JPH10505496A

JPH10505496A - 酵母による組換フィブリノーゲンの生産及び分泌

Info

Publication number: JPH10505496A
Application number: JP8509599A
Authority: JP
Inventors: ナスロイ，サマー
Original assignee: ニューヨークブラッドセンター，インコーポレイティド
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1995-09-01
Publication date: 1998-06-02
Also published as: EP0778884A1; WO1996007728A1; CA2198928A1; CN1159206A; AU3463495A

Abstract

(57)【要約】本発明は組換フィブリノーゲン、フィブリノーゲン変異体及びそのサブユニットの新規の発現系、該発現系により形質転換された酵母、フィブリノーゲン、フィブリノーゲン変異体及びそのサブユニットをクローニングするための該発現系の利用、並びに研究又は医薬品、例えば診断アッセイ又は所定の症状の処置のための治療薬における手段としての組換フィブリノーゲン、フィブリノーゲン変異体及びそのサブユニットの利用に関する。本発明の酵母系はその他の発現系により可能であったものよりも少なくとも10倍多くの組換タンパク質を生産する。また、本発明の酵母系は組換タンパク質の大量の生産に簡単に適応できる。更に、本発明の酵母系により、組換フィブリノーゲンが主要分泌タンパク質となり、従って培養培地から容易に精製できる。

Description

【発明の詳細な説明】酵母による組換フィブリノーゲンの生産及び分泌政府の権利本研究は州認定番号HL37457 により一部支援されたものである。政府は本発明の一定の権利を有する。発明の背景１．発明の分野本発明は組換フィブリノーゲン、フィブリノーゲン変異体及びそのサブユニットの新規の発現系、該発現系により形質転換された酵母、フィブリノーゲン、フィブリノーゲン変異体及びそのサブユニットをクローニングするための該発現系の利用、並びに研究又は医薬品、例えば診断アッセイ又は所定の症状の処置のための治療薬における手段としての組換フィブリノーゲン、フィブリノーゲン変異体及びそのサブユニットの利用に関する。２．関連技術の説明フィブリノーゲンはフィブリンの可溶性前駆体であり、これは血餅の主要構成分である。フィブリノーゲンの構造はかなり研究されている。構造の参考については、M．Furlan のFibrinogen，Fibrin Stabilization and Fibrinolysis，J.L ．Francis 編，Chichester，Ellis Horwood，1988，頁17-64；及びR.F．Doolitt le，1984，Annu，Rev．Biochem.，53：195を参照のこと。フィブリノーゲンは３種類のポリペプチド鎖（Ａα，Ｂβ及びγ）より成り、ダイマーとしての形態をとり、各半分子は一組の各鎖を含んでいる。２つの半分子はポリペプチドのアミノ末端領域において３本のジスルフィド結合により互いと結合している。２本の対称性結合は隣接し合うγ鎖の間にあり、そして１本はＡα鎖の間にある。更に、分子間及び分子内ジスルフィド結合の複雑な組合せ（29本のジスルフィド結合があり、スルフヒドリル基はない）が適正な構造の維持に関与している。フィブリノーゲンは本質的に、小さな中心ドメインにつながった２本の末端二分裂型ドメインより成る線形形態を有する。ポリペプチドα，β及びγのアミノ末端が中心ドメインの中に含まれ、且つ連結し合っている。フィブリノーゲンはトロンビンに対して感受性である。トロンビンはフィブリノーゲンのα及びβ鎖の末端からペプチドを切断する。遊離した鎖はそれぞれフィブリノペプチドＡ及びＢと呼ばれる。フィブリノーゲンα及びβ鎖のアミノ末端からのフィブリノペプチドＡ及びＢの除去は本質的な意味での「フィブリンモノマー」をもたらしめ、その自発的重合はフィブリンをもたらす。各フィブリンモノマーはその中心ドメインの中に特定の重合部位（又は「節目」）を有し、それはフィブリノーゲンにおいてはフィブリノペプチドＡ及びＢにより遮蔽されている。フィブリノーゲンＡ及びＢの遊離はこれらの節目を露出させる。これらの節目は正に帯電しており、そして隣りの分子の末端ドメイン上に横たわっている相補的に負に帯電した「穴」に結合しうる。まずフィブリンモノマーは重合して二本鎖プロトフィブリルとなり、ここで一の分子の中心ドメインは２個の隣接し合う分子それぞれに由来する末端ドメインと、半分子が互い違いに重なり合った状態で結合する。ＸIIIａ因子（フィブリン安定化因子）及びCa²⁺の存在下でのこれらのプロトフィブリルの架橋がフィブリンを形成する。架橋はトロンビンによっても触媒され、それは不活性な酵素前駆体ＸIII因子を活性形態のＸIIIａ因子に変換せしめる。フィブリン塊は一過性な封鎖体となることを意図し、そしてその結果正常な創傷治癒過程の一部として行動する。プラスミンはフィブリン塊を分解し、そしてプラスミノーゲンからプラスミンに至る変換は溶解のペースを支配する。最も重要なプラスミノーゲン変換過程には組織プラスミノーゲンアクチベーター（t-PA ）が関与し、それは負傷した内皮細胞から遊離する。t-PAそれ自体はプラスミノーゲンの活性化においてあまり有効ではないが、フィブリン及び様々なフィブリン分解産物の存在は活性化過程は著しく促進する。凝塊形成におけるその役割に加えて、フィブリノーゲンは血小板凝集にも関与している。高親和性「血小板認識部位」は両γ鎖の対立する末端（残基397-411 ）にある親水性カルボキシ末端ペンタデカペプチドに局在している。このセグメントは血小板フィブリノーゲンレセプターに収まる塩架橋化γループを形成しているようである。フィブリノーゲンが血小板レセプターにいづれかのγ末端において結合すると、この分子は隣接する血小板上のフィブリノーゲンに対してその自由末端上で橋を形成するのに十分に「近づく」。その結果、両血小板上のレセプターは互いに向き合って移動し、これにより橋を強化する。他の血小板が同様に結合し、これにより格子の形成がもたらされる。フィブリノーゲンの主要機能は凝塊形成及び血小板凝集であるが、フィブリノーゲンは多種多様なその他のタンパク質及び細胞にも相互作用を及ぼす。例えば、刺激又は損傷を受けると、脈管系に広がる内皮細胞もフィブリノーゲンと結合する。内皮細胞に対するフィブリノーゲン上の主要結合部位は血小板に対する結合に関与するものと同じようである。D.A．Cheresch ら，1989，Cell，58：945 を参照のこと。更に、フィブリノーゲンはスタフィロコッカス．アウレウス(Staphylococcus aureus)。所定の株を「凝集」させることができる点で血漿タンパク質のうちで固有である。フィブリノーゲンに対する主要の「凝集」部位も血小板に対する結合に関与するものと同一のようである。J．Hawigerら，1982，Biochem.，21：1407 を参照のこと。哺乳類における主要の（そしておそらくは唯一の）フィブリン生合成部位は肝臓である。肝細胞は合成の主要部位であり、そしてフィブリノーゲンの成分鎖は別々の遺伝子によりコードされる。これらの遺伝子が発現し、鎖が合体し、適切なジスルフィド結合が形成され、そして六量体が循環系の中に放出され、そして小胞体に輸送され、そこでそれらはグリコシル化、ホスホリル化及び硫酸化される。臨床結果により又は日常的なスクリーニング中に数百の天然フィブリノーゲン変異体が既に同定されている。これらの変異体はフィブリノーゲン−フィブリン生化学の理解に多大に寄与し、多くの場合構造−機能関係の重要な見識をもたらした。天然変異体が価値を有するのと同様に、それらは組換系において発現させる組換フィブリノーゲンによる部位特異的突然変異誘発実験により理解されるようになる。例えば、ジスルフィド結合γCys326−γCys339のカルシウム結合における役割を研究するため、ある研究室はエッシェリヒア．コリ（Escherichia coli）の中の改質ポリペプチドをコードするDNA で発現させることによってCys326及びCys3 39を欠くポリペプチドを合成するのに部位特異的突然変異誘発を既に利用している。M.G．Bolyardら，1990，Biochem．Biophys．Res．Comm.，174：853 を参照のこと。興味深いことに、このγCys326−γCys339結合は凝塊能にも関係する。R．Procyk ら，1990，Biochem.，29：1501-1507は、この結合が、カルシウムの非存在下での低濃度のジチオスレイトールによるフィブリノーゲンの温和な還元中に切断される結果の一つであることを示した。所定の還元の結果は凝塊能の消失である。これは後に、フィブリノーゲン上のカルボキシ−末端重合部位の妨害の結果であると明白に決定された。カルボキシ−末端重合部位のこの妨害は、いうなれば、γCys326−γCys339結合切断の結果であることが明らかである。R．Procyk ら，1992，Biochem.，31：2273 を参照のこと。同時係属中の米国特許出願第07/946,826号（その内容は引用することで本明細書に組入れる）はこのようにして還元したフィブリノーゲンはフィブリン及びフィブリンモノマーとの生化学的及び免疫学的に実質的に同等であり、それ故このような物質を必要とするアッセイにおけるフィブリン又はフィブリンモノマーの代替物として有用である。かかるアッセイは、例えば（ｉ）フィブリンモノマー、（ii）プラスミンアクチベーター阻害活性、（iii）組織プラスミノーゲンアクチベーター活性及び（iv）イムノアッセイの定量決定用の慣用アッセイを含む。かかる還元フィブリノーゲン又はその他のフィブリノーゲン変異体をコードするDNA 配列を構築するのに部位特異的突然変異誘発を利用することが可能であり、その結果、かかるDNA を含む発現ベクターを構築する、かかる発現ベクターにより適当な宿主を形質転換させる、そしてこの宿主をDNA を発現するように誘導させることが可能である。我々の研究室及びその他は、トランスフェクションされた動物細胞が組換フィブリノーゲンを産生する系を述べている。S.N．Royら，1991，J．Biol．Chem.， 266：4758（COS-1 及びHep G2細胞の中での発現）；R．Hartwigら，1991，J．Bi ol．Chem.，266：6578（ COS-1 細胞の中での発現）；及びD.H．Farrellら，1991，Biochem.，30：9414（ベビーハムスター腎(BHK)細胞の中での発現）を参照のこと。しかしながら、これらの系は少量のフィブリノーゲンしか生産できず、そしてスケールアップするのが困難である。組換フィブリノーゲンはまちがいなく研究手段として有用であるが、それに加えてそれらは医薬品において、例えば創傷治癒のための「フィブリン接着剤」の調製において、又はある場合、低フィブリノーゲン血症患者への点滴のためにも有用であろう。発明の概要本発明の主たる目的は組換フィブリノーゲン、組換フィブリノーゲン変異体、及び組換フィブリノーゲンサブユニットを比較的大量に発現させる系の提供であった。本発明の更なる目的は組換フィブリノーゲン、組換フィブリノーゲン変異体及び組換フィブリノーゲンサブユニットのための、簡単にスケールアップできるであろう発現系の提供にある。本発明の更なる別の目的は、組換フィブリノーゲン、組換フィブリノーゲン変異体及び組換フィブリノーゲンサブユニットの提供、並びに研究における、並びに治療薬としての医薬品及び診断アッセイにおけるかかる組換タンパク質の利用の提供にある。これら及びその他の目的は本発明により達成される。本発明は一般にフィブリノーゲンのポリペプチド鎖又はその変異体をコードする少なくとも一本のcDNAを含んで成る酵母用の発現ベクターに関する。一の態様はフィブリノーゲンのＡα 鎖又はその変異体をコードするcDNA、フィブリノーゲンのＢβ鎖又はその変異体をコードするcDNA、及びフィブリノーゲンのγ鎖又はその変異体をコードするcD NAを含む酵母用の発現ベクターを含む。本発明の第二の態様はかかるベクターにより形質転換された酵母に関する。本発明の第三の態様は酵母の中でフィブリノーゲン、又はその変異体もしくはサブユニットを発現させる方法に関し、この方法は：（ａ）ポリペプチド鎖もしくはフィブリノーゲン又はその変異体をコードする少なくとも一本のcDNAを含む酵母用の発現系を構築又は獲得する；（ｂ）前記発現ベクターにより酵母を形質転換させ、そして安定な形質転換体を選別する；（ｃ）培養培地の中でこの形質転換体を、フィブリノーゲン又はその変異体もしくはサブユニットがこの培養培地の中に分泌されるような条件下で維持する；そして（ｄ）この培養培地からフィブリノーゲン又はその変異体もしくはサブユニットを回収する；工程を含んで成る。本発明の第四の態様は本発明の方法により生産した組換フィブリノーゲン又はその変異体もしくはサブユニットに関する。本発明の酵母系は驚くべきことに、その他の発現系により可能なものよりも少なくとも10倍多い組換フィブリノーゲンを産生する。また、本発明の酵母系は組換フィブリノーゲンの大量生産に簡単に適応される。更に、本発明の酵母系により、組換フィブリノーゲンは主要な分泌タンパク質となり、それ故培養培地から容易に精製できる。図面の簡単な説明図１はプラスミドpYES2 の地図である。図２はヒト血漿及び酵母組換フィブリノーゲンのSDS-PAGE及びウェスタンブロット分析を示す。図３はヒト血漿及び酵母組換フィブリノーゲンのトロンビン誘導凝塊及び架橋のSDS-PAGE及びウェスタンブロット分析を示す。発明の詳細な説明本発明は組換ヒトフィブリノーゲン又はその変異体もしくはサブユニットを提供し、これは研究において、又は治療薬としての医薬品において、又は診断アッセイにとっての試薬として利用できる。「フィブリノーゲン変異体」又は単に「変異体」とは、ヒトフィブリノーゲンのアミノ酸配列を本質的に有するか、しかし１又は複数の挿入、欠失、付加及び／又は置換が慣用の方法により意図的に施されているポリペプチドを意味する。「フィブリノーゲンサブユニット」又は単に「サブユニット」とは、ヒトフィブリノーゲン又はフィブリノーゲン変異体の個々のα，βもしくはγ鎖又はかかる鎖の任意の組合せのアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドであって、２本づつの各鎖を含む完全分子を除くものを意味する。これらの鎖の様々な組合せが機能性タンパク質の生合成及び集成を研究するための研究手段として有用である。ヒトフィブリノーゲンのα，β及びγ鎖についてのcDNAは単離及び特性決定されている。それぞれM.W．Rixonら，1983，Biochem.，22：3237；D.W．Chungら， 1983，Biochem.，22：3244；及びD.W．Chungら，1983，Biochem.，22：3250 を参照のこと。しかしながら、そのコード縮重性に基づき、同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列においてかなりの多様性がありうる。本発明の目的にとって、かかる「縮重変異体」も有用であり、そして「フィブリノーゲンのポリペプチド鎖をコードするcDNA」との言及があるときには考慮に入る。本明細書において利用する「縮重変異体」なる語は任意のDNA 配列であって、遺伝子コードの縮重性に基づき、別のDNA 配列と同一のアミノ酸配列をコードするものを意味する。本発明はまた酵母において有用な量の精製フィブリノーゲン又はその変異体もしくはサブユニットを生産するための発現ベクターを提供する。本明細書で用いる語「酵母」とは、任意の酵母株、特にサッカロマイセス・セレビジュ（Saccha romyces cerevisiae）又はサッカロマイセス・ポンベ（S．pombe）の特定の株、並びにその他の属、例えばピシア（Pichia）又はクルイベロマイセス(Kluyverom yces)の株であって、組換タンパク質にとっての産生株として利用されているものを包括することを意図する。一般にベクターは、酵母に由来する調節因子に作用可能式に連結されたフィブリノーゲンのポリペプチド鎖（α，β及び／又はγ）又はその変異体をコードする少なくとも一種のcDNAを含んで成りうる。かかるベクターによる酵母細胞系の形質転換後、これらのベクターを、コードポリペプチド鎖を発現させるように、又はこのベクターが３本の鎖全てを含んで成るとき、適正に集成したフィブリノーゲン又はその変異体を発現させるように誘導する。酵母において利用するためのベクターは当業者によく知られている。かかるベクターにはエッシェリヒア・コリ及び酵母の双方において複製するいわゆる「シャトルベクター」が含まれる。かかるベクターの一般的な説明はJ．D．Watsonら，Recombinant DNA 第２版， New York，W.H．Freeman and Company，1992，頁235-253 にされている。かかるベクターのより詳しい詳細、並びに酵母遺伝子の基礎的な技術、例えば酵母培地の調製、株の保存及び復帰、株の増殖及び操作、突然変異誘発、高効率性形質転換、選択マーカー、発現カセット、レプリケーター、プロモーター、リーダー、ターミネーター、分泌のためのシグナル配列等の詳細はF.M．Ausubelら(編):「S accharomyce s cerevisiae」、F.M．Ausubelら（編）Short Protocols in Molecular Biology 第２版，New York，John Wiley & Sons，1992，頁13-1〜13-49 に記載されている（その内容は全て引用することで本明細書に組込れる）。一般に、酵母は液体培地の中で、又は固形寒天プレートの表層（又はその中に埋没させて）増殖させることができ、尚液体培地が好ましい。酵母はデキストロース（グルコース）、窒素、リン、微量金属及びタンパク質、並びにアミノ酸、ヌクレオチド前駆体及び細胞が通常de novo で合成するであろうその他の代謝物を供する酵母−細胞−抽出物加水分解物を含む液体培地で最も良く増殖する。デキストロースの代わりに、酵母は様々なその他の炭素源、例えばカラクトース、マルトース、フルクトース及びラフィノースで増殖できる。特に好適な態様において（これは以降により詳しく説明する）、我々は転写を、ガラクトースで誘導されるGal-1 プロモーター因子のコントロール下に置いた。培地は例えば 15lb/ m²において15分オートクレーブすることにより滅菌すべきであるが、その時間は大量の培地を調製するときには延長すべきである。かかる培地上で培養する場合、酵母細胞は約90分毎に分裂する。酵母ベクターは酵母の中でのその複製のやり方に基づいて５つの一般的なクラスに分類できる：YIp（酵母組込プラスミド）、YRp（酵母複製プラスミド）、YC p（酵母動原性プラスミド）、YEp（酵母エピソームプラスミド）及び YLp（酵母線形プラスミド）。YLpを除き、全てシャトルベクターである。YIpプラスミドは選択酵母遺伝子を含むが、酵母の中でのプラスミドの自己複製を可能にする配列を欠く。その代わり、酵母の形質転換は酵母ゲノムへの YIpプラスミドの組込みにより生ずる。YRpプラスミドは自己複製能を授ける酵母ゲノム由来の配列を含む。YRpプラスミドは高い形質転換率（10³〜10⁴形質転換体/MgDNA）を有するが、形質転換体は時折り有系分裂又は減数分裂中不安定である。YCpプラスミドは酵母動原体由来のDNA セグメントを含み、そしてこれは有系分裂及び減数分裂中の安定性を大いに高める。YLpプラスミドは末端小粒として機能する一定のGCリッチ反復配列をその末端に含み、そしてそれはプラスミドが線形分子として複製することを可能にする。しかしながら、本発明の目的にとっては YEpプラスミドが好ましい。これらのプラスミドは天然酵母プラスミド、いわゆる「２μｍサークル」に由来する配列を含む。この２μｍ配列は染色体外複製を可能にし、そして高い形質転換率を授ける（約10⁴ 〜10⁵形質転換体/MgDNA）。これらのプラスミドは有系分裂及び減数分裂中に比較的安定であり、そしてその結果、酵母における高レベル遺伝子発現のために一般的に利用される。一般に、異種構造配列を適切なリーディングフレームの中で翻訳開始及び終止配列、選択マーカー、及び好ましくは細胞外媒質に至る翻訳タンパク質の分泌を指令できるリーダー配列と集成する。一般的に利用されている選択マーカーは野生型遺伝子、例えばURA3，LEU2，HIS3及びTRP1であり、そして好ましくはそれら全てが利用される。これらの遺伝子は酵母宿主における特定の代謝欠陥（栄養要求性）を補完し、その結果有用な形質転換体は選択培地上でのその増殖により同定できる。好適な態様において（これは以下により詳しく説明する）MFα１リーダー配列が利用されるか、しかしその他の配列も同様に有用であろう。MFα１リーダー配列を利用するとき、異種タンパク質は酵母KEX タンパク質により切断される。このような場合、W．Fiersらの「Secretion and Surface Expression in Microorganisms of Heterologous Proteins Important for Medical Research a nd Clinical Applications」Harnessing Biotechnolo gy for the 21st Century，M．R．Ladischら編，American Chemical Society，1 992，頁23-25 により提唱されている通り、プロ配列と異種遺伝子配列との間に、プロ配列の切断を促進する１又は２個のGlu-Ala ジペプチドを配置することが有用でありうる。上記のベクターは全てRNA ポリメラーゼIIにより利用される強力なプロモーターを担持する。これらのプロモーターは誘導的（例えばGal-1，Gal-10，PHO5）又は構成的（例えば ADHI，PGK又は GPD）のいづれかでありうる。これらのプロモーターからの転写は転写開始部位の上流の部位（酵母においては上流活性化部位又は UAS）に結合するアクチベータータンパク質に依存する。Gal プロモーター、特にGal-1（ガラクトキナーゼ）プロモーターが好ましい。Gal プロモーターはアクチベーターGal-4（それは転写開始の上流のUAS に結合する）及びアクチベーターによる活性化を抑制するネガティブ調節因子Gal-80により調節される。Gal-1 プロモーターからの転写は例えば細胞を炭素の唯一の起源としてガラクトースを含む培地の中で増殖させたときに多大に誘導される。このような条件下では、Gal-80はGal-4 から解離し、そしてGal-4 はGal-1 UAS に結合する。従って、Gal-1 プロモーターを、唯一の炭素源としてガラクトースを含む培地と一緒に利用するのが好ましい。適当な酵母形質転換プロトコールは当業者に公知である。酵母形質転換キットはBIO 101，Inc．（La Jolla，CA）より購入でき、そしてこのキットのプロトコールは以下に示す実施例において若干の変更を伴って行った。Gal-1 プロモーターの抑圧解除は培地のガラクトース枯渇により生ずる。粗酵母上清液を濾過により回収し、そして更なる精製まで４℃に保持した。好適な態様において、我々は発現ベクター pYES2を利用してすばらしい収率を達成した。その構築の詳細を以下の実施例に示す。ベクター pYES2を３種のフィブリノーゲンcDNA全てによりタンデムで構築した。それぞれはMFα１プレプロ分泌シグナルカスケードに融合したGal-1-プロモーター因子のコントロール下にある。以下により詳しく説明する通り、酵母から分泌した組換フィブリノーゲンはポリアクリルアミドゲル上で分析したときに血漿フィブリノーゲンと類似しており、そして更に天然血漿フィブリノーゲンと同様、酵母から分泌した組換フィブリノーゲンはトロンビン誘導凝塊を形成可能である。この酵母系において、フィブリノーゲンは培養培地中の主要分泌タンパク質であり、それ故タンパク質についての慣用の精製方法により、例えば塩析、限外濾過、透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等により簡単に精製できる。酵母細胞を、単一ベクター中にタンデムとなっているのではなく、別の発現ベクターの中にある各フィブリノーゲンcDNAにより同時トランスフェクションすることにより適正に集成したフィブリノーゲンを得ることも可能である。この態様を利用した場合、３種のcDNA全てを含む安定な形質転換体の選択を助長するため、各ベクターは異なる選択ベクターを含むべきである。フィブリノーゲン変異体又は変異サブユニットの調製のため、天然cDNAのDNA 配列を改変する慣用の突然変異誘発技術を利用するのが有利である。例えば、必要とされる置換、欠失又は挿入に応じて改変された特定のコドンを有する改変「遺伝子」を得るためにオリゴヌクレオチド依存性部位特異的突然変異誘発手順を利用できうる。研究のためにフィブリノーゲン変異体を使用する場合、縮重オリゴヌクレオチドによるカセットの突然変異誘発が単一実験でランダム突然変異の大量なコレクションを作り上げるために利用できる。これらの技術の詳細は当業者に公知であり、そしてここでは繰り返さない。しかしながら、J．D．Watsonら，前掲，頁191-211；F.M. Ausubelら，前掲，頁 8-1 〜8-25；及び J．Sambrookら，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第２版，Plain view New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，頁15 -1〜15-113を参照のこと（その内容は引用することで本明細書に組入れる）。前述の通り、γCys 326-γCys 339 結合が凝塊能に関与している。様々な診断アッセイのため、このアッセイ中に凝塊しないか、生化学的及び免疫学的にフィブリン又はフィブリンモノマーから区別できる試薬を利用することが所望される。米国特許出願第07/946,826号（前掲）によると、この目的のために適当な試薬はフィブリノーゲンを一定の還元にかけることにより達成でき、それはR．Procy k ら1992前掲によれば、一定のCys-Cys 結合の切断をもたらす。かかる「還元フィブリノーゲン」は組換方法により調製することが可能でありうる。例えば、オリゴヌクレオチド依存性部位特異的突然変異誘発手順を利用し、一定の還元の際に破壊される位置にあるシステインについてのコドンを別のアミノ酸についてのコドン、例えばグリシン、又はおそらくはメチオニンであって、システインと同様に疎水性であり、そして側鎖に硫黄を含んでいるアミノ酸についてのコドンと置き換えることにより、様々な鎖をコードするcDNAを改変することが可能である。更に、組換フィブリノーゲン及びその変異体は治療剤としての医薬品における用途を有するであろう。フィブリノーゲンは「緊急時タンパク質」の一つであり、その生合成は外傷及び負傷時に著しく増大する。R.F．Doolitle：「The Molec ular Biology of Fibrin」、G．Stamatoyannopoulos ら（編）The Molecular Ba sis of Blood Diseases 第２版，Philadelphia，W．B．Saunders Company，19 94，頁 712を参照のこと。フィブリノーゲン置換は肝不全もしくは汎発性血管内凝固症候群(DIC)を有する患者、又は先天性フィブリノーゲン欠乏症を有する患者に必要とされうる。現在、VIII因子とも呼ばれている低温沈殿抗好血性因子(A HF)の投与がフィブリノーゲン置換にとっての好適な処置となっている。低温沈殿AHF の各バッグは約 250mgのフィブリノーゲンを含む。少なくとも 50mg/dlのフィブリノーゲンの血漿レベルが手術又は外傷の適正な止血にとって必要である。M.S．Kennedy：「Transfusion Therapy」D.Harmening-Pittiglio ら（編）Mod ern Blood Banking and Transfusion Practices，第２版，Philadelphia，F.A． Davis Company，1989，頁 268を参照のこと。かかる患者への組換フィブリノーゲン又はその変異体の投与は静脈内ルートによるものであり、そして一般的な日常の用量は例えば 50mg/dlのフィブリノーゲンの最小血漿レベルを維持するのに必要な量であろう。かかる目的のため、組換フィブリノーゲン又はその変異体は全血又は血液製品、例えば血漿、低温沈殿物等に、又は慣用の薬理ビヒクルに加えてよい。本発明を以下の非限定例を参考により詳しく説明する。材料：発現ベクター(p YES2)及び酵母株（INSVC 1，MATα his3-Δ1 leu2 trpl-289 ura 3-52）はInvit rogen，Inc.より入手した。選択条件で酵母を増殖するための培地はBio101，Inc .より購入した。ガラクトース、ラフィノース、ツニカマイシンはSigma から入手した。ヒトフィブリノーゲンに対する抗体はDako Corporationから、制限酵素、クレノウフラグメント、仔牛小腸ホスファターゼ(CIP)はBoehringer，Mannhei mから、エンドグリコシダーゼＨはGenzyme から、T4 DNAリガーゼはNew England Biolabから、L-[³⁵S]メチオニン（1100 Ci/mmol）はNew England Nuclear Corp oration-Du Pont から入手した。その他の利用した試薬は述べられている（S.N ．Royら，J． Biol．Chem.，267：23151（1992）；S.N．Roy ら，J．Biol．Chem.，269：691（ 1994）；及び S.N．Roy ら，J．Biol．Chem.，266 ：4758(1991)を参照のこと）。実施例１：発現ベクターの構築一本の鎖、２本の鎖の組合せ、及び３本全ての鎖についてのフィブリノーゲン cDNAを含む発現ベクターを、pYES2 プラスミドの中のMFα1 プレプロ分泌シグナル（SS）カスケードに融合したGal-1 プロモーターの３′末端にある多重クローニング部位に挿入する。これを図１に示す。pYES2Aα，pYES2Bβ及び pYES2γを調製するため、全長cDNAを、既に記述されている構築とは別に、適当な制限酵素により遊離させた（S.N．Royら，J．Biol．Chem.，269：691（1994）；及びS.N ．Royら，J．Biol．Chem.，266：4758（1991）を参照のこと）。その他の構築体 pYES2AａB β，pYES2Aαγ，pYES2Bβγ及びpYES2AαB βγはフィブリノーゲン鎖cDNAをタンデムに結合させることによって作った。それぞれはGal-1-SSプロモーターのコントロール下とした。アガロースゲルからのDNA フラグメントの溶出、CIP によるプラスミド脱リン酸化、クレノウフラグメントによるフィル・イン反応、及びライゲーションは公知の方法の通りに実施した（S.N．Royら，J．Bio l．Chem.，267：23151（1992）；S.N．Roy ら，J．Biol．Chem.，269：691（199 4）；及びS.N．Royら、J．Biol．Chem.，266：4758（1991）を参照のこと）。実施例２：酵母の形質転換フィブリノーゲンcDNAを含むpYES2 ベクターによるS.セレビジエ（INVSCI）の形質転換はアルカリ−カチオン法により実施し、モル細胞をSC-uraプレートでプレート培養した（L.D．Schultzら，Gene，54：113（1987）参照）。各プレート由来の単一のコロニーを４％のラフィノースを含むSC-ura培地の中で30℃において一夜強く撹拌して増殖させ、そしてストック培養物として保存した。上記の構築体により形質転換した酵母細胞を INVSC1Aα，INVSC1Bβ及びINVSC1γ，INVSC1AαB β，INVSC1Aαγ、I NVSC1Bβγ及び INVSC1AαB βγと命名する。ベクターpYES2AαB βγにより安定的に形質転換されたS.セレビジエ細胞（IN VSC1）を上記の態様で調製し、そして1994年８月12日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Rockville，MD に受託番号ATCC 74296で寄託した。この寄託はブダペスト条件に従う。実施例３：ツニカマイシンによる発現及び処理ストック培養物を５mlのSC-uraの中で一夜１×10⁸/mlの密度で培養した。これらの細胞を 500×ｇで回収し、２％のガラクトースを含むSC-ura培地の中に再懸濁し、そしてフィブリノーゲン鎖合成の誘導のために更に16ｈ増殖させた。細胞を 500×ｇで回収し、50μCi/ml のL-[³⁵S]メチオニンを含むSC-ura-met培地に再懸濁し、そして30℃で１ｈインキュベートした。あるケースにおいては、細胞を10μｇ/ml のツニカマイシンを含む培地で１ｈインキュベートし、次いでL-[³ ⁵ S]メチオニンで通常通りにインキュベートした。細胞内フィブリノーゲンを決定するとき、細胞を回収し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗い、0.5mlのIPバッファー（50mMのトリス・HCl，pH7.4 ，１％のトリトンＸ-100，0.2％のSDS，150mMの NaCl，５mMのEDTA，10U/mlのトラジロール、１mMのPMSF，0.1mMのTPCK，１μｇ/ ml のダイズマメ−トリプシンインヒビター）及び 200mg（直径 0.5mm）の酸洗浄ガラスビーズ／10⁸個の細胞で 45secで２回ボルテックスにかけることにより溶解させた（J.R．Franzusoff ら，Methods in Enzymology，194：662（1991）を参照のこと）。細胞リゼートを水で１mlに希釈し、そして15000×ｇで15分４℃で遠心した。フィブリノーゲンは細胞質ゾルをヒトポリクローナルフィブリノーゲン抗体で公知の通りに免疫沈殿させることにより単離した（S.N．Royら，J．Biol．Chem.，267 ：23151（1992）；S.N．Roy ら，J．Biol．Chem.，269:691（1994）；及びS.N． Royら，J．Biol．Chem.，266：4758（1991）を参照のこと）。実施例４：フィブリノーゲンの分泌 pYES2AαB βγにより形質転換され、そして単一コロニーより増殖させた酵母細胞を４％のラフィノースを含む50mlのSC-ura培地に接種し、そして30℃で一夜増殖させた。この細胞を２％のガラクトースで誘導し、そして更に16hrインキュベートした。培養培地を室温で500×ｇで５分遠心した。培地のpHを１Ｍのトリス-HClバッファーpH8.0 で7.0 に調整し、そしてプロテアーゼインヒビターのカクテル（10U/mlのトラジロール、１mMのPMSF、0.1mM のTPCK、１μｇ/ml のダイズマメ−トリプシンインヒビター、１mg/ml のパプスタチン）を加えた。フィブリノーゲンをバッファーＡ（50mMのトリス-HCl，pH7.4 ，５mMのEDTA）により平衡にしておいた硫酸プロタミン-Sepharose 6B カラム（10ml）上への吸着によって培地から単離させた。このカラムを 0.8ＭのNaClを含むバッファ−Ａで洗い、そして結合フィブリノーゲンを 0.1Ｍの Na-酢酸、pH4.5 で溶出させた。pHを１Ｍのトリス-HCl，pH8.0 で7.0 に調整した（C.E．Dempfleら、Thromb．Res.，46 ：19(1987)）。実施例５：分泌したフィブリノーゲンの定量培地の中に分泌したフィブリノーゲンの量を２種類のフィブリノーゲン鎖特異的モノクローナル抗体[1-8C6(抗 Bβ1-21)及びFd4-7B3（抗フィブリノーゲンフラグメントＤ）]を利用する競合ELISAにより測定した。Fd4-7B3を利用するアッセイの詳細は既に報告されている（S.N．Royら，J．Biol．Chem.，266：4758（1991）を参照のこと）。抗体1-8C6 による新しいアッセイが最近開発され、その特異性が説明されている（ B．Kudryk ら，Molec．Immun.，20：1191（1983）を参照のこと）。抗体1-8C6 の西洋ワサビペルオキシダーゼラベル形態がこのアッセイに利用でき、そして0. 05μｇ/ml ほどの低いフィブリノーゲン濃度が容易に測定されうる。実施例６：ヒト血漿及び酵母組換フィブリノーゲンの特性の比較分泌した組換フィブリノーゲンをトロンビン（6.8 NIH U/ml）により、ＸIII 因子（1.0U/ml）の存在下又は非存在下で処理し、トロンビン誘導凝塊を形成する能力及び架橋する能力について調べた。フィブリン複合体をSDS-PAGEにより分け、そしてクマジーブルーによる染色、並びに鎖特異的抗体 1C2-2(抗フィブリノーゲンＡα／フィブリンα)(R．Procykら、Thromb．Res.，71：127(1993))；E a3(抗フィブリノーゲンＢβ／フィブリンβ)(B．Kudryk ら「Monoclonal Antibo dies as Probes for Fibrin（ongen）Proteolysis：Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy(J.F．Chatal編)，CRC Press，Boca Rato，FL,頁 365-398）；T2G1(抗フィブリンβ)(B．Kudryk ら，Molec．Immun.，21：89(1984))；及び 4-2(抗フィブリノーゲンγ／フィブリンγ−二量体)(R．Procyk らBlood，77：1 469(1991))を利用するウェスタンイムノブロットにより検定した。ヒト血漿フィブリノーゲンに対する酵母組換フィブリノーゲンの類似性を評価するため、２種の生成物の対比をポリアクリルアミドゲルで行った。図２は組換フィブリノーゲンと鎖特異的抗体との免疫反応性を示す。組換フィブリノーゲンを４−10％勾配SDS-PAGEで還元又は非還元条件下で分け、そして種々の鎖特異的抗体を利用するウェスタンイムノブロットにより分析した。パネルＡ：クマジーブルーで染色した還元ゲル。パネルＢ：Ａα／α鎖に対するMAb と反応させた還元サンプルのイムノブロット。パネルＣ：Ｂと同様、Ｂβ／β鎖に対するMAb と反応。パネルＤ：Ｂと同様、γ鎖に対するMAb と反応。パネルＥ：γ鎖に対するMAb と反応させた非還元サンプルのイムノブロット。データーは、形質転換酵母細胞により分泌された組換フィブリノーゲンが血漿フィブリノーゲンと類似の電気泳動及び免疫反応特性を有することを示した。図３は組換酵母フィブリノーゲンの凝塊特性を示す。酵母細胞により分泌された精製組換フィブリノーゲンをトロンビン又はトロンビン＋ＸIII因子と37℃で４hrインキュベートした。凝塊後、各サンプルをDTT 及びSDS 含有バッファーに溶かし、SDS-PAGE（５−15％の勾配ゲル）により分け、そしてフィブリンβ鎖に、又はフィブリンγ鎖もしくはフィブリンγ−二量体に反応するMAb によりウェスタンブロット分析を行った。パネルＡ：クマジーブルーで染色したイムノブロット。パネルＢ：フィブリンβ−鎖（T2G1）抗体と反応させたイムノブロット。パネルＣ：フィブリノーゲンγ鎖／フィブリンγ−二量体（４−２）抗体と反応させたイムノブロット。レーン１、分子量マーカー；レーン２、血漿Fbg ；レーン３、酵母Fbg；レーン４、酵母Fbg から調製した非架橋化フィブリン；レーン５、酵母Fbg から調製したＸIIIの因子架橋化フィブリンデーターは、組換フィブリノーゲンが、血漿フィブリノーゲンと同様に、トロンビン誘導凝塊を形成でき、そしてＸIII因子誘導架橋を受けることを示した。本明細書及び請求の範囲は例示のために記載したものであり、そして様々な改良及び変更が本発明の範囲を逸脱することなくなされうる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:85） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．フィブリノーゲンのポリペプチド鎖又はその変異体をコードする少なくとも一本のcDNAを含んで成る酵母用発現ベクター。２．フィブリノーゲンのＡα鎖又はその変異体をコードするcDNA、フィブリノーゲンのＢβ鎖又はその変異体をコードするcDNA、及びフィブリノーゲンのγ鎖又はその変異体をコードするcDNAを含んで成る、請求項１記載の発現ベクター。３．pYES発現ベクターであり、その中に３種の前記cDNAがタンデムでT7プロモーターの３′末端において挿入されているものである、請求項２記載の発現ベクター。４．前記３種のcDNAがGal-1-プロモーターのコントロール下にある、請求項３記載の発現ベクター。５．請求項１記載の発現ベクターにより形質転換された酵母。６．請求項２記載の発現ベクターにより形質転換された酵母。７．請求項３記載の発現ベクターにより形質転換された酵母。８．請求項４記載の発現ベクターにより形質転換された酵母。９．酵母の中でフィブリノーゲン又はその変異体もしくはサブユニットを発現する方法であって：（ａ）ポリペプチド鎖もしくはフィブリノーゲン又はその変異体をコードする少なくとも一本のcDNAを含む酵母用発現ベクターを構築又は獲得する；（ｂ）前記発現ベクターで酵母を形質転換し、そして安定形質転換体を選択する；（ｃ）この形質転換体を培養培地の中で、フィブリノーゲン又はその変異体もしくはサブユニットがこの培養培地の中に分泌されるような条件下で維持する；そして（ｄ）この培養培地からフィブリノーゲン又はその変異体もしくはサブユニットを回収する；工程を含んで成る方法。 10．前記発現ベクターがフィブリノーゲンのＡα鎖又はその変異体をコードするcDNA、フィブリノーゲンのＢβ鎖又はその変異体をコードするcDNA、及びフィブリノーゲンのγ鎖又はその変異体をコードするcDNAを含んで成る、請求項９記載の方法。 11．前記発現ベクターがpYES2 発現ベクターであり、その中に３種の前記cDNA がタンデムでT7プロモーターの３′末端において挿入されているものである、請求項10記載の方法。 12．前記３種のcDNAがGal-1-プロモーターのコントロール下にある、請求項11 記載の方法。 13．請求項９の方法に従って生産されたフィブリノーゲン又はその変異体。 14．請求項10の方法に従って生産されたフィブリノーゲン又はその変異体。 15．請求項11の方法に従って生産されたフィブリノーゲン又はその変異体。 16．請求項12の方法に従って生産されたフィブリノーゲン又はその変異体。