JPH10506279A

JPH10506279A - 分析用の核酸を調製する方法およびその方法のためのキット

Info

Publication number: JPH10506279A
Application number: JP8510959A
Authority: JP
Inventors: ノース，リサ，エス; ダソヴィッチ−ムーディ，メアリー; ウィンゲット，メリッサ，リアドン
Original assignee: ボーリンガー・マンハイム・コーポレイション
Priority date: 1994-09-21
Filing date: 1995-09-13
Publication date: 1998-06-23
Anticipated expiration: 2015-09-13
Also published as: DE69535284T2; EP0784695B1; CA2199835A1; EP0784695A1; DE69535284D1; JP3887014B2; US5538870A; EP0784695A4; ES2274520T3; CA2199835C; WO1996009404A1

Abstract

(57)【要約】全細胞のサンプルから核酸を純化するのに有用な方法が記載される。これは、非イオン界面活性剤を含有する非−フェニール基と架橋化ポリカルボン酸とのいずれか一方またはこれらの両方を添加することによって行われる。これらの方法に使用可能なキットも記載される。

Description

【発明の詳細な説明】分析用の核酸を調製する方法およびその方法のためのキット発明の分野本発明は核酸分子の純化に関する。より詳しくは、後の分析方法、特に、増幅アッセイに使用するための核酸分子の調製に関する。背景および従来技術特定の核酸分子の測定または、これら分子の発現の測定は、分析および臨床化学における非常に重要な側面をなす。この分野において、膨大な数の各種核酸アッセイが知られている。これらのアッセイのすべてが、共通の目的、即ち、サンプル中における特定の核酸分子の同定を有しているということができる。この目的を達成することによって、バクテリア又はウィルス感染などの感染の同定、組織の分類、個人の同定（いわゆる”ＤＮＡ指紋法”）等が可能となる。核酸アッセイにおける問題の１つは、目的とする物質、即ち、特定の核酸分子が、唯一又は非常に少ないコピーしか存在していないことにある。従って、所望の分子を実際に発見する可能性が最大となるように核酸分子を純化することに、多大な関心が持たれている。核酸分子の純化として、古典的な技術が既に開発されている。これらの内で最も基本的なものの１つは、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他により、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＮｅｗＹｏｒｋ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２，ｐｐ．２８０−１）に記載されている。この方法は、プロテアーゼを使用して標的細胞を溶解し、その後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことを教示している。この方法は完了するのに非常に長い時間がかかり、しかも、危険な発ガン性物質を使用する。この方法に関する問題のいくつかが、ここに参考文献として含ませるミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）他、ＷＯ８９／０７６０３（１９８９年８月２４日）に記載されている。更に、上述のフェノール／クロロホルムに基づく方法は、例外なく、核酸分子をその溶媒から分離するために、エタノールやイソプロパノール等のアルコール沈澱剤を必要とする。所望の物質に対する損傷またはその物質の損失の危険性はきわめて高い。この非常に基本的な技術において改良を続けることの必要性は、これを課題とする多数の特許および非特許刊行物を通じて見ることができる。これらの文献は、所望の核酸分子を得るための改良を目的としている。これらは、採用可能な数多くの各種アプローチを明示している。例えば、カミンズ（Ｃｕｍｍｉｎｓ）の米国特許第５，２３１，０１５号は、溶解溶液中において金属イオンを使用することを教示している。このイオンは、自然発生する核酸分子ポリメラーゼに対する補因子である。その原理は、前記金属イオンが、元から存在するポリメラーゼが有する対象の核酸分子をコピーする潜在能力を改善するというものである。このような技術は、後に詳述する増幅方法において特に有用である。ファン・ネス（ｖａｎＮｅｓｓ）他の米国特許第５，１３０，４２３号は、ＤＮＡの抽出において、ベンジルアルコール等のフェニール誘導体の使用における改良を主張している。コーラー（Ｋｏｌｌｅｒ）の米国特許第５，１２８，２４７号も同じ線に沿ったものであり、これは、細胞の溶解にカオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤を使用し、その後、ヘパリン等の硫酸化多糖類タンパク質による処理を行うことを教示している。マクファーレン（Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ）の米国特許第５，０１０，１８３号は、核酸の純化において陽イオン界面活性剤を使用する技術を推奨しており、これに対して、米国特許第４，９０８，３１８号は、核酸分子を可溶化した後、界面活性剤で溶解を行い、その後、これらの核酸分子をスプーリング（ｓｐｏｏｌｉｎｇ）することを教示している。リン（Ｌｉｎ）他の米国特許第５，２８４，９４０号は、増幅反応中におけるポリメラーゼインヒビタの活動を防止するためにトランスフェリン、グロブリン又は、血清アルブミンを使用することを示唆している。上述した特許の大半は、後の増幅アッセイ、特に、周知のポリメラーゼ連鎖反応、”ＰＣＲ”技術での使用のためのサンプルの調製を扱っている。ここに参考文献として含ませるムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）他の米国特許第４，６８３，３０２号に記載されているように、この方法は、所望の核酸分子の複数コピーを、単数または複数種の核酸分子プライマを通して、サームスアクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）即ち”Ｔａｑ”ポリメラーゼ等のポリメラーゼとの併用によっていかにして得ることが出来るかを示している。しかしながら、増幅された核酸分子を得る手順は、本質的に、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他の手順と同じである。この技術の改良に対する要求は、例えば、ここに参考文献として合体する、カサリアル（Ｃａｓａｒｅａｌｅ）他の”ＩｍｐｒｏｖｅｄＢｌｏｏｄＳａｍｐｌｅＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＦｏｒＰＣＲ”ＰＣＲ法と応用（ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２，ｐｐ．１４９〜１５３）に見ることができる。この文献は、サンプル量の少なさ、応用の阻害、サンプルの安定性などを含むＰＣＲの本来的限界について論じている。カサリアル（Ｃａｓａｒｅａｌｅ）他は、熱と界面活性剤とを使用することによる核酸分子の単離の改善を報告している。使用した界面活性剤はＮｏｎｉｄｅｔＰ −４０であり、その化学名は、エチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）_nであり、ここで”ｎ”は、通常約１１の整数である。その成功は、ＤＮＡ増幅の抑制を低下させたことによるものである。その他にも同様の主張をしているものがあり、例えば、エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）他、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｐ．１９〜２１があり、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０を、Ｔｗｅｅｎ２０と組み合わせて使用することによって、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を溶解剤に使用した溶解サンプル中においてＴａｑポリメラーゼの抑制を防止したとされている。ＳＤＳの効果は、増幅プロセスにおいて使用されるすべてのポリメラーゼを抑制することにある。前記界面活性剤の組合せによって、ＤＮＡとＭｇ²⁺（Ｔａｑポリメラーゼのための補因子）が存在する場合に、３７℃において前述した問題を軽減することができたと主張されている。ＳＤＳを中和するための界面活性剤の使用は、理論的には驚くべきことではない。ハーゼルベック（Ｈａｓｅｌｂｅｃｋ）他の”ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅＩｎｃｕｂａｔｉｏｎＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ＶａｒｉｏｕｓＤｅｔｅｒｇｅｎｔｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅＥｎｚｙｍａｔｉｃＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＮ−ＧｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ（ＧｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＦ），ａｎｄＥｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ”，ｉｎＴｏｐｉｃｓＩｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ８：１〜４（１９８８）には、ＳＤＳの酵素に対する一般的抑制効果が記載されている。ハーゼルベック（Ｈａｓｅｌｂｅｃｋ）他は、更に、ＮＰ−４０又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００（オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）_n、ここで”ｎ”は約１０）が、リストアップされた酵素に対するＳＤＳの効果を抑制することを示している。但し、一般化はされておらず、事実、後述するように、増幅プロセスに対するＳＤＳのインパクトを除去することにおける界面活性剤の効果に関し、広く一般化することは不可能である。上述した技術の大半が、本発明によって対象とされる問題の１つを指し示している。要約すると、細胞の溶解に使用され、これによって増幅のための核酸を遊離させる薬剤として、ドデシル硫酸ナトリウム、即ち”ＳＤＳ”が含まれることが多い。しかし、ＳＤＳには、増幅反応を行うために必要なポリメラーゼを抑制するという望ましくない副作用がある。当該技術における更に別の問題は、可能な限り短時間で非常に純度の高い核酸サンプルを得ることにある。細胞が溶解されるとき、目標とする核酸分子以外の物質が放出されるが、これらの物質は汚染物質と見なさなければならない。全血液サンプルの場合、核酸の量に対して、放出されるタンパク質の量が多ければ特に重大な問題が生じる。ポルフィリン環含有化合物、特に、ヘムとその誘導体は、特に悪名高いポリメラーゼインヒビタである。これらの物質をサンプルから除去することが、非常に重要であることは明らかである。上述したアルコール沈澱法は、不純物から核酸分子を分離する１つの方法である。出願人らは、この方法の欠点をここで繰り返すことはしないが、アルコール沈澱工程を必要とせずに、純度の高い核酸分子のサンプルを迅速かつ効率的に得られることが望ましい。このようにして純化された核酸分子が、即座に増幅プロセスに使用可能であるような方法を達成することが更に望ましい。ここに、その全部を参考文献として含ませるクルペイ（Ｋｒｕｐｅｙ）の米国特許第５，２９４，６８１号には、水不溶性の架橋化ポリヒドロキシポリカルボキシル酸分子が記載されている。これらの分子は、であり、ここで、各ストランドにおけるその少なくとも１つのマレオイルモエティ（ｍａｌｅｏｙｌｍｏｉｅｔｙ）のカルボキシル基は、 −ＨＮ［Ｈ）_p（ＣＨ₂）（ＯＨ）_m］ＮＨ−モエティに共有結合して、その中で以下の式の少なくとも１つの架橋化モエティを作り出す。ここで、Ｒは水素または低級アルキレン又は炭素元素１〜４の低級アルコキシ、又はフェニールであり、ｚは１〜４の整数、ｐは０又はｚ−１までの整数、ｍは１またはｚまでの整数であるものにおいて、ポリ（アルキレン炭酸（ａｌｋｙｌｅｎｅｃａｒｂｏｎｉｃａｃｉｄ））ストランドへの架橋の比率が１と約２００から２までの間が水性媒質からのタンパク質の回収に有効であると記載されている。前記分子は、サンプル中のタンパク質を隔離する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）。ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥとして知られているこの特許に基づく製品が市販されている。しかし、この商品は、その中に使用されている特定の酸の概要を示しておらず、その特許に言及しているに過ぎない。クルペイ（Ｋｒｕｐｅｙ）は、その新規な分子のタンパク質からのＤＮＡの単離における一般的な使用について記載しているが、その方法については一般的にしか説明しておらず、常にグアニジウムチオシアネート水溶液（ａｑｕｅｏｕｓｑｕａｎｉｄｉｕｍｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）、及び溶解剤について言及している。これらの方法は、すべて、アルコール等を使用した核酸の沈澱を併用する方法として報告されている。従って、当該技術においては、望ましいタンパク質の分離が、望ましくないＤＮＡの沈澱と関連づけられているという別の問題がある。今回、まず、ＳＤＳの界面活性剤に基づく不活性化についての一般化が、核酸の増幅のためのサンプルの調製においては不可能であるということが判った。これは、特に、非イオン界面活性剤について当てはまり、ここでは、”Ｔｒｉｔｏｎ”ファミリの界面活性剤などのフェニール基含有界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウムを抑制する作用がないということが判った。従って、本発明の一態様は、ドデシル硫酸ナトリウムを抑制するために、フェニール基を有さない非イオン界面活性剤のみを使用することが可能であり、これによって、全細胞からの核酸サンプルの純化の改善が達成されるという驚くべき認識に基づくものである。本発明の第２の態様は、下記の式の架橋化されたポリヒドロキシポリカルボン酸であって、各ストランドにおけるその少なくとも１つのマレオイルモエティの１つのカルボニル基が、 −ＨＮ［Ｈ）_p（ＣＨ₂）（ＯＨ）_m］ＮＨ−モエティに共有結合して、その中で以下の式の少なくとも１つの架橋化モエティを作り出す。ここで、Ｒは水素または低級アルキレン又は炭素元素１〜４の低級アルコキシ、又はフェニールであり、ｚは１〜４の整数、ｐは０又はｚ−１までの整数、ｍは１またはｚまでの整数であるものにおいて、ポリ（アルキレン炭酸）ストランドへの架橋の比率が１と約２００から２までの間であるものが核酸の純化のための方法に使用可能であり、これによってアルコール沈澱工程を除外することができる。これらの化合物の使用によってＳＤＳを抑制することもでき、従って、単体または、上述した界面活性剤と共に使用することができる。これらの方法は、別々、あるいは一緒に使用することが可能である。本発明のこれら及びその他の態様は、以下の開示から理解されるであろう。図面の簡単な説明図１は、ヒトの白血球細胞ＤＮＡからの１．５キロベースのβ−グロブリンセグメントに対するポリメラーゼ連鎖反応後に得られた結果を示す。図１Ａは、塩濃度を変化させながらｐＨを一定（ｐＨ６）にした場合の効果に関する研究を示す。図１Ｂは、ｐＨを一定（ｐＨ７）に維持して、塩濃度を変化させた場合に得られた結果を示す。図１Ｃは、塩濃度を一定に保ち、ｐＨを変化させた場合の結果を示す。図１Ａ及び１Ｂにおいて、使用した塩濃度は１００ｍＭと１５０ｍＭであり、図１Ｃにおいての濃度は５０ｍＭであった。図１Ａにおいて使用したｐＨは６であり、図１Ｂでは７、そして図１Ｃでは６と７との両方であった。図２は、フェニール基含有非イオン界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用してドデシル硫酸ナトリウムの抑制を試みた場合に得られた結果を示す。図３は、非フェニール基含有非イオン界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０をドデシル硫酸ナトリウムの抑制に使用した場合に得られた結果を示す。好適実施形態の詳細な説明例１この例は、後記の例２及び３において言及されているポリメラーゼ連鎖反応（ ”ＰＣＲ”）を行うためのプロトコルを記載するものである。サンプルの調製後、前記β−グロブリン遺伝子の１．５キロベースのセグメントを増幅した。サンプルに、次のＰＣＲ試薬を添加した。蒸留水７０部反応緩衝液１０部２５ｍＭＭｇＣｌ₂ ６部サンプルＤＮＡ１０部ｄＮＴＰｓ２部プライマＡ１部プライマＢ１部プライマＡの配列は、 GTACGGCTGT CATCACTTAG ACCTCA （配列認識番号：１）であった。プライマＢの配列は、 AGCACACAGA CCAGCACGTT （配列認識番号：２）であった。これらの試薬に、下記のサイクルプロトコルにおいて説明するように、０．５ｕｌのサームスアクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）を添加した。第１サイクルは次の通りであった。変成（９７℃、７分間）アニーリング（５９℃、１分間）。休止後、５９℃の温度を維持しながら、各サンプルに対して０．５ｕｌ（２．５Ｕ）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加。重合化（７２℃、２分間）これは一度行い、その後、下記を３０サイクル行った。変成（９４℃、１分間）アニーリング（６０℃、２．５分間）重合化（７２℃、２分間）。最後に、１サイクル延長を行った（７２℃、７分間）。ＤＮＡを、２．０％ＬＥアガロースゲル上で分画し、コントロールと共に、前記ゲルの一部であるレーンに分子量マーカを付けた。これらのゲルは、図面に示されているものであり、以下の諸例において説明する。例２この実験とその後の実験のため、以下の試薬を使用した。（ｉ）赤血球細胞溶解緩衝液：１４０ｍＭＮＨ₄Ｃｌ，１７ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．６５）；（ｉｉ）白血球細胞溶解緩衝液：６種類の選択肢の内の１つ、それぞれの選択肢において、１０ｍＭのＴｒｉｓと０．１％のＳＤＳとを添加した。これらの種々の塩濃度の１つを使用した（５０，１００又は１５０ｍＭＮａＣｌ）。ｐＨは、６又は７であった。これによって、次の６種類の溶解緩衝液が調合された。５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ，０．１％ＳＤＳ（ｐＨ６又はｐＨ７）１００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ，０．１％ＳＤＳ（ｐＨ６又はｐＨ７）１５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ，０．１％ＳＤＳ（ｐＨ６又はｐＨ７）。各サンプルランにおいて、１ｍｌの前記赤血球細胞溶解緩衝液に、５００ｕｌの全血液を添加した。次に、この混合物を５分間、インキュベートし、その後、これを２５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。インキュベーションの時間は、適宜変更可能である。これによって、ペレットと上清とが作られた。上清を廃棄し、ペレットを１ｍｌの新しい赤血球細胞溶解緩衝液中にて再懸濁させた。この新しい溶液を、２５００ｒｐｍで３分間回転させた。その結果得られたペレットを、次に、前述の６種類の白血球細胞溶解緩衝液の１つの中で懸濁させた。この新しい懸濁液を、６５℃で５分間加熱した。加熱後、サンプルを下記の選択肢の１つにおいて使用した。例３例２において調製した懸濁液に、７００ｕｌのＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを添加した。この混合物を、５分間インキュベートし、次に、遠心分離機でフルスピードで５分間回転させた。サンプルを、例１で述べたようにして、ポリメラーゼ連鎖反応において使用した。増幅後、増幅産生物を、２．０％ＬＥのアガロースゲル上に流した。その結果を、前記実験のゲルを示すここに添付の図１Ａ，１Ｂ及び１Ｃに示す。各ケースにおいて、ゲルのレーン１は、分子量マーカを示している。レーン２はコントロールである。図１Ａにおいて、レーン３及び４は、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥなしで、１００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ及び０．１％ＳＤＳ（ｐＨ６）を使用した場合の結果を示し、レーン５及び６は、前記緩衝液にＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを添加した場合に得られた結果を示す。レーン７及び８において、緩衝液は、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥなしの、１５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ及び０．１％ＳＤＳ（ｐＨ６）であった。レーン９及び１０においては、ＰＲＯ −ＣＩＰＩＴＡＴＥを含む、高級塩緩衝液を使用した。図１Ｂは、図１Ａに示した結果に対応するものであるが、ここではｐＨは７であった。図１Ｃには、図１Ａと図１Ｂとに対応する結果が示されている。しかし、ここでは、レーン３は、５０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ及び０．１％ＳＤＳをｐＨ６で使用した。レーン４及び５は、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥが使用されていることを除いては同じである。レーン６は、ｐＨが７であることを除いてはレーン３に対応している。レーン７は、ｐＨが７であることを除いてはレーン４及び５に対応している。図１Ａ，１Ｂ及び１Ｃに示した結果は、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用した場合、信号が明白に改善されていることを示している。この結果は、前記濃度、あるいはｐＨとは独立したものであり、従って、その効果を、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥの存在のみに帰することができる。例４この実験は、非イオン界面活性剤をＳＤＳと組み合わせて使用した場合を記載する。これは、前者が後者の効果を中和し、これによってサンプルのＰＣＲ分析を可能にすることを示すものである。５００ｕｌの全血液に、例３において説明した１ｍｌの赤血球細胞溶解緩衝液を添加した。これらの物質を、５分間振動（ｒｏｃｋｅｄ）（即ち、インキュベート）させ、その後、２５００ｒｐｍで５分間回転させた。前述した例２と同様、インキュベーションの時間は適宜変更可能である。前記ペレットに、追加の１ｍｌの赤血球細胞溶解緩衝液を添加し、その後、２５００ｒｐｍで３分間回転させた。次に、得られたペレットに、５００ｕｌの白血球細胞溶解緩衝液を添加した。第１組のテストにおいて、この溶解緩衝液は以下の１つを有していた。ａ．ＳＤＳのみｂ．ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のみｃ．ＳＤＳ＋ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ｄ．ＳＤＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０ｅ．Ｔｗｅｅｎ２０のみ第２組のテストにおいて、下記のように、前記緩衝液にＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥも添加した。ａ．ＳＤＳ（溶解緩衝液）、次にＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥ、その後Ｔｗｅｅｎ２０ｂ．ＳＤＳ（溶解緩衝液）、次にＴｗｅｅｎ２０、その後、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥｃ．ＳＤＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０（溶解緩衝液）、次にＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥｄ．ＳＤＳ（溶解緩衝液）、次に、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥ前記第１組のテストにおいて、サンプルに溶解緩衝液を添加し、その後、６５ ℃で５分間加熱し、その後、例１と同様にしてポリメラーゼ連鎖反応を行った。前記第２組のテストにおいて、まず、前記溶解緩衝液を添加し（”ａ”と”ｂ”と”ｄ”とにおいてはＳＤＳのみ、又は、”ｃ”においてはＳＤＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０）、次に、これらサンプルを第１組のテストと同様に加熱した。その後、残りの試薬を添加した（”ａ” においては、まずＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥ、次に、Ｔｗｅｅｎ２０；”ｂ” においては、まずＴｗｅｅｎ２０、次にＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥ；”ｃ”と ”ｄ”においては、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥのみ）。図２及び３にその結果を示す。図２において、レーン１及び１１は分子量マーカである。レーン２及び３は、ＳＤＳのみを使用した場合に得られた結果である。レーン４及び５は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のみを使用した場合の結果である。レーン６及び７は、ＳＤＳとＴｒｉｔｏｎとの組合せ、そして、レーン８及び９は、ＳＤＳとＴｒｉｔｏｎＸ−１００を、同時にではなく、順番に使用した場合を示している。レーン１０はコントロールである。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用した場合のレーン４及び５におけるバンドに注目されたい。しかし、ＳＤＳを使用したときにはバンドがなく、これは、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００がＳＤＳを不活性化することができなかったことを示している。これに対して、図２ｂに示されている結果は、Ｔｗｅｅｎ２０は、確かにＳＤＳを不活性化したことを証明している。図２ｂにおいて、レーン１は、分子量マーカを示している。レーン２及び３は、ＳＤＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０（同時使用）の使用を示している。レーン４及び５は、これらの物質を順番に使用した場合の結果を示している。レーン６及び７は、ＳＤＳのみを使用した場合の結果であり、レーン８及び９は、Ｔｗｅｅｎ２０のみの場合。レーン１０はコントロールである。図３Ａ及び３Ｂにおいて、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用した場合が示されている。図３Ａにおいて、レーン１は分子量マーカであり、レーン１２はコントロールである。レーン２及び３は、ＳＤＳとＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥとを使用し、レーン６及び７はＴｒｉｔｏｎＸ−１００と組み合わせてＳＤＳを使用し、その後、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用した。レーン８および９においては、ＳＤＳの後でＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用し、その後、ＴｒｉｔｏｎＸ −１００を使用した。レーン１０及び１１においては、ＳＤＳの後でＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用し、その後、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用した。図３Ｂにおいて、レーン１及び１２はレーン３Ａと同じである。レーン２及び３は、ＳＤＳの後でＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥと更にその後でＴｗｅｅｎ２０の使用を示している。レーン４及び５は、ＳＤＳの後でＴｗｅｅｎ２０と、更にその後でＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥの使用を示す。レーン６及び７は、ＳＤＳをＴｗｅｅｎ２０と使用し、その後、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用した。レーン８及び９はＳＤＳの使用後、ＰＲＯ −ＣＩＰＩＴＡＴＥを使用したものである。レーン１０及び１１は、ブランクであった。各ケースにおいて、ＰＲＯ−ＣＩＰＩＴＡＴＥは標的配列の増幅を容易にした。上述した諸例は、核酸の増幅などのアッセイのために核酸分子を調製するための方法に関する本発明を記載するものである。本発明の一態様において、全細胞サンプルは、その中に含まれる核酸を放出させるために溶解される。その後、前述した、又、その開示内容をここに参考文献として含ませるクルペイ（Ｋｒｕｐｅｙ）の米国特許第５，２９４，６８１号に記載された少なくとも一種類の非水溶性の架橋化ポリヒドロキシポリカルボキシル酸を添加する。これらの物質を含有している試薬は、であるが、その構造の詳細は、この製品からは知ることができない。しかし、前記クルペイ（Ｋｒｕｐｅｙ）特許には、前記ポリカルボキシル酸をいかにして得るかについての十分な詳述が含まれている。前記ポリカルボキシル酸の添加後、サンプル中の核酸を、従来のそれらを沈澱させるためのアルコールの添加工程なしで、直接に回収することができる。その結果、所望の場合には、そのサンプルを、核酸増幅に必要な試薬と即座に接触させることができる。このような試薬としては、例えば、サームスアクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ヌクレオチドポリメラーゼや、例えばＰＷＯポリメラーゼのためのその他の等価な酵素がある。これらの試薬に、更に、多くの周知の核酸増幅のプロトコルに従って、例えば適当なプライマ、デオキシヌクレオチド、緩衝液などを含ませてもよい。核酸増幅のためのファミリの中には、現在では既に古典的となっているポリメラーゼ連鎖反応すなわち”ＰＣＲ”や、リガーゼ連鎖反応すなわち”ＬＣＲ”があり、これらのすべては当業者にとって知られているので、ここでリストアップする必要はない。ここに記載した方法を使用して、核酸を含有するあらゆる細胞から核酸を得ることができる。（尚、この点に関して、例えば赤血球細胞は核酸を含んでいない）。ほ乳類細胞などの真核細胞が処理されることが好ましく、特に、ヒトの細胞が好ましい。このように処理可能な多数のヒト細胞の内、純化されたサンプルとして、あるいは、全血液サンプルの一部として、白血球細胞を処理することが特に好適である。上記概説した調製方法は、種々な細胞タイプに適用可能である。前に挙げた技術によって示されているように、種々の細胞を各種溶解剤によって溶解し、その核酸を放出させることはよく知られている。従って、前記細胞サンプルを処理しているときには、１つは赤血球細胞用、もう１つは白血球細胞用の２つの異なった溶解緩衝液を利用すると便利である。ここでも、前に挙げた技術によって示されているように、様々な緩衝液は当業者にとって周知である。前記ポリカルボキシル酸を使用するに当たって、溶解後、但し、そのポリカルボキシル酸を添加する前に、サンプルを加熱することが特に好ましい。この加熱は、好ましくは、約５０℃〜約７０℃の範囲の温度で、少なくとも１分間行われる。好ましくは、この加熱工程は、１０分間以下である。更に、サンプルからの核酸の純度を更に高めるために、サンプルに対するポリカルボキシル酸の添加後に遠心分離工程を利用することも可能である。ここでも、遠心分離のプロトコルは周知である。上記概説した本発明の方法による核酸の単離後、これらの核酸を後の使用のために保存することも可能であるし、あるいは、すぐに増幅を行うことも可能である。後者の場合、遊離された核酸分子のアリコットに対して直接増幅試薬を添加すると、反応が始まる。本発明の別の態様は、例えば、（ｉ）非イオン性で、かつ、（ｉｉ）フェニール基を含まない界面活性剤の、ドデシル硫酸ナトリウム、即ち”ＳＤＳ”も含有する溶解緩衝液中での使用を例示した。ＳＤＳは、溶解剤において、標準的で、ほとんどいたるところに見られる物質である。前記諸例によって指摘したように、フェニール基を含有しない、非イオン界面活性剤を使用することによって、ＳＤＳによる酵素抑制の問題を避けることができるのである。より正確には、ポリ（オキシエチレン）_n−ソルビタン−モノラウレート、” ｎ”は通常２０、でありＴｗｅｅｎ２０と称され、非フェニール基含有非イオン界面活性剤を使用することが好ましい。本発明において有用なその他の物質には、モノ−ラウレートではなくモノオレエートのＴｗｅｅｎ２０、Ｎ−（Ｄ−グルコ−２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキシル） −Ｎ−メチルデカンアミドである”ＭＥＧＡ−１０”、Ｎ，Ｎ−ビス−（３−Ｄ −グルコンアミドプロピル）−デオキシコルアミド，１−０−ｎ−ドデシル−β −Ｄ−グリコピラノシド，１−０−ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→４） α−Ｄ−グルコピラノシド、６−０−（Ｎ−ヘプチル−カルバモイル）−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−（Ｄ−グルコ−２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキシル）−Ｎ−メチルオクタンアミド、１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドであるＤｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ、ラウリン酸シュクロースエステル”Ｂｒｉｊ−３５”又はドデシルポリ（オキシエチレングリコールエーテル）₂₃、”ＧｅｎａｐｏｌＸ−０８０”又はイソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）_n、ここでｎは８、ポリエチレンコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｃｏｌ）−ポリプロピレングリコ−ルーコポリマである”ＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃＰＥ／Ｆ６８”、ポリエチレングリコール− ポリプロピレングリコールコポリマである”ＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃＰＥ／Ｆ１２７”、ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）_n、ここで”ｎ”は９、である” Ｔｈｅｓｉｔ”が含まれる。具体的に除外されるものは、その構造中にフェニール基を含む”Ｔｒｉｔｏｎ”界面活性剤である。この含まれるものと除外されるものとのリストはまだまだ続くが、以上挙げたものに加えてその他の非イオン界面活性剤も当業者にとって周知であると推定される。上述したポリカルボン酸の使用と同様に、上に挙げたもの全部を含めて、溶解が完了した後、それによって遊離された核酸分子を増幅反応に使用することができる。尚、当業者は、本発明が、核酸分子を純化、回収および／又は増幅するのに使用されるキット（ｋｉｔｓ）をも含むものであることを理解するであろう。その最も広い範囲において、このようなキットは、ここに記載した物質の別のポーションとともに、単数または複数の溶解試薬のポーションを有する。例えば、本発明の一実施形態は箱などの容器手段を有し、この容器手段は、白血球細胞溶解剤と、ここに記載したポリカルボキシル酸とのそれぞれの別々のポーションを収納している。この第１実施形態を改変した別の実施形態において、前記溶解緩衝液は、ドデシル硫酸ナトリウムを含有し、そのキットの第２アイテムは、非フェニール基含有非イオン界面活性剤である。これらのキットに、更に、サームスアクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼ、あるいはその他の重合酵素のサンプルを含ませてもよい。これらのキットをＨＩＶアッセイやその他類似のテスト等の特定のシステムにおける使用に構成する場合には、関連するプライマの別のポーションも含ませることができる。本発明のその他の特徴は当業者にとって明らかであり、ここに繰り返す必要はない。尚、本明細書および諸例は本発明を例示するものであって限定するものではなく、本発明の精神および範囲内のその他の実施形態も当業者にとって自明であると理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ダソヴィッチ−ムーディ，メアリーアメリカ合衆国インディアナ 46260 インディアナポリスミンバーン・レーン 1449 (72)発明者ウィンゲット，メリッサ，リアドンアメリカ合衆国インディアナ 46077 ジムズヴィルカントリー・プレイス 2969

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸増幅用に全細胞含有サンプルを調製する方法であって、以下の工程を有する、（ｉ）前記全細胞含有サンプルを、少なくとも一種類の溶解緩衝液に接触させて核酸含有細胞を溶解する工程、（ｉｉ）前記サンプルに対して、以下の式で表される少なくとも２つのストランドを有する非水溶性架橋化ポリヒドロキシポリカルボン酸の一定量を添加する工程ここで、各ストランドにおけるその少なくとも１つのマレオイルモエティの１つのカルボニル基が、 −ＨＮ［（Ｈ）_p（ＣＨ）₂（ＯＨ）_m］ＮＨ−モエティに共有結合して、その中で以下の式の少なくとも１つの架橋化モエティを作り出す、ここで、Ｒは水素または低級アルキレン又は炭素元素１〜４の低級アルコキシ、又はフェニールであり、ｚは１〜４の整数、ｐは０又はｚ−１までの整数、ｍは１またはｚまでの整数であるものにおいて、ポリ（アルキレン炭酸）ストランドへの架橋の比率が１と約２００から２までの間であり、前記サンプル中のすべてのタンパク質を隔離するのに十分なものである、そして（ｉｉｉ）前記サンプル中の核酸を回収する工程、ここで、この回収は、アルコール沈澱なしに行われる。２．請求項１の方法であって、前記全細胞含有サンプルは全血液サンプルである。３．請求項２の方法であって、前記全血液サンプルを、赤血球細胞を溶解する第１溶解緩衝液と、白血球細胞を溶解させる第２溶解緩衝液とに接触させる工程を有する。４．請求項１の方法であって、更に、前記サンプルを工程（ｉ）の後で、かつ、工程（ｉｉ）の前において、約５０℃〜約７０℃の温度で、約１分間〜約１０分間、加熱する工程を有する。５．請求項１の方法であって、更に、前記核酸分子を、前記工程（ｉｉ）の後において前記サンプルを遠心分離にかけることによって回収する工程を有する。６．対象の核酸分子を増幅する方法であって、以下の工程を有する、（ｉ）全細胞含有サンプルを、少なくとも一種類の溶解緩衝液と接触させて核酸含有細胞を溶解させる工程、（ｉｉ）前記サンプルに対して、以下の式で表される少なくとも２つのストランドを有する非水溶性架橋化ポリヒドロキシポリカルボン酸の一定量を添加する工程ここで、各ストランドにおけるその少なくとも１つのマレオイルモエティの１つのカルボニル基が、 −ＨＮ［（Ｈ）_p（ＣＨ）₂（ＯＨ）_m］ＮＨ−モエティに共有結合して、その中で以下の式の少なくとも１つの架橋化モエティを作り出す、ここで、Ｒは水素または低級アルキレン又は炭素元素１〜４の低級アルコキシ、又はフェニールであり、ｚは、１〜４の整数、ｐは０又はｚ−１までの整数、ｍは１またはｚまでの整数であるものにおいて、ポリ（アルキレン炭酸）ストランドへの架橋の比率が１と約２００から２までの間であり、前記サンプル中のすべてのタンパク質を隔離するのに十分なものである、（ｉｉｉ）前記サンプル中の核酸を回収する工程、ここで、この回収は、アルコール沈澱なしで行われる、そして（ｉｖ）前記核酸に対して、前記対象の核酸分子を特異的に増幅する増幅試薬を添加する工程。７．請求項６の方法であって、前記増幅試薬は、少なくとも１対のプライマと核酸ポリメラーゼとを有する。８．請求項７の方法であって、前記核酸はＤＮＡである。９．請求項８の方法であって、前記核酸は、サームスアクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼである。１０．核酸含有細胞から核酸を回収するためのキットであって、以下のそれぞれについて各別のポーションを収納するように構成された容器手段を有する、（ｉ）溶解緩衝液、および（ｉｉ）下記式の化合物のサンプル、ここで，各ストランドにおけるその少なくとも１つのモレオイルモエティの１つのカルボニル基が、 −ＨＮ［（Ｈ）_p（ＣＨ）₂（ＯＨ）_m］ＮＨ−モエティに共有結合して、その中で下記式の少なくとも１つの架橋化モエティを作り出す、ここで、Ｒは水素または低級アルキレン又は炭素元素１〜４の低級アルコキシ、又はフェニールであり、ｚは１〜４の整数、ｐは０又はｚ−１までの整数、ｍは１またはｚまでの整数であるものにおいて、ポリ（アルキレン炭酸）ストランドへの架橋の比率が１と約２００から２までの間である。１１．請求項１０のキットであって、前記溶解緩衝液は赤血球細胞溶解緩衝液であり、前記キットは、更に、白血球細胞用の第２の溶解緩衝液を有する。１２．請求項１０のキットであって、更に、（ｉｉｉ）核酸増幅試薬、を有する。１３．核酸増幅のために全細胞含有サンプルを調製する方法であって、以下の工程を有する、（ｉ）前記全細胞含有サンプルを、ドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶解緩衝液と接触させる工程、そして（ｉｉ）前記サンプルに対して、非フェニール基含有非イオン界面活性剤を、ドデシル硫酸ナトリウムの酵素抑制効果を抑制するのに十分な量だけ添加する工程。１４．請求項１３の方法であっいて、前記非イオン界面活性剤はＴｗｅｅｎ２０である。１５．請求項１３の方法であって、更に、前記サンプルを工程（ｉ）の後において、約５０℃〜約７０℃の温度で、少なくとも１分間、加熱する工程を有する。１６．対象の核酸分子を増幅する方法であって、以下の工程を有する、（ｉ）前記全細胞含有サンプルを、ドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶解緩衝液と接触させる工程、（ｉｉ）前記サンプルに対して、非フェニール基含有非イオン界面活性剤を、ドデシル硫酸ナトリウムの酵素抑制効果を抑制するのに十分な量だけ添加する工程、そして（ｉｉｉ）前記サンプルに対して、前記対象核酸分子を増幅させるための増幅試薬を添加する工程。１７．請求項１６の方法であって、前記増幅試薬は、少なくとも２つのプライマとＤＮＡポリメラーゼとを有する。１８．核酸含有細胞から核酸を回収するのに有用なキットであって、以下のそれぞれについて別々のポーションを収納するように構成された容器手段を有する、（ｉ）ドデシル硫酸ナトリウム含有溶解緩衝液、そして（ｉｉ）非フェニール基含有非イオン界面活性剤のサンプル。１９．請求項１８のキットであって、前記非イオン界面活性剤はＴｗｅｅｎ２０である。２０．請求項１８のキットであって、更に、増幅試薬を有する。