ｍＬＬ２の脱グリコシル化がRaji細胞への結合アフィニティに及ぼす影響を示す図である。発明の詳細な説明ｍＬＬ２ｍＡｂのＶＬ領域およびＶＨ領域をコードするｃＤＮＡを分離して、それぞれヒト抗体のκ定常領域およびＩｇＧ₁定常領域をコードする遺伝子を含む哺乳類発現ベクターに、組換えにより別々にサブクローニングした。この２つのリコンビナントＤＮＡを哺乳類細胞に共トランスフェクトすると、親ｍＬＬ２ｍＡｂと同様、Ｂリンパ腫細胞に食欲に結合し、Ｂリンパ腫細胞により速やかにインターナライズされるｃＬＬ２ｍＡｂを発現した。同様に組換えによって、ＶＫＤＮＡおよびＶＨＤＮＡのＣＤＲを、それぞれヒトＶＫ領域およびＶＨ領域のフレームワーク（ＦＲ）配列に連結させ、その後で、上記ｈＬＬ２と同様、哺乳類細胞に発現するために、それぞれヒトκ定常領域およびＩｇＧ₁定常領域に連結させた。本明細書では、“ｃＬＬ２”または“ｃＬＬ２ｍＡｂ”という表現は、ネズミＶＫ領域およびＶＨ領域を、それぞれヒト定常軽鎖および定常重鎖に連結するかサブクローニングすることにより構築されたキメラ・モノクローナル抗体を指すつもりである。“ｈＬＬ２”または“ｈＬＬ２ｍＡｂ”という表現は、ｃＬＬ２のネズミＦＲ配列をヒト・フレームワーク領域の配列と置き換えることによる、キメラ・モノクローナル抗体のヒト化を指す。先行技術の抗体結合体と比較して、Ｂ細胞リンパ腫特異的ターゲッティングおよび白血病細胞特異的ターゲッティング、標的細胞内への迅速なインターナリゼーション、診断用試薬または化学療法試薬の迅速な細胞内放出（それによって試薬の有効性が上昇する）、および患者でのＨＡＭＡ応答のが低減する可能性という利点を備えた、ｃＬＬ２ｍＡｂおよびｃＬＬ２ｍＡｂと、製薬上許容できる媒体（例えば、Remington's Pharmaceutical Science（Remingtonの薬科学）、第１８版，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990を参照）で調合された診断用試薬または化学療法試薬との間で共有結合体を調製することができる。ｃＬＬ２ｍＡｂのＶＫ付加炭水化物部分はＢリンパ腫細胞への結合に関与しないことが本明細書で明らかにされているため、例えば酸化炭水化物誘導体を介するなど、このような炭水化物部分を介して試薬が抗体に結合している結合体を使用する方が好ましい。例えば、引用することによりその内容が本明細書に組み込まれる、Shihらの米国特許第5,057,313号、Shih et al.，Int．J．Cancer 41: 832(1988)、および同時係属で同一所有者にかかるHansenらの米国出願第08/162 ,912号で、このような結合体を生産する方法および診断用および治療用に使用する方法が得られる。重合キャリヤを使用せずに試薬を酸化炭水化物に直接結合する方法が、やはり引用することにより本明細書に組み込まれるMcKearnらの米国特許第5,156,840号に記述されている。広く様々な診断用試薬および治療用試薬を本発明の抗体に都合よく結合させることができる。この例としては、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソールなどの諸化学療法剤、蛍光分子などの検出可能標識または重金属や放射核種などの細胞障害剤が錯体を形成することができるＤＴＰＡなどの諸キレート化剤、 Pseudomonas外毒素などのトキシン類などがある。この結合体のうち幾つかの実施態様を以下の実施例に記述する。本発明で使用する細胞株および培地は、ＬＬ２（ＥＰＢ−２）ハイブリドーマ細胞（上記Pawlak-Byczkowskaら、1989）、Sp2/0-Ag14骨髄腫細胞（ATCC，Rockv ille，MD）およびRaji細胞などである。この細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Gibco/BRL，Gaithersburg，MA）、２mMのＬ−グルタミンおよび７５μg /mlのゲンタマイシンを加えたDulbeccoの改良Eagle培地（DMEM）（完全ＤＥＭＥ）で培養することが望ましい。トランスフェクトーマは、１０％のＦＣＳおよび７５μg/mlのゲンタマイシンを加えたハイブリドーマ無血清培地であるＨＳＦＭ（Gibco/BRL，Gaithersburg，MA）（完全ＨＳＦＭ）で成長させるか、指示がある場合には、抗生物質のみを含有するＨＳＦＭで成長させる。トランスフェクトーマの選択は、５００μg/mlのハイグロマイシン（Calbiochem，San Diego，CA ）を含有する完全ＨＳＦＭで実行することが可能である。すべての細胞株を５％のＣＯ₂中、３７℃で維持することが望ましい。本発明の重要な態様は、抗体の可変ドメインをコンピュータモデリングでモデル化できることである。（例えば、引用することにより本明細書に組み込まれる、Goldenbergら編、Cancer Therapy with Radiological Antibodies（放射標識抗体による癌治療）、CRC Press，Boca Raton，FL，1994の中のDionを参照されたい）。一般に、ｍＬＬ２２抗体とｈＬＬ２抗体の両者の三次元構造は、相同関係によってモデル化するのが最善の方法である。推測されるｍＬＬ２軽鎖ＦＲ領域の一次配列とヒトＲＥＩ（ＶＫ）の一次配列との間で高頻度の残基一致（７５．０〜９２．３％）がみられたため、引用することにより本明細書に組み込まれるProtein Data Bank(タンパク質データバンク)（PDR Code IREI，Bernsteinら、J．Mol. Biol.112: 535（1977））の結晶学データを利用できるので、この研究が促進された。同様に、抗体ＥＵ（ＶＨ）配列は、ｍＬＬ２重鎖のＦＲ１〜ＦＲ３コンピュータ相対物として選択することができ、ＦＲ４はＮＥＷＭを基礎とした。ＥＵ配列のＸ線座標データは現在不足しているため、ＦＲ１〜ＦＲ４のＮＥＷＭ構造データ（PDR Code 3FAB）を使用することが可能で、必要に応じてｍＬＬ２またはＥＵ（ｈＬＬ２）に対応するようにアミノ酸側基を置き換えることができる。軽鎖のＣＤＲは、ＩＭＣＰ（Ｌ１およびＬ２）および１ＲＥＩ（Ｌ３）の対応する配列からモデル化することができる。重鎖ＣＤＲの場合、Ｈ１およびＨ２はそれぞれ２ＨＦＬおよび１ＭＣＰを基礎とすることができるが、Ｈ３は新たにモデル化することが可能である。ＣαとＣβとの間の捻り角を維持するように、可能な場合はいつも、側基置換を実施する。エネルギ最小化は、AMBER分子力場（Weu ner et al，J Amer．Chem．Soc．106: 765（1984））により、収束法を使用して遂行した。潜在的に重要なＦＲ−ＣＤＲ相互作用は、ｍＬＬ２の可変軽鎖および可変重鎖を最初にモデリングすることにより決定した。各ＣＤＲ内のあらゆる原子の半径４．５Å以内のあらゆるＦＲ残基を同定し、それによってｈＬＬ２の最終デザインモデルに保持することができる。ｈＬＬ２のＶＫドメインおよびＶＨドメインの配列をデザインすると、その後は、ＰＣＲ反応で長い合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを鋳型として使用し、短いオリゴヌクレオチドをプライマとして使用して、ＣＤＲ合体を遂行することができる。ほとんどの場合、ＶＫドメインまたはＶＨドメインをコードするＤＮＡは、約３５０ｂｐとなる。コドン同義性（縮重）を利用して、コードされるアミノ酸を変化させずに、独特な制限部位を、Ｖ遺伝子ＤＮＡ配列の中央に近い領域に容易に導入することが可能である。例えば、最初にデザインされたアミノ酸配列を維持しながら、ｈＬＬ２ＶＨドメインのＤＮＡヌクレオチド１５７〜１６２位（アミノ酸５３位および５４位）に、独特なAvrII部位を導入することができる（第４図Ｂ）。自動ＤＮＡオリゴヌクレオチド・シンセサイザ（Cyclone Plus D NA Syntesizer，Milligen-Biosearch）で、AvrII部位の２本の長い非重複１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（〜１５０ｂｐ）上流および下流を作ることができる（例えば、以下の実施例３、オリゴＡおよびオリゴＢを参照されたい）。オリゴＡやオリゴＢなどの全長ＤＮＡオリゴヌクレオチドの収率は低いと予測されるため、ＰＣＲ反応で２組の横側オリゴヌクレオチド（実施例３、オリゴＡはオリゴ配列識別番号１０および１１、オリゴＢはオリゴ配列識別番号１２および１３）により増幅することができる。必要な制限部位を含むプライマをデザインして、後続のサブクローニングを容易にすることができる。オリゴＡのおよびオリゴＢの各プライマは、それぞれ結果として得られるオリゴＡおよびオリゴＢのＰＣＲ産物がAvrII部位でフレーム内連結してｈＬＬ２ＶＨドメインをコードしている全長ＤＮＡ配列（約３５０ｂｐ）を形成することができるように、AvrII部位に重複配列を含まなければならない。（PstIおよびAvrIIで制限消化した）オリゴＡのＰＣＲ産物と（AvrIIおよびBstEIIで制限消化した）オリゴＢのＰＣＲ産物をAvrII部位で連結させて、それらをステージングベクターVHpBSのPstII/BstE II部位へサブクローニングすることは、１つの３フラグメント連結ステップで完成することができる（例えば、実施例３を参照されたい）。正しい配列がVHpBS にサブクローニングされたことは、最初に制限消化分析で分析し、その後で、Sa nger et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74: 5463（1977）による逐次反応で確認することができる。Ｉｇプロモーター、リーダー配列およびｈＬＬ２ＶＨ配列を含むHindIII/Ba mHIフラグメントをステージングベクターから切除して、pSVgptベースのベクターｐＧ１ｇの対応する部位にサブクローニングすることが可能で、このｐＧ１ｇはヒトＩｇＧ定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサーおよびｇｐｔ選択マーカーを含み、最終発現ベクターhLL2pG1gを形成する。同様な戦術を使用してｈＬＬ２ＶＬ配列を構築することができる。長いオリゴヌクレオチド（以下の実施例オリゴＣおよびＤを参照されたい）のためのＰＣＲ産物の連結用に選択された制限部位は、この場合NruIでよい。Ｉｇプロモーター、リーダー配列およびｈＬＬ２ＶＫ配列を含むＤＮＡ配列をBamH1/HindIII処理によってステージングベクターＶＫｐＢＲから切除して、p SVhygベースのベクターpKhの対応する部位にサブクローニングすることが可能で、このpKhは、ヒトκ鎖定常領域、ハイグロマイシン選択マーカー、Ｉｇおよび κエンハンサーを含み、最終発現ベクターhLL2pKhを形成する。ヒト化すると、アフィニティが低下したり喪失する場合もあるため、もとのアフィニティを回復させるためには、さらに修飾することが必要であることがある（例えば、引用することにより組み込まれる、Tempest et al.，Bio/Technology 9: 266(1991); Verhoeyen et al.，Science 239: 1534(1988)を参照されたい）。ｃＬＬ２はネズミの相対物に匹敵する結合アフィニティを示すことが判明しているため（以下の実施例５を参照）、原型のｈＬＬ２に欠陥デザインがあればその欠陥デザインは、ｃＬＬ２の軽鎖と重鎖を混合して、ヒト化バージョンと適合させることによって同定することができる。非還元条件（ジスルフィドＬ−Ｈ鎖連結が無傷のままである）および還元条件（鎖が切れる）での異なる混合により適合化した（mix-and-match）ヒト化キメラＬＬ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で、分子の特性に関する異なる種類の軽鎖と重鎖の関係を分析することができる。例えば、多重バンドとしての移動、あるいはより大きいみかけの分子サイズとしての移動は、ＬＬ２のネズミＶＫドメインのＦＲ１領域でみられるＮ結合グリコシル化部位にグリカン基が存在することに起因する可能性がある。別の実施例では、約２５kDaで移動する不連続バンドは、予期された非グリコシル化軽鎖の分子サイズである。一般に、ｃＬＬ２ｍＡｂを調製するために、ＤＮＡ産物およびプライマを使用してＰＣＲクローニングで、ｍＬＬ２のＶＨ鎖およびＶＫ鎖を得ることができる。（下記のOrlandiらの論文および下記のLeungらの論文）。上記と同様、ＶＫＰＣＲプライマをｐＢＲ３２７ベースのステージングベクター（VKpBR）にサブクローニングすることも可能である。上記と同様、類似したpBluescriptベースのステージングベクター（VHpBS）にＶＨＰＣＲ産物をサブクローニングすることも可能である。HindIII制限エンドヌクレアーゼおよびBamHI制限エンドヌクレアーゼを使用して、ＶＫ配列およびＶＨ配列を含むフラグメントを、プロモーター配列およびシグナルペプチド配列と共に、ステージングベクターから切除することができる。通常通り、ＶＫフラグメント（約６００ｂｐ）を哺乳類発現ベクター（例えば、ｐＫｈ）にサブクローニングすることができる。ｐＫｈは、ヒトκ定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー、κエンハンサーおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＳＶｈｙｇベースの発現ベクターである。同様に、ヒトＩｇＧ１定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサーおよびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を担持しているｐＳＶｇｐｔベースの発現ベクターｐＧ１ｇに、約８００ｂｐのＶＨフラグメントをサブクローニングすることができる。２つのプラスミドをエレクトロポレーションによってSp2/0-Ag14細胞などの哺乳類発現細胞にトランスフェクトして、ハイグロマイシン耐性を選択する。選択で生き残ったコロニーを拡大し、上清液のｃＬＬ２抗体産生をＥＬＩＳＡ法でモニタリングする。約１〜１０⁶細胞のトランスフェクション効率が望ましい。この系で、０．１０〜２．５μg/mlの抗体発現レベルが期待できる。ＲＮＡ分離、ｃＤＮＡ合成および増幅を次のように実施することができる。引用することにより本明細書に組み込まれる、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング：実験マニュアル）・第２版・Cold Spr ing Harbor Press，1989）の方法に従って、合計約１０⁷細胞を使用して、ＬＬ２ハイブリドーマ細胞株から全細胞ＲＮＡを調製することができる。SuperScrip t前増幅システム(Gibco/BRL.，Gaithersburg，MD)を使用するなどして、通常通り、全ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを逆転写することができる。簡単に記述すると、２μlの１０×合成緩衝液［200 mM Tris-HCl(pH 8.4)、500 mM KCl、25 mM Mg Cl₂、１mg/ml BSA］、１μlの10 mM dNTP mix、２μlの0.1 M DTT、および200単位のSuperScript逆転写酵素の存在下、反応体積２０μlで、５０ngのランダムプライマを５μgのＲＮＡにアニーリングすることができる。延長ステップは、最初は室温で１０分間進行させ、続いて４２℃で５０分間インキュベートする。反応混合物を９０℃で５分間加熱することにより反応を停止することができる。引用することにより本明細書に組み込まれるOrlandiら(Proc．Natl．Acad．Sc i.，USA，86: 3833（1989）)の記述通りに、ｃＬＬ２またはｈＬＬ２のＶＫ配列およびＶＨ配列を増幅することができる。プライマＣＫ３ＢＨおよびプライマＶＫ５−３を使用して、ＶＫ配列を増幅することも可能である（Leung et al.，Bi otechniques，15: 286(1993)、これは引用することにより本明細書に組み込まれる）が、ネズミＩｇＧのＣＨ１領域およびVHIBACKにアニーリングするプライマＣＨ１Ｂを使用してＶＨ配列を増幅することができる（上記のOrlamdi et al., 1989）。１０μlの第１鎖ｃＤＮＡ産物、９μlの１０×ＰＣＲ緩衝液［500 mM K Cl、100 mM Tris-HCl(pH8.3)、15 mM MgCl₂、および０．０１％（w/v）ゼラチン］（Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT）を含むＰＣＲ反応混合物を３０サイクルのＰＣＲにかけることができる。各ＰＣＲサイクルは、９４℃で１分間の変性、５０℃で１．５分間のアニーリング、および７２℃で１．５分間の重合から成ることが好ましい。増幅されたＶＫフラグメントおよびＶＨフラグメントは、２％アガロース（BioRad，Richmond，CA）で精製することができる。ヒト化Ｖ遺伝子の構築に使用するオリゴＡ（149-mer）およびオリゴＢ（140-mer）を自動Cycl one Plus ＤＮＡシンセサイザ(Milligen Bioresearch)で合成する方法に関しては実施例３を参照されたい。Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列、およびＶＫＰＣＲ産物のフレーム内連結を促進するのに便利な制限部位を含むｐＢＲ３２７ベースのステージングベクターＶＫｐＢＲなどのステージングベクターにＶＫのＰＣＲ産物をサブクローニングすることができる。pBluescriptベースのVHpBSなど、類似したステージングベクターにＶＨのＰＣＲ産物をサブクローニングすることができる。それぞれのＰＣＲ産物を含む個々のクローンを、たとえば、引用することにより本明細書に組み込まれるSanger et al.，Proc Natl Acad．Sci.，USA，74: 5463（19 77）の方法で配列決定することも可能である。本明細書に記載のＤＮＡ配列は、あらゆる対立遺伝子、ならびに自然発生のものであろうと誘導されたものであろうと、突然変異体およびその変種を含むものと考えるべきである。以下に記載の通り、２種類のプラスミドを適切な細胞、例えば骨髄腫Sp2/0-Ag 14に共トランスフェクトして、ハイグロマイシン耐性のコロニーを選択し、上清液のｃＬＬ２抗体産生またはｈＬＬ２抗体産生を、例えばＥＬＩＳＡ法でモニタリングすることができる。トランスフェクション、およびＥＬＩＳＡによる抗体分泌クローンの分析を次の様に実施することができる。引用することにより本明細書に組み込まれるCo e t al.，J，Immunol.，148: 1149（1992）に従って、約１０μgのhLL2pKh（軽鎖発現ベクター）および２０μgのhLL2pG1g（重鎖発現ベクター）を使用して５× １０⁶SP2/0骨髄腫細胞をエレクトロポレーション（BioRad，Richmond，CA）でトランスフェクトすることができる。トランスフェクション後、９６ウェル微量滴定プレートの完全ＨＳＦＭ培地（GIBCO，Gaithersburg，MD）中、３７℃、５％ＣＯ₂で細胞を成長させることが可能である。最終ハイグロマイシン濃度５００ μg/mlでハイグロマイシン選択培地（Calbiochem，San Diego，CA）を加えることによって、２日後に選択過程を開始することができる。コロニーは一般にエレクトロポレーション後２〜３週間で出現する。さらに分析するため、培養を拡大することができる。キメラ重鎖またはヒト化重鎖の分泌陽性であるトランスフェクトーマ・クローンは、ＥＬＩＳＡ分析で同定することができる。簡単に記述すると、トランスフェクトーマ培養の上清サンプル（１００μl）を、F(ab)₂フラグメント特異的抗体であるヤギ抗ヒト（GAH）-IgG（Jackson ImmunoResearch，west Grove，PA）で予め被覆したＥＬＩＳＡ微量滴定プレートに三重に加える。プレートを室温で１時間インキュベートする。洗浄緩衝液（０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄することにより、非結合タンパク質を除去する。Ｆｃフラグメント特異的抗体であるカラシペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合GAH-IgG、（Jackson ImmunoResearch，west Grove，PA）をウエルに加える（×１０⁴希釈し、非結合抗体を加えた抗体ストック１００μlを最終濃度１．０μg/mlまで）。１時間インキュベートした後、プレートを、一般には３回、洗浄する。反応溶液［１００μl、１６７μgのオルトフェニレン−ジアミン（ＯＰＤ）（Sigma，S t. Louis，MO）を含有する、ＰＢＳ中０．０２５％過酸化水素］をウェルに加える。暗所で３０分間発色させる。５０μの４ＮＨＣｌ溶液を各ウェルに加えることによって反応を停止してから自動ＥＬＩＳＡ読取り装置（Bio-Tek instrume nts, Winooski，VT）により４９０nmで吸光度を測定する。非関連キメラ抗体標準（Scotgen，Ltd.，Edinburg，Scotlandから入手可能）を基準にして結合キメラ抗体を測定する。次の様に細胞培養培地から抗体を分離することができる。トランスフェクトーマ培養を無血清培地に適合させる。キメラ抗体産生用に、ＨＳＦＭを使用してローラーボトルで５００ml培養として、細胞を成長させる。培養を遠沈し、上清を０．２ミクロン膜を通過させて濾過する。濾過した培地を、流量１ml/minでタンパク質Ａカラム（１×３cm）を通過させる。カラムの約１０培量のＰＢＳで樹脂を洗浄し、１０mMEＤＴＡを含有する０．１Mグリシン緩衝液（ｐＨ３．５）でタンパク質Ａ結合抗体をカラムから溶出させる。１０μlの３M Tris（ｐＨ８．６）が入っている試験管に１．０mlの分画を採集して、２８０／２６０nmの吸光度からタンパク質濃度を決定する。ピーク分画をプールしてＰＢＳに対して透析を行い、例えばCentricon 30(Amicon Beverly，MA)で抗体を濃縮する。前記同様、ＥＬＩＳＡで抗体濃度を決定し、その濃度をＰＢＳで約１mg/mlに調整する。通常通り、０．０１％（w/v）アジ化ナトリウムを保存料としてサンプルに加える。このようにして分離されたｍＬＬ２抗体、ｃＬＬ２抗体およびｈＬＬ２抗体の比較結合アフィニティを直接ラジオイムノアッセイで測定する。クロラミンＴ法（例えば、引用することにより本明細書に組み込まれるGrennwood et al.，Bioc hem．J.，89: 123(1963)を参照されたい）を用いてｍＬＬ２を¹³¹Ｉまたは¹²⁵Ｉで標識することができる。一般に、ヨウ素標識抗体の比活性を約１０μCi/μgに調整する。反応培地（１％ウマ血清および１００μg/mlゲンタマイシンを加えたＨＳＦＭ）を使用して、非標識抗体および標識抗体を適切な濃度に稀釈する。適切な濃度の標識抗体と非標識抗体の両者を、合計体積を１００μlにして反応試験管に一緒に加える。Raji細胞培養のサンプルを採取して細胞濃度を測定する。培養を遠沈し、収集した細胞を反応培地で１回洗浄した後、最終濃度が約１０⁷ 細胞/mlとなるように反応培地に再懸濁する。あらゆる手順を４℃の寒冷条件で実施する。細胞浮遊液１００μlを反応試験管に加える。反応試験管を定期的に穏やかに振とうさせながら、反応を４℃で２時間行って細胞を懸濁させる。反応期間後、５mlの洗浄緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）を各試験管に加える。浮遊液を遠沈し、さらに５mlの洗浄緩衝液で細胞ペレットを２回洗浄する。遠沈後、細胞ペレットに残っている残存放射能の量をγカウンタ（Minaxi，Packar d Instruments，Sterling，VA）で測定する。フローサイトメトリ分析で評価すると、Ｆｃ部分が欠けている種々の濃度のｍＬＬ２ F(ab)₂フラグメントを競合物質として使用して、混合により適合化した抗体および完全にヒト化した抗体のRaji細胞表面抗原結合アフィニティを、ｃＬＬ２と比較することができる。フローサイトメトリーで、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＦｃ特異的抗体により、ヒトＦｃ部分を担持する残留表面結合ＬＬ２抗体（ｃＬＬ２および混合適合化(mix-and-match)ＬＬ２）を検出することができる。混合適合化ＬＬ２抗体がｃＬＬ２と類似した抗原結合アフィニティを示す場合、軽鎖と重鎖の両者をヒト化するための最初のデザインはｍＬＬ２免疫反応性を保持すると結論を下すことができる。引用することにより本明細書に組み込まれるPirker et al.，J．Clin．Invest ., 76: 1261（1985）の手順に実質的に従って、ｍＬＬ２抗体、ｃＬＬ２抗体およびｈＬＬ２抗体の標的細胞内へのインターナリゼーション後に蛍光標識が可能である。培養Raji細胞を遠沈し、細胞を約５×１０⁶細胞/mlの濃度まで新鮮な培地に懸濁させる。９６ウェル微量滴定プレートの各ウェルに、１００μlの細胞浮遊液を加える。すべての反応を同時に停止させるため、体積１００μlの４０ μg/ml抗体を反応ウェルに一定間隔で加える。プレートを３７℃、ＣＯ₂細胞培養インキュベータ内でインキュベートする。インキュベーションの終わりに冷１％ＦＣＳ／ＰＢＳで３回洗浄することにより非結合抗体を除去する。次に１mlの Formaid-Fresh［１０％ホルマリン溶液(Fisher，Fair Lawn，NJ)］で細胞を室温で１５分間処理する。洗浄後、測定する抗体がネズミ、キメラ、あるいはヒト化であるかどうかによって、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体(Tago，Burlingame，C A)またはＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒト抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove，P A)で処理して、細胞表面または細胞内部のいずれかに存在する抗体を検出する。ＢＨ−２蛍光顕微鏡（Olympus，Lake Success，NY）を使用して蛍光分布を評価する。Opreskoら(J．Biol．Chem.，262: 4116(1987))に従って、放射性ヨード標識抗体をトレーサとして使用して抗体インターナリゼーション速度を測定することができる。簡単に記述すると、１％ヒト血清を含有するＤＭＥＭ培地０．５mlの中で、放射標識抗体（１×１０⁴cpm）をRaji細胞（１×１０⁶細胞/ml）と共に４ ℃で２時間インキュベートする。反応間隔後、０．５mlのＤＭＥＭ培地で３回洗浄することにより、非特異的に結合した抗体を除去する。インターナリゼーションを測定するため、各々の反応試験管に０．５mlのＤＭＥＭ培地を加えて、浮遊液を３７℃でインキュベートする。三重の細胞を一定間隔で取り出し、即座に氷浴で冷却してそれ以上のインタナリゼーションを停止させる。細胞を１０００× gで、４℃で５分間遠沈する。上清を除去して放射能をカウントする。寒冷条件で、ｐＨ３．０、１mlの０．１mM酢酸／０．１mMグリシン緩衝液で８分間処理することにより、表面に結合した放射能を除去する。酸処理で除去された放射能、および細胞と結合して残存している放射能を測定した。インターナリゼーションＣＰＭ／表面ＣＰＭの比率を時間に対してプロットし、勾配からインターナリゼーションの速度を決定した。オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発およびクローン化ＤＮＡの突然変異のための関連技術に関する詳細なプロトコルは周知である。例えば、上記Sambrook らの文献とAusubelらの文献を参照されたい。従来の部位指向性オリゴヌクレオチド突然変異誘発を使用して、Ａｓｎ結合グリコシル化部位を抗体に導入することも可能である。例えば、κタンパク質の１８位のＡｓｎを導入するためには、コドン１８をＡＧＧからＡＡＣに変化させてもよい。これを遂行するには、チミンの代わりに少数のウラシルを含むＤＮＡ分子を得るために、抗体軽鎖配列を含む１本鎖ＤＮＡ鋳型を、E．coliの適当な菌株（例えば、dut-ung-）から調製する。このようなＤＮＡ鋳型は、ＭＩ３クローニングまたはSP6プロモーターを使用して、in vitro転写で得ることもできる。例えば、Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学における現行プロトコル）、John Wiley & Sons，NY，1987を参照されたい。突然変異した配列を含むオリゴヌクレオチドを通常通り合成し、１本鎖鋳型にアニーリングして、生成物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼで処理すると、２本鎖ＤＮＡ分子が生じる。野生型E．coli （dut+ung+）細胞を２本鎖ＤＮＡで形質転換すると、突然変異ＤＮＡが効率よく回収される。その代わりに、望み通りの突然変異を含むオリゴヌクレオチドを、ＶＬ鎖の可変領域のプライマおよびＤＮＡクローンとして使用するか、関心事の抗体を産生する細胞由来のＲＮＡを鋳型として使用して、Ａｓｎ連結したグリコシル化部位を抗体軽鎖に導入することもできる。Huse、Antibody Engineering: A Practica l Guide(抗体エンジニアリング：実践ガイド)のBoerrebaeck編、W.H．Freeman & Co.，PP．103-120，1992も参照されたい。例えば、製造業者の説明書に従ってT RANSFORMER^TMキット(Clontech，Palo Alto，CA)を使用して、部位指向性突然変異誘発を実施することができる。その代わりに、望み通りの突然変異を含む、相互にプライミングするオリゴヌクレオチドを含む抗体鎖を合成することによって、グリコシル化部位を導入することができる。例えば、引用することにより本明細書に組み込まれるUhlmann，G ene 71: 29(1988); Wosnick et al.，Gene 60: 115(1988); 上記のAusubelらの文献を参照されたい。上記一般記述は、抗体の１８位のＡｓｎグリコシル化部位の導入に言及しているが、軽鎖の他所のＡｓｎ連結したグリコシル化部位、または重鎖可変領域の場合でも導入することが可能なことは、当業者の心に浮かぶであろう。以下に記述する代表的な実施態様は、本発明を説明するために使用するに過ぎない。当業者は、本材料の変化は、請求の範囲に記載されている発明の広い全般的な範囲内に属することを認めるであろう。本明細書で言及したすべての引用文献の内容は、引用することにより本明細書に組み込まれる。実施例１ＬＬ２モノクローナル抗体をヒト化するためのヒト・フレームワークの選択および配列デザイン引用することにより組み込まれるKabatデータ(Kabatら、Sequences of Protei ns of Immunological Interest(免疫学的に重要なタンパク質の配列)、第５版、連邦保険福祉省、米国政府印刷局、Washington，D.C.)でＬＬ２のネズミ可変（Ｖ）領域フレームワーク（ＦＲ）をヒト抗体の可変領域フレームワークと比較することにより、ヒトＲＥＩ配列（第１図Ａ、配列識別番号６）およびＥＵ配列（第１図Ｂ、配列識別番号９および１０）は、それぞれＬＬ２のＶＫドメインおよびＶＨドメインのフレームワークと最高級の配列ホモロジーを示すことが確認された。したがって、ＬＬ２ＶＫおよびＬＬ２ＶＨのＣＤＲを移植するヒトフレームワークとして、それぞれＲＥＩＦＲおよびＥＵＦＲを選択した。しかし、ＬＬ２重鎖のヒト化では、ＥＵの配列ではなく、むしろＮＥＷＭのＦＲ４配列を使用してＥＵＦＲ４配列を置き換えた。コンピュータモデリング試験結果（第２図Ａおよび第２図Ｂ）に基づいて、ヒト化ＦＲ配列のデザインは、結果として得られる抗体のアフィニティおよび特異性に影響を及ぼすと考えられる、潜在的ＣＤＲ接触があるネズミＦＲ残基を保持した（第１図）。２つのバージョンのヒト化重鎖を構築した。第１のバージョン（ｈＬＬ２−１、配列識別番号９）で、グルタミン（Ｑ）をアミノ酸５位（Kabatナンバリング）に導入してPstI制限部位を含め、ステージングベクターへのグルタミンのサブクローニングを促進した。オリゴ指向性突然変異誘発により、このネズミ残基をｈＬＬ２−２（配列識別番号８）のヒトＥＵ残基バリン（Ｖ）に変換した。もとのネズミκ鎖可変配列で、１８〜２０位（第１図、配列識別番号２）で潜在的Ｎ結合グリコシル化部位が同定され、炭水化物付加に使用されたことに注目すべきである。このグリコシル化部位は、ＬＬ２軽鎖のヒト化に使用したＲＥＩＦＲ配列に含まれていなかった。より多くのオリゴヌクレオチドの詳細に関しては、実施例３を参照されたい。実施例２ＬＬ２重鎖可変領域およびＬＬ２軽鎖可変領域のＰＣＲクローニングおよび配列解明ｍＬＬ２（１ｇＧ２ａ）の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖変領域（ＶＫ）の両者を、一般には上記通りに、さらに詳細には以下の実施例３の記載通りに、ＤＮＡプライマを使用してＰＣＲクローニングで獲得した。ＰＣＲは突然変異させる傾向があるため、重鎖または軽鎖のいずれかの多様な個々のクローン可変領域を、６クローンについて決定し、同一であることを確認してからキメラ抗体の構築に使用した。Ｉｇプロモーターと、シグナルペプチド配列と、ＶＫＰＣＲ産物のフレーム内連結反応の促進に便利な制限部位とを含む、ｐＢＲ３２７ベースのステージングベクターであるＶＫｐＢＲに、ＶＫのＰＣＲ産物をサブクローニングした（第３図Ａ）。ＶＨのＰＣＲ産物は、類似したpBluescriptベースのステージングベクターであるＶＨｐＢＳにサブクローニングした（第３図Ｂ）。上記と同様、それぞれのＰＣＲ産物を含む少なくとも６個の個々のクローンの配列を、上記Sangerら（1977）の方法に従って決定した。全てが同一配列を担持していることが証明され、ＬＬ２ＶＫ（配列識別番号１）は第４図Ａから、またＬＬ２ＶＨ（配列識別番号３）は第４図Ｂからわかるように、その各々の配列が解明された。欠損突然変異は、ＶＫ領域およびＶＨ領域をコードする配列内で１つも同定されなかった。ＬＬ２のＰＣＲ増幅可変領域配列とKabatデータベース（Kabatら、上記）との比較によって、ＬＬ２のＶＫ配列およびＶＨ配列は、それぞれサブグループ５および２Ｂに属することがわかる。ドメイン内ジスルフィド結合のためのＣｙｓなど、重要な残基は適切な部位に保持された。ＶＫのＦＲ１フレームワークで、Ｎ結合炭水化物付着部位、Asn-Val-Thrが１８〜２０位で同定され（第４図Ａ、配列識別番号２）、ＬＬ２のＶＫはグリコシル化されていることが示唆された。以下に詳述する通り、還元条件でのＳＤＳ− ＰＡＧＥ分析で、このＡｓｎグリコシル化部位は実際に炭水化物付加に使用されていることが証明された。しかし、可変領域にグリコシル化部位が存在することにより、抗体の免疫反応性は影響を受けないようである。競合的ラジオイムノアッセイでｍＬＬ２の免疫反応性とｃＬＬ２の免疫反応性を比較すると、２つの抗体の活性はほぼ同じであった。実施例３ヒト化Ｖ遺伝子のＰＣＲ／遺伝子合成ｈＬＬ２ＶＨドメイン用にデザインされた配列、長いオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲによるｈＬＬ２ＶＨドメインの構築、ｈＬＬ２ＶＨドメインを含むステージングベクターＶＨｐＢＳを、第６図に示したスケッチにまとめる。ｈＬＬ２ＶＨドメインの構築に関しては、オリゴＡ（149-mer）およびオリゴＢ(140-mer)を自動CYCLONE PLUSTM ＤＮＡシンセサイザ(Milligen Bioresear ch)で合成した。オリゴＡ（下記配列識別番号１０）は、ｎｔ２４〜１７２に相補的なｈＬＬ２ＶＨドメインのマイナス鎖を表す。配列識別番号１０オリゴＢ（下記配列識別番号１１）は、ｎｔ１８０〜３２０に相補的なｈＬＬ２ＶＨドメインのマイナス鎖を表す。配列識別番号１１オリゴＡおよびオリゴＢを濃水酸化アンモニウム処理により支持体から切断し、保護解除した。サンプルを真空乾燥して（SpeedVac，Savant，Farmingdale，N Y）、水100μlに再懸濁した後、CHROMOSPIN-100TMカラム（Clonetech，Palo Alt o，CA）による遠心分離で不完全オリゴマ（100-mer未満）を除去してからＤＮＡオリゴマをＰＣＲで増幅した。オリゴＡおよびオリゴＢを別々に増幅してＰＣＲクローニングするため、横側に位置するプライマすべてを、本質的に上記Sambro okら（1989）の方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製した。１０μlの１０×ＰＣＲ緩衝液（５００mM ＫＣｌ、１００mM Tris-HCl緩衝液、ｐＨ８．３、１５mM ＭｇＣｌ₂）および、５単位のAMPLTAQTM ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT）の存在下、５μlの５μMオリゴ配列識別番号１２およびオリゴ配列識別番号１３を加えることによって、CHROMOSPIN精製オリゴＡから、１μlのサンプル・ストックを100μlの反応体積でＰＣＲ増幅した。この反応混合物を、９４℃で１分間の変性、５０℃で１．５分間のアニーリング、および７２℃で１．５分間の重合から成る３０サイクルのＰＣＲ反応に供した。同様の条件で、プライマ・ペア配列識別番号１４および配列識別番号１５によりオリゴＢをＰＣＲ増幅した。オリゴＡおよびオリゴＢの二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、PstI/AvrII（オリゴＡのＰＣＲ産物）およびBstEII/AvrII（オリゴＢのＰＣＲ産物）で制限消化して、重鎖ステージングベクターＶｈｐＢＳの相補的PstI/BstEII部位にサブクローニングすると、最終的なヒトＩｇＧ１重鎖発現ベクターｈＬＬ２ｐＧ１ｇが得られた。ヒト化ＶＫ配列の全長ＤＮＡを構築する場合、オリゴＥ（150-mer）およびオリゴＦ（121-mer）を上記のように合成した。オリゴＥ配列識別番号１６は、ｎｔ３１〜１８０に相補的なヒト化ＶＫドメインのマイナス鎖を表し、この配列をオリゴ配列識別番号１７およびオリゴ配列識別番号１８でＰＣＲ増幅した。オリゴＦ配列識別番号１９は、ｎｔ２０８〜３２７に相補的なヒト化ＬＬ２ＶＫドメインのマイナス鎖を表し、この配列を、オリゴ同定配列番号２０およびオリゴ配列識別番号２１でＰＣＲ増幅した。オリゴＥおよびオリゴＦのＰＣＲ増幅産物をゲル精製して、それぞれPvuII/Nr uIおよびNruI/Bg1IIIで制限消化した。２つのＰＣＲフラグメントＥおよびＦをN ruI部位で連結し、軽鎖ステージングベクターであるＶＫｐＢＲの相補的PvuI/Bc II部位に連結した。ヒト化ＶＫ配列をｐＫｈにサブクローニングすると最終的なヒトκ鎖発現ベクターであるｈＬＬ２ｐＫｈが生じた。ヒト化抗体を発現させるために、約１０μgの直鎖化ｈＬＬ２ｐＫｈと約２０ μgの直鎖化ｈＬＬ２ｐＧ１ｇを使用して、エレクトロポレーションにより５× １０⁶のSP2/0細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトーマを５００μg/ mlのハイグロマイシンで選択し、分泌された抗体を１×３cmのタンパク質Ａカラムで精製した。精製抗体をCentricon 30遠心分離機で濃縮した後、ＥＬＩＳＡで抗体濃度を測定した。０．１％（w/v）アジ化ナトリウムを保存料として含有するＰＢＳ緩衝液で最終抗体濃度を１mg/mlに調節した。第１図で、ネズミＬＬ２ＶＫドメインとヒト化ＬＬ２ＶＫドメイン（第１図Ａ、配列識別番号２および６）との間、およびネズミＬＬ２ＶＨドメインとヒト化ＬＬ２ＶＫドメイン（第１図Ｂ、配列識別番号４、９、８）との間で、アミノ酸配列を比較する。ＶＫ鎖では、ヒトＲＥＩフレームワーク配列をすべてのＦＲに使用した。ＶＨ鎖では、ヒトＥＵフレームワーク配列をＦＲ１〜３に使用し、ＮＥＷＭ配列をＦＲ−４に使用した。マウスのＦＲ配列と異なるヒトＦＲ配列のみを示す。星印は、対応する位置のヒトＦＲ配列と異なるネズミＦＲ配列を示す。この星印の位置のネズミの残基は、ヒト化構造においても保持された。ＣＤＲは枠で囲われている。第４図Ａ（配列識別番号１および２）に、ネズミＬＬ２ＶＫドメインの二本鎖ＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列（１文字コードで示す）を示す。ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は枠で囲われている。第４図Ｂ（配列識別番号３および４）に、対応するＶＨを表示する。第５図Ａ（配列識別番号５および６）および第５図Ｂ（配列識別番号７および８）に、それぞれヒト化ＬＬ２ＶＫおよびＬＬ２ＶＨの二本鎖ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は１文字コードで表し、ＣＤＲアミノ酸配列は枠で囲ってある。実施例４キメラＬＬ２抗体の構築、発現および精製 HindIIIおよびBamHIによる二重制限消化により、それぞれＬＬ２ＶＫｐＢＲおよびＬＬ２ＶＨｐＢＳから、ＬＬ２のＶＫ配列およびＶＨ配列を含むフラグメントを、プロモーター配列およびシグナル・ペプチド配列と共に切除した。約６００ｂｐのＶＫフラグメントを、哺乳類発現ベクターｐＫｈのHindIII／BamHI部位にサブクローニングした（第３図Ａ）。ｐＫｈは、ヒトκ定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー、κエンハンサーおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＳＶｈｙｇベースの発現ベクターである。同様に、ｐＧ１ｇ、ヒトＩｇＧ１定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサーおよびキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を担持するｐＳＶｇｐｔベースの発現ベクター（第３図Ｂ）の対応するHindIII／BamHI部位に約８００ｂｐのＶＨフラグメントをサブクローニングした。最終発現ベクターは、それぞれＬＬ２ｐＫｈおよびＬＬ２ｐＧ１ｇと呼ばれる。２つのプラスミドをエレクトロポレーションによりSp2/0-Ag14細胞に共トランスフェクトしてハイグロマイシン耐性を選択した。選択で生き残ったコロニー由来の上清のキメラ抗体分泌をＥＬＩＳＡ検定でモニタリングした（上記参照）。トランスフェクション効率は約１〜１０×１０⁶細胞であった。終末培養での抗体発現レベルは、0.10/μg/ml未満から2.5/μg/mlまでの範囲で様々であった。第７図は、タンパク質Ａ精製したｍＬＬ２（レーン４および７）およびｃＬＬ２（レーン５および８）を、それぞれ還元条件および非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果示す図である。「ＨＭＷ」は高分子量タンパク質マーカーを表し、「ＬＭＷ」は低分子量マーカーを表す。ｍｍＬ２の軽鎖もｃＬＬ２の軽鎖も（レーン４および５）主としてダブレット・バンドとして泳動し、予期されたみかけの分子量より大きかった。ｃＬＬ２のヒトκ定常領域は潜在的グリコシル化部位を含むことが判明しており、ＬＬ２ＶＫドメインのＦＲ１領域で同定された潜在的グリコシル化部位が利用されたと推理される。第８図は、異なるバージョンのｈＬＬ２抗体およびｃＬＬ２抗体を、還元条件および非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を示す図である。上記と同様、ＬＭＷおよびＨＭＷは分子量マーカーである。レーン３および６は、ｃＬＬ２抗体である。レーン４および７は、ＶＨドメインにネズミＦＲ残基が７個含まれているｈＬＬ２である（ｈＬＬ２−１）。レーン５および８は、ＶＨドメインにネズミＦＲ残基が６個含まれているｈＬＬ２である（ｈＬＬ２−２）。ヒト化軽鎖はキメラ軽鎖と比較して、より迅速に、しかもより不連続のバンドとして泳動する。第９図は還元および非還元の両条件で、混合適合化(mix-and-match)抗体およびｃＬＬ２抗体およびｈＬＬ２抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析成績を示す図である。レーン１および２は、分子量マーカーである。レーン３および７はｃＬＬ２である。レーン４および８は、ヒト化軽鎖およびキメラ重鎖を含む混合適合化したものであり［（ｈＬ／ｃＨ）ＬＬ２）］。レーン５および９は、キメラ軽鎖およびヒト化重鎖（バージョン１）であり［（ｃＬ／ｈＨ）ＬＬ２−１）］。レーン６および１０はキメラ軽鎖およびヒト化重鎖（バージョン２）である［（ｃＬ／ｈＨ）ＬＬ２−２）］。ヒト化ＬＬ２バージョン１はＶＨドメインにネズミＦＲ残基７個を含むが、バージョン２はＶＨドメインにネズミＦＲ残基６個を含む。（ｈＬ／ｃＨ）ＬＬ２）（レーン４）の軽鎖の位置は他の位置と異なることは注目に値し、ヒト化ＬＬ２軽鎖への炭水化物付着がないことが示唆される。実施例５ｃＬＬ２抗体のRaji細胞表面抗原への結合競合細胞結合分析を実施して、親ｍＬＬ２を基準としたｃＬＬ２の免疫反応性を評価した。プローブとして¹³¹Ｉ標識ｍＬＬ２（０．０２５μg/ml）を使用して、Raji細胞を抗体と共にインキュベートし、細胞結合した標識ｍＬＬ２の量から細胞への相対的結合を求めた（上記参照）。第１０図に示した競合分析からわかるように、ｍＬＬ２抗体もｃＬＬ２抗体も類似した結合活性を示した。フローサイトメトリに基づく第２競合分析で結果を確認した。簡単に記述すると、前述と同様、Raji細胞を使用して、前述と同様、１つの抗体濃度を他と比較して変化させながら、結合したｍＬＬ２またはｃＬＬ２の量を、ＦＩＴＣ標識抗マウスＦｃ抗体または抗ヒトＦｃ抗体で測定し、続いてフローサイトメトリを使用して分析する。実施例６ｈＬＬ２抗体のRaji細胞への結合実施例５と類似した実験で、混合適合化ＬＬ２またはヒト化ＬＬ２の異なる３種類の組み合わせの抗原結合アフィニティとｃＬＬ２の抗原結合アフィニティを、フローサイトメトリで比較した。簡単に記述すると、１％ＦＣＳおよび０．０１％アジ化ナトリウムを加えた最終体積１００μlのＰＢＳ緩衝液中に様々な濃度のｍＬＬ２ F(ab')₂フラグメント（競合体として）が存在する条件下、１μgのｃＬＬ２抗体、混合適合化ｃＬＬ２抗体、ｈＬＬ２−１抗体またはｈＬＬ２−２抗体を１０⁸のRaji細胞と共にインキュベートした。混合液を４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄して非結合抗体を除去した。抗体にヒトＦｃ部分が存在することを利用して、２０×希釈ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ１、Ｆｃフラグメント特異的抗体（Jackson ImmunoResearch，West Grove PA）を加えることにより、抗体の結合レベルを評価した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、FACSCAN蛍光活性化細胞選別装置（Becton-Dickinson，Bedford，MA）で蛍光強度を測定した。結果を第１１図Ａに示す。同じ方法を使用して、ｃＬＬ２を２つのバージョンのｈＬＬ２と比較した（第１１図Ｂ）。第１１図ＡおよびＢに示した結果から、ｃＬＬ２の免疫反応性は、ヒト化抗体または混合適合化抗体の免疫反応性と同様または同じであることが明らかである。ｃＬＬ２とｍＬＬ２の比較（第１０図）も考慮すると、得られたキメラＶＫおよびＶＨならびにヒト化ＶＫおよびＶＨの配列の信憑性が証明され、ｃＬＬ２およびｈＬＬ２の機能性が確認される。実施例７ Raji 細胞によるｍＬＬ２およびｃＬＬ２のインターナリゼーションＬＬ２抗体独特の特性は、Raji細胞に結合するとすぐに速やかにインターナライズすることである（上記、Shihら、1994）。インターナリゼーション後のネズミＬＬ２は、速やかにゴルジ装置に輸送され、そこから広く様々な生化学物質の分解を担当する細胞小器官であるリソソームに輸送される（Keisariら、Immunoc hem.，10:565（1973））。抗体インターナリゼーション速度は、上記Opreskoら（1987）に従って測定した。細胞内ＣＰＭ／表面ＣＰＭの比率は、時間の関数として求めた。ＬＬ２抗体インターナリゼーション速度は、１％ヒト血清を含有するＤＭＥＭ緩衝液０．５ml中で、放射標識ＬＬ２抗体（１×１０⁶cpm）を０．５×１０⁶Raj i細胞と共に４℃で２時間インキュベートすることによって測定した。Ｆｃ受容体を介した非抗原特異的インターナリゼーションを排除するかまたは最小限に抑えるために、Raji細胞表面Ｆｃ受容体を飽和させるため、過剰なヒト血清が含まれていた。４℃のＤＭＥＭ０．５mlで３回洗浄することにより、結合されていない放射標識ＬＬ２抗体を細胞から除去した。次に細胞を３７℃でインキュベートし、一定時間後に、インターナリゼーションを停止させるために細胞浮遊液の一部を移して氷で冷却した。３つの部分標本中の細胞を１，０００×ｇで５分間遠沈して分離し、表面に結合している放射標識ＬＬ２を、１mlの０．１M酢酸グリシン緩衝液、ｐＨ３を用いて４℃で８分間除去した。このようにして得られた放射能（表面ＣＰＭ）および細胞内に残存している放射能（細胞内ＣＰＭ）を測定した。インターナリゼーション速度を、細胞内：表面放射能比のプロットの勾配から時間の関数として算出した。第１２図からわかるように、ｍＬＬ２抗体、ｃＬＬ２抗体、ｃＬＬ２Ｑ抗体およびｈＬＬ２抗体は、類似した速度でインターナライズされた（Ｋｅ＝０．１７０（ｍＬＬ２）〜０．１２２１（ｃＬＬ２Ｑ、ＮＶＴからＱＶＴへの突然変異）。この数値から、１０分で表面結合抗体の約５０％がインターナライズされると考えられた。結果から、ｍＬＬ２抗体のキメラ化もヒト化も脱グリコシル化も、インターナリゼーション速度を低下させないことがわかる。ｍＬＬ２、ｃＬＬ２およびｈＬＬ２のインターナリゼーションの様式も、本明細書に記載のＦＩＴＣ標識第２抗体プローブを使用して、時間経過ベースで蛍光検鏡法によりモニタリングした。両抗体のインターナリゼーションは、測定可能な最も初期の時点で確認された。５分で、抗体は細胞表面上でも、膜に隣接した領域内に細胞質小胞としてインターナライズされた状態でも見られた。インキュベーション後１５分で、膜内周囲に散在した細かい点が、ゴルジ装置であると考えられる位置の顆粒群に溶けこみ始めた。３０分間インキュベートした後、さらに多くの抗体がインターナライズされるにつれて、抗体が分解されるリソソームであると考えられる離ればなれの位置に、群れをなした抗体が再分布するのが確認された。インキュベーション後２時間に、抗体のほとんどが細胞内部で認められた。ＬＬ２を氷上で２０分間インキュベートすると、強い表面染色のみが確認された。ｍＬＬ２もｃＬＬ２も、類似した様式でインターナライズされた。非関連コントロール・ヒト化抗体は鈍感な表面染色にすぎないことが証明されたため、ＬＬ２のインターナリゼーションは抗原−抗体結合と特に関連していた。Ａ１０３抗体（あらゆるヒト上皮細胞の表面に結合するが、効率よくインターナライズしないＩｇＧ２ａ抗体（Mattesら、Hybridoma，2: 253(1983)）は、２時間まで強い膜染色を示したが、抗トランスフェリン受容体抗体（５Ｆ９）はＬＬ２と同様、すみやかにインターナライズした。実施例８ＬＬ２ＶＫ配列のＦＲ１領域におけるグリコシル化部位の役割特に発明としての関心事は、ＬＬ２ＮＶＴ軽鎖配列のＦＲ１領域内の１８〜２０位にあるAsnグリコシル化部位の同一性である（第４図Ａ配列識別番号２）。上記の通り、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、Asnグリコシル化部位は炭水化物付加に使用されることが示唆される。実施例８では、１８〜２０位の炭水化物部分が軽鎖の機能的活性に及ぼす影響を試験した。ネズミＬＬ２軽鎖およびキメラＬＬ２軽鎖をエンドグリコシダーゼＦで（＋）処理するか、通常通りエンドグリコシダーゼＦを使用せずに（−）処理して、その抗体産物を還元条件および非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験した（第１３図）。電気泳動的挙動に関して抗体型間で違いはなかった。両者とも、脱グリコシル化により軽鎖の移動速度が低下した。脱グリコシル化がｍＬＬ２抗体のRaji細胞結合アフィニティに及ぼす影響を図１４に示す。エンドグリコシダーゼＦで炭水化物を除去しても、結合活性に対する影響はなかった。 AsnをGlnで置き換えてＬＬ２ＱＶＫＦＲ１を作るため、軽鎖の１８位に突然変異を導入した。ＮＶＴからＱＶＴへの突然変異によって、抗体のグリコシル化が完全に破壊されることがＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で証明された。軽鎖ＶＫグリコシル化を伴うｃＬＬ２と伴わないｃＬＬ２のRaji細胞結合アフィニティを比較すると、炭水化物部分はこれらの細胞への抗体の結合に影響を及ぼさないことが明らであった。可変領域に炭水化物部位があることによって、抗体の免疫反応性は影響を受けないと結論を下すことができる。ＬＬ２のＶＫ炭水化物部分をＣＤＲから離して置くと、ＣＤＲを支持するＦＲ関連のβバレルのボトムループの上に「帽子」を形成することが、コンピュータモデリング試験で示唆された。。原型のグリコシル化部位を含めずにヒト化すると、ネズミ相対物に匹敵する免疫反応性を持つＣＤＲ移植ＬＬ２抗体を生じる。以上の特徴は、グリコシル化部位を使用して、抗体がＢリンパ腫細胞または白血球細胞に結合して細胞内にインターナライズする能力を損なわずに治療用試薬または診断用試薬をＬＬ２に結合させることができることを示す。実施例９ＬＬ２の炭水化物担持部位における結合可変領域炭水化物分部は、ｍＬＬ２ｍＡｂ、ｃＬＬ２ｍＡｂおよびｈＬＬ２ｍＡｂの機能活性に明らかに関与していないことから、この部分は放射性核種トキシンなどの細胞障害剤または検出剤の付加部位として有利に使用でき、その結果、結合体が細胞表面に結合するのを妨害する可能性がなくなる。 Shihら、米国特許第5,057,313号（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記載の手順を使用して、抗体の酸化炭水化物部分、および種々の薬物、トキシン、キレート形成剤、および検出可能標識のうちの１つ以上と等価である重合キャリアの第一級アルカリアミノ基を介して抗体結合物を調製すると、薬物の複数のコピーを含む、付加グリカン類が欠如したドキソルビシン−デキストランＬＬ２抗体フラグメントが生じる。ｃＬＬ２ＶＫＦＲ１領域に含まれる炭水化物部分は、Asnグリコシル化部位に共有結合するものであった。１つの合成で、NaIO₄によるデキストランの酸化、NH₂-CH₂-CHOH-CH₂-NH₂によるSchiff塩基形成およびNaBH₄による還元によって、デキストラン（１８〜４０k Da）をアミノデキストランに変換した。次に、無水コハク酸および１−エチル− ３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの存在化、アミノデキストランをドキソルビシン（ＤＯＸ）と縮合すると、ＤＯＸアミノデキストランを生じた。さらに、ＤＯＸアミノデキストランを、抗体フラグメントの炭水化物部分をNaIO₄で酸化して生じたＬＬ２ＶＫＦＲ−１のアルデヒド基と縮合させた。１つのＤＯＸ−ＬＬ２調製で、デキストランに付着したＤＯＸの分子数はデキストラン１分子当たり１４であり、１分子のF(ab)2当たりのドキソルビシンの分子数は８．９であった。上記Raji細胞結合分析での免疫反応性は、コントロール値の約８０％であった。この結合系は、ｍＬＬ２抗体に制限されない。比較試験で、ＤＯＸ１５〜１９分子／ｃＬＬ２分子が結合していた。結合の可能性は上記実施例でのキャリヤ・デキストランの使用に制限されない。例えば、ＬＬ２ＶＫＦＲ１領域の炭水化物部分を酸化してアルデヒド基を生成することができる。このアルデヒド基は、任意の薬物のアミノ基と反応して Schiff塩基を生成することができ、このSchiff塩基は還元されると、アルキルアミン基により抗体に安定に連結する薬物の複数のコピーを作成する。例えば、薬物がアミノヘキシルＤＴＰＡ（キレート化剤）である場合、キレート化剤に共有結合したＬＬ２が生成する。キレート化剤を使用して、例えば、診断用または治療用に使用できる可能性がある放射核種や常磁性金属イオンなどを、標的組織に送達することができる。Ｙ−９０の４７．３％およびＩｎ−１１１の９７．４％がキレート化されている、キレート化剤５．５分子／抗体分子を含むＤＴＰＡ−ＬＬ２結合体が生成された。上記実施例は本発明の幾つかの実施態様を示すにすぎず、本出願は上記の詳細な実施例によって請求の範囲が制限されるものではないことを強調する。本出願に引用されたあらゆる出版物および特許は、引用することにより出願に組み込まれる。

【手続補正書】【提出日】１９９７年６月６日【補正内容】記実施態様例以下は、本願発明の実施態様例である。１．親ｍＬＬ２抗体のＢ細胞リンパ腫細胞と白血病細胞ターゲティング特性及び細胞インターナリゼーション特性を実質的に保持しているように、ヒトκ定常領域及びＩｇＧ₁定常領域にそれぞれ連結されたヒトＶＫ及びヒトＶＨ領域のフレームワーク配列とそれぞれ結合したｍＬＬ２モノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むｈＬＬ２モノクローナル抗体であって、 KSSQSVLYSANHKNYLA のアミノ酸配列（配列番号２の２４〜４０番目の残基）を含む、ＬＬ２モノクローナル抗体のＶＫ領域の単離された相補性決定領域１（ＣＤＲ１）のポリペプチドと、 WASTRES のアミノ酸配列（配列番号２の５６〜６２番目の残基）を含む、ＬＬ２モノクローナル抗体のＶＫ領域の単離されたＣＤＲ２のポリペプチドと、 HQYLSSWTF のアミノ酸配列（配列番号２の９５〜１０３番目の残基）を含む、ＬＬ２モノクローナル抗体のＶＫ領域の単離されたＣＤＲ３のポリペプチドと、 SYWLH のアミノ酸配列（配列番号４の３１〜３５番目の残基）を含む、ＬＬ２モノクローナル抗体のＶＨ領域の単離されたＣＤＲ１のポリペプチドと、 YINPRNDYTEYNQNFKD のアミノ酸配列（配列番号４の５０〜６６番目の残基）を含む、ＬＬ２モノクローナル抗体のＶＨ領域の単離されたＣＤＲ２のポリペプチドと、 RDITTFY のアミノ酸配列（配列番号４の９９〜１０５番目の残基）を含む、ＬＬ２モノクローナル抗体のＶＨ領域の単離されたＣＤＲ３のポリペプチドとを含む前記モノクローナル抗体。２．バリンが前記重鎖の５番目のアミノ酸の位置に挿入されている実施態様例１に記載のｈＬＬ２モノクローナル抗体３．グルタミンが前記重鎖の５番目のアミノ酸の位置に挿入されている実施様態例１に記載のｈＬＬ２のモノクローナル抗体。４．ヒトκ定常領域及びＩｇＧ₁定常領域とそれぞれ結合したｍＬＬ２モノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の可変領域を含むｃＬＬ２モノクローナル抗体。５．実施態様例１に記載のｈＬＬ２モノクローナル抗体、又は、Ｂ細胞リンパ腫細胞及び白血病細胞と結合するその特異的結合断片を含む、Ｂ細胞リンパ腫細胞及び白血病細胞ターゲティング結合体であって、前記ｈＬＬ２モノクローナル抗体は診断用又は治療用試薬と共有結合している前記結合体。６．実施態様例４に記載のｃＬＬ２モノクローナル抗体、又は、Ｂ細胞リンパ腫細胞及び白血病細胞と結合するその特異的結合断片を含むＢ細胞リンパ腫細胞及び白血病細胞ターゲティング結合体であって、前記ｃＬＬ２モノクローナル抗体は診断用又は治療用試薬と共有結合している前記結合体。７．前記診断用試薬が標識を含む実施態様例５又は６に記載の結合体。８．前記治療用試薬が細胞傷害性剤を含む実施態様例５又は６に記載の結合体。９．前記治療用試薬は、前記モノクローナル抗体又はその特異的細胞結合断片の炭水化物部分によって、前記モノクローナル抗体又はその特異的細胞結合断片と結合している実施態様例５又は６に記載の結合体。１０．ＬＬ２モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＫ）領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含み、かつ、ＬＬ２ｐＫｈと名付けられた哺乳類の発現ベクターに組み込まれている図４Ａ（配列番号１）に記載の単離されたポリヌクレオチド。１１．ｈＬＬ２のＶＫドメインのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含み、かつ、ｈＬＬ２ｐＫｈと名付けられた哺乳類の発現ベクターに組み込まれている図５Ａ（配列番号５）に記載の単離されたポリヌクレオチド。１２．Ｉｇプロモーター、シグナルペプチドＤＮＡ配列、ヒトκ定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー、κエンハンサー、及び、マーカー遺伝子を前記ベクターが適宜含む実施態様例１０又は１１に記載のポリヌクレオチド。１３．ＬＬ２モノクローナル抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含み、かつ、ｈＬＬ２ｐＧ１ｇと名付けられた哺乳類の発現ベクターに組み込まれている図４Ｂ（配列番号３）に記載の単離されたポリヌクレオチド。１４．ｈＬＬ２のＶＨドメインのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含み、かつ、ｈＬＬ２ｐＫ１ｇと名付けられた哺乳類の発現ベクターに組み込まれている図５Ｂ（配列番号７）に記載の単離されたポリヌクレオチド。１５．前記ベクターが、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチドＤＮＡ配列、ヒトＩｇＧ₁定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー、及び、マーカー遺伝子のうち一以上をさらに含む実施態様例１３又は１４に記載のポリヌクレオチド。請求の範囲１．親ｍＬＬ２抗体のＢ細胞リンパ腫細胞と白血病細胞ターゲティング特性及び細胞インターナリゼーション特性を実質的に保持しているように、ヒトκ定常領域及びＩｇＧ₁定常領域にそれぞれ連結されたヒトＶＫ及びヒトＶＨ領域のフレームワーク配列とそれぞれ結合したｍＬＬ２モノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含むｈＬＬ２モノクローナル抗体であって、 KSSQSVLYSANHKNYLA のアミノ酸配列（配列番号２の２４〜４０番目の残基）を含む、ＬＬ２モノクローナル抗体のＶＫ領域の単離された相補性決定領域１（ＣＤＲ１）のポリペプチドと、 WASTRES のアミノ酸配列（配列番号２の５６〜６２番目の残基）を含む、ＬＬ２モノクローナル抗体のＶＫ領域の単離されたＣＤＲ２のポリペプチドと、 HQYLSSWTF のアミノ酸配列（配列番号２の９５〜１０３番目の残基）を含む、ＬＬ２モノクローナル抗体のＶＫ領域の単離されたＣＤＲ３のポリペプチドと、 SYWLH のアミノ酸配列（配列番号４の３１〜３５番目の残基）を含む、ＬＬ２モノクローナル抗体のＶＨ領域の単離されたＣＤＲ１のポリペプチドと、 YINPRNDYTEYNQNFKD のアミノ酸配列（配列番号４の５０〜６６番目の残基）を含む、ＬＬ２モノクローナル抗体のＶＨ領域の単離されたＣＤＲ２のポリペプチドと、 RDITTFY のアミノ酸配列（配列番号４の９９〜１０５番目の残基）を含む、ＬＬ２モノクローナル抗体のＶＨ領域の単離されたＣＤＲ３のポリペプチドとを含む前記モノクローナル抗体。２．ヒトκ定常領域及びＩｇＧ₁定常領域とそれぞれ結合しているｍＬＬ２モノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の可変領域を含むｃＬＬ２モノクローナル抗体。３．ＬＬ２モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＫ）領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含み、かつ、ＬＬ２ｐＫｈと名付けられた哺乳類の発現ベクターに組み込まれている配列番号１に記載の単離されたポリヌクレオチドと、ｈＬＬ２のＶＫドメインのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含み、かつ、ｈＬＬ２ｐＫｈと名付けられた哺乳類の発現ベクターに組み込まれている配列番号５の単離されたポリヌクレオチドと、ＬＬ２モノクローナル抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含み、かつ、ｈＬＬ２ｐＧ１ｇと名付けられた哺乳類の発現ベクターに組み込まれている配列番号３の単離されたポリヌクレオチドと、ｈＬＬ２のＶＨドメインのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含み、ｈＬＬ２ｐＫ１ｇと名付けられた哺乳類の発現ベクターに組み込まれている配列番号７の単離されたポリヌクレオチドとから成る群から選択される１以上のベクターであって、さらに、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチドＤＮＡ配列、ヒトＩｇＧ₁定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー、マーカー遺伝子のうちの１以上を適宜含む前記ベクター。４．請求項１に記載のｈＬＬ２モノクローナル抗体若しくは請求項２に記載のｃＬＬ２モノクローナル抗体、又は、Ｂ細胞リンパ腫細胞又は白血病細胞と結合する前記抗体の特異的結合断片を含むＢ細胞リンパ腫細胞及び白血病細胞ターゲティング化合物であって、前記ｈＬＬ２若しくはｃＬＬ２モノクローナル抗体、又は、その断片は、診断用又は治療用試薬と共有結合している前記化合物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｋ 49/00 ＺＣ０７Ｋ 16/30 Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 21/08 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＬＬ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の軽鎖可変（ＶＫ）領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む、第４図Ａ（配列識別番号１）の分離されたポリヌクレオチド。２．ＬＬ２ｍＡｂの重鎖可変（ＶＨ）領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む、第４図Ｂ（配列識別番号３）の分離されたポリヌクレオチド。３．ｈＬＬ２ＶＫドメインのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む、第５図Ａ（配列識別番号５）の分離されたポリヌクレオチド。４．ｈＬＬ２ＶＨドメインのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む、第５図Ｂ（配列識別番号７）の分離されたポリヌクレオチド。５．請求項１乃至４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。６．アミノ酸配列（配列識別番号２の残基２４〜４０） KSSQSVLYSANHKNYLA を含む、ＬＬ２ｍＡｂのＶＫ領域の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）分離ポリペプチド。７．アミノ酸配列（配列識別番号２の残基５６〜６２） WASTRES を含む、ＬＬ２ｍＡｂのＶＫ領域の分離ＣＤＲ２ポリペプチド。８．アミノ酸配列（配列識別番号２の残基９５〜１０３） HQYLSSWTF を含む、ＬＬ２ｍＡｂのＶＫ領域の分離ＣＤＲ３ポリペプチド。９．アミノ酸配列（配列識別番号４の残基３１〜３５） SYWLH を含む、ＬＬ２ｍＡｂのＶＨ領域の分離CＤＲ２ポリペプチド。１０．アミノ酸配列（配列識別番号４の残基５０〜６６） YINPRNDYTEYNQNFKD を含む、ＬＬ２ｍＡｂのＶＨ領域の分離ＣＤＲ２ポリペプチド。１１．アミノ酸配列（配列識別番号４の残基９９〜１０５） RDITTFY を含む、ＬＬ２ｍＡｂのＶＨ領域の分離ＣＤＲ３ポリペプチド。１２．VKpBRプラスミドに挿入された請求項１に記載のポリヌクレオチド。１３．VHpBSプラスミドに挿入された請求項２に記載のポリヌクレオチド。１４．さらにＩｇプロモーターおよびシグナルペプチド配列を含む、請求項１２または１３に記載のプラスミド。１５．LL2pKhと呼ばれる哺乳類発現ベクターに組み込まれ、前記ベクターがさらにＩｇプロモーター、シグナルペプチドＤＮＡ配列、ヒトκ定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー、κエンハンサー、およびマーカー遺伝子を含む、請求項１または３に記載のポリヌクレオチド。１６．LL2pK1gと呼ばれる哺乳類発現ベクターに組み込まれ、前記ベクターがさらにＩｇプロモーター、シグナルペプチドＤＮＡ配列、ヒトＩｇＧ１定常領域のゲノム配列、Ｉｇエンハンサーおよびマーカー遺伝子を含む、請求項２または４に記載のポリヌクレオチド。１７．ヒトκ定常領域およびヒトＩｇＧ１定常領域に連結された請求項１または２のｍＬＬ２ｍＡｂの軽鎖および重鎖を含む、請求項３または４のｃＬＬ２ｍＡｂ。１８．ｈＬＬ２ｍＡｂが親ｍＬＬ２抗体のＢ細胞腫細胞および白血球細胞タゲッティング特性および細胞インターナリゼーション特性を実質的に保持しているような、ヒトκ定常領域ドメインおよびヒトＩｇＧ１定常領域ドメインにそれぞれ連結された第１Ａ図および第１Ｂ図のヒトＶＫ領域およびヒトＶＨ領域のフレームワーク配列にそれぞれ連結された請求項６乃至１０のいずれかのｍＬＬ２ｍＡｂの軽鎖相補性決定領域および重鎖相補性決定領域を含む、ｈＬＬ２ｍＡｂ。１９．診断用試薬または治療用試薬に共有結合したｃＬＬ２抗体またはｈＬＬ２抗体またはそれらのフラグメントを含む結合体。２０．前記診断用試薬が標識を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の結合体。２１．前記治療用試薬が細胞障害剤を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の結合体。２２．前記抗体またはそのフラグメントの炭水化物部分によって前記試薬が前記抗体またはそのフラグメントに結合していることを特徴とする、請求項１９に記載の結合体。２３．被験者のＢ細胞リンパ腫または白血病を治療する方法において、製薬上許容できる媒体で調合された請求項２１に記載の結合体の治療上有効な量を前記被験者に投与するステップを含む方法。２４．被験者のＢ細胞リンパ腫細胞または白血病細胞を診断する方法において、製薬上許容できる媒体で調合された請求項２０に記載の結合体の診断上有効な量を前記被験者に投与するステップと、前記標識を検出するステップとを含む方法。２５．アミノ酸配列（配列識別番号の残基２４〜４０） KSSQSVLYSANHKNYLA を含む、分離された、ＬＬ２ｍＡｂのＶＫ領域の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）ポリペプチドと、アミノ酸配列（配列識別番号２の残基５６〜６２） WASTRES を含む、ＬＬ２ｍＡｂのＶＫ領域の分離ＣＤＲ２ポリペプチドと、アミノ酸配列（配列識別番号２の残基９５〜１０３） HQYLSSWTF を含む、ＬＬ２ｍＡｂのＶＫ領域の分離ＣＤＲ３ポリペプチドと、アミノ酸配列（配列識別番号４の残基３１〜３５） SYWLH を含む、ＬＬ２ｍＡｂのＶＨ領域の分離ＣＤＲ１ポリペプチドと、アミノ酸配列（配列識別番号４の残基５０〜６６） YINPRNDYTEYNQNFKD を含む、ＬＬ２ｍＡｂのＶＨ領域の分離ＣＤＲ２ポリペプチドと、アミノ酸配列（配列識別番号４の残基９９〜１０５） RDITTFY を含む、ＬＬ２ｍＡｂのＶＨ領域の分離ＣＤＲ３ポリペプチドとを含む、請求項１８に記載のｈＬＬ２ｍＡｂ。