JPH10505358A

JPH10505358A - クロストリジウム・ディフィシル関連疾患の治療処置

Info

Publication number: JPH10505358A
Application number: JP8509507A
Authority: JP
Inventors: ボストウィック，アイリーン・エフ; ホウアー，ロバート・エイ
Original assignee: ギャラゲン・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-09-06
Filing date: 1995-08-14
Publication date: 1998-05-26
Also published as: AU702405B2; US5773000A; NZ291659A; MX9701683A; WO1996007430A1; AU3325895A; EP0779819A1; CA2197714A1

Abstract

(57)【要約】クロストリジウム・ディフィシル大腸炎およびその各トキシンに対する特異的活性を有する抗体を、単独で、またはバンコマイシン、バシトラシン、またはメトロニダゾールと組み合わせて投与することによる、クロストリジウム・ディフィシル関連疾患、例えば、クロストリジウム・ディフィシル大腸炎、偽膜性大腸炎および抗生物質関連下痢の効果的処置、並びにそのための医薬組成物を本明細書に記載する。

Description

【発明の詳細な説明】クロストリジウム・ディフィシル関連疾患の治療処置発明の分野本発明は、特定の抗体を経口および／または医薬組成物形態で投与することによるクロストリジウム・ディフィシル大腸炎、偽膜性大腸炎および抗生物質関連の下痢などのクロストリジウム・ディフィシル関連疾患の処置に関する。発明の背景クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）は、最初、グラム陽性嫌気性細菌として１９３５年に報告された。この細菌は、当初、なかなか単離できず、培養に当たっては、非常にゆっくりと増殖したことから、“取り扱い困難なクロストリジウム”と命名された。この細菌は、リンコマイシンやクリンダマイシンなどの広域スペクトル抗生物質の広範囲の使用により抗生物質関連の偽膜性大腸炎の増大が起こる、およそ１９６０年代および１９７０年代まで注目されなかった。これらの抗生物質は、患者のおよそ１０％で下痢を、またおよそ１％で偽膜性大腸炎を引き起こすことが分かった。現在、Ｃ.ディフィシルがヒトの大腸炎、抗生物質関連の下痢、および実質的には、あらゆる場合の偽膜性大腸炎の原因であることは明らかである。この疾患は、大腸内でこの微生物による２つの主たる毒素、トキシンＡ（Ｍ_r 、３０８,０００）およびトキシンＢ（Ｍ_r、２７９,０００）の生産の結果として発症する（Barroso等、Nucleic Acids Res.,18:4004；Dove等、Infect.Immun. ,58:480-488；Lyerly等、Clin.Microbiol.Rev.,1:1-18）。トキシンＡは、実験動物において、その腸毒素活性のため殆どの胃腸内徴候を引き起こすと考えられている（Borriello等、Microecol.Ther.,15:213-236；Lyerly等、Infect.Immun. ,35:1147-1150；Lyerly等、Infect.Immun.,47:349-352）。各トキシンが疾患の進行中に相互依存的に作用すること、およびトキシンＡにより引き起こされた最初の組織損傷がトキシンＢにその毒性作用を発揮させること、を示唆する幾つかの証拠がある（Lyerly等、Infect.Immun.,47:349-352）。殆どのＣ.ディフィシル疾患の患者は、バンコマイシン、バシトラシン、またはメトロニダゾールで効果的に処置される。しかしながら、約１０−２０％のケースで再発が起こり、これは抗生物質治療が常に完全には有効でないことを示している。結果として、代替治療の研究が続いている。サッカロマイセス・ブラルディイ（Saccharomyces boulardii）、即ち、胃腸病を処置するのに使用される酵母は、ヒトおよび実験動物の疾患を処置するための共生物質として有望な結果を示している（Corthier等、Can.J.Microbiol.,32:894-896；Elmer等、Antimicr ob.Agents Chemother.,31:129-131；Kimmey等、Dig.Dis.Sci.,35:897-901；Sura wiczs等、Gastroenterology,96:981-988；Toothaker等、Antimicrob.Agents Che mother.,26:552-556）。酵母が保護を提供するためには生存能力がなければならないと報告されているが、酵母が保護を与える実際の機構は、不明である（Luca s等、Presented at the 15th International Congress on Microbial Ecology o f Disease、１９９０年９月７日〜９日、ギリシャ、イオニナ）。免疫予防もまた、一種の処置として提案されている。トキシンＡおよびＢに対するワクチン接種は、実験動物におけるＣ.ディフィシル疾患に対する活発な免疫を刺激することが知られている（Fernie等、Dev.Biol.Stand.,53:325-332；Libby等、Infect. Immun.,36:822-829）。しかしながら、現時点では、この微生物およびその各トキシンに対する適切なワクチン類は、個体に対する危険性が高いため開発されておらず、積極的な免疫処置が適切であるかどうかは依然不明である。これとは別に、受動免疫による処置が提案されている。予備研究では、Ｃ.ディフィシルの毒素原性単離物に対する血清抗体は、ハムスターに経口投与した場合、そのハムスターをＣ.ディフィシル疾患から保護した。そのため、受動免疫は、予防処置として有用であるといえる。ウシ抗体を用いる受動免疫は、ロタウイルス、腸内病原性および腸毒素原性大腸菌、ビブリオ・コレラエ、およびクリプトスポリジウム・パルヴムにより引き起こされる疾患を含む、他の胃腸管伝染性疾患の処置における代替可能性のある治療として試験されており、その結果は、この方法で投与した抗体が、保護を与えることを示している（Boesman-Finkelstein等、Infect.Immun.,57:1227-1234 ；Brussow等、J.Clin.Microbiol.,25:982-986；Fayer等、Infect.Immun.,58:296 2-2965；Hilpert等、J.Infect.Dis.,156:158-166；Mietens等、Eur.J.Pediatr., 132:239-252；Tacket等、N.Engl.J.Med.,318:1240-1243；Yoshiyama等、Immunol ogy,61:543-547）。ウシ抗体からの受動免疫には、殆どの動物およびヒトが経口的に与えられた物質に対して耐性があるという利点、および存在する主要な抗体、即ち、免疫グロブリンＧ１（ＩgＧ１）がタンパク質分解に対して比較的抵抗性であるという利点がある。最近の研究では、Ｃ.ディフィシルトキソイドで予防接種したウシの初乳由来のウシ免疫グロブリンＧ（ＩgＧ）濃縮物（ＢＩＣ）が、ハムスターを実験的抗生物質関連盲腸炎から保護する能力について報告された。その結果は、下痢の徴候の前にハムスターを処理すれば、ハムスターがその疾患に対して受動的に免疫処置されることを示した。この研究者は、一旦下痢が発症すれば、超免疫ＢＩＣではハムスターを効果的に処置できないことを示した（Lyerly等、Infection an d Immunity、５９巻、６号、２２１５−２２１８頁(１９９１年)）。そのため、依然として、ヒトにおける抗生物質関連の下痢、偽膜性大腸炎、およびクロストリジウム・ディフィシル大腸炎を、相当数の患者集団において再発の恐れなく、効果的に処置する方法に対する強い要望がある。発明の概要従って、本発明は、Ｃ.ディフィシルおよび結腸中に見出されるその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物のＣ.ディフィシル大腸炎に関連する疾患を処置する方法を含む。このような疾患には、例えば、クロストリジウム・ディフィシル大腸炎、偽膜性大腸炎および抗生物質関連の下痢がある。本発明の第２の態様は、Ｃ.ディフィシルおよびその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量を、経口または直腸経由の投与、または腸内装着（ enteric installation）に適した医薬的に許容され得る担体との組み合わせで含む、患者において、例えば、偽膜性大腸炎または抗生物質関連の下痢を含むＣ. ディフィシルに関連する疾患の処置に使用するための医薬組成物である。本発明の第３の態様は、（ａ）Ｃ.ディフィシルおよびその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量、および（ｂ）医薬的に許容され得る担体と組み合わせた、バンコマイシン、バシトラシン、またはメトロニダゾールの有効量を含む、偽膜性大腸炎または抗生物質関連の下痢の処置に使用するための医薬組成物である。最後に、本発明の第４の態様は、バンコマイシン、バシトラシン、またはメトロニダゾールの有効量の投与と同時に、またはその投与を後続させて、Ｃ.ディフィシルおよびその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量を、患者に投与することを含む、患者において、偽膜性大腸炎または抗生物質関連の下痢を処置する方法である。図面の簡単な説明図１は、ＥＬＩＳＡ法による、抗クロストリジウム・ディフィシルトキシンＡ抗体レベルのグラフ説明である。図２は、ＥＬＩＳＡ法による、抗クロストリジウム・ディフィシルトキシンＢ抗体レベルのグラフ説明である。図３は、Ｃ.ディフィシル培養濾液（×１０最小細胞毒性用量）に２４時間さらした後のＩＭＲ−９０繊維芽細胞の単層の顕微鏡写真である。全ての細胞の球状化（rounding）を伴う著しい細胞変性効果がある。図４は、抗濾液ＢＩＣ（１００mg／ml）と共に予めインキュベーションしたＣ .ディフィシル培養濾液（×１０最小細胞毒性用量）に２４時間さらした後のＩＭＲ−９０繊維芽細胞の単層の顕微鏡写真である。抗濾液ＢＩＣは、細胞変性効果を効果的に阻害したので、単層は、正常な形態を示している。図５は、トキシンＡのその腸細胞受容体への結合を阻害する抗クロストリジウム・ディフィシルＢＩＣのグラフ説明である。図６は、ラットの回腸ループにおける、クロストリジウム・ディフィシル培養濾液誘導化分泌液に対するウシ免疫グロブリン濃縮物（ＢＩＣ）の効果を示す棒グラフ説明である。図７は、ラットの回腸ループにおける、Ｃ.ディフィシル培養濾液誘導化マンニトール浸透性に対するウシ免疫グロブリン濃縮物（ＢＩＣ）の効果を示す棒グラフ説明である。図８は、ラットの回腸ループにおける、Ｃ.ディフィシル培養濾液誘導化腸炎に対するウシ免疫グロブリン濃縮物（ＢＩＣ）の効果を示す棒グラフ説明である。図９は、Ｃ.ディフィシル培養濾液にさらした回腸組織の顕微鏡写真である。図１０は、抗Ｃ.ディフィシル濾液ＢＩＣと共に予めインキュベーションしておいたＣ.ディフィシル培養濾液にさらした回腸組織の顕微鏡写真である。発明の詳細な説明Ｃ.ディフィシル、抗生物質関連の下痢および大腸炎の在来療法では、メトロニダゾール、バシトラシン、またはバンコマイシンなどの抗菌性物質を使用する。これらの薬剤は、結腸叢の一層の撹乱を招き、１０−２０％の再発性下痢を伴う。本発明は、結腸叢を撹乱させない効果的な処置を提供するものである。抗Ｃ .ディフィシルウシ免疫グロブリン濃縮物（ＢＩＣ）は、Ｃ.ディフィシルトキソイドで予め免疫処置したホルスタイン種のウシの初乳から製造した（詳細は下記）。この濃縮物は、ＥＬＩＳＡで評価したところ、Ｃ.ディフィシルトキシンＡおよびＢに特異的な高レベルのウシＩgＧを含有した。抗Ｃ.ディフィシルＢＩＣは、Ｃ.ディフィシルトキシンＡおよびＢの両方の細胞毒性効果を中和したのに対し、対照の非免疫ＢＩＣは、それを中和しなかった。抗Ｃ.ディフィシルＢＩＣは、ラット回腸ループ重量／長さ比率の増大（６４％阻害、Ｐ＜０.０１）、マンニトール浸透性の増大（８９％阻害、Ｐ＜０.０１）および腸炎の組織学的部類分け（Ｐ＜０.０１対非免疫ＢＩＣ）により測定したところ、ラット回腸における各Ｃ.ディフィシルトキシンの腸毒素効果も阻害した。このように、抗Ｃ. ディフィシルＢＩＣは、Ｃ.ディフィシルトキシンのインビトロでの細胞毒性効果を中和し、それらのインビボでの腸毒素効果を阻害する。上記実験の結果（更に詳細は実施例に記載）、発明者らは、Ｃ.ディフィシルに対して特異的な抗体を含有する免疫グロブリン生成物の投与が、各Ｃ.ディフィシルトキシンを除去し、結腸内の細菌も殺すこと、従って、それ自身が、大腸炎、偽膜性大腸炎、および抗生物質関連の下痢などのＣ.ディフィシル関連疾患、特に多数回の再発を経験している患者を効果的に処置するための現実的手法を提供していることを見い出した。本発明の目的では、用語“クロストリジウム・ディフィシルおよびその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体”は、“抗Ｃ.ディフィシルウシ免疫グロブリン濃縮物(ＢＩＣ)”と同義である。抗体は、液体または固体、好ましくは固体粉末形態で、単独で、また好ましくは、錠剤、カプセル、または坐剤などの医薬組成物を形成するための担体と混合して使用できる。好ましい投与方法は、経口および直腸経由、または腸内装着であり、最も好ましくは経口投与であるため、錠剤、およびカプセルは特に好ましく、または腸内装着も好ましい。勿論、これらは当分野で知られた常法に従い製造される。抗体類は、更に付加的な栄養的および／または医薬的利点も提供し得る各種の液体類、タンパク質類、または油類などの他の医薬的に許容され得る担体と組み合わせることもできる。抗体の効果は、結腸へ到達するかどうかに左右されるため、好ましい錠剤またはカプセルは、腸溶性被覆されているべきである。あるいは、活性のある抗体自身を、製剤に先立ってマイクロカプセル化してもよい。抗体のマイクロカプセルの製造や、腸溶性被覆錠剤またはカプセルの製造は、当分野で知られている常法により達成できる。本発明の抗体類は、まず、各Ｃ.ディフィシルトキシンを除去するものであるため、本発明の抗体類をＣ.ディフィシル関連疾患を患う患者に、偽膜性大腸炎および／または抗生物質関連の下痢の処置に既知の抗生物質と組み合わせて投与するのにも有利である。このような抗生物質は、例えば、バンコマイシン、バシトラシン、およびメトロニダゾールである。Ｃ.ディフィシルトキシンが迅速かつ短時間に除去されるため、抗体と抗生物質を組合せると、相乗的に通常のそれらの疾患処置より抗生物質の使用量が少なくてすむとともに、症状の進展が減少し、症状緩解が早くなり、かつ再発率も低下する。メトロニダゾール投与の用量は、例えば、１日に２５０mg４回であり、経口バンコマイシンでは、１日に１２５mg４回と認められる。本発明の抗体と一緒にこれらの抗生物質を投与することにより、抗生物質の使用量が実質的に低減することとなる。かかる組合せ投与は、両方の有効成分を組合せて、医薬的に許容され得る担体と混合した単回投与形態であり得る。好ましい組成物は、経口または直腸投与に適したものであり、腸溶性被覆錠剤、カプセル、または坐剤を含む。そのような組み合わせの投与は、同時的なものでも別々の投与形態で続けて行う場合でも、錠剤またはカプセルを分割して、一緒に製剤化できる。このこともまた、医薬分野では知られている。２つの有効成分の組合せを用いるＣ.ディフィシル関連疾患を患う患者の処置は、単回のまたは分割した投与形態で同時に行い得るだけでなく、一成分の投与に続けて他の成分の投与を行うこともできる。抗体の投与に後続させて抗生物質の投与を行うのが好ましく、上記疾患の効果的な処置となるであろう。本発明の抗体は、患者に提供される免疫グロブリン画分に含まれている。このような形態では、患者に提供される免疫グロブリンの量は、１日当たり約１グラムである。典型的には、１日当たり約１から２０グラムの量を使用する。例えば、約１ないし２グラムの免疫グロブリンを１日当たり３ないし４回患者に与えることができる。投与する抗体製剤の用量は、患者、および患者の医療経歴によって変わる。本発明により構想され、かつ治療的に有効であると見なされた、成人ヒトの場合の特定抗体の用量は、約０.１から５００mgの間の範囲である。しかしながら、用量は、子供を含むどの患者にも適量の抗体を提供することとなるよう容易に調整できると理解すべきである。本発明は、更に、下記詳述実施例を参照して記載しており、それらの方法論は下記のとおりである。これらの実施例は、上記した本発明の範囲を限定することを意味していない。本発明の概念の範囲内での変形は、当業者には明らかである。引用文献の開示は、出典明示により本明細書の一部としている。実施例１ウシでの抗体産生トキソイドを高レベルのトキシンＡおよびＢを含有するＣ.ディフィシルＶＰ１１０４６３培養濾液から製造した。この株を、培養濾液製造のために、前記（ Sullivan等、Infect.Immun.,35:1032-1040）の通り、ブレインハートインフュージョン透析フラスコ中３７℃で７２時間増殖させた。続いて、１／１００容量のホルマリンを加え、この混合物を３７℃で１時間インキュベーションすることにより、培養濾液をトキソイドに変換させた。組織培養アッセイおよびマウスアッセイによるトキソイドの分析は、それが、本来の細胞毒性活性および致死活性の＜１％を保持したことを示した。動物モデルで使用した攻撃株は、偽膜性大腸炎の患者から単離され、中間レベルのトキシンＡおよびＢを産生する、Ｃ.ディフィシルＶＰＩ７６９８であった。両菌株は、バージニア・ポリテクニック・インスティテュート・アンド・ステート・ユニバーシティー（バージニア州、ブラックスブルグ）のアナロビック・ミクロバイオロジー部門に収容された嫌気性細菌コレクションから得た。合計１４匹の妊娠しているホルスタイン種ウシは、ランド・オ’レークス・アンサー・ファーム（アイオワ州、ウェブスター・シティー）またはバージニア・ポリテクニック・インスティテュート・アンド・スティト・ユニバーシティの試験農場で、一般的に許容された酪農管理法に従って、飼育した。これらのウシに、不完全フロイントアジュバント５mlに乳化させたトキソイド５ml（約５mgのタンパク質）を皮下注射した。ウシには、多重免疫処置を施し、これは出産予定日の少なくとも６０日前に開始した。注射の時点で試験試料を採血した。初乳を、過免疫処置したウシの最初の６搾乳から集め、集めて２ないし３時間以内に凍結させた。初乳は、操作準備ができるまで凍結貯蔵した。要約すると、ウシ１４匹全てから取った初乳を解凍し、プールし、遠心分離して、脂肪成分を低減させた。ｐＨを下げて、カゼインを沈澱させた。次いで、上清のｐＨを再調整し、材料を加熱処理して、バイオバーデン（bioburden）を低減させた。超濾過を使用して、ラクトースおよびミネラル含量を低減させた。再び、材料を加熱処理し、スプレー乾燥させて、バルク免疫グロブリン濃縮物を貯蔵安定性粉末として製造した。予防接種していないウシの初乳由来の非免疫ＩgＧ濃縮物を同様にして、調製した。実施例２ウシのＣ.ディフィシル抗原での免疫処置が、その後の、それらの初乳における特異的抗Ｃ.ディフィシルＩgＧの増大に関連することの確認。ＥＬＩＳＡ法Ｃ.ディフィシルに対するウシＩgＧレベルを既に報告されている方法（C.P.Ke lly等、Gastroenterology 1992；102:35-40；D.Y.M.Leung等、J.Pediatr.1991； 118:633-637）の改良法を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。ＩgＧ力価を測定するために使用した被覆抗原は、精製したＣ.ディフィシルトキシンＡおよび精製したＣ.ディフィシルトキシンＢを含んだ。毒素原性クロストリジウム・ディフィシルは、ブレインハートインフュージョンブロス（ベックトン・ディキンソン、メリーランド州、コッキースビル）で７２時間培養した。ならし培地を遠心分離し、上清濾液を４５nm濾紙（Nalgene）に通して滅菌した。Ｃ.ディフィシルトキシンＡおよびＢを既に報告されているとおり（C.Pothoulakis等、J.Clin.Invest.1991;88:119-125）、ブロス培養上清から精製した。マイクロタイタープレート（イムロンII、ダイナテック）を、３７℃で２時間インキュベーションし、次いで、４℃で一晩インキュベーションすることにより、Ｃ.ディフィシルトキシンＡまたはトキシンＢで被覆した（それぞれ、１ウェル当たりカーボネート緩衝液、ｐＨ９.６、１００ul中ml当たりタンパク質１０ug）。プレートは、０.０５％トゥイーン２０を含むホスフェート緩衝化塩水（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて各インキュベーション工程の間で洗浄した。次いで、プレートを室温で１時間インキュベーションしたＰＢＳ中２％ヒト血清アルブミンでブロックした。次のＢＩＣ調製物を試験した：ｉ)Ｃ.ディフィシル培養濾液免疫物、ロットナンバー９００９１８(“#１８”)およびロットナンバー９２１０１９(“#１９”) 、ii)Ｃ.ディフィシルトキシンＡ免疫物、ロットナンバー９００９２７(“#２７ ”)およびiii)対照、“非免疫”ＢＩＣ、ロットナンバー９１０３１１(“#１１ ”)。ＢＩＣ試料を全て、ＰＢＳ−Ｔで希釈（連続半減希釈）し、１ウェル当たり試料１００ulを３７℃で１時間インキュベーションした。アッセイは全て３回実施した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ウシＩgＧ（ＫＰＬラボラトリーズ）を、第２抗体（２％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ中０.２ug／ml）として使用し、３７℃で１時間インキュベーションした。ＴＢＭマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬラボラトリーズ）を基質（１００ul／ウェル）として用い、２ないし５分後、当容量の１Ｍリン酸で反応を止めた。次いで、光学密度を、自動光度計（ダイナテック）を用い、６３０nmをリファレンスとして４５０nmで読み取った。対照には、第２抗体の代わりにペルオキシダーゼ標識化抗ヒトＩg Ｇを用い、さらにペルオキシダーゼ基質溶液を省略したものを用いた。結果は、試験ウェルの平均光学密度からバックグラウンドウェル（ヒト血清アルブミン単独で被覆した）の平均光学密度を引いたもので表した。抗濾液および抗トキシンＡＢＩＣ調製物は両方、精製トキシンＡに対して、実質的により高いＩgＧ抗体レベルを有した。この場合、最高抗体レベルは、トキシンＡ免疫処置動物由来の初乳におけるものである［図１］。精製トキシンＢに対するＩgＧ抗体レベルの増大は、抗濾液ＢＩＣでは明らかである。抗トキシンＡＢＩＣは、重量基準で重量についてアッセイしたところ、トキシンＢ抗体レベルが対照と比べてほとんど増大しないことを示した［図２］。Ｃ.ディフィシル全体細胞ウシ抗体結合：毒素原性無傷Ｃ.ディフィシルを洗浄して、細胞外毒素を除去し、ｐＨ９.６のカーボネート緩衝液で希釈して、マイクロタイタープレート中４℃で一晩インキュベーションして、プレートに細菌を結合させた。ウシ免疫グロブリン濃縮物（ＢＩＣ粉末、Ｃ.ディフィシルに対して非免疫および免疫）を、結合した無傷Ｃ. ディフィシルと共にインキュベーションした。ウシ免疫グロブリン（重(Ｈ)鎖および軽（Ｌ）鎖）に対するアフィニティー精製化ペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗体およびテトラメチルベンジジン基質を用いて、無傷Ｃ.ディフィシルに結合したウシ免疫グロブリンの量を検出した。抗体結合は、マイクロタイタープレートのウェルの４８０nmでの吸光度を読み取ることにより定量した。結果：Ｃ.ディフィシルトキシンＡ免疫ＢＩＣロットナンバー９００９２７は、非免疫ＢＩＣロットナンバー９１０３１１と比べて、８倍の全体細胞毒素原性Ｃ.ディフィシルに対する特異的抗体活性を有した。Ｃ.ディフィシル培養濾液免疫ＢＩＣロットナンバー９２１０１９は、非免疫ＢＩＣロットナンバー９１０３１１と比べて、８倍の全体細胞毒素原性Ｃ.ディフィシルに対する特異的抗体活性を有した。実施例３ウシ抗体のＣ.ディフィシルに対する殺菌活性：対数増殖期の毒素原性Ｃ.ディフィシルをＣ.ディフィシルトキシンに対するＢＩＣ粉末免疫物または１００％増殖対照として扱うための培地単独のいずれかと組み合わせた。嫌気性チャンバー中、室温で４時間インキュベーション後、細菌＋ＢＩＣおよび細菌＋培地を培地で連続希釈し、次いで、トリプシン大豆血液寒天（ＴＳＢＡ）プレートで培養した。ＴＳＢＡプレートを嫌気性チャンバー中、３７℃で１６時間インキュベーションし、次いで、個々の細菌コロニーを計数した。結果：１０％（重量／容量）で再構築し、更に、１：２（最終）希釈したＣ.ディフィシルトキシンＡ免疫ＢＩＣロットナンバー９００９２７は、反応培養物中の〜９０％のＣ.ディフィシルを死滅させる。１０％（重量／容量）で再構築し、更に、１：２（最終）希釈したＣ.ディフィシル培養濾液免疫ＢＩＣロットナンバー９２１０１９は、反応培養物中の９０−９５％のＣ.ディフィシルを死滅させる。表１も参照。実施例４抗Ｃ.ディフィシルＢＩＣがＣ.ディフィシルトキシンの細胞毒性作用を阻害する能力のあることの実証。細胞毒性法細胞毒性は、組織培養におけるＩＭＲ−９０繊維芽細胞の集密的単層の細胞球状化（cell rounding）により測定した。Ｃ.ディフィシル培養濾液の、および精製したＣ.ディフィシルトキシンＡおよびＢの細胞毒性作用を試験した。各調製物の最小細胞毒性用量を、２４時間で１００％細胞球状化を生じる最小用量として定めた（培養濾液の場合０.１−１ngのタンパク質／ml、トキシンＡの場合１０−２５ng／ml、およびトキシンＢの場合０.００３ng／ml、これらの範囲は、これらの研究に使用した別々のトキシン調製物の様々な効力を表わしている）。様々なＢＩＣ調製物の中和活性は、半減希釈のＢＩＣを最小細胞毒性用量の、または最小細胞毒性用量の１０倍のいずれかの各トキシン調製物に加え、２４時間後の細胞球状化を評価することにより、定量した。それぞれの場合、結果は、ＩＭＲ−９０細胞の＞５０％の球状化を妨げるのに要求されるＢＩＣの最低濃度として表わした。結果：細胞毒性阻害実験の結果は、表２および３にまとめてある。図３は、Ｃ.ディフィシル培養濾液の最小細胞毒性用量×１０に２４時間さらしたＩＭＲ−９０単層の顕微鏡写真である。全ての細胞は、Ｃ.ディフィシルトキシンの細胞変性効果に典型的な細胞球状化を示す。図４は、同じＣ.ディフィシル濾液の濃縮物にさらしたＩＭＲ−９０単層の同様の例である。しかしながら、この場合は、濾液を、単層に添加する前に抗Ｃ.ディフィシルＢＩＣ（#１８、１００ug／ml）と共に室温で１時間インキュベーションした。抗Ｃ.ディフィシル濾液ＢＩＣは、Ｃ. ディフィシルトキシンの細胞毒性作用を効果的に阻害した。抗Ｃ.ディフィシル培養濾液ＢＩＣ（#１８）は、Ｃ.ディフィシル培養濾液の細胞毒性作用、および精製トキシンＡおよびトキシンＢの細胞毒性作用を効果的に遮断した。抗トキシンＡＢＩＣ（#２７）は、細胞毒性の阻害において、あまり効果的ではなかった。実施例５抗Ｃ.ディフィシルＢＩＣが、Ｃ.ディフィシルトキシンＡのその腸細胞刷子縁レセプターへの結合を遮断する能力のあることの実証。方法精製したＣ.ディフィシルトキシンＡを、既に報告されているとおり、修飾ボルトン−ハンタープロトコールを用いて³Ｈ−標識した（C.Pothoulakis等、J.Cl in.Invest.1991；88:119-125）。放射性標識したトキシンＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣにおいて天然トキシンと同一の移動をし、細胞毒素（ＩＭＲ− ９０繊維芽細胞球状化アッセイ）および腸毒素（ウサギ回腸ループアッセイ）としての全生物学的活性を保持している。³Ｈ−トキシンＡを用いる初期研究では、ウサギ回腸刷子縁における単一種のトキシンＡレセプターが５.４×１０^-8ＭのＫ_dおよびトキシンＡ５.９pmol／刷子縁タンパク質mgの最大結合能力を持って存在することが示された。刷子縁膜（ＢＢＭ）を上記引用文献に記載されているとおり、ＥＤＴＡ−キレート形成によりウサギ回腸から精製した。ＢＢＭの純度は、光学顕微鏡により、さらに、アルカリホスファターゼおよびスクラーゼ活性の計測により、測定した。トキシンＡ−ＢＢＭ結合実験は、５０mMトリス、０.２ＭＮaＣｌ（ｐＨ７. ４）中５％スキムミルクで予め被覆した１.８mlエッペンドルフ管中で、３回実施した。様々な濃度の抗Ｃ.ディフィシルＢＩＣ（３０μl）を５０mMトリス（ｐＨ７.４）１４５μl中³Ｈ−トキシンＡ（およそ３５,０００dpm／pmol比活性）２００ngと共に２０℃で２時間インキュベーションした。次いで、試料を４℃まで冷却し、５０mMトリス２５ul中、精製ＢＢＭ２００μgを加えた。４℃で１時間インキュベーション後、５０mMトリス緩衝液１mlを加え、管を１１,０００gで４分間遠心分離した。ＢＢＭペレットを５０mMトリス１mlで２回洗浄し、次いで、１０％ＳＤＳを含有する緩衝液０.４mlに溶解させた。膜結合放射能を液体シンチレーションカウンティングにより測定した。結果は、特異的トキシンＡ結合として表す。特異的結合は、総³Ｈ−トキシンＡ結合から１００倍過剰の天然非標識トキシンＡの存在下での³Ｈ−トキシンＡ結合を引いたものとして定めた。結果結果は、図５（平均±ＳＥとして表した）に図示説明する。特異的トキシンＡ結合は、刷子縁膜タンパク質グラム当たり³Ｈ−トキシンＡ結合のpmol （pmol／ g）として表わす。抗濾液ＢＩＣ（#１８）は、³Ｈ−トキシンの刷子縁膜への特異的結合を用量依存的に阻害した。１５ug／mlの濃度で、抗濾液ＢＩＣ（#１８）は、トキシンＡレセプター結合を完全に遮断した。抗トキシンＡＢＩＣもまた、用量依存的にトキシンＡ結合を実質的に低減させた。１５ug／mlの濃度で、抗トキシンＡＢＩＣは、同じ濃度の対照、即ち、非免疫ＢＩＣと比較して、トキシンＡレセプター結合を８４％まで遮断した。Ｃ.ディフィシル培養濾液またはＣ.ディフィシルトキシンＡに対して免疫処置したウシ由来の免疫グロブリン濃縮物は、精製ウサギ刷子縁膜へのトキシンＡの特異的結合を低減する能力がある。トキシンＡ−レセプター結合の阻害は、恐らく、ウシＩgＧ抗トキシンがトキシンＡへ結合することによって、その後のトキシン−レセプター相互作用が遮断されることから生じる。このことは、インビボでトキシンＡの腸毒素作用を阻害する際の抗Ｃ.ディフィシルＢＩＣの保護効果について推定される作用機構を表すものである。実施例６抗Ｃ.ディフィシルＢＩＣがＣ.ディフィシルトキシンの腸毒素作用を阻害する能力のあることの実証。腸毒性法絶食状態の雄ウィスターラットに、ペントバルビタールナトリウムを腹膜内注射することにより麻酔をかけた。側腹切開を行い、腎小足を結び、３Ｈ−マンニトール（１０uＣi、ＮＥＮ、マサチューセッツ州ボストン）を静脈内注射した。次いで、閉塞回腸ループ（５cm）を形成し、５０mMトリス緩衝液（ｐＨ７.４）４００ulまたはＣ.ディフィシル培養濾液（タンパク質２０ug）を含有するトリス緩衝液を注射した。抗Ｃ.ディフィシルＢＩＣの阻害効果は、回腸内腔に注射する前にＢＩＣ（２００ug）を各トキシンに添加することにより評価した。下記のＢＩＣ調製物を試験した：ｉ）Ｃ.ディフィシル培養濾液免疫物（#１８および #１９）、ii）Ｃ.ディフィシルトキシンＡ免疫物（#２７）、およびiii）対照非免疫ＢＩＣ（#１１）。腹部切開部を閉じ、ペントバルビタールナトリウムを用いて麻酔を維持した。４時間後、動物を屠殺し、回腸ループを直ちに集めた。ループの長さに対する重量の比率を腸毒素作用の尺度として測定した。腸の浸透性を示すマンニトール排出は、ルミナール液中の放射能をカウントすることにより測定した。回腸組織試料もまた、ホルマリンに固定し、パラフィン包埋し、断片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。腸炎の組織学的深刻さは、下記の特徴を考慮して部類分けした：ｉ)好中球辺縁趨向および組織浸潤、ii)粘膜の出血性うっ血および水腫、iii）上皮細胞損傷。ある組織病理学者がこれらのパラメーターそれぞれに割り当てたようにして、段階的に深刻な異常を示す、０ないし３のスコアを与えた。結果予想通り、Ｃ.ディフィシル培養濾液は、濾液にさらした回腸ループにおける、長さ対重量比率の実質的な増大［図６］およびマンニトール排出［図７］により示される腸毒素作用を示した。Ｃ.ディフィシル培養濾液免疫ＢＩＣ（抗−Ｆil）は、これらの腸毒素作用を実質的に阻害した（重量／長さ比率では５４％［図６］およびマンニトール浸透性では１００％［図７］、双方ともＰ＜０.０１）。Ｃ.ディフィシルトキシンＡ免疫ＢＩＣ（抗−ＴｘＡ）は、同様の濾液−誘導化腸毒性の阻害をもたらした（重量／長さ比率では６４％［図６］およびマンニトール浸透性では８９％［図７］、双方ともＰ＜０.０１）。対照の非免疫ＢＩＣは、何も阻害せず、培養物の腸毒性に対してなんら顕著な作用を有しなかった。回腸ループ組織の組織学的試験は、Ｃ.ディフィシル培養濾液にさらした組織の顕著な損傷を示し、これは、ヒストロジー・スコアの増大として反映された［図８］。抗濾液ＢＩＣおよび抗トキシンＡＢＩＣは、両方とも、ヒストロジー・スコアの実質的な低下により明示される、Ｃ.ディフィシル濾液により誘導される腸炎を顕著に緩和した。対照の非免疫ＢＩＣは、なんら顕著な保護効果を有しなかった。図９は、Ｃ.ディフィシル培養濾液にさらした後の回腸粘膜の代表的な断片を例示する顕微鏡写真である。正常絨毛構造の完全な破壊が見られる。血管うっ血（底部中心および右の血管）並びに好中球辺縁趨向および組織浸潤がはっきりとわかる。図１０は、抗濾液ＢＩＣの保護効果を示す。若干の破壊および絨毛先端の水腫を除けば、構造が保護されている。粘膜下組織血管の最小の炎症性浸潤またはうっ血がみられる。Ｃ.ディフィシル培養濾液免疫ＢＩＣは、ラット回腸における濾液誘導化腸毒性を実質的に阻害する。同程度の阻害が、Ｃ.ディフィシルトキシンＡ免疫ＢＩＣで見られる。これらのデータは、齧歯類の腸におけるＣ.ディフィシルトキシン誘導化腸毒性はトキシンＡにより媒介されるという我々の先行する発見と矛盾しない。トキシンＡおよびＢは、相互依存的に働いて、ヒトの疾病徴候を生み出すこともあるが、トキシンＢは、この動物モデルにおいてなんら顕著な腸毒素作用を持たない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年７月１７日【補正内容】請求の範囲１．クロストリジウム・ディフィシルおよび結腸内に見出されるその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量を経口または直腸経由の投与形態で哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物のクロストリジウム・ディフィシル関連疾患を処置する方法。２．投与形態が錠剤、カプセルまたは坐剤である、請求の範囲第１項記載の方法。３．錠剤またはカプセルが腸溶性被覆されている、請求の範囲第２項記載の方法。４．投与形態が抗体をマイクロカプセル化した形態で含有する、請求の範囲第１項記載の方法。５．クロストリジウム・ディフィシルおよびその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量を経口的にまたは直腸経由で患者に投与することを含んでなる、患者の偽膜全腸炎を処置する方法。６．抗体を腸溶性被覆した錠剤またはカプセルで投与する、請求の範囲第５項記載の方法。７．クロストリジウム・ディフィシルおよびその各トキシン類に対して特異的活性を有する抗体の有効量を患者に経口投与することを含んでなる、患者の抗生物質関連下痢を処置する方法。８．抗体を、腸溶性被覆した錠剤またはカプセルで投与する、請求の範囲第７項記載の方法。９．経口または直腸経由投与に適した医薬的に許容され得る担体と組み合わせて、クロストリジウム・ディフィシルおよびその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量：を含んでなる、患者の偽膜全腸炎または抗生物質関連下痢の処置に使用するための医薬組成物。 10．（ａ）クロストリジウム・ディフィシルおよびそれらのトキシン類に対する特異的活性を有する抗体の有効量、および（ｂ）バンコマイシン、バシトラシン、またはメトロニダゾールの有効量を医薬的に許容され得る担体と、経口または直腸経由投与に適合するように組み合わせて、含んでなる：偽膜全腸炎または抗生物質関連下痢の処置に使用するための医薬組成物。 11．バンコマイシン、バシトラシン、またはメトロニダゾールの有効量の投与と同時に、またはその投与を後続させて、クロストリジウム・ディフィシルおよびその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量を経口的にまたは直腸経由で患者に投与することを含んでなる、患者の偽膜全腸炎または抗生物質関連下痢の処置法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/70 ＡＧＡＡ６１Ｋ 31/70 ＡＧＡ 38/00 ＡＤＺ 37/02 ＡＤＺ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．クロストリジウム・ディフィシルおよび結腸内に見出されるその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物のクロストリジウム・ディフィシル関連疾患を処置する方法。２．抗体を経口または直腸経由の投与形態で投与する、請求の範囲第１項記載の方法。３．投与形態が錠剤、カプセルまたは坐剤である、請求の範囲第２項記載の方法。４．錠剤またはカプセルが腸溶性被覆されている、請求の範囲第３項記載の方法。５．投与形態が抗体をマイクロカプセル化した形態で含有する、請求の範囲第２項記載の方法。６．クロストリジウム・ディフィシルおよびそのトキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量を患者に投与することを含んでなる、患者の偽膜性大腸炎を処置する方法。７．抗体を経口的にまたは直腸経由で投与する、請求の範囲第６項記載の方法。８．抗体を腸溶性被覆した錠剤またはカプセルで投与する、請求の範囲第６項記載の方法。９．クロストリジウム・ディフィシルおよびその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量を患者に投与することを含んでなる、患者の抗生物質関連下痢を処置する方法。 10．抗体を経口投与する、請求の範囲第９項記載の方法。 11．抗体を、腸溶性被覆した錠剤またはカプセルで投与する、請求の範囲第９項記載の方法。 12．経口または直腸経由投与に適した医薬的に許容され得る担体と組み合わせて、クロストリジウム・ディフィシルおよびその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量：を含んでなる、患者の偽膜性大腸炎または抗生物質関連下痢の処置に使用するための医薬組成物。 13．（ａ）クロストリジウム・ディフィシルおよびその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量、および（ｂ）バンコマイシン、バシトラシン、またはメトロニダゾールの有効量を医薬的に許容され得る担体と組み合わせて、含んでなる：偽膜性大腸炎または抗生物質関連下痢の処置に使用するための医薬組成物。 14．バンコマイシン、バシトラシン、またはメトロニダゾールの有効量の投与と同時に、またはその投与を後続させて、クロストリジウム・ディフィシルおよびその各トキシンに対して特異的活性を有する抗体の有効量を患者に投与することを含んでなる、患者の偽膜性大腸炎または抗生物質関連下痢の処置法。