JPH10507184A - ヒトにおけるショック状態の診断評価法及び経過コントロール法及び治療用薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、患者の血液中のサイクロフィリンの濃度を、ａ）酵素学的方法、ｂ）特異的抗体を用いる免疫学的検出法、ｃ）ペプチド化学的方法、ｄ）放射線化学的方法を用いて測定し、このショック度の評価のために使用することを特徴とする、ショック状態を検出し、かつショック患者を治療コントロールする方法、並びに、ショック患者の血液中の活性サイクロフィリンの濃度を低める医薬品、生物学的作用物質及び物理化学的方法を、ショック、殊に敗血症、術後ショック及び毒性ショックの治療のために使用することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトにおけるショック状態の診断評価法 及び経過コントロール法及び治療用薬剤 本発明の目的は、ヒトにおけるショック状態の診断評価法及び経過コントロー ル法及び治療用薬剤である。 主要工業国においては、毎年、数千人が直接種々のショックの形で、又はその ショックに直接引き続いて死亡している。ショックとは、血圧低下による特徴で 現れる生命に重要な臓器の血流の急性の調節不全であると理解されている。この 急性の調節不全から、屡々分散した又は選択的な臓器障害及び長引く臓器故障が 発生し、この場合の約１０〜３０％では、死亡に至っている（例えば、W.Pschyr embel,Klin．Woerterbuch,de Gruyter Berlin，1992 参照）。このようなショ ック反応は、急性の及び慢性の感染に基づき、予め障害のある患者（術後）の場 合には、静細胞剤等での処置又は認識可能な原因なしでも、大抵は他では害のな い細菌感染の結果でも現れうる。アナフィラキシー、細菌性、敗血症性、外傷後 、心臓原性、出血性、血流減退性、神経原性及び毒物で、ショックの形は区別さ れている。共通点は、同時の又はその直前の臓器の外傷性の、外科的な、免疫学 的な、薬品による又は毒物の 傷害に基づく屡々無害な微生物に対する身体の防御反応の変化の共存を本質とす るように見える(例えばBochner，B.S．et al.,N Engl J Med 1991,32411785)。 殊に外傷後の、術後の、毒物の又は敗血症性のショックの単一のかつ安全な治療 法は従来には存在しない(Barron,R.L.,Clin Pharm 1993,12,829)。ショック症に おける予後及び治療結果の評価のための信頼できる判断基準はない。従って、定 評のある合理的に根拠のある特異的な治療コンセプトは、おそらく予後のパラメ ータの欠如に基づき開発されていない。 従って本発明の課題は、ヒトにおけるショック状態を診断評価する方法及び経 過をコントロールする方法並びに治療用の医薬品を見つけることである。 意外にも、ショック患者の血液を分析すると、そのいくつかにおいて、ショッ ク症の開始の直後又は更なる経過の間に、その血液の血清中に多量のサイクロフ ィリン(Cyclophilin)を含有することが判明した。ショック症の間のいずれかの 時期（第１日と１４日の間）に血清中に明白に測定可能な程度のサイクロフィリ ンを有する患者は、多大の規則性で、処置した医者の強力な治療努力にも関わら ず、死亡している。生存している患者は、回復までのいずれの時点でもその血液 の細胞不含の部分（血清、血漿、血漿フラクシヨン等）中に測定可能な程度のサ イクロフィリンを示さなかった。 現在の知識によれば、ヒト及び動物の臓器、更に多くの細菌、植物細胞等のす べての細胞は、特別の群の細胞質蛋白質、サイクロフィリンを含有している(Gal at,A.,Eur J Biochem 1993,216,689)。これは、蛋白質褶曲、蛋白質安定性、蛋 白質放出、更に蛋白質形成の調節に、正常又はストレス（例えば感染、移植反発 等）の細胞の機能の調節と関連して作用している(Galat s.o.)。サイクロフィリ ンは、細胞質中にも真核細胞の核中にも確認されている(Galat s.o.)。しかしな がら、これは、通常は細胞外媒体中には現れず、それらに実質的な細胞外作用は 書き加えられていない。 ここに報告されている観察は、ショック症と関連して、ショック症状が最終的 に死亡に至った患者においては、その死亡の前に既に長い間（数日〜数週間）、 かなりの量のサイクロフィリンが血液中に検出できたことが、ここで初めて報告 されているかぎりにおいて、技術水準に矛盾している。例えば外傷性のショック の際の種々のメデイエータ(Mediator)が発見されている （de Boer,J.O.,Immun opharmacology 1992,24,135）が、サイクロフィリンはショック症状と関連付け られてはいなかった。 ショック患者の血漿又は血清中のサイクロフィリンの出現は、病因論的に不所 望の徴候である。血清中のこのパラメータの観察により、予後言及が的中し、治 療をコントロールすることができる。サイクロフィリ ン濃度の低下は、可能な治療結果の徴候と評価すべきであり、上昇は目前に迫っ ている死の結末の警告信号とみなすべきである。実験的に惹起されたショック状 態では、更に、サイクロフィリン濃度が新規治療形の作用立証のための測定値と して使用することができる。 更に、ここに記載の意想外の所見は、メデイエータとしてのサイクロフィリン それ自体がショック発生で負に作用することを推測させる。 サイクロフィリンは、サイトカイン(Bang et al.Experientia 1993,49,533)、 実質的にヒト及び動物臓器の防御準備に関与している群の物質と類似性を有する 。従って、細胞境界の外の予想外にそれが現れることは、ヒト臓器の防御準備の 完全な制御欠如又は逆調節を誘発し、これがショック状態の間接的な結果に責任 がある。従って、治療のためには、ショック患者において現れるサイクロフィリ ンを失活させ、拮抗させ又は除去することが必要である。このためには、原則的 に次の可能性が提供される： ａ）血漿中に現れるサイクロフィリンの遮断性又は拮抗性の薬剤による遮断又は 拮抗 ｂ）現れるサイクロフィリンの生物学的作用物質、例えば特異抗体、抗酵素等に よる遮断又は拮抗 ｃ）血漿又は血清中に現れるサイクロフィリンの物理的又は化学的方法、例えば 血液洗浄等による除去又は 破壊。 血清中のサイクロフィリンの検出は、種々の方法で、例えば酵素学的方法、放 射線化学的方法、免疫学的方法及び典型的な蛋白質生化学的方法を用いて行うこ とができる。 前記の診断法は、部分的には、細胞中のサイクロフィリンの検出のために公知 であり；他の徴候に関しては他の方法があり、ここに記載の状況に適合させるこ とができる。例えば、サイクロフィリン濃度は、次の記載によるロータマーゼ活 性（ペプチジル−プロリン−シス−トランス−イソメラーゼ）の測定により実施 することができる(H.Bang，Dissertation,Halle 1986,Wissenschaftsbereich Bi ochemie,Galat,s.o.und Fischer,G.et al.,BIomrd Biochim Acta 1984,43,1101) 。 体液中のイソメラーゼ活性の測定： −この分析系は、連結された分光学的酵素テストの原理に基づく、即ち、補助酵 素（キモトリプシン）の反応をイソメラーゼの検出のために使用する、 −プロテアーゼ（キモトリプシン）を用いて発色性のペプチド基質の幾何学的構 造特異性反応を実施し、分光学的に追跡する、 −最初の非常に迅速な反応で、プロテアーゼは選択的にトランス配置を分解する 、 −第２の緩徐な相で、シス−配置が非触媒的にトラン ス−形に変換し、その後、プロテアーゼにより分解することができる、 −イソメラーゼ、例えばサイクロフィリンは、選択的にこのシス-トランス-変換 を促進する、 −従って、細胞不含の体液中で、イソメラーゼはその分光学的検出により分析す ることができる。 −検出試薬：ｎＭイソメラーゼ。 同様に、サイクロフィリンに対する現存する特異的な抗体を用いても、技術水 準に従って、免疫学的、放射線化学的及び他の方法を開発することができる。 治療法としては、サイクロフィリンの遮断を、例えばサイクロイクロスポリン Ａと共に、移植医療で、リウマチ治療で、喘息治療でかつ外傷の治療で既に用い られている薬剤を原理的に臨床で用いることができる。サイクロフィリンに対す るその遮断作用は、試験管内で証明できる。 実験動物（マウス）では、サイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の投与が、細菌性リ ポポリサッカライド（ＬＰＳ）又はＴＮＦａ（Tumornekrosefaktor:腫瘍壊死因 子ａ）の注射により誘起された致死性のショック状態を抑制することができる。 この実験で肝臓障害は、肝臓に典型的な酵素、例えばＡＬＴ（ＧＰＴ）、ＡＳＴ （ＧＯＴ）及びＳＤＨ（ソルビットデヒドロゲナーゼ）の検出により定量した。 この結果を第１表に記載した。データは、処置後８時間に測定した。処置の１５ 時 間前及び１時間前に、ＣｓＡを各々５ｍｇ/ｋｇ（ｉ．ｖ．）を注射した。 臨床検査の結果 ショック症を有する６患者の血清中のサイクロフィリンの濃度測定結果を第１ 図中に表示する。酵素的検出法（ペプチジル-プロリン-シス-トランス-イソメラ ーゼ、ＰＰラーゼ-テスト）の使用の際にのみサイクロフィリンの測定時には、 患者において、血漿中の死に至らしめる上昇性の又は高められた量のサイクロフ ィリンが検出可能であった。意外にも、この細胞内蛋白質が既に死亡の１週間前 までに明白に現れた。これは死亡の直前に著しく上昇する。これとは反対に、シ ョック症で生存した３患者のすべては、血清中のサイクロフィリン濃度の測定可 能な上昇を示さなかった。 従って、５０Ｕ/ｍｌのサイクロフィリン濃度は、シ ョック状態の致死性の結果を示しており、２０Ｕ／ｍｌの濃度は明らかな警告信 号を表している。 定量及び測定法： ＰＰラーゼ-試験は、使用基質の分子構造及びＰＰラーゼの蛋白質分解感度に 関連して限界が変動性の方法であり、これを用いて、粗雑に調製された生物学的 物質中のＰＰラーゼ-活性でさえも定量的に測定することができる。おおざっぱ な近似において、約１ｎＭサイクロフィリンは１Ｕ/ｍｌの濃度に相当する。前 記の関連において、５Ｕ/ｍｌの上昇は、サイクロフィリン濃度の著しい増加を 意味し、０Ｕ/ｍｌの値とは明らかに区別することができる。 更に、敗血症患者の血清中では、サイクロフィリンの明白に定量可能な量（正 の値に相当）のみならず、サイクロフィリンの変性体も測定できた。負の値（− ４０Ｕ/ｍｌ）の場合には、抑制を意味する。この値は、外からＰＰラーゼ-試験 のために添加されるべきサイクロフィリンに対する敗血症-血液の影響の検査に より測定した。 イソメラーゼ活性の測定の例 −細胞不含の血清の準備 −熱処理可能なキュベット（１０℃までの熱処理）を有するＵＶ／ＶＩＳ分光光 度計の使用 −Hepes-緩衝液１ｍｌを血清１〜２０μｌと共に３０秒間前インキュベートし、 その後、キモトリプシン- 溶液２００μｌを添加し、直ちに基質溶液５μｌで開始させる； −反応を連続的に３９０ｎｍの波長で３分間追跡する； −観察された１次反応の速度定数を評価プログラムを用いて測定し、表中で使用 のＵ／ｍｌに相当する −評価を伴う測定には、この時点の方法では約１０分必要である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/48 (72)発明者 カイ ブルーネ ドイツ連邦共和国 Ｄ−91080 マーロフ シュタイン ヴァイエラッカーヴェーク 17 (72)発明者 アルブレヒト ヴェンデル ドイツ連邦共和国 Ｄ−72070 テュービ ンゲン イム ブッケンロー 19 (72)発明者 ゲザ ティークス ドイツ連邦共和国 Ｄ−78465 コンスタ ンツ ホルデンシュタイク ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １.ショック状態を検出し、かつショック患者を治療コントロールする方法にお いて、患者の血液中のサイクロフィリンの濃度を ａ）酵素学的方法 ｂ）特異的抗体を用いる免疫学的検出法 ｃ）ペプチド化学的方法 ｄ）放射線化学的方法 を用いて測定し、このショック度の評価のために使用することを特徴とする、 ショック状態を検出し、かつショック患者を治療コントロールする方法。 ２. ａ）酵素学的方法としてロータマーゼ活性測定又は ｂ）免疫学的検出法としてラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ−酵素結合免疫 -吸着-分析又は ｃ）ペプチド化学的方法として親和性クロマトグラフィ又は ｄ）特定の物理化学的反応条件下の放射能活性サイクロスポリンの結合 を使用することを特徴とする、請求の範囲１に記載の方法。 ３.ショック、殊に敗血症、術後ショック及び毒物ショックの治療のための、シ ョック患者の血液中の活性サイクロフィリンの濃度を低める医薬品、生物学的 作用物質及び物理化学的方法の使用。 ４. ａ）サイクロスポリン又はサイクロスポリン類縁のサイクロフィリン失活性作 用物質、 ｂ）特異的に又は非特異的にサイクロフィリンに結合する失活性特性を有する 薬剤、 ｃ）サイクロフィリンの生物学的失活化剤、抗体、抗体フラグメント、サイク ロフィリン分解酵素、 ｄ）サイクロフィリン又はサイクロフィリン含有血液フラクションを除去する ために好適であるすべての形の血液洗浄物を使用することを特徴とする、請求の 範囲３に記載の使用。