JPH10505238A

JPH10505238A - 中枢神経系の再生に関する栄養因子

Info

Publication number: JPH10505238A
Application number: JP8508862A
Authority: JP
Inventors: アイ．ベノウィッツ，ラリー; エイ．アーウィン，カーリーン; ジャクソン，ポール
Original assignee: Boston Childrens Hospital
Current assignee: Boston Childrens Hospital
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-08-24
Publication date: 1998-05-26
Also published as: AU3539395A; NZ293048A; CN1127517C; RU2157223C2; EP0777686A1; CN1164858A; AU713028B2; WO1996006859A1; CA2198587A1; KR970705577A; US5898066A

Abstract

(57)【要約】網膜の神経細胞を、明確に規定された無血清状態で維持する細胞培養条件が明らかになった。これらのニューロンからの軸索の再生を刺激する分子因子が特性付けされた。視神経の軸索を取り囲むグリア有鞘細胞は、神経再生の引き金となり、しかも神経再生を持続させる２種類の分子を放出する。１つの分子は軸索形成因子１(axogenesis factor１：ＡＦ−１)と呼ばれ、大きさが１０００ダルトンの範囲にある低分子量ポリペプチド（質量分光分析法で約７０７ダルトンであることが判明した）である。２番目の分子のＡＦ−２は大きさが約１２，０００ダルトンの大型のタンパク質である。本研究から、これらの因子はＣＮＳ再生に強く関与しており、それゆえ脊髄や他の神経組織の損傷を治療するのに有効であることが示される。

Description

【発明の詳細な説明】中枢神経系の再生に関する栄養因子本発明の背景本発明は、一般的に、中枢神経系損傷の治療法、及び特に脊髄再生に関する栄養因子の使用の分野に関する。幼児期を過ぎて、中枢神経系(CNS)に損傷を受けると、たいてい不可逆的である機能的障害が起こる。脳又は脊髄中に、病気、外傷又は他の原因によって損傷が生じると、認識機能、知覚機能及び運動機能、さらには生命機能の維持に関する終生の障害が起こる。損傷部位の近くでは、限られた量の局所的なシナプスの再編成が起こるが、損傷した神経細胞は取り替えられないし、予備の神経細胞は厳密な接合を再生し得ない。現在、損傷した機能の治療は不可能である。 CNS が再生されないのには、幾つかの要因、例えば、軸索成長を抑制するグリア細胞の表面上の阻害分子の存在、成長を促進するラミニンのような適当な基質分子の欠損、並びに細胞の生存及び分化に要求される遺伝子発現のプログラムを活性化するのに必要とされる適当な栄養因子の欠損、が挙げられる。それとは対照的に、末梢神経系中では、損傷した神経繊維が遠距離にわたって再生でき、結果として機能の優れた回復を伴う。この15年間で、神経科学者は、これが末梢神経系と中枢神経系との神経細胞の本質的な相違によるものでないことを認識するようになった。注目すべきことに、PNS(例えば、座骨神経)の移植片を通して成長する機会が与えられると、CNS のニューロンは非常に遠距離にわたってその軸索を伸長させる。従って、CNS のニューロンは、細胞外の環境からの適当なシグナルが与えられると、成長する能力を保持する。CNS 及びPNS の異なる成長潜在能力に関与する因子としては、例えば、CNS 中の神経繊維を囲む稀突起神経膠細胞の表面上に存在するが、PNS に匹敵する細胞群（シュワン細胞）中ではあまり豊富に存在しない、部分的に特性付けされた成長阻害分子、PNS 中では成長を促進するがCNS(例えば、ラミニン)中では欠損している、基底膜の分子及び他の表面の分子、並びに細胞の生存及び分化の基礎となる遺伝子発現のプログラムを活性化する可溶性ポリペプチドである栄養因子、がある。このような栄養因子は、神経細胞の生存及び分化を維持するために必要不可欠であると考えられているが、CNS 中の軸索の再生を誘発する原因となる特定の栄養因子は不確定のままである。ヒト及びその他の高等脊椎動物とは対照的に、下等脊椎動物は、損傷したCNS 経路を一生を通じて再生できる(Sperry,R.W.(1944),J.Neurophysiol.,7:57-69;S perry,R.W.(1963),Proc.Nat.Acad.Sci.USA,50:703-710)。金魚においては、網膜神経節細胞の95% は、視神経が損傷しても生存し(Meyerら,(1985),J.Comp.Neuro l.,239:27-43)、視覚蓋及びその他の標的領域の細胞との、形態学的に組織化した機能的な接合を１から２カ月以内に再生する(Grafstein,(1986),再生する器官である網膜，R.Adler及びB.D.Farber編，網膜: A Model for Cell Biology Stud ies Part II，Academic Press，New York,275-335; Jacobson,(1991)，Developm ent Neurobiology,第３版(Plenum Publishing Co.,New York)参照)。このプロセスに付随する細胞変化及び分子変化は詳細に研究されている。網膜神経節細胞は、広範な代謝変化及び形態変化（例えば、仁の劇的な増大、遊離リボソームの増殖、及び細胞直径の増加）を受ける(Murray & Grafstein,(1969)，Exp.Neurol., 23:544-560; Murray & Forman,(1971)，Brain Res.,32:287-298)。細胞骨格の一定の構成要素(Burrellら.,(1978),J.Neurochem.,31:289-298; Heacock & Agrano ff,(1982)，Neurochem.Res.,7:771-788; Giulianら.,(1980)，J.Biol.Chem.,255 :6494-6501; Quitschke & Schechter,(1983)，Brain Res.,258:69-78;Glasgowら .,(1994)EMBO J.,13:297-305; Glasgowら.(1992)Neuron,9:373-381)、細胞表面接着分子(Vielmetter ら.,(1991)J.Neurosci,11:3581-3593; Bastmeyer ら.,(19 90)Development,108:299-311;Paschkeら.,(1992)J.Cell Biol.,117:863-875;Bla ugrund ら.,1990; Battistiら.,(1992)J.Neurocytol.,21:557-73)、及び成長する神経末端膜中へ組み込まれる数種のタンパク質、特にGAP-43(Benowitz ら.,(1 981)J.Neurosci.,1:300-307: Heacock & Agranoff,(1982); Perrone-Bizzozero ら.,(1987)，J.Neurochem.,48:644-652; Perryら.,(1987)，J.Neurosci.,7:792- 806; LaBate & Skene,(1989)，Neuron,3:299-310; Wilmotら.,(1993),J. Neuros ci.,13:387-401)をコードする遺伝子の発現が大量に増加する現象が観察される。同様の変化のうちの幾つかは、他の種の視神経の発達及び再生と関連している(Skene & Willard,(1981),J.Cell Biol.,89:86-95 J.Cell.Biol.,89:96-1 03; Moyaら.,(1988)，J.Neurosci.,8:4445-4454; Dosterら.,(1991),Neuron,6:6 35-647)。一般に、損傷後に軸索を再生するニューロンの能力は、周囲の非ニューロン性要素によって強く影響を受ける(Aguayo ら.,(1991)Phil.Trans.Royal Soc.Londo n,Series B，331:337-343)。金魚の網膜剥離後の経過において、視神経のグリア有鞘細胞は、軸索伸長に高度に促進的な環境を提供すると考えられる(Bastmeyer ら.,(1993)Glia,8:1-11;Bastmeyerら.,(1991)J.Neurosci,11:626-640)。部分的に、これは、特定の細胞表面タンパク質及び細胞外マトリックスタンパク質、例えば、L1様細胞接着分子(Blaugrundら.,(1990)Brain Res.,530:239-244; Bastme yerら.,(1993); Bastmeyer ら.(1991); Vielmetter ら.,1991; Battistiら.,199 2)、ラミニン(Hopkinsら.,(1985)J.Neurosci.,5:3030-3038)、及びコンドロイチンサルフェートプロテオグリカン(Battisti ら.,1992)の発現によるものであると考えられる。同時に、金魚の視神経グリアは、哺乳動物CNS 稀突起神経膠細胞よりも低レベルに成長阻害タンパク質を表面に発現すると考えられる(Caroni & Schwab,(1988)J.Cell Biol.,106:1281-1288; Schwab & Caroni,(1988)J.Neurosc i.,8:2381-2393; Bastmeyer ら.,1991; Sivronら.,(1994)，魚類視神経ミエリンの成長阻害物質の存在：損傷後の変化．J.Comp.Neurol.,343:237-246)。細胞表面成分に加えて、金魚視神経細胞は、金魚の網膜外植片(Mizrachi ら., (1986)J.Neurochem.,46:1675-1682)、胎児哺乳動物ニューロン(Finkelsteinら., (1987)Brain Res.,413:267-274; Cadayら.,1989)、及び成熟ウサギ網膜(Schwart z ら.,(1985)Science,228:600-603)由来の軸索の伸長を促進する可溶性因子を分泌する。視神経のグリア及びマイクロファージによって分泌されるタンパク質には、例えば、アポリポタンパク質Ａ(Harelら.,(1989)J.Neurochem.,52:1218-122 8)、プラスミノーゲン活性化物質(Salles ら.,(1990)EMBO J.,9:2471-2477)、インターロイキン-2(Eitanら.,1992)、トランスグルタミナーゼ(Eitan及びSchwart z,(1993)Science,261:106-108)、及び血小板誘導成長因子(Eitanら. ,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:5442-5446)がある。これらの知見にもかかわらず、軸索が網膜神経節細胞から伸長を開始する原因となる因子は、不確定のままである。この点に関する研究は、一般的に、in viv o で行なわれるか、又は損傷という条件を設けることによってin vivo で既に再生が誘発された動物に由来する網膜の外植片を用いて行なわれる(Landreth 及び Agranoff(1976)Brain Res.,118:299-303; Landreth 及びAgranoff(1979)Brain R es.,161:39-53; Turner ら.,(1981)Brain Res.,204:283-294; Turner ら.,(1982 )Dev.Brain Res.,4:59-66; Schwartz ら.,1985; Yip & Grafstein,(1982)Brain Res.,238:329-339; Hopkinsら.,1985; Limaら.,(1989)Int.J.Devl.Neuros cienc e,7:375-382)。in vivo で既に再生プロセスが開始されていなければ、種々の薬品を用いても伸長を促進することができないという事実によって、再生を開始するために必要とされる因子は、外植片培養物中には存在しない源、例えば、視神経グリア、循環系、又はその他の脳組織、に由来することが示唆される(Johnson 及びTurner,(1982)J.Neurosci.Res.,8:315-329)。栄養因子は、一般的には、Dev elopmental Neurobiology，M.Jacobson（第３版、Plenum Publ.Co.,NY 1991,第 8章及び第11章）；Molecular Neurobiology，Z.Hall編(Sinauer Publ.Co.,Sunde rland，MA 1992,第11章及び第12章)に概説されている。従って、本発明の目的は、哺乳動物において神経接合の再生を開始させる分子シグナルを得るための方法を提供することである。また、本発明の目的は、哺乳動物において神経組織の再生を開始させる因子を提供することである。さらに、本発明の目的は、脊髄又はその他の中枢神経系組織の損傷を治療する方法を提供することである。本発明の要旨網膜の神経細胞を、明確に規定された無血清状態で維持する細胞培養条件が明らかになった。軸索の再生を刺激する分子因子は、神経繊維を取り囲むグリア細胞から放出される。金魚のニューロン及び、哺乳類の中枢神経系(CNS)由来のグリア細胞から単離したこれらの因子が特性付けされた。金魚の視神経の軸索を取り囲むグリア有鞘細胞は、神経再生を引き起こして維持する二つの分子を放出する。その二つのうちの一つは軸索形成因子１(AF-1)と呼ばれ、1000ダルトンの範囲の大きさを持つ低分子親水性ポリペプチドであって、質量分光分析法によって 707 ダルトンの質量を持つことが示されている。二番目の分子のAF-2はおよそ12 ,000ダルトンの大きさを持つ、より大きなタンパク質である。AF-1の濃度は、視神経ホモジェネート中よりもＣＭ中の方がかなり高く、それが活発に分泌されることを示唆している。AF-2は細胞の内外において、同じような濃度を持つ。これらの因子はCNS 再生に強く関わっており、従って、視神経、脳、脊髄及びその他の神経組織の損傷を治療するのに有用であろうことが、研究により示されている。例えば、解離した細胞培養物中では、金魚の網膜神経節細胞は、視神経の有鞘細胞からの二つの因子に応答して、それらの軸索を再生する。生体染料である5,6-カルボキシフルオレセインジアセテート（5,6-CFDA）を使用した視覚的観察によれば、これらの因子が存在しないときは、解離した網膜細胞は少なくとも１週間は、無血清の規定培地中で生存能力を維持するが、殆ど伸長を示さない。AF-1を加えることにより、培養物中の２５％までの細胞は、６日間で長さにして７５μm 以上に、突起を伸長させた。AF-2はAF-1程ではないが、高度に顕著な効果を持っていた。神経突起が網膜神経節細胞それ自体から伸長していることを確かめるために、視蓋に脂肪親和性染料である4-Di-10-ASP を加え、網膜を培養する前に数日間、それを視神経に拡散させた。細胞の個体群の全てに渡って観察されるよりも、遙かに多くの割合の染料含有細胞が軸索の伸長を示したが、これは、神経節細胞が前記因子の選択性標的であることを示唆している。AF-1又はAF -2の効果は、高まった生存能力に二次的に起因するものではない、というのは、６日後の培養物中に残っている、全ての細胞の生存も網膜神経節細胞の数も、前記因子の存在の影響を受けないからである。AF-1及びAF-2の活性は、神経成長因子、 BDNF、NT-3、CNTF、タウリン、レチン酸、酸性及び塩基性繊維芽細胞成長因子を含む、広範な濃度範囲に渡って試験された、幾つかの既知因子には似ていない。金魚の細胞由来のAF-1は、前記の割合の網膜神経節細胞及び哺乳類の脊髄のニューロンの培養物で試験すると、活性であった。新生児のラットの脳から単離されたAF-1は、同様にアッセイしたとき金魚の細胞から単離されたAF-1と同じような活性を示した。図面の簡単な説明図１ａは神経突起の伸長の計測のヒストグラムである。軸索長分布は、神経細胞を、0%、5%、10% 及び15% という図中に示された濃度のＣＭと共に培養した５日後に測定した。長さにして１〜５細胞直径分突起を伸長している細胞の数（斜線なし）。長さにして５細胞直径より大きな突起を伸長している細胞の数（斜線）。数字はそれぞれのＣＭ濃度の４つのウェルからの平均値を表す。誤差線は、平均の標準誤差(SEM)を示す。図１ｂは二つの別々の実験の用量反応曲線であり、ＣＭの濃度の増加(0%,5%,1 0%，そして15%)に応答する神経突起の伸長（５細胞直径より大きな軸索を持つ細胞の割合）を示す。データは、図１ａ中のヒストグラムのデータに基づいて選択したカットオフ点である長さにして５細胞直径より大きな突起を有する細胞の百分率を表す。どちらの実験においても、濃度１０％のＣＭ（即ち、全タンパク質濃度が約１０μg/ml）に応答して最大伸長が見られる。誤差が１％未満のときは、誤差線は記さない。図１ｃは二つの独立した実験における、ＣＭ濃度の関数としての細胞生存のグラフである。（14の連続した顕微鏡視野中でカウントした、5,6-CFDAでラベルされた細胞。４つのウェルの平均を取り、L-15対照値により規格化した。）図２ａ，２ｂはＣＭのサイズフラクションに対する神経突起促進活性のグラフである。図２ａは、あらかじめ無傷な視神経（０日）又は、３日若しくは７日前に傷つけた視神経から得た、限外濾過(3,000 Da カットオフ)により高分子量と低分子量のフラクションに分けたＣＭである。全ての場合において、低分子量（斜線なし）と高分子量（斜線）両方のフラクションで、高いレベルの神経突起促進活性が見られた。図２ｂでは、対照とＣＭ及び、分子量1,000 Daで分離したＣＭとを比較した。図２ｃはサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（280 nmにおける光学濃度、 O.D.）によって分離したＣＭの高分子量フラクションのクロマトグラムである。高分子量フラクションは７０倍に濃縮し、１mlのフラクション（数字付きの線）に分離した。矢印は分子量較正標準の保持時間を示す（BSA、ウシ血清アルブミン ;Ova、卵白アルブミン ;Cyto C、シトクロムＣ）。図２ｄは濃度２５％（出発物質に基づいて計算した）においてアッセイしたカラムフラクションに応答する神経突起伸長のグラフである。フラクションはまず最初に二つ一組でバイオアッセイし、活性があれば個別に再試験し、活性がなければ二つ一組で再試験した。１２と１３のフラクションだけが顕著な神経突起促進活性を有していた。図３は神経突起伸長のグラフであって、低分子量因子、AF-1は二相溶媒抽出系を使って単離できることを示している。陰性対照は培養培地のみである。陽性対照（第２レーン）は、グリア有鞘細胞から培養培地に分泌される分子の低分子量フラクションである3,000 Da未満のＣＭであり、これは高レベルの軸索伸長を誘発する。この物質をｐＨ7.5 で有機溶媒イソブタノールと混合すると、水相（ｐＨ7.5 の水相）にはほとんど活性は残らない。そして、その有機相をｐＨの低い緩衝液（ｐＨ２の水相）と混合すると、生物学的に活性な分子が水相に移動し、有機相（ｐＨ２の有機相）には何も残らない。図４は神経突起伸長のグラフであって、低分子量の栄養因子AF-1を含む、部分的に精製した抽出物を逆相ＨＰＬＣによって分離すると、活性な成分が特定のカラムフラクション（ＦＣ，ＦＤ，ＦＥ）に現れるということを示す。図３と同様に、陰性対照(L-15)は組織培養培地のみである。陽性対照は、視神経グリアから分泌される分子の、分画化されていない低分子量成分（3,000 Da未満の１ＣＭ、 10% 濃度）である。ＦＡ〜ＦＩは高速液体クロマトグラフィー分離からのカラムフラクションを示す。図５ａ及び５ｃは、対照及び、神経基底(Neurobasal)培地（図５ａ）又は血清を補充したダルベッコ最小必須培地（図５ｃ）の中で培養した、15日齢ラット胎児の脊髄由来の解離したニューロンをAF-1で処理したものに関する、10細胞直径より大きな軸索を有する細胞の比率のグラフである。図５ｂ及び５ｄは、対照及び、神経基底培地（図５ｂ）又は血清を補充したダルベッコ最小必須培地（図５ｄ）の中で培養した、15日齢ラット胎児の脊髄由来の解離したニューロンをAF-1 で処理したものに関する、カラム１顕微鏡視野幅×１ウェル半径中の、生存能力のある細胞のグラフである。実験は見分けのつかない４通りのサンプルに対して行った。線は平均±平均のの標準誤差(SEM)を示す。図６ａは、神経突起伸長を示すグラフであり、２％のMEM 又はGCM-D 中でAF-1 と共にインキュベートしたラットの網膜神経節細胞に関する、表示した長さ（細胞直径単位）の軸索を有する細胞の比率を示す。図６ｂは、細胞の生存能力を示すグラフであり、２％のMEM 又はGCM-D 中でAF-1と共にインキュベートしたラットの網膜神経節細胞に関する、14の顕微鏡視野中の生存細胞を示す。実験は見分けのつかない４通りのサンプルに対して行った。線は平均士平均のの標準誤差(S EM)を示す。図７は哺乳類のグリア細胞がAF-1様因子を分泌する事を示すグラフであり、金魚網膜神経節細胞培養物から得た対照グリア培養物、及び、血清含有培地中でほぼ密集するまで成長させた、新生児ラット脳の培養物由来の、部分的に分画化したグリアならし培地とともにインキュベートした培養物("MGCM")について、長さにして５細胞直径より大きな軸索を有する細胞の百分率として、神経突起伸長を示す。MGCMを限外濾過によって高分子量及び低分子量成分に分離し、1,000 D 未満の分子量を持つフラクション(MGCM<1kDa(20%))をアッセイした。疎水性の逆相 C-18カラムに結合しない、前記成分のサブフラクション（フラクション4,5 及び 6,7 ）もアッセイした。陽性対照には、金魚由来のAF-1を含む高度に活性なサンプルを用いた。発明の詳細な説明Ｉ．神経再生を開始させる分子シグナルの発見損傷した視神経を再成長させ得る下等脊椎動物の能力は、ＣＮＳの発生および柔軟性の理解を目標とする多数の研究の主題になっている。網膜神経節細胞をその軸索を再生するよう誘導する、内在性因子の特性化するため、血清を含まない所定の培地で培養した、キンギョ網膜の解離モデルが開発されている。これらの条件下で、網膜神経節細胞は、キンギョ視神経細胞を起源とする２種類の可溶性因子に応答して、長い、軸索様突起を延伸する。その一方は、軸索形成因子１（ＡＦ−１）と呼ばれ、１kDa のカットオフフィルターを通過する、小型で熱に安定なプロテアーゼ感受性分子であり、質量分光測定によって、７０７ダルトンの質量を有することが決定され、他方、すなわちＡＦ−２は、１２kDa と推定される大きさの、熱に不安定なタンパク質である。これらの研究は、下記のとおり実施した。眼窩の奥の視神経を破砕して３日後に、視神経および視路を取り出し、０．５〜１mmの小片に裁断し、ＨＥＰＥＳ緩衝Ｌ１５培地中で３〜４時間インキュベートした。この調整培地を濾過し、イオン交換、ＨＰＬＣ逆相およびサイズ排除クロマトグラフィーに付して、培養物中の解離した網膜ニューロンからの、軸索の伸長を誘導する因子を精製した。培養物は、正常なキンギョから網膜を切り出し、パパインで４５分間処理し、静かに摩砕し、組織の大片を沈降させることによって得た。伸長は、培養して５日後に細胞径の５倍またはそれ以上軸索を延伸した、大型の生存細胞の分画に基づき、１条件につき３〜６ウエルで、盲検で採点し、生存率は、５（６）−カルボキシフルオレセインジアセテートを用いて評価した。トリプシン感受性の、熱に安定な、Ｍr ＝１０〜１５kDa の塩基性タンパク質によって、軸索の伸長の数倍の増大が誘導された。軸索促進活性の第二の明確なピークは、1000 kDa未満のＭr を有する。これらの研究は、キンギョの視神経は、軸先の伸長に明確に寄与し得る多様な栄養因子を分泌することを示す。本明細書に記載したとおり、基線条件下では、細胞は、生体染料である５，６ −カルボキシフルオレセインジアセテート（５，６−ＣＦＤＡ）を用いて評価した限りで、少なくとも１週間生存し続けたが、僅かな伸長を示したにすぎなかった。視神経の支持細胞が分泌する分子（ＡＦ−１および／またはＡＦ−２）を含有する調整培地（ＣＭ）の添加は、５〜６日後には、長さが細胞径の５倍またはそれ以上の突起を延伸するよう、最高２５％のニューロンを誘導した。ある場合には、この成長は３００μm を上回った。この伸長が網膜神経節細胞（ＲＧＣ）それ自体からであることを検証するため、網膜を切り出す５〜７日前に、親油性染料の４−ジ−１０ＡＳＰを視蓋に塗布した。培養６日後に、４−ジ−１０ＡＳＰで逆行的に標識された細胞は、集団全体より２倍もの軸索の伸長を示し、ＣＭがＲＧＣに選択的に作用することを示した。全集団中の４−ジ−１０ＡＳＰ標識細胞の百分率、および細胞全体の生存率のいずれも、ＣＭの存在に影響されなかったことから、ＣＭの効果は、生存率の上昇に二次的ではないことが示された。ＡＦ−１およびＡＦ−２は、キンギョ視神経からのＣＭ中で以前に同定された分子のいずれにも符合しないと思われる。Mizrachiら（1986）は、中性のpHでＤＥＡＥに結合し、ポリリシン基質に吸着される、視神経ＣＭ中の１０kDa のタンパク質を記載した。このタンパク質は、生体内でその軸索を再生させ始めた網膜外植片で軸索の伸長を促進したが、始動されなかった網膜からの伸長は、誘導しなかった。ＡＦ−２は、始動されなかった網膜神経節細胞からの伸長を誘導するばかりでなく、pH８．４でさえＤＥＡＥに結合せず、基質にも吸着されない。やはりここに記載されたものとは異なるＣＭのその他の成分は、ヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合し、脂質輸送に寄与すると思われる、２８kDa のタンパク質であるアポリポタンパク質Ａ［Harel ら（1989）］；細胞外基質のタンパク質分解に関与し、それによって軸索の成長を増進させると思われる、６０〜６５kDa のプラスミノーゲン活性化因子［Sallesら（1990）］；インターロイキン２に似た２８kDa のタンパク質［ＩＬ−２；Eitan ら（1992）］；ＩＬ−２の二量化に寄与し、それを希突起神経膠細胞に有毒にさせると思われるトランスグルタミナーゼ［Eitan およびSchwartz（1993）］；血小板由来成長因子［Eitan ら（1992 ）］；ポリリシン基質に結合し、長い、分岐しない軸索を延伸するよう、哺乳類の胚ニューロンを誘導する２６kDa の酸性タンパク質［Caday ら（1989）、Mol ．BrainRes．、５：45〜50］；およびラミニン、すなわち細胞外基質の主要成分である１０⁶kDa の糖タンパク質［Hopkins ら（1985）；Battistiら（1992 ）；Reichardt およびTomaselli（1991）、Ann．Rev．Neurosci．、14：531 〜7 0］を包含し；Giulian ら（1986a）［J．Cell Biol．、102 ：803〜811］；Giul ian およびYoung（1986b）［J．Cell Biol．、102 ：812 〜820］は、視神経の損傷後に視蓋によって分泌され、神経の特定の大神経膠細胞集団の増殖に寄与する、３、６、９および１２５kDa のポリペプチドを記載している。最後に、脈絡膜叢［Thormodsson ら（1992）、Exp．Neurol.、118 ：275 〜283］および上衣下層［Shashoua（1985）、Cell．Mol．Neurobiol．、５：183 〜207］の細胞が分泌する、３７kDa またはそれ以上の分子量を有する一群の糖タンパク質（エペンジミンまたはＸ−ＧＰ類）が、始動された外植片での軸索の伸長を促進することが示されている［Schmidt ら（1991）］。本明細書に記載の系では、これらの特性に見合う分子が活性であると判明しなかったという事実は、（ａ）ＲＧＣに対するそれらの効果は、あまりにも希薄なためにそのアッセイでは検出されないこと、（ｂ）それらは、初めに生体内で始動されていたＲＧＣでのみ作用するにすぎない可能性があること、または（ｃ）それらの第一義的な効果は、ＲＧＣに二次的に作用するもう一つの細胞型に対するものであることのいずれかを示唆する。 II．栄養因子の特性解析サイズ分離の研究は、ＣＭが２種類の活性成分を含有することを明らかにした。第一の分子は、軸索形成因子１（ＡＦ−１）と呼ばれ、１kDa のカットオフフィルターを通過する。耐熱性であるが、プロテイナーゼＫによる消化に感受性である。第二の分子、すなわちＡＦ−２は、１２kDa の大きさを有し、熱に不安定であり、トリプシン感受性である。ＡＦ−１は、視神経ホモジネートよりＣＭ中で著しく濃縮されるので、能動的に分泌されることを示唆するが、ＡＦ−２は、細胞内と細胞外とで類似の濃度を有する。両因子は、再生応答が、開始病変によって生体内で始動されたか否かとは無関係に、ＲＧＣからの活発な軸索伸長を誘導する。その上、条件設定病変によって増殖するよう始動された神経節細胞は、両因子の不在下では、基本的に伸長を全く示さない。したがって、ここに用いられた実験条件下では、ＡＦ−１および／またはＡＦ−２は、軸索の再生を誘導かつ維持するのに必要である。キンギョの視神経は、希突起神経膠細胞、星状神経膠細胞、マクロファージ、小神経膠細胞および上皮細胞など、いくつかの細胞型よりなる［Battistiら（19 92）］。栄養因子は、これらのいずれからも分泌され得るか、これに代えて、培養中の神経の破砕または切断によって損傷された細胞の細胞質からのみ放出され得るにすぎないかであると思われる。この問題に取り組むため、調整培地（ＣＭ）中と、視神経ホモジネートから調製した細胞質ゾル分画中との両因子の濃度を比較した。ＡＦ−１は、視神経細胞質ゾルよりＣＭ中で有意に高い濃度で存在することが判明し、能動的に分泌されることを示唆した。一方、ＡＦ−２は、細胞内と細胞外とで類似の濃度で存在した。ＣＭ中のタンパク質の大部分が細胞溶解の結果であるならば、細胞内と細胞外とで等濃度で存在するタンパク質は、生理的には、神経損傷後に依然として細胞外に出現し得るものの、通常は、細胞内にのみ存在し得ると思われる。しかし、細胞外に存在するタンパク質の大部分が、能動的な分泌機序に由来するならば、ＡＦ−２は、通常は、生理的に分泌され得ると思われる。C．Stormier 博士（ドイツ国Constants 大学）と共同して実施した研究は、解離させたキンギョ視神経膠細胞から分泌された因子を含有する培地は、認識し得るレベルの3000ダルトン未満の栄養因子、およびより低いレベルの 3000ダルトンより大きいそれを含有することを示した。これらの知見は、ＡＦ− １およびＡＦ−２の発生源であるのは、視神経の神経膠細胞であって、損傷した軸索または血液ではないことを示した。後者の発生源は、他の様々な組織によって条件設定された培地での軸索促進活性の不在によっても、可能性がないと考えられた。ＡＦ−１およびＡＦ−２の特性解析初めに、物質を分子量フィルター、または特定分子量のふるいを通過させた後に、栄養活性の存在を決定することによって、ＡＦ−１およびＡＦ−２を特性記述した。いくつかの方法を用いて、活性因子の大きさを決定した。初めに、１０、１００および1000 kDaの分子量分離限界を有するフィルターを用いて、遠心限外濾過によってＣＭを分離した。濾液および滞留物をバイオアッセイで試験した。次いで、ＣＭを6000ダルトンの脱塩カラムを通過させ、分画を、２８０nmでの吸光度（タンパク質について）、および導電率の測定（塩類を含有する低分子量分画について）によって監視した。高分子量および低分子量の成分を含有する分画を、バイオアッセイによって評価し、双方とも活性であることが判明した。6000 ダルトンより大きい分画を貯留し、3000ダルトンの分離限界を有するフィルターを用いて、１０〜１００倍に濃縮し、次いで、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離した。6000ダルトン未満の低分子量物質を、1000ダルトンの分子量分離限界を有するフィルターを通過させることによって、更に特性解析を行った。次いで、例えばジエチルアミノエチルセルロースカラムでの、栄養因子の陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。初めに、カラムを２５mMのＨＥＰＥＳで洗浄し、次いで、２５mMのＨＥＰＥＳへの０．１、０．２、０．５および１．０モルＮａＣｌで段階的に溶出させた。本明細書に記載したとおりの、分子量と陰イオン交換クロマトグラフィーとに基づくＡＦ−１およびＡＦ−２の精製は、アミノ酸配列を得るのに充分であって、それを用いて、栄養因子をコードしているクローンについて遺伝子ライブラリーをふるい分けるための、オリゴヌクレオチドプローブを生成する。例えば、精製されたＡＦ−１の試料を、質量分光測定によって、最低料金でアミノ酸組成、および厳密な分子量を決定するために、ハーバード大学微量化学施設に提出した。この施設は、最低料金でポリペプチドを微量配列決定することができる。精製された分画は遊離アミノ酸を含有することから、それらを分析以前に除去するのが好ましい。子供病院（Children's Hospital ）は、ペプチド配列をコードしている何通りものオリゴヌクレオチドを、遺伝暗号の縮重を許しつつ生成できる施設を有する。これらのオリゴヌクレオチドは、放射能標識し、ＡＦ −の起源となるポリペプチドをコードしている遺伝子を単離するためのｃＤＮＡライブラリーをふるい分けるのに用いることになる。次いで、ＡＦ−１についての正しいアミノ酸配列をコードしているか否かを決定するために、これを配列決定することになる。配列決定さえしたならば、細胞培養体での組換え配列の発現、天然に産する栄養因子の単離、またはＡＦ−１の場合に好ましくは、合成という手段によって、タンパク質を製造することができる。これらの方法は、当業者には公知である。一例は、米国特許第4,792,525 号明細書に用いられ、米国特許第4,244,946 号明細書に記載された、保護されたαアミノ酸を適切な樹脂とカップリングさせて、ペプチドのＣ末端から出発してペプチドの合成を始動する、J．Merrifield、J． Am．Chem．Soc．、85：2149（1964）によって記載された固相合成である。別の合成方法は、米国特許第4,305,872 号および第4,316,891 号明細書に記載されている。これらの方法は、本明細書に記載の栄養因子と同一の配列、またはアミノ酸の置換もしくは付加を有する、上記および以下の実施例に記載のとおり、活性についてふるい分けできるペプチドを合成するのに用いることができる。 III．診断、スクリーニングおよび単離における栄養因子の用途他の栄養因子の進化論的保存および単離過去１０年前後にわたる研究は、神経系の発生および機能発揮に潜在する分子的要素は、生理学的に古く、脊椎動物の進化を通じて終始高度に保存されたことを明確に示している。遺伝子発現のプログラムを制御する転写因子、公知の栄養因子、細胞認識分子、伝達物質およびそれらの受容体のような分子は、過去数億年にわたって顕著に不変のままであり、そのため、ＡＦ−１およびＡＦ−２の相同な等価体が、ヒトなどの高等脊椎動物の神経系に存在し、本明細書に初めて記載された魚類やラットの栄養因子の類似の構造および配列に基づいて同定できることが予測され得る。その上、これらの分子は視覚系で研究されたものの、網膜および視神経は、個体発生上は、中脳の延長として発生し、基本的には、中枢神経系のその他の部分と同一である。したがって、ＡＦ−１およびＡＦ−２は、哺乳類の網膜神経節細胞に加えて、ニューロンのその他の集団、特に脊髄および大脳皮質にも作用することが期待される。このことは、以下の例によって立証される。大脳皮質でのニューロンに対する損傷は、卒中の際の主要な要因であるが、損傷した軸索を脊髄ニューロンが再生できないことは、事故に起因する多くの類型の麻痺における主な要因である。この因子の広範囲の特異性の確認を、例えば、G．Banker およびK．Goslin 編、 Culturing Nerve Cells（MIT Press，1991）に記載されたとおり、ラット脊髄からの解離したニューロンの一次培養系を用いて、確定した。この系は、ＡＦ−１またはＡＦ−２が培養体中の細胞型のすべてからの軸索の伸長に影響を及ぼすか否かを、基本的には、網膜神経節細胞を用いる以下の実施例に用いた方策に平行して、研究を行うためにも用いることができる。これらの結果の確認は、ＡＦ−１およびＡＦ−２の効果を調べる生体内モデル、例えば哺乳類の脊髄損傷モデルを用いて得ることができる。脊髄を脊柱ごと横に切断し、その後に、ＡＦ−１またはＡＦ−２を、ミニポンプの使用、またはより詳しくは以下に記載のとおり、それらを徐放性カプセルに埋め込むことのいずれかによって、送達した。本明細書に用いられる限りで、別途特定して記述されない限り、用語「ＡＦ− １」および「ＡＦ−２」は、本明細書に記載のとおり精製されたそれぞれのタンパク質およびその変性した変種、ならびに他の生物種、特にヒトその他の哺乳類を起源とするその等価物はもとより、上記に特性記述した神経栄養因子の機能的活性を著しく変化させない、アミノ酸の付加、欠失および置換を有する機能的に等価の変種を意味する。診断およびスクリーニングへの適用本明細書に記載の栄養因子の構造および機能はもとより、これらのタンパク質をコードしているｃＤＮＡ、およびそれらと免疫反応する抗体の理解は、多様な用途を有する。特に、該タンパク質とそれらのＤＮＡとは、下記のような患者の治療ばかりでなく、栄養因子の活性および／または発現を調整する薬物のスクリーニング、ならびに機能的な栄養因子の存在についての患者試料のスクリーニング；ヒトの等価物など、その他の栄養因子についてライブラリーをふるい分けるためのプローブを構成するためのｃＤＮＡ、ならびにこれらおよびその他の栄養因子の発現を制御する調節配列の用途にも用いることができる。例えば、７０７ダルトン（ＡＦ−１）および12000 ダルトン（ＡＦ−２）の栄養因子をコードするとして本明細書で同定したヌクレオチド配列は、関連する栄養因子の存在についてライブラリーをふるい分けるためのプローブとして役立つ。ライブラリーは、望みの種の細胞または組織、例えばヒトの脳から構成し、次いで、これらを、ＡＦ−１またはＡＦ−２のいずれかをコードしているヌクレオチド配列の全部もしくは一部でふるい分ける。問題とされる特定の領域は、ヌクレオチド配列の、異なる栄養因子間；異なる種からの同じ栄養因子間；および該栄養因子の別個の領域内で保存されているタンパク質の領域をコードしている部分である。これらの領域は、当業者には定型的に利用できる方法を用いた、構造的解析によって同定される。これらの方法は、電気泳動による分析、ならびに予測されたアミノ酸配列に基づく構造の、電子顕微鏡およびコンピューターに支援される分析を包含する。アミノ酸配列、および該アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列は、ゲノムに存在する、神経栄養因子が細胞内で発現される程度を制御する調節配列の単離と特性解析、および栄養因子の発現を変化させる薬物のスクリーニングにも用いることができる。栄養因子の発現についての患者試料のスクリーニング本明細書に開示されたタンパク質をコードしている配列は、血液や組織などの患者試料のハイブリダイゼーションアッセイを用いる、栄養因子の存在についての患者試料のスクリーニングに役立つ。スクリーニングは、代表的には蛍光、放射性標識か、または酵素による、標識で標識した抗体を用いるか、あるいは標的細胞の単離、および結合活性のスクリーニングによって、当業者には公知の方法を用いて実施できる。代表的には、定性的または定量的のいずれかの基盤での発現について、および機能的な栄養因子の発現についてふるい分けることになると思われる。ハイブリダイゼーションプローブヌクレオチド配列に対するオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーションのための反応条件は、オリゴヌクレオチドごとに異なり、オリゴヌクレオチドの長さ、ＧおよびＣヌクレオチドの数、ならびにハイブリダイゼーション反応に用いられる緩衝液の組成に依存する。適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、一般に、完全に塩基対合した二本鎖ＤＮＡの融解温度より約２５℃低い条件として、当業者に理解されている。より高い特異性は、一般的には、より高い温度を有するインキュベーション条件、換言すれば、よりストリンジェントな条件を用いることによって、達成される。一般に、配列が長いか、またはＧおよびＣ含量が高ければそれだけ、必要な温度および／または塩濃度も高い。Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、米国ニューヨーク（1990）（本明細書中に参考として包含される）という周知の研究室手引書の第１１章は、必要とされる要因、および特異性を有するハイブリダイゼーションを保証するのに必要なストリンジェンシーの水準の説明など、オリゴヌクレオチドのプローブやプライマーのためのハイブリダイゼーション条件を非常に詳細に記載している。ハイブリダイゼーションプローブの好適な大きさは、長さが１０〜10000 ヌクレオチドである。１０ヌクレオチド未満では、ハイブリダイズさせる系が安定ではなく、２０℃を越えると変性し始めることになる。10000 ヌクレオチドより大では、ハイブリダイゼーション（復元）が、はるかに遅く、かつ不完全な過程になることが判明し、それは、Molecular Genetics、G.S．StentおよびR．Calende r、213 〜219 ページ（1971）に記載されたとおりである。理想的には、プローブは２０〜10000 ヌクレオチドでなければならない。より小さいヌクレオチド配列（２０〜１００）は、自動化された有機合成手法による生産に役立つ。１００〜10000 ヌクレオチドの配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼ処理から得ることができる。より小さいプローブを比較的大型の化学発光部分で標識することは、場合によっては、ハイブリダイゼーション過程に干渉する可能性がある。ＡＦ−１またはＡＦ−２に対する抗体の生産マウスのような動物は、免疫応答を生じるのに有効な、ある量の免疫原の投与によって免疫し得る。該タンパク質が、代表的には高度の進化論的保存を示すことから、進化論的に最も保存された領域に対して免疫反応性である抗体を探して、抗体を試験または使用しようとする種とは異なる起源の種のタンパク質に対する抗体を生成することが、好都合であり得る。必要とされる方法は、当業者には公知である。例えば、マウスの背中に１００ μg の抗原を皮下注射し、次いで、３週後に、１００μg のコカインである免疫原をアジュバント、最も好ましくはフロインドの完全アジュバントとともに腹腔内注射する。マウスの血中に適正な抗体価が達成されるまでは、アジュバント、好ましくはフロインドの不完全アジュバントとともに追加の腹腔内注射が、２週間ごとに必要とされ得る。マウスを融合およびハイブリドーマ形成に用いるには、少なくとも１：5000の抗体価が好ましく、１：100000またはそれ以上の抗体価が最も好ましい。タンパク質が、良好な免疫原でない場合は、当業者に公知の方法によって、免疫応答を誘発するための哺乳類への注射に適した担体と接合することができる。好適な担体は、アルブミン、ジフテリア類毒素および破傷風類毒素を包含するが、他の適切な担体も当業者は容易に決定し得る。ヒトリンパ球の生体外免疫化の手法は、非常に様々なヒトのモノクローナル抗体を生成するために頻用される。例えば、本明細書中に参考として包含される、 T．Inai ら（1993年５月）、Histochemistry（ドイツ国）、99（５）：335 〜36 2 ；A．Mulder ら（1993年３月）、Hum．Immunol．、36（３）：186 〜192 ；H ．Haradaら（1993年４月）、J．Oral Pathol．Med．（デンマーク国）、22（４）：145 〜152 ；N．Stauberら（1993年５月26日）、J．Immunol．Methods（オランダ国）、161（２）：157 〜168 ；およびS．Venkateswaranら（1992年12月）、Hybridoma、11（６）：729 〜739を参照されたい。ＡＦ−１またはＡＦ−２のいずれかと免疫反応性であるＭＡｂを得るには、モノクローナル抗体の技術を用いることができ、これらは、栄養因子の精製に役立ち得る。モノクローナル抗体を製造する方法は、当業者にとって今や定型的である。例えば、本明細書中に参考として包含される、G．Galfre およびC．Milstei n（1981）、Methods Enzymol.、73：3 〜46を参照されたい。略述すると、特定の栄養因子で免疫したマウスからの脾臓細胞を用いて、ハイブリドーマを形成する。免疫した各マウスの脾臓細胞を、例えばG．Galfre およびC．Milstein（198 1）、Methods Enzymol.、73：3 〜46のポリエチレングリコール融合法を用いて、マウス骨髄腫のＳｐ２／０細胞と融合させる。ハイブリドーマの成長、ＨＡＴ培地での淘汰、抗原に対するクローンのクローニングおよびスクリーニングは、標準的方法［G．Galfre およびC．Milstein（1981）、Methods Enzymol.、73：3 〜46］を用いて実施する。ＨＡＴで淘汰したクローンは、G．Galfre およびC．Milstein（1981）、Metho ds Enzymol.、73：3 〜46に記載されたとおり、マウスに注射して腹水中に大量のＭＡｂを生産し、プロテインＡのカラムクロマトグラフィー（BioRad、米国カリフォルニア州Hercules）を用いて、精製することができる。ＭＡｂは、それらの（ａ）特定のタンパク質に対する特異性、（ｂ）高い結合親和性、（ｃ）イソタイプ、および（ｄ）安定性に基づいて淘汰する。ＭＡｂは、ウエスタンブロット法［E．Korenら（1986）、Biochim．Biophys．Acta、876 ：91〜100 ］および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）［E．Korenら（1986）、Biochim．Bio phys．Acta、876 ：91〜100］などの様々な標準的手法のいずれを用いても、特異性についてふるい分けまたは試験できる。組換え栄養因子の発現本明細書に記載したとおり、栄養因子は、天然に産するタンパク質の単離によって得ることができる。しかし、適当な組換え宿主系、例えば哺乳類、酵母、細菌または昆虫の細胞での発現によって、タンパク質、特に、より大きいタンパク質であるＡＦ−２を発現させるのが好ましい。単離は、組換えタンパク質に対する抗体を製造し、次いで、上記のとおり、追加の栄養因子の精製に用いるための基質に固定化することによって、促進することができる。適切なベクターおよび発現系が、例えばInvitrogenおよびStratageneから、商業的に入手できる。場合によっては、エンハンサー、または調節配列もしくはタンパク質コード化配列の多重コピーを発現系に挿入して、発現の操作、およびタンパク質の発現の方法ならびに試薬のスクリーニングを促進するのが好都合であり得る。栄養因子の機能または発現の程度を変更または変化させる薬物のスクリーニング栄養因子は、これらの因子の発現を開始するか、停止するか、または別途に調節する化合物に対する標的として役立つ。上記のアッセイは、明らかに、化合物を神経栄養活性について試験できる、定型的な方法論的体系を提供する。そうして、動物試験によって、神経栄養活性を有すると思われる化合物の生体外での研究が確認される。該分子は、進化論的に保存されているものと期待されることから、ラットのような実験動物で研究を実施して、ヒトにおける効果を予測することができる。最初のデータは、ＡＦ−１が、ラットのニューロン（網膜神経節細胞）からの軸索の伸長を促進することを確認する。あるいはまた、該アッセイは、栄養因子をコードしている遺伝子配列、好ましくは、栄養因子の発現を支配する調節配列との相互作用に基づくことができる。例えば、充分に分化した成熟細胞での栄養因子の発現を妨げる、調節配列に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、標準的なオリゴヌクレオチド合成化学を用いて合成できる。アンチセンスは、標準的な方法論的体系（リポソームまたは微小球への封入；分解に耐性である修飾されたヌクレオチド、またはエンドヌクレアーゼに対する耐性を増大させる基、例えばチオリン酸塩およびメチル化の導入）を用いて、製剤の用途に向けて安定化し、そうして、栄養因子活性の変化について、初めに、栄養因子を発現する、核酸移入されたか、または天然に産する細胞で、次いで実験動物での生体内でふるい分けることができる。代表的には、アンチセンスは、合成を「停止する」配列を遮断することによって、発現を開始するものと思われる。生体内での遺伝子発現を調節するには、栄養因子遺伝子の５’調節配列を含む核酸分子を用いることができる。特定の組換え５’フランキング領域−遺伝子構成体を細胞で、熟練した実践者の選好および判断に応じて発現するには、プラスミドおよび真核ウイルスベクターなどのベクターを用い得る（例えば、Sambrook ら、第１６章を参照されたい）。更に、本明細書中に参考として包含される、Mu lligan（1993）、Science 、260 ：926 〜932 ；米国特許第4,980,286 号明細書；米国特許第4,868,116 号明細書に記載のとおり、生体内での核酸配列の導入を可能にする多数のウイルスおよび非ウイルス性ベクターが開発されつつある。哺乳類に静脈内またはＣＮＳ液に注入できる、陽イオン性リポソームに核酸を封入する送達系が開発されている。この系は、本明細書中に参考として包含されるZh u ら（1993）、Science 、261 ：209 〜211 に記載のとおり、成体マウスの、内皮および骨髄などの多数の組織の細胞にＤＮＡを導入するのに用いられている。オリゴヌクレオチドは、自動化された合成装置（例えばMilligen-Biosearch、米国マサチューセッツ州Burlingtonのモデル８７００自動化合成装置またはＡＢＩモデル３８０Ｂ）で合成することができる。加えて、アンチセンスデオキシオリゴヌクレオチドは、遺伝子転写およびウイルス複製を阻害するのに効果的であることが、Zamecnikら（1978）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、75：280 〜284 ； Zamecnikら（1986）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、83：4143〜4146；Wickstro m ら（1988）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、85：1028〜1032；Crooke（1993）、FASEB J.、７：533 〜539 によって示されている。最近の研究は、本明細書中に参考として包含される、Offenspergerら（1993）、EMBO J．、12：1257〜1262 （アンチセンスチオリン酸オリゴデオキシヌクレオチドによる、アヒル肝炎Ｂウイルス複製および遺伝子発現の生体内での阻害）；Rosenberg ら、国際公開特許第93/01286号公報（チオ硫酸オリゴヌクレオチドの合成）；Agrawal ら（1988）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、85：7079〜7083（ヒト免疫不全ウイルス−１の複製を阻害するためのアンチセンスアミドリン酸およびチオリン酸オリゴヌクレオチドの合成）；Sarin ら（1989）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、85：7448〜 7794（アンチセンスメチルホスホン酸オリゴヌクレオチドの合成）；Shawら（19 91）、Nucleic Acids Res.、19：747 〜750（３’末端アミドリン酸修飾を有するエキソヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの合成）によって報告されたとおり、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、修飾されたヌクレオチドを含むならば、改良された結果を得ることができることを示している。標的配列の特異性を確保するには、オリゴヌクレオチドは、一般的には、長さが１４ヌクレオチドより大でなければならない［Maher ら（1989）；Grigoriev ら（1992）］。多くの細胞は、長さが５０ヌクレオチド未満であるオリゴヌクレオチドを貧欲に取り込む［Orson ら（1991）；Holtら（1988）、Mol．Cell．Biol.、８：963 〜973 ；Wi ckstrom ら（1988）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、85：1028〜1032］。例えば３’エキソヌクレアーゼによる、細胞内分解に対する感受性を低下させるには、オリゴヌクレオチドの３’末端ヒドロキシル基に遊離アミンを、配列結合特異性を失うことなく導入できる［Orson ら（1991）］。更に、やはり配列結合特異性を失うことなしに、オリゴヌクレオチド中に存在し得るいかなるシトシンもメチル化するならば、また挿入剤、例えばアクリジン誘導体を５’リン酸に（ペンタメチレン架橋を介して）共有結合させるならば、より安定な三重らせんが形成される［Maher ら（1989）；Grigoriev ら（1992）］。オリゴヌクレオチドを生成または合成する方法は、当技術に周知である。そのような方法は、例えばSambrookら、第５、６章に記載されたとおりの、標準的な酵素消化後のヌクレオチドフラグメントの単離から、例えば、MilligenまたはBe ckman システム１プラスＤＮＡ合成装置を用いるアミドリン酸シアノエチル法による、純粋に合成的な方法までにわたることができる［Ikuta ら（1984）、Ann ．Rev．Biochem.、53：323 〜356（ホスホトリエステルおよび亜リン酸トリエステル法）；Narangら（1980）、Methods Enzymol.、65：610 〜620（ホスホトリエステル法）も参照されたい］。ＩＶ．神経系の損傷および障害の治療栄養因子は、神経組織の再成長および／または再生を刺激するために使用することができる。近年の研究により、栄養因子とＣＮＳ稀突起膠細胞の表面上にある成長阻害タンパク質をブロックする抗体との組み合わせが、成体の哺乳類において増強された神経突起の伸長を促進することが示された（Schnell ら、（1994 ）Nature，367:170-173 ）。したがって、ラザロイド(LaZaroid)などの遊離ラジカルの生成を防止する薬剤、21−アミノステロイド、またはフェニルブチルニトロンおよびその誘導体などの遊離ラジカル捕捉剤、並びに逆成長阻害分子とともに使用される、ＡＦ−１およびＡＦ−２、またはそれらのヒト相同体は、臨床において重要なはずである。神経系の損傷および障害神経細胞、またはニューロンは、典型的には、核と多くのオルガネラを含む細胞体；刺激を受けるプロセスである樹状突起；神経刺激を発生させ、または筋肉、腺または他のニューロンなどの他の細胞に送るプロセスである軸索からなる。神経繊維は、特別な細胞の鞘で包まれた軸索である。神経繊維の群は脳、脊髄、および末梢神経を形成する。成熟した神経組織中の多くの軸索の有鞘細胞は、末梢神経におけるシュワン細胞であり、中枢神経繊維における稀突起膠細胞である。直径の小さい軸索は通常、鞘を持たず、無髄神経繊維と呼ばれる。細胞の鞘に包まれた太い軸索は、有髄神経繊維と呼ばれる。末梢神経系において、神経繊維が束ねられ、神経を形成する。ほとんどの末梢神経は有髄神経繊維を包んでいる。中枢神経系（脳及び脊髄）における神経プロセスは、細胞体が生きている限り、細胞体の合成活性を介して狭い範囲内で再生することができる。しかし、重要な問題は、このプロセスは通常、大グリア瘢痕組織によるブロックを避けるのに十分な速さでは再生できないことである。かくして、再生は、再生が起こり得る前に物理的障壁によってブロックされるかもしれない。末梢神経系における各種プロセスもまた、この細胞体が生きているかぎり、再生し得る。退行段階および再生段階は記載されているものの、十分には理解されていない。末梢神経が切断された場合には、切断部に近位の軸索部分は、切断部に遠位の軸索セグメントを既に包んでいるミエリン鞘の方向に成長する。その鞘にうまく適合した軸索のみが再生してエフェクター細胞に到達するだろう。かくして、瘢痕組織形成の前にプロセスの成長が起こると、さらに良好な再生が生じる。軸索の退行または軸索の欠失（loss）は、中毒性疾患、遺伝性疾患、外傷性疾患、虚血性疾患において、最も普通に起こる。これは脱髄性疾患と関連して生じる可能性があり、またこれらは遺伝性または自己免疫性炎症性疾患であるかもしれない。軸索の欠損を生じながら退行と脱髄とが混在する病像は、例えば、糖尿病で生じる。外傷による神経プロセス、特に軸索に対する損傷は、脳、脳神経、脊髄、および末梢神経を含む、中枢神経系および末梢神経系で生じ得る。外傷に起因する損傷の型には、直接的な切断、腫れおよび圧迫、挫傷など、影響を受けた軸索の全部分の欠損が生じ得る全ての損傷が含まれる。外傷はまた、微生物および空気の進入路を形成し、神経への血液の供給を断ち切る。神経の軸索の破壊によって機能が損なわれるエフェクター細胞には、骨格筋、血管およびリンパ管の平滑筋、主要器官系の平滑筋が含まれ、呼吸器、泌尿器、および消化器；内分泌腺および外分泌腺細胞；並びに他の神経細胞をも含む。かくして、生体内における実質的にいかなる系の生理学的機能も、軸索の欠失に伴う神経の供給への損傷によって変化し得る。外傷性の損傷の例は、骨格筋に至る運動神経の切断である。切断部に遠位の軸索は、数日経過後に退行する。神経系との接続を断たれた筋肉繊維は、他の神経支配が存在するか否かによって、束収縮、その後の根深い神経除去無栄養症を起こす。このような筋肉は、その神経支配の再生が生じない限り、無機能となる。脱鞘性の疾患はまた、軸索の欠失と関連している。このような疾患は、自己免疫および／またはウイルス感染および遺伝的に決定される欠陥に起因するかもしれず、そして、多発性硬化症、急性播種性脳脊髄炎、および急性壊死性出血性脳脊髄炎（acute necrotizing hemorrhagic encepharomelitis）などが含まれる。脱鞘および軸索の欠失はまた、一酸化炭素などの毒素によって起こり得る。軸索はまた、神経系の退化性疾患を介して、例えば、筋萎縮性側索硬化症および進行性脊髄筋萎縮症（progressive spinal muscular atrophy）；他の運動神経障害；急性、慢性脱鞘、および、大量の砒素による中毒、ウイルス感染（ギヤン−バレー（Guillain-Barre）症候群、ヘルペス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バー）、外科手術による外傷、リンパ腫、狼瘡、糖尿病、異常タンパク質血症、および寒冷傷害（cold injury）などに起因する他の型の多発性神経障害において欠失され得る。軸索の退化後の再生は、重篤度および回復すべき距離によって、２ヶ月〜１年以上を要する。医薬組成物タンパク質を、無機酸（例えば、塩酸、臭素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸）と有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸）とを反応させることによって、または無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム）と有機塩基（例えば、モノアルキル−、ジアルキル−、トリアルキルおよびアリールアミン並びに置換されたエタノールアミン）とを反応させることによって生成される、製剤学的に許容される酸−または塩基−付加塩として投与できる。栄養因子は、アミノ酸を化学的に修飾するかまたは担体分子もしくは不活性基質に接着させることによって、in vivoの半減期を長くすることができる。例えば、このペプチドを、キーホールリンペットヘモシアニンなどの担体タンパク質に、ピアースケミカル社製の市販のInject kitなどの標準的な方法を用いて、そのN-末端のシステインで結合させるか、または融合タンパク質として発現させることができ、この融合タンパク質はin vivoにおける効力が増強され、半減期が長くなっている。シクロプロピルアミノ酸、または同様な様式に誘導体化されたアミノ酸を含むペプチドもまた、使用することができる。これらのペプチドは、それらの本来の活性を保持しているが、in vivoでの半減期が長くなっている。アミノ酸を修飾する方法およびそれらの使用は、例えば、Stammerらの方法について米国特許請求番号第4,629,784に記載されているように、当業者には公知である。患者への投与 in vitroの研究に基づくと、神経の伸長に影響を与えるか、または増強するために必要とされる用量であるIC₅₀は、通常、ピコモルとなる。この用量は、１以上のタンパク質が投与されるか否かに、部分的に依存する。栄養因子は、好ましくは、製剤学的に許容されるビヒクル(vehicle)中で投与される。製剤学的に好適なビヒクルは当業者には公知である。例えば、この化合物は、通常、滅菌水または生理食塩水に溶解されるか、または懸濁される。この化合物はまた、溶液の局所適用によって、局所的に投与することができる。また、この化合物は、リポソームまたはマイクロスフェア（または微粒子）中で投与され得る。患者に投与するためのリポソームまたはマイクロスフェアの製造方法は、当業者には公知である。米国特許公報第4,789,734号には、リポソーム中への生体物質の封入方法が記載されている。すなわち、この物質を水性溶液に溶解し、適当なリン脂質と脂質とを、必要に応じて界面活性剤とともに添加し、そして、必要に応じてこの物質を透析するか超音波処理する。公知の方法の総説としては、GregoriadisによるD rug Carriers in Biology and Medicin eの第14章「リポソーム」、287〜341頁（ Academic Press，1979）がある。ポリマーまたはタンパク質で形成されたマイクロスフェアは、当業者に公知である。マイクロスフェアまたは、マイクロスフェアの複合体は、一定期間、すなわち数日から数ヶ月にわたる緩やかな放出のために埋め込まれる。例えば、米国特許公報第4,906,474、4,925,673および3,625,214を参照せよ。重合デバイス（polymeric device）は、例えば、溶媒流延長、スプレー乾燥またはホットメルトなどのデバイスを通して、または圧縮成型によって麻酔薬を均一に分散させる方法を用いて好適に製造される。デバイスは、マイクロスフェアおよびマイクロカプセルを含めた、平板、ビーズ、ペレット、微粒子として形成することができ、またはペースト状に形成することができる。微粒子、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルは、ここでは総括的に「微粒子」と呼ばれる。このデバイスを、別のポリマーまたは他の物質で被覆して、放出特性を変化させるか、または生体適合性を向上させることができる。微粒子は、懸濁液としてもしくはゼラチンカプセル内のデバイスとして投与することができ、または例えば、ペーストを作るために使用することができる。好適な実施例においては、デバイスは微粒子の形態中に存在する。所望の放出プロファイルは、例えば、１日、３日、および１週間の間にポリマーを放出する、異なる放出率を有するポリマーからなる微粒子の混合物を用いて達成することができるため、各ポリマーそれ自体は同じ期間中に線形の放出をしない場合でも線形の放出が達成される。リポソーム、微粒子または平板(Slab)の好適な投与方法においては、デバイスは、効果が達成される部位に注射することによって投与することができる。また、このデバイスは、その部位に外科的に埋め込むことができる。デバイスの埋め込みは、外科的な場を介してまたは針を経由して臨床治療で行われる。制御された放出はまた、例えば、硬膜上を経由して痛みに対する薬物療法を行うために使用される型のミニポンプによる連続注入によっても行われ得る。本発明は、下記に示す、限定的なものではない実施例を参照することによって、さらに理解されるだろう。実施例１：内因性神経栄養因子を同定するためのモデルの開発視神経の再生を誘導する内因性の因子を同定することができる実験モデルを開発した。低密度で維持された網膜の神経節細胞に富む細胞培養系を樹立し、目的とする神経突起の伸長の定量を行い、そして他の型の細胞によって仲介される間接的な影響を最小限にすることが最終目標であり；さらに、血清の非存在下で培養される「自然のままの」動物の網膜を用いて、伸長を開始させる因子を同定することが重要である。結果から、分離された網膜の神経節細胞は、ここで定義され、確立された無血清コンディション中で十分に生存するが、金魚の視神経のグリア細胞によって分泌される２つの因子のうちの１つと接触しない限り、軸索の伸長はほとんど示さないことが証明された。これらの因子は、(a)１キロダルトンより小さいと思われるプロテアーゼ−感受性の耐熱性分子、および(b)８〜15kDaの熱感受性かつプロテアーゼ−感受性の分子である。逆行標識実験（retrograde labeling experi ments）より、網膜の神経節細胞がこれらの因子の主要な標的であり、これらの分子がin vivoにおける視神経の再生を開始させる上で、主要な役割を果たすという見込みが強いことが示された。方法馴らし培地コメット（Comet）金魚（体長３〜４インチ、Mt．Parnell Fisheries，Ft．Lo udon，PA）を馴らし培地（ＣＭ）の調製に使用し、網膜培養物を分離した。動物を４℃に冷して眠らせ、ついで、頸部を切断した。視神経（ＯＮｓ）および視神経路は、２段階で骨と結合組織から切り離した：眼球から視神経と神経路を得るために、２倍拡大下で肉眼的解剖を行うが、かなりの結合組織と骨とがまだついており、その後第二段階では、卓上用解剖用顕微鏡（Wild）を用いて12倍拡大下で行う。Schwartzら（1985）によって記載され、Finkelsteinら（1987）によって改良された以下の方法は、６個のＯＮｓを３mLのHEPES緩衝Liebovitz L-15培地（Gibco/BRL，Gaithersburg，MD）中に入れ、１〜２mmの切片に切断した。これらを、５％CO₂中、37℃にて３〜４時間インキュベートし、ついで、0.2μｍ孔の低タンパク質−結合シリンジフィルターで濾過滅菌した（Acrodisc，Gelman S ciences，Ann Arbor，MI）。調製後、通常、ＣＭをアリコートに分け、−80℃で速やかに凍結した。しかし、いくつかの実験では、分画前またはバイオアッセイに使用する前に１〜５日間４℃で保存した。タンパク定量（Bradford kit，BSA standard; BioRad，Richmond，CA）は、約100μg/mLの濃度を示す数バッチのＣＭについて行った。視神経手術を解剖前に行う場合は、動物を0.5mg/mLの3-アミノ安息香酸エチルエステル（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）で麻酔し、頭部の位置を固定して、えらに一定量の空気を吹き込んだタンクの水を送るPlexiglass^TMホルダー中に置いた。眼窩の上側の縁に３mm間隔で２つの切り込みを入れ、骨蓋を引っ込ませ、眼窩の軟組織と外膜とを摘出して視神経を露出させた。４号先丸（jewele r's）ピンセットを用いて、眼の１〜２mm後ろの神経を左右対称に押しつぶした。眼窩の出血または神経の横断面は、この研究から動物を排除するための根拠として考慮した。分離した網膜の培養 LandrethおよびAgranoff(1976，1979)、およびDowlingら(1985)Brain Res.，3 60:331-338によって記載された技術を改良して培養物の製造を行った。金魚は屠殺前に少なくとも30分間、覆いをしたタンクに入れて暗順応させた。眼を速やかに摘出し、滅菌したL-15、70％エタノール、およびＬ-15で間を置かずに洗浄した。水晶体、角膜、および虹彩を虹彩用鋏を用いて摘出した。網膜をミクロ解剖鋏と先丸ピンセットとを用いて、25倍拡大下で細切した。４つの網膜を層流フード内の５mLの滅菌消化液中に入れ、ここで、培養物の残りを処理した。消化液を調製するために、100単位のパパイン（Worthington）と2.5mgのL-システイン（S igma）とを５mLのHEPES緩衝L-15に添加してNaOHを用いてpHを7.4にし、濾過滅菌した。45分後に、消化液を５mLの滅菌L-15と交換し、組織をそっと５回つぶして壊し、網膜を小片にした。溶液を、再び５mLの滅菌L-15と交換し、分離した網膜を細かい断片にし、光受容体細胞を除去しつつ、組織を５回激しくつぶした。この工程を新鮮なL-15中で繰り返し、単細胞懸濁液を作製した。連続的なつぶし工程で、ほとんどの光受容体細胞および間葉細胞が除去されるため、神経節細胞の濃度が高くなる。細胞を、ポリ−Ｌ−リシン（分子量300,000以上、Sigma）で被覆した24ウェル組織培養ディッシュ（Costar，Cambridge，MA）にプレートした。最初に、各ウェルに200μLの２×Ｅ培地を入れた。この培地は、Bottenstein(1983)In: Curre nt Methods in Cellular Neurology，vol．IV: Model System．J．L．BarkerとJ ．F．McKelvy，編、107〜130(John Wiley & Sons，New York); Dichter Brain． Res.，149:279-293(1978); Walickeら、J.Neurosci.，6:114-121(1986);およびA izenmanとdeVellis Brain Res.，406:32-42(1987)といった刊行物に基づいて開発した。Ｅ培地は、終濃度、20nMのヒドロコルチゾン、１mMのカイヌリネート（ kinurinate）、100μＭのプトレッシン、20nMのプロゲステロン、30nMのセレン、0.3 Ｍの3，3',5-トリヨード−Ｌ−チロシン、50μg/mLのトランスフェリン、150Ｕ/mLのカタラーゼ、60Ｕ/mLのスーパーオキシドディスミューターゼ、１％のＢＳＡ、10μg/mLのゲンタマイシン、５μg/mLのインスリン、および15ｍＭのHEPES（すべての試薬はSigmaより購入した）を含む。Ｅ培地をpH7.4にし、培養プレートに添加する前に濾過滅菌した。調製を促進し、再生産性を向上させるために、最初の６個の成分を一緒に調製し、25倍濃度で、0.5mLのアリコートで−20℃にて保存した。Ｅ培地を添加した後、各ウェルに50μＬの細胞懸濁液を添加し、ついで、実験サンプルまたは対照サンプルを添加してL-15で150μＬとした。他に記載がない限り、実験サンプルは、研究室の他のメンバーによって盲検ランダム様式でセットしたので、検査者はウェル中に存在している条件を知らなかった。所定の実験の範囲内で、各実験条件について４〜８ウェルを当てた；すべての実験には、少なくとも４ウェルの陽性対照（すでに５〜15％濃度で確認されたＣＭ）と、少なくとも４ウェルのL-15とＥ培地とを陰性対照として含む。評価前に、プレートを５〜６日間、室温にて暗くした加湿タンク内でインキュベートした。多くの実験を、２〜５に分けた調製物からの材料を用いて繰り返した。データは、４〜８の繰り返し実験について、平均±標準偏差で表した。幾つかの実験では、陰性対照における伸長を差し引き、ついで、陽性対照の正味の伸長で割って標準化した。神経突起伸長アッセイ神経突起伸長アッセイは、５日または６日後に定量した。0.1mg/mLの5,6-カルボキシフルオレセインジアセテート（ＣＦＤＡ：Sigma）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で培地を交換し、室温で10分間インキュベートした。生細胞染料であるＣＦＤＡは、生細胞に取込まれ、代謝されて細胞全体に分布する蛍光物質を産生し、細胞の生存率と神経突起伸長とを評価可能にする。培養は、緑色のバリヤフィルターを用いて、100倍の倍率で、蛍光発光を調べた（Nikon AF-BS倒立顕微鏡）。14個の連続する顕微鏡視野（すなわち、１個のウェルの半径）での生細胞の総数をウェルの先頭から記録した。網膜の神経節細胞（ＲＧＣｓ）の形態学的基準と合致する細胞を、逆行標識実験で記載したように（すなわち、プロセスの大きさおよび数）、それらの神経突起の長さ（すなわち、１〜５細胞直径、５〜10細胞直径、10〜20細胞直径、および20細胞直径を超える長さ、に伸長している細胞）によって点数付けした。しかしながら、ほとんどの例では、最後の３つのビンが潰れて神経突起の伸長の単一の測定、すなわち、（［細胞の５直径より大きな神経突起を有する細胞の数］＋［生存細胞の総数］×100）を与えた。網膜の神経節細胞の同定魚を麻酔し、眼蓋上の骨の構造によって定義される頭蓋の領域内で小刀による一連の切開を行った。骨蓋を引っ込ませ、親油性染料である、4-(4-ジドデシルアミノスチリル)−Ｎ−メチルピリジニウムヨージド（４−ジ10 ＡＳＰ：Molec ular Probes，Inc，Portland，OR）を視蓋上に直接置いた。骨蓋を交換し、アロンアルファ（Ted Pella，Inc.）で密着させた。取込まれた細胞が神経節細胞中に戻るまで５〜９日間おき、網膜を摘出して上記のように10％ＣＭまたは陽性対照培地の存在下に培養した。培養６日後、神経突起の伸長を４−ジ−10 ＡＳＰで逆行的に標識された細胞を蛍光顕微鏡で定量した。神経節細胞自体における神経突起の伸長についての情報に加えて、これらの研究は、標準的な異種起源のＲＧＣｓ基準の確立を助けるものであった。実施例２：栄養因子の源の定量栄養因子の源栄養因子が、摘出の間に傷つけられた視神経細胞から能動的に分泌されたものなのか、単に放出されたものなのかを調べるために、ＣＭおよび視神経細胞質の高分子量および低分子量画分の活性を比較した。細胞質画分は、10個の視神経を 25mMのHEPES、pH7.4またはL-15中でホモジナイズして調製した。この抽出物の高速上清を、BioRad^TMのタンパク質アッセイを用いて、全ＣＭにタンパク質濃度を合せた。ついで、視神経の細胞質およびＣＭをCentriprep-3^TMフィルターを用いて高分子量および低分子量画分に分離した。画分をバイオアッセイでスクリーニングした。前記因子はまた、視神経によって選択的に分泌されるかどうかを、標準ＣＭと他の金魚組織によって分泌された因子で馴らした培地とを比較することにより、試験して定量した。３mLのＣＭを調製するために必要な視神経をミンスする前に秤量した。等容の金魚の骨格筋、肝、およびえらの各組織を使用して、上記のように馴らし培地を調製した。網膜の移植培養における成長に影響を与えることがすでに見出された分子の効果を評価するために、10^-9〜10^-3Ｍのタウリン（Sigma）、レチノイン酸（10^-9 〜10^-4Ｍ:Sigma）、およびＮＧＦ（β−サブユニット、100nM: Collaborative R esearch，Bedford，MA）をバイオアッセイで試験した。ＣＭに対するＲＧＣｓの応答が培養中にプレートされた密度に依存するか否かを調べるために、別の実験を行なった。研究全体を通して使用された標準的な細胞密度に加えて、この密度の１／３、１／９および１／27の細胞をプレートした。最後に、「プライム」された網膜の神経節細胞（この細胞はin vivoでそれらの軸索を再生し始めている）の軸索の伸長と、すでにそのままの金魚から摘出した「自然のままの」網膜のそれとを比較するために、実験が行なわれた。網膜は、in vivoで解離とプレーティングに先立って再生プロセスを10日間進めることにより、プライムした。この期間は、網膜移植および一瞬で破壊された神経における軸索伸長を最大限に増強することがすでに知られており（Landreth及びAgranoff，1976）、in vivoでの再生を可能にした（McQuarrie及びGrafstein，(1981)Brain Research，216:25 3-264）。条件の間でなされた比較は、両側Ｔ検定に基づくものである。結果分離された網膜細胞の、視神経由来の因子に対する応答分離された網膜の、視神経によって分泌された因子に対する応答を、染料5,6- ＣＦＤＡを用いて定量した。ベースラインの条件以下では、細胞は生存しているが、ほとんど伸長しない。視神経によって分泌された因子を含むＣＭの添加とともに、10〜17μｍ幅の細胞は、１つまたは２つの均一に薄いキャリバー（calibe r）の長いプロセスを伸ばし、このキャリバーはしばしば顕著な成長の円錐体で終わる。より大きな、多角形の細胞は神経突起の伸長の定量においては見られない。 L-15とＥ培地のみと播種した６日後に、網膜細胞は生存していたが、ほとんど伸長を示さなかった。5,6-ＣＤＦＡによる染色で約70個/mm²であることが明らかになった。14個の顕微鏡の視野（すなわち、１ウェル半径）を計数したところ、 200〜300個/mLであった。視神経によって分泌された因子で馴らした培地を追加すると、軸索に似ている長い神経突起を伸長させるように細胞が誘導された。濃度依存的特性ＣＭ濃度の増加に対する網膜細胞の応答を図１に示した。図１ａは、示された濃度でＣＭとともに培養した５日後の軸索長の分布の棒グラフである。プロセスを１〜５細胞直径分の長さに伸長させている細胞の数はＣＭの濃度が上昇してもほとんど変らないが、プロセスを５細胞直径の長さより大きく伸長させている細胞の数は著しく増加した。図１ｂは、ＣＭの濃度上昇に応答する神経突起の伸長を示す２つの別々の実験の濃度依存曲線である。データは、５細胞直径の長さより大きなプロセスを有する細胞のパーセンテージであり、カットオフ点は図１ａの棒グラフに基づいて選択した。双方の実験で、極大伸長は10％濃度のＣＭに応答して生じた（すなわち、総タンパク質濃度は約10μg/mL）。図１ｃは、２つの独立した実験におけるＣＭ濃度の関数としての細胞の生存のグラフである。図１ａの棒グラフに示したように、ＣＭが存在しないと、４％の細胞が１〜５細胞直径の範囲内の神経突起を有し、１％未満の細胞がこれよりも長いプロセスを有していた。５％濃度のＣＭを添加すると、プロセスの長さの分布は顕著に変化した：７％の細胞が５〜10細胞直径の長さの神経突起を有し、２％の細胞はさらに長いプロセスを有していた。より高濃度（15％）のＣＭでは、１〜５細胞直径の軸索を有する細胞はごくわずかであった。引続く実験すべてのように、結果は各サンプルについて４ウェル以上の平均値±S.E.Mで示した。ここで見出された分布パターンに基づいて、その後の多くの結果を５細胞直径より長い軸索を有する細胞のパーセンテージとして示した。カットオフ点で応答群と非応答群とがよく区別された。図１ｂは、異なるＣＭと網膜の調製物とを使用した２つの連続する実験の濃度依存曲線を示す。10％までのＣＭ濃度では５細胞直径の長さよりも長い軸索を有する細胞が増加し、ついで、レベルが低下した（５％ＣＭ対L-15＋Ｅ培地のみに対する応答における伸長、いずれの実験においてもｐ＜0.001；10％ＣＭでの伸長対５％ＣＭでの伸長、いずれの実験においてもｐ＜0.02；１％未満のエラーバーは示していない；これら２つの実験は、この研究の初期に行なわれ、盲検は行なわなかった）。応答している細胞の最大数は２つの実験の間で幾分相違があり、おそらく２つの調製物中のＲＧＣｓのパーセンテージの相違を反映している。挿入図は、ＣＭが細胞の生存率に影響しないことを証明した。２つの実験から得られたこれらのデータは、14個の連続する顕微鏡の視野（すなわち１ウェルの直径）で計数し、各条件について４ウェル以上を平均した生細胞の数を、ＣＭの濃度上昇で示す。データを陰性対照（２つの実験における播種密度における相違を説明するための）における生細胞の数で標準化した。生細胞数は１つの実験で15 ％ＣＭに応答して上昇するように思われるが、これは統計的に有意ではなく（15 ％ＣＭ対L-15、ｐ＝0.21）、別の実験ではこれは見られなかった。網膜の神経節細胞の同定逆行標識を、網膜の神経節細胞自体における伸長を調べるために使用した。４ −ジ−10 ＡＳＰを視蓋の小さな領域へ適用すると、培養物中の生細胞の４〜５％の逆行標識が生じた。これらの細胞は楕円形で、８〜10×16〜18μｍの大きさであり、SchwartzおよびAgranoff（1981）Brain Res.，206:331-343によって報告されたＲＧＣｓの特質と類似している。４−ジ−10 ＡＳＰで標識された細胞は、L-15とＥ培地のみの存在下においては自発的な伸長をほとんど示さなかった；しかしながら、10％ＣＭへの応答では、これらの細胞はすべての細胞集団で観察された神経突起の伸長の２倍のレベルを示した。ＲＧＣｓの生存率はＣＭによって影響されなかった。網膜のいずれのセットについても、培養物物中における逆行的に標識された細胞数（生細胞の総数によって割った）は、ＣＭの存在または非存在に関わらず４〜５％である。ＲＧＣｓにおける伸長対総細胞の伸長は、いずれの網膜のセットについてもｐ＜0.005であった。親油性の染料４−ジ−10 ＡＳＰを視蓋に培養７日前に適用することにより網膜の神経節細胞を標識した。６日後培地中で、標識細胞がＣＭに応答して１または２のプロセスを伸長させた。これらの細胞は、一般的に１または２の、長く、薄いプロセスを形成した。網膜のいずれのセットでも、逆行標識された細胞の全細胞集団に対する生存率は、ＣＭを添加しても変化しなかった。こうして、ＣＭはＲＧＣｓからの神経突起の伸長を選択的に刺激し、そしてこの効果はこの細胞型の生存率を増強するという結果ではない。この研究はまた、混合された、5,6- ＣＦＤＡ染色培養物中の神経節細胞を区別するための基準（直径、プロセスの数）を提供する。混合培養物中では、神経突起の伸長を、ＲＧＣｓのための基準に合致する細胞のみを計数し、全集団の15〜25％が５細胞直径より長い神経突起を伸長させたということが明らかになった。ＲＧＣｓとして同定された神経細胞の１／３がこれらの条件下で大きく成長しているということが逆行標識の研究から決定されたことから、ＲＧＣｓは混合培養物中の細胞の45〜75％を構成することにつながる。馴らし培地の組織特異性金魚の視神経によって馴らした培地とことなり、等容の金魚の骨格筋、えら、または肝で馴らした培地は神経突起の促進活性をほとんど示さなかった（全サンプルが視神経ＣＭとはｐ＜0.01で相違した；実験は盲検としていない）。実施例３：神経栄養因子の分離および特徴付け視神経ＣＭは２つの栄養因子を含有する。限外濾過により実施された予備分離では、すべての栄養活性が分子量カットオフ１００ｋＤａおよび１０００ｋＤａで限外濾過装置を通過し、また、多量の活性が１０，０００および３，０００Ｄａのカットオフでフィルタを通過することがわかった。分子量カットオフが６ｋＤａのサイズ排除カラム（すなわち、脱塩カラム；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）では、神経突起促進活性が、タンパク質を含有する画分（Ｏ．Ｄ．₂₈₀で分光分析により評価）と低分子量の画分（塩を含有、伝導度の測定により評価）の両方に存在することがわかった。こうした観察に基づき、正常な金魚または両眼の視神経挫傷後３乃至７日の動物のいずれかより切開した視神経から調整培地を調製した後、限外濾過を行い、ＣＭサンプルを３，０００Ｄａ未満のサイズの画分と３，０００Ｄａより大きなサイズの画分に分離した。無傷視神経または損傷視神経のいずれかより得られたＣＭにより、高分子量の神経突起促進因子と低分子量の神経突起促進因子の両方が得られた（全サンプルはｐ＜０．００２の水準でＬ−１５対照よりも高い増殖を示す）。図を単純化するため、まず培地ＥおよびＬ−１５のみで増殖した陰性対照の増殖水準を引き（この特別実験において３±０．２％［平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．］）、次に非分画ＣＭで処理した陽性対照における正味増殖で標準化する（この場合には２１．３±２．３％）ことにより、データが表されている。図２ａにおけるデータは、非分画ＣＭにおけるほとんどの活性が小さな因子に帰するが、これは損傷後３日で集められた物質においては明らかではないことを示す。質的には、高分子量の栄養因子および低分子量の栄養因子の存在が、無傷視神経または損傷視神経のいずかにより調製されたＣＭにおいて繰り返し観察されている。サイズ分画いくつかの方法を用いて、活性因子のサイズを測定した。まず、分子量カットオフが１０、１００および１０００ｋＤａのフィルタ（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いた遠心限外濾過によりＣＭを分離した。濾液および保持液をバイオアッセイで試験した。次に、ＣＭを６ｋＤａ脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）に通し、画分を（タンパク質について）２８０ｎｍでの吸光度により、また（塩を含有する低分子量の画分について）伝導度を測定することによりモニターした。高分子量および低分子量の成分を含有する画分をバイオアッセイにより評価し、図２ａに示すように両方が活性であることがわかった。６ｋＤよりも大きな画分をプールし、３ｋＤａカットオフのＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３^TMフィルタ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて１０−１００倍に濃縮した。次にこの材料をＢｉｏｓｅｐＳｅｃ^TM−Ｓ３０００Ｎキャップ結合シリカカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により分離した。図２ｃに示すように、カラム画分をバイオアッセイでスクリーニングした。さらに、低分子量の材料（６ｋＤａ未満）の特徴を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３^TMフィルタ（Ａｍｉｃｏｎ）または１ｋＤａカットオフのＭｉｃｒｏｓｅｐ^TM（Ｆｉｌｔｒｏｎ、Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）に通過させることにより明らかにした。さらに、凍結乾燥で１５倍に濃縮後、サイズ排除ＨＰＬＣ（Ｂｉｏｓｅｐ^TM ＳｅｃＳ−２０００、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）により分析した。いくつかの小さなペプチド（ロイ−エンケファリン［Ｌｅｕ、ＭＷ＝５５６］、ｍｅｔ−エンケファリン［ｍｅｔ、ＭＷ８７７］、アンジオテンシンＩ［ａｎｇｉｏ、ＭＷ＝１２９７］、すべてＳｉｇｍａ製）の溶出時間に基づき、活性因子のサイズは６００〜９００Ｄａ（ダルトン）であるとみられる。加熱およびプロテアーゼ処理ＣＭ中の神経突起促進因子がポリペプチドであるかどうかを決定するため、高分子量および低分子量の画分を１５分間９５℃に加熱または０．１％トリプシンに曝露した。０．１２５％の大豆トリプシン阻害剤を、トリプシンといっしょに、またはトリプシンで１乃至２時間のインキュベーション後に添加した。次にバイオアッセイでサンプルをスクリーニングした。また、３ｋＤａ未満の画分を１０Ｕ／ｍｌで８時間（４９℃）プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、またはプロテイナーゼＫ（ＰＫ、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ：５０μｇ／ｍｌ、５６℃、１時間）に曝露した。インキュベーション後、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３^TMフィルタを用いて低分子量の成分から酵素を分離し、濾液のバイオアッセイを行った。対照として、酵素なしで活性画分を加熱し、熱自体では不活性化を引き起こさないことを確認し、５６℃で１時間、単独で酵素をインキュベートし、濾過し、さらに３ｋＤａ未満の画分に濾液を添加し、プロテアーゼが細胞の増殖に影響を及ぼすような自己融解フラグメントを生成していないことを確認した。熱およびプロテアーゼに対する２つの因子の感度は、両方の因子がポリペプチドであることを示した。９５℃で１５分間加熱後、非分画ＣＭ（５％）はその活性の半分を喪失し、高分子量の画分は、単独で（濃度２０％）ほぼすべての活性を喪失した。５６℃で１時間または９５℃で１５分間単独で処理した低分子量因子の活性喪失は、わずか３０％であった。１時間または２時間のトリプシンへの曝露により、非分画ＣＭの活性は約６０％減少したが、単独での低分子量画分の活性喪失は、トリプシン消化後にはほとんど認められなかった。対照において、トリプシンと同時に添加された大豆トリプシン阻害剤により、活性は喪失されなかった。さらに、プロナーゼ処理（８時間、４０℃）またはプロテイナーゼＫ処理（１時間、５６℃）により、プロテアーゼに対する低分子量因子の感度を検査した。インキュベーション後、限外濾過により酵素から低分子量成分を分離し、バイオアッセイで試験した。対照は酵素の非存在下にインキュベートした。プロナーゼは、トリプシンと同様、低分子量因子の活性に対する影響をほとんど示さなかった。しかし、プロテイナーゼＫは、低分子量因子の活性を８０％減少させた（ｐ＝０．００４で有意なプロテイナーゼＫの存在下および非存在下に５６℃で処理）。このため、大きな因子と小さな因子はいずれもポリペプチドであるとみられる。陰イオン交換クロマトグラフィージエチルアミノエチルセルロースカラム（ＤＥ−５２、Ｗｈａｔｍａｎ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）で陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。ｐＨ８．４の２５ｍＭＨＥＰＥＳでＤＥ−５２ビーズを平衡化した後、０．５ｍｌの割合で水和ビーズ、１０ｍｌＣＭ（６ｋＤａカットオフのサイズ排除カラムを用いて脱塩されていた）を添加した。一夜インキュベート（４℃）後、混合液をピペッドで５ｍｍＩ．Ｄ．、ガラスＥｃｏｎｏ−カラム（ＢｉｏＲａｄ）内に採取した。結合されていない画分および２５ｍＭＨＥＰＥＳによるカラムの最初のリンス液をプールした。次に、連続的に３ｍｌきざみで２５ｍＭＨＥＰＥＳ中の０．１、０．２、０．５および１．０ＭＮａＣｌで結合タンパク質を溶出した。それぞれの画分をアリコートに分け、バイオアッセイのために−８０℃で保存した。ｐＨ１０でＣＭの高分子量画分について、イオン交換クロマトグラフィーも行った。小さな栄養因子は１，０００Ｄａフィルターを通過する。さらに、１，０００ＤａカットオフのＭｉｃｒｏｓｅｐ^TMフィルタを用いたＣＭの分画により、図２ｂにより示される通り、濾液中に高レベルの活性が得られ、１，０００Ｄａ未満の画分対Ｌ−１５対照、ｐ＝０．０１、１，０００Ｄａ未満の画分対総ＣＭ、ｐ＝０．０６となる。しかし、分子がこの細孔サイズを通過できるかどうかは、分子の形状およびそのサイズによって決まるため、これは絶対的にサイズの決定因ではない。さらに、ＨＰＬＣによる試験により、因子のサイズは６００乃至９００Ｄａ（ダルトン）であることがわかった。ハーバード微量化学施設により実施された質量分光分析では、ペプチドは遊離アミノ酸汚染物を有し、質量が約７０７Ｄａ（ダルトン）であることが測定されている。アミノ酸分析により、疎水性残留物が存在しないことがわかり、これはＨＰＬＣで観察された親水性反応と一致する。大きな栄養因子のサイズ評価図２ｃは、サイズ排除ＨＰＬＣで分離した際のＣＭの高分子量画分の溶出を示すグラフである。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｃａｄａｙ，ｅｔａｌ．、１９８９）および今回のクロマトグラムによりわかる通り、ＣＭはタンパク質の複合混合物を含有している。画分のバイオアッセイを最初は２群で行い、プールした画分が活性を示した場合は、それぞれを個別に再スクリーニングし、活性を示さなかった場合は、ペアで再スクリーニングした。一次スクリーニングおよび二次スクリーニングの両方で画分１２および１３に高レベルの活性が観察された（図２ｄ；画分１２対Ｌ−１５、ｐ＝０．０１；画分１３対Ｌ−１５、ｐ＝０．０５３；ほかのすべては有意性なし）。活性因子はシトクロムＣ（１２ｋＤａ；図２ｄ）とほぼ同じ保持時間を示すため、サイズの範囲は８，０００〜１５，０００Ｄａであると推定される。一部の実験では、７０，０００乃至１００，０００Ｄａで活性の追加ピークが観察されているが、これは再現性が示されていない。この大きな分子は不安定であり、変性して１２，０００Ｄａの因子を形成するとみられ、またはある実験条件下に解離するマルティマーの複合体(multimeric complex)であるとみられる。電荷および基質結合イオン交換クロマトグラフィーを用いて、さらに大きな因子を精製した。ＤＥＡＥ−陰イオン交換クロマトグラフィーによるＣＭの高分子量成分の分離を行った。ｐＨ８．４では神経突起促進活性が結合されていない画分で回収されたのに対し、ｐＨ１０では活性因子はカラムに結合され、０．２ＭＮａＣｌで溶出された。ＣＭのいずれの成分も基質結合栄養因子として作用しない。限外濾過（３，０００Ｄａカットオフ）により、ＣＭを高分子量画分と低分子量画分に分離した。大きなタンパク質を上昇させたｐＨに長く曝露させると、その活性が大幅に低下するように思われる。ＣＭの高分子量画分または低分子量画分のいずれかを用いて、最高強度または１：１０希釈のいずれかでポリリシン被覆プレートを一夜インキュベートした。ウェルをリンスし、結合されていない材料を除去した後、Ｌ−１５によるプレートのリンス後には神経突起促進活性は保持されなかった。このため、大きな因子も小さな因子も基質結合増殖因子として作用しない。ＣＭの２相抽出図３は、低分子量因子のＡＦ−１が２相溶媒抽出系を用いて単離できることを示す神経突起伸長のグラフである。陰性対照は培養培地のみであり、陽性対照のレーン２はグリア有鞘細胞により培養培地に分泌された分子の低分子量画分であり、高レベルの軸索伸長を誘発する３，０００Ｄａ未満のＣＭである。この材料をｐＨ７．５の有機溶媒、イソブタノールと混合すると、水相（ｐＨ７．５水）にはほとんど活性が残らない。次に有機相を低ｐＨ緩衝液（ｐＨ２水）と混合すると、生物学的に活性な分子が水相に移り、有機相（ｐＨ２有機）には何も残らない。これにより、低分子量栄養因子ＡＦ−１の一次精製の簡単な方法が提供される。図４は、低分子量栄養因子のＡＦ−１を含有する部分的に精製された抽出物を逆相ＨＰＬＣにより分離すると、ＦＣ、ＦＤ、およびＦＥで示したカラム画分に活性成分が出現することを示す神経突起伸長のグラフである。上述した通り、陰性対照（Ｌ−１５）は組織培養培地のみであり、陽性対照は視神経グリアにより分泌された分子の分画されていない低分子量成分（３，０００Ｄａ未満の１ＣＭ、１０％濃度）であり、ＦＡ−ＦＩは高速液体クロマトグラフィー分離からのカラム画分を示す。２つの因子の細胞内および細胞外の濃度次に、ＣＭおよび視神経ホモジネートの高速上清画分におけるそれぞれの活性を比較することにより、２つの神経突起促進因子が活発に分泌されるかどうかを測定した。サンプルを用いて濃度１０％および２０％でバイオアッセイを行い、視神経サイトゾルのタンパク質濃度を調整し、ＣＭのタンパク質濃度に適合させた（すなわち、１０％濃度はそれぞれについて約１０μｇ／ｍｌの限外濾過前のタンパク質濃度と同等である。これは、ＣＭにおいて認められるほとんどのタンパク質が細胞溶解から生じ、活性分泌によっては生じないという仮説に基づくものである）。低分子量因子は、ＯＮＣｙｔｏ（ｐ＝０．００２）内に比べ、ＣＭ中で遥かに高い濃度を示している。更に２回の実験において反復されたこれらのデータは、より小さい分子が活発に分泌されることを示唆している。より大きな因子は、細胞内及び細胞外で等しい濃度で存在している。視神経に対する傷害の影響栄養因子の発現が視神経傷害の後で変化するか否かを調査するため、０．５mg ／mlの３−アミノ安息香酸エチルエステル（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の中で金魚に麻酔をかけて、頭の位置を固定し曝気されたタンクの定常水流が口及び鰓を通って流れるようにするプレキシグラスホルダーの中にこの金魚を入れた。視神経を露呈させるため眼窩の上縁内で３ mm離して２回の切開を施し、骨の鰓蓋(bone flap)を収縮させ、眼窩柔軟組織及び外膜を切除し、湾曲した４”の宝石商鉗子を用いて眼の後ろで視神経を両側で１〜２mm破砕した。神経が破断されていたり、重大な出血があった場合には、被験動物を除去した。両眼視神経破砕の３日後又は７日後に、正常な金魚又は動物から切除した視神経からＣＭを調製し、その後、６ｋＤａ未満の及び６ｋＤａ以上の分画へと試料を分離させるために選別カラムを用いた。無傷の視神経は又傷害のある視神経のいずれかから得られたＣＭは、高分子量及び低分子量の両方の神経突起促進因子を生成した。（全ての試料はｐ＜０．００２レベルでＬ−１５の対照より大きい伸長を示している）。データは、分画化されなかったＣＭ内の活性の大部分はより小さい因子に起因するとすることができるということを示している。分画化の時点で、視蓋からのＣＭが、各々視神経調整培地内にみられるレベルの約３分の１のレベルで、高分子量及び低分子量の両方の栄養因子を内含することが発見された。細胞密度の影響細胞密度が、ＣＭに対する網膜神経節細胞の応答に影響を及ぼすか否かを見極めるため、これらの研究全体を通して使用された標準密度（約７０細胞／mm²）か、又は益々低くなる密度のいずれかで、網膜を平板固定した。ＲＧＣが、ＣＭの直接的標的であるもう１つのタイプの細胞によって放出された二次的因子に応答している場合、これらのその他の細胞の数及び二次的因子の濃度が減少するにつれて、より低い細胞密度でＲＧＣの応答の低減を発見することになるということが予想される。標準細胞密度の３分の１（約２５細胞／mm²）で、網膜神経細胞は、標準密度（ＮＳ）に比べて僅かに高いＣＭに対する応答を持つように思われ、もう１つの３倍希釈の場合、伸長は、正常の平板固定密度の場合よりもわずか３０％低いだけであった（Ｐ＝０．１８、有意ではない）。標準密度の１／２７では、伸長は有意な減少を示さなかった（ｐ＝０．０５）。プライミング効果の欠如。それまで無傷であった魚又は、再生応答を開始させるべく１４日前に視神経手術を受けた魚のいずれかから切除した網膜を、対照（Ｌ−１５）培地単独、分画化されていない１０％濃度のＣＭ、又は１０％濃度のＣＭの低分子量分画の存在下で解離、培養させた。全てのケースにおいて、ＲＧＣの応答は、「プライミング」病巣によって影響されなかった。これは、ＣＭ中の視神経突起促進因子により、「特定の投薬を受けたことのない(naive)」網膜視神経節細胞が、インビボで再生プロセスが開始された「プライムされた(primed)」細胞と同じ程度まで成長できるようになるか否かを見極めるために行ったものである。それまで無傷であった魚からの４つの網膜を、１０日前に両側視神経手術を受けた魚から４つの網膜と同様にプールした。「特定の投薬を受けたことのない」網膜視神経節細胞と同様に、「プライムされた」ＲＧＣは、対照培地内で自然発生的伸長を殆ど示さなかった。全（非分画化）ＣＭ又は低分子量分画単独（３ｋＤａ未満）の存在下で、「特定の投薬を受けていない」網膜及び「プライムされた」網膜は、同一レベルの神経突起伸長を示した。実施例３：解離された網膜培養上のその他の分子の活性網膜外殖培養の伸長特性を変えるものとして報告されたその他の分子がこの系の中で活性であるか否かを、次に決定した。その他の因子が、ＣＭ中に見いだされる活性を疑似するか否かを調査するために、「プライムされた」網膜培養内の伸長を変調させるものとして報告された２つの小さな分子を、幾つかの巨大分子成長因子と共に試験した。タウリン、レチノイン酸及びＮＧＦは全て、網膜外殖体からの神経突起伸長に影響を及ぼすものとして報告されている。Ｌｉｍａｅｔａｌ．（１９８９）は、ラミニンの存在下でタウリンが、インビボで再生するようプライムされた網膜外殖体からの神経突起伸長を増大させるものの、それまで無傷だった網膜に対しては殆ど影響を及ぼさないということを報告した。タウリンは同様に、棒細胞の分化にも貢献する（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒｅｔａｌ．（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１９；１３１７−１３２８）。細胞分化における傑出した因子であるレチノイン酸（ＲＡ）は、それ自体伸長に影響を及ぼすことなく金魚網膜外殖体内での中間フィラメントタンパク質ＯＮ₁ （ゲフィルチン）及びＯＮ₂の発現を高めるものであることが分かっている（Ｈａｌｌｅｔａｌ．、１９９０）。ＮＧＦ活性は、金魚の脳の中で実証され（Ｂｅｎｏｗｉｔｚ＆Ｇｒｅｅｎｅ，（１９７９）ＢｒａｉｎＲｅｓ．、１６２：１６４−１６８）、視神経ＣＭ内のＮＧＦ様分子の存在は、マウスＮＧＦに対する活性がβ−ＮＧＦ単量体の予想サイズである１２〜１３ｋＤａのタンパク質と交差反応することを示す予備的ウエスタンブロット研究によっても裏付けられている。低い濃度（即ち５ng／ ml）では、哺乳動物のＮＧＦのβ−サブユニットは、in vivo で成長するプライムされた金魚の網膜外殖体からの神経突起の伸長を増大させ、一方、ＮＧＦに対する抗体は、血清の存在下に維持されたプライムされた網膜外殖体からの伸長を抑制させる（Ｔｕｒｎｅｒｅｔａｌ．、１９８２）。しかしながら、ＮＧＦは、プライムされていない網膜の外殖体に対して（Ｔｕｒｎｅｒｅｔａｌ．、１９８２）も、又in vivo での軸索伸長速度に対して（Ｙｉｐ＆Ｇｒａｓｆｓｔｅｉｎ、１９８２）も殆ど影響を及ぼさない。従って、ＮＧＦはこの系においてモジュレータの役目を果たす可能性が高いものの、軸索伸長を直接誘発するとは思われない。ＮＧＦは、グリア細胞を刺激して、それ自体神経細胞に作用する因子を放出することができる。生物検定では、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ−３）、ＮＴ−４−５、繊毛神経細胞栄養因子（ＣＮＴＦ；全て、１〜１００ng／ml でテスト、Ｒｅｇｅｎｅｒａｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹからのもの）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、１〜１００ng／ml）及び塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＰａｔｒｉｃｉａＤ’Ａｍｏｒｅ博士より寄贈、１〜１００ng／ml）も試験した。この細胞系においては、１μm〜１０mMの間の濃度のタウリンは、全く効果を持たず、１０^-9と１０^-4の間の濃度のレチオニン酸も全く効果を示さなかった。予備的実験は、５０nMで解離された網膜細胞神経に対するＮＧＦの効果を全く見い出せず、５００nMで弱い刺激が発見された。結果をみると、プライムされた外殖培養内で軸索伸長を増大させる用量の２０倍である１００nMで、ＮＧＦ活性が存在しないことが分かる（ＴｕｒｎｅｒｅｔＡｌ．、１９８２）。神経成長因子（ＮＦＧ）は、これらの培養内で神経突起の伸長を惹起することができなかったものの、それでも、間接的に視神経の再生に貢献する可能性がある。その他のニューロトロフィンは同様に、広い濃度範囲にわたって伸長を誘発することができなかった：１０pg／mlと１００ng／mlの間でＢＤＮＦ、ＮＴ−３及びＮＴ−４／５を試験したが、全て軸索伸長を全く惹起できなかった。１〜１００ng／mlの間で試験された非ニューロトロフィン成長因子は、酸性及び塩基性の繊維芽細胞増殖因子及び繊毛神経栄養因子を含んでいた。これらも同様に全く効果を示さなかった。実施例４：調整培地の組織特異性活性因子が視神経に対して特異的だったか否かを、その他の金魚組織により分泌された因子を含有する培地と標準ＣＭを比較することによって検討した。３ml のＣＭを調製するのに必要とされる視神経を、切り刻む前に秤量した。金魚の肝臓、鰓及び骨格筋からの組織を等質量用いてその他の調整培地を調製した。その他の脳組織を評価するために、金魚の視蓋を６つ用いて調整培地を調製した。視蓋調整培地のタンパク質濃度を標準の視神経調整培地のものに符合させて、生物検定を行った。金魚の視神経で調整された培地とは異なり等質量の金魚の骨格筋、鰓又は肝臓によって調整された培地は、神経突起促進活性を殆ど示さなかった。全ての試料はｐ＜０．０１で視神経ＣＭと異なっている。視蓋により調整された培地は、視神経ＣＭにタンパク質濃度を符合させられた場合（即ちｃ．タンパク質１０μｇ／ml）、視神経調整培地の活性の約３分の１を示した。２つの因子間の相互関係は、この時点で明確に理解されていない。ＡＦ−１及びＡＦ−２は、各々これらの検定おいて独立して神経突起伸長を誘発することができ、それらの効果は相乗的であるとは思われない。それでもin v ivo では、これらが相補的に機能することが可能である。同様に、ＡＦ−１がＡＦ−２の分解から誘導される可能性もある。培養には様々な細胞型が内含されていることから、ＡＦ−１及びＡＦ−２が網膜神経節細胞に直接作用せず、むしろ媒介としてもう１つの細胞型に対し作用し得るという可能も尚存在している。Ｓｃｈｗａｒｔｚ＆Ａｇｒａｎｏｆｆ（１９８１）が観察しているとおり、ＲＧＣは、上述のように調製された解離した金魚網膜培養内で優性な細胞型であり、支持細胞は豊富でない。かくして、支持細胞の増殖を抑制するのではなく、ＣＭの濃度を一定に保ちながらもう１つの細胞型により放出され得るあらゆる二次的因子の濃度を低下させるべく系統的に細胞密度を低減させた。細胞濃度の９分の１の減少全体にわたって神経突起の伸長は著しく減退しなかったことから、ＲＧＣはＣＭに対し直接応答していると思われる。しかしながら約３細胞／mm²の細胞密度では、伸長は正に著しい減退を示した。これは、培養内のもう１つの細胞型又はＲＧＣ自体から放出された栄養因子の濃度の低下の結果であると考えられ、これは、ＣＭに応答できる状態に細胞を維持するのに必要とされることである。これらの発見事実は、ＲＧＣからの軸索伸長を誘発する上でのＡＦ−１及びＡＦ−２の特異性に対する更なる裏付けを与えている。実施例５：魚由来のＡＦ−１は、哺乳動物の網膜神経節細胞の軸索再生を刺激する。金魚の神経細胞からの軸索伸長を刺激する低分子量ペプチドが哺乳動物の網膜神経節細胞（即ち網膜の主要突出神経細胞）からの軸索再生をも刺激するか否かを見極めるために研究を行った。胎生１５日の脊髄からの解離された神経細胞を、神経基本培地か又は血清で補足されたダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）のいずれかの中で培養した。図５ａ−ｄに示されているとおり、一定数のブラインド実験において、軸索誘発因子１（ＡＦ−１）が、生後１０日目のラットから誘導された網膜の解離培養内で著しいレベルの軸索伸長を誘発することが繰り返し発見された。神経基本培地内では、ＡＦ−１を添加することにより、全体的神経突起伸長が約２．５倍増大し（図５ａ）、細胞の生存は７５％増大した（図５ｂ）。全体的な細胞の生存を改善させた条件下では、ＡＦ−１は、細胞の生存度に対してもはや影響を持たなかったが、神経突起伸長における約２．５倍の増大をなおも引き起こした（図５ｃ及び５ｄ）。結果は、神経突起伸長に対するＡＦ−１の影響が、特定の細胞下位母集団を生存させたか又は全体的細胞の生存度を改善したことの単なる帰結ではないということを立証している。実施例６：ラットの網膜神経節細胞に対する金魚から誘導されたＡＦ−１の効果金魚由来のＡＦ−１が同様に、培養中に軸索を伸長させるよう哺乳動物の脊髄の神経細胞をも刺激するか否かを知るために研究を行った。これらの研究においては、胎児性ラット脊髄から神経細胞を誘導した。Ｇ．Ｂａｎｋｅｒ及びＫ．Ｇｅｓｌｉｎ．ｅｄｓ．神経細胞培養（ＭＩＴプレス、１９９１）によって記述されているラット脊髄からの解離された神経細胞の一時的培養系を用いて、因子の広い特異性を確認した。この系は、ＡＦ−１又はＡＦ−２が培養中の細胞型全てからの軸索の伸長に影響を及ぼすか否かを研究するためにも使用することができる。生後７日目〜１０日目のラットの網膜をＤＭＥＭ内で解離、培養した。顆粒状ブルーで視神経の軸索を予め標識付けし、色素が網膜へ逆行的に輸送されるよう３日間放置することによって、神経節細胞を同定した。ＡＦ−１が無い状態で、約５％の網膜神経節細胞が、軸索の長さを細胞直径の５倍から１０倍にまで拡張し、わずか１％がこれより長く軸索を拡張した。低いナノモル範囲内のＡＦ−１の添加により、細胞直径の５〜１０倍の軸索を持つ細胞の数は倍増し、細胞直径の１０倍以上の大きい軸索を持つ細胞数はほぼ１０倍増大した。細胞の生存にはいかなる効果もみられなかった。結果は図６ａ〜６ｄに示されている。図６ａ及び６ｂに示されている研究においては、細胞の生存及び軸索外殖の両方に対するＡＦ−１の効果を実証するために培地を用いた。図６ｃ及び６ｄに示された研究においては、培地条件を変更した。生存効果は全く明白ではなかったが、ＡＦ−１がなおも軸索外殖における大きな増大を引き起こすことが分かった。実施例７：哺乳動物のＣＮＳから誘導されたグリア細胞の培地内に存在する金魚由来のＡＦ−１に比較できる因子の同定哺乳動物のＣＮＳから誘導されたグリア細胞が、そのサイズ及び生物活性について、金魚から誘導されたＡＦ−１に似ている因子を分泌することを実証するための研究が行われた。血清含有培地内で、真正ラットの脳のグリア培養をほぼ周密性にまで成長させた。２４時間グリアにより分泌された因子を収集するするため、培地を規定の血清無しの培地に変えた。グリア調整培地（「ＭＧＣＭ」）を限外濾過により高分子量と低分子量の成分に分離し、１０００Ｄ未満の分子量を持つ画分を標準金魚検定において活性について検定した。この成分のサブ画分を、逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって得た。疎水性逆相Ｃ−１８カラムに結合しなかったサブ画分（画分４．５及び６．７）も同様に検定した。図７は、哺乳動物のグリア細胞がＡＦ−１に類似した因子を分泌することを示すグラフであり、様々な画分について長さが細胞直径の５倍以上である軸索を持つ神経突起伸長の細胞の割合をグラフに表している。１０００ダルトン以下の分子量を持つ画分及びＨＰＬＣ溶離液からの画分の両方は、金魚から誘導された化合物に対しほぼ同等の活性を有していた。これらの研究は、全て考え合わせると（ａ）ＡＦ−１が下等脊椎動物からの神経細胞に対してと同様に哺乳動物の神経細胞に対しても作用すること、（ｂ）ＡＦ−１が、網膜神経節細胞に加えて神経系のその他の細胞をもターゲティングすること、及び（ｃ）哺乳動物のグリア細胞によって、比較可能な分子が生成されること、を立証している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 ＡＢＬ (72)発明者アーウィン，カーリーンエイ. アメリカ合衆国 02167 マサチューセッツ州ニュートン，ブルックリンストリート 105番地 (72)発明者ジャクソン，ポールアメリカ合衆国 02146 マサチューセッツ州ブルックリン，ナンバー５，ワシントンストリート 471番地

Claims

【特許請求の範囲】１．グリア有鞘細胞を培養した培地から分子量分離、２相抽出および逆相高速液体クロマトグラフィーにより単離することができ、９５℃で１５分加熱後に活性を保持し、プロナーゼおよびトリプシンによる消化後に活性を保持し、かつ親水性である、質量分光分析法で分子量約７００ダルトンのポリペプチド、およびグリア有鞘細胞を培養した培地から分子量分離およびアニオン交換クロマトグラフィー（その場合、下記タンパク質はｐＨ１０でカラムに結合するがｐＨ８．４では結合せず、0.2M NaCl で溶出可能である）により単離することができ、９５℃ で１５分加熱後に失活し、かつトリプシンまたはプロテイナーゼＫによる消化後に失活する、分子量約１２，０００ダルトンのタンパク質、よりなるタンパク質群から選ばれる神経栄養ポリペプチド。２．動物への投与に適した製剤学的担体をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。３．担体がリポソーム、微小粒子、ポリマースラブ、およびポンプよりなる群から選ばれる持続放出デバイスである、請求項２に記載のポリペプチド。４．フリーラジカルの生成を防止する薬剤、フリーラジカル捕捉剤、および逆成長(counter growth)阻害分子の群から選ばれる化合物をさらに含む、請求項２に記載のポリペプチド。５．動物への投与に適した製剤学的担体中の有効量の神経栄養タンパク質に神経細胞をさらすことを含んでなる軸索伸長を誘導する方法であって、該神経栄養タンパク質が、グリア有鞘細胞を培養した培地から分子量分離、２相抽出および逆相高速液体クロマトグラフィーにより単離することができ、９５℃で１５分加熱後に活性を保持し、プロナーゼおよびトリプシンによる消化後に活性を保持し、かつ親水性である、質量分光分析法で分子量約７００ダルトンのポリペプチド、およびグリア有鞘細胞を培養した培地から分子量分離およびアニオン交換クロマトグラフィー（その場合、下記タンパク質はｐＨ１０でカラムに結合するがｐＨ８．４では結合せず、0.2M NaCl で溶出可能である）により単離することができ、９５℃で１５分加熱後に失活し、かつトリプシンまたはプロテイナーゼＫによる消化後に失活する、分子量約１２，０００ダルトンのタンパク質、よりなるタンパク質群から選ばれる、上記の方法。６．担体がリポソーム、微小粒子、ポリマースラブ、およびポンプよりなる群から選ばれる持続放出デバイスである、請求項５に記載の方法。７．フリーラジカルの生成を防止する薬剤、フリーラジカル捕捉剤、および逆成長阻害分子の群から選ばれる化合物を神経栄養タンパク質とともに投与することをさらに含む、請求項５に記載の方法。８．グリア有鞘細胞を培養した培地から分子量分離、２相抽出および逆相高速液体クロマトグラフィーにより単離することができ、９５℃で１５分加熱後に活性を保持し、プロナーゼおよびトリプシンによる消化後に活性を保持し、かつ親水性である、質量分光分析法で分子量約７００ダルトンのポリペプチドをコードする配列、およびグリア有鞘細胞を培養した培地から分子量分離およびアニオン交換クロマトグラフィー（その場合、下記タンパク質はｐＨ１０でカラムに結合するがｐＨ８．４では結合せず、0.2M NaCl で溶出可能である）により単離することができ、９５℃で１５分加熱後に失活し、かつトリプシンまたはプロテイナーゼＫによる消化後に失活する、分子量約１２，０００ダルトンのタンパク質をコードする配列、よりなる群から選はれるヌクレオチド配列。９．グリア有鞘細胞を培養した培地から分子量分離、２相抽出および逆相高速液体クロマトグラフィーにより単離することができ、９５℃で１５分加熱後に活性を保持し、プロナーゼおよびトリプシンによる消化後に活性を保持し、かつ親水性である、質量分光分析法で分子量約７００ダルトンのポリペプチド、およびグリア有鞘細胞を培養した培地から分子量分離およびアニオン交換クロマトグラフィー（その場合、下記タンパク質はｐＨ１０でカラムに結合するがｐＨ８．４では結合せず、0.2M NaCl で溶出可能である）により単離することができ、９５℃ で１５分加熱後に失活し、かつトリプシンまたはプロテイナーゼＫによる消化後に失活する、分子量約１２，０００ダルトンのタンパク質、よりなるタンパク質群から選ばれる神経栄養タンパク質と免疫反応性の抗体。