JPH10506018A - 不活化ＩＶａ２遺伝子を有する欠陥組換えアデノウィルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アデノウィルスから誘導される新規なウィルスベクター、それの製造および遺伝子治療での利用に関する。本発明は特に、少なくともＩＶａ２遺伝子が不活化された欠陥組換えアデノウィルスに関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 不活化ＩＶａ２遺伝子を有する欠陥組換えアデノウィルス 本発明は、新規なウィルスベクター、その製造およびそれの遺伝子治療での使 用に関する。本発明はさらに、前記ウィルスベクターを含有する医薬組成物に関 するものである。さらに詳細には、本発明は遺伝子治療用のベクターとしての組 換えアデノウィルスに関する。 遺伝子治療は、細胞または冒された臓器中に遺伝子情報を組み込むことで、欠 失または異常（突然変異、異常発現など）を改善することにある。この遺伝子情 報は、in vitroすなわち臓器から細胞を取り出し、次に修飾した細胞を体内に再 度組み入れるか、あるいはin vivoで適切な組織に直接組み入れることができる 。この第２の場合では各種方法があり、その中にはＤＮＡおよびΔＥＡＥ−デキ ストラン（Pagano el al.，J.Virol.1(1967)891）、ＤＮＡおよび核蛋白（Kaned a et al.，Science 243(1989)375）、ＤＮＡおよび脂質(Felgner et al.，PNAS 84(1987)7413)の複合体やリポソームの利用（Fraley et al,，J.Biol.Chem,255( 1980)10431）などが関与する各種トランスフェクション法がある。さらに最近で は、遺伝子転移の ベクターとしてウィルスを利用する方法が、これらの物理的トランスフェクショ ン法に対する有望な代替法として登場してきた。これに関して、各種ウィルスに ついて、ある種の細胞群を感染させる能力に関する試験が行われてきた。特には 、レトロウィルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳなど）、ＨＳＶウィルス、アデノ随 伴ウィルスおよびアデノウィルスがある。 これらのウィルスのうち、アデノウィルスは遺伝子治療での使用に関していく つかの有利な性質を提供する。特に、当該ウィルスはかなり広い宿主スペクトル を持ち、静止細胞を感染させることができ、感染細胞のゲノム中に組み込まれず 、現在までのところヒトにおける主要な病気と関連のあったことがない。アデノ ウィルスは、約３６ｋｂの大きさの直線二本鎖ＤＮＡを有するウィルスである。 そのゲノムは特に、末端の逆方向反復塩基配列（ＩＴＲ）、カプシド形成配列、 初期遺伝子および後期遺伝子を有する（図１参照）。主要な初期遺伝子は、Ｅ１ （Ｅ１ａおよびＥ１ｂ）、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子である。主要な後期遺伝 子は、Ｌ１〜Ｌ５遺伝子である。 上記のアデノウィルスの性質を考慮して、後者はすでにin vivoでの遺伝子転 移に使用されている。そのために、アデノウ ィルスから誘導される各種ベクターが作られ、各種遺伝子（β−ｇａｌ、ＯＴＣ 、ａ−１ＡＴ、サイトカインなど）を組み込んでいる。これらの各構造体におい ては、アデノウィルスを修飾して、感染細胞中で複製できないようにしている。 そこで、先行技術に記載の構造体は、異種ＤＮＡ配列を挿入するレベルでＥ１（ Ｅ１ａおよび／またはＥ１ｂ）領域と適宜にＥ３領域を欠失させたアデノウィル スである（Levrero et al.，Gene 101(1991)195; Gosh-Choudhury et al.，Gene 50(1986)161）。そうであっても、先行技術に記載のベクターは多くの欠点を持 っていることから、それの遺伝子治療での利用は制限される。特に、これらベク ターはいずれも、in vivoでの発現が遺伝子治療の枠組では望ましくない多くの ウィルス遺伝子を有している。さらに、これらのベクターでは、ある種の利用分 野では必要であると考えられる非常に大きいＤＮＡ断片の組み込みができない。 本発明は、これらの欠点を克服できるようにするものである。本発明は、遺伝 子治療において、特にはin vivoでの遺伝子の転移および発現に使用することが できる新規な組換えアデノウィルスについて説明するものである。特に、本発明 のアデノウ ィルスにより、ウィルス蛋白の産生、ウィルスの伝染、病原性などの危険性を抑 制しながら、対象遺伝子のin vivoでの有効な転移および継続的発現が可能であ る。 より詳細には、本発明は、少なくとも１個のＩＶａ２という名称の特異的ウィ ルス遺伝子を非機能性とした組換えアデノウィルスの形成にある。ＩＶａ２遺伝 子は、アデノウィルスゲノムの左側に位置する小さい遺伝子である。それは特に 、部分的にＥ２Ｂ遺伝子末端と重なっており、そのために操作が困難である。Ｉ Ｖａ２遺伝子は、アデノウィルスの複製周期における後期遺伝子転写の活性化物 質の役割を果たすように思われる。従って、それが存在することにより、ウィル ス粒子形成に必要なウィルス蛋白の発現が可能となるか、もしくはその発現が促 進される。 出願人は、この遺伝子をアデノウィルスゲノム中で不活化することが可能であ ることを本願において示している。出願人はさらに、この不活化が遺伝子治療ベ クターとしてのアデノウィルスの性質、すなわちそれが持つ細胞（特にはヒト細 胞）への高い感染力および対象遺伝子を前記細胞中に効率良く転移させる能力に 影響を与えないことを示している。さらに、先行技術 のベクターと比較して、本発明に記載のベクターは、欠失によりＩＶａ２遺伝子 を不活化することで得られる対象遺伝子を組み込む能力が向上しており、しかも 特に、本発明による組換えアデノウィルス中に存在し得る後期遺伝子の発現がか なり低減されるか、場合によっては消失することから、免疫原性がかなり低いも のとなっている。 従って本発明のベクターは、得られる力価に特に影響を与えることなく、大き い（８ｋｂより大きく、１１ｋｂより大きく成長することができる）対象遺伝子 を組み込むことができ、さらには、発現されるウィルス領域がほとんどないため に、免疫原性、病原性、伝染、複製、組換えなどの遺伝子治療でのベクターとし てウィルスを使用する場合に固有の危険性をかなり低減もしくは抑制することか ら、特に有利である。本発明はそのように、特に、所望のＤＮＡ配列のin vivo での転移および発現に適合したウィルスベクターを提供するものである。 従って本発明の第１の主題は、少なくともＩＶａ２を不活化した欠陥組換えア デノウィルスに関するものである。 アデノウィルスは、感染した細胞において自律的に複製することができない場 合に、欠陥ウィルスであると言われる。従っ て、本発明によるアデノウィルスのゲノムは少なくとも、感染細胞での当該ウィ ルスの複製に必要な配列を欠いている。その領域は、除去するか（完全にもしく は部分的に）、非機能性とするか、あるいは他の配列により、特に異種核酸配列 によって置換することができる。 以上で示したように、本出願人はここに、アデノウィルスの所望の性質に影響 を与えることなく、そのウィルスのゲノム中でＩＶａ２遺伝子を不活化すること ができることを示している。さらに詳細には、本発明のベクターを形成するため に、当業者には公知の各種方法、特に１以上の塩基の抑圧、置換、欠失および／ または付加によって、ＩＶａ２遺伝子を不活化することができる。そのような修 飾は、例えば遺伝子工学技術により、あるいは別法として突然変異誘発剤処理に よって、in vitro（単離ＤＮＡ上で）またはin situで行うことができる。その 遺伝子修飾は、遺伝子のコード部分内またはコード領域外で、さらには例えばそ の遺伝子の発現および／または転写調節を担当する領域に局在させることができ る。従って、遺伝子の不活化は、構造またはコンホメーションの修飾による不活 化蛋白の産生、産生の喪失、活性の変わった蛋白の産生、あるいは別法 としてレベルを弱めたまたは所望の調節形態に従った天然蛋白の産生によって発 現する。 不活化に使用することができる突然変異誘発剤の中では、例えばエネルギー照 射（Ｘ線、γ線および紫外線など）などの物理的なもの、あるいはアルキル化剤 ［メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロ ソグアニジン、Ｎ−ニトロキノリン−１−オキサイド（ＮＱＯ）］、ジアルキル 化剤、挿入剤などのＤＮＡの塩基の各種官能基と反応することができる化学的な ものを挙げることができる。 その遺伝子修飾は、例えばロトスタイン（Rothstein）が最初に報告した方法 （Meth．Enzymol. 101(1983)202）に従い、遺伝子破壊によって行うこともでき る。その場合好ましくは、コード配列の全体または一部を乱して、相同的組換え により、ゲノム配列を非機能性もしくは突然変異体配列で置き換えることができ るようにする。 好ましくは、本発明のアデノウィルスにおいては、１以上の塩基の突然変異お よび／または欠失によってＩＶａ２遺伝子を不活化する。さらに好ましくは、完 全もしくは部分的欠失によってＩＶａ遺伝子を不活化する。 より詳細には、欠失とは、検討対象遺伝子の全体または一部のあらゆる抑圧を 意味するものと理解される。これは特に、当該遺伝子のコード領域の全体もしく は一部、および／または当該遺伝子の転写のためのプロモーター領域の全体もし くは一部であることができる。抑圧は、実施例に示すように、従来の分子生物学 的方法に従って、適切な制限酵素による消化と、それに続く連結反応によって行 うことができる。 特に好ましい方法では、遺伝子の不活化は、それが検討対象の遺伝子のみに影 響を与えて、他のウィルス遺伝子、特に隣接する遺伝子に影響しないような形で 行う。さらに、点変異などの一部の変更は細胞機序によって修正もしくは減衰さ れる可能性があることから、不活化が分離時に完全に安定および／または非可逆 的であることが特に好ましい。 特に有利な態様によれば、本発明の組換えアデノウィルスにおいては、ＩＶａ ２遺伝子の不活化を、Ａｄ５アデノウィルス配列上のヌクレオチド４１０６〜ヌ クレオチド５１８６の範囲のＢｓｓＨＩＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片の欠失によって行 う。この配列は文献に報告されており、データベースにもある（特には、遺伝子 バンクＮｏ．Ｍ７３２６０参照）。 本発明による組換えアデノウィルスは、ＩＴＲ配列とカプシド形成を可能とす る領域を有するのが有利である。 逆方向反復塩基配列（ＩＴＲ）が、アデノウィルス複製の起源である。その配 列は、ウィルスゲノムの３’末端および５’末端に局在しており（図１参照）、 そこから、当業者に公知の従来の分子生物学的方法に従って容易に単離すること ができる。ヒトアデノウィルスのＩＴＲ配列のヌクレオチド配列（特には、Ａｄ ２およびＡｄ５血清型のもの）が文献に記載されており、イヌアデノウィルス（ 特にはＣＡＶ１およびＣＡＶ２）についても記載されている。例えばＡｄ５アデ ノウィルスに関しては、左側のＩＴＲ配列はそのゲノムのヌクレオチド１〜１０ ３を有してなる領域に相当する。 カプシド形成配列（Ｐｓｉ配列とも称される）が、ウィルスゲノムのカプシド 形成には必要である。従ってこの領域が存在して、本発明による欠陥組換えアデ ノウィルスを形成することができるようにしなければならない。カプシド形成配 列は、アデノウィルスのゲノム中、左側（５’）ＩＴＲとＥ１遺伝子との間に局 在している（図１参照）。それは従来の分子生物学的方法によって単離もしくは 人為的に合成することができる。ヒ トアデノウィルスのカプシド形成配列のヌクレオチド配列（特にはＡｄ２および Ａｄ５血清型のもの）が文献に記載されており、イヌアデノウィルス（特にＣＡ Ｖ１およびＣＡＶ２）についても知られている。例えばＡｄ５アデノウィルスに 関しては、ゲノムのヌクレオチド１９４〜３５８の間に機能性カプシド形成配列 が存在する。 第１の具体的な実施態様においては、本発明の組換えアデノウィルスはＥ１お よびＩＶａ２遺伝子の全体もしくは一部に関して欠失を有する。 別の具体的な実施態様においては、本発明の組換えアデノウィルスはＥ４およ びＩＶａ２遺伝子の全体もしくは一部に関して欠失を有する。 さらに好ましい１実施態様によれば、本発明の組換えアデノウィルスはＥ１、 ＩＶａ２およびＥ３遺伝子の全体もしくは一部に関して欠失を有する。 特に有利な形態においては、本発明の組換えアデノウィルスはＥ１、ＩＶａ２ およびＥ４遺伝子の全体もしくは一部に関して欠失を有する。 遺伝子治療での使用に特に有望な性質を有する本発明による 組換えアデノウィルスは、Ｅ１、ＩＶａ２、Ｅ３、Ｅ４および恐らくはＬ５遺伝 子の全体もしくは一部に関して欠失を有するものである。これらのベクターは実 際、感染、安全性および非常に高い遺伝子転移能力に関係する性質を併せ持って いる。 本発明の組換えアデノウィルスがさらに、細胞、臓器もしくは生物体において 転移および／または発現することが望ましい異種核酸配列をも有することが有利 である。 特に、異種ＤＮＡ配列は、１以上の治療効果を有する遺伝子および／または抗 原性蛋白をコードする１以上の遺伝子を有することができる。 そうして転移され得る治療効果のある遺伝子は、標的細胞で転写および恐らく は翻訳されることで治療効果を有する産生物を生じる遺伝子である。 これは特に、治療効果を有する蛋白産生物をコードする遺伝子であることがで きる。そうしてコードされた蛋白産生物には、蛋白、ペプチド、アミノ酸などが あり得る。この蛋白産生物は標的細胞に関して相同的なものであっても良い（す なわち、標的細胞が病原性を示さない場合に、通常その標的細胞で発現する産生 物）。この場合、蛋白の発現によって例えば、細胞での 不十分な発現、または修飾の結果としての不活性もしくは活性の弱い蛋白の発現 を軽減するか、あるいは別法としてその蛋白を過剰に発現させることができる。 治療効果のある遺伝子はさらに、細胞蛋白の突然変異体をコードして、安定性を 高めたり、活性を変えたりすることもできる。蛋白産生物はさらに、標的細胞に 関して異種であることもできる。その場合、発現蛋白は例えば、細胞に不足して いる活性を補充もしくは提供して、細胞が病気と戦うことができるようにするこ とができる。 本発明の趣旨における治療効果を有する産生物では、より具体的には、酵素、 血液誘導体、ホルモン、リンホカイン、インターロイキン、インターフェロン、 ＴＮＦなど（ＦＲ９２０３１２０）、成長因子、神経伝達物質もしくはその前駆 体または合成酵素、栄養因子（ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、 ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５など）、アポリポ蛋白（ＡｐｏＡＩ、Ａｐ ｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど（ＦＲ９３０５１２５））、ジストロフィンもしくはミ ニジストロフィン（ＦＲ９１１１９４７）、腫瘍サプレッサー遺伝子（ｐ５３、 Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなど（ＦＲ９３０４７４５）、凝集に関 与する因子をコードする遺伝子（因子ＶＩＩ、 ＶＩＩＩ、ＩＸなど）、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ など）が挙げられる。 治療効果を有する遺伝子はさらに、標的細胞中での発現によって遺伝子の発現 や細胞ｍＲＮＡの転写を抑制できるようにするアンチセンスの遺伝子もしくは配 列であることもできる。そのような配列は例えば、欧州特許１４０３０８号に記 載の方法に従って、標的細胞において、細胞ｍＲＮＡに対して相補的なＲＮＡに 転写されることで、そのｍＲＮＡが蛋白に翻訳されるのを妨害することができる 。 以上のように、異種ＤＮＡ配列は、ヒトにおいて免疫応答を起こすことができ る抗原性ペプチドをコードする１以上の遺伝子を有することもできる。従ってこ の特定の実施態様では、本発明によって、特に微生物もしくはウィルスに対して ヒトを免疫感作することができるワクチンの産生が可能となる。それは特に、エ プスタイン・バーウィルス、ＨＩＶウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス（ＥＰ１８５５ ７３）、擬似狂犬病ウィルスに特異的な、あるいは腫瘍に対して特異的な（ＥＰ ２５９２１２）抗原性ペプチドであることができる。 通常、異種核酸配列は、感染した細胞において機能する転写 のためのプロモーター領域も有している。この領域は、それが感染細胞において 機能できる場合には、当然のことながら、検討対象の遺伝子の発現を起こさせる プロモーター領域となり得る。この領域はさらに、各種起源の領域であることが できる（他の蛋白の発現を起こすもの、あるいは合成のもの）。特に、これは真 核生物遺伝子もしくはウィルス遺伝子のプロモーター配列であることができる。 例えばこれは、それが感染することが望ましい細胞のゲノムから誘導されるプロ モーター配列であっても良い。同様に、これは、使用されるアデノウィルスを含 むウィルスのゲノムから誘導されるプロモーター配列であっても良い。この点に 関しては、例えばＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ遺伝子などのプロモーターを 挙げることができる。さらに、これらのプロモーター領域は活性化配列、調節配 列または優勢もしくは組織特異的発現を可能にする配列を加えることで修飾する ことができる。さらに、異種核酸がプロモーター配列を持たない場合には、それ をそのような配列の下流で欠陥ウィルスのゲノムに挿入することができる。 さらに、異種核酸配列は、特に治療効果を有する遺伝子の上流で、標的細胞の 分泌経路で合成される治療薬を指示する信号 配列を有することもできる。この信号配列は、治療薬の天然の信号配列であって も良いが、他の機能性信号配列または人為的信号配列であることもできる。 さらに特に有利な態様においては、本発明のベクターがさらに、異種プロモー ターの制御下に機能性Ｅ３遺伝子を有する。より好ましくは、そのベクターがｇ ｐ１９Ｋ蛋白の発現を可能とするＥ３遺伝子の一部を有する。この蛋白によって 実際に、アデノウィルスベクターが、（ｉ）それの作用を制限する可能性があり 、しかも（ｉｉ）望ましくない副作用を有する可能性のある免疫反応の対象とな るのを回避することができる。 本発明による組換えアデノウィルスは、各種起源のものが可能である。構造お よび性質にいくらか変動があるが、同等の遺伝子構成を示す各種アデノウィルス 血清型がある。そのため、本願に記載の開示内容は、いずれの種類のアデノウィ ルスについても、当業者であれば容易に再現することができる。 より詳細には、本発明のアデノウィルスはヒト起源、動物起源もしくはその両 者（ヒトおよび動物）が起源のものであることができる。 ヒト起源のアデノウィルスに関しては、群Ｃに分類されるも のを使用するのが好ましい。より好ましくは、各種ヒトアデノウィルス血清型の うち、２型または５型のアデノウィルス（Ａｄ２またはＡｄ５）の使用が、本発 明の枠組みでは好ましい。 前述のように、本発明のアデノウィルスは、動物起源であるか、あるいは動物 起源のアデノウィルスから誘導される配列を有することもできる。本願出願人は 実際、動物起源のアデノウィルスが高効率で、ヒト細胞を感染させること、なら びに試験を行ったヒト細胞中で増殖することはできないことを明らかにしている （フランス出願９３ ０５９５４号参照）。本出願人はさらに、動物起源のアデ ノウィルスがヒト起源のアデノウィルスによって全くトランス補足（transcompl ement）されないため、ヒトアデノウィルス存在下に、感染性粒子の形成につな がり得るin vivoでの組換えおよび増殖の危険性が排除されることも明らかにし た。従って、遺伝子治療でのベクターとしてのウィルスの使用に固有の危険性が かなり低いことから、動物起源のアデノウィルスまたはアデノウィルス領域の使 用は特に有利である。 本発明の枠組み内で使用できる動物起源のアデノウィルスは、 イヌ、ウシ、ネズミ（例：Ｍａｖｌ、Beard et al.，Virology 75(1990)81）、 ヒツジ、ブタもしくはトリのもの、またはサル起源のもの（例：ＳＡＶ）があり 得る。より詳細には、トリのアデノウィルスでは、例えばフェルプス（Phelps） 株（ＡＴＣＣ ＶＲ−４３２）、フォンテス（Fontes）株（ＡＴＣＣ ＶＲ−２ ８０）、Ｐ７−Ａ株（ＡＣＴＴ ＶＲ−８２７）、ＩＢＨ−２Ａ株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８２８）、Ｊ２−Ａ株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８２９）、Ｔ８−Ａ株（ＡＴＣ Ｃ ＶＲ−８３０）、Ｋ−１１株（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２１）または別のものと してＡＴＣＣ ＶＲ−８３１〜８３５と称される株などのＡＴＣＣで入手可能な 血清型１〜１０が挙げられる。ウシアデノウィルスでは、各種公知の血清型を使 用することができ、特にはＡＴＣＣ ＶＲ−３１３、３１４、６３９〜６４２、 ７６８および７６９の名称下にＡＴＣＣで入手できるもの（１〜８型）が挙げら れる。さらに、ネズミアデノウィルスＦＬ（ＡＴＣＣ ＶＲ−５５０）およびＥ ２０３０８（ＡＴＣＣ ＶＲ−５２８）、５型（ＡＴＣＣ ＶＲ−１３４３）も しくは６型（ＡＴＣＣ ＶＲ−１３４０）；ヒツジアデノウィルス；ブタアデノ ウィルス（５３５９）；または特にＡＴＣＣでＶＲ −５９１〜５９４、９４１〜９４３、１９５〜２０３の番号で呼ばれるアデノウ ィルスなどのサルアデノウィルス等を挙げることができる。 好ましくは、各種動物起源のアデノウィルスでは、イヌ起源のアデノウィルス もしくはアデノウィルス領域、特には全てのＣＡＶ２アデノウィルス株［例：マ ンハッタン（manhattan）すなわちＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００） ］を本発明の枠組み内では使用する。イヌアデノウィルスは、多くの構造研究の 対象となってきた。そうして、ＣＡＶ１およびＣＡＶ２アデノウィルスの完全な 制限マップが先行技術で報告されており（Spibey et al.，J.Gen.Virol.，70(19 89)165）、Ｅ１ａおよびＥ３遺伝子ならびにＩＴＲ配列についてのクローニング および配列決定が行われている（特には、Spibey et al.，Virus 11525参照）。 本発明による欠陥組換えアデノウィルスは、各種方法で得ることができる。 第１の方法は、in vitroで得た欠陥組換えウィルスからのＤＮＡ（連結反応に よるか、あるいはプラスミドの形で）をコン ピテント細胞系にトランスフェクションすること、すなわち欠陥ウィルスの補足 に必要な全ての機能をトランスで（in trans）行うことにある。これらの機能は 好ましくは、細胞のゲノムに統合されており、それによって組換えの危険性を低 減し、細胞系に関する安定性を向上させる。そのような細胞系の製造については 、実施例に記載してある。 第２の方途は、適切な細胞系で、in vitroで得た欠陥組換えウィルスからのＤ ＮＡ（連結反応によるか、あるいはプラスミドの形で）および１以上のヘルパー ウィルスもしくはプラスミドからのＤＮＡのトランスフェクションにある。この 方法によれば、組換えアデノウィルスの全ての欠陥機能を補足することができる コンピテント細胞系を有する必要はない。これらの機能の一部は実際には、ヘル パーウィルスによって補足される。このヘルパーウィルス自体は欠陥ウィルスで ある。この方法による本発明の欠陥組換えアデノウィルスの製造についても、実 施例に説明してある。 この点に関して本願では、Ａｄ５アデノウィルスゲノムの修飾された左側部分 を有するプラスミド（プラスミドｐＣＯ１およびｐＣＯ２）の形成についても説 明してある。これらのプラ スミドは、遺伝子治療におけるベクターとしての欠陥組換えアデノウィルスの形 成に特に有用である。そのようにして、プラスミドｐＣＯ１は、Ｅ１遺伝子に相 当するヌクレオチド３８２〜３４４６の領域が欠失した、左側ＩＴＲからヌクレ オチド６３１６までのアデノウィルスゲノムの左側領域を有している。このプラ スミドは、先行技術に記載のこの種の他のプラスミドと比較して、Ｅ１遺伝子に おける欠失が大きいために、より高いクローニング能力を提供し、特に組換えの 危険性が低くなっていることから、特に有利である。プラスミドｐＣＯ２は、I Ｖａ遺伝子の一部に相当するヌクレオチド４１０６〜５１８６の別の領域の欠失 によって、プラスミドｐＣＯ１から誘導される。この欠失はＥ２遺伝子に影響を 与えないという利点を有する。プラスミドｐＣＯ６は、ＩＶａ２遺伝子の読み取 り枠中に終止コドンを挿入することでプラスミドｐＣＯ１から誘導される。さら に、プラスミドｐＣＯ１、ｐＣＯ２およびｐＣＯ６は多重クローニング部位を持 っていることで、対象の異種核酸配列を組み込むことができる。次に、得られる 構造体を用いてアデノウィルスゲノムの右側部分に相当するＤＮＡとともにコン ピテント細胞系に同時トランスフェクションすることで、欠陥 組換えアデノウィルスを得ることができる。後者に関しては、野生型ウィルスの ゲノム、あるいはＥ３領域が欠失しているＡｄｄｌ３２４およびＥ４領域が欠失 しているＡｄｄｌ８０８（Weinberg et al.，J.Vlrol.57(1986)833）などのそれ 自体欠陥を有するウィルスのゲノムから誘導することができる（実施例参照）。 使用することができる細胞系では、特に、ヒト胎児腎臓系２９３、ＫＢ細胞、Ｈ ｅｌａ細胞、ＭＤＣＫ、ＧＨＫなど、より一般的には欠失領域を補足する細胞系 を挙げることができる（実施例参照）。 次に、増殖した組換えウィルスを、従来のウィルス学的方法に従って、回収、 精製および増幅する。 そのようにして、プラスミドｐＣＯ１によって、Ｅ１遺伝子にヌクレオチド３ ８２からヌクレオチド３４４６にかけて欠失を有する欠陥組換えアデノウィルス を形成することができる。 プラスミドｐＣＯ２により、Ｅ１遺伝子にヌクレオチド３８２からヌクレオチ ド３４４６にかけて欠失を有し、ＩＶａ２遺伝子にヌクレオチド４１０６からヌ クレオチド５１８６にかけて欠失を有する欠陥組換えアデノウィルスを形成する ことができる。 プラスミドｐＣＯ６によって、Ｅ１遺伝子にヌクレオチド３８２からヌクレオ チド３４４６にかけて欠失を有し、ＩＶａ２遺伝子がＡｄ５アデノウィルスの塩 基５１４１に相当するＳｐｈ１部位のレベルでその読み取り枠中への終止コドン 挿入により不活化されている欠陥組換えアデノウィルスを形成することができる 。 本発明はさらに、欠陥組換えアデノウィルスをトランス補足する細胞系を形成 することができる一連のプラスミドについても記載する。特には、それ自体のプ ロモーターの制御下にＩＶａ２遺伝子を有するプラスミドｐＡＣ５とそれぞれＴ ＫおよびＣＭＶプロモーターの制御下にＩＶａ２遺伝子を有するプラスミドｐＧ Ｙ３７−ＴＫ−ＩＶａ２およびｐＧＹ３７−ＣＭＶ−ＩＶａ２である。これらの プラスミドはさらに、ＥＢＮＡ１／ＯｒｉＰ配列を有することで、真菌細胞中で 複製することができる。従ってこれらのプラスミドにより、ヘルパーウィルスを 用いる必要なく、ＩＶａ２遺伝子について欠陥組換えアデノウィルスをトランス 補足する細胞系を形成することができる。 本発明はさらに、上記の１以上の欠陥組換えアデノウィルスを有してなる医薬 組成物に関するものでもある。本発明の医薬 組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、経鼻投与、静脈投与、筋肉投与、 皮下投与、眼内投与、経皮投与など向けに製剤することができる。 好ましくは、その医薬組成物は、注射剤向けに医薬的に許容される媒体を含有 する。そのような媒体としては特に、塩水（リン酸モノナトリウムもしくはジナ トリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネ シウムなど、またはそのような塩の混合物）、無菌液もしくは等張性液、あるい は状況に応じて無菌水もしくは生理食塩水を加えることで注射液を調製すること ができる乾燥組成物（特には凍結乾燥組成物）が挙げられる。 注射に使用されるウィルスの用量は各種パラメータの関数として、特には実施 する投与形態、関連する病気、発現する遺伝子あるいは所望の治療期間の関数と して調整する。一般には、本発明による組換えアデノウィルスは、１０⁴〜１０^{1 4} ｐｆｕ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕの用量で製剤・投与する。ｐｆｕとい う用語（「プラーク形成単位」）は、ウィルス溶液の感染性に相当し、適切な細 胞培地を感染させ、一般には５日後に感染細胞のプラーク数を測定することで求 められる。ウィ ルス溶液のｐｆｕ力価の測定方法については、文献に詳細に記載されている。 挿入するＤＮＡ配列に応じて、本発明のアデノウィルスを用いて、遺伝性疾患 （異栄養、嚢胞性線維症など）、神経変性性疾患（アルツハイマー病、パーキン ソン病、ＡＬＳなど）、癌、凝血障害もしくは異常リポ蛋白血症に関係する病気 、ウィルス感染に関係する病気（肝炎、ＡＩＤＳなど）等の多くの病気の治療も しくは予防を行うことができる。 以下の実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は例示 的なものと考えるべきものであって、本発明を制限するものではない。図面の説明 図１は、Ａｄ５アデノウィルスの遺伝子構成である。Ａｄ５の完全な配列はデ ータベースで入手でき、当業者はあらゆる制限部位を選択もしくは形成し、そう してゲノムのあらゆる領域を単離することができる。 図２は、ＣＡＶ２アデノウィルスマンハッタン株（前記にて引用のSpibeyらの 報告による）の制限マップである。 図３は、プラスミドｐＣＯ１に含まれるＨｉｎｄＩＩＩ断片 の制限マップである。 図４は、プラスミドｐＣＯ２に含まれるＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限マップであ る。 図５は、プラスミドｐＰＹ３２の構造および表示の図である。 図６は、プラスミドｐＰＹ５５の表示である。 図７は、プラスミドｐＥ４Ｇａｌの構造図である。 図８は、プラスミドｐＣＯ６に含まれるＨｉｎｄ３断片の制限マップである。 図９は、プラスミドｐＡＣ２の制限マップである。 図１０は、プラスミドｐＡＣ５の制限マップである。 図１１は、プラスミドｐＧＹ３７−ＴＫ−ＩＶａ２の制限マップである。 図１２は、プラスミドｐＧＹ３７−ＣＭＶ−ＩＶａ２の制限マップである。一般的分子生物学的方法 プラスミドＤＮＡの分取抽出、塩化セシウム勾配でのプラスミドＤＮＡの遠心 、アガロースもしくはアクリルアミドゲルでの電気泳動、電気溶離によるＤＮＡ 断片の精製、フェノールもしくはフェノール−クロロホルムによる蛋白抽出、塩 水媒体中 でのエタノールもしくはイソプロパノールを用いるＤＮＡ沈殿、大腸菌中での形 質転換等の分子生物学で使用される従来の方法は当業者には十分知られており、 文献的に広く記載されている［Maniatis T．et al.，'Molecular Cloning，a La boratory Manual'，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y .，1982; Ausubel F.M．et al．(eds)，'Current Protocols in Molecular Biol ogy'，John Wiley & Sons，New York，1987］。 ｐＢＲ３２２型およびｐＵＣ型プラスミドならびにＭ１３系のファージは市販 のものである（Bethesda Research Laboratories）。 連結反応については、ＤＮＡ断片をその大きさに応じてアガロースもしくはア クリルアミドゲル電気泳動によって分離し、フェノールもしくはフェノール／ク ロロホルム混合物によって抽出し、エタノールで沈殿させ、次に供給者の指示に 従ってファージＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Biolabs）の存在下にインキュベーショ ンすることができる。 突出（protruding）５’末端の充填は、供給者の説明に従って、大腸菌のＤＮ ＡポリメラーゼＩ（Biolabs）のクレノウ断 片を用いて行うことができる。突出３’末端の破壊は、製造者の説明に従って使 用するファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Biolabs）の存在下に行う。突出５ ’末端の破壊は、制御下にＳ１ヌクレアーゼで処理して行う。 合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いるin vitroでの部位指向性の突然変異 誘発を、アマシャム（Amersham）が販売しているキットを用いて、テイラーらが 開発した方法（Taylor et al.，Nucleic Acids Res．13（1985）8749-8764）に 従って行うことができる。 いわゆるＰＣＲ法［複製連鎖反応（Polymerase-catalyzed Chain Reaction） ，Saiki R.K．et al.，Science 230(1985)1350-1354; Mullis K,B．and Faloona F.A.， Meth.Enzym．155(1987)335-350］によるＤＮＡ断片の酵素的増幅を、製 造者の説明に従って、「ＤＮＡ熱サイクル装置(DNA thermal cycler)」（Perkin Elmer Cetus）を用いて行うことができる。 ヌクレオチド配列の検証は、アマシャムが販売するキットを用いて、サンガー らが開発した方法（Sanger et al,，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74(1977)5463-546 7）によって行うことができる。使用する細胞系 以下の実施例においては、下記の細胞系を使用したか、もしくは使用すること ができる。 −ヒト胎児腎臓系２９３（Graham et al.，J.Gen.Virol.36(1977)59）。この 細胞系は特に、そのゲノムに統合された形で、ヒトアデノウィルスＡｄ５のゲノ ムの左側部分を有する（１２％）。 −ヒト細胞系ＫＢ（ヒト表皮癌から誘導したもの）。この細胞系は、その培養 可能条件と共にＡＴＣＣ（参照番号ＣＣＬ１７）で入手できる。 −ヒト細胞系Ｈｅｌａ（ヒト上皮の癌から誘導したもの）。この細胞系は、そ の培養可能条件と共にＡＴＣＣ（参照番号ＣＣＬ２）で入手できる。 −イヌ細胞系ＭＤＣＫ。ＭＤＣＫ細胞の培養条件については、マッカトニーら （Macatney et al.，Science 44(1988)9）によって特に詳細に記載されている。 −細胞系ｇｍＤＢＰ６（Brough et al.,Virology 190(1992)624）。この細胞 系は、ＭＭＴＶのＬＴＲの制御下にアデノウィルスＥ２遺伝子を有するＨｅｌａ 細胞からなる。実施例 実施例１−プラスミドｐＣＯ１の形成（図３） Ａ−プラスミドｐＣＥの形成 Ａｄ５アデノウィルスゲノムの左側末端に相当するＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片 を最初に、ベクターｐＩＣ１９ＨのＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位の間にクロー ニングした。これによりプラスミドｐＣＡが得られる。次に、プラスミドｐＣＡ をＨｉｎｆＩで切断し、その突出５’末端を大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのク レノウ断片で充填し、次にそれをＥｃｏＲＩで切断した。そうしてプラスミドｐ ＣＡから得られた、Ａｄ５アデノウィルスゲノムの左側末端を有する断片を次に 、ベクターｐＩＣ２０Ｈ（Marsh et al.，Gene 32(1984)481）のＥｃｏＲＩ部位 とＳｍａＩ部位との間にクローニングした。これによってプラスミドｐＣＢが得 られる。次に、プラスミドｐＣＢをＥｃｏＲＩで切断し、それの突出５’末端を 大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で充填し、それをＢａｍＨＩで切 断した。そうしてプラスミドｐＣＢから生じたＡｄ５アデノウィルスゲノムの左 側末端を有する断片を、ベクターｐＩＣ２０ＨのＮｒｕＩ部位とＢｇｌＩＩ部位 の間にクローニングした。これによ り、Ａｄ５アデノウィルスの最初の３８２個の塩基対を有し、それに続いて多重 クローニング部位を有するという有利な特徴を持っプラスミドｐＣＥが得られる 。 Ｂ−プラスミドｐＣＤ’の形成 最初にＡｄ５アデノウィルスゲノムのＳａｕ３Ａ（３３４６）〜ＳｓｔＩ（３ ６４５）断片とＳｓｔＩ（３６４５）〜ＮａｒＩ（５５１９）断片を連結し、ベ クターｐＩＣ２０ＨのＣｌａＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間にクローニングした。 これによりプラスミドｐＰＹ５３が得られる。次に、ｄａｍ文脈から得られた、 Ｓａｕ３Ａ（３３４６）部位からＴａｑＩ（５２０７）部位のＡｄ５アデノウィ ルスゲノムの一部を有するプラスミドｐＰＹ５３のＳａｌＩ−Ｔａｑ−Ｉ断片を 、ベクターｐＩＣ２０ＨのＳａｌＩ部位とＣｌａＩ部位の間にクローニングした 。それによってプラスミドｐＣＡ’が得られる。次に、ｄａｍ文脈から得られた Ａｄ５アデノウィルスゲノムのＴａｑＩ（５２０７）−ＮａｒＩ（５５１９）断 片とプラスミドｐＣＡ’のＳａｌＩ−ＴａｑＩ断片とを連結し、ベクターｐＩＣ ２０ＨのＳａｌＩ部位とＮａｒＩ部位の間にクローニングした。これにより、プ ラスミドｐＣＣ’が得られる。次に、ｄａｍ文脈か ら得られたＡｄ５アデノウィルスゲノムのＮａｒＩ（５５１９）−ＮｒｕＩ（６ ３１６）断片とプラスミドｐＣＣ’のＳａｌＩ−ＮａｒＩ断片とを連結し、ベク ターｐＩＣ２０ＨのＳａｌＩ部位とＮｒｕＩ部位の間にクローニングした。これ により、プラスミドｐＣＤ’が得られる。 Ｃ−プラスミドｐＣＯ１の形成 プラスミドｐＣＤ’のＸｈｏＩによる部分消化と、次にＳａｌＩによる完全消 化を行って、Ｓａｕ３Ａ（３４４６）部位からＮｒｕＩ（６３１６）部位のＡｄ ５アデノウィルス配列を有する制限断片が得られる。この断片を、プラスミドｐ ＣＥのＳａｌＩ部位にクローニングした。これにより、ＨｉｎｆＩ部位（３８２ ）までのＡｄ５アデノウィルスの左側部分、多重クローニング部位ならびにＡｄ ５アデノウィルスのＳａｕ３Ａ（３４４６）−ＮｒｕＩ（６３１６）断片を有す るプラスミドｐＣＯ１が得られる（図３）。実施例２−プラスミドｐＣＯ２の形成（図４） Ａ−プラスミドｐＣＤ”の形成 最初にＡｄ５アデノウィルスゲノムのＢｓｓＨＩＩ（４１０６）−ＢｓｔＥＩ Ｉ（５１８６）断片に相当するＢｓｓＨＩＩ −ＢｓｔＥＩＩ断片をプラスミドｐＣＡ’から除去した。これによりプラスミド ｐＣＢ”が得られ、このプラスミドは、ＩＶａ２遺伝子の配列の一部に関して欠 失を有するという有利な特徴を持っている。次に、ｄａｍ文脈から得られたＡｄ ５アデノウィルスゲノムのＴａｑＩ（５２０７）−ＮａｒＩ（５５１９）断片と プラスミドｐＣＢ”のＳａｌＩ−ＴａｑＩ断片を連結し、ベクターｐＩＣ２０Ｈ のＳａｌＩ部位とＮａｒＩ部位の間にクローニングした。これにより、プラスミ ドｐＣＣ”が得られる。次に、ｄａｍ文脈から得られたＡｄ５アデノウィルスゲ ノムのＮａｒＩ（５５１９）−ＮｒｕＩ（６３１６）断片とプラスミドｐＣＣ” のＳａｌＩ−ＮａｒＩ断片を連結し、ベクターｐＩＣ２０ＲのＳａｌＩ部位とＮ ｒｕＩ部位の間にクローニングした。これによりプラスミドｐＣＤ”が得られる 。 Ｂ−プラスミドｐＣＯ２の形成 プラスミドｐＣＤ”のＸｈｏＩによる部分消化と、次にＳａｌＩによる完全消 化を行って、Ｓａｕ３Ａ（３４４６）部位からＮｒｕＩ（６３１６）部位のＡｄ ５アデノウィルス配列を有し、ＢｓＳＨＩＩ（４１０６）−ＢｓｔＥＩＩ（５１ ８６）断片が欠失した制限断片が得られる。この断片を、プラスミド ｐＣＥのＳａｌＩ部位にクローニングした。これにより、ＨｉｎｆＩ部位（３８ ２）までのＡｄ５アデノウィルスの左側部分、多重クローニング部位ならびにＡ ｄ５アデノウィルスのＳａｕ３Ａ（３４４６）−ＮｒｕＩ（６３１６）断片を有 し、ＢｓｓＨＩＩ（４１０６）−ＢｓｔＥＩＩ（５１８６）断片が欠失したプラ スミドｐＣＯ２が得られる（図４）。実施例３−Ｅ１遺伝子に欠失を有する組換えアデノウィルスの形成 本実施例は、ヌクレオチド３８２からヌクレオチド３４４６にかけてＥ１領域 に欠失を有する欠陥組換えアデノウィルスの形成について説明する。このアデノ ウィルスは、Ｅ１遺伝子に比較的大きい欠失を持つことで、高いクローニング能 力を与え、特に組換えの危険性が低減していることから、特に有利である。 この組換えアデノウィルスは、in vivoでの組換えにより、リン酸カルシウム の存在下、ＣｌａＩによって消化されたＡｄＲＳＶβｇａｌウィルスからのＤＮ ＡとＸｍｎＩによって消化されたプラスミドｐＣＯ１からのＤＮＡを細胞２９３ に同時トランスフェクションすることで得た。次にその細胞を回収し、 その上清中で３回の凍結−解凍サイクルを行うことで破壊し、次に４０００ｒｐ ｍで１０分間遠心する。そうして得られた上清を新鮮な細胞培地で増幅する。次 に、ウィルスをプラークから精製し、そのＤＮＡをヒルト（Hirt）法（上記で引 用）に従って分析する。次に、塩化セシウム勾配でウィルスストックを調製する 。実施例４−Ｅ１遺伝子およびＩＶａ２遺伝子に欠失を有する組換えアデノウィル スの形成 本実施例は、ヌクレオチド３８２からヌクレオチド３４４６にかけてＥ１領域 に欠失を有し、ＩＶａ２領域に欠失を有する欠陥組換えアデノウィルスの形成に ついて説明する。このアデノウィルスは、実施例３に記載のアデノウィルスと比 較して、ＩＶａ２遺伝子に欠失を持つことで、高いクローニング能力を与え、in vivoでウィルス蛋白が産生する危険性が低減していることから、特に有利であ る。 Ａ−Ｅ１機能をトランス補足する細胞系（Ｅ１＋）における欠陥組換えアデノ ウィルスΔＥ１−ΔＩＶａ２の形成 以下の３つの手順に従って、上記組換えアデノウィルスを得た。 （ａ）ＣｌａＩで消化したＡｄＲＳＶβｇａｌウィルスＤＮＡとＸｍｎＩで消 化したプラスミドｐＣＯ２を、リン酸カルシウムの存在下に細胞Ｅ１⁺（２９３ もしくは２９３Ｅ４）中に同時トランスフェクションして、in vivoでの組換え ができるようにした。 （ｂ）ＣｌａＩおよびＸｃａＩで消化したＡｄＲＳＶβｇａｌウィルスＤＮＡ とＸｍｎＩで消化したプラスミドｐＣＯ２を、リン酸カルシウムの存在下に細胞 Ｅ１⁺（２９３もしくは２９３Ｅ４）中に同時トランスフェクションして、in io voでの組換えができるようにした。 （ｃ）最初にいずれもＸｃａＩで消化したＡｄＲＳＶβｇａｌウィルスＤＮＡ とプラスミドｐＣＯ２を最初にin vitroで連結し、次に得られた構成体をリン酸 カルシウムの存在下に細胞Ｅ１⁺（２９３もしくは２９３Ｅ４）中にトランスフ ェクションする。 （ｄ）ＣｌａＩで消化したＡｄＲＳＶβｇａｌウィルスＤＮＡ、Ｘｍｎ１で消 化したプラスミドｐＣＯ２ ＤＮＡおよびヘルパーウィルスｐＡＣ２のＤＮＡを 、リン酸カルシウムの存在下に細胞Ｅ１⁺（２９３もしくは２９３Ｅ４）中に同 時トラン スフェクションした。 （ｅ）Ｃｌａ１で消化したＡｄＲＳＶβｇａｌウィルスＤＮＡ、Ｘｍｎ１で消 化したプラスミドｐＣＯ６ ＤＮＡおよびヘルパーウィルスｐＡＣ２のＤＮＡを 、リン酸カルシウムの存在下に細胞Ｅ１⁺（２９３もしくは２９３Ｅ４）中に同 時トランスフェクションした（プラスミドｐＡＣ２およびｐＣＯ６については、 実施例７に記載してある）。 次に、得られたウィルスを増幅し、実施例３に記載の方法に従って精製する。 Ｂ−ＩＶａ２機能をトランス補足する細胞系におけるアデノウィルスΔＥ１− ΔＩＶａ２の形成 アデノウィルスＡｄ５のＩＶａ２領域を発現する細胞クローンで、アデノウィ ルスΔＥ１−ΔＩＶａ２を以下の２つの手順に従って得ることができた。 （ａ）Ｃｌａ１で消化したＡｄＲＳＶβｇａｌウィルスＤＮＡとＸｍｎ１で消 化したプラスミドｐＣＯ２ ＤＮＡを、リン酸カルシウムの存在下に細胞中に同 時トランスフェクションした。 （ｂ）Ｃｌａ１で消化したＡｄＲＳＶβｇａｌウィルスＤＮ ＡとＸｍｎ１で消化したプラスミドｐＣＯ６ ＤＮＡを、リン酸カルシウムの存 在下に細胞中に同時トランスフェクションした。実施例５−Ｅ１、Ｅ３およびＩＶａ２遺伝子に欠失を有する組換えアデノウィル スの形成 本実施例は、ヌクレオチド３８２からヌクレオチド３４４６にかけてのＥ１領 域の欠失、ＩＶａ２遺伝子における欠失、しかもＥ３領域の欠失を有する欠陥組 換えアデノウィルスの形成について説明する。このアデノウィルスは、実施例４ に記載のアデノウィルスと比較して、Ｅ３領域に欠失を有することで、高いクロ ーニング能力を与えることから特に有利である。 以下の３つの手順に従って、上記組換えアデノウィルスを得た。 （ａ）ＣｌａＩで消化したＡｄｄｌ３２４ウィルスＤＮＡとＸｍｎＩで消化し たプラスミドｐＣＯ２を、リン酸カルシウムの存在下に細胞２９３中に同時トラ ンスフェクションして、in vivoでの組換えができるようにした。 （ｂ）ＣｌａＩおよびＸｃａＩで消化したＡｄｄｌ３２４ウィルスＤＮＡとＸ ｍｎＩで消化したプラスミドｐＣＯ２を、リ ン酸カルシウムの存在下に細胞２９３中に同時トランスフェクションして、in v ivoでの組換えができるようにした。 （ｃ）最初にいずれもＸｃａＩで消化したＡｄｄｌ３２４ウィルスＤＮＡとプ ラスミドｐＣＯ２をin vitroで連結し、次に得られた構造体をリン酸カルシウム の存在下に細胞２９３中にトランスフェクションする。 得られるウィルスを、実施例３に記載の方法に従って増幅・精製する。実施例６−Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４およびＩＶａ２遺伝子に欠失を有する組換えアデノ ウィルスの形成 本実施例は、ゲノムからＩＶａ２、Ｅ１、Ｅ３およびＥ４遺伝子が欠失した本 発明による欠陥組換えアデノウィルスの製造について説明する。第１にこのアデ ノウィルスは、異種遺伝子を組み込むかなり高い能力を有する。さらにそのベク ターは、ＩＶａ２領域とＥ４領域に欠失があることから、非常に安全である。後 者は実際には、後期遺伝子の発現調節、後期プレメッセンジャーＲＮＡの処理、 宿主細胞の蛋白発現の消去ならびにウィルスＤＮＡの複製の効率に関与している 。従ってこのベクターは、転写バックグラウンドノイズとウィルス遺伝子発現が 非常に低減されている。最後に、特に有利な形態では、このベクターを高力価で 得ることができる。 ウィルスゲノムの右側部分が、Ｅ３領域およびＥ４領域に関して欠失があるか （項目Ｂ参照）、あるいは例えばケトナーらの報告（G.Ketner，J．of Virology ，63(1989)631）に記載のウィルスｄｌ８０８、ｄｌ１００４、ｄｌ１００７も しくはｄｌ１０１０の場合のようにＥ４領域に関してのみ欠失を持っている。別 の選択肢によれば、その右側部分はいくつかの部分、例えばin vitroで形成され て、プラスミドｐＰＹ５５から以下のようにして得られるウィルスで提供される ものなどのようにＥ３およびＥ４領域に欠失を持つことができる。 Ａ／Ｅ１、Ｅ３およびＥ４遺伝子に欠失を持つアデノウィルスの形成 Ａ．１．プラスミドｐＰＹ５５の形成 ａ）プラスミドｐＰＹ３２の形成 最初に、Ａｄ５アデノウィルスのゲノムの右側末端に相当するプラスミドｐＦ Ｇ１４４のＡｖｒＩＩ−ＢｃＩＩ断片［F.L.Graham et al.，EMBO j.8(1989)207 7-2085］を、ｄａｍ文脈から得られたベクターｐＩＣ１９ＨのＸｂａＩ部位とＢ ａｍＨＩ 部位の間にクローニングした。これにより、プラスミドｐＰＹ２３が得られる。 プラスミドｐＰＹ２３の一つの有利な特徴は、ベクターｐＩＣ１９Ｈの多重クロ ーニング部位から得られるＳａｌＩ部位が非反復配列のままであり、それがＡｄ ５アデノウィルスのゲノムの右側末端の横に位置することである。次に、位置３ ５６１４に局在するＨａｅＩＩＩ部位からの、Ａｄ５アデノウィルスのゲノムの 右側末端を有するプラスミドｐＰＹ２３のＨａｅＩＩＩ−ＳａｌＩ断片を、ベク ターｐＩＣ２０ＨのＥｃｏＲＶ部位とＸｈｏＩ部位の間にクローニングした。こ れによりプラスミドｐＰＹ２９が得られる。このプラスミドの一つの有利な特徴 は、ベクターｐＩＣ２０Ｈの多重クローニング部位から得られるＸｂａＩ部位お よびＣｌａＩ部位がクローニングから生じるＥｃｏＲＶ／ＨａｅＩＩＩ結合の横 に局在することである。さらに、この結合は、この時点ではｄａｍ＋文脈でメチ ル化可能（methylable）になっているＣｌａＩ部位に直接隣接するヌクレオチド 文脈を修飾する。Ａｄ５アデノウィルスのゲノムのＸｂａＩ（３０４７０）−Ｍ ａｅＩＩ（３２８１１）断片をｄａｍ文脈から得られたプラスミドｐＰＹ２９の ＸｂａＩ部位とＣｌａＩ部位の間にクローニングした。これ によってプラスミドｐＰＹ３０が得られる。最後に、位置３０５５６のＳｓｔＩ 部位から右側末端までのＡｄ５アデノウィルスのゲノムの配列に相当するプラス ミドｐＰＹ３０のＳｓｔＩ断片をベクターｐＩＣ２０ＨのＳｓｔＩ部位間でクロ ーニングした。それによってプラスミドｐＰＹ３１が得られる。そのＨｉｎｄＩ ＩＩ部位間に局在する挿入物の制限マップを図５に示してある。 プラスミドｐＰＹ３１のＢｇｌＩＩによる部分消化と、それに続くＢａｍＨＩ による完全消化、およびその後の再連結によって、プラスミドｐＰＹ３２を得た 。従って、プラスミドｐＰＹ３２は、プラスミドｐＰＹ３１のＢａｍＨＩ部位と 位置３０８１８に局在するＢｇｌＩＩ部位の間に位置するＡｄ５アデノウィルス のゲノムに関しての欠失に相当する。プラスミドｐＰＹ３２のＨｉｎｄＩＩＩ断 片の制限マップを図５に示してある。プラスミドｐＰＹ３２の一つの特徴は、そ れが非反復のＳａｌＩ部位およびＸｂａＩ部位を有することである。 ｂ）プラスミドｐＰＹ４７の形成 最初に、Ａｄ５アデノウィルスのゲノムのＢａｍＨＩ（２１５６２）−Ｘｂａ Ｉ（２８５９２）断片を、ｄａｍ文脈 から得られたベクターｐｌＣ１９ＨのＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位の間にクロ ーニングした。これにより、プラスミドｐＰＹ１７が得られる。従ってこのプラ スミドはＡｄ５アデノウィルスのゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ（２６３２８）−Ｂａ ｌＩＩ（２８１３３）断片を有し、それをベクターｐＩＣ２０ＲのＨｉｎｄＩＩ Ｉ部位とＢｇｌＩＩ部位の間にクローニングして、プラスミドｐＰＹ３４を得る ことができる。このプラスミドの一つの特徴は、多重クローニング部位から得ら れるＢａｍＨＩ部位がＡｄ５アデノウィルスのゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ（２６３ ２８）部位に直接隣接して局在することである。 次に、プラスミドｐＰＹ１７から得られたＡｄ５アデノウィルスのゲノムのＢ ａｍＨＩ（２１５６２）−ＨｉｎｄＩＩＩ（２６３２８）断片を、プラスミドｐ ＰＹ３４のＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にクローニングした。これ により、プラスミドｐＰＹ３９が得られる。次に、ｄａｍ文脈から得られ、Ｂａ ｍＨＩ（２１５６２）部位からＢａｌＩＩ（２８１３３）部位のＡｄ５アデノウ ィルスのゲノムを一部を有するプラスミドｐＰＹ３９のＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断 片を、ｄａｍ文脈から得られるベクターｐＩＣ１９ＨのＢａｍＨＩ部 位とＸｂａＩ部位の間にクローニングした。これによりプラスミドｐＰＹ４７が 得られる。そのプラスミドの一つの有利な特徴は、多重クローニング部位から得 られるＳａｌＩ部位が、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の隣接部分に局在することである（ 図６）。 ｃ）プラスミドｐＰＹ５５の形成 ｄａｍ文脈から得られたプラスミドｐＰＹ４７のＳａｌＩ−ＸｂａＩ断片で、 ＢａｍＨＩ（２１５６２）部位からＢｇｌＩＩ（２８１３３）部位までのＡｄ５ アデノウィルスのゲノムの一部を有するものを、プラスミドｐＰＹ３２のＳａｌ Ｉ部位とＸｂａＩ部位の間にクローニングした。これにより、プラスミドｐＰＹ ５５が得られる。このプラスミドを用いて、少なくとも、Ｅ３領域に関して欠失 （Ａｄ５アデノウィルスのゲノムの位置２８１３３および３０８１８に局在する ＢｇｌＩＩ部位間の欠失）およびＥ４全体に関する欠失（Ａｄ５アデノウィルス のゲノムのＭａｅＩＩ（３２８１１）部位とＨａｅＩＩＩ（３５６１４）部位の 間の欠失）を有する組換えアデノウィルスを直接形成することができる（図６） 。 Ａ．２．プラスミドｐＥ４Ｇａｌの形成 この場合、Ａｄ５からのＪ鎖ＩＴＲ、カプシド形成配列、そ れ自体のプロモーターの制御下にあるＥ４遺伝子および異種遺伝子としてＲＳＶ ウィルスのＬＴＲプロモーターの制御下にあるＬａｃＺ遺伝子を有するプラスミ ドを形成した（図７）。このｐＥ２Ｇａｌという名称のプラスミドは、以下の断 片のクローニングおよび連結反応によって得た（図７参照）。 −プラスミドｐＦＧ１４４（Graham etal.，EMBO J.8(1989)2077）から誘導さ れるＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩＩ断片。この断片は、縦一列のＡｄ５からのＩＴ Ｒ配列およびカプシド形成配列を有する。ＨｉｎｄＩＩＩ（３４９２０）−Ｓａ ｃＩＩ（３５２）断片。 −ＳａｃＩＩ（塩基対３８２７のレベルで局在）部位とＰｓｔＩ（塩基対４２ ４５のレベルで局在）部位の間のＡｄ５からの断片。 −ＰｓｔＩ（ｂｐ３２）部位とＳａｌＩ（ｂｐ３４）部位の間のｐＳＰ７２（ Promega）の断片。 −ストラトフォード−ペリコードらの報告（Stratford-Perricaudet et al，J CI 90(1992)626）に記載のプラスミドｐＡｄＬＴＲ ＧａｌＩＸのＸｈｏＩ−Ｘ ｂａＩ断片。この断片は、ＲＳＶウィルスのＬＴＲの制御下にＬａｃＺ遺伝子を 有す る。 −プラスミドｐＳＰ７２のＸｂａＩ（ｂｐ４０）−ＮｄｅＩ（ｂｐ２３７９） 断片。 −Ａｄ５のＮｄｅＩ（ｂｐ３１０８９）−ＨｉｎｄＩＩＩ（ｂｐ３４９３０） 。Ａｄ５ゲノムの右側末端から局在するこの断片は、それ自体のプロモーターの 制御下にＥ４領域を有する。それを、プラスミドｐＳＰ７２のＮｄｅＩ（２３７ ９）部位および最初の断片のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。 このプラスミドは、プラスミドｐＳＰ７２の指定の領域中に各種断片をクロー ニングすることで得た。等価な断片であることがわかる［lacuna］。 Ａ．３．細胞２９３中への同時トランスフェクション 以下の戦略に従って、in vivoでの組換えにより、アデノウィルスが得られる 。 （ｉ）最初にいずれもＢａｍＨＩで消化したＡｄ−ｄｌ３２４ウィルス（Thim mappaya et al.，Cell 31(1982)543）およびプラスミドｐＰＹ５５をin vitroで 連結し、次にプラスミドｐＥＡＧａｌとともに細胞２９３に同時トランスフェク ションする。 （ｉｉ）ＥｃｏＲＩで消化したＡｄ−ｄ１３２４およびＢａｍＨＩで消化した プラスミドｐＰＹ５５からのＤＮＡを、プラスミドｐＥ４Ｇａｌとともに細胞２ ９３に同時トランスフェクションする。 （ｉｉｉ）いずれもＢａｍＨＩで消化したＡｄ５アデノウィルスおよびプラス ミドｐＰＹ５５を連結し、次にプラスミドｐＥ４Ｇａｌとともに細胞２９３に同 時トランスフェクションする。 （ｉｖ）ＥｃｏＲＩで消化したＡｄ５アデノウィルスおよびＢａｍＨＩで消化 したプラスミドｐＰＹ５５からのＤＮＡを、ｐＥＡＧａｌとともに細胞２９３に 同時トランスフェクションする。 戦略（ｉ）および（ｉｉ）により、Ｅ１、Ｅ３およびＥ４領域に関して欠失を 有する組換えアデノウィルスを形成することができる。戦略（ｉｉｉ）および（ ｉｖ）によって、Ｅ３およびＥ４領域に関して欠失を有する組換えアデノウィル スを形成することができる。さらに、Ｅ１領域を発現する細胞系（例：細胞系２ ９３）で、さらに少なくともＡｄ５アデノウィルス Ｅ４領域の読み取り枠ＯＲＦ６およびＯＲＦ６／７も発現するものから誘導され る細胞系を用いることも可能である（ＦＲ９３０８５９６参照）。そのような細 胞系を用いることで、プラスミドｐＥ４Ｇａｌの使用を回避することができる。 Ｂ／ＩＶａ２、Ｅ１、Ｅ３およびＥ４遺伝子に欠失を有するアデノウィルスの 形成 このアデノウィルスは、プラスミドｐＣＯ２（実施例２）および少なくともＥ ４領域に関して欠失を有するアデノウィルスの右側部分、ならびにプラスミドｐ ＰＹ５５を用いることで得られるアデノウィルスを細胞２９３に同時トランスフ ェクションすることにより、組換えで得た（項目Ａ参照）。 リン酸カルシウムでの同時トランスフェクション後、細胞を回収し、その上清 中で３回の凍結−解凍サイクルによって破壊し、次に４０００ｒｐｍで１０分間 で遠心する。そうして得られる上清を新鮮な細胞培地で増幅する。次に、細胞を プラークから精製し、そのＤＮＡをハート法（上記で引用）に従って分析する。 次に、塩化セシウム勾配でウィルスストックを調製する。実施例７−Ｅ１、Ｅ４、ＩＶａ２遺伝子に欠失を有する組換えアデノウィルスの 形成 Ａ−プラスミドｐＣＯ６の形成（図８） Ａ．１−プラスミドｐＧＹ３８の形成 塩基３９２４〜６３１６の範囲のＡｄ５アデノウィルスゲノムの配列を有する プラスミドｐＣＯ１のＭｕｎ１−Ｎｒｕ１断片、特にＩＶａ２遺伝子（塩基４０ ９４〜５７１９）を、市販のベクターｐＳＬ１１８０のＭｕｎ１部位とＮｒｕ１ 部位の間にクローニングした。これにより、プラスミドｐＧＹ３８が得られる。 Ａ．２−プラスミドｐＧＹ３９の形成 以下のヌクレオチド配列およびその相補的鎖を、従来の分子生物学的方法によ って人為的に合成した。 各鎖はその３’末端にＳｐｈ１制限部位を有する。この配列を、プラスミドｐ ＧＹ３８のＳｐｈ１部位にクローニングした。それにより、Ａｄ５アデノウィル スの塩基５１４１に相当するＳｐｈ１部位でＩＶａ２遺伝子のコード部分に終止 コドンが導入される。これにより、プラスミドｐＧＹ３９が得られる。こ のプラスミドにおいては、そうして修飾されたＩＶａ２遺伝子が不活化されてい る。それは、野生型ＩＶａ２蛋白の最初の１０２個のアミノ酸に相当する不活性 蛋白をコードしている。 Ａ．３−プラスミドｐＣＯ６の形成 プラスミドｐＧＹ３９のＭｕｎ１−Ｎｒｕ１断片を、プラスミドｐＣＯ１のＭ ｕｎ１部位とＮｒｕ１部位の間にクローニングした。これにより、Ｈｉｎｆ１部 位（３８２）までのＡｄ５アデノウィルスの左側部分、多重クローニング部位、 Ａｄ５アデノウィルスのＳａｕ３Ａ（３４４６）−Ｓｐｈ１（５１４１）断片、 ＩＶａ２遺伝子のコード配列に終止コドンを提供するオリゴヌクレオチドならび にＡｄ５アデノウィルスのＳｐｈ１（５１４１）−Ｎｒｕ１（６３１６）断片を 有するプラスミドｐＣＯ６が得られる（図８）。Ｂ−プラスミドｐＡＣ２の形成（図９） Ｂ．１−プラスミドｐＳＰＩＴＲの形成 以下の断片のクローニングを行った。 −プラスミドｐＦＧ１４４（Graham et al.，EMBO J.8,1989，2027）から誘導 されるＨｉｎｄ３（３４９３０）−Ｓａｃ２（３５７）断片。この断片は、縦一 列のＡｄ５のＩＴＲ配列 およびカプシド形成配列を有する。 −Ｓａｃ２（Ａｄ５の塩基対３８２７のレベルで局在）部位とＰｓｔ１（塩基 対４２４５のレベルで局在）部位の間のＡｄ５アデノウィルス断片。 次に、市販のプラスミドｐＳＰ７２のＨｉｎｄ３部位とＰｓｔ１部位の間でこ れらの断片の連結反応を行うことで、プラスミドｐＳＰＩＴＲを得た。 Ｂ．２−プラスミドｐＡＣ２の形成 塩基４０２９〜６３１６の範囲のＡｄ５アデノウィルスゲノムの配列を有する プラスミドｐＣＯ１のＤｒａ１−Ｎｒｕ１断片、特にＩＶａ２遺伝子とそのプロ モーターを、ベクターｐＩＣ２０ＨのＥｃｏＲＶ部位中にクローニングした（J. L.March et al.，(1984)，Gene，32，481-485）。これにより、プラスミドｐＡ Ｃ１が得られる。プラスミドｐＡＣ１のＢｇｌ２−ＢａｍＨ１断片を、プラスミ ドｐＳＰＩＴＲのＢａｍＨ１部位中にクローニングした。これにより、プラスミ ドｐＡＣ２が得られる（図９）。Ｃ−プラスミドｐＡＣ５の形成（図１０） Ｃ．１−プラスミドｐＡＣ３の形成 市販のプラスミドｐＭＥＰ４（Invitrogen）のＥｃｏＲ１−Ｘｂａ１断片をプ ラスミドｐＡＣ１のＥｃｏＲ１部位とＸｂａ１部位の間で連結した。これにより 、ＥＣＮＡ１−ＯｒｉＰ配列およびＩＶａ２遺伝子を有することを一つの特徴と するプラスミドｐＡＣ３が得られる。 Ｃ．２−プラスミドｐＡＣ５の形成 市販のプラスミドｐＭＳＣＶのＳａｌ１−Ｘｈｏ１断片を、ベクターｐＩＣ２ ０ＨのＳａｌ１部位中にクローニングした。これにより、ｎｅｏ遺伝子を有する プラスミドｐＡＣ４が得られる。プラスミドｐＡＣ３のＸｂａ１−Ｎｒｕ１断片 を、プラスミドｐＡＣ４のＸｂａ１部位とＮｒｕ１部位の間にクローニングした 。これにより、それ自体のプロモーターの制御下にｎｅｏ遺伝子とＩＶａ２遺伝 子を有するという重要な特徴を持ったプラスミドｐＡＣ５が得られる（図１０） 。さらに、このプラスミドは、ＥＢＮＡ１／ＯｒｉＰ配列を有することから、真 核細胞で複製することができる。Ｄ−プラスミドｐＧＹ３７−ＴＫ−ＩＶａ２の形成（図１１） Ｄ．１−プラスミドｐＧＹ３２の形成 以下のヌクレオチド配列およびそれの相補的鎖を、従来の分子生物学的方法に よって人為的に合成した。 これは、その５’末端にＳａｌ１に対する制限部位を持ち、その３’末端にＥ ｃｏ４７ＩＩＩに対する制限部位を有する。この配列を、Ａｄ５アデノウィルス 配列の塩基５４１１に相当するＩＶａ２遺伝子の最初のＳａｌ１部位とＥｃｏ４ ７ＩＩＩ部位との間でプラスミドｐＡＣ１中に挿入した。これにより、ＩＶａ２ 遺伝子のＡＴＧの前のＫｏｚａｋ共通配列の上流に多重クローニング部位（Ｂａ ｍＨ１、Ａｆｌ２、Ｈｉｎｃ２）を有するという重要な特徴を持つプラスミドｐ ＧＹ３２が得られる。さらに、この構造体においては、ＩＶａ２遺伝子のイント ロンが抑圧された。 Ｄ．２−プラスミドｐＧＹ３３−ＴＫの形成 プラスミドｐＸ４Ｂ（B.Wasylyk et al.，N.A.R.(1987)，15，13，5490）のＴ ＫプロモーターのＢａｍＨ１（−１１０）− Ｈｉｎｃ２（＋３５）断片およびＳａｌ１部位とＢａｍＨ１部位によって仕切ら れた多重クローニング部位を連結し、次に、プラスミドＰＧＹ３２のＳａｌ１部 位とＨｉｎｃ２部位の間にクローニングした。これにより、ＴＫプロモーターの 制御下にイントロンを持たないＩＶａ２遺伝子を有するという有利な特徴を持っ たプラスミドｐＧＹ３３−ＴＫが得られる。 Ｄ．３−プラスミドｐＧＹ３４の形成 以下の断片を得て、次に連結した。 −市販のプラスミドｐＭＥＰ４のＸｂａ１−Ｐｖｕ１断片（５．５ｋｂ）。こ の断片は、ＥＢＮＡ１／ＯｒｉＰ配列とアンピシリン抵抗性遺伝子の５’末端を 有する。 −市販のプラスミドｐＭＥＰ４のＰｖｕ１−ＡｌｗＮ１断片（０．８ｋｂ）。 この断片は、アンピシリン抵抗性遺伝子の３’末端と複製起源の一部を有する。 −プラスミドｐＩＣ２０ＨのＸｂａ１およびＡｌｗＮ１断片（０．８ｋｂ）。 この断片は、複製起源の末端を有する。 これにより、ＥＢＮＡ１／ＯｒｉＰ配列を有するプラスミドｐＧＹ３４が得ら れる。 Ｄ．４−プラスミドｐＧＹ３６の形成 市販プラスミドｐＵＴ６１４（Cayla）のＢａｍＨ１断片を、ベクターｐＩＣ ２０ＨのＢａｍＨ１部位中にクローニングした。これにより、Ｚｅｏ遺伝子を有 するプラスミドｐＰＹ９が得られる。プラスミドｐＰＹ９のＸｂａ１−ＥｃｏＲ Ｖ断片を、ベクターｐＩＣ２０ＲのＸｂａ１部位とＮｒｕ１部位との間にクロー ニングした。これにより、プラスミドｐＧＹ３５が得られる。次に、ｄａｍ^-文 脈で得られたプラスミドｐＧＹ３５のＸｂａ１断片を、プラスミドｐＧＹ３４の Ｘｂａ１部位中にクローニングした。これにより、プラスミドｐＧＹ３６が得ら れる。 Ｄ．５−プラスミドｐＧＹ３７−ＴＫ−ＩＶａ２の形成（図１１） プラスミドｐＧＹ３３−ＴＫのＢｇｌ２−Ｓａｐ１断片を、プラスミドｐＧＹ ３６のＢｇｌ２部位とＳａｐ１部位の間にクローニングした。これにより、ＴＫ プロモーターの制御下に、イントロンを持たず、Ｚｅｏ遺伝子およびＩＶａ２遺 伝子を有するという重要な特徴を持ったプラスミドｐＧＹ３７−ＴＫ−ＩＶａ２ が得られる（図１１）。さらに、このプラスミドは、 ＥＢＮＡ１／ＯｒｉＰ配列を有することから、真核細胞を複製することができる 。Ｅ−プラスミドｐＧＹ３７−ＣＭＶ−ＩＶａ２の形成（図１２） Ｅ．１−プラスミドｐＧＹ３３−ＣＭＶの形成 市販プラスミドｐＣＩ（Promega）のＢｇｌ２−Ａｆｌ２断片を、プラスミド ＰＧＹ３２のＢａｍＨ１部位とＡｆｌ２部位の間にクローニングした。これによ り、ＣＭＶプロモーターの制御下にイントロンを持たずＩＶａ２遺伝子を有する という興味深い特徴を持ったプラスミドｐＧＹ３３−ＣＭＶが得られる。 Ｅ．２−プラスミドｐＧＹ３７−ＣＭＶ−ＩＶａ２の形成（図１２） プラスミドｐＧＹ３３−ＣＭＶのＢｇｌ２−Ｓａｐ１断片を、プラスミドｐＧ Ｙ３６のＢｇｌ２部位とＳａｐ１部位の間にクローニングした。これにより、Ｃ ＭＶプロモーターの制御下に、イントロンを持たず、Ｚｅｏ遺伝子およびＩＶａ ２遺伝子を有するという重要な特徴を持ったプラスミドｐＧＹ３７−ＣＭＶ−Ｉ Ｖａ２が得られる（図１２）。さらに、このプラスミドは、ＥＢＮＡ１／Ｏｒｉ Ｐ配列を有することから、真核細胞で複製することができる。Ｆ−Ａｄ５アデノウィルスのＩＶａ２領域を発現する細胞クローンの形成 ＩＶａ２機能をトランス補足する各種種類の細胞系を、Ｅ１⁺細胞（細胞２９ ３もしくは２９３Ｅ４）で形成した。 （ａ）プラスミドｐＡＣ５をリン酸カルシウム存在下に細胞２９３中にトラン スフェクションし、複製型プラスミドｐＡＣ５を有する細胞クローンをゲネチシ ン（geneticin）（Sigma，４００μｇ／ｍＬ）の存在下に選択した。 （ｂ）プラスミドｐＧＹ３７−ＴＫ−ＩＶａ２をリン酸カルシウム存在下に細 胞中にトランスフェクションし、複製型プラスミドｐＧＹ３７−ＴＫ−ＩＶａ２ を有する細胞クローンをフレオマイシン（phleomycin）（Cayla，細胞２９３に ついては１５μｇ／ｍＬ、細胞２９３Ｅ４については３０μｇ／ｍＬ）の存在下 に選択した。 （ｃ）プラスミドｐＧＹ３７−ＣＭＶ−ＩＶａ２をリン酸カルシウム存在下に 細胞中にトランスフェクションし、複製型プラスミドｐＧＹ３７−ＣＭＶ−ＩＶ ａ２を有する細胞クローンをフレオマイシン(Cayla、細胞２９３については１５ μｇ／ｍＬで細胞２９３Ｅ４については３０μｇ／ｍＬ）の存在下 に選択した。より正確には、これら３つの場合のそれぞれにおいて、直径５ｃｍ の皿に入った細胞を、リン酸カルシウム存在下にプラスミド１〜５μｇによって トランスフェクションした。細胞をトランスフェクションした後、その細胞を洗 浄し、次にウシ胎児血清を補充した（最終的に７％）培地（ＭＥＭ、Sigma）を 加え、細胞を２４時間インキュベーションする。翌日、細胞をゲネチシンもしく はフレオマイシンの存在下に選択する。ゲネチシンもしくはフレオマイシンは３ 日ごとに変え、約３週間後に選択可能なクローンが現れる。未トランスフェクシ ョン細胞が全て死滅した時に、トランスフェクションした細胞のみを分けて、細 胞クローンを得る。細胞クローンが十分大きくなって肉眼で見ることができるよ うになったら、それを個々に「２４本溝」培養プレートの培養孔に移す。次に、 ゲネチシンもしくはフレオマイシンの存在下に、最初は「１２本溝」、次は「６ 本溝」の培養プレートの孔で各クローンを順次増幅し、次に細胞培養皿中で増幅 する。Ｇ−Ｅ１−ＩＶａ２−Ｅ４遺伝子に欠失を有する組換えアデノウィルスの形成 Ｇ．１−ＩＶａ２遺伝子を有するヘルパーウィルスの同時トランスフェクショ ンによる、アデノウィルスΔＥ１−ΔＩＶａ２−ΔＥ４の形成 例えば、以下の２つの手順に従って、アデノウィルスΔＥ１−ΔＩＶａ２−Δ Ｅ４を得ることができた。 （ａ）Ｃｌａ１で消化したΔＥ１−ΔＥ４ウィルス（例：イエーらの報告（P. YEH el al.，"Efficient dual transcomplementation of adenovirus El and E4 regions from a 293-derived cell line expressing a minimal E4 functional unlt"，J,Virology、印刷中）に記載のＡｄＲＳＶβｇａｌ−ｄｌ１００４、Ａ ｄＲＳＶβｇａｌ−ｄｌ１００７もしくはＡｄＲＳＶβｇａｌ−ｄｌ１０１４） のＤＮＡ、Ｘｍｎ１で消化したプラスミドｐＣＯ２ ＤＮＡおよびヘルパーウィ ルスｐＡＣ２ＤＮＡを、リン酸カルシウム存在下に２９３Ｅ４細胞中に同時トラ ンスフェクションした。 （ｂ）Ｃｌａ１で消化したΔＥ１−ΔＥ４ウィルスのＤＮＡ、Ｘｍｎ１で消化 したプラスミドｐＣＯ６ ＤＮＡおよびヘルパ ーウィルスｐＡＣ２ ＤＮＡを、リン酸カルシウム存在下に２９３Ｅ４細胞中に 同時トランスフェクションした。 Ｇ．２−ＩＶａ２およびＥ４の機能をトランス補足する細胞系でのアデノウィ ルスΔＥ１−ΔＩＶａ２−ΔＥ４の形成 Ａｄ５アデノウィルスのＩＶａ２領域およびＥ４領域を発現し、フレオマイシ ンに対して抵抗性の細胞クローンにおいて、以下の２つの手順に従って、アデノ ウィルスΔＥ１−ΔＩＶａ２−ΔＥ４を得ることができた。 （ａ）Ｃｌａ１で消化したΔＥ１−ΔＥ４ウィルスのＤＮＡおよびＸｍｎ１で 消化したプラスミドｐＣＯ２ ＤＮＡを、リン酸カルシウム存在下に細胞中に同 時トランスフェクションした。 （ｂ）Ｃｌａ１で消化したΔＥ１−ΔＥ４ウィルスのＤＮＡおよびＸｍｎ１で 消化したプラスミドｐＣＯ６ ＤＮＡを、リン酸カルシウム存在下に細胞中に同 時トランスフェクションした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/43 Ａ６１Ｋ 37/48 48/00 ＡＢＡ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 37/66 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ビーニユ，エマニユエル フランス国、エフ−94200・イブリイ−ス ユール−セーヌ、リユ・ジヤン−ル−ガル ウ、60 (72)発明者 イエ，パトウリス フランス国、エフ−75005・パリ、リユ・ ラセペードウ、11・ビス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 少なくともＩＶａ２遺伝子が不活化されている欠陥組換えアデノウィルス 。 ２． ＩＶａ２遺伝子が１以上の塩基の突然変異および／または欠失によって不 活化されている請求項１に記載の組換えアデノウィルス。 ３． ＩＶａ２遺伝子が部分的欠失によって不活化されている請求項２に記載の 組換えアデノウィルス。 ４． ＩＶａ２遺伝子がヌクレオチド４１０６からヌクレオチド５１８６の範囲 の断片の欠失によって不活化されている請求項３に記載の組換えアデノウィルス 。 ５． ＩＴＲおよびカプシド形成領域を有する請求項１ないし４のいずれかに記 載の組換えアデノウィルス。 ６． 異種核酸配列を有する請求項５に記載の組換えアデノウィルス。 ７． Ｅ１遺伝子およびＩＶａ２遺伝子の全体もしくは一部に関して欠失を有す ることを特徴とする欠陥組換えアデノウィルス。 ８． Ｅ１遺伝子にヌクレオチド３８２からヌクレオチド３４４６の範囲の欠失 があり、ＩＶａ２遺伝子にヌクレオチド４１０６からヌクレオチド５１８６の範 囲の欠失があることを特徴とする欠陥組換えアデノウィルス。 ９． Ｅ４遺伝子およびＩＶａ２遺伝子の全体もしくは一部に関して欠失を有す ることを特徴とする欠陥組換えアデノウィルス。 １０． Ｅ１、ＩＶａ２およびＥ３遺伝子の全体もしくは一部に関して欠失を有 することを特徴とする欠陥組換えアデノウィルス。 １１． Ｅ１、ＩＶａ２およびＥ４遺伝子の全体もしくは一部に関して欠失を有 することを特徴とする欠陥組換えアデノウィルス。 １２． Ｅ１、ＩＶａ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子の全体もしくは一部に関して欠 失を有することを特徴とする欠陥組換えアデノウィルス。 １３． Ｅ１、ＩＶａ２、Ｅ３、Ｌ５およびＥ４遺伝子の全体もしくは一部に関 して欠失を有することを特徴とする欠陥組換えアデノウィルス。 １４． ヒト起源、動物起源もしくは両方の起源のものである請求項１ないし１ ３のいずれかに記載のアデノウィルス。 １５． ヒト起源のアデノウィルスが群Ｃに分類されるもの、好ましくは２型ま たは５型のアデノウィルス（Ａｄ２またはＡｄ５）から選択される請求項１３に 記載のアデノウィルス。 １６． 動物起源のアデノウィルスが、イヌ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、ト リおよびサル起源のアデノウィルスから選択される請求項１３に記載のアデノウ ィルス。 １７． さらに、異種プロモーターの制御下にｇｐ１９Ｋ蛋白をコードするＥ３ 遺伝子の一部を有する請求項１ないし１６のいずれかに記載のアデノウィルス。 １８． 異種核酸配列が治療効果を有する遺伝子および／または抗原性ペプチド をコードする遺伝子を有する請求項６に記載のアデノウィルス。 １９． 異種核酸配列がさらに、感染した細胞、臓器および／または生物体で機 能する転写のためのプロモーター領域をも有する請求項６に記載のアデノウィル ス。 ２０． 異種核酸配列がさらに、分泌配列を有する請求項６に記載のアデノウィ ルス。 ２１． ヌクレオチド３８２からヌクレオチド３４４６の範囲の欠失を有する欠 陥組換えアデノウィルス。 ２２． １以上の請求項１ないし２１のいずれかに記載の欠陥組換えアデノウィ ルスを含有する医薬組成物。 ２３． 医薬的に許容される注射剤用媒体を含有する請求項２２に記載の医薬組 成物。 ２４． 図３に示した特徴を有するプラスミドｐＣＯ１。 ２５． 図４に示した特徴を有するプラスミドｐＣＯ２。 ２６． 図８に示した特徴を有するプラスミドｐＣＯ６。 ２７． 図１０に示した特徴を有するプラスミドｐＡＣ５。 ２８． 図１１に示した特徴を有するプラスミドｐＧＹ３７−ＴＫ−ＩＶａ２。 ２９． 図１２に示した特徴を有するプラスミドｐＧＹ３７−ＣＭＶ−ＩＶａ２ 。