JPH10506098A

JPH10506098A - 自己免疫疾患の処置のために有用なインバリアント鎖組成物

Info

Publication number: JPH10506098A
Application number: JP8504452A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムエフ．ヒッキー，
Original assignee: トラスティーズオブダートマウスカレッジ
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 1998-06-16
Also published as: WO1996001646A1; US20040002113A1; CA2194550A1; EP0773790A1; AU2967395A; US6509165B1

Abstract

(57)【要約】インバリアント鎖タンパク質またはそのペプチド断片と、薬学的に受容可能なキャリヤとを含む薬物組成物が開示される。この組成物のインバリアント鎖ペプチド断片は、MHCクラスII分子のような主要組織適合性複合体(MHC)分子に対する結合モチーフのアミノ酸配列を含む。好ましくは、このペプチド断片は約10〜35のアミノ酸長さ、より好ましくは、10〜20のアミノ酸長さ、さらに好ましくは、12〜16のアミノ酸長さである。本発明はさらに、開示される組成物および方法で使用するためのインバリアント鎖ペプチド断片を調製する方法を提供する。この方法は、MHC分子に対する結合モチーフのアミノ酸配列を同定する工程、MHC結合モチーフのアミノ酸配列を含むインバリアント鎖タンパク質の領域を選択する工程、およびこの選択された領域を包含するインバリアント鎖ペプチド断片を調製する工程を包含する。自己免疫疾患を処置する方法もまた開示される。本発明の方法は、治療上有効な量のインバリアント鎖タンパク質またはそのペプチド断片を、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリヤと共に、処置が必要な被験体に投与する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】自己免疫疾患の処置のために有用なインバリアント鎖組成物発明の背景抗原によるＴ細胞の活性化は、増殖、サイトカイン生成、および、細胞傷害性Ｔ細胞の刺激およびＢ細胞による抗体産生のようなヘルパー−エフェクター機能の誘導を含む多くの応答を発生させる。Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞の表面上に存在するクローン的に分布するＴ細胞レセプタ(TCR)の刺激の結果生じる抗原特異的シグナルを必要とする。自然の免疫応答において、TCRは、抗原提示細胞(APC) の表面上に存在する主要組織適合性複合体(MHC)（MHCクラスＩタンパク質または MHCクラスIIタンパク質のいずれか）に結合した抗原性ペプチドの認識により刺激される。構造的には、MHC分子は、抗原性ペプチドが結合するクレフト(cleft) 様の結合部位を有する。代表的には、CD4⁺Ｔ細胞はMHCクラスII分子と結合するペプチドを認識する。MHCクラスII分子は、限られた数の細胞タイプ（主にＢ細胞、単球／マクロファージ、および樹状細胞）上に見られ、ほとんどの場合、細胞外環境（つまり、外因性抗原）から取り出されたタンパク質由来のペプチドを提示する。対照的に、CD8⁺Ｔ細胞は、代表的には、MHCクラスＩ分子と結合するペプチドを認識する。MHCクラスＩ分子は、ほとんど全ての細胞タイプ上に見られ、ほとんどの場合、内因的に合成されたタンパク質由来のペプチドを提示する。MHCクラスＩ分子とクラスII分子とに対して、異なる細胞内プロセッシングおよび運搬経路が存在する。MHCクラスＩ分子は、小胞体内の抗原性ペプチドと結合すると考えられる。一方、MHCクラスII分子は、エンドソームコンパートメント内の抗原性ペプチドと結合すると考えられる。MHCクラスIIのプロセッシング経路の他と区別し得る特徴は、インバリアント鎖(Ii)を含むことである。このインバリアント鎖は、新生(nascent)MHCクラスII分子と細胞内で相互作用するが代表的には細胞表面上では成熟MHCクラスII分子と複合化されないタンパク質である。外来の抗原に特異的なＴ細胞応答の誘導は病原体に対する宿主防御にとって非常に重要である一方、自己タンパク質（「自己抗原」）に応答する「不適切な」Ｔ細胞の活性化は自己免疫につながり得る。多くの自己免疫疾患における重要な開始事象は、自己反応性Ｔリンパ球による、MHCクラスII分子と結合した自己タンパク質の認識である。この自己タンパク質に対する免疫寛容のブレークダウンは、Ｔ細胞のクローン欠失および／またはＴ細胞中の自己抗原特異的アネルギー誘導のような、自己反応性Ｔ細胞の生成を阻害または抑制するために設計された精巧な胸腺内のそして周辺のメカニズムにもかかわらず起こる（例えば、Sprent ，J．(1988)Immunol．Rev．101:172-189、Blackman，M.ら、(1990)Science 248: 1335-1341、Ramsdell，F.およびFowlkes，B．J．(1990)Science 248:1342-1348 、およびSchwartz，R．(1990)Science 248:1349-1356を参照のこと）。例えば、多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)に関わる自己反応性Ｔ細胞の特徴についての多くの研究により、自己反応性Ｔ細胞により認識されるミエリン塩基性タンパク質(MBP)の免疫優性のアミノ酸配列(Chou，C.-H.ら、(19 77)J．Neurochem．28:115-119、Hashim，G．(1978)Immunol．Rev．39:60-107、Z amvil，S.ら、(1986)Nature 324:258-260)、および好適なＴ細胞レセプター遺伝子の使用(Heber-Katz，E.およびAcha-Orbea，H．(1989)Immunol．Today 10:164- 169、Heber-Katz，E．(1990)Clin．Immunol．& Immunopathol．55: 1-8)が明らかにされている。自己タンパク質に対する寛容のブレークダウンにつながり且つ自己免疫を生じさせる精密なメカニズム（単数または複数）は知られていないが、遺伝的要因および環境的要因の両方が示唆されている。多くの疾病が、実際に自己免疫性であるかまたは少なくとも自己免疫要素を有すると考えられる。これらの疾病はしばしば、慢性的であり且つ患者を衰弱させ、それにより、疾病にかかった患者に大きな苦痛を与え且つ医学的、社会的および経済的負担を引き起こす。例えば、リウマチ性関節炎だけでもアメリカ合衆国において年間約１０億ドルの経済的損失を与えていると推定される(McDuffie，F ．C．(1985)Am J．Med．78:1)。自己免疫疾患の現在の処置は、コルチコステロイドの投与（例えば、自己抗体の産生を抑制するため）および／または抗炎症性薬物の投与（例えば、免疫複合体による組織のダメージを軽くするため）を含む。自己抗体および循環免疫複合体を除去するために、プラズマフェレーシスも用いられ得る。これらの療法の各々は、症状を軽減させることに向けられ、概して疾病の進行を止めることはない。更に、これらの処置はしばしば、望ましくない副作用を伴う。従って、自己免疫疾患の処置のための更なる治療法が必要である。発明の要旨本発明は、被験体の自己免疫疾患を処置するために特に有用な、抗原性ペプチドと主要組織適合性複合体(MHC)分子との間の相互作用を阻害する組成物および方法を提供する。一実施態様においては、本発明は、抗原性ペプチドと抗原提示細胞上のMHC分子との間の相互作用を阻害する方法であって、抗原提示細胞をインバリアント鎖タンパク質またはそのペプチドフラグメントに接触させることを含む方法を提供する。別の実施態様においては、本発明は、自己免疫疾患を処置する方法であって、処置を必要とする被験体に、インバリアント鎖タンパク質またはそのペプチドフラグメントを含む組成物の治療的有効量を、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアと共に投与することを含む方法を提供する。本発明によると、自己抗原性ペプチドのような抗原性ペプチドの、MHC分子への結合を競合的に阻害するために、インバリアント鎖タンパク質またはペプチドが用いられる。インバリアント鎖のアミノ酸配列が、MHC分子、特にMHCクラスII 分子のペプチド結合部位との結合を可能にするアミノ酸残基のパターンを含むことが発見されている。更に、自己抗原性ペプチドがこのMHC結合モチーフのアミノ酸配列を共有することも発見されている。従って、自己免疫反応において、MH C分子と結合する自己抗原性ペプチドの濃度は、自己抗原性ペプチドのMHC分子に対する結合を競合的に阻害するためのインバリアント鎖タンパク質またはペプチドを投与することにより低下し得、それにより自己反応性Ｔ細胞の活性化が阻害され得る。本発明の一実施態様においては、自己免疫疾患にかかっている被験体を、インタクトなインバリアント鎖タンパク質を含む組成物を被験体に投与することにより処置する。インバリアント鎖タンパク質は好適には、被験体と同一の種由来である。他の実施態様においては、インバリアント鎖のペプチドフラグメントを被験体に投与する。この方法で用いるために選択されたインバリアント鎖のペプチドフラグメントは、被験体で発現したMHCタンパク質の結合モチーフのアミノ酸配列を含む。ペプチドフラグメントは好適には、ヒトMHCクラスIIタンパク質(例えば、HLA-DR、HLA-DQまたはHLA-DP)のようなMHCクラスIIタンパク質の結合モチーフのアミノ酸配列を含む。被験体に投与されるペプチドフラグメントは、長さ約10〜35のアミノ酸であり、より好適には長さ10〜20のアミノ酸、またはさらに好適には長さ12〜16のアミノ酸であり得る。インバリアント鎖タンパク質またはそのペプチドフラグメントは、所望の結果（例えば、自己免疫疾患の少なくとも１つの症状の阻害）を達成するのに十分な用量および経路で被験体に投与する。例えば、タンパク質またはペプチドは、静脈注射または皮下注射により投与され得る。あるいは、このタンパク質またはペプチドは、筋肉内注射、腹腔内注射または経口により投与され得る。本発明の別の局面は、抗原性ペプチドと抗原提示細胞上のMHC分子との間の相互作用を阻害するために有用なインバリアント鎖ペプチドフラグメントを調製するプロセスに関する。このプロセスは、被験体で発現したMHCタンパク質の結合モチーフのアミノ酸配列を同定すること、MHCタンパク質の結合モチーフのアミノ酸配列を含むインバリアント鎖タンパク質の領域を選択すること、およびMHC 結合モチーフを含むインバリアント鎖タンパク質の選択された領域に対応するインバリアント鎖ペプチドフラグメントを調製することを含む。好適には、このプロセスにおいて、MHCクラスII結合モチーフが用いられ、従って、このように調製されたインバリアント鎖ペプチドフラグメントはMHCクラスII結合モチーフのアミノ酸配列を含む。インバリアント鎖ペプチドフラグメントは、例えば、化学的合成による、またはインバリアント鎖タンパク質をタンパク質分解により消化しインバリアント鎖タンパク質の選択された領域を含むタンパク質分解フラグメントを単離することによる、標準的技術で調製され得る。このように調製されたインバリアント鎖ペプチドフラグメントは好適には、長さ10〜35のアミノ酸であり、さらに好適には長さ10〜20のアミノ酸であり、またさらに好適には長さ12〜 16のアミノ酸である。被験体の自己免疫疾患の処置のための薬学的組成物もまた、本発明の範囲内である。一実施態様においては、この薬学的組成物は、被験体の自己免疫疾患の少なくとも１つの症状を阻害するために十分な量のインバリアント鎖タンパク質と薬学的に受容可能なキャリアとを含む。好適には、このインバリアント鎖タンパク質はヒト由来である。別の実施態様においては、この薬学的組成物は、被験体の自己免疫疾患の少なくとも１つの症状を阻害するために十分な量のインバリアント鎖タンパク質のペプチドフラグメントと薬学的に受容可能なキャリアとを含む。この組成物内に含まれるために選択されたペプチドフラグメントは、MHCタンパク質（例えば、MHCクラスIIタンパク質）の結合モチーフのアミノ酸配列を含む。図面の簡単な説明図１は、様々な濃度でアセチル化および非アセチル化ペプチドPLP224による刺激に際しての、アセチル化ペプチドPLP224で免疫されたラット由来のＴ細胞の増殖応答を表すグラフである。図２は、アセチル化および非アセチル化ペプチドPLP224によるＴ細胞の刺激に際しての、アセチル化ペプチドPLP224で免疫されたラット由来のＴ細胞により産生されたIL-2に応答したHT-2細胞の増殖を表すグラフである。図３は、酵素切断によりインシュリン（ジスルフィト結合により結合したＡ＋Ｂ鎖）およびＣ−ペプチドになる前のプロインシュリンの構造との相対的な、MH CクラスII(RT1.B/D)結合モチーフを含む合成ペプチドの位置を模式的に示す図である。結合モチーフは、プロセッシングの間に部位特異的エンドプロテアーゼにより切断された１対の塩基性(Arg-Arg)残基を含むプロインシュリン中のＢおよびＣ鎖のアミノ酸にわたっている。図4A〜Cは、抗MHCクラスII抗体の存在下または非存在下においてGAD₄₁₂（パネルＡ）、GAD₅₂₀（パネルＢ）、およびPI（パネルＣ）ペプチドに特異的なＴ細胞株の増殖を示すグラフである（参考のため、APCおよび培地とともにインキュベートされたGAD₄₁₂Ｔ細胞の平均cpmは850±297、GAD₅₂₀では74±30、そしてPIでは1763±181である）。図５は、コンカナバリンＡによる72時間の刺激後の、細胞表面抗原のPIペプチド特異的Ｔ細胞株発現のフローサイトメトリーのプロフィールである。各一次抗体のヒストグラムおよび陽性発現のパーセント値（括弧内）は、10,000個の細胞をFACScan分析することにより得られた。図６は、様々な濃度（μg／ml）でアセチル化および非アセチル化POMCペプチドにより刺激した際の、抗POMCacＴ細胞株の増殖応答を示すグラフである。（バックグラウンド平均cpm±SD=145±43）。図7A〜Bは、ホルモン抗原（濃度はμg／ml）で刺激した際の、抗ホルモン特異的Ｔ細胞株の増殖応答を示すグラフであり、抗MHCクラスII抗体の添加により増殖が阻害されることを示す。パネルＡは、抗POMC特異的Ｔ細胞の増殖応答を示す（バックグラウンド平均cpm±SD=852±444）。パネルＢは、抗CRH特異的Ｔ細胞の増殖応答を示す（バックグラウンド平均cpm±SD=81±24）。図8A〜Bは、アセチル化CRHペプチド（パネルＡ）または非アセチル化CRHペプチド（パネルＢ）のいずれかに特異的なＴ細胞株による、インタクトなCRH（40 μg／ml）対CRHペプチド（20 μg／ml）のプロセッシングおよび提示を示すグラフである（平均培地のみのcpm±SD=77±28）。図9A〜Cは、POMCペプチドをPOMC特異的Ｔ細胞に提示する、異なる供給源からのCRH刺激Ｔ細胞の能力を示すグラフである。パネルＡは、抗POMCＴ細胞の抗原提示能力を示す。パネルＢは、抗GADＴ細胞の抗原提示能力を示す。パネルＣは、胸腺細胞の抗原提示能力を示す（バックグラウンド平均cpm±SD=159±29）。図10は、20 μg／mlのPOMCペプチドの存在下または非存在下における、抗POMC Ｔ細胞＋照射APC（胸腺細胞または抗POMCＴ細胞）との混合物から得られた40時間培養上清に対する、IL-2依存性HT-2細胞の増殖応答を示すグラフである。発明の詳細な説明本発明は、抗原性ペプチドと、抗原提示細胞(APC)により発現される主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質との間の相互作用を阻害するために、インバリアント鎖タンパク質またはそのペプチドフラグメントを用いることに関する。抗原性ペプチドとAPC上のMHCタンパク質との相互作用を阻害することにより、Ｔ細胞による抗原性ペプチドの認識が阻害され、それにより、抗原性ペプチドに対するＴ細胞応答もが阻害される。抗原性ペプチドとAPCにより発現されたMHC分子との間の相互作用は、抗原性ペプチドとAPCにより発現されたMHC分子との間の相互作用を阻害するために十分な量のインバリアント鎖タンパク質またはそのペプチドフラグメントにAPCを接触させることにより阻害される。本明細書において、用語「抗原提示細胞」は、Ｂリンパ球、「プロフェッショナル」抗原提示細胞（例えば、単球、樹状細胞、ランゲルハン細胞）、および免疫細胞に抗原を提示し得る他の細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、繊維芽細胞、乏突起膠細胞）を含む。 MHC分子に結合することが阻害される好適な抗原性ペプチドは、自己抗原のペプチドである。本明細書において、用語「自己抗原」とは、Ｔ細胞応答のような、被験体において免疫応答を引き出すことができる自己タンパク質を意味する。従って、本発明は、自己免疫疾患を処置するために特に有用である。本発明は、自己免疫疾患を処置するために有用なインバリアント鎖組成物を提供する。本発明はさらに、自己免疫疾患を処置する方法であって、処置を必要とする被験体に、本発明のインバリアント鎖組成物を投与することを含む方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、特定の種のインバリアント鎖タンパク質のアミノ酸配列がその種のMHC分子（例えば、MHCクラスII分子）の結合モチーフに対応する１以上の領域を含むという発見に基づいている。従って、インバリアント鎖タンパク質の領域は、MHC分子の抗原結合部位を占めることができる。同一のM HC結合モチーフが、自己抗原の免疫原性ペプチドフラグメント中に存在し、これらのペプチドがMHC分子と結合することを可能にする。従って、インバリアント鎖タンパク質またはそのペプチドフラグメントは、MHC分子のペプチド結合部位について競合することにより、自己抗原性ペプチドフラグメントがMHC分子に結合するのを阻害するために用いられ得、それにより、MHC分子と結合する自己抗原性ペプチドの濃度が低下し、自己反応性Ｔ細胞の刺激が阻害される。本発明の様々な局面を以下のサブセクションにおいて更に詳細に述べる。Ｉ．インバリアント鎖タンパク質一実施形態において、本発明の組成物および方法は、インバリアント鎖タンパク質を利用している。インバリアント鎖(Ii)は、ヒトの体内において、約33 kD( p33)と35 kD(p35)という２つのメジャーな形態および約41 kD(p4l)と43 kD(p43) という２つのマイナーな形態で存在するタイプII貫膜タンパク質である。p33 およびp35は、キャップ部位から８番目および56番目の位置の２つのインフレームAUGコドンをオルタナティブに用いることにより生じ（Strubin，Mら、(1986)C ell 47:619-625を参照のこと）、大きい方の形態(p45およびp43)は、オルタナティブスライシングにより更なるエキソンを含むことにより生じる(Strubin，M．ら、(1986)EMBO J．5:3483-3488を参照のこと)。インバリアント鎖において、疎水性N末端配列は、シグナル配列およびメンブランアンカーの両方として作用する（Lipp，J.およびDobberstein B．(1986)Cell 46:1103-1112を参照のこと）。本発明で用いるインバリアント鎖タンパク質は、当該分野で知られている標準的技術により得られ得る。例えば、天然のタンパク質は、細胞から精製され得る。あるいは、インバリアント鎖の組換え形態は、インバリアント鎖をコードする核酸を用いて発現され得、その後組換えタンパク質が単離され得る。インバリアント鎖cDNAのヌクレオチド配列およびインバリアント鎖タンパク質の予想されるアミノ酸配列は、いくつかの種に関して記載されている。ヒトインバリアント鎖 cDNAのオルタナティブ形態のヌクレオチド配列は、Claesson，Lら、(1983)Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 80:7395-7399、Strubin，M.ら、(1984)EMBO J．3:869- 872、Strubin，M.ら、(1986)EMBO J．5:3483-3488、およびStrubin，M.ら、(198 6)Cell 47:619-625に開示されている。マウスインバリアント鎖cDNA配列は、Koc h，N.ら、(1987)BMBO J．6:1677-1683、およびZhu，L.およびJones，P．P．（19 89）Nucleic Acids Res．17:447-448に開示されている。ラットインバリアント鎖cDNA配列は、Henkes，W.ら、(1988)Nucleic Acids Res．16:11822、およびMc Knight，A．J.ら、(1989)Nucleic Acids Res．17:3983-3984に開示されている。インバリアント鎖タンパク質をコードするcDNAは、発現ベクターにクローン化され得、発現ベクターは適切な宿主細胞に導入されてインバリアント鎖タンパク質を発現する。インバリアント鎖は、原核、またより好適には真核宿主細胞において発現され得る。ヒトインバリアント鎖タンパク質の可溶形態は、Teyton，L.ら、(1990)Nature 348:39-44に記載されているように、組換えにより発現され得る。簡単に述べると、N末端の29残基をコードする領域を除去することにより、完全長のIi cDNAが改変される。この欠失により、シグナル配列切断部位が露出し、分泌可溶性形態のインバリアント鎖の産生につながる。本明細書において、用語「インバリアント鎖タンパク質」は、膜結合または可溶性形態（例えば、N末端短縮形態）の、インバリアント鎖の全ての天然に生じる変異体を含むことを意図する。II ．インバリアント鎖ペプチドフラグメントの選択本発明の別の実施形態において、インバリアント鎖タンパク質のペプチドフラグメントが、本発明の方法および組成物に利用される。本発明で用いられるインバリアント鎖ペプチドは、主要組織適合性複合体(MHC)分子に対する結合モチーフの存在に基づいて選択される。従って、本発明は、抗原性ペプチドとMHCタンパク質との相互作用を阻害するために適したインバリアント鎖ペプチドフラグメントを調製する方法であって、1)MHCタンパク質に対する結合モチーフのアミノ酸配列を同定すること、2)MHC結合モチーフのアミノ酸配列を含むインバリアント鎖タンパク質の領域を選択すること、および3)インバリアント鎖タンパク質の選択された領域を囲むインバリアント鎖ペプチドフラグメントを調製することを含む方法を提供する。このようにして選択されたインバリアント鎖ペプチドは、自己抗原性ペプチドとMHCタンパク質との相互作用を阻害することにより自己免疫疾患を処置するために特に有用である。用語「MHC分子に対する結合モチーフ」は、ペプチドがMHC分子の抗原結合部位に結合することを可能にする、ペプチド（またはタンパク質全体の領域）内に存在するアミノ酸残基のパターンを意味する。すなわち、特定のMHC分子に対する結合モチーフは、そのMHC分子にフラグメントが結合するために必要な、ペプチドフラグメントの重要なアミノ酸残基を規定する。例えば、本明細書で述べたように、ラットMHCクラスII分子RT1.B¹の結合モチーフは、５つのアミノ酸残基によってグルタミン酸残基から分離されたセリン残基（すなわち、S-x-x-x-x-x-E 、SEQ ID NO:1）からなる。実施例中で示すように、この結合モチーフは、自己免疫を有する多くの動物モデルにおいて自己抗原の免疫原性ペプチドフラグメントを予測するために用いられ得る（すなわち、自己抗原性ペプチドは、このモチーフのアミノ酸配列を含む）。S-E結合モチーフはまた、ラットインバリアント鎖内の３つの位置、すなわち、位置69〜75(S-Q-N-L-Q-L-E、SEQ ID NO:2)、177 〜 183(S-K-N-S-L-E-E、SEQ ID NO:3)、および256〜262(S-E-P-L-D-M-E、SEQ ID NO :4)にも存在する。従って、これらの領域の１つを囲む、ラットインバリアント鎖のペプチドフラグメントは、RT1.B¹MHC分子への自己抗原性ペプチドフラグメントの結合を阻害するために選択され得る。 MHCクラスＩ分子またはMHCクラスII分子のいずれかに対する他の結合モチーフは当該分野において記載されている（例えば、以下を参照のこと：Margalit，H. ら、(1987)J．Immunol．138:2213-2229、Sette，A.ら、(1988)J．Immunol．141: 45-48、Rothbard，J．B.ら、(1988)Cell 52:515-523、Rothbard，J．B.およびTa ylor，W．R．(1988)BMBO J．7:93-100、Sette，A.ら、(1989)Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 86:3296-3300、Jardetzky，T．S.ら、(1990)EMBO J．9:1797-1803、 Hill，C．M.ら、(1991)J．Immunol．147:189-197、Falk，K.ら、(1991)Nature 3 51 :290-296、Kropshofer，H.ら、(1992)J．Exp．Med．175:1799-1803、Sidney， J.ら、(1992)J．Immunol．149:2634-2640、Hunt，D．F.ら、(1992)Science 256: 1817-1820、Rudensky，A．Y.ら、(1992)Nature 359:431、Corr，M.ら、(1993)J ．Exp．Med．178:1877-1892、Chicz，R．M.ら、(1993)J．Exp．Med．178:27-47 、Sette，A.ら、(1993)J．Immunol．151:3163-3170)。一実施形態において、HLA-DR、HLA-DQまたはHLA-DP分子のようなヒトMHCクラスII分子に対する結合モチーフを囲むインバリアント鎖ペプチドが選択される。ヒトMHCクラスII分子に対する結合モチーフの例は以下を含む：リジン残基から６個のアミノ酸残基によって分離されたチロシン残基を含む、 HLA-DR1結合モチーフ（Y-x-x-x-x-x-x-K、SEQ ID NO:5）(Jardetsky，T．S.ら、 (1990)EMBO J．9:1797-1803)；小さいアミノ酸残基（例えば、トレオニン、アラニン、セリンまたはグリシン）から４個のアミノ酸残基によって分離されたかさ高い疎水性残基（例えば、チロシン、ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはメチオニン）を含む、HLA-DR1wD1結合モチーフ（Y/L/V/I/F/M-x-x-x-x-T/A/S/G、SEQ ID NO :6）(Hill，C．M.ら、(1991)J.Immunol．147:189-197)；位置１および３に疎水性残基（例えば、イソロイシン、チロシン、ロイシン、バリン、アラニン）を含み、好適にはそれに続いて位置４に親水性水素結合ドナー残基（例えば、アルパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリンまたはトレオニン）および位置６に正に帯電した残基（例えば、リジン、アルギニン、またはヒスヒジン）を含む、HLA-DR3結合モチーフ(I/Y/L/V/A/-x-I/Y/L/V/A-N/G/R/K/E/D/S/T-x-K/R/H、SEQ ID NO:7)(Sidn ey，J.ら、(1992)J.Immunol．149:2634-2640)；ヒドロキシル（セリンまたはトレオニン）または脂肪族（ロイシン、イソロイシン、バリンまたはメチオニン）残基から４個のアミノ酸残基によって分離された疎水性または芳香族残基（ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン）を含む、HLA-DR4w4結合モチーフ（L/I/V/M/F/Y/W-x-x-x-x-S/T/L/I/V/M、SEQ ID NO:8）(Sette，A.ら、(1 993)J．Immunol．151:3163-3170)；ヒスチジン、リジンまたはアルギニン残基から９個のアミノ酸残基によって分離されたイソロイシン、ロイシンまたはバリン残基を含む、HLA-DR2a/DR2b結合モチーフ（I/L/V-x-x-x-x-x-x-x-x-x-H/K/R、SEQ ID NO:9）(Chicz，R．M.ら、( 1993)J．Exp．Med．178:27-47)；アルパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、またはトレオニン残基から２個のアミノ酸によって分離されたフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリンまたはチロシン残基を含む、HLADR3/DRw52結合モチーフ（F/I/L/V/Y-x-x-D/ N/Q/T、SEQ ID NO:10）(Chicz，R．M.ら、(1993)J．Exp．Med．178:27-47)；アスパラギン、グルタミン、セリン、またはトレオニン残基から７個のアミノ酸残基によって分離されたフェニルアラニン、ロイシン、またはバリン残基を含む、HLA-DR4結合モチーフ（F/L/V-x-x-x-x-x-x-x-N/Q/S/T、SEQ ID NO:11）(Chi cz，R．M.ら、(1993)J．Exp．Med．178:27-47)；アスパラギン、セリン、またはトレオニン残基から４個のアミノ酸残基によって分離されたフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、またはバリン残基を含む、HLA-DR7結合モチーフ（F/I/L/V-x-x-x-x-N/S/T、SEQ ID NO:12）(Chicz， R．M.ら、(1993)J．Exp．Med．178:27-47)；ヒスチジン、リジン、またはアルギニン残基から３個のアミノ酸残基によって分離されたフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリンまたはチロシン残基を含む、HLA-DR8結合モチーフ（F/I/L/V/Y-x-x-x-H/K/R、SEQ ID NO:13）(C hicz，R．M.ら、(1993)J．Exp．Med．178:27-47)。インバリアント鎖ペプチドを選択するために、本明細書で述べるか又は当該分野で知られているMHC結合モチーフが用いられ得、また、MHC結合モチーフは公知の技術により同定され得る。例えば、MHC結合モチーフを同定するために、特定のMHC分子に結合することができる１連のペプチドのアミノ酸配列が比較され得、それによりペプチド内の特定の位置に保存されたアミノ酸残基が同定される。加えて、または別の選択肢として、特定のMHC分子に結合することができるペプチドは、系統だてて変異され得、変異したペプチドを、そのMHC分子に結合する能力についてアッセイすることによりMHC結合にとって非常に重要なアミノ酸残基が同定され得る（MHC結合モチーフの同定に関する更なる記載については、上記の参考文献を参照のこと）。 MHC分子に対する結合モチーフを含む、インバリアント鎖タンパク質の領域が一旦同定されると、この領域を囲むペプチドフラグメントが従来の方法で調製され得る。この領域のアミノ酸配列を有するペプチドフラグメントは、例えば市販の樹脂（例えば、p-メチルベンズヒドリルアミン；NEN/Dupont(Wilmington，DE) からのRapidAmide）および延長ペプチド上の末端アミノ酸用の保護基としてのF- mocを用いることにより、化学的に合成され得る。ペプチドはまた、自動ペプチド合成器（例えば、Applied Biosystems（Foster City，CA）製のPeptide Synth esizer 432A）を用いることによっても化学的に合成され得る。また、ペプチドフラグメントは、インバリアント鎖タンパク質のタンパク質分解による消化に続いて目的のペプチドフラグメントを単離することにより、得られ得る。規定されたタンパク質分解特異性を有するプロテアーゼは当該分野で入手可能である（例えばトリプシン(typsin)）。タンパク質分解のペプチドフラグメントは、例えば、高圧液体クロマトグラフィー(HLPC)により単離され得る。一実施形態において、インバリアント鎖ペプチドフラグメント（例えば、合成されたまたはタンパク質分解消化により得られた）は、長さ約10〜35アミノ酸である。また、ペプチドフラグメントは、長さ約10〜20アミノ酸または約12〜16アミノ酸であり得る。更に、インバリアント鎖ペプチドフラグメントは、溶解性、安定性、MHC分子と相互作用する能力、または他の所望の機能的特性を向上させるために、修飾され得る。例えば、溶解性を向上させるために、インバリアント鎖ペプチドのC-末端および／またはN-末端に、インバリアント鎖タンパク質内でコードされない１以上の帯電したアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸）が付加され得る。ペプチドの好適な修飾は、N-末端アセチル化であり、これは、α−らせん形成およびMHCとの相互作用を促進し得る（例えば、Mai n Rら、(1983)Trends Neurosci．6:229-235を参照のこと）。III ．薬学的組成物本発明のインバリアント鎖タンパク質およびペプチドは、薬学的投与に適した組成物に調剤され得る。薬学的組成物は代表的には、インバリアント鎖タンパク質またはそのペプチドフラグメント、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書において、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合する、あらゆる溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質のために、このような媒体および薬剤を用いることは当該分野で周知である。いずれかの従来の媒体または剤が活性化合物と不適合でない限り、組成物におけるこれらの使用が意図される。組成物には、補足的な活性化合物もまた組み込まれ得る。一実施形態において、インバリアント鎖タンパク質またはそのペプチドフラグメントが、抗原性ペプチドと抗原提示細胞により発現したMHC分子との相互作用を阻害するために十分な量で、組成物に含まれる。別の実施形態において、インバリアント鎖タンパク質またはそのペプチドフラグメントが、被験体の自己免疫疾患の少なくとも１つの症状を阻害するために十分な量で、組成物に含まれる。インバリアント鎖薬学的組成物は、意図した投与経路に適合するように調剤される。例えば、非経口、皮内、または皮下適用に用いる溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理的食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤などの無菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度調整剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基により調整され得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数投与バイアルに収容され得る。注射に適した薬学的組成物は、無菌水溶液（水に溶ける場合）または分散液、および無菌の注射可能溶液または分散液をその場で調製するための無菌パウダーを含む。静脈投与の場合、適したキャリアは、生理的食塩水、静菌水、Cremopho r EL^TM（BASF，Parsippany，NJ）、またはリン酸緩衝食塩水(PBS)を含む。すベての場合において、組成物は、無菌かつ注射が容易に行える程度に流体でなければならない。製造および保存条件下において安定的でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶剤または分散媒体、およびこれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合は必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の抑制は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アソルビン酸(asorbic acid)、およびチメロサールなどの様々な抗細菌および抗真菌剤により達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、およびマニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収を延長することは、組成物中に吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより行われ得る。無菌の注射可能溶液は、必要に応じて上記の成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶剤中に、必要量の活性化合物（すなわち、インバリアント鎖タンパク質またはペプチド）を組み込み、次いで、濾過により滅菌することにより調製され得る。概して、分散液は、ベースとなる分散媒体および上記したうちの他の必要な成分を含む無菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことにより調製される。無菌の注射可能溶液を調製するための無菌パウダーの場合、好適な調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、この方法は、既に滅菌のため濾過されている溶液から、活性成分および任意の所望の成分のパウダーを生成する。経口用組成物は概して、不活性希釈剤または食用のキャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに収容されるか、またはタブレット状に圧縮される。経口による処置剤の投与のために、活性化合物は賦形剤に組み込まれ得、タブレット、トローチ、またはカプセルの形態で用いられ得る。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント材料が、組成物の一部として含まれ得る。タブレット、ピル、カプセル、およびトローチなどは、以下のいずれの成分または同様の性質を有するいずれの化合物をも含み得る：微結晶セルロース、ゴムトラガカント、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Primogelまたはコーンスターチなどの崩解剤；ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesなどの滑剤(lubricant)；コロイド状二酸化シリコンなどのすベり剤(glidant)；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーなどの芳香剤。一実施形態において、活性化合物は、体内からの急速な排出に抗して化合物を保護するキャリアとともに調製される。これは、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などである。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生体分解性、生物学的適合性を有するポリマーが用いられ得る。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals，Inc.からの市販品であり得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染した細胞に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして用いられ得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載のような、当業者に公知の方法によって調製され得る。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（単数または複数）（例えばステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロール）を無機溶媒中に溶解し、次いでこれをエバポレートして、容器の表面上に乾燥した脂質の薄膜を残すことにより調製され得る。その後、インバリアント鎖タンパク質またはペプチドの水性溶液が容器に導入される。次いで、容器を手でゆらすことにより、容器の側面から脂質材料を遊離させかつ脂質の凝集物を分散させる。これにより、リポソーム懸濁液が形成される。投与を容易にするため、および投与量を均一にするために、経口用および非経口用組成物を投与量ユニット形態で製剤することが特に利点がある。本明細書において、投与量ユニット形態とは、処置する被験体のための単位投与量として適した、物理的に分離したユニットを意味する。各々のユニットが、必要な薬学的キャリアと共に、所望の処置効果を生み出すために計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投与量ユニット形態の仕様は、(a)活性化合物の固有の特徴および達成すべき特定の治療効果、そして(b)個体の処置のためのこのような活性化合物を化合する技術に固有の制限事項により決定されかつこれらに直接依存する。IV ．自己免疫疾患を治療する方法本発明によると、被験体の自己免疫疾患は、インバリアント鎖タンパク質またはそのペプチドフラグメントおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、治療上効果的な量の組成物を、被験体に投与することにより処置される。本発明のインバリアント鎖タンパク質またはペプチドは、インビボで、薬学的投与に適した生物学的適合形態で、被験体に投与される。すなわち、投与されるタンパク質またはペプチドの形態は、いかなる毒性効果よりもタンパク質またはペプチドの処置効果の方が優っている形態である。用語「被験体」は、免疫応答が引き出され得る生体、例えば哺乳類を含む。被験体の例は、ヒト、サル、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種を含む。本明細書で述べる本発明のリガンドの投与は、処置上活性な量のインバリアント鎖タンパク質またはペプチドの単体または他の処置用分子（例えば、抗炎症性剤またはステロイド）との組み合わせを含む、いずれの薬理学的形態でもあり得る。本発明の組成物の治療上効果的な量の投与は、所望の結果を達成するために十分な、量、投与量、および時間として規定される。例えば、所望の結果は、自己免疫疾患の少なくとも１つの徴候を阻害すること、この疾病の進行を遅らせることまたは停止させること、あるいは他の臨床的に望ましい結果を含み得る。治療上効果的な量のインバリアント鎖タンパク質またはペプチドは、個体の疾病の段階、年齢、性別、および体重、そしてタンパク質またはペプチドの、個体内で所望の応答を引き出す能力などの要因に応じて変わり得る。最適の治療応答を提供するために、投与療法(regimen)が調整され得る。例えば、組成物は一度に投与され得るし、またはいくつかに分割された量が毎日一定時間にわたって投与され得る。投与量は、処置状態の緊急性(exigency)により示されるように比例的に減少され得る。組成物中の活性化合物の濃度は、化合物の吸収率、不活性化率、および排出率、そして当業者に知られている他の要因に依存する。投与値もまた軽減すべき状態の深刻さに応じて変わる。さらに、いずれの特定の被験体の場合でも、個体からの要求、および組成物を投与するか又は組成物の投与を指揮する者の専門家としての判断に従って、特定の投与療法が経時的に調整されるべきであること、および本明細書中で述べる投与量の範囲は一例にすぎず本発明の組成物の範囲または実施を制限するものではないことが理解される。インバリアント鎖組成物は、所望の結果を達成するために適した好都合な様式で投与され得る。好適な実施態様において、組成物は静脈を介して投与される。別の好適な実施形態において、組成物は皮下に投与される。あるいは、組成物は経口、または皮内、筋肉内、または腹膜内などの非経口ルートにより投与され得る。活性化合物は、投与のルートによっては、酵素、酸、または化合物を非活性化し得る他の自然の状態の作用から化合物を守るための材料でコーティングされ得る。本明細書で述べる条件にとっての代表的な全身投与量は、0.01〜5 mg/kg （体重）であり、より好適には0.05〜1 mg/kg（体重）であり、さらに好適には0 .1〜0.5 mg/kg（体重）である。本発明の方法は、自己免疫疾患を治療するために有用である。本明細書において、用語「自己免疫疾患」は、性質的に自己免疫性であることが知られている疾病、および自己免疫コンポーネントに関連する障害を含む。このような疾病および障害の例は、多発性硬化症、インシュリン依存性真性糖尿病、関節炎（例えば、リューマチ性関節炎、小児リューマチ性関節炎、変形性関節炎）、myesthenia gravis、心筋炎、ギラン−バレー症候群、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、クローン病、アフタ症潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー、皮膚紅斑性狼瘡、硬皮症、膣炎、直腸炎、薬剤発疹、ハンセン病逆転反応、ハンセン病性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性進行性感覚神経性聴覚喪失、無形性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性関節炎、スティーヴェンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーヴズ眼症、サルコイドーシス、一次胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、および間隙性肺腺維症を含む。本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。本願に引用されるすべての引例、特許および公開特許出願の内容は、本明細書において参考として援用される。実施例１実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）は、ヒト疾患である多発性硬化症（MS）の動物モデルとして用いられる中枢神経系のCD4＋Tリンパ球仲介炎症疾患である。ミエリン塩基性タンパク質（MBP）およびアジュバントエマルジョンを用いる動物の能動免疫化、あるいは活性化されたMBP特異的Ｔ細胞の注入のいずれかによって、EAEは無傷のレシピエント齧歯類中で誘発され得る（例えば、Zamvil,S. ら(1985)Nature 317:355；Richert,J.ら(1979)J.Immunol．122:494；Ben-Nun，A .ら(1981)Eur．J．Immunol．11:195；Hickey，W．F.ら(1987)Cell: Immunol．10 9 :272を参照）。しかし、プロテオリピドアポタンパク質(PLP)に特異的なＴ細胞応答は、自然発生するヒト脱髄疾患MSにおける免疫学的に顕著な現象であり得ることを示唆する証拠がある（例えば、Kennedy，M.K.ら(1990)J．Immunol．144:9 09; Whitham，R．H.ら(1991)J．Immunol.146:101を参照）。合成ペプチド中のPLPのいくつかの起脳炎決定因子が、マウスおよびウサギの異なる系統について同定されている（Whitham，R．Hら(1991)J．Immunol．147: 3803；Tuohy，V.K.ら(1989)J．Immunol．142:1523; Tuohy，V.K.ら(1988)J．Imm unol．141:1126；Sobel，R.A．(1990)J．Neuropathol．Exp．Neurol．49: 468; Tuohy，V.K.ら(1992)J．Neuroimmunol．39:67；Greer，J.M.ら(1992)J．Immunol ．149: 783；Linington，C.ら(1990)J．Neuroimmunol．30:135を参照）。そのような脳炎誘発領域を同定する標準的な方法は、重複するペプチドを合成し、そして標的組織において炎症を誘発するその能力について各ペプチドを個別に試験することである。本実施例において、MHCクラスII結合モチーフを用いて、LewisラットについてPLP中の脳炎誘発性Ｔ細胞エピトープを同定した。このモチーフは、５つのアミノ酸残基によってグルタミン酸残基から分離されたセリン残基（S-x-x-x-x-x-E）（配列番号１）を含んでいる。脳炎誘発性Ｔ細胞エピトープはMHCクラスII結合モチーフを含むアミノ酸配列の存在に基づいてのみ予測され得ることを、本実施例は示している。さらに、本明細書中に記載されている結果はPLPペプチドのＮ末端アセチル化がLewisラットにおけるEAEの誘発のみならず、インビトロでのＴ細胞増殖応答およびIL-2産生においても重要な役割を果たすことを示している。以下の方法論を本実施例で用いた。材料および方法実験動物月齢２〜３カ月の雌Lewisラットを、Charles River Laboratory，Wil mington，MAから購入した。ラットをDartmouth Medical Schoolの動物研究施設に収容し、そして実験動物の取扱いに関するNIH指針に従って世話をした。ペプチド合成まず、製造者の指示に従ってRaMPS Multiple Peptide Synthesis System(NEN-DuPont，Wilmington，DE)を用いて、すべてのペプチドをラットPLP のアミノ酸配列(Laursen，R.A.ら(1984)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:2912；およびMilner R.J.ら(1985)Cell 42:931に開示)に基づく１次構造を有するように合成した。伸長中のペプチド上の末端アミノ酸の保護基としてF-mocを用いてR apidAmide樹脂（p-メチルベンズヒドリルアミン樹脂）上でペプチドを合成した。Ｎ末端アセチル化という点のみが異なる同一ペプチドを生成するために、ペプチド樹脂を２つの部分に分割し、次いてペプチドにＮ末端アミノ酸を付加した。ペプチド樹脂化合物の半分はＮ末端がアセチル化されたが、残りの半分はアセチル化されなかった。アセチル化は、製造者の指示（NEN-Dupont）に伴って無水酢酸およびジイソプロピルエチルアミン法によって行った。完成したペプチドをトリフルオロ酢酸およびフェノールを用いて処理することにより、樹脂から切り離した。ジエチルエーテル抽出および水中のペプチド溶解後、ペプチドを凍結乾燥し、そして使用時まで-80℃で保存した。特別な指示がない限り、すべてのペプチドのＣ末端アミノ酸をアミド化した。また、Ｃ末端アミノ酸のアミド化（ RapidAmide樹脂上での標準的なペプチド合成の副産物）が免疫原性に影響を与えるか否かを決定するために、ペプチドのＣ末端におけるカルボキシルアミド部位ではなくカルボキシルになるWang樹脂(Dupont NEN)上でペプチドPLP224を合成した。また、Peptide Synthesizer 432A（Applied Biosystems，Foster City，CA ）を用いてＮアセチル化ペプチドPLP224を合成して、別のペプチド合成メカニズムを介して結果を確証した。精製ペプチドのアセチル化状態および合成の特異性を、質量分光分析によって確認した。具体的には、Ｎ末端アミノ酸がアセチル化されたことをが確認された。免疫化およびリンパ節細胞の調製 PLPペプチドをPBS中で濃度0.5mg/mlで溶解し、等容量の、10mg/mlのMycobacterium tuberculosis H37RA(DIFCO，Detroit，MI )を補充した完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化した。能動的に誘発された EAEを生成するために、各ラットにつき計0.4mlのエマルジョンを用いて、ラットを脇腹の４箇所の部位で皮下免疫し、これによってラット一匹につき100μgのCM ペプチドの免疫化用量を得た。インビトロでの研究およびEAEの養子免疫移入のためのＴリンパ球細胞系を生成するために、0.1mlの同一PLP-CFAエマルジョンをLewisラットの側部後足の皮膚に皮内注入した（動物１匹につき50μｇの抗原ペプチド）。９日後、排出されている膝窩リンパ節を単離し、リンパ球を解離し、免疫化ペプチドが20μg/ml存在する状態で培養した。Ｔ細胞系の株化を開始するための、および増殖アッセイのための培地（「開始培地」と称する）は、１％ラット血清、５％NCTC-109、５ ×10^-5Ｍ２−メルカプトエタノール、２mMグルタミン、100μg/mlペニシリン、 100μg/mlストレプトマイシンおよび100μg/mlファンギゾンを補充したRPMI-164 0からなっていた。培養３日後、Histopaque 1.077（Sigma，St．Louis，MO）を比重1.066に希釈して、密度勾配によりＴリンパ芽球を分離した。密度相界面に停留していたＴリンパ芽球を採集し、PBSで洗浄し、ラット血清の代わりに10％ウシ胎児血清（HyClone Labs，Logan Utah）を用い、かつ5.0μg/ml Con A存在下、48時間培養したラット脾細胞のIL-2強化上清を５％培地に補充したことを除いて、開始培地と同一の培地で培養した。10日後、抗原特異性アッセイのために細胞を用いるか、あるいはさらなるインビトロ継代およびそれに続く養子免疫移入研究のために、特異的抗原で細胞を再刺激した。照射された同系の抗原提示細胞の存在下、抗原で周期的に刺激することによって、Ｔリンパ球系のすべてが長期間増殖し、Con A刺激脾細胞からのサイトカイン強化上清を５％補充した培地で拡大した。抗原特異性アッセイＴリンパ球系細胞を96ウエルＵ字型底面マイクロタイタープレート中で三点平行で１ウエルあたり0.2mlの「開始培地」で５×10⁴個の細胞を培養した。Lewisラットからの2.5×10⁵照射（2000ラド）の混合リンパ節および胸腺細胞を、抗原提示細胞（APC）として各ウエルに添加した。適切なペプチド抗原を種々の濃度で培養ウエルに添加した。48時間目に、各ウエルに50μl容量の0.5μCi[³H]チミジンを添加した。さらに16時間培養後、1295-001 Cell Har vester(LKB-Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)を用いて細胞を集めた。細胞増殖の指標として液体シンチレーションカウンターによってカウント／分を決定した。さらに、選択された増殖アッセイの間、96ウエルプレートの各ウエルからの10 0μlの上澄みを24時間および48時間の時点で採取し、IL-2バイオアッセイに用いた。このようなアッセイにおいて、上清を採取した後、容量を一定に保つために、等容量の新鮮な開始培地を各ウエルに添加した。Abs OX-6、抗MHCクラスII I- AおよびOX-17、抗MHCクラスII I-Eを、増殖阻害アッセイにおいて用いた。EAE 誘発および等級づけ上記のようにラットを抗原−アジュバントエマルジョンで免疫化することによって、能動的に誘発されたEAEを生成した。補助細胞存在下で3.0μg/mlのCon Aあるいは20μg/mlのPLPペプチドで３日間インビトロで刺激されたPLPペプチド特異的Ｔリンパ芽球の皮内注入によって、養子EAEを誘発した。養子免疫移入実験において、特定の実験プロトコルに基づいてラットは５ ×10⁶個と30×10⁶個との間のＴ細胞を受容した。すべてのラットについて、臨床的EAEを以下のようにスコアを毎日つけた。０、疾患なし；１、尾の衰弱あるいは尾の弛緩；２、後脚麻痺；３、麻痺に加え、動物は刺激に応答しないことによって活動停止状態を示した（Hickey，W.F.ら(1987)Cell．Immunol．109:272；Hi ckey，W.Fら(1983)J.Immunol．131:2805）。組織学的研究ペプチド脳炎誘発性の研究に用いたすべてのラットについて、免疫後15日目に殺して脊髄を除去し、10％ホルマリン中に固定した。パラフィン包埋組織を切り取り、組織学的検討のためにヘマトキシリン−エオシンで染色した。脊髄断片中の炎症の重篤度を以下のように等級づけした：０、炎症無し；１、散在する炎症の小さい病巣がまれにみられる；２、細胞浸潤の多数の独立した病巣がみられる；３、炎症の多数の融合する病巣がみられる；および４、壊死および／または好球中性浸潤の病巣がみられる。免疫組織化学腰椎膨大を含む脊髄の下部を除去し、O.C.T 化合物(Miles Inc., Elkhart，IN)中で予め固定せずに急速凍結した。６μm厚クリオスタット断片を切り取り、ガラススライド上に置き、Hickley，W.F.ら(1983)J.Immunol．131:28 05に記載のプロトコルに従って、免疫組織化学染色した。簡潔に述べると、−20 ℃で無水メタノールに30秒間曝し、0.5Mトリス緩衝液（pH7.6）中で大量のすすぎを行った後、適切な一次抗体で４℃で一晩インキューベートした。さらに緩衝液で洗浄した後、ビオチン化二次抗マウスIgG抗体で40分間スライドをインキュベートし、緩衝液中で洗浄し、次いで、アビジンビオチン化セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体（Vector laboratories，Burlingame，CA）で２時間インキュベートした。0.03％H₂O₂の存在下、スライドを3,3'−ジアミノベンジジンでインキュベートすることによって、発色反応を行った。脱水し、カバースリップをかぶせて、スライドを組織学的に評価した。本実験において用いた抗体はすべて、免疫学的に重要なラット分子について特異的なマウスモノクローナル抗体であった。これらの試薬はHarlan-Bioproducts for Science、Indianapolis，INから購入した。抗体およびその特異性は、OX-6、抗RT1.B（ラットMHCクラスII、I-A ）（McMaster、W.R.およびWilliams，A.F.(1979)Eur.J.Immunol.９:426）；OX-8 、抗ラットCD8(Mason，D.W.ら(1983)Immunol．Rev．74:57)；W3／25、抗ラットC D4（Mason，D.W.ら(1983)Immunol．Rev．74:57；およびJefferies,W.A.ら（1985 ）J．Exp．Med．162:117）；およびOX-42、抗ラットCD11b/c（Robinson、A.Pら( 1990)Immunology 57:239）である。IL-2 バイオアッセイ成長にIL-2を要求するマウスリンパ腫系であるHT-2細胞（W atson，J．(1979)J．Exp．Med．150:1510）を、96ウエルプレートに0.2ml培地中に５×10³細胞／ウエルでプレーティングした。増殖アッセイプレートから採取した50マイクロリットルの上清を、IL-2アッセイプレートウエルに添加した。標準IL-2をまた、陽性コントロールとして添加した。24時間のインキュベーション後、プレートをウエルにつき0.5μCI[3H]チミジンでパルスした。16時間後、細胞を集め、放射性チミジン取り込みを、IL-2生成の相対的な指標として測定した。微細構造微細構造検討のために、抗PLPペプチドＴ細胞の養子免疫移入によって誘発された麻痺EAEを有するラットを高度に麻酔し、カルシウムおよびマグネシウム不含改変PBSで大動脈を介して潅流した。この後に、0.1Ｍリン酸緩衝液、 pH.7.4中の200mlの４％ｐ−ホルムアルデヒドを用いた。CNS組織を除去し、さらに１％グルタルアルデヒドおよびカコジル酸緩衝液中の３％ｐ−ホルムアルデヒド中でさらに固定した。次いで、四酸化オスミウム中で後固定し、脱水し、エポンに包埋した。１ミクロンの断片を組織の各ブロックから切り取り、トルイジンブルーで染色して組織学的検査を行った。これらの断片から、微細構造検討に適切な領域を選択した。結果研究のためのこれらのペプチドの選択は、MHCクラスII分子結合モチーフの存在に基づいている。これは５つのアミノ酸残基によってグルタミン酸残基から分離されているセリン残基（S-x-x-x-x-x-E）（配列番号１）を含む。ラットPLP配列を走査することによって、残基225と残基231との間の、そのような推定モチーフを含む１つの領域のみが明らかになった。Laursenのモデルによると、この領域はC3ドメインと称される疎水性残基の小さい細胞外ループにある(Laursen，R. A.ら(1984)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:2912)。Ｔ細胞エピトープのアセチル化はインビトロでＴ細胞増殖性応答を増大させ得るというRothbardの観察（Ro thbard，J.B.ら(1989)Philos．Trans．R Soc．Lond-Biol．Sci．323:553）によって刺激されるように、PLPペプチド中のＮ末端アセチル基が含まれた。さらに、ペプチドPLP224もWang樹脂上で合成され、遊離Ｃ末端カルボキシル基を有するアセチル化あるいは非アセチル化ペプチドを生成した。すべてのこれらの合成ペプチドの溶解性は、インビボでの作業およびインビトロでの作業の両方に適し、天然の全PLPタンパク質よりもはるかに良いものであった。アセチル化PLPペプチドと非アセチル化PLPペプチドの溶解性に差はない。より多くのアミノ酸がＣ末端端部に付加されるに従って、ペプチド溶解の容易さが低減する。これは、PLP 配列に基づいて前もって行われる疎水性ドメイン予測によって予測される（Laur sen，R.A.（1984）Proc．Natl．Acad．Sci USA 81:2912；Milner，R.J.ら(1985) Cell 42:931、Hudson，L.D.ら(1989)J.Cell Biol．109:717）。それにもかかわらず、４つすべてのペプチドは、活発なＴ細胞応答を生じさせた。アセチル化ペプチドPLP224は、３つのペプチドのうちで最も起脳炎性であったことは注目に値するが他のペプチドのようには水性媒体に容易に溶解しなかった。合成ペプチドの予測されたm.w.を、質量分光分析法によって確認した。さらに、HPLC分析を用いることによって、すべてのペプチドの純度が90％よりも大きいことが示された。EAE の能動誘発Ｎアセチル化末端あるいは遊離Ｎ末端のいずれかを有する３つのペプチドを、EAE誘発能について試験した。各ペプチドで３〜６匹のLewisラットを免疫化し、その後、免疫後30日まで動物を管理して臨床疾患を発生させた。表IIに示すように、アセチル化ペプチドPLP217で免疫化された１匹のラットのみが、能動免疫化後にEAEの臨床的徴候を生じさせた。しかし、アセチル化ペプチドPLP217およびPLP224で能動的に免疫化されたラットからの脊髄の組織学的検討の結果は、脊髄下部において典型的な炎症を発生させ、炎症は2.2および2.0の平均組織学的重篤度スコアをそれぞれ有していた。また、アセチル化ペプチドPLP2 20で免疫化された４匹の動物のうちの２匹に、軽い組織学的炎症を見いだした。３つのより長いペプチドとは大いに異なり、アセチル化ペプチドPLP224〜233で免疫化された動物で、組織学的炎症は観察されなかった。最も顕著には、非アセチル化ペプチドで免疫化された動物は、CNS炎症のいずれの臨床的徴候も呈さなかった。 EAE の養子誘発アセチル化PLPペプチドおよび非アセチル化PLPペプチドに対するＴリンパ球株を生成し、誘発PLPペプチドAgについてのそれらの特異性をインビトロで確認した（下記および表IIIを参照）。養子免疫移入実験の結果を、表I Iに要約して示す。アセチル化ペプチドPLP217に特異的なＴ細胞の７つのレシピエントのうちの２つは、EAEの臨床的徴候を発症し、平均スコアは1.5であった。これらの動物のうちの６匹は、平均重篤度スコアは2.3で、組織学的炎症を示した。アセチル化PLP224に特異的なＴ細胞の７つのレシピエントのうちの３つは、４日目と６日目との間に麻痺性臨床的EAEを発症し、平均臨床スコアは2.3であり、これらすべての動物は、平均スコア2.2で組織学的炎症を示した。非アセチル化ペプチドPLP217あるいは非アセチル化ペプチドPLP224に特異的なＴ細胞を注入されたラット、およびアセチル化ペプチドPLP220に特異的なＴ細胞の１つのレシピエントのうち、EAEの臨床的徴候あるいは組織学的異常特性を示したものはなかった。非アセチル化ペプチドPLP220に対するＴ細胞を注入されたラットは臨床的疾患を示さなかったが、脊髄で組織学的炎症を発症した。アセチル化ペプチド PLP224〜233に特異的な活性化Ｔ細胞を受容した４匹の動物は、臨床的EAEあるいは組織学的炎症のいずれも発症しなかった。本研究の初期段階では、EAEの臨床的徴候の発生は注入されたＴ細胞の数にある程度依存することを示した。６×10⁶個のＴ細胞は組織学的炎症を誘発し得たが、臨床疾患の発症には少なくとも15×10⁶個の細胞が必要であった。しかし、非アセチル化ペプチドが疾患を誘発し得ないとことはこの現象によって説明され得なかった。なぜなら、すべての場合において、Ｔ細胞株が非脳炎誘発性であると決定される前にラットは最低限で15×10⁶個の細胞を受容したからである。形態学的特徴能動EAEあるいは養子EAEのいずれかを有するラットからの脊髄の顕微鏡による検討は、単核細胞から成る広範囲な髄膜下および脈管周囲の炎症性浸潤を示した。これらの浸潤は、脈管周囲領域を超えて、CNS実質中に延びることがしばしば観察され得た。表IIにおいて示したように、臨床的EAEを有さない数匹のラットにおいて、重篤な炎症が脊髄で見いだされ得た。従って、Lewis ラットにおけるMBP誘発EAEでの所見（Hickey，W.F.ら(1983)J．Immunol．131:2805 ）から区別されるPLP誘発EAEにおいて、臨床的徴候の発生と組織学的炎症の強度との間には、おそらく相違があるように思われる。炎症領域の縁部での軸索の超構造の検討は、２〜３の軸索の脱髄を明らかに示した。しかし、全PLPについて以前に報告されているように（Yamamura，Tら(1986)J．Neurol．Sci．76:269 ）、これらのペプチドAgでは広範囲な脱髄は全く観察されなかった。免疫組織化学的所見免疫組織化学的分析は、炎症性浸潤において最も優勢な細胞タイプは、CD4⁺Ｔ細胞およびマクロファージであったことを示した。散在した CD8⁺Ｔ細胞も、病変において見いだした。MHCクラスII発現は、病変近傍の小神経膠細胞および脈管周囲細胞で増加した。これらの所見は、MBP免疫によってあるいはMBP特異的Ｔ細胞の移入によって誘発されるEAEと同一である（Hickey，W ．F.ら(1987)Cell Immunol．109:272;Hickey，W．F.ら(1983)J．Immunol．131:2 805）。Ag 特異性およびI1-2バイオアッセイ養子EAE実験において用いられるＴ細胞株の特異性およびＴ細胞応答に対するPLPペプチドのＮアセチル化の重要性を、インビトロにおいてさらに確認した。表IIIに示すように、アセチル化ペプチドPLP 224特異的Ｔ細胞は、それらが誘発されたAgのみならず、アセチル化形態および非アセチル化形態の両方のその他の２つのオーバーラップするペプチドPLP217およびPLP220にも強い応答を示す。しかし、これらの抗PLPペプチドＴ細胞株は、精製モルモットMBPあるいはモルモットMBPの配列由来のLewisラットについての合成脳炎誘発ペプチドのいずれにも応答しなかった（Mannie，M.D.ら(1985)Proc ．Natl．Acad Sci．USA 82:5519）。さらに、抗MHCクラスII、I-A（RT-1B）Ab O X-6がAg誘発Ｔ細胞増殖を阻害するのに対して、抗MHCクラスII、I-E（RT-1D）Ab OX-17はAg誘発Ｔ細胞増殖を阻害しないことが決定され、これらのPLPペプチドのＴ細胞認識はLewisラットRT-1B¹によって制限されることを示した（表III）。フローサイトメトリー分析による表現型は、これらのＴ細胞の95％がCD4陽性であることを示した。すべての例において、Ｔ細胞株が非アセチル化ペプチドよりもアセチル化ペプチドに対してより強く応答したことを示した（図１参照）。１〜20μg/mlのペプチド濃度範囲にわたって、Ｎアセチル化ペプチドに対して、非アセチル化ペプチドよりも３〜７倍大きいＴ細胞応答があった。さらに、IL-2産生アッセイは、非アセチル化ペプチドよりも強いＴ細胞応答を誘発するアセチル化ペプチドの増強された能力と一致した（図２参照）。アセチル化および非アセチル化の両方ペプチドPLP224のＣ末端アミド化の、Agに対するＴ細胞応答への影響も検討した（表 III）。Ｔ細胞株が、Ｃ末端アミド基あるいはカルボキシル基を有するアセチル化ペプチドPLP224に比較できるほど応答したことをデータは示し、このシステム中でＴ細胞応答の増強においてアミド部分がＮ末端アセチル化ほどは重要ではないことを示した。Ｎ末端アセチル化の重要性は、非アセチル化ペプチドPLPで誘発されたＴ細胞株がそれらが以前に曝されていないペプチドのアセチル化型で刺激されたときに得られた結果によって、強調される（表IV）。すべての例において、Ｔ細胞がPLPペプチドの非アセチル化形態によって誘発され、そして以前はそれのみで刺激されたときてさえも、等量の非アセチル化ペプチドについてよりもアセチル化ペプチドについての方が、Ｔ細胞のAg誘発増殖およびそれらのIL-2産生は大きかった。さらに、所定のAg濃度で非アセチル化形態よりも大きい増殖を誘発する、アセチル化ペプチドのこの増強された能力は、Ｔ細胞株を誘発するために用いられるペプチド種のみならず、特定のペプチドと一部がオーバーラップするその他のペプチドにも当てはまった。従って、臨床的および組織学的所見と組み合わせられたとき、上記の情報は、ここで用いられる PLPペプチドのＮ末端アセチル化が、PLP誘発EAEの病原、これらのペプチドに対するＴ細胞増殖応答、および比-2産生において重要な役割を果たし得るという強力な証拠を提供する。実施例２ヒトおよび動物に生じる自己免疫疾患であるＩ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病とも呼ぶ）は、膵臓のインスリン分泌島β細胞を破壊するという特徴を有する。ヒトにおける疫学的研究により、ヒトMHCのHLA-DR3、HLA-DR4およびHLA-DQ3 .2クラスII対立遺伝子に関連する強力な遺伝学的な素因が報告されている（例えば、Wolf，E.ら、(1983)Diabetologia 24:224-230；Platz，P.ら、(1981)Diabet ologia 21:108-115；Warram，J.ら、(1994)Joslin's Diabetes Mellitus、R．Ka hnおよびG．Weir（編）、Philadelphia，PA、Lea & Febiger、201-215頁；およびTait，B.D.ら、(1991)Bailliere's Clin．Endocrinol．& Metab．5:211-228を参照）。これは、これらの特異的なMHCクラスII分子においては、病原性膵臓自己抗原とＴリンパ球への抗原提示との間に重要な関連があることを示唆している。本実施例では、ラットMHCクラスII（RT1.B¹）結合モチーフを用いて、２つの島β細胞の構成要素、すなわち、酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)およびインスリン前駆体ホルモンであるプロインスリン(PI)中の潜在的自己反応性 CD4⁺Ｔ細胞エピトープを予測した。結合モチーフを含有するGADおよびPIの17アミノ酸長のペプチドフラグメントを合成し、これを用いて、ペプチド特異的でMH CクラスIIに限定されたCD4⁺Ｔ細胞株を生成した。樹立後、ラットの島GADおよび PIに特異的なＴ細胞株を、未処理ラットに養子免疫伝達した。伝達から10日後、プロインスリン特異的Ｔ細胞を受けたラットではインスリン炎が発症したが、GA D特異的Ｔ細胞を受けたラットの膵臓ではインスリン炎は観察されなかった。この病原性PIペプチド特異的Ｔ細胞はCD4⁺/CD8^-であり、抗原に応答してTH₁様のサイトカインを分泌する。ここで述べた結果は、MHCクラスII結合モチーフが、ラットのプロインスリンの病原性Ｔ細胞エピトープを予測するために用い得ることを示している。本実施例はさらに、プロインスリンのペプチドフラグメントに特異的なＴ細胞によって、自己免疫インスリン炎の新しい抗原特異的モデルを提供する。本実施例では以下の方法を用いた。材料および方法動物。本研究では、MHCタイプRT1.A^uB¹D¹E/C^aを有するDA(RP)ラットを用いた。このラット系統は自発的インスリン炎も糖尿病も発病しない。DA(RP)系のラットを、元々はHeinz Kunz博士（Department of Pathology，University of Pittsbu rgh，Pittsburgh，PA）から入手し、繁殖コロニーをAnimal Research Facility of the Dartmouth Medical School，Lebanon，NHで維持した。実験には、50〜70 日齢の雄雌両方のDA(RP)ラットを用いた。すべての手順および動物の世話は、実験動物保護についてのNational Institutes of Healthのガイドラインに従って行った。MHC クラスII結合モチーフペプチド合成。結合モチーフを含有するPIおよびGADペプチドの配列を、RapidAmide Multiple Peptide Synthesis(RaMPS)システム(NEN -Dupont，Wilmington，DE)を用いて、標準的なF-moc化学作用によって合成した。MHCクラスII拘束Ｔ細胞が、代表的には、13〜25個の間のアミノ酸長のペプチドを識別すると仮定して（Zamvil，S.ら、(1986)Nature 324:258-260；Wraith， D.C.ら、(1989)Cell 59:247-255）、GADおよびPIペプチドを、モチーフの各端部で４〜６個のアミノ酸だけ伸長し、17個のアミノ酸長のペプチド（GAD₄₁₂、GAD₅ ₂₀ 、およびPIと呼ぶ）を生成するように合成した。さらに、ペプチドのＮ末端をアセチル化して、αらせん形成およびMHC相互作用を促進した（Mains，R.ら、(1 983)Trends Neurosci．6:229-235）。ペプチド特異的Ｔ細胞株の生成および養子免疫伝達。 GAD₄₁₂、GAD₅₂₀、および PIペプチドに対して個別のＴ細胞株を生成した。Ｔ細胞株を開始させるために、ペプチドを、５mg/mlのH37RA(DIFCO，Detroit，MI)を補充した完全フロイントアジュバント(CFA)中で乳化し、200μgのペプチドの最終濃度でDA(RP)ラットの後足の肉跳に皮内注射した。９日後、ラットをフルオタン麻酔(Ayerst Laboratories ，New York，NY)して屠殺し、膝窩リンパ節を得た。リンパ節をピンセットにより単一細胞懸濁液に機械的に溶解し、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で２回洗浄し、そして50μg/mlのペプチドを含む開始培地中に再懸濁した。開始／増殖培地は、RPMI 1640、1%の自己ラット血清、5%のNCTC-109(Bio Whittaker Products， Walkersville，MD)、2 mMのグルタミン、100 U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、100μg/mlのファンギゾン(ICN Biomedicals，Costa Mesa，C A)、および5×10^-5Mの2-メルカプトエタノール(Sigma，St．Louis，MO)よりなっていた。３日後、Ｔリンパ芽球を、Histopaque-1.077(Sigma)を用いて密度遠心分離によって回収し、PBSで２回洗浄し、そして10%のウシ胎児血清とコンカナバリンＡ刺激脾臓細胞からの5%のIL-2リッチ上清とを含有する培地中に再懸濁した。ペプチドによる最初のインビトロにおける刺激から７〜10日間、ペプチド特異的Ｔ細胞株を休止状態に置き、次に、照射（2000ラド）胸腺細胞および20μg/ml のペプチドにより再刺激した。養子免疫伝達を研究するために、抗GADおよび抗PIのＴ細胞を、未処置のレシピエントへの静脈内(i.v.)注射の前に72時間、ペプチド(20μg/ml)またはマイトジェン性レクチンコンカナバリンＡ(5μg/ml)により刺激した。ペプチド特異的Ｔ細胞（25〜120×10⁶の濃度範囲）の静脈内伝達の10日後、ラットをエーテル麻酔して屠殺し、膵臓を得た。組織を10%のホルマリンに固定し、パラフィンに包埋し、切開し（６ミクロン）、台に固定し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ペプチド特異的Ｔ細胞株の抗原特異性およびMHC拘束。ペプチド特異的Ｔ細胞を回収して、ペプチド(5〜20μg/ml)、抗原提示細胞(APC)としての照射（2000ラド）胸腺細胞（5×10⁵／ウェル）、OX-3、OX-6、またはOX-17（抗RT1.BおよびD ）抗体、もしくはW3/25（抗CD4）、OX-8（抗CD8）抗体と共にまたはこれらを用いないで、３連で（5〜7×10⁴／ウェル）、³H-チミジン（0.5μCi／ウェル）による最後の18時間のパルスを含む72時間の間、共培養した。³H-チミジンの組み込みを液体シンチレーションカウンター(Wallac，Gaithersburg，MD)によって測定し、結果を３連培養について刺激インデックス±1標準偏差(SD)として表した。ペプチド特異的Ｔ細胞のサイトカイン産生プロフィール。プロインスリン特異的Ｔ細胞を試験して、PIペプチドに応答してサイトカインが産生されたかどうかを調べた。インターロイキン２(IL-2)およびインターロイキン４(IL-4)のプロインスリンペプチド特異的レベルを、IL-2依存性HT-2細胞を用いてバイオアッセイで測定し、ラットIFN-γに特異的なELISA(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)により、IFN-γの産生を測定した。つまり、PI特異的Ｔ細胞、PIペプチド、APC＋抗MHC クラスII抗体のインビトロにおける培養物から、IL-2およびIL-4アッセイでは40 時間で、IFN-γでは72時間で、100μlアリコートの上清を回収した。インターロイキン-2含有上清を、１×10³個のHT-2細胞と共に、培養の最後の12時間の3H-チミジンによるパルスを含めて72時間、培養した。インターロイキン-4含有上清を、IL-2レセプター抗体(PC 61.5.3，ATCC，Rockville，MD)により予めインキュベートされた１×10³個のHT-2細胞と共に培養した。48時間後、HT-2細胞を採収して、³H-チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターによって測定した。ペプチド特異的Ｔ細胞株のフローサイトメトリー分析。 PI特異的およびGAD特異的Ｔ細胞を、表面抗原発現の決定の前に72時間、20μg/mlのペプチドまたは５ μg/mlのコンカナバリンＡにより刺激した。１×10⁶個の抗PIＴ細胞の試料各々に、一次抗体（OX-19(CD5)；W3/25(CD4)；OX-8(CD8)；R7.3（αβＴ細胞レセプター）；OX-3、OX-6、OX-17(RT1.BおよびRT1.D)；OX-22(CD45RC);腹水からの12. 5〜20μg/mlのタンパク質;Harlan Bioproducts for Science，Indianapolis，IN ）を、氷上で30分間にわたって染色し、２回洗浄し、次に、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合ヤギ抗マウスF(ab)'₂抗体(Cappel-Orginon Teknika， West Chester，PA)により、氷上で30分間インキュベートし、２回洗浄して、1% のパラホルムアルデヒド／PBSで固定した。コントロールの染色には、染色されていない細胞および二次抗体のみで染色した細胞に加えて、一次抗体の代わりに IgG1イソタイプのコントロール抗体(MOPC 21，Sigma，St．Louis，MO)で染色した細胞からなっていた。細胞をFacScanフローサイトメーター(Becton-Dickinson ，Lincoln Park，NJ)で分析した。RINm5F インスリノーマ細胞。 RINm5Fインスリノーマ細胞（Gadzar，A.ら、(198 0)Proc．Natl．Acad，Sci．USA 77:3519-3523）を、Walter Hsu博士、Iowa Stat e Universityから入手した。RIN細胞を、10%の熱不活性化されたウシ胎児血清(H yclone)、100μg/mlのストレプトマイシン、100 U/mlのペニシリン、および2mM のＬ-グルタミン(Bio Whittaker)を補充したRPMI 1640培地中で培養した。５日間の増殖後、使い尽くされたRIN細胞の上清を回収した。50〜70%コンフルエントのRIN細胞が得られた。上清を遠心分離して、滅菌濾過し、PI特異的Ｔ細胞アッセイで使用するまで−20℃で保存した。RIN細胞の上清を、20% v/vの濃度で、インビトロにおいてPI特異的Ｔ細胞に添加した。結果 MHCクラスII結合モチーフを含有するプロインスリン(PI)およびGADペプチドを合成し、これを用いてＴ細胞株を生成した。表Ｖは、合成PIおよびGADペプチドのアミノ酸配列を示す。図３は、ラットのプレプロインスリンのアミノ酸配列と、MHCクラスII結合モチーフと、インスリンおよびＣペプチドの切断産物との間の近似関係の図を示す。プロインスリン特異的およびGAD特異的Ｔ細胞株を、静脈内注射尾静脈注入によってDA(RP)ラットに養子移入した。ペプチド特異的Ｔ細胞の移入の10日後、膵臓を得て、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いた染色によって、組織病理学の兆候を調べた。未処置の膵臓と比較して、GAD₄₁₂またはGAD₅₂₀特異的Ｔ細胞（範囲＝3.0〜12.0×10⁷細胞／ラット）を受けたラットの膵臓には検出可能なインスリン炎は観察されなかった。これに対して、PIペプチドに特異的な3.0〜7.0×10⁷ 個のＴ細胞／ラットを静脈内注射すると、すべてのDA(RP)ラット(n=18)にインスリン炎が生じた。膵臓切片／ラットあたりにつき島の平均炎症関与率は、PI特異的Ｔ細胞の移入後10日目までに、40+6%（膵臓切片あたり21〜62%の範囲）であった。膵臓切片内では、島の関与の重症度は、関与しない場合から初期の島周辺部の炎症、さらに顕著なインスリン炎までの範囲にわたった。免疫組織化学的分析により、PI誘発のインスリン炎は、主に、ラット内の遅延型の過敏症および自己免疫反応に典型的な湿潤物であるCD4⁺Ｔ細胞およびマクロファージよりなることが分かった。抗原特異性およびMHC拘束を測定するために、GADおよびPI特異的Ｔ細胞株の表現型の特徴および機能的な特徴を調べた。図４は、抗GADおよび抗PIのＴ細胞株ならびにこれらのMHCクラスII拘束パターンに対する、³H-チミジン取り込みアッセイの結果を示す。刺激指数(S.I.)は、コントロールウェル（培地のみ）の平均 cpmで割った実験試料の平均cpmとして定義される。ペプチドを用いて第２のインビトロ刺激を行うとき、各株の細胞に対して、³H-チミジン取り込みアッセイを２〜３回繰り返した。GADおよびPI特異的Ｔ細胞は、これらのそれぞれのペプチドに反応し、そしてクラスII結合モチーフを含有する他のペプチドとは交差反応しなかった。S-E結合モチーフを含有する両方のGADＴ細胞株の増殖は、抗RT1.B 抗体（Ox-3およびOx-6）の添加によって阻止されたが、抗RT1.D(Ox-17)抗体の添加によっては阻止されなかった（図４、パネルＡ：GAD₄₁₂；パネルＢ：GAD₅₂₀）。PI特異的Ｔ細胞の20μg/mlのPIペプチドに対する増殖は、RT1.B（54〜67%）およびRT1.D（22〜25%）分子に対する抗体によって個々に部分的に阻止され得、そしてRT1.BおよびD抗体を一緒に添加することによって有意に阻止することができた（>90%）（図４、パネルＣ）。この抗MHCクラスII抗体の阻止効果は、使用される抗原提示細胞（APC）の供給源（すなわち、DA(RP)またはRT1.B/D¹同種(cong en ic)Lewis株ラット）に関係なく同じパターンに従った。さらに、PI特異的Ｔ細胞は、ラットインスリノーマ細胞株であるRINm5Fからのインスリン／プロインスリン含有上清に反応して増殖し、この増殖は、抗RT1.B抗体の添加によって阻止することができた。GAD特異的およびPI特異的細胞の増殖は共に、CD8ではなくCD4 に対するモノクローナル抗体により阻害された。これは、CD4陽性Ｔ細胞のみがG ADおよびPIペプチドに反応したことを示す。 PI特異的Ｔ細胞が、MHCクラスIIをブロックする抗体と共にまたはこれなしでP Iペプチドに反応してサイトカインを産生するかどうかをインビトロでモニタした。PI特異的Ｔ細胞は、増殖を阻止したMHCクラスIIに対する抗体の存在下でも、PIペプチドに反応して、顕著な量のIL-2およびIL-4の両方を分泌した。さらに、ラットIFN-γ(GIBCO)に特異的なELISAによって測定したとき、PI特異的Ｔ細胞は、PIペプチド単独に反応してIFN-γを分泌した(22.5+0.2 ng/ml)。個々のクラスII抗体（Ox-3およびOx-17）との組み合わせでPIペプチドに反応するIFN-γ産生は、平均23.8+0.3 ng/mlであり、次に、PIペプチドに反応する³H-チミジンの取り込みがOx-3およびOx-17を一緒に添加することによって有意に阻止される培養物では、12.5+0.2 ng/mlに低下した（図４、Ｃ）。Ｔ細胞株の細胞表面抗原発現は、FACScan(Becton-Dickinson)を用いるフローサイトメトリー分析によって定義され、これを図５に示す。PI特異的Ｔ株細胞は、TcRαβに対して陽性であり、CD4⁺/CD8^-表現型が支配的で、無視できる程度の CD45RCの発現(<1%)を示した。GAD₄₁₂およびGAD₅₂₀株に特異的な細胞によって示された細胞表面の表現型は同様であった。少数のCD8⁺細胞のPI特異的Ｔ細胞株の枯渇（磁気ビーズ；DYNAL，Lake Success，NYを用いる）によって、残りのCD4⁺/ CD8^-細胞がPIペプチドに活発に反応する能力が妨げられることも、CD4⁺細胞がインスリン炎を養子移入させる能力が阻止されることもなかった。従って、DA(RP) ラットでは、たとえすべてのペプチドが結果的には活発に抗原特異的CD4⁺Ｔ細胞を増殖させるにせよ、匹敵するGADペプチドに特異的なＴ細胞よりむしろ、PIのペプチド断片に特異的なCD4⁺Ｔ細胞が、インスリン炎の養子移入を仲介することができる。インビボにおけるGADおよびPI特異的Ｔ細胞株の抗原特異性の持続性を評価するために、移入の18日後、GADまたはPI特異的Ｔ細胞のいずれかを注射したラットから脾臓を取り出した。PI特異的細胞を注射したラットからの脾細胞は、³H- チミジンの取り込みによって測定すると、PIペプチドに特異的に反応する能力を示したが、GADに対しては示さなかった（PIペプチドに対する抗PI T細胞株の反応刺激指数(S.I.)=41.9に対して、GADに対する反応刺激指数=1.9）。同様に、GA D特異的Ｔ細胞を注射したラットからの脾細胞は、GADペプチドに対して顕著に増殖する(S.I.=21.6)が、PIペプチドに対しては増殖しない(S.I.=1.3)ことが分かった。さらに、PI特異的Ｔ細胞を受けたラットの島は、+10日より+18日においてより重症のインスリン炎を示した（島の63±10%関与率）。GAD特異的Ｔ細胞を注射したラットからの膵臓は、移入から18日経った後もインスリン炎の症状を示さなかった。特に興味深いのは、プロインスリン内で同定された病原性Ｔ細胞エピトープが、インスリンのＢ鎖とＣペプチドとの間の内因性開裂部位にまたがることである。プロインスリンのインスリンＢ鎖およびＣペプチドへの通常の酵素プロセッシングの下では、（表Ｖに示すような）２つの重複する結合モチーフを含有する正にその領域が開裂され、これにより両方のモチーフが破壊される（図３参照）。プロインスリンの上記の領域は、プロインスリンが異なる方法でプロセッシングされる場合島β細胞またはその近辺にのみに、有意な量でインタクトに存在し得る。これらの結果により、病原性Ｔ細胞エピトープが、その後、通常の酵素プロセッシング中に分解される分子の部分に位置し得ることが分かる。プロインスリンは、膵臓の島のβ細胞において最高濃度で見い出されるため、個々の分解産生物（すなわち、インスリンおよびＣペプチド）ではなくこの分子が、タイプＩ糖尿病の病因における自己抗原として働き得る。プロインスリンのほぼ99%が、β 細胞細粒から調節された放出経路を介してインスリンになるよう定められているが、残りのプロインスリンは、構成的放出経路に沿って分泌小胞内で移動する（ Sizonenko，Sら、(1991)Biochem．J．278:621-625；Sizonenko，Sら、(1993)Dia betes 42:933-936；Hutton，J.C.ら、(1989)Diabetologia 32:271-281；Halban ，P．A.ら、(1991)Diabetologia 34;767-778参照）。タイプＩ糖尿病の臨床学的な発症に関連して興味深いのは、最近診断された糖尿病では、循環プロインスリンのレベルが、糖尿病でない場合に比べて２倍以上高いという知見である（Heaton， D.ら、(1988)Diabetologia 31:182-184；Heding，L.ら、(1981)Acta．Med．Scan d．Suppl．656:509）。本実施例では、GADおよびPIペプチドの両方を用いて、ペプチド特異的Ｔ細胞株を連続して生成することが可能であった。これら株の大部分が、インビトロにおけるこれら各ペプチドの認識において、CD4⁺およびMHCクラスII拘束であった。PI特異的およびGAD特異的Ｔ細胞の両方が、移入後少なくとも３週間脾臓内に持続し、そしてそれらの抗原特異性を保持することが分かった。しかし、養子移入の実験では、PI特異的Ｔ細胞のみがインビトロでインスリン炎を仲介し得たことが明らかとなった。GADに対する脾細胞の反応は検出可能なインスリン炎に先だって生じ、このことはNODマウスにおける自己免疫インスリン炎の病因におけるGADの役割を示唆するものであるが（Kaufman，D.L.ら、(1993)Nature 366:69- 72；Tisch，R.ら、(1993)Nature 366:72-75参照）、本研究により、選択されたG ADペプチドに特異的なラットＴ細胞は島障害を生じさせないことが分かった。本研究は、プロインスリン反応性Ｔ細胞がインスリン炎を発症させるに十分であることを示すことにより、GADに加えて、別の潜在的に重大な自己抗原を同定した。BBラットでは、インスリン炎は糖尿病より２〜３週間先だって進行することが示されている（Colle，E．(1990)Clin．Immunol．Immunopathol．57:1-9参照）。タイプＩ糖尿病に罹っているヒトおよびマウスの循環インスリンレベルが、島の>95%が破壊されるまで有意に低下しないと仮定して（Katz，J.D.ら、(1993)Ce ll 74:1089-1100）、現在行っている研究では、島内の炎症性細胞が増えると明白な糖尿病が生じるかどうかを決定するために、PI特異的Ｔ細胞を与えたラットにおいて長期間にわたってインスリン炎および血液グルコースのレベルをモニタしている。実施例３心臓ミオシン(CM)は、現在のところCMの心筋炎発症ペプチドは同定されてはいないが、実験アレルギー性心筋炎(EAM)の誘発における自己抗原であると示唆されている。本実施例では、Lewisラットを免疫化するために用いるとEAMの発症を誘発するCM重鎖のペプチドを同定した。このペプチドは、CMαおよびβ重鎖のアミノ酸配列を走査して、次の２つの基準を満たすペプチドを探すことによって選択された。第１の基準は、選択されるペプチドは、MHCクラスII分子RT1.B¹のクラスII結合モチーフを含有しなければならないということであった。この結合モチーフは、５つの介在アミノ酸によって分離されたセリンとグルタミン酸残基(S -x-x-x-x-x-E)よりなる（配列番号１）。この第１の要件を満たす９つのペプチドが見い出された。第２の基準は、これらのCMペプチドのアミノ酸配列は、CMに独特であるべきであり、骨格筋肉ミオシンと共有するものであってはならないということである。この第２の要件は、骨格ミオシンは心筋炎を誘発しないとう観察に基づく。３個のS-E含有ペプチドがこの第２の基準を満たし、アミノ酸1309- 1315、アミノ酸1544-1550、およびアミノ酸1845-1851に対応する。ラットCMα重鎖のアミノ酸1304-1320(CM#1)、アミノ酸1539-1555(CM#2)、およびアミノ酸1840 -1856(CM#3)に対応する合成ペプチドを調製した。自己抗原から誘導されるペプチドに対する免疫反応は、場合によっては、Ｎ末端アミノ酸のアセチル化によって増大し得ることがすでに観察されているため（例えば、Rothbard，J.B.ら、(1 989)Phil．Trans．R．Soc．Lond．323:553参照）、CMペプチドを、アセチル化されていない形態およびＮ末端をアセチル化した形態の両方で合成した。直接免疫によって、または免疫化された動物からのＴ細胞の養子移入によって、CM#1、CM #2、またはCM#3（アセチル化またはアセチル化されていないいずれか）のEAMを誘発する能力を調べた。その結果、完全フロインドのアジュバントにより乳化されたアセチル化CM#2により免疫化された動物は活性な心筋炎を発症することが分かった。さらに、アセチル化CM#2またはアセチル化されていないCM#2のいずれかに特異的なＴ細胞株は、EAMを正常なLewisラットレシピエントに養子移入することができた。その上、アセチル化CM#1に特異的なリンパ節細胞は、EAMの正常なレシピエントへの移入を仲介することができた。従って、MHCクラスII結合モチーフを、心臓ミオシンの自己反応性ペプチドの同定のための基礎として用いることができる。本実施例では以下の方法を用いた。材料と方法実験動物６〜８週齢の雌LewisラットをCharles River Laboratory(Wilmington ,MA)から購入した。DA(RP)ラットの系統をDartmouth Medical Schoolの動物研究施設で飼育しそして維持した。Lewis(RT1¹)およびDA(RP)ラットの系統は、RT1.B およびRT1.D遺伝子座においては同遺伝子型であり、そして他のMHC遺伝子座（それぞれRT1¹およびRT1^u）においては異なっている。全てのラットをDartmouth Me dical Schoolの動物研究施設で飼育し、そして実験室動物保護に関するNIHガイドラインに従って世話した。ペプチド合成ラットCMα重鎖のアミノ酸1304〜1320(CM#1)、a.a.1539〜1555(C M#2)、およびa.a.1840〜1856(CM#3)に対応する合成ペプチドを調製した。全てのペプチドを、製造業者の使用説明書に従い、RaMPS Multiple Peptide Synthesis System(NEN-DuPont,Wilmington,DE)を用い、ラットCM重鎖のα鎖のアミノ酸配列(McNally,E.M.ら、(1989)J．Mol．Biol.210:665により開示された)に基づいた一次構造を有して合成した。ペプチドを、延長するペプチド上の末端アミノ酸の保護基としてFmocを用いてRapid Amide樹脂（ｐ-メチルベンズヒドリルアミン樹脂）上で合成した。Ｎ末端アセチル化のみが変化している同一ペプチドの生成においては、このペプチド樹脂を、ペプチドへのＮ末端アミノ酸の付加後に二つの部分に分割し、そしてペプチド-樹脂化合物の一方の半分をＮ末端アセチル化し、一方もう半分をＮ末端アセチル化しなかった。全てのペプチドのカルボキシ末端アミノ酸はアミド化された（これは標準RaMPSペプチド合成の副産物である）。完成したペプチドをトリフルオロ酢酸およびフェノールでの処理によって樹脂から切断(cleave)した。標準的なジエチルエーテル抽出および水へのペプチド溶解の後、このペプチドを凍結乾燥し、そして-80℃で保存した。合成後、全ペプチドがHPLC上で一つの主要ピークを含むことが示された。免疫およびリンパ節細胞調製 CMペプチドを２mg/mlの濃度でPBSに溶解し、５mg /mlのMycobacterium tuberculosis H37RA(DIFCO,Detroit,MI)を補充した等容量の完全フロイントアジュバントとともに乳化した。能動的に誘導されたEAMを生成するために、ラットは各ラット当たり合計0.4 mlの乳化物で側腹部上の４ヶ所の皮下部位に一回の免疫を受容した。従って、一匹のラット当たり、400μｇのC Mペプチドの免疫用量となる。インビトロ研究およびEAMの養子移入用のＴリンパ球株を生産するため、0.1ml の同じCM-CFA乳化物をLewisラットの側下肢の皮膚に皮内注射した（一匹の動物当たり200μｇの抗原性ペプチド）。９日後、除液する(draining)膝下のリンパ節を単離し、リンパ球を解離し、そして20μg/mlの免疫ペプチドの存在下で培養した。Ｔ細胞株を開始するため、および増殖アッセイのために用いた培地（「開始培地」と命名）は、１％ラット血清、５％NCTC-109、5×10^-5M 2-メルカプトエタノール、２mMグルタミン、100μg/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび100μg/mlファンギゾンを補充したRPMI-1640からなった。培養３日後、この細胞をHistopaque 1.077(Sigma,St．Louis,MO)を用いて、特異的な密度により分離した。密度相界面において懸濁されたＴリンパ芽球を採集し、PBSで洗浄し、そしてラット血清を10％ウシ胎児血清(HyClone Labs.，Logan Utah)で置換した以外は、開始培地と同一の培地中で培養した。この培地に5.0μg/mlのCon Aの存在下で48時間培養したラット脾細胞の上清を5％補充した。10日後、この細胞を抗原特異性アッセイに使用するか、またはさらなるインビトロ継代および次の養子移入研究のためにそれらの特異的抗原でそれらを再刺激した。全てのＴリンパ球株を、照射した同遺伝子型抗原提示細胞の存在下で抗原での周期的な再刺激によって長期間増殖させ、そしてConA刺激脾細胞由来のサイトカイン増強上清を5％補充した培地中で拡大した。EAM 誘導能動的に誘導されたEAMを、上記のように、抗原-アジュバント乳化物の側腹部注射を用いるラットの一回の免疫によって生成した。EAMの養子移入は補助細胞の存在下で20μg/mlのCMペプチドまたは5.0μg/mlのConAと共に３日間インビトロで刺激したCMペプチド特異的なＴリンパ芽球の静脈内注射によって開始した。養子移入のために、特定の実験プロトコールに基づいて、ラットは500 万から4500万の間のＴ細胞を受容した。養子移入の後（他に述べない限り）レシピエント動物を細胞移入後11日目に心筋炎の組織学的兆候の存在について調べた。抗原特異性アッセイＴリンパ球株細胞を、96ウエルマイクロタイタープレート中で、１ウエル当たり5×10⁴個の細胞で0.2mlの「開始培地」中３連で培養した。Lewisラット由来の2.5×10⁵個の照射(2000ラド)混合リンパ節および胸腺細胞を抗原提示細胞として各ウエルに添加した。適切なペプチド抗原を様々な濃度で培養ウエルに添加した。48時間の時点で各ウエルは50μlの容量にて0.5μCi[³H]チミジンを受けた。細胞をさらに16時間培養後、1295-001 Cell Harvester(LKB-Wa llac Inc.，Gaithersburg，MD)を用いて回収した。一分当たりのカウントを細胞増殖の指標として液体シンチレーションカウンターで測定した。組織学的研究ペプチド心臓炎症能の研究に用いた全てのラットについて、死後に心臓を取り出し、そして10％ホルマリン中で固定した。パラフィンで包埋した組織を切断し、そして組織学的検討のためにヘマトキシリン−エオシンで染色した。２心室心臓切断面における炎症の重症度を以下のように階級分けした：０、炎症なし；１、炎症のまばらな小さい病巣；２、細胞浸潤の多数の分離した病巣；３、炎症集密を有する多数の病巣；ならびに４、壊死および/あるいは好中球浸潤の病巣。巨細胞形成もまた、存在する場合は記したが、組織学的な階級分けの系には影響を及ぼさなかった。免疫組織化学心臓を事前の固定なしに取り出しそして３つの横断面に切断し、中間の切片をO.C.T.Compound(Miles Inc.，Elkhart，IN)中で急速凍結した。６ μｍの厚さのクリオスタット切片を切断し、Hickey,W.F.ら((1983)J.Immunol.13 1 :2805)によって記載されたプロトコルに従い、免疫組織化学的染色を行うためにスライドガラスにマウントした。要約すると、-20℃の無水メタノールへの30 秒間の曝露および0.5M Tris緩衝液(pH7.6)での充分なリンス後、この切片を４℃ で一晩、適切な一次抗体とともにインキュベートした。さらに緩衝液で洗浄後、スライドをビオチン化抗マウスIgG二次抗体とともに40分間インキュベートし、緩衝液で洗浄し、そして次いでアビジン-ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(Vector laborarories，Burlingame，CA)と共に２時間インキュベートした。染色反応を、0.03％H₂O₂存在下でスライドを3,3'-ジアミノベンジジンとともにインキュベートすることにより展開した。脱水しそしてカバーガラスをのせた後、このスライドを組織学的に評価した。この実験で用いた抗体は全て免疫学的に重要なラット分子に対して特異的なマウスモノクローナル抗体であった。これらの試薬はHarlan-Bioproducts for Science(Indianapolis,IN)から購入した。抗体およびそれらの特性は以下の通りであった：OX-6、抗RT1.B(ラットMHCクラスII,I-A)(McMaster,W.R.およびWilliams,A.F.(1979)Eur.J.Immunol.9:426)； OX-8、抗ラットCD8(Mason,D.W.ら(1983)Immunol.Rev.74:57)；Ｗ3/25、抗ラット CD4(Mason,D.W.ら(1983)Immunol.Rev.74:57;およびJefferies,W.A.ら(1985)J.Ex p.Med.162:117)；OX-19、抗ラットCD5(Mason,D.W.ら(1983)Immunol.Rev.74:57) ；およびR7.3、抗ラットα-βＴ細胞レセプター(Hunig,T.ら(1989)J.Exp.Med.16 9:73)。ペプチド刺激細胞株の表面表現型以下の手順をペプチド刺激細胞株の表現型を決定するための間接的染色法として用いた。用いた全ての一次抗体は様々なラット表面マーカーに対するマウスモノクローナル抗体(IgG1イソタイプ)であった： OX-19(pan-T)、Ｗ3/25(CD4)、OX-8(CD8)、OX-3(MHCクラスII RT1.B¹)、OX-17(MH CクラスIIRT1.D)、およびOX-22(CD45RO白血球共通抗原)。破片を除くため、ペプチド刺激Ac-CM#2特異的Ｔリンパ球をフィコール勾配上に置き、次いでDPBSで２回洗浄し、そして1％自己ラット血清を含むRPMIまたはDPBSに再懸濁した。0.5〜 1.0×10⁶のアリコートを12×75mmのポリプロピレンチューブに入れ、そして細胞を遠心分離によってペレット化し、そして100μlの各一次抗体に再懸濁した。チューブを氷上に30分間放置し、その後DPBS/1%ラット血清で２回洗浄した。２回目の洗浄後、ペレットを100μlのFITC標識二次抗体(DPBS/1%ラット血清中で1:20 希釈した)に再懸濁し、ボルテックスし、氷上に30分間放置した。次いで細胞をD PBS/1%ラット血清で２回洗浄し、次いで細胞を固定するために1mlのDPBS/1%パラホルムアルデヒド溶液中に再懸濁した。結果潜在的に心筋炎性であり得るCM重鎖由来のペプチドの同定ラットCMαおよびβ 重鎖のアミノ酸配列を、５アミノ酸により隔てられたセリンおよびグルタミン酸残基を含むペプチドを同定するため精査した(ラットCMαおよびβ重鎖のアミノ酸配列は、McNally,E.M.ら(1989)J.Mol.Biol.210:665に開示されている)。このセリン、グルタミン酸(S-x-x-x-x-x-E)(配列番号１)モチーフはラットクラスII( RT1.B1)分子へのペプチドの結合に重要であると考えられる１つのパターンである。心筋ミオシンのαおよびβ重鎖の両方はこのクラスII結合モチーフを有する８個のペプチドを含むことが見いだされた。これらはCMα重鎖のa.a.14〜30、a. a.168〜184、a.a.318〜334、a.a.839〜855、a.a.863〜879、a.a.1196〜1212、a. a.1539〜1555およびa.a.1840〜1856に相当する。９番目のペプチドはα鎖にのみ見いだされた(a.a.1309〜1316)。 CM重鎖のアミノ酸配列は、骨格ミオシンと比較すると、高度に保存されている (Strehler,E.E.ら(1986)J.Mol.Biol.190:291-317を参照のこと)。しかし、CMは骨格筋の炎症(筋炎)を誘導しないことが実験的に示されている(Neu,N.ら(1987)J .Immunol.139:3630)；同様に、骨格ミオシンは心筋の炎症を引き起こさない(Neu ,N.ら(1990)J.Immunol.145:4094;Rosenberg,N.L.ら(1987)Clin.Exp.Immunol.68: 117)。その結果、心筋炎を誘発し得るCM由来のペプチドはCMに独特のものであり、そして骨格ミオシン中には存在しないことが推論された。それゆえ、ラット骨格筋のアミノ酸配列を、CMペプチドと同一であるまたは類似しているペプチドについて精査した。骨格ミオシンと同一であるあるいは類似しているCMペプチドは、更なる研究のために考慮されなかった。CMα鎖に独特のS-Eモチーフを含む３個のペプチドが存在する。これらのペプチドを下の表VIに示す。さらに、３個の独特のペプチドの全てが構造上(in confirmation)高度にαらせんであるCM重鎖( a.a.831〜1940)の棒状の部分に見いだされる。合成CM重鎖ペプチドでの免疫後の実験的アレルギー性心筋炎の誘導 CMペプチドによるEAMの誘導に用いられた免疫レジメは、CMペプチド-CFAの一回の注射からなった。CMペプチド-CFAを注射した動物は心筋炎の臨床的兆候を発生しなかった。CMペプチド-CFA免疫に関連した臨床的兆候の欠如は、組織学的炎症の発生のみが報告された(Smith,S.C.およびAllen,P.M.(1992)Cir．Res．70:856)全CM-CFA免疫で見られることと類似している。表VII中に見られ得るように、アセチル化CM #2を受容している動物は、心筋炎の組織学的兆候を発生した。炎症性の浸潤巣が一回の免疫後約５週間で発生したことが見いだされた。非アセチル化CM#2ペプチドが臨床的また組織学的な心筋炎の兆候のいずれも誘導しなかったということは興味深い。Ac-CM#1およびAc-CM#3は、能動免疫に臨床的または組織学的な心筋炎の兆候を発生しなかった。 CM ペプチドに対して特異的なＴリンパ球の養子移入後の実験的アレルギー性心筋炎の誘導アセチル化CM#2は能動EAMの誘導に有効であった唯一のペプチドであったが、養子移入したEAMを媒介し得るCMの唯一のペプチドではなかった。表III に見られ得るように、それぞれのペプチドでのインビトロ活性化の後、アセチル化および非アセチル化CM#2ペプチドの両方に対するＴリンパ球は養子EAMの移入を媒介した。ConAでの分裂促進刺激はまた、アセチル化CM#2特異的Ｔリンパ球を活性化して、EAMの養子移入を媒介し得たということに注目すべきである。アセチル化CM#1での免疫は能動的に誘導されたEAMの発生へと導かなかったが、アセチル化CM#1ペプチドで免疫した動物から得られたＴリンパ球は、ConAでのインビトロ活性化の後、EAMを移入し得た。それにも拘わらず、アセチル化CM#1および# 3ペプチドに対して生じたＴリンパ球の長期培養は、それらのそれぞれのペプチドに対する確実な増殖応答を欠如していたため可能でなかった。Ac-CM#3は能動的に誘導したEAMも養子移入したEAMも生成しなかった。本発明者らはアセチル化また非アセチル化CM#2ペプチドに特異的なＴリンパ球およびアセチル化CM#1ペプチドに特異的なＴリンパ球のいずれかを有するラットにおいて、疾病の臨床的兆候を誘導し得なかった。4.5×10⁷の、ConA刺激アセチル化CM#2ペプチド特異的Ｔリンパ球の養子移入後、重篤な組織学的心筋炎が移入後８日目までに明らかに発生し、これは他の研究者によって報告されたカイネティクス(Kodoma,M.ら(1992) Circulation 85:1918)と類似しているが、このラットは明らかな疾病は示さない。表ＶIII中に見られ得るように、心筋炎の組織学的重篤度は直接的に養子移入した細胞の数に比例する。能動的に誘導しそして養子移入した実験的心筋炎の形態学的および組織学的特徴 Ac-CM#2に特異的な少なくとも１×10⁷個のＴリンパ球(Ac-CM#2ペプチドまたは ConAで刺激された)を受容している動物は、心膜滲出を呈した；さらに、心筋の肉眼的検査は、両心室の心外膜表面上に分布した多数の地図状の白色斑を示した。5×10⁶未満の細胞を受容している動物は心筋炎の肉眼的兆候を示さなかった。心筋炎の目立って観察可能な証拠は養子移入されたＴリンパ球を受容している動物に限定され、能動的に免疫されたラットにおいては見られなかった。 ConAまたはAc-CM#2ペプチドのいずれかで刺激されたＴリンパ球を受容した動物から得られた心臓の横断面の組織病理学的検査は、頻繁に経壁炎症を呈した。この浸潤物は主にリンパ球、マクロファージ、および分散した巨細胞から成り、局部的に心筋繊維の破壊を伴った。CM ペプチド#2誘導性養子移入実験的アレルギー性心筋炎の免疫組織学的所見心臓組織の凍結横断面を、炎症細胞の亜集団を特徴付けするためにモノクローナル抗体のパネルで染色した。その損傷において見いだされた炎症細胞は主にCD4陽性Ｔ細胞および単球/マクロファージであり、そして、より少ない割合でCD8陽性Ｔ細胞もまた存在した。マクロファージはリンパ球性凝集塊の中およびまわりに広く存在した。MHCクラスIIの発現は広範囲であり、単にクラスII陽性マクロファージによって説明され得るよりも広範囲であるようであった。Ac-CM#2 ペプチドに対して生成したＴリンパ球株のペプチド特異性 Ac-CM#2および無関係なペプチドに対して生成したLewisＴリンパ球株の代表的な増殖応答の結果を表IＸ(パートＡ)に示す。そこに見られ得るように、抗Ac-CM#2Ｔリンパ球株はAc-CM#2ペプチドに対し用量依存的様式で応答する。さらに、この増殖応答はペプチド特異的である。Ac-CM#2特異的Ｔリンパ球株は、無関係なCMペプチド、Ac-CM#3(たとえこのペプチドもまたS-Eモチーフを含んでいても)に対しては増殖しない。Ｔリンパ球の認識におけるアセチル化の影響を調べるため、Ac-CM#2Ｔリンパ球株をアセチル化または非アセチル化CM#2ペプチドのいずれかで刺激した(表IＸパートＢ)。そこに見られ得るように、より低いペプチド濃度ではアセチル化ペプチドに対する増殖応答は非アセチル化ペプチドよりも大きいか、CM#2ペプチドのアセチル化はＴリンパ球の認識には必要とされない。 Ac-CM#2ペプチドがMHCクラスII分子によって提示されるかどうかを決定するために、本発明者らはLewisおよびDA(RP)抗原提示細胞を、Lewis由来Ac-CM#2ペプチド特異的Ｔリンパ球にAc-CM#2ペプチドを提示するために使用した。表IＸ(パートＡ)に示すように、DA(RP)およびLewisAPCの両方が、Lewis由来Ac-CM#2ペプチド特異的Ｔリンパ球にAc-CM#2ペプチドを提示し得る。 DA(RP)胸腺細胞のペプチド特異的Ｔリンパ球にAc-CM#2ペプチドを提示する能力は、Ac-CM#2ペプチドがRT1.B1および/またはRT1.DクラスII分子によって効率的に提示されることを示唆する。DA(RP)胸腺細胞のLewis細胞への抗原提示能はA c-CM#2ペプチドそれ自身がDA(RP)ラットにおけるCMＴ細胞エピトープであり得ることを示唆する。この前提を試験するために、DA(RP)動物をAc-CM#2ペプチド/CF Aで免疫し、Ｔリンパ球株の樹立のためのリンパ節細胞を得た。DA(RP)由来Ac-CM #2特異的Ｔリンパ球株を樹立した。Ac-CM#2ペプチドに対する応答を表Ｘに示す。DA(RP)またはLewis由来抗原提示細胞のいずれかによって提示されたとき、Ac- CM#2DA(RP)由来細胞株はペプチド濃度に用量依存的様式で応答し、そして同様にこのDA(RP)由来細胞株は特異的なペプチドに対し応答する。抗Ac-CM#2細胞株の表現型の特徴付け Ac-CM#2細胞株のペプチド刺激の後、応答細胞をFACS分析によって特徴付けした。表現型的に、細胞の91％がＴリンパ球(O X-19、PanＴ細胞)であることが見いだされた。細胞の大部分(83.9％)がCD4陽性( Ｗ3/25、Ｔヘルパー/マクロファージ)であり、そして8.5％がCD8陽性(OX8、細胞傷害性/サプレッサーＴ細胞)であった。細胞の8％のみがCD45RO(OX-22、白血球共通抗原)陽性であり、これは主にメモリーＴリンパ球から成るＴリンパ球株と一致する。細胞の少数(21.2％)がRT1.BクラスII分子を発現しており、そして全ての細胞はRT1.DクラスII分子(OX-17)の発現について陰性であった。Ac-CM#2 ペプチドはRT1.B¹およびRT1.D¹クラスII分子の両方によって提示される Ac-CM#2特異的Ｔリンパ球株を、OX-3(１ハプロタイプと交差反応する抗RT1.B^u )、OX-6(RT1.B)およびOX-17(RT1.D)モノクローナル抗体の存在下で同遺伝子型抗原提示細胞と共に培養物中に置いた。次いでAc-CM#2ペプチドを様々な濃度で添加した。表ＸIに見られ得るように、RT1.B阻止抗体の添加はAc-CM#2特異的Ｔリンパ球株の増殖を阻害し得た。さらに、RT1.D阻止抗体の添加もまたペプチドに対するAc-CM#2Ｔリンパ球株の増殖を実質的に減じ得た。これらの結果はAc-CM#2 ペプチドがRT1.B¹およびRT1.D¹クラスII分子の両方により効率的に提示され得ることを示唆する。実施例４：医学文献は、ヒトにおける下垂体前葉を標的化するまれな自己免疫疾患(リンパ球性下垂体炎と称する)を記載している(Goudie,R.およびPinkerton,P.(1962)J .Pathol.＆Bacteriol.83:584-585;Pestell,R.ら(1990)Clin.Endocrinol.33:457- 466を参照のこと)。同様の現象がアジュバント中での下垂体前葉組織の接種後に Lewisラットで再現された(Levine,S.(1967)Science 158:1190-1191を参照のこと )。このことは下垂体が潜在的に下垂体炎(hypophysis)の病因となる自己抗原を含有することを示す。今日までに、下垂体炎の原因となる抗原の本質は知られていない。本実施例では、視床下部-下垂体-副腎軸によって分泌されたペプチドホルモンが自己認識についてＴ細胞標的であり得る可能性を検討する。本実施例中で、MHCクラスII結合モチーフ(S-x-x-x-x-x-E)(配列番号１)を、Ｔ細胞エピトープとして作用し得る、神経内分泌ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン(C RH)およびプロ-オピオメラノコルチン(POMC)のペプチドフラグメントの選択および合成のための鋳型として使用した。Ｔ細胞株は17アミノ酸のCRHまたはPOMCペプチドに対して特異的に生成された。本明細書中に記載される結果は、ラットの正常Ｔ細胞レパトアが、視床下部-下垂体軸の自己タンパク質を認識しそして特異的に増殖させ得る要素を含有していること、および、さらに、MHCクラスII結合モチーフを用いてCRHおよびPOMCの自己反応性ペプチドフラグメントを予測し得ることを示す。以下の方法を本実施例において用いた：材料と方法動物無ウイルス抗体の雌Lewis系統(RT1¹)ラットをCharles River Laboratory( Wilmington,MA)から購入した。ラットを群で飼育し(n=2-3/ケージ)、そして随意、餌および水に接近させつつ、12時間の明/暗サイクルで維持した。全ての手順および動物の世話は実験室動物保護に関するNIHガイドラインに従った。POMC/CRH ペプチド合成 POMCの17マーのペプチドを、プロセッシングされていない下垂体前葉由来POMCの一次アミノ酸配列(Drouin,J.およびGoodman,H(1980)Nat ure 288:610-612)に基づいて合成した。推定MHCクラスIIペプチド結合モチーフ( S-Eモチーフ)を含有するPOMCの一部分が、Ｎ末端フラグメントにおいて残基67〜 83の間に見いだされ、そして以下のように合成した：⁶⁷SSAGGSAORRAEEETAG⁸³(配列番号25)。CRHの17マーのペプチドを、41アミノ酸の視床下部ホルモン(ヒト/ラットCRH)の一次アミノ酸配列(Shibahara,S.ら(1983)EMBO J.2:775-779)に従って合成した。S-Eモチーフが残基25〜41の間に見いだされ、そして以下のように合成した：²⁵EQLAQQAHSNRKLMEII-NH₂ ⁴¹(配列番号26)。POMCおよびCRHペプチドの両方を、以前に記載のように(Trotter,Jら(1991)J.Neuroimmunol.33:55-62)、RaMP S(Rapid Amide Multiple Peptide Synthesis)System(NEN-Dupont,Wilmington,DE )を用いて、Ｎ末端アセチル化された形態(POMCac,CRHac)および非アセチル化形態(POMCnon-ac,CRHnon-ac)で合成した。全てのCRHおよびPOMCペプチドはカルボキシ末端アミノ酸上でアミド化された(これは標準的なRaMPS合成の副産物である)。Ｎ末端アセチル化およびカルボキシ末端アミド化の両方は、多くの神経ペプチドの生物学的活性を増大させる自然なインビボにおける現象である(Mains,R .およびEipper,B.(1983)Trends Neurosci．6:229-235を参照のこと)。POMC およびCRHＴ細胞株の生成 POMCおよびCRHペプチドをDulbeccoリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS,Bio Whittaker Products，Walkersville,MD)に2mg/mlの濃度で懸濁し、そして5mg/mlのH37RA(DIFCO,Detroit,MI)を補充した等容量の完全フロイントアジュバンント(CFA)で乳化した。各ペプチドについて、Lewisラットは両後肢への皮下注射を介する100μg/0.1cc(計200μg)ペプチド/CFAを受容した。各ペプチドに対してＴ細胞株を生成させるために、ラットを免疫後９日目にFluoth ane麻酔(Ayerst Laboratories,New York,NY)により屠殺して、膝窩リンパ節を得た。リンパ節をピンセットで機械的にDPBS中で単細胞懸濁物に分離し、そして２回洗浄した(10分、450×g、4℃)。POMC特異的およびCRH特異的細胞ペレットを、 RPMI1640(Bio Whittaker Products)、1％自己ラット血清、5％NCTC-109(Bio Whi ttaker Products)、5×10^-5M 2-メルカプトエタノール(Sigma Chemical Company ,St．Louis，MO)、2mMグルタミン、I00U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、100μg/mlファンギゾン(ICN Biomedicals，Costa Mesa，CA)を含有する培地に再懸濁し、そして25cm²組織培養フラスコ(Corning Glass Works，Corning ，NY)中で50〜100μg/mlの開始ペプチドとともに37℃、5％CO₂にて72時間培養した。Ｔリンパ芽球細胞をHistopaque-1.077(Sigma)を用いる密度遠心分離によって採集し、DPBSで２回洗浄し、そして完全培地(血清供給源を10％ウシ胎児血清( Hyclone Laboratories，Logan，UT)で置換し、そして5％コンカナバリンＡ(ConA )刺激脾臓細胞上清を増殖因子、インターロイキン-2の供給源として含有した以外は上記と同じ)に再懸濁した。細胞株を、さらなるインビトロ継代のためにペプチド抗原(20μg/mlPOMCまたはCRHのいずれか)で再刺激時あるいは抗原特異性の試験のための増殖アッセイにおいて使用する時には、細胞をさらに4〜7日間培養した。Ｔ細胞株抗原特異性のための増殖アッセイ細胞株が休止状態に到達した時点で (開始後7〜10日)、POMCおよびCRHＴ細胞株を回収し、DPBSで２回洗浄し、そして 1％自己ラット血清を含有する増殖培地に再懸濁した。細胞をトリパンブルー色素排除によって計測し、96ウエルのＵ底マイクロタイタープレート(Becton-Dick inson,Lincoln Park，NJ)に１ウエル当たり5〜7×10⁴の濃度で添加した。同遺伝子型の胸腺細胞を抗原提示細胞(APC)として用い、2,000ラドで照射し(¹³⁷Ｃs源：Shepherd ＆ Assoc.,San Fernando，CA)、そして5×10⁵/ウエルの濃度でマイクロタイタープレートに添加した。細胞株および胸腺細胞の混合物を、それらのそれぞれのペプチド抗原(POMC,CRH)と共にまたは無しで、0.5から20μg/mlの範囲の最終濃度でインキュベートした。いくつかの実験においては、抗MHCクラスI I抗体もまた添加した(Ox-3,12.5μg/ml;Ox-6,20μg/ml;またはOx-17,20μg/ml;S erotec)。培養物を、0.5μCi³H-TdR/ウエルでの最後の18時間のパルスを含めて合計72時間インキュベートした。ウエルをLGB Wallac 1295-001 Cell Harvester (Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)を用い繊維ガラスフィルターマット上に回収し、そして³H-TdR取り込みを1205-02Betaplate液体シンチレーションカウンター (Wallac)によって測定した。データは刺激指数（S.I.）±１標準偏差(SD)として表され、そして各アッセイを各細胞株について2〜3回繰り返した。フローサイトメトリー分析によるPOMC/CRHＴ細胞株の表現型付け(phenotyping) 間接的染色法を用いて、休止およびConA活性化POMCおよびCRHＴ細胞株の表面に発現している細胞表面分子の相対的パーセンテージを決定した。表面マーカーは以下のマウス抗ラットモノクローナル一次抗体(全てIgG1イソタイプ)から成った：CD5(OX-19)、CD4(Ｗ3/25)、CD8(OX-8)、MHCクラスIIRT1.B(OX-3およびOX-6) 、MHCクラスIIRT1.D(OX-17)、CD45RC(白血球共通抗原、OX-22)。これらのマーカーをHarlan Bioproducts for Science(Serotec)(Indianapolis,IN)から得た。用いたイソタイプコントロール抗体は、MOPC21(Sigma)(マウスIgG1重鎖および軽鎖特異的)であった。二次抗体はFITC-結合ヤギF(ab')₂抗マウスIgG(Cappel-Organo n Teknika Corp.，West Chester，PA)から成った。細胞染色プロトコル活性化細胞上の細胞表面マーカーの発現を測定するために、POMCおよびCRH細胞株を、照射Lewis脾細胞の存在下で72時間ConA(5μg/ml)で刺激した。72時間後、Ｔ細胞株を回収し、そして密度勾配遠心分離によって脾細胞からリンパ芽球を分離した。問題の各一次抗体（イソタイプコントロールを含む）について、0.5〜1×10⁶個の細胞のアリコートを用いた。12.5〜20μg/mlの濃度の各一次抗体を細胞に添加し、そして氷上で30分間インキュベートした。次いで細胞を２回洗浄し、そして次いで1:30希釈のFITC結合二次抗体を細胞に添加して、氷上にてさらに30分間インキュベーションを続けた。最後に、細胞をDPBS/1 ％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞をアルゴン-イオンレーザーを装備したBecton Dickinson FACScanフローサイトメーターにより分析した。各株由来のＴ細胞を少なくとも２回染色した。10,000事象後の各マーカーの陽性発現のパーセントを表すデータを記録した。全CRH対CRHペプチドの抗原プロセッシングおよび提示アセチル化CRHペプチド( CRHac)および非アセチル化CRHペプチド(CRHnon-ac)に特異的なＴ細胞株を、全ヒト/ラットCRH(Sigma)およびCRHペプチドに対する増殖応答性について試験した。照射(2000ラド)、同遺伝子型ラット胸腺細胞を抗原提示細胞として用いた(5×10⁵ /ウエル)。CRHacＴ株細胞(5×10⁴/ウエル)を、全CRH(40μg/ml)、CRHacペプチド(20μg/ml)、CRHnon-acペプチド(20μg/ml)、±抗MHCクラスII(Ox-3;Ox-6;Ox- 17、12.5〜20μg/ml)の存在下または非存在下で、96ウエルのＵ底マイクロタイタープレート中で72時間(³H-TdR(0.5μCi/ウエル)を用いた最後の18時間のパルスを含む)培養した。POMC Ｔ細胞株へのPOMCの自己提示 POMCＴ株細胞、胸腺細胞またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)のペプチドフラグメントに特異的なＴ細胞(3×10⁶)を抗原提示細胞として用いた。異なった供給源由来のＴ細胞を100nMの全ラット/ヒトCRH(Sigma)の存在下で30時間培養して、任意の内因性Ｔ細胞POMC遺伝子発現を潜在的にアップレギュレートした。抗原提示実験での使用のため、CRH刺激Ｔ細胞を30時間後に回収し、DPBSで２回洗浄し、RPMIおよび1％自己ラット血清を含有する培地に再懸濁し、次いで照射(2000ラド)した。次いで休止POMCＴ株細胞を２：１のAPC：Ｔ比の濃度で、POMCペプチド(20μg/ml)を含有するかまたは含有しない96ウエルＵ底マイクロ培養プレート中に添加した。照射胸腺細胞をAPCとして用いた場合、それらを10：1のAPC：Ｔ細胞の標準的な比率でPOMCＴ細胞に添加した。培養物を合計72時間(³H-TdR(0.5μCi/ウエル)での最後の18時間のパルスを含む)インキュベートした。同じAPC/Ｔ細胞/ペプチド混合物の40時間培養上清を、IL-2産生について、IL-2依存性HT-2細胞を用いるバイオアッセイによってアッセイした。上清(100μl)を、1×10³/ウエルのHT-2細胞と共に48時間(³H-TdR (0.5μCi/ウエル)での最後の12時間のパルスを含む)培養した。された。他の材料 RU38486グルココルチコイドレセプターアンタゴニスト(Roussel UCLAF,France からの好意による贈与)を用いて、CRH特異的Ｔ細胞(20〜55×10⁶)をLewisラット (n=5)に養子移入した１つの実験において、0.03〜3mg/ml/100gm/日i.p.の用量範囲で、内因性CRHをアップレギュレートした。結果POMC およびCRHＴ細胞株の抗原特異性それらのそれぞれの開始抗原を用いた少なくとも一回のインビトロ刺激の後、POMC−およびCRH−特異的Ｔ株細胞を増殖アッセイにおける抗原特異性について試験した。図６はアセチル化POMC（POMCac ）に対して生成されたＴ細胞株の特異性を示す。データを刺激指数として示す：Ｔ細胞＋ペプチドの３連の微量培養物についての³H-チミジン取り込みの平均の一分間当たりのカウント(cpm)割るＴ細胞＋培地単独についての平均cpm。細胞は、用量依存的様式で、非アセチル化POMC(POMCnon-ac)ではなく、POMCacとの共培養に応答して増殖した。これと同じ結果が、CRHac特異的細胞株について得られた。さらに、POMCacおよびCRHac細胞株はS-E結合モチーフを含有する同様なサイズの無関係なペプチドとは交差反応しなかった。図７（パネルＡ）に見られるように、POMCＴ細胞は、POMCペプチドと比較して、CRHペプチドに応答して有意に増殖せず、そして同様に、CRHＴ細胞は、CRHペプチドと比較して、POMCペプチドに応答しなかった(図７Ｂ)。MHCクラスII(RT1.B)抗原がこの細胞株にS-E含有ペプチドを提示しているかどうか決定するために、MHCクラスIIに対する抗体を、抗原提示細胞、抗原およびＴ細胞株の培養物中に添加した。ペプチドに対する増殖応答は、抗MHCクラスII抗体(RT1.B;Ox-3、Ox6)の添加によって変化する程度に阻害され得たが、無関係なMHCクラスII抗体(RT1.D;Ox-17)によっては阻害され得なかった。フローサイトメトリー分析によるPOMC/CRH細胞株表面抗原の表現型これらのＴ細胞株の樹立および抗原エピトープの予測において、仮説は、ペプチド内に含有されるMHCクラスIIペプチド結合モチーフがCD4⁺(Ｔヘルパー)表現型を発現している細胞の発生を助けるというものであった。ConA活性化POMCおよびCRHＴ細胞株は表面抗原表現型が著しく類似していた(表ＸII)。この細胞の90％近くがＴ細胞であり、大多数がCD4を発現していた。両細胞株由来のＴ細胞の少ない割合がC D8の発現について陽性であった。POMCおよびCRH細胞の両方の約25％が、ConAによる活性化後にMHCクラスII(RT1.B;I-A)を強く発現し、一方RT1.D(I-E)発現は両細胞株上で最小であった。休止Ｔ細胞上の総MHCクラスII発現は活性化Ｔ細胞上よりも低かったが、それでもなお存在した(16％＋3)。予想されたように、CD45R C発現は、それらの抗原特異的な活性化状態と一致して、両株の細胞の１％未満に見いだされた(Thomas,M(1989)Ann.Rev.Immunol.7:339-369)。表面抗原の発現はCD5(85％)、CD4(79％)およびCD8(18％)発現に関して、活性化Ｔ細胞株と休止Ｔ株細胞との間で類似していた。Ｔ株細胞を適切な抗原で染色前にインビトロで少なくとも２回刺激した。非特異的抗体染色は５％未満であった。CRH Ｔ細胞株に対する全CRH対CRHacペプチドのプロセッシングおよび提示全ラット/ヒトCRHが比較的小さいポリペプチド(41アミノ酸)である場合、このタンパク質が、合成17アミノ酸CRHペプチドと類似して抗原性フラグメントに自然にプロセスされるのか、またはこの天然のタンパク質がCRHacまたはCRHnon-ac細胞株を刺激し得るのかは不確実であった。CRHペプチドの分子量(MW)(2295MW)を、合成したアミノ酸配列のMWから概算し、そして増殖アッセイにおいて用いられるべき等モル濃度を規定するために、全ヒト/ラットCRH(4757MW)と比較した。CRHac 株細胞は、この細胞株の全CRHに対する増殖より約８倍大きな値を生じて、CRHac ペプチドに対し最大に増殖した(それぞれ34対4.4のS.I.;図8Ａ)。それにも拘わらず、合成ペプチドに対して特異的な細胞は、天然のタンパク質ホルモンに対し反応性を示した。全CRHおよびそのフラグメントは非アセチル化形態でありそうなので、CRHnon-acペプチドに対する細胞応答と全CRHに対する細胞株応答との間で、別の比較をした(図８、パネルＢ)。非アセチル化CRHペプチド特異的Ｔ細胞は全CRHに対するよりも、非アセチル化ペプチドに対し２倍大きく応答した。抗原と組み合わせての細胞株への抗MHCクラスII抗体の添加が、CRHペプチドに対して観察されたと類似して、全CRHペプチドの提示を阻害することが見出された(図７Ｂにおけるように)。POMC Ｔ細胞へのPOMCペプチドの自己提示ヒトおよびラットＴ細胞の両方がMHC クラスII抗原を発現し、そしてＴ細胞自体がPOMCを作る場合、Ｔ株細胞がPOMC特異的Ｔ細胞にPOMCペプチドを提示し得るかどうかを決定するための一つの実験を行った。この実験において、抗POMCＴ細胞、抗GADＴ細胞または胸腺細胞を、100 nMのラット/ヒトCRH(Sigma)と共に30時間インキュベートし、次いで照射し(2000 ラド)、そして72時間の3Ｈ-チミジン取り込みアッセイにおいて、POMCペプチド、 POMCＴ細胞および抗MHCクラスII抗体と共にまたはなしで培養することにより、抗原提示細胞(APC)として使用した。結果を図９Ａ-Ｃに示す。POMC特異的Ｔ細胞はPOMCペプチドをPOMCＴ細胞へ提示し得たが、しかし胸腺細胞(図９Ｃ,それぞれ S.I.5対15)、または別のペプチドに特異的なＴ細胞株(GAD;グルタミン酸デカルボキシラーゼ、図９Ｂ)へは提示し得なかった。抗MHCクラスII抗体の添加は、いずれのタイプのAPCによって提示された場合でも、POMCペプチドに対するPOMC特異的Ｔ細胞の増殖応答を阻害した。POMCＴ細胞、POMCペプチドおよび照射POMCＴ細胞の40時間での培養物から採取された上清は、POMCペプチドを含まない同じ培養物よりもより多量のＩＬ-２を含有していることが見出された(図１０を参照のこと)。しかし、胸腺細胞によるPOMCＴ細胞へのPOMCペプチドの抗原提示はIL-2 依存性HT-2細胞による³H-TdR取り込みによって測定したところ、最大レベルのIL -2を生成した。要約すると、Ｔ細胞株がMHCクラスII結合モチーフ(S-E)を含有するPOMCまたは CRHペプチドの17アミノ酸ペプチドに対して特異的に生じ、そしてこのＴ細胞株はインビトロにおいてペプチドでの再刺激に際して激しく応答した。これらのＴ細胞株は主にCD4⁺Ｔ細胞であり、そして抗原特異的、MHCクラスII拘束性様式で増殖した。さらに、ペプチドホルモンに特異的なＴ細胞株の増殖は、抗MHCクラスII抗体によって阻害され得た。インビトロにおいて、全CRHタンパク質はCRH特異的Ｔ細胞によってプロセスされ得、抗原として認識され得た。さらに、POMC特異的Ｔ細胞は、MHCクラスII⁺POMCＴ細胞の膜上に提示されたPOMCペプチドを認識し得る。本明細書中で示されたデータは、ラットＴ細胞レパトアが神経内分泌ホルモン、CRHおよびPOMCのペプチドフラグメントに特異的な細胞を含むこと実証する。この結果は、生物が内分泌軸によって産生された物質に対してＴ細胞媒介性「自己免疫」様式で反応する能力を有することを示す。等価物当業者は、日常の実験程度を用いて、本明細書中に記載される本発明の特定の実施態様に対する等価物を認識するか、または確認し得る。そのような等価物は以下の請求の範囲に包含されることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＣＣＣ０７Ｋ 14/74 ＡＣＪＧ０１Ｎ 33/564 ＺＡＣＶＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＧＡＤＡＡＢＬＡＤＰＡＢＮＣ０７Ｋ 5/10 ＡＢＭ 7/06 ＡＣＣ 7/08 ＺＮＡＡＣＶ 14/47 ＡＣＪ // Ｃ０７Ｋ 14/74 ＡＤＡＧ０１Ｎ 33/564 ＡＤＰ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．被験体内の自己抗原ペプチドの存在に関連した自己免疫疾患を処置する方法であって、インバリアント鎖ペプチドを、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリヤと共に含む、治療上有効な量の組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該インバリアント鎖ペプチドが、該被験体によって発現される主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質に対する結合モチーフのアミノ酸配列を含み、そして該結合モチーフが該自己抗原ペプチドにも存在する、方法。２．前記インバリアント鎖ペプチドが前記被験体と同じ種由来である、請求項１に記載の方法。３．前記インバリアント鎖ペプチドが、MHCクラスIIタンパク質に対する結合モチーフのアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。４．前記インバリアント鎖ペプチドがヒトMHCクラスIIタンパク質に対する結合モチーフのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。５．前記ヒトMHCクラスIIタンパク質がHLA-DRタンパク質である、請求項４に記載の方法。６．前記ヒトMHCクラスIIタンパク質がHLA-DQタンパク質である、請求項４に記載の方法。７．前記ヒトMHCクラスIIタンパク質がHLA-DPタンパク質である、請求項４に記載の方法。８．前記インバリアント鎖ペプチドが10〜35のアミノ酸長さである、請求項４に記載の方法。９．前記インバリアント鎖ペプチドが10〜20のアミノ酸長さである、請求項４に記載の方法。 10．前記インバリアント鎖ペプチドが12〜16のアミノ酸長さである、請求項４に記載の方法。 11．前記MHCクラスIIタンパク質に対する結合モチーフのアミノ酸配列が、アミノ酸配列、Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Glu（配列番号１）、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である、を含む、請求項３に記載の方法。 12．前記インバリアント鎖ペプチドが静脈内投与される、請求項１に記載の方法。 13．前記インバリアント鎖ペプチドが皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、および経口投与よりなる群から選択される投与ルートによって投与される、請求項１に記載の方法。 14．前記インバリアント鎖ペプチドが、約0.01から5 mg／kg被験体体重の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。 15．前記インバリアント鎖ペプチドが、約0.05から1 mg／kg被験体体重の投与量で投与される、請求項14に記載の方法。 16．前記インバリアント鎖ペプチドが、約0.1から0.5 mg／kg被験体体重の投与量で投与される、請求項15に記載の方法。 17．前記自己免疫疾患が関節炎である、請求項１に記載の方法。 18．前記自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿病である、請求項１に記載の方法。 19．前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１に記載の方法。 20．前記自己免疫疾患が、myesthenia gravis、心筋炎、ギラン・バレー症候群、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー、皮膚紅斑性狼瘡、硬皮症、膣炎、直腸炎、薬剤発疹、ハンセン病反転反応、結節性紅斑、自己免疫ぶどう膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性進行性感覚神経聴覚損失、無形成性貧血、純赤細胞貧血、特発性栓球減少症、多発生軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スチーブンス−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔蘇、グレーブス眼症、類肉腫症、一次胆管硬変、後部ぶどう膜炎、および間質性肺線維症よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。 21．被験体内の自己抗原ペプチドの存在に関連した自己免疫疾患を処置する薬物の製造におけるインバリアント鎖ペプチドの使用であって、ここで該インバリアント鎖ペプチドが、該被験体によって発現される主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質に対する結合モチーフのアミノ酸配列を含み、そして該結合モチーフが該自己抗原ペプチドにも存在する、使用。 22．前記インバリアント鎖ペプチドが前記被験体と同じ種由来である、請求項21 に記載の使用。 23．前記インバリアント鎖ペプチドがMHCクラスIIタンパク質に対する結合モチーフのアミノ酸配列を含む、請求項22に記載の使用。 24．前記インバリアント鎖ペプチドがヒトMHCクラスIIタンパク質に対する結合モチーフのアミノ酸配列を含む、請求項23記載の使用。 25．前記ヒトMHCクラスIIタンパク質がHLA-DRタンパク質である、請求項24に記載の使用。 26．前記ヒトMHCクラスIIタンパク質がHLA-DQタンパク質である、請求項24に記載の使用。 27．前記ヒトMHCクラスIIタンパク質がHLA-DPタンパク質である、請求項24に記載の使用。 28．前記インバリアント鎖ペプチドが10〜35のアミノ酸長さである、請求項24に記載の使用。 29．前記インバリアント鎖ペプチドが10〜20のアミノ酸長さである、請求項24に記載の使用。 30．前記インバリアント鎖ペプチドが12〜16のアミノ酸長さである、請求項24に記載の使用。 31．MHCクラスIIタンパク質に対する結合モチーフのアミノ酸配列が、アミノ酸配列、Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Glu（配列番号１）、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である、を含む、請求項23に記載の使用。 32．前記インバリアント鎖ペプチドが静脈内投与される、請求項21に記載の使用。 33．前記インバリアント鎖ペプチドが、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、および経口投与よりなる群から選択される投与ルートによって投与される、請求項 21に記載の使用。 34．前記インバリアント鎖ペプチドが、約0.01から5 mg／kg被験体体重の投与量で投与される、請求項21に記載の使用。 35．前記インバリアント鎖ペプチドが、約0.05から1 mg／kg被験体体重の投与量で投与される、請求項34に記載の使用。 36．前記インバリアント鎖ペプチドが、約0.1から0.5 mg／kg被験体体重の投与量で投与される、請求項35に記載の使用。 37．前記自己免疫疾患が関節炎である、請求項21に記載の使用。 38．前記自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿病である、請求項21に記載の使用。 39．前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項21に記載の使用。 40．前記自己免疫疾患が、myesthenia gravis、心筋炎、ギラン・バレー症候群、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー、皮膚紅斑性狼瘡、硬皮症、膣炎、直腸炎、薬剤発疹、ハンセン病反転反応、結節性紅斑、自己免疫ぶどう膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性進行性感覚神経聴覚損失、無形成性貧血、純赤細胞貧血、特発性栓球減少症、多発生軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スチーブンス−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔蘇、グレーブス眼症、類肉腫症、一次胆管硬変、後部ぶどう膜炎、および間質性肺線維症よりなる群から選択される、請求項21に記載の使用。 41．被験体内の自己抗原ペプチドの存在に関連した自己免疫疾患の少なくとも１つの徴候を阻止するに十分な量のインバリアント鎖ペプチド；および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物であって、ここで、該インバリアント鎖ペプチドが該被験体によって発現される主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質に対する結合モチーフのアミノ酸配列を含み、そして該結合モチーフが該自己抗原ペプチドにも存在する組成物。 42．前記インバリアント鎖ペプチドがヒト由来である、請求項41に記載の薬学的組成物。 43．前記MHCタンパク質がヒト由来である、請求項41に記載の薬学的組成物。 44．前記インバリアント鎖ペプチドが、MHCクラスIIタンパク質に対する結合モチーフのアミノ酸配列を含む、請求項41に記載の薬学的組成物。 45．前記MHCクラスIIタンパク質に対する結合モチーフのアミノ酸配列が、アミノ酸配列、Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Glu（配列番号１）、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である、を含む、請求項44に記載の薬学的組成物。 46．前記インバリアント鎖ペプチドが、10〜35のアミノ酸長さである、請求項41 に記載の薬学的組成物。 47．前記インバリアント鎖ペプチドが、10〜20のアミノ酸長さである、請求項41 に記載の薬学的組成物。 48．前記インバリアント鎖ペプチドが、12〜16のアミノ酸長さである、請求項41 に記載の薬物組成物。 49．自己抗原ペプチドと被験体によって発現される主要組織適合性複合体(MHC) タンパク質との間の相互作用を阻止し得るインバリアント鎖ペプチドを調製する方法であって、 a)該自己抗原ペプチド内で、該被験体のMHCタンパク質に対する結合モチーフを含む領域を同定する工程； b)該自己抗原ペプチドに存在する該MHCタンパク質に対する同じ結合モチーフを含むインバリアント鎖タンパク質の領域を選択する工程；および c)該インバリアント鎖タンパク質の選択された領域を含むインバリアント鎖ペプチドを調製する工程を包含する方法。 50．前記MHCタンパク質がMHCクラスIIタンパク質である、請求項49に記載の方法。 51．前記インバリアント鎖ペプチドが、前記被験体と同じ種由来である、請求項 49に記載の方法。 52．前記インバリアント鎖ペプチドが、前記ペプチドを化学的に合成することによって調製される、請求項49に記載の方法。 53．前記インバリアント鎖ペプチドが、該インバリアント鎖タンパク質をタンパク質加水分解により消化し、そして該インバリアント鎖タンパク質の前記選択された領域を含むタンパク質加水分解断片を単離することによって調製される、請求項49に記載の方法。 54．前記インバリアント鎖ペプチドが、10〜35のアミノ酸長さである、請求項49 に記載の方法。 55．前記インバリアント鎖ペプチドが、10〜20のアミノ酸長さである、請求項49 に記載の方法。 56．前記インバリアント鎖ペプチドが、12〜16のアミノ酸長さである、請求項49 に記載の方法。