JPH10506289A - ２の治療的遺伝子：自殺性および免疫刺激性遺伝子を含むアデノウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規なアデノウイルス由来のウイルスベクター、その製法、および遺伝子治療におけるその使用。特に、２の治療的遺伝子、すなわち、自殺遺伝子および免疫刺激もしくは腫瘍−サプレッサー遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ２の治療的遺伝子：自殺性および免疫刺激性 遺伝子を含むアデノウイルス 本発明は、新しいウイルスベクター、その製法および遺伝子治療におけるその 使用に関する。また、本発明は、該ウイルスベクターを含有する医薬組成物に関 する。さらに詳しくは、本発明は、遺伝子治療のためのベクターとしての組換え アデノウイルスに関する。 遺伝子治療は、遺伝子情報を患部の器官または細胞に導入することによって欠 陥または異常性（突然変異、異常発現等）を矯正することからなる。この遺伝情 報は、器官から抽出された細胞にイン・ビトロで導入して、該修飾された細胞は 次いで身体に再度導入されるか、あるいはイン・ビボで適当な組織に直接導入さ れる。この第２の場合、ＤＮＡおよびＤＥＡＥ−デクストラン（Ｐａｇａｎｏら 、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７（８９１）の複合体、ＤＮＡおよび核タンパク 質の複合体（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３(１９８９)３７５）、ＤＮ Ａおよび脂質の複合体（Ｆｅｌｇｎｅｒら、ＰＮＡＳ８４（１９８７）７４１３ ）、およびリポソームの使用（Ｆｒａｌ ｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）１０４３１）に関する種 々のトランスフェクション技術には、異なる技術が存在する。より最近では、こ れらの物理的トランスフェクション技術の替わりに期待されるものとして、遺伝 子の移入用ベクターとしてのウイルスの使用が出現した。これに関し、異なるウ イルスが、ある細胞集団を感染するその能力につきテストされてきた。特に、レ トロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳ等）、ＨＳＶウイルス、アデノ−関連ウ イルスおよびアデノウイルスである。 これらのウイルスのうち、アデノウイルスは遺伝子治療での使用に有利なある 種の特性を示す。特に、それらは、かなり広い宿主スペクトルを有し、静止期細 胞を感染でき、感染細胞のゲノムに組み込まれた状態とはならず、これまでヒト における主要疾患に関連してこなかった。アデノウイルスは、サイズが約３６ｋ ｂの線状二本鎖ＤＮＡを持つウイルスである。そのゲノムは、特に、その端部の 逆方向反復配列（ＩＴＲ）、カプセル化配列、初期遺伝子および後記遺伝子（図 １参照）を含む。主要初期遺伝子はＥ１（Ｅ１ａおよびＥ１ｂ）、Ｅ２、Ｅ３お よびＥ４遺伝子である。主要後記遺伝子はＬ１〜Ｌ５遺伝子で ある。 アデノウイルスの前記特性が与えられれば、それらは、イン・ビボで遺伝子の 導入で既に使用されてきた。この目的では、異なるアデノウイルス−由来ベクタ ーが調製され、異なる遺伝子に組み込まれた（β−ｇａｌ、ＯＴＣ、α−１ＡＴ 、サイトカイン等）。これらの各構築体において、アデノウイルスは、感染細胞 で複製できないようにするために修飾されてきた。かくして、先行技術で記載さ れている構築体は領域Ｅ１（Ｅ１ａおよび／またはＥ１ｂ）および所望により、 異種ＤＮＡ配列が挿入されるレベルでのＥ３を欠失したアデノウイルスである（ Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ１０１(１９９１)１９５； Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏ ｕｄｈｕｒｙら、Ｇｅｎｅ５０（１９８６）１６１）。 本発明は、遺伝子治療適用に特に効果的な新しいアデノウイルス−由来ベクタ ーに関する。さらに詳しくは、本発明は、部分的には、注目するいくつかの遺伝 子をアデノウイルスに導入して、感染細胞でこれらの異なる遺伝子の実質的発現 を得ることができるという証明の結果である。また、本発明は、その最適発現を 可能とする条件下で、いくつかの治療遺伝子を組み込 むことができるアデノウイルスベクターの構築の結果である。さらに、本発明は 、相補的治療遺伝子の、同一標的細胞における共発現に関連した、本発明のベク ターの相乗的効果の証明に由来する。かくして、本発明は、遺伝子または細胞の 治療でその使用が完全に有利である治療特性を呈するウイルスベクターを提供す る。特に、本発明のベクターは、細胞過剰増殖（癌、再狭窄）のエピソードでの 疾患の治療で使用するのに完全に有利である特性を示す。 本発明の最初の主題は、２の治療的遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスに 関し、ここに、該治療的遺伝子の一方は自殺遺伝子であって、他方は免疫刺激も しくは腫瘍−サプレッサー遺伝子である。出願人は、事実、同一標的細胞におけ るかかる遺伝子の同時共発現は、これらの遺伝子単独または別途導入によって得 られる効果よりもかなり大きい特に有利な治療的抗腫瘍効果を生じることを示し た。 本発明の枠内で使用される治療的遺伝子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ ）または、例えば、１以上のイントロンが挿入され得るｃＤＮＡからなるハイブ リッド構築体であり得る。また、それらは、合成または半合成配列であり得る。 特に有利 には、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡを使用する。 本発明によりアデノウイルスベクターに組み込まれた２の治療的遺伝子は異な る方法で配置できる。 まず、それらは、単一の転写体（entity）を構成する。この配置では、２の遺 伝子は連続的であり、単一のプロモーターの制御下に置かれ、単一のプレメッセ ンジャーＲＮＡを生起する。この配置は、唯一の転写プロモーターを使用するの が可能なので有利である。 ２の治療的遺伝子は別々の転写プロモーターの制御下に置くこともできる。こ の配置は高発現レベルを得ることができ、遺伝子発現の良好な制御を提供する。 この場合、２の治療的遺伝子は、アデノウイルスゲノムの同一部位または異なる 部位に、同一の向きに挿入することができるか、あるいは逆向きに挿入すること ができる。 自殺遺伝子としては、その発現産物が細胞に治療剤に対する感受性を与える遺 伝子が好ましく使用される。より好ましくは、自殺遺伝子はチミジンキナーゼで あり、その発現産物は哺乳動物細胞に、ガンシクロビール（ｇａｎｃｉｃｌｏｖ ｉｒ）およびアシクロビール（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）のごときある種の治 療剤に関する感受性を付与する。単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼはアシクロ ビール（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）およびガンシクロビール（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉ ｒ）のごときヌクレオシド類似体をリン酸化できる。これらの修飾された分子は 、伸長されつつあるＤＮＡ鎖に取り込むことができ、その結果、ＤＮＡ合成が停 止され、細胞の死減を引き起こす（Ｆ．Ｌ．Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒ ｅｓ．４６（１９８６）５２７６）。かくして、この戦略は、自殺遺伝子を発現 する細胞を特異的に排除するのを可能とする。さらに、ＤＮＡ合成は毒性の標的 であり、分裂している細胞のみが影響される。 より好ましくは、ヒト単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ｈＴＫ、Ｈ ＳＶ−１）を本発明の枠内で使用する。この遺伝子の配列は文献に記載されてい る（特に、ＭｃＫｎｉｇｈｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ ８（１９ ８０）５９３１参照）。また、より大きい基質特異性および良好なキナーゼ活性 を有するこの配列の誘導体を使用することもできる。かかる誘導体は、特に、前 記したごとき結合部位のレベルでの突然変異誘発によって得ることができる（Ｂ ａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１９９０） ２９７９；Ｍｕｎｉｒら、ＪＢＣ ２６７（１９９２）６５８４）。 また、その発現産物が、哺乳動物細胞にニトロ芳香族産物に対する感受性を付 与するニトロレダクターゼまたは５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）に対する感 受性を哺乳動物細胞に付与するシトシンデアミナーゼを使用することもできる（ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１９９１）４１２６）。 前記したごとく、自殺遺伝子を免疫刺激または腫瘍サプレッサー遺伝子と組み 合わせるのが最も有利である。これに関し、免疫刺激遺伝子は、その発現産物が 身体の防御を刺激できるいずれの遺伝子であってもよい。好ましくは、特にリン ホカイン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１２）のごときサイトカイン、インターフェロン（ アルファ、ベータ等）、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ− ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ等）等をコードする遺伝子である。なおさらに好ま しくは、インターロイキン−２またはＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子である。 インターロイキン−２は、抗原、特に腫瘍抗原の存在に応答して、リンパ球によ って実質的に合成される。次いで、それは、細胞毒性Ｔおよびキラー（ＮＫ）細 胞の局所的活性化によって、 これらの抗原に対する免疫応答の発生に作用する。かくして、このリンホカイン は抗腫瘍免疫性で主要な役割を演じる。本発明のベクターによって、今や、イン ターロイキン−２の、およびチミジンキナーゼ遺伝子のごとき自殺遺伝子の、同 一腫瘍細胞における、同時発現から得られる相乗的抗腫瘍効果を得ることができ る。 ＧＭ−ＣＳＦは顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子である。従って 、それは、これらの免疫細胞の増殖を刺激し、従って、免疫防御を補強できる。 ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子およびｃＤＮＡは文献に記載されている。自殺遺伝子と一緒 の、本発明のベクターにおけるその共発現は高い相乗的抗腫瘍効果を生じる。 本発明の枠内で使用できる腫瘍−サプレッサー遺伝子の中には、特にｐ５３、 Ｒｂ、ｒａｐ １Ａ、ＤＤＣ、ＷＡＦおよびＭＴＳ遺伝子を挙げることができる 。より好ましくは、ｐ５３またはＲｂ遺伝子を用いる。 ｐ５３遺伝子は５３ｋＤａの核タンパク質をコードする。欠失および／または 突然変異によって突然変異するこの遺伝子の形態はほとんどのヒト癌の発生に関 与する（Ｂａｋｅｒら、 Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４（１９８９）２１７）。また、その突然変異形態はｒａｓ オンコジーンと共働してネズミ繊維芽細胞を形質転換することもできる。天然ｐ ５３をコードする野生型遺伝子は、他方、種々の組合せのオンコジーンで形質転 換された齧歯類繊維芽細胞における形質転換のフォーカスの形成を阻害する。最 近のデータは、ｐ５３遺伝子はそれ自体他の腫瘍−サプレッサー遺伝子を刺激で きるのではないかと強調している。さらに、血管小筋肉細胞の増殖に対するｐ５ ３の効果が最近示されている（Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ１５１（１９ ９４））。 Ｒｂ遺伝子は、その機能が、休止相へのその侵入を引き起こす細胞の分裂を抑 制すべき約９２７アミノ酸（Ｆｒｉｅｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ３２３（１９８６） ６４３）の核リンタンパク質の合成を決定する。Ｒｂ遺伝子の不活性形態は、異 なる腫瘍で、特に網膜芽細胞腫および骨肉腫のごとき間葉癌で考えられてきた。 この遺伝子の、それが不活化された腫瘍細胞への再導入は、正常状態への復帰お よび腫瘍形成の喪失を生じる（Ｈｕａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２（１９８８ ）１５６３）。最近、正常Ｒｂタンパク質（その突然変異形態ではなく）はプロ トーオ ンコジーンｃ−ｆｏｓ（細胞増殖に必須の遺伝子）の発現を抑制することが示さ れた。 ＷＡＦおよびＭＴＳ遺伝子およびその抗腫瘍特性は文献に記載されている（Ｃ ｅｌｌ７５（１９９３）８１７；Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４（１９９４）４３６）。 特に好ましい具体例において、本発明は、チミジンキナーゼをコードする遺伝 子および腫瘍−サプレッサー遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスに関する。 より好ましくは、本発明は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする遺 伝子および野生型ｐ５３遺伝子を含むアデノウイルス（Ａｄ−ＴＫ−ｐ５３）に 関する。特に有利には、２の遺伝子は、別々のプロモーター、好ましくはＨＳＶ ウイルスＬＴＲプロモーターの制御下に置く。なおさらに好ましくは、２の遺伝 子はアデノウイルスゲノムのＥ１領域のレベルにおいて挿入する。 もう１つの特に好ましい具体例において、本発明は、チミジンキナーゼをコー ドする遺伝子およびリンホカインをコードする遺伝子を含む欠陥組換えアデノウ イルスに関する。より好ましくは、本発明は、ヘルペスウイルスチミジンキナー ゼをコードする遺伝子およびインターロイキン−２をコードする遺伝子 を含むアデノウイルス（Ａｄ−ＴＫ−ＩＬ２）またはヘルペスウイルスチミジン キナーゼをコードする遺伝子およびＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含むアデ ノウイルス（Ａｄ−ＴＫ−ＧＭ−ＣＳＦ）に関する。特に有利には、２の遺伝子 は別々のプロモーター、好ましくはＨＳＶウイルスＬＴＲプロモーターの制御下 に置く。なおさらに好ましくは、２の遺伝子はアデノウイルスゲノムのＥ１領域 のレベルにおいて挿入される。 本発明の枠内で使用される転写プロモーターに関しては、それらは、感染細胞 で機能できる場合に考えられる治療的遺伝子の発現を天然で担うプロモーターで あり得る。それらは、（他のタンパク質または合成タンパク質でさえ発現を担う ）異なる起源の配列であり得る。特に、それらは、哺乳動物、真核生物またはウ イルス遺伝子の配列であり得る。例えば、それらは、感染させるのが望まれる細 胞のゲノムに由来するプロモーター配列であり得る。同様に、それらは、使用す るアデノウイルスを含めた、ウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列であ り得る。これに関し、例えば、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶおよびＲＳＶ遺伝子等の プロモーターを挙げることができる。加えて、これらの発現配列は、組織−特異 的発現を可能とする配列の活 性化および調節配列の付加によって修飾することができる。さらに、挿入された 遺伝子が発現配列を含有しない場合は、それはかかる配列の下流の欠陥ウイルス のゲノムに挿入できる。本発明のベクターを産生する好ましいプロモーターは、 ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（ＬＴＲ−ＲＳＶ）よりなる。他の特に好ましいプロ モーターは、増殖または癌細胞に特異的なプロモーターである。これらのプロモ ーターは、事実、規定細胞集団に対して治療効果を標的化できる。 本発明の好ましい具体例において、発現シグナルは、腫瘍の原因となるまたは それに関するウイルスの存在によって誘導されるか、またはその存在下で活性で ある。なおさらに好ましくは、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）によっ て、またはパピローマウイルスによって誘導可能な発現ウイルスは本発明の枠内 で使用される。 エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）は、２つのタイプのヒト癌：バーキ ットリンパ腫および鼻咽頭の癌に関連する。ＥＢＶによって誘導可能なプロモー ターの制御下にある毒性遺伝子よりなる組換えアデノウイルスの使用は、鼻咽頭 の腫瘍細胞においてこの毒性遺伝子を特異的発現させる。鼻咽頭の癌の バイオプシーにおいて、単一の核抗原は規則的に存在するＥＢＮＡ１であり、こ れは、ＥＢＶによって感染される細胞におけるウイルスゲノムを潜伏期に維持す ることに関連し、これはＢＣＲ２ウイルスプロモーターをトラント活性化する。 従って、本発明の特別の主題は、ＥＢＮＡ１応答的配列（ＥＢＮＡ１−ＲＥ）の 、鼻咽頭の癌細胞における遺伝子の特異的発現のための使用にある。特に、本発 明は、もう１つのウイルスプロモーター（末端タンパク質１（ＴＰ１）のための 遺伝子のプロモーター）の上流で使用されるＥＢＮＡ１応答的配列からなるキメ ラプロモーターを発現シグナルとして含んでなるアデノウイルスに関する。本出 願で記載される例は、明らかに、このキメラプロモーターはＥＢＮＡ１によって 誘導可能であることを示す。 パピローマウイルス（特にＨＰＶ１６および１８ウイルス）は、婦人の子宮癌 の９０％を担い、前癌表皮細胞病巣で同定されている（Ｒｉｏｕら、Ｌａｎｃｅ ｔ３３５（１９９０）１１７）。Ｅ６遺伝子の産物は、ＨＰＶ−陽性細胞におい て、野生型ｐ５３、抗−オンコジーンの量を実質的に減少させることによって、 腫瘍の形成に導く（Ｗｒｅｄｅら、Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．４（１９９１） １７１）。ＨＰＶ（例えば、 Ｅ６タンパク質）によって誘導可能なプロモーターの制御下にある毒性遺伝子か らなる組換えアデノウイルスの使用は、対応する腫瘍細胞にいてこの毒性遺伝子 を特異的に発現させる。 発現シグナルは、さらに、正常細胞で不活性であり得、腫瘍細胞で活性であり 得る。特に、本発明の枠内で、α−フェトプロテインのプロモーター（Ａｌｐｅ ｒｔ Ｅ．，ｄａｎｓ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｏｋｕｄａ ＆ Ｐｅｔｅｒｓ（編），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６，３５３） またはＩＧＦ−ＩＩのＰ３プロモーター（Ｓｕｓｓｅｎｂａｃｈら、Ｇｒｏｗｔ ｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ２（１９９１）１）を使用することができ、これら は成体で、特に悪性肝癌でのみ活性である。また、ホルモン−依存的またはホル モン−関連腫瘍の場合には、ホルモンによって誘導できるプロモーターを使用す ることもできる（例えば、乳癌または前立腺腫瘍）。 前記したごとく、本発明のベクターの生産では異なる配置が考えられる。まず 、本発明のベクターは単一の転写体(transcriptional entity)の形態である２の 遺伝子を含有することができる。この配置では、２の遺伝子は隣接し、単一のプ ロモー ターの制御下に置かれ、単一のプレメッセンジャーＲＮＡを生起する。その配置 は、単一の転写プロモーターを使用して２の遺伝子の発現を調節できるので有利 である。さらに、この単一転写体は、２つの可能な向きでアデノウイルスベクタ ーに組み込むことができる。 また、２の遺伝子を別々の転写プロモーターの制御下に置くこともできる。こ の配置は、高発現レベルを得ることができ、遺伝子発現の良好な制御を提供する 。この場合、２の治療的遺伝子は同一の向きで、あるいは逆の向きで、アデノウ イルスゲノムの同一部位または異なる部位に挿入できる。 好ましくは、該遺伝子は、少なくとも部分的には、アデノウイルスゲノムのＥ １、Ｅ３またはＥ４領域のレベルで挿入される。それらを２つの異なる部位に挿 入する場合は、Ｅ１およびＥ３またはＥ１およびＥ４領域の使用は本発明の枠内 のものである。特に有利な具体例は、２の治療的遺伝子がＥ１領域のレベルで挿 入されるものである。その例は、事実、この挿入は、２つの間の干渉なくして、 ２の遺伝子の高い発現を可能とすることを示す。従って、本発明は、ゲノムのＥ １領域のレベルにおいて挿入された注目する２の治療的遺伝子に関する。 さらに、また、免疫刺激遺伝は、標的細胞の分泌経路において合成される産物 に向けられるシグナル配列を含む。このシグナル配列は免疫刺激産物の天然シグ ナル配列であってもよいが、いずれの他の機能的シグナル配列または人工的シグ ナル配列のいずれであってもよい。 前記したごとく、本発明のアデノウイルスは欠陥(defective)があり、すなわ ち、それらは標的細胞では自律的に複製できない。一般に、本発明による欠陥ア デノウイルスのゲノムは、少なくとも、感染細胞における該ウイルスの複製のた めに必要な配列を欠く。これらの領域は（完全にまたは部分的に）除去されてい てもよく、あるいは非機能的にされていてもよく、あるいは他の配列によって、 または治療的遺伝子によって置き換えられていてもよい。本発明のアデノウイル スの欠陥特性は重要な要素である。というのは、それは投与後に本発明のベクタ ーの非散在を確実とするからである。 好ましい具体例において、本発明のアデノウイルスは、ＩＴＲ配列およびカプ セル化(encapsidation)を可能とする配列を含み、Ｅ１遺伝子の全部または一部 の欠失を有する。 逆方向反復配列（ＩＴＲ）はアデノウイルスの複製起点を構 成する。それらはウイルスゲノムの３’および５’末端の間に位置し（図１参照 ）、それから、当業者に公知の通常の分子生物学技術によって容易に単離される 。ヒトアデノウイルス（特に、Ａｄ２およびＡｄ５セロタイプ）のＩＴＲ配列の ヌクレオチド配列は文献に記載されており、イヌアデノウイルス（特に、ＣＡＶ １およびＣＡＶ２）も同様である。例えばＡｄ５アデノウイルスに関しては、左 側ＩＴＲ配列はゲノムの１〜１０３ヌクレオチドに対応する。 カプセル化配列（Ｐｓｉ配列とも言われる）は、ウイルスＤＮＡのカプセル化 に必要である。従って、この領域は、本発明の欠陥組換えアデノウイルスの調製 を行うのに存在させなければならない。カプセル化配列はアデノウイルスゲノム に、左側（５’）ＩＴＲおよびＥ１遺伝子の間に存在する（図１参照）。それは 、通常の分子生物学技術によって単離できるか、あるいは人工的に合成できる。 ヒトアデノウイルス（特に、Ａｄ２およびＡｄ５セロタイプ）のカプセル化配列 のヌクレオチド配列は文献に記載されており、イヌアデノウイルス（特に、ＣＡ Ｖ１およびＣＡＶ２）も同様である。例えば、Ａｄ５アデノウイルスに関しては 、カプセル化配列はゲノムのヌクレオチド １９４〜３５８を含む領域に対応する。 より好ましくは、本発明のアデノウイルスはＩＴＲ配列およびカプセル化を可 能とする配列を含み、Ｅ１およびＥ４遺伝子の全部または一部の欠失を有する。 より好ましい具体例において、本発明のアデノウイルスのゲノムは、Ｅ１、Ｅ ３およびＥ４遺伝子の全部または一部、なおさらに好ましくは、Ｅ１、Ｅ３、Ｌ ５およびＥ４遺伝子の全部または一部を欠失している。 本発明のアデノウイルスは、広範な起源のアデノウイルスから調製できる。事 実、異なるアデノウイルスセロタイプがあり、その構造および特性はいくぶん変 化するが、匹敵する遺伝的組織を呈する。かくして、本出願に記載する教示は、 いずれのタイプのアデノウイルスについても当業者が容易に追試できるであろう 。 より詳しくは、本発明のアデノウイルスはヒト、動物または混合（ヒトおよび 動物）起源であってもよい。 ヒト起源のアデノウイルスに関しては、グループＣに分類されるものの使用が 好ましい。より好ましくは、異なるヒトアデノウイルスセロタイプのうち、タイ プ２および５のアデノウイ ルス（Ａｄ２またはＡｄ５）の使用が本発明の枠内で好ましい。 前記したごとく、また、本発明のアデノウイルスは動物起源でものであってよ く、あるいは動物起源のアデノウイルスに由来する配列を含むものであってもよ い。出願人は、事実、動物起源のアデノウイルスは高効率でヒト細胞に感染でき 、また、それらはテストされたヒト細胞で増殖できないことを示した（仏国特許 出願９３ ０５９５４参照）。また、出願人は、動物起源のアデノウイルスはヒ ト起源のアデノウイルスによって全くトランス−補足（trans-complemented）さ れず、これは、感染粒子の形成に導くことができるヒトアデノウイルスの存在下 で、組換えおよびイン・ビボでの増殖のいずれの危険も除外する。動物起源のア デノウイルスまたはアデノウイルスの領域の使用は、従って、特に有利である。 というのは、遺伝子治療においてベクターとしてウイルスを使用するのに固有の 危険はより小さくなるからである。 本発明の枠内で使用できる動物起源のアデノウイルスはイヌ、ウシ、ネズミ（ 例えば、Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（１９９０）８１）、 ヒツジ、ブタ、鳥類または類人猿（例えば：ＳＡＶ）起源であってよい。より特 別には、鳥 類アデノウイルスのうちには、例えば株Ｐｈｅｌｐｓ（ＡＴＣＣ ＶＲ−４３２ ）、Ｆｏｎｔｅｓ（ＡＴＣＣ ＶＲ−２８０）、Ｐ７−Ａ（ＡＴＣＣ ＶＲ−８ ２７）、ＩＢＨ−２Ａ（ＡＴＣＣ ＶＲ−８２８）、Ｊ２−Ａ（ＡＴＣＣ ＶＲ −８２９）、Ｔ８−Ａ（ＡＴＣＣ ＶＲ−８３０）、Ｋ−１１（ＡＴＣＣ ＶＲ −９２１）または参照株ＡＴＣＣ ＶＲ−８３１〜８３５のようなＡＴＣＣで入 手可能なセロタイプ１ないし１０が挙げられる。ウシアデノウイルスのうちでは 、公知の異なるセロタイプ、特に、参照ＡＴＣＣ ＶＲ−３１３、３１４、６３ ９−６４２、７６８および７６９の下でＡＴＣＣで入手できるもの（タイプ１〜 ８）を使用できる。また、ネズミアデノウイルスＦＬ（ＡＴＣＣ ＶＲ−５５０ ）およびＥ２０３０８（ＡＴＣＣ ＶＲ−５２８）、ヒツジアデノウイルスタイ プ５（ＡＴＣＣ ＶＲ−１３４３）またはタイプ６（ＡＴＣＣ Ｒ−１３４０） ；ブタアデノウイルス（５３５９）、または特に番号ＶＲ−５９１−５９４、９ ４１−９４３、１９５−２０３等の下でＡＴＣＣで参照されるアデノウイルスの ようなシミアンアデノウイルスが挙げられる。 好ましくは、動物起源の異なるアデノウイルスのうちには、 イヌ起源のアデノウイルスまたはアデノウイルスの領域、特にすべてのＣＡＶ２ アデノウイルス株［例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株（ＡＴＣ Ｃ ＶＲ−８００）］が本発明の枠内で使用される。イヌアデノウイルスは多数 の構造的研究の主題であった。かくして、ＣＡＶ１およびＣＡＶ２アデノウイル スの完全な制限地図は先行技術で記載されており（Ｓｐｉｂｅｙら、Ｊ．Ｇｅｎ ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９８９）１６５）、Ｅ１ａおよびＥ３遺伝子ならびにＩ ＴＲ配列はクローン化され、配列決定されている（特に、Ｓｐｉｂｅｙら、Ｖｉ ｒｕｓ Ｒｅｓ．１４（１９８９）２４１；Ｌｉｎｎｅ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． ２３（１９９２）１１９，ＷＯ ９１／１１５３５参照）。 本発明の欠陥組換えアデノウイルスは種々の方法で調製できる。 第１の方法は、イン・ビトロで調製された欠陥組換えウイルスのＤＮＡ（連結 によるまたはプラスミド形態による）をコンピテント細胞系（すなわち、欠陥ウ イルスの相補性(Complementation)に必要な全ての機能をトランス(intrans)にて 担う）へトランスフェクトすることよりなる。これらの機能は好ましくは細胞の ゲノムに組み込まれ、これは組換えの危険 み込まれ、これは組換えの危険性を回避することを可能とし、増大した安定性を 細胞系に与える。 第２のアプローチは、イン・ビトロで調製した欠陥組換えウイルスからのＤＮ Ａ（連結またはプラスミド形態による）、およびヘルパーウイルスからのＤＮＡ を適当な細胞系に共トランスフェクトすることからなる。本発明によると、組換 えアデノウイルスのすべての欠陥機能を補足できるコンピテント細胞系を有する 必要はない。これらの機能の一部は、事実、ヘルパーウイルスによって補足され る。このヘルパーウイルスは、それ自体、欠陥があり、細胞系がその補足のため に必要な機能をトランスにて担持する。特に第２のアプローチの意味で使用でき る細胞系には、特にヒト胚系２９３、ＫＢ細胞、細胞Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＧＨ Ｋ等（実施例参照）が挙げることができる。 次に、増殖したベクターを回収し、精製し、通常の分子生物学的技術に従って 増幅する。 変形した具体例では、連結またはプラスミド形成のいずれかによって、適当な 欠失および２の治療的遺伝子を担持する欠陥組換えウイルスＤＮＡをイン・ビト ロで調製することができる。前記したごとく、本発明のベクターは、有利には、 あるウイル ス遺伝子、特にＥ１、Ｅ３、Ｅ４および／またはＬ５遺伝子の全部または一部の 欠失を有する。この欠失は、考えられる遺伝子に影響するいずれのタイプの抑制 にも対応できる。それは、特に、該遺伝子の暗号配列の全てまたは一部、および ／または該遺伝子の転写プロモーター領域の全部または一部の抑制であり得る。 抑制は、一般に、実施例に示すごとく、分子生物学技術に従い、例えば、適当な 制限酵素による消化、次いで、連結によって欠陥組換えウイルスＤＮＡに対して 生じる。次いで、選択された領域のレベルにて、かつ選択した向きにて、治療的 遺伝子を、酵素切断、次いで連結によってこのＤＮＡに挿入できる。 かくして得られたＤＮＡ（従って、適当な欠失および２の治療的遺伝子を担持 する）は、該欠失および治療的遺伝子を担持する欠陥組換えアデノウイルスが直 接生じるのを可能とする。この第１の変形は、特に、治療的遺伝子が別々のプロ モーターの制御下にある単一転写単位（unit）の形態で配置され、ゲノムの同一 部位に挿入された組換えアデノウイルスの生産に適用される。 また、２段階で組換えウイルスを調製することも可能であり、 ２の治療的遺伝子の連続的導入を可能とする。かくして、適当な欠失（または該 欠失の一部）および治療的遺伝子の１つを担持する第１の組換えウィルスからの ＤＮＡは、連結またはプラスミド形態で構築される。次いで、このＤＮＡを使用 して、該欠失および治療的遺伝子を担持する第１の組換えウイルスを得る。次い で、この第１のウイルスからのＤＮＡを単離し、第２のプラスミドまたは第２の 治療的遺伝子、適当な欠失（第１のウイルス上に存在しない一部）、および相同 組換えを可能とする領域を担持する第２の欠陥組換えウイルスからのＤＮＡで共 トランスフェクトする。かくして、この第２の段階で、２の治療的遺伝子を担持 する欠陥組換えウイルスが生じる。この変形調製は、特に、アデノウイルスゲノ ムの２の異なる領域に挿入された２の治療的遺伝子を担持する組換えウイルスの 調製に適する。 また、本発明は、前記した欠陥組換えアデノウイルスを１つ以上を含むいかな る医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻孔内 、静脈内、筋肉内、皮下、眼内または経皮経路等を介する投与用に処方できる。 好ましくは、該医薬組成物は、注射用処方のための医薬上許 容される賦形剤を含有する。それらは、特に、等張滅菌生理食塩水（リン酸一ナ トリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマ グネシウム等、かかる塩の混合物）、または乾燥した、特に、場合に応じての滅 菌水または生理食塩水の添加に際して、注射溶液の調製を可能とする、凍結乾燥 した組成物であってよい。 注射に使用するウイルス用量は、異なるパラメーターに応じて、特に使用する 投与方法、関連する疾患、発現させるべき遺伝子、または治療の望まれる持続に 従って適合させることができる。一般に、本発明の組換えアデノウイルスは１０ ４および１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌの間、好ましくは１０⁶および１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌ の間の用量の形態で投与される。ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）なる語は、ウ イルス溶液の感染性に対応し、適当な細胞培養を感染させ、一般に５日後に感染 した細胞プラークの数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のｐｆ ｕ力価を測定する技術は文献によく記載されている。 本発明のアデノウイルスは、多数の疾患の治療または予防で使用できる。それ らは、関連部位のレベルにおいて直接的注射によって、過剰増殖疾患（癌、再狭 窄）の治療で特に有利であ る。これに関して、本発明は、増殖性細胞またはその一部を前記したアデノウイ ルスベクターで感染させることよりなる増殖性細胞を破壊する方法にも関する。 自殺遺伝子が治療剤に対する感受性を付与する遺伝子である場合、本発明の破壊 方法は、細胞を該治療剤で治療することよりなる。この方法の実施では、本発明 は、自殺遺伝子が治療剤に対する感受性を付与する遺伝子である前記定義の組換 えアデノウイルスからなる産物に関し、該治療剤は、過剰増殖疾患の治療のため の、同時にまたは別々の使用あるいは経時的に別々の使用用の組合せ産物として のものである。さらに詳しくは、自殺遺伝子はチミジンキナーゼ遺伝子であって 、治療剤はガンシクロビールまたはアシクロビールである。 以下の実施例の助けを借りて本発明をさらに詳細に記載し、これは説明のため であって、限定的なものと考えるべきでない。 図面の説明 図１：Ａｄ５アデノウイルスの遺伝的構成。Ａｄ５の完全な配列はデータベー スで入手でき、当業者がいずれの制限部位も選択または創製することができ、か くして、ゲノムのいずれか領域も単離できる。 図２：ＣＡＶ２アデノウイルス、Ｍａｎｈａｔｔａｎ株（Ｓｐｉｂｅｙら、前 記引用）の制限地図。 図３：ベクターｐＯＮＴｔｋの表示。 図４：ベクターｐＲＳＶｔｋの表示。 一般的分子生物学技術 プラスミドＤＮＡの分取抽出、塩化セシウムグラジエント中でのプラスミドＤ ＮＡの遠心、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、電気泳動によるＤ ＮＡ断片の精製、タンパク質のフェノールまたはフェノール−クロロホルム抽出 、生理食塩水媒体中のＤＮＡのエタノールまたはイソプロパノール沈殿、Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等における形質転換のごとき分子生物学で通常使用 される技術は当業者によく知られており、文献で豊富に記載されている［Ｍａｎ ｉａｔｉｓ Ｔ．ら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ，，１９ ８２；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら（編）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｐｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］。 ｐＢＲ３２２およびｐＵＣタイプのプラスミドおよびＭ１３シリーズのファー ジは商業的源からのものである（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。 連結には、供給業者の推奨に従い、ＤＮＡ断片をそのサイズに従ってアガロー スまたはアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、フェノールまたはフェノ ール／クロロホルム混合液で抽出し、エタノールで沈殿させ、次いで、Ｔ４ファ ージＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートする。 突出５’末端の充填は、供給業者の仕様に従い、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメ ラーゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）のクレノウ断片で行うことができる。突出３’末端 の破壊は、製造業者の推奨に従って使用するＴ４ファージＤＮＡポリメラーゼ（ Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で行う。突出５’末端の破壊は、ヌクレアーゼＳ１を 用いた調節処理によって行うことができる。 イン・ビトロ合成オルゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発は、Ａｍｅｒｓｈ ａｍによって供給されているキットを用い、Ｔａｙｌｏｒら［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］によって開発され た方法に 従って行うことができる。 製造業者の仕様に従い、「ＤＮＡサーマルサイクラー」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ ｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い、いわゆるＰＣＲ［ポリメラーゼ−触媒の鎖反応， Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０(１９８５)１３５０−１３５４ ；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．およびＦａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ ｙｍ．１５５(１９８７)３３０−３５０］技術によってＤＮＡ断片の酵素的増幅 を行うことができる。 ヌクレオチド配列の確認は、Ａｍｅｒｓｈａｍによって販売されているキット を用い、Ｓａｎｇｅｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７ ４ (１９７７)５４６３−６４６７］によって開発された方法によって行うことが できる。 使用する細胞系 以下の実施例では、以下の細胞系を使用した、または使用することができる。 −ヒト胚腎臓系２９３（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１ ９７７）５９）。この系は特に、そのゲノムに組み込まれた、ヒトアデノウイル スＡｄ５のゲノムの左側部分を含有する（１２％）。 −ＫＢヒト細胞系：ヒト表皮癌に由来するもので、この系ならびにその培養を 可能とする条件はＡＴＣＣ（参照ＣＣＬ１７）で入手できる。 −Ｈｅｌａヒト細胞系：ヒト上皮癌に由来するもので、この株ならびにその培 養を可能とする条件はＡＴＣＣ（参照ＣＣＬ２）で入手できる。 −ＭＤＣＫイヌ細胞系：ＭＤＣＫ細胞の培養条件は特にＭａｃａｔｎｅｙら、 Ｓｃｉｅｎｃｅ４４（１９８８）９によって記載されている。 −ｇｍＤＢＰ６細胞系（Ｂｒｏｕｇｈら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９０（１９９２ ）６２４）。この系はＭＭＴＶ ＬＴＲの制御下にあるアデノウイルスＥ２遺伝 子を担持するＨｅｌａ細胞よりなる。 実施例 実施例１ 癌−特異的プロモーターの制御下にあるＴＫ遺伝子およびＣＭＶプロモーターの 制御下にあるｐ５３遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスの構築 これらのアデノウイルスは、Ａｄ５アデノウイルスの左側部 分、２の治療的遺伝子およびＡｄ５アデノウイルスの領域（ＩＸタンパク質に対 応）を担持するプラスミドと、異なる欠失を担持する欠陥アデノウイルスからの ＤＮＡとの間の相同組換えによって構築した。 １．ベクターｐＯＮＴ−ｔｋの構築 １．１ プラスミドｐ７ｔｋ１の構築 本実施例は、多重クローニング部位に挿入された、１１３１塩基対（ＡＴＧ１ １４−１１６および停止コドンＴＧＡ１２４２−１２４４）のｔｋ遺伝子のオー プンリーディングフレームを含有するプラスミドｐ７ｔｋ１の構築を記載する。 単純疱疹ウイルスタイプ１チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含有するＢｇＩ ＩＩ−ＮｃｏＩ断片をプラスミドｐＨＳＶ−１９６（ＧｏｂｃｐＢＲＬによって 市販）から単離し、クレノウ断片の作用によって修復し、次いで、プラスミドｐ ＧＥＭ７ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａによって市販）のＳｍａＩ部位に挿入した 。ＳｍａＩおよびＢｇＩＩＩ部位はこの工程の間に破壊され、ＮｃｏＩ部位は保 存される。 得られたプラスミドはｐ７ｔｋ１と命名した。 １．２．プラスミドｐＯＮＴ１の構築 本実施例は、ＥＢＮＡ１抗原のトランス活性化およびＥＢＶウイルスのＴＰ１ プロモーターのトランス活性化に必要な配列からなるキメラプロモーターを含有 するプラスミドの構築を記載する。 ＥＢＶウイルスのＥｃｏＲＩ（７３１５）−ＳｍａＩ（８１９１）断片を株Ｂ ９５−８から単離した。ＥＢＶウイルスの完全配列はＢａｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３１０（１９８４）２０７）によって記載されている。この断片は核抗原１（ ＥＢＮＡ１）（Ｄ．Ｒｅｉｓｍａｎ ＆ Ｂ．Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６，Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６ ｐｐ ．３８３８−３８４６）によるトランス−活性化に必要な配列を含有する。次い で、この断片を、ＴＰ１プロモーターを含有する、ＥＢＶ Ｂ９５−８（Ｐｓｔ Ｉ部位はＴ４ポリメラーゼで消化した）のＮｒｕＩ（１６６ ２４１）−Ｐｓｔ Ｉ（１６６ ５５９）断片に融合させた。次いで、かく得られたキメラプロモー ターをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫの多重クローニング部位 に挿入した。 得られたプラスミドをｐＯＮＴ１と命名した。 １．３．プラスミドｐＯＢＴｔｋの構築 プラスミドｐＯＢＴｔｋは、プラスミドｐＯＮＴ１にクローン化したキメラプ ロモーターＥＢＮＡ１−ＲＥ／ＴＰ１の制御下にあるプラスミドｐ７ｔｋ１にク ローン化した単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子からなる。 このプラスミドを構築するために、ＥＢＮＡ−１およびＥＢＮＡ−２によって トランス活性化されるキメラプロモーターを含有するｐＯＮＴ１のＢａｍＨＩ− ＸｈｏＩ断片、およびｔｋオープンリーディングフレームを含有するｐ７ｔｋ１ のＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断片をプラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβｇａｌのＢａｍＨＩ（ ４７８）およびＣｌａＩ（４５５０）部位にクローン化した。プラスミドｐＡｄ ．ＲＳＶβＧａｌは、５’→３’の向きに、 −ＩＴＲ配列、複製起点、カプセル化およびエンハンサーシグナルＥ１Ａを含 むＡｄ５アデノウイルスの左側末端に対応するＰｖｕＩＩ断片； −ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）の制御下にあるβ−ガラクトシ ダーゼをコードする遺伝子、 −プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβＧａｌおよびアデノウイルス ｄ１３２４の間の相同組換えを可能とするＡｄ５アデノウイルスゲノムの第２断 片； を含有する。プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβＧａｌはＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒ ｒｉｃａｕｄｅｔら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６） によって記載されている。 すべてのクローニング部位は保存されている。得られたプラスミドをｐＯＮＴ ｔｋと命名した（図３）。 ２．プラスミドｐＯＮＴｔｋＣＭｖｐ５３の構築 本実施例は、Ａｄ５アデノウイルスの左側部分（左側ＩＴＲ、カプセル化領域 およびＥ１領域の開始からなる）、ＯＮＴプロモーターの制御下にあるｔｋ遺伝 子、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるｐ５３遺伝子および組換えアデノウイル スの創製のための相同組換えを可能とするＡｄ５ゲノムの第２断片（ｐＩＸタン パク質）を担持するベクターの構築を記載する（実施例１．３参照）。 このプラスミドは、ｔｋ遺伝子の下流に、ＣＭＶプロモーターの制御下にある ｐ５３遺伝子を担う断片、続いてＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化部位を同一 向きに挿入することによって構築した。さらに詳しくは、挿入された断片は以下 のものを 含む。 −サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターに対応するウイルス起源 のプロモーター領域。この領域は、ベクターにおいて、ＣＭＶ／ｐＯＮＴｔｋ結 合における唯一の制限部位ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩおよびＣＭＶ／ｐ５３結合にお けるＢａｍＨＩ部位によって囲まれている。プロモーター領域を隣接して挟む唯 一の部位の存在は、いずれかの他のプロモーターによるＣＭＶ領域の置き換えを 可能とする。かくして、ｐ５３遺伝子が誘導可能なプロモーター（重金属（カド ミウムおよび亜鉛））によって誘導可能なメタロチオニンプロモーター）の制御 下に置かれた第２シリーズのベクターが得られる。 −野生型形態であるマウスｐ５３タンパク質をコードするＣＤＮＡに対応する １１７３ｂｐ配列（Ｚａｋｕｔ−Ｈｏｕｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ３６（１９８３） ５９４）。この構築体において、サプレッサー遺伝子はｃＤＮＡの形態であり、 これはイントロンを欠く。これは、特にベクターのサイズを減少させるのを可能 とする。さらに、得られた発現レベルがイントロンの存在下または不存在下で匹 敵することをチェックした。 −ＳＶ４０ウイルス後期遺伝子のポリアデニル化シグナル、 これは非常に効率的なポリアデニル化シグナルに対応する。２つの唯一の制限部 位ＳａｌＩおよびＨＩｎｄＩＩＩはポリアデニル化シグナルの下流に位置する。 得られたベクターをｐＯＮＴｔｋｃＭＶｐ５３と命名した。 該断片の挿入は逆向きに同様になすことができ、ｔｋ遺伝子およびｐ５３遺伝 子が逆向きであるプラスミドに導くことは理解されるであろう（ｐＯＮＴｔｋＣ ＭＶｐ５３ｉｎｖ）。 ３．組換えアデノウイルスの構築 ３． １ Ｅ１領域のレベルにおいて、同一向きに挿入された２の治療的遺伝 子を担持する、Ｅ１領域が欠失した組換えアデノウイルスの構築 ベクターｐＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３を線状化し、Ｅ１領域を欠くアデノウイル スベクターで、アデノウイルスＥ１（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）領域によってコード される機能をトランス的に供するヘルパー細胞（系２９３）に共トランスフェク トした。 より正確には、アデノウイルスＡｄ−ＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３は、以下の手順 に従い、アデノウイルスＡｄ−ＲＳＶβｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒ ｉｃａｕｄｅｔら、前記引用参照）およびベクターｐＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３の 間のイ ン・ビボ相同組換えによって得られる。ＸｍｎＩで線状化されたプラスミドｐＯ ＮＴｔｋＣＭＶｐ５３、およびＣｌａＩ酵素で線状化されたアデノウイルスＡｄ −ＲＳＶβｇａｌを、リン酸カルシウムの存在下で系１９３に共トランスフェク トして、相同組換えを行った。次いで、かく創製された組換えアデノウイルスを プラーク精製によって選択した。単離の後、組換えアデノウイルスＤＮＡを２９ ３細胞系で増幅し、これは約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する未精製組換え欠 陥アデノウイルスを含有する培養上清に導く。 一般に、ウイルス粒子は公知の技術に従い（特に、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６参照）、塩化セシウムグラジエント上での遠心 によって精製される。アデノウイルスＡｄ−ＯＮＴ−ｔｋＣＭＶｐ５３，ΔＥ１ は−８０℃で貯蔵できる（２０％グリセロール）。 ３．２ Ｅ１領域のレベルにて、同一向きに挿入された２の治療的遺伝子を担 持する、Ｅ１およびＥ３領域を欠失した組換えアデノウイルスの構築 ベクターｐＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３を線状化し、Ｅ１およびＥ３遺伝子を欠く アデノウイルスベクターで、アデノウイルス Ｅ１（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）領域によってコードされる機能をトランスにて供す るヘルパー細胞（系２９３）に共トランスフェクトした。 より正確には、アデノウイルスＡｄ−ＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３，ΔＥ１，ΔＥ ３は、以下の手順に従い、突然変異体アデノウイルスＡｄ−ｄ１１３２４（Ｔｈ ｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅｌｌ３１（１９８２）５４３）およびベクターｐＯ ＮＴｔｋＣＭＶｐ５３の間のイン・ビボ相同組換えによって得られる。ＸｍｎＩ で線状化されたプラスミドｐＯＮＴｔｋＣＭＶｐ５３、および酵素ＣｌａＩで線 状化されたアデノウイルスＡｄ−ｄ１１３２４を、リン酸カルシウムの存在下で 系２９３に共トランスフェクトして、相同組換えを行った。次いで、かく創製さ れた組換えアデノウイルスをプラーク精製によって選択した。単離の後、組換え アデノウイルスＤＮＡを２９３細胞系で増幅し、これは約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの 力価を有する末精製組換え欠陥アデノウイルスを含有する培養上清に導く。 一般に、ウイルス粒子は公知の技術に従い（特に、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６参照）、塩化セシウムグラジエント上での遠心 によって精製される。アデ ノウイルスＡｄ−ＯＮＴ−ｔｋＣＭＶｐ５３，ΔＥ１，ΔＥ３は２０％グリセロ ール中、−８０℃で貯蔵できる。 ３．３ ｔｋおよびｐ５３遺伝子が逆向きで位置するアデノウイルスの構築 前記実施例３．１．および３．２．に記載した手法に従って、ｔｋおよびｐ５ ３遺伝子が逆向きに位置するアデノウイルスを、プラスミドｐＯＮＴｔｋＣＭＶ ｐ５３ｉｎｖで出発して構築することができる。実施例２ ＲＳＶウイルスＬＴＲプロモーターの制御下にあるＴＫ遺伝子およびＣＭＶプロ モーターの制御下にあるｐ５３遺伝子からなる欠陥組換えアデノウイルスの構築 これらのアデノウイルスは、Ａｄ５アデノウイルスの左側部分、２の治療的遺 伝子およびＡｄ５アデノウイルスの領域（ＩＸタンパク質に対応）を担持するプ ラスミドと異なる欠失を担持する欠陥アデノウイルスからのＤＮＡとの間の相同 組換えによって構築した。 １．ベクターｐＲＳＶｔｋの構築 このプラスミドは、ＥＢＮＡ１−トランス活性化可能なプロ モーターをＲＳＶ ＬＴＲプロモーターによって置き換えることによって、プラ スミドｐＯＮＴｔｋ（実施例１．１）から構築した。そのために、ＲＳＶプラス ミドを、プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶ．βｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒ ｉｃａｕｄｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６）か らのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片の形態で単離し、次いで、プラスミドｐＯＮＴｔ ｋのＢａｍＨＩ（４７８）およびＳａｌＩ（１７００）部位にクローン化した。 得られたプラスミドをｐＲＳＶｔｋと命名した（図４）。 ２．プラスミドｐＲＳＶｔｋＣＭＶｐ５３の構築 本実施例は、Ａｄ５アデノウイルスの左側部分（左側ＩＴＲ、カプセル化領域 およびＥ１領域の開始からなる）、ＲＳＶプロモーターの制御下にあるｔｋ遺伝 子、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるｐ５３および組換えアデノウイルスの創 製のための相同組換えを可能とするＡｄ５ゲノムの第２断片（ｐＩＸタンパク質 ）を担持するベクターの構築を記載する（実施例２．３参照）。 このプラスミドは、ｔｋ遺伝子の下流に、ＣＭＶプロモーターの制御下にある ｐ５３遺伝子を担持する断片、続いてＳＶ ４０ウイルスのポリアデニル化部位を挿入することによってプラスミドｐＲＳＶ ｔｋから構築した。より詳しくは、挿入された断片は以下のものよりなる。 −サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターに対応するウイルス起源 のプロモーター領域。この領域は、ベクターにおいて、ＣＭＶ／ｐＯＮＴｔｋ結 合における唯一の制限部位ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩおよびＣＭＶ／ｐ５３結合にお けるＢａｍＨＩ部位によって囲まれている。プロモーター領域を隣接して挟む唯 一の部位の存在は、いずれかの他のプロモーターによるＣＭＶ領域の置き換えを 可能とする。かくして、ｐ５３遺伝子が誘導可能なプロモーター（重金属（カド ミウムおよび亜鉛））によって誘導可能なメタロチオニンプロモーター）の制御 下に置かれた第２シリーズのベクターが得られる。 −野生型形態であるマウスｐ５３タンパク質をコードするＣＤＮＡに対応する １１７３ｂｐ配列（Ｚａｋｕｔ−Ｈｏｕｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ３６（１９８３） ５９４）。この構築体において、サプレッサー遺伝子はｃＤＮＡの形態であり、 これはイントロンを欠く。これは、特にベクターのサイズを減少させるのを可能 とする。さらに、得られた発現レベルがイントロンの 存在下または不存在下で匹敵することをチェックした。 −ＳＶ４０ウイルス後期遺伝子のポリアデニル化シグナル、これは非常に効率 的なポリアデニル化シグナルに対応する。２つの唯一の制限部位ＳａｌＩおよび ＨｉｎｄＩＩＩはポリアデニル化シグナルの下流に位置する。 得られたベクターをｐＲＳＶｔｋＣＭＶｐ５３と命名した。 ３．組換えアデノウイルスの構築 ３．１ Ｅ１領域のレベルにおいて、同一向に挿入された２の治療的遺伝子を 担持する、Ｅ１領域を欠失した組換えアデノウイルスの構築 このアデノウイルスは、実施例１（３．１）に記載した手法に従って構築する 。かく得られたアデノウイルスＡｄ−ＲＳＶ−ｔｋＣＭＶｐ５３，ΔＥ１は２０ ％グリセロール中で−８０℃で保存できる。 ３．２ Ｅ１領域のレベルにおいて、同一向に挿入された２の治療的遺伝子を 担持する、Ｅ１およびＥ３領域が欠失した組換えアデノウイルスの構築 このアデノウイルスは実施例１（３．２）に記載した手法に従って構築する。 かく得られたアデノウイルスＡｄ−ＲＳＶ− ｔｋＣＭＶｐ５３，ΔＥ１，ΔＥ３は２０％グリセロール中、−８０℃で貯蔵で きる。実施例３ ＲＳＶウイルスＬＴＲプロモーターの制御下のあるＴＫ遺伝子および同プロモー ターの制御下にあるインターロイキン−２遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイル スの構築 これらのアデノウイルスは、Ａｄ５アデノウイルスの左側部分、２の治療的遺 伝子およびＡｄ５アデノウイルスの領域（ＩＸタンパク質に対応する）を担持す るプラスミドと、異なる欠失を担持する欠失アデノウイルスからのＤＮＡとの間 の相同組換えによって構築した。 １．プラスミドｐＲＳＶｔｋＲＳＶＩＬ−２の構築 本実施例は、Ａｄ５アデノウイルスの左側部分（左側ＩＴＲ、カプセル化領域 およびＥ１領域の開始からなる）、ＲＳＶプロモーターに制御下にあるｔｋ遺伝 子、ＲＳＶプロモーターの制御下にあるインターロイキン−２遺伝子および組換 えアデノウイルスの創製のための相同組換えを可能するＡｄ５ゲノムの第２断片 （ｐＩＸタンパク質）を担持かるベクターの構築を記載する（実施例３．２参照 ）。 このプラスミドは、ｔｋ遺伝子の下流に、ＲＳＶプロモーターの制御下にある インターロイキン−２伝子を担持する断片、続いてＳＶ４０ウイルスのポリアデ ニル化部位を挿入することによってプラスミドｐＲＳＶｔｋ（実施例２参照）か ら構築した。より詳しくは、挿入された断片は以下のものよりなる。 −プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶ．βｇａｌからのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片の形 態で単離されたＲＳＶウイルスＬＴＲプロモーター（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅ ｒｒｉｃａｕｄｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６ ）。 −ヒトインターロイキン−２をコードするｃＤＮＡに対応する配列（ＥＰ９１ ５３９）。この構築体において、治療的遺伝子はｃＤＮＡの形態である。 −ＳＶ４０ウイルス後期遺伝子のポリアデニル化シグナル、これは非常に効率 的なポリアデニル化シグナルに対応する。２つの唯一のＳａｌＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位はポリアデニル化シグナルの下流に位置する。 得られたベクターをｐＲＳＶｔｋＲＳＶＩＬ−２と命名した。 ２．組換えアデノウイルスの構築 ２つのタイプの組換えアデノウイルスを実施例１または２ら 記載した手法に従って構築する。これらのアデノウイルスは、Ｅ１領域のレベル において、同一向きで挿入された２の治療的遺伝子を担持し、Ｅ１領域に、また はＥ１およびＥ３領域に欠失を有する。 かく得られたアデノウイルスＡｄ−ＲＳＶ−ｔｋＲＳＶＩＬ−２，ΔＥ１およ びＡｄ−ＲＳＶ−ｔｋＲＳＶＩＬ−２，ΔＥ１，ΔＥ３は２０％グリセロール中 、−８０℃で貯蔵できる。実施例４ ＴＫ遺伝子および顆粒球およびマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ ）をコードする遺伝子を含む欠陥組換えアデノウイルスの構築 前記実施例に記載した手法に従って、（例えば、ＯＮＴおよびＲＳＶプロモー ターの制御下にある）ｔｋ遺伝子およびそれ自体のプロモーターのまたはＲＳＶ プロモーターの制御下にあるＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を担持する欠陥アデノウイルス を特に構築することができる。 このために、２の遺伝子を担持する中間体ベクターを、プロモーターの制御下 にあるＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を担持する断片を、同一向または反対向に挿入するこ とによってベクターｐＯＮＴ ｔｋまたはｐＲＳＶｔｋから構築することができる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする 遺伝子およびそれを含有する構築体は特に国際出願ＷＯ ８６／０３２２５に記 載されている。実施例５ ２つの注目する遺伝子（１つはＥ１領域のレベルで挿入されたもの、他方はＥ３ 領域のレベルで挿入されたもの）を含む欠陥組換えアデノウイルスの構築 これらのアデノウイルスは、Ｅ１領域のレベルにおいて挿入された第１の遺伝 子を担持する第１の欠陥ウイルスのＤＮＡと、Ｅ３領域のレベルにおいて挿入さ れた第２の欠陥アデノウイルスのＤＮＡとの間の相同組換えによって構築される 。 １．Ｅ３領域のレベルで挿入された遺伝子を担持する欠陥ウイルスの構築 このウイルスはアデノウイルスＡｄｄ１３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、 Ｃｅｌｌ ３１（１９８２）５４３）から構築される。このウイルスはＥ１およ びＥ３領域のレベルで欠失を担持する（ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片が欠失）。Ａ ｄｄ１３２４ウイルスＤＮＡを単離し精製する。次いで、このＤＮＡを酵素Ｘｂ ａＩおよびＥｃｏＲＩで切断する。次いで、ＸｂａＩ −ＥｃｏＲＩ断片は、ＲＳＶプロモーターの制御下にあるチミジンキナーゼをコ ードする配列を担持するプラスミドｐＲＳＶｔｋに由来し、次いで、前記したご とく開いたＡｄｄ１３２４ＤＮＡ中の該部位のレベルで挿入する。 かく得られたＤＮＡは、従って、Ｅ１領域のレベルでの欠失およびＥ３領域の レベルで挿入されたＴＫ遺伝子を含む。 ２．２の遺伝子を担持するアデノウイルスの構築 前記から調製した組換えウイルスからのＤＮＡおよびＢａｍＨＩによって線状 化された、Ｅ１領域のレベルで挿入された免疫刺激または腫瘍−サプレッサー遺 伝子を担持する組換えアデノウイルスからのＤＮＡをリン酸カルシウムの存在下 で系２９３に共トランスフェクトして、相同組換えを可能とする。次いで、かく 創製された組換えアデノウイルスをプラーク精製によって選択する。単離後、組 換えアデノウイルスＤＮＡを２９３細胞系で増幅し、これは約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍ ｌの力価を有する未精製組換え欠陥アデノウイルスを含有する培養上清に導く。 ウイルス粒子は、一般に、公知の技術（Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５ ２（１９７３）４５６参照）に従って塩化セシウムグラジエント上の遠心によっ て精製される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 トツク，ブリユノ フランス国、エフ−92400・クルブボワ、 ブルバール・サン−ドニ、58

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．２の治療的遺伝子よりなり、第１のものは自殺遺伝子であって、第２のも のは免疫刺激遺伝子もしくは腫瘍−サプレッサー遺伝子であることを特徴とする 欠陥組換えアデノウイルス。 ２．２の遺伝子が単一プロモーターの制御下で単一の転写体を構成することを 特徴とする請求項１記載のアデノウイルス。 ３．２の遺伝子が別々の転写プロモーターの制御下にあることを特徴とする請 求項１記載のアデノウイルス。 ４．２の遺伝子が同一向きで挿入されたことを特徴とする請求項３記載のアデ ノウイルス。 ５．２の遺伝子が反対向きに挿入されたことを特徴とする請求項３記載のアデ ノウイルス。 ６．２の治療的遺伝子がゲノムの同一部位に、好ましくはＥ１、Ｅ３またはＥ ４領域のレベルにおいて挿入されたことを特徴とする請求項１ないし５のいずれ か１項記載のアデノウイルス。 ７．２の遺伝子がＥ１領域のレベルで挿入されたことを特徴とする請求項６記 載のアデノウイルス。 ８．２の治療的遺伝子がゲノムの異なる部位に挿入されたことを特徴とする請 求項１、３、４および５のいずれか１項記載のアデノウイルス。 ９．遺伝子の１つがＥ１領域のレベルで、他のものがＥ３またはＥ４領域のレ ベルで挿入されたことを特徴とする請求項８記載のアデノウイルス。 １０．ＩＴＲ配列、カプセル化を可能とする配列を含み、Ｅ１およびＥ４遺伝 子の全部または一部の欠失を担持することを特徴とする請求項１〜９のいずれか １項記載の欠陥組換えアデノウイルス。 １１．ＩＴＲ配列、カプセル化を可能とする配列を含み、Ｅ１、Ｅ３及びＥ４ 遺伝子の全部または一部の欠失を担持することを特徴とする請求項１０記載のア デノウイルス。 １２．そのゲノムがＥ１、Ｅ３、Ｌ５およびＥ４遺伝子の全部または一部を欠 失したことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項記載のアデノウイルス。 １３．ヒト、動物または混合起源であることを特徴とする請求項１記載のアデ ノウイルス。 １４．ヒト起源のアデノウイルスがグループＣに分類される ものから、好ましくはタイプ２または５アデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５） のうちから選択されることを特徴とする請求項１３記載のアデノウイルス。 １５．動物起源のアデノウイルスがイヌ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、鳥類 および類人猿起源から選択されることを特徴とする請求項１３記載のアデノウイ ルス。 １６．自殺遺伝子がチミジンキナーゼ遺伝子、好ましくはヘルペスウイルスＨ ＳＶ−Ｉチミジンキナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のアデノ ウイルス。 １７．チミジンキナーゼをコードする遺伝子および腫瘍−サプレッサー遺伝子 を含むことを特徴とする請求項１記載のアデノウイルス。 １８．チミジンキナーゼをコードする遺伝子およびリンホカインをコードする 遺伝子を含むことを特徴とする請求項１記載のアデノウイルス。 １９．ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする遺伝子および野生型ｐ ５３遺伝子を含むことを特徴とする欠陥組換えアデノウイルス（Ａｄ−ＴＫ−ｐ ５３）。 ２０．ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする遺伝 子およびインターロイキン−２をコードする遺伝子を含むことを特徴とする欠陥 組換えアデノウイルス（Ａｄ−ＴＫ−ＩＬ２）。 ２１．ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする遺伝子およびＧＭ−Ｃ ＳＦをコードする遺伝子を含むことを特徴とする欠陥組換えアデノウイルス（Ａ ｄ−ＴＫ−ＧＭ−ＣＳＦ）。 ２２．転写プロモーター（類）が哺乳動物、真核生物またはウイルスプロモー ターから選択されることを特徴とるす請求項２または３記載のアデノウイルス。 ２３．免疫刺激遺伝子が標的細胞の分泌経路で合成される治療的産物を指示す るシグナル配列を含むことを特徴とする請求項１〜２２のいずれか１項記載のア デノウイルス。 ２４．請求項１〜２３のいずれか１項記載の少なくとも１の欠陥組換えアデノ ウイルスを含む医薬組成物。 ２５．注射処方のための医薬上許容される賦形剤を含む請求項２４記載の医薬 組成物。 ２６．−自殺遺伝子が治療剤に対する感受性を付与する遺伝子である請求項１ 〜２３のいずれかに記載の１以上の組換えアデノウイルス、および −過剰増殖疾患の治療のために同時または別々に使用されるあるいは経時的に 使用される組合せ産物としての該治療剤 を含む産物。 ２７．自殺遺伝子がチミジンキナーゼ遺伝子であって、治療剤がガンシクロビ ールまたはアシクロビールまたは類似体であることを特徴とする請求項２６記載 の産物。 ２８．ゲノムのＥ１領域のレベルで挿入された治療的価値の２の遺伝子を含む 欠陥組換えアデノウイルス。