JPH10505321A - 子宮内膜症の処置における抗ｖｅｇｆ因子の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 子宮内膜症の処置に使用するための組成物であって、VEGFの産生および／または活性を妨げ得る因子および生理学的に受容可能なキャリア物質を含む、組成物；子宮内膜症の処置のための組成物であって、腹腔マクロファージの活性化および／または漸増加を阻害する因子および生理学的に受容可能なキャリアを含む、組成物；ならびに該組成物を作成する方法、および子宮内膜症の処置におけるそれらの使用を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 子宮内膜症の処置における抗VEGF因子の使用発明の分野 本発明は、特定の組織における血管内皮成長因子(VEGF)およびその関連レセプ ター(FltおよびKDR)の発現の発見に関し、その結果として、子宮内膜症および関 連症状の処置／予防におけるVEGFアンタゴニストの潜在能力を実証する。発明の背景 子宮内膜症は、子宮腔外部における子宮膜細胞の存在と規定されている。本疾 患は、出産可能期間の女性に影響し、有害な社会的、性的、および生殖的結果を 伴う。子宮内膜症の発症および維持は、逆行性月経後の異所部位(最も多くは骨 盤腹膜)での子宮膜細胞の樹立およびその後の増殖の持続に関与する(Sampson 19 27 Am．J．Obstet．Gynecol．14，422; RidleyおよびEdward 1958 Am．J．Obste t．Gynecol．76,783-790；LieuおよびHitchcock 1968 Br．J．Obstet．Gynecol ．93，859-862；ならびにThomasおよびPrentice 1992 Repro．Med．Rev．1，21- 36)。卵巣ステロイドホルモンの影響(Dizeregaら、1980 Fertil．Steril．33，6 49-653；Bergqvistら、1985 Am．J．Pathol．121，337-341)を除いて、この疾患 を制御する因子についてはほとんど知られていない。しかし、異所性子宮内膜着 床物の増殖は、血管新生成長因子(血管新生は、新しい血管の形成を示す名称)の 影響を受ける。 子宮内膜症病巣は、子宮内膜症組織よびその周辺腹膜の両方における血管過多 形成を特徴とする(Shaw、46-47頁、「子宮内膜症のアトラス」、1993、The Part henon publishing group；ならびにFolkmanおよびShing 1992 J．Biol．Chem．2 67，10931-10934)。血管内皮成長因子(VEGF)は、最近特徴づけられた血管新生タ ンパク質であり、これは内皮細胞に対する強力なマイトジェンおよび血管透過性 のメディエーターである(Ferraraら、1992 Endocrinol．Rev．13，18-32)。VEGF およびそのレセプター(fltおよびKDR)は内皮細胞上で発現され(De Vriesら、199 2 Science 255，989-991)、発達期の胎児における血管新生(Breierら、1992 Dev elopment 114，521-532；Jakemanら、1993 Endocrinology 133，848-859；およ びMillauerら、1993 Cell 72，835-846)、ならびに正常部位の子宮内膜(eutopic endometrium)(Charnock-Jonesら、1993 Biol．Repro．48，1120-1128)および黄 色化黄体(lutenised corpus luteum)(Ravindranathら、1992 Endocrinology 13 ，254-260)のような深刻な血管形成を経験している成人組織に関係している。さ らに、腫瘍血管形成におけるその役割については、かなり確立されつつある(Shw eikiら、1992 Nature 359，843-848；Kimら、1993 Nature 362，841-844)。 本発明者らは、VEGFおよびその関連レセプターfltが子宮内膜組織に存在する かどうかを決定しようとした。さらに、本発明者らは、腹腔マクロファージのよ うな他の細胞(その数および活性化状態がこの疾患において上昇する(Halmeら、1 983 Am．J．Obstet．Gynecol．145，333-337；Oliveら、1985 Fertil．Steril． 44，772-777；およびHalmeら、1987 Am．J．Obstet．Gynecol．156，783-789)こ とが知られている)もまた、VEGFの分泌による子宮内膜症の病因に関与し得るか どうかを決定しようとした。発明の要旨 第１の局面において、本発明は子宮内膜症の処置における使用のための組成物 を提供する。この組成物は、VEGFの産生および／または活性を妨げ得る因子、お よび生理学的に受容可能なキャリア物質を含む。 本発明に従う組成物に使用するための多くの可能な因子が存在し、これらは選 択された因子の作用形態に依存してその性質がかなり変化し得るようである。 例えば、因子を使用して、全身的に、または好ましくは局所的(すなわち、子 宮内膜症組織またはその周辺)にVEGFの産生をブッロクし得る。望ましくは、因 子を使用して局所マクロファージによるVEGFの産生をブロックし得る。局所のマ クロファージによるVEGFの産生は、病因に特に重要な役割を演じていると思われ る。VEGFの発現はステロイドによって調節され得ることが明らかにされており( 例えば、Charnock-Jonesら、1993 Biology of Reproduction 48，1120-1128)、 そしてマクロファージはステロイドレセプターを有すると思われる。したがって 、 ステロイド経路を調節する物質は、特にマクロファージにおけるVEGF産生のダウ ンレギュレーションに有用であり得る。多くのステロイドおよびステロイドイン ヒビターが公知である(例えば、エストロゲンおよび抗エストロゲンのタモキシ フェン；プロゲステロンおよび抗プロゲストゲンRU 486)。 別の因子としては、VEGFアンチセンスRNAまたはリボザイム(例えば、Zaugら、 1986 Nature 324，429-433)が挙げられ、いずれも特異的に使用されて、VEGF mR NAの翻訳を阻害し得る。いずれの特異的アプローチも、あまり目的とされない因 子に比べると望ましい。 他の因子を使用して、VEGF活性をブロックするか、または阻害し得る。これら には、例えば、VEGFがKDRおよび／またはfltレセプター(例えば、WO94/10202に 記載)に結合することを阻害する抗VEGF抗体(あるいは、Fv、Fab、またはscFv部 分のような、抗VEGF抗体の有効部分)；KDRおよび／またはfltレセプター(例えば 、VEGFに結合する、末端を切断した可溶性形態のfltレセプター、例えば、WO94/ 21679に記載)への結合についてVEGFと競合し得るVEGFアンタゴニスト；およびVE GFがその効果を発揮する細胞に導入され得るチロシンキナーゼインヒビターが挙 げられる。好ましくは、これらは比較的小さなペプチド(便宜的には合成ペプチ ド)か、またはマクロファージによって有利に補食される粒子(リポソームなど) 内にパッケージされ得る薬剤の形態をとる。 また他のグループの因子を使用して、子宮内膜症組織およびその周辺の細胞に おけるfltおよび／またはKDRの発現を阻害し得る。このような因子としては、fl tおよび／またはKDR mRNAの翻訳を特異的に阻害するアンチセンスRNAまたはリボ ザイム、または遺伝子治療法に使用される因子を含み得る。後者のカテゴリーの １例として、適切な標的細胞が機能性VEGFレセプターを発現することを防止する ために、典型的には、レトロウイルスベクターによって、この細胞に「優性なネ ガティブレセプター」遺伝子(Millauerら、Nature 367，576-579を参照のこと) を導入してもよい。 好ましくは、組成物は、子宮内膜症組織またはその周辺のマクロファージに対 して標的化される因子を含む。都合の良いことに、因子は、マクロファージ特異 的細胞表面マーカー(CD14のような)に対するリガンドと会合する。このマーカー は、マクロファージに対して因子を標的化するのに役立ち得る。 因子のこれらのカテゴリーは相互に排他的である必要はなく、そして実際は、 もし組成物が２つ以上の因子(好ましくは異なる作用形態を有する)を含むならば 、いくらかの協同作用をうまく生じ得ることが理解される。 本発明に従う組成物は全身投与(例えば、i-v)または局所投与し得る。腹腔内 投与または子宮内投与も十分に有利である。適切な投与用量および投与経路を、 発明的努力を駆使する必要のない試行錯誤によって解明し得る。 さらなる局面において、本発明は子宮内膜症の治療のための組成物を提供する 。この組成物は、腹腔マクロファージの活性化および／または漸増加を阻害する 因子および生理学的に受容可能なキャリア物質を含む。 このような特性を有する因子としては、マクロファージの活性化および／また は漸増加を特異的に阻害し得るサイトカイン(cvytokine)のような免疫調節因子 ；適切なマクロファージレセプターをブロックする抗体(またはその有効部分)； マクロファージの活性化／漸増加シグナル(例えば、抗体、特異的アンタゴニス ト)を阻害する物質；またはマクロファージの活性化を導くポリペプチドをコー ドするmRNAのマクロファージにおける翻訳を妨げるアンチセンスRNAまたはリボ ザイムが挙げられる。 したがって、本発明はまた、子宮内膜症を処置する方法であって、患者に、有 効量の上記で規定される組成物の１つまたは両方を投与する工程を包含する方法 を提供する。 さらなる局面において、本発明は、子宮内膜症の処置に使用するための組成物 を製造する方法であって、生理学的に受容可能なキャリア物質とVEGFの産生およ び／または活性を阻害し得る因子とを混合する工程を包含する方法を提供する。 別の局面において、本発明は、子宮内膜症の処置に使用するための組成物を製 造する方法であって、生理学的に受容可能なキャリア物質と腹腔マクロファージ の活性化および／または漸増加を阻害し得る因子とを混合する工程を包含する方 法を提供する。 以下に、例示によって、そして添付の図面を参考にして本発明をさらに説明す る。添付の図面において： 図１は、子宮内膜症組織細胞および腺上皮におけるVEGF mRNAのインサイチュ での局在を示唆する４つの顕微鏡写真を示す； 図２は、VEGFタンパク質について免疫組織化学染色に供した子宮内膜症組織の ４つの顕微鏡写真(Ａ−Ｄ)を示す； 図３は、VEGFタンパク質(顕微鏡写真Ｃ)またはCD14(顕微鏡写真Ｄ)について免 疫組織化学染色に供した子宮内膜症組織の４つの顕微鏡写真(Ａ−Ｄ)を示す； 図４は、VEGFタンパク質について免疫組織化学染色に供した、子宮内膜症被験 体(顕微鏡写真Ｃ)または非子宮内膜症被験体(顕微鏡写真Ｄ)由来の単離された腹 腔マクロファージの顕微鏡写真(Ａ−Ｄ)を示す； 図５は、正常被験体または子宮内膜症被験体から抽出された腹膜液についての 酸性ホスファターゼ活性(ユニット/ml)の棒グラフである； 図６は、子宮内膜症被験体および正常被験体由来の腹腔マクロファージから調 製したcDNAについてのKDR(上のパネル)またはflt(下のパネル)に特異的なプライ マーを用いるPCR産物のアガロースゲル分析の写真である。 図７および８は、fltまたはKDRに対する抗体を用いて、被験体から単離された 腹腔マクロファージのFACS分析の結果を示すグラフである。 図９は、子宮内膜症被験体および正常被験体から単離されたKDR＋腹腔マクロ ファージの百分率を示す棒グラフである。 図10は、子宮内膜症被験体および正常被験体から単離された腹腔マクロファー ジのVEGFへの走化性応答(移動)を示す棒グラフである； 図11は、子宮内膜症被験体および正常被験体の腹膜液におけるVEGF濃度(ng/ml )を示すグラフである；そして 図12は、子宮内膜症被験体および正常被験体から単離された腹腔マクロファー ジで馴化した培地に曝した後の、ヒト膳静脈内皮細胞(HUVEC)における³Hチミジ ンの取り込みの棒グラフである。実施例 方法患者の詳細 不妊症について選択的腹腔鏡検査を受けている24から44歳の女性を本研究に用 いた。腹腔鏡検査後、患者を正常または子宮内膜症と診断し、そしてAmerican F ertility Society(AFS)により定められた条件に従って評価した。子宮内膜症と 思われる組織を生検し、そして診断を組織学的に確認した。異所性および正常部 位の子宮内膜生検、腹膜液、および末梢血液サンプルを、６名の子宮内膜症患者 のそれぞれから採取した。腹膜液、子宮内膜、および血液をまた、６名の月経周 期が一致した非子宮内膜症コントロール(cycle matched non-endometriotic con trol)から得た。表１は、６名の子宮内膜症患者の詳細、ならびに一致した異所 性および正常部位子宮内膜組織において、VEGF mRNAに対して特異的なプローブ を用いたインサイチュハイブリダイゼーション(下記の通りに実施した)の結果を 示す。 腹腔マクロファージ(PM)の単離 トロカール挿入後、直ちに盲嚢の後方から腹膜液(PF)を吸引した。サンプルを 、400ｇ、10分間の遠心分離により澄明化した；上清を使用時まで-70℃で保存し た。室温で10分間、400ｇで、Ficoll-Hypaque 1077(Sigma.，Poole，UK)による さらなる遠心分離後、ペレットからマクロファージを単離した。リン酸緩衝化生 理食塩水(PBS)中で細胞を洗浄し、そして５mM Hepes、ペニシリン(100mU/ml)、 ストレプトマイシン(100μg/ml)、およびL-グルタミン(２mM)を含有するDMEM-H( Gibco.，Paisley，UK)中１×10⁶細胞/mlの濃度で再懸濁する前に計数した。５% CO₂中、37℃で２時間の処理スライドに対する粘着性により(「粘着性の」マクロ ファージはスライド上に保持されるが、他の白血球は洗い流される)、細胞懸濁 液をさらに精製した。 キット(Sigma.，Poole，UK)を用いる非特異的エステラーゼ染色、およびCD14 に対するマクロファージモノクローナル抗体による免疫組織化学染色(Leu M3)(D ako.，Cambridge，UK)を用いることによって、調製物の純度を測定した。インサイチュハイブリダイゼーション 先に記載のKanzakiの方法(Sharkeyら、1993 Mol．Endo．6，1235-1241)に従っ て、インサイチュハイブリダイゼーションを行った。凍結切片(cryostat sectio n)を、3-アミノプロピルトリエトキシシランをコートしたスライド上で回収し、 空気乾燥し、そしてPBS中の４%パラホルムアルデヒド中で20分間４℃で固定した 。スライドをアルコールで脱水し、そして-70℃で保存した。VEGFのコード領域 の579bpを含むプラスミドを制限酵素Not IまたはBam Iで線状化し、そしてそれ ぞれセンスおよびアンチセンスRNAプローブの作製のためにテンプレートとして 用いた。プローブ１マイクログラムあたり約２×10⁶cpmの³⁵S-UTPを取り込ませ た。アセチル化後、空気乾燥したスライドを50%ホルムアミド、１×デンハルト 溶液(20mM Tris-HCl(pH8.0)、0.3M NaCl、５mM EDTA、10mMリン酸ナトリウム)、 および0.5mg/ml酵母tRNA中で１時間50℃でプレハイブリダイゼーションした。プ レハイブリダイゼーション緩衝液を除き、そしてハイブリダイゼーション溶液(( 上記に加えて)10%硫酸デキストラン、50mMジチオスレイトール、および１×10⁵c pm/ μl³⁵S標識センスまたはアンチセンスプローブを含む)を添加した。50℃で16〜1 8時間、ハイブリダイゼーションを行った。50℃で20分間、(２×)クエン酸ナト リウム生理食塩水(SSC)/14mMβ-メルカプトエタノール中で２回スライドを洗浄 し、(２×)SSC中でリンスし、そして0.5Ｍ NaCl、10mM Tris，pH7.0、１mM EDTA 中、37℃で30分間、RNAse A(10μg/ml)で処理した。スライドを２×SSC中、室温 にて15分間で２回、続いて(0.1×)SSCにより65℃で60分間、洗浄し、次いでエタ ノールのシリーズで脱水した。スライドをIlford K5エマルジョン中でコート後 、オートラジオグラフィーを４℃で２〜３週間行った。スライドをKodak K19で 現像し、固定化し、そしてヘマラムで対比染色した。免疫組織化学染色 異所性および正常部位の子宮内膜組織の凍結切片(７〜30μmの厚さ)を取り、 冷アセトン中で10分間固定し、そして必要時まで-70℃で保存した。染色のため の切片を解凍し、そしてアセトン中で２分間さらに固定する前に空気乾燥した。 次いで切片をPBS中で洗浄し、そして10%ヤギ血清中で20分間インキュベートして 、非特異的染色をブロックした。PBS中１%のH₂O₂で10分間のインキュベーション により、内在性のペルオキシダーゼ活性を不活化した。次いで、切片を１時間、 VEGFポリクローナルウサギ抗体(Santa Cruz Biotechnology，Hatfield，UK)(１ ：300)、または10倍過剰量のVEGFペプチドに24時間予め吸着させたVEGF抗体(San ta Cruz Biotechnology，Hatfield，UK)のいずれかとともにインキュベートした 。この後者の処理を、ネガティブコントロールとした。ヤギ抗ウサギビオチン化 抗体(１：200)とともに１時間インキュベートし、続いてABC(Vector，Peterboro ugh，UK)で複合体化した後、結合を可視化した。複合体を、0.1M Tris-HCl(pH7. 5)中のジアミノベンジジンおよび過酸化水素で検出した。ポジティブコントロー ルは、絨毛膜板における免疫染色の検出を含めた。モノクローナル抗体Leu M3(C D14)を用いる同様の免疫組織化学染色手順(Houckら、1991 Mol．Endocrinol．5 ，1806-1814)の後、両組織切片中のマクロファージおよび単離された単核球およ び腹腔マクロファージを同定した。酸性ホスファターゼ 酸性ホスファターゼは、マクロファージに対する加水分解酵素のマーカーであ り、そしてその活性の上昇はマクロファージの活性化に関連する(Halmeら、1983 Am．J．Obstet．Gynecol．145，333-337)。その組織をインサイチュハイブリダ イゼーションおよび免疫組織化学染色に用いた、６名の一致した子宮内膜症およ び正常患者由来の細胞を含まない、腹膜液においてその活性を測定した。p-ニト ロフェノールの形成を測定する定量的比色測定キット(Sigma，Poole，Dorset)を 用いて、酵素活性を測定した。子宮内膜症患者と非子宮内膜症患者との間の腹膜 液中の酸性ホスファターゼ活性の差を、対応のないStudentのｔ検定で分析した 。0.05以下のｐ値で有意とした。結果 子宮内膜症組織へのインサイチュハイブリダイゼーションは、VEGFをコードす るmRNAが間質内の数個の個々の細胞内、およびいくつかの腺上皮内に位置するこ とを示した。結果を図１に示す。図１は、子宮内膜症組織細胞および腺上皮内の VEGF mRNAのインサイチュでの位置を示す。ハイブリダイゼーションのシグナル は、明視野顕微鏡写真において黒の粒で示されている。切片をヘマラムで対比染 色した。アンチセンスVEGF RNAでプローブした実験切片を顕微鏡写真ＣおよびＤ に示す。センスのコントロールプローブとハイブリダイズした等価なコントロー ル切片は、ネガティブであった(顕微鏡写真ＡおよびＢ)。血管の内側に存在する 内皮細胞にのみ、VEGFレセプター、fltをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)が 検出された(データ示さず)。顕微鏡写真Ａ、Ｃ、およびＤにおけるスケールバー は、15μmを表す。一方、顕微鏡写真Ｂでは、38μmを表す。VEGFのこの分布は、 月経周期の両方の期(「増殖」期および「分泌」期)に採取した組織に見られ、そ して分析した６つの子宮内膜症サンプルのうち４つに生じた(表１)。残りの２名 の患者(月経周期の各段階からの１つずつ)は、アンチセンスプローブと有意なイ ンサイチュハイブリダイゼーションを示さなかった。対の正常部位の子宮内膜は 、いくつかの間質および腺上皮ハイブリダイゼーションを示し、先に記載された 結果(Charnock-Jonesら、1993 Biol．Repro．48，1120-1128)と一致した。 免疫組織化学的分析により測定したVEGF免疫反応性の位置決定は、異所性組織 におけるインサイチュハイブリダイゼーションで観察される分布と同様なパター ンの分布を示した。結果を図２に示す。図２は、４つの顕微鏡写真(Ａ〜Ｄ)を示 す：顕微鏡写真ＣおよびＤは、子宮内膜症組織、特に間質(Ｃ)および腺上皮(Ｄ) におけるVEGFに対してポジティブな免疫組織化学染色を示す。顕微鏡写真Ａおよ びＢはネガティブコントロールである。すべての切片をヘマラムで対比染色した 。中に含まれているスケールバーは、15μm(ＡおよびＣ)または38μm(Ｂおよび Ｄ)を表す。異所性組織の間質内の個々の細胞は、強いポジティブで染色され、 そしてポジティブ染色はまた、腺内にも認められた。しかし、VEGFに対して免疫 組織化学的にポジティブな正常部位の子宮内膜間質内の個々の細胞は、たとえあ るとしても、ごく少ししかなかった。 一連の子宮内膜症切片のマクロファージマーカーLeu M3による免疫組織化学染 色は、VEGFを発現する細胞の位置とマクロファージ抗原に対してポジティブに染 色される細胞の位置との間に強い関係があることを示した。これらの結果を図３ に示す。図３は、子宮内膜症組織におけるVEGFタンパク質(顕微鏡写真Ｃ)または Leu M3(顕微鏡写真Ｄ)の免疫組織化学的位置を示す。顕微鏡写真ＡおよびＢはネ ガティブコントロールである。ＣおよびＤにおいて矢印で示した細胞は、VEGFお よびLeu M3に対してポジティブに染色された細胞(すなわち、VEGF発現マクロフ ァージ)を示す。すべての切片をヘマラムで対比染色した。スケールバーは５μm を表す。一致した正常部位の子宮内膜内には、マクロファージはたとえあるにし ても、ごく少ししか見られなかった。 末梢血液の単核球は、マクロファージの前駆体であり、そして正常患者および 子宮内膜症を患う患者の両方からのこれらの細胞のサンプルをVEGFタンパク質に 対して免疫染色した。いすれのグループからの末梢血液の単核球も、免疫組織化 学によってVEGFタンパク質に対してポジティブに染色されなかった。両グループ の患者由来の腹膜液から単離されるマクロファージもまた、VEGFタンパク質に対 して免疫染色したところ、子宮内膜症を患う患者のみがVEGFに対してポジティブ に染色されたことが見出された。結果を図４に示す。図４は、子宮内膜症被験体 (顕微鏡写真Ｃ)または非子宮内膜症被験体(顕微鏡写真Ｄ)から単離される腹腔マ クロファージ内のVEGFタンパク質の免疫組織化学的位置を示す。顕微鏡写真Ａお よびＢは、ネガティブコントロールを表す。すべてのスライドをヘマラムで対比 染色した。スケールバーは顕微鏡写真ＡおよびＣに対して９μm、ＢおよびＤに 対して５μmを表す。 酸性ホスファターゼ活性によりマクロファージの活性化を評価した。要約する と、子宮内膜症患者由来の腹膜液は、正常被験体由来の腹膜液(8.55±2.29U/ml) より高い酸性ホスファターゼ活性(15.77±2.25U/ml)を示した。結果を棒グラフ として図５に示す。データを、ユニット/mlの腹膜液中の酸性ホスファターゼ活 性±１標準偏差として表す。統計解析は、子宮内膜症被験体由来の腹膜液と非子 宮内膜症被験体由来の腹膜液との間の酸性ホスファターゼ活性の有意差(Ｐ＜0.0 01)を示した。腹腔マクロファージcDNAのflt特異的およびKDR特異的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR ) 使用したプロトコルは先に記載した通りであった(Boocockら、1995 J.Natl.Ca ncer Inst．87，506-516)。 要約すると、試験したすべての腹腔マクロファージ(PM)サンプル由来のcDNAに おけるPCRによりfltレセプターを検出した。これには、子宮内膜症を伴う患者お よび伴わない患者の両方が含まれた。いずれの患者グループにおいても、定性的 な周期依存性の差異は検出されなかった。PCR産物のアガロースゲル電気泳動を 図６の下のパネルに示す。 両患者グループ由来のcDNAにおけるPCRによりKDRレセプターを検出した。両グ ループ内に、KDRレセプターの周期依存性の発現が認められた。両グループとも 、月経周期の分泌期の間に採取されたPFから単離されたマクロファージによりポ ジティブな結果を示したが、増殖期の腹膜液から単離されたそれらの細胞からは 、ポジティブな結果を示さなかった。PCR産物のアガロースゲル電気泳動を図６ の上のパネルに示す。 図６の上および下のパネルの両方において、レーン１は分子量マーカーを含み 、レーン２はネガティブコントロール(cDNAを添加せず)であり、レーン３はポジ テ ィブコントロール(胎盤cDNA)であり、レーン４は分泌期の子宮内膜症被験体から 単離されたPM由来のcDNAであり、レーン６は増殖期の正常被験体から単離された PM由来のcDNAであるが、レーン７は分泌期の正常被験体から単離されたPM由来の cDNAである。PCR産物のサイズの計算値を右側に示す。flt 特異的蛍光活性化細胞分離(FACS) プロトコル： 両患者グループから単離されたPMを用いた。細胞を最初に血清 中でインキュベートして、非特異的染色をブロックした。次いでこれらの細胞を flt抗体(１：50)または先に本来の抗原ペプチドに予め吸着させたflt抗体のいず れかにおいて４℃で30分間インキュベートした。この最後のサンプルをコントロ ールとした。次いで細胞をFITC標識二次抗体(１：200)中、４℃で30分間インキ ュベートした。インキュベーション後、FACSスキャンでの分析前に細胞を２%パ ラホルムアルデヒド中で固定した。各段階の間に細胞をPBSで２回洗浄した。(CD 14に対して惹起させた)抗体Leu M3を用いて、マクロファージの決定を行った； この段階は、二次抗体除去後すぐに行った。 結果を図７のグラフａ〜ｃに示す。図7aは、ペプチドを予め吸着させた抗flt 抗体で標識した細胞を含む、コントロールサンプルの染色を示し、図7bは、抗fl t抗体を用いる実験サンプルの染色を示し、そして図7cは、抗fltおよび抗CD14の 両方で二重染色した細胞を示す。グラフａおよびｂについて、ｘ軸はfltに対す る染色の対数蛍光強度であり、そしてｙ軸は細胞数を示す。グラフｃについて、 ｘ軸はfltに対する染色の蛍光強度の対数であり、そしてｙ軸はマクロファージ に対する染色の蛍光強度の対数である。２つの患者グループ間で、%fltポジティ ブ腹腔ファクロファージに有意差は見られなかった。両グループにおいて、採取 した腹腔マクロファージの約63%は、fltポジティブであった。 ％fltポジティブ腹腔マクロファージ 正常患者グループ 子宮内膜症患者 63±11 63.41±10.4 ｎ＝６ ｎ＝６KDR 特異的蛍光活性化細胞分離 プロトコル： KDR抗体およびその抗原ペプチドを適切に用いたことを除いて 、fltについて先に記載した通り。 結果を図８のグラフａ〜ｃに示す。 グラフａはコントロール(ペプチドを予め吸着させた抗KDR抗体で標識した細胞 )を示し、グラフｂは、抗KDR抗体とともにインキュベートした、分泌期の正常被 験体から単離した細胞についての結果を示すが、グラフｃは分泌期の子宮内膜症 被験体から単離された細胞についての結果を示す。すべてのグラフａ〜ｃについ て、ｘ軸はKDRに対する染色の蛍光強度の対数を表し、そしてｙ軸は細胞数を表 す。 両患者グループにおいて、KDRポジティブ腹腔マクロファージ数の周期依存的 変動が認められ、分泌期のPMは最も高い％のKDRポジティブ細胞を示した。子宮 内膜症を患う婦人由来の分泌期のPMは、周期が一致した健常者より有意に高い％ のKDRポジティブPMを有した。 ％KDRポジティブ腹腔マクロファージ これらの結果を図９にグラフとして示す。図９は、月経周期の増殖期および分 泌期の両方における、正常被験体および子宮内膜症被験体についてのKDR+マクロ ファージの割合を示す。走化性アッセイ プロトコル： 両患者グループから単離されたPMのサンプルを使用した。PMを 種々の濃度のVEGFに曝した(細胞は膜によってVEGFから隔離されている)。適切な レセプターを含む細胞は、VEGFに向かって移動し、そして膜を通過する傾向があ る。膜を通過した細胞を染色し、そして計数した。種々のポジティブおよびネガ ティブコントロールを含めた。インキュベーション時間は、37℃で90分間であっ た。 結果を図10に示す。図10は、(それぞれ)５、１、0.5、および0.1ng/mlのVEGF での子宮内膜症被験体(中実カラム)または正常被験体(斜線カラム)についての走 化性指数(コントロールサンプルの百分率として)を示す。 (月経周期の分泌期由来の)子宮内膜症PMのみが、５または１ng/mlのVEGFで、V EGFに対して有意な走化性応答を示した(ｐ＜0.01)。子宮内膜症を伴う婦人および伴わない婦人由来の腹膜液中のVEGF濃度 プロトコル： 本発明者らが開発したELISAシステムを用いて、腹膜液中のVEG F濃度を測定した。完全ヒトrVEGF₁₆₅(Boocockら、1995)に対して惹起されたポリ クローナル抗VEGF抗体(100μg/ml)でプレートをコートし、そして一晩４℃でイ ンキュベートし、次いでTBS中の３%BSAで、室温で２時間ブロックした。ヒトrVE GF₁₆₅サンプル(１〜64ng/mlの間)またはPFサンプルをコートしたウェルに添加し 、そして室温で２時間インキュベートした。次いでプレートをビオチン化ポリク ローナル抗VEGF抗体とともにインキュベートした。基質溶液をプレートに添加し た。発色させ、そして硫酸の添加によって反応を停止し、そして409nmの吸光度 をプレートリーダーで測定した。各工程の間に、0.01% Tween 20を含有するTBS でプレートを洗浄した。VEGFをスパイクした標準物質および関連のない成長因子 を用いて、ELISAシステムを確認し、そして最適化した。このシステムを用いた とこ ろ、感度の限界は４ng/mlであり、そして吸光度対ヒトVEGF濃度の対数をプロッ トして標準曲線を作製した。標準曲線は４〜58ng/mlの範囲まで直線であった。 結果を図11に示す。図11は、月経周期の増殖期および分泌期の両方における正 常被験体および子宮内膜症被験体由来の腹膜液の個々のサンプル中のVEGF濃度(n g/ml)を示す。VEGFは、子宮内膜症を伴う婦人にもおよび伴わない婦人にも見い 出された。月経周期の増殖期由来の子宮内膜症のPFは、分泌期由来のPFよりも、 そして子宮内膜症を伴わない婦人の月経周期の両方の期由来のPFよりも有意に多 くのVEGFを含んでいた。 マクロファージ馴化培地によるHUVECにおける³Ｈチミジンの取り込み プロトコル： ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)をPM馴化培地に曝し、そして³Ｈチ ミジンの取り込みを測定した。これは、内皮細胞増殖の指標を提供する。特異的 抗VEGF抗体を用いる阻害研究は、PM誘導性内皮細胞増殖に対するVEGFの寄与の評 価を可能にした。 結果を図12の棒グラフに示す。グラフは、子宮内膜症被験体(左側のカラム)ま たは正常被験体(右側のカラム)由来のPMによって馴化された培地に曝されたHUVE Cに対するトリチウム化チミジンの取り込みを(コントロールサンプルの百分率と して)示す。中実カラムはPM馴化培地のみである。一方、斜線カラムは抗VEGF抗 体で処理されたPM馴化培地を用いて得られた結果を示す。１つの＋符号は、コン トロールに比較して有意に大きい(Ｐ＜0.05)³Ｈ取り込みを示す；++は子宮内膜 症マクロファージ馴化培地に比べて有意に少ない(Ｐ＜0.05)³Ｈ取り込みを示す ；そして^**は、正常マクロファージ馴化培地に比較して有意に多い³Ｈ取り込み( Ｐ＜0.05)を示す。 両グループ由来の馴化培地は、コントロールより有意に大きな³Ｈチミジンの 刺激を生じた。子宮内膜症の培地は、正常培地により示される³Ｈチミジン取り 込みの刺激よりも有意に大きな³Ｈチミジン取り込みの刺激を生じ、そして抗VEG Fの作用によってこの取り込みが有意に減少する唯一のグループであった。 上記から、以下のことが結論され得る： ａ）VEGFは腹膜液中に存在する(HUVECの培養およびELISAの結果により示され る)； ｂ）正常被験体よりも子宮内膜症を患う患者の腹膜液中により多くのVEGFが存 在する； ｃ）ｉ)子宮内膜症組織移植物 およびii)(主に)腹腔マクロファージによって、VEGFが産生される。 ｄ）VEGFレセプターのfltおよびKDRは、腹腔マクロファージ上に存在し、そし て ｉ)flt mRNA(RT-PCRによって判定される)は、月経周期を通じて存在し、 ii)KDR mRNA(RT-PCRによって判定される)は、分泌期にのみ存在する。 ｅ）FACS分析の結果より、 ｉ)flt免疫反応性は月経周期の間変化しない。 ii)分泌期においてKDR＋集団が有意に増加する。 iii)子宮内膜症を患う患者でKDRが上昇する。 ｆ）腹腔マクロファージのVEGFに対する走化性応答は、分泌期にのみそして子 宮内膜症を患う患者から単離される細胞においてのみ有意に上昇する。 したがって、本発明者らは、VEGFが、血管新生に対するVEGFの効果を介するだ けではなく、マクロファージの機能(例えば、活性化状態、移動、プロテアーゼ および／またはサイトカイン放出)に対する効果を介しても、子宮内膜症の病因 に関与し得ることを示唆する。考察 子宮内膜症の病因は不明である。子宮内膜は、多くの機構により広く散在され 得るが、臨床的証拠および実験的証拠の両方が、子宮内膜が腹膜腔に入る最もあ りそうな機構として逆行性月経を指摘している(LieuおよびHitchcock 1968、先 に引用されている；およびBlumenkrantzら、1981 Obstet．Gynecol．57，667)。 卵巣ホルモンは別として、子宮内膜の着床をもたらし得る他の因子はほとんど知 られていない。 末梢単核球から分化する腹腔マクロファージは、子宮内膜症を患う婦人におい て、数および活性化が上昇することが知られている(Halmeら、1983；Oliveら、 両者とも先に引用されている)。本研究において、子宮内膜症患者由来の腹腔マ クロファージは、VEGFに対して強く染色され、そしてインサイチュハイブリダイ ゼーションは顕著な量のmRNAを示したが、正常患者由来の腹腔マクロファージ、 および両患者グループ由来の循環単核球は、VEGFに対してポジティブには染色さ れなかった。 正常患者におけるより低い酸性ホスファターゼ活性の知見は、子宮内膜症にお けるよりも低い活性化状態であることを示し、この活性化がVEGFの合成に必要で あることを示唆する。したがって、腹腔マクロファージの活性化状態は、子宮内 膜症の病因、特にVEGFの発現および血管新生に関して決定的な因子であり得る。 しかし、最近、子宮内膜症患者由来の単核球は、培養中の子宮内膜細胞増殖に対 して直接的な刺激効果を有し得ることが示唆されており(Braunら、1994 Fertil ．Steril．61，78-84)、それゆえ、少なくとも子宮内膜細胞の増殖については、 単核球成熟化の活性化が、唯一の機構ではあり得ないことが示唆される。 本研究は、子宮内膜症組織の間質および腺上皮内の個々の細胞においてVEGFを コードするmRNAの位置を示す。免疫組織化学染色によるVEGFペプチドの同様の位 置決定により、この組織内にこのペプチドが存在することが確認される。抗体Le u M3を用い、そして形態学による一連の切片の染色は、これらのVEGF産生細胞が ほとんど間違いなくマクロファージであることを示す。これらの細胞は、腹膜腔 内に沈着する前は、正常部の子宮内膜に存在していた。 あるいは、腹膜液マクロファージは異所性組織に浸潤する。本研究において、 免疫組織化学染色は、一致する正常部位の子宮内膜において、VEGFを発現するマ クロファージのいずれの集団をも同定できなかった。このことは、異所性の子宮 内膜症組織において見い出されるVEGFを発現するマクロファージが別の供給源か ら生じたことを示唆する。より好ましくは、このようなマクロファージは、腹膜 液から浸潤し得る。Kleinおよび研究者ら(1993，Am.J.Human Repro．30，74-81) は、最近、正常組織に比較して子宮内膜症組織の常在性白血球が増加することを 示し、そしてこれらは白血球の腹膜の集団から生じると結論した。第２に、子宮 内膜症組織は、インターフェロンγ(白血球に対して走化性である(Tabibzadeh 1 991、上記で引用されている))のような因子を分泌し得る(Kleinら、上記で引用 されている)。さらに、VEGF自体は、白血球に対して走化性であり(Claussら、19 90 J.Exp.Med．172，1535-1545)、本研究では、子宮内膜症の腺上皮内で分泌さ れることが示された。第３に、本発明者らは、子宮内膜症を患う婦人由来の腹膜 液が、VEGFを発現するマクロファージの集団を含むことを示している。これらの 観察から、VEGFを分泌するマクロファージの異所性子宮内膜への浸潤はかなり可 能性が高い。 結論として、VEGFは子宮内膜症組織中で発現されることが示されており、免疫 染色はマクロファージポジティブ細胞において最も強くそして腺上皮においてよ り低い程度で認められる。単離されたマクロファージおよび単核球を用いる本発 明者らの研究は、子宮内膜症を患う婦人由来の腹腔マクロファージのみがVEGFを 産生することを示唆する。このことは、子宮内膜症の腹膜液中のこの強力な血管 新生因子のレベルの上昇、およびVEGF産生マクロファージによる異所性子宮内膜 症組織の浸潤をもたらし得る。両方の出来事は、異所性組織内および周辺の腹膜 内の両方において血管形成を生じるVEGFの上昇を介する子宮内膜症外植物の首尾 良い着床および維持に極めて重要であり得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マックラーレン，ジョン イギリス国 シービー１ ２エヌエス ケ ンブリッジ，スリーフォード ストリート 132 (72)発明者 プレンティス，アンドリュー イギリス国 シービー４ ６イーイー ケ ンブリッジ，ミルトン，マンスフィールド クローズ 10 (72)発明者 スミス，スティーブン ケビン イギリス国 シービー４ ３エイジー ケ ンブリッジ，ハートフォード ストリート 14

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．子宮内膜症の処置に使用するための組成物であって、VEGFの産生を妨げ得る 因子；VEGFの活性を阻害し得る因子；および生理学的に受容可能なキャリア物質 を含む、組成物。 ２．子宮内膜症組織またはその周辺において、マクロファージによるVEGFの発現 を阻害し得る、請求項１に記載の組成物。 ３．ステロイド／抗ステロイド薬；VEGFアンチセンスRNA；およびアンチVEGF mR NAリボザイムからなる群より選択される因子を含む、請求項１または２に記載の 組成物。 ４．子宮内膜症組織に対するVEGFの影響を阻害し得る、請求項１、２、または３ のいずれかに記載の組成物。 ５．子宮内膜症組織またはその周辺において、マクロファージに対するVEGFの影 響を阻害し得る、請求項４に記載の組成物。 ６．抗VEGF抗体またはその有効な部分；VEGFアンタゴニスト；およびチロシンキ ナーゼインヒビターからなる群より選択される因子を含む、請求項４または５に 記載の組成物。 ７．VEGFに結合し、そしてVEGFに対するアンタゴニストとして作用する、可溶性 の末端を切断した形態のfltまたはKDRレセプターである因子を含む、請求項６に 記載の組成物。 ８．子宮内膜症組織またはその周辺において、fltおよび／またはKDR発現を阻害 し得る、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。 ９．fltまたはKDRアンチセンスRNA：アンチfltまたはアンチKDR mRNAリボザイム ：および優性なネガティブfltまたはKDRレセプター遺伝子からなる群より選択さ れる因子を含む、請求項８に記載の組成物。 １０．活性因子が、子宮内膜症組織またはその周辺において、マクロファージに 対して特異的に標的化される、請求項１〜９に記載の組成物。 １１．前記因子が、マクロファージ特異的細胞表面マーカーに対するリガンドに 会合する、請求項１０に記載の組成物。 １２．腹腔マクロファージの活性化および／または漸増加を阻害する因子、およ び生理学的に受容可能なキャリア物質を含む、子宮内膜症を処置するための組成 物であって、ここで該因子が、アンチセンスRNA：リボザイム；およびマクロフ ァージの活性化をシグナルする化合物のアンタゴニストからなる群より選択され る、組成物。 １３．請求項１２にさらに従う、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。 １４．子宮内膜症を処置する方法であって、VEGFの産生を妨げ得る因子の有効量 と、VEGFの活性を阻害し得る因子の有効量とを患者に投与する工程を包含する、 方法。 １５．請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物を投与する工程を包含する、請 求項１４に記載の方法。 １６．前記組成物が子宮内経路または腹腔内経路により投与される、請求項１５ に記載の方法。 １７．子宮内膜症の処置に使用するための組成物を作成するための方法であっ て、生理学的に受容可能なキャリア物質と、VEGFの産生を妨げ得る因子およびVE GFの活性を阻害し得る因子とを混合する工程を包含する、方法。 １８．子宮内膜症の処置に使用するための組成物を作成するための方法であって 、生理学的に受容可能なキャリア物質と、腹腔マクロファージの活性化および／ または漸増加を阻害し得る因子とを混合する工程を包含する、方法。 １９．子宮内膜症の処置のための組成物中のVEGFの産生を妨げ得る因子およびVE GFの活性を阻害し得る因子の有効量の使用。 ２０．子宮内膜症の処置のための組成物中の腹腔マクロファージの活性化および ／または漸増加を阻害する因子の有効量の使用。