JPS6355671B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、実際上、従来なし得なかつた優れた
正確性、信頼性及び再現性をもつて、カブトガ
ニ・アメボサイト・ライゼート成分を用いて、生
体試料中に存在するエンドトキシンを測定するこ
とを可能としたエンドトキシンの測定法に関す
る。 更に詳しくは、本発明は、カブトガニ・アメボ
サイト・ライゼート成分を用いて生体試料中に存
在するエンドトキシンを測定する方法に於て、該
試料中のカブトガニ凝固系酵素基質切断活性が検
出されなくなる条件下に酸処理した生体試料を用
いることを特徴とする方法に関する。 1968年、Levinによりカブトガニ・アメボサイ
ト・ライゼートを用いるエンドトキシン（細菌内
毒素）の特異的インビトロ検出法が報告され、そ
れ以来、リムルテスト（LAL−Test）として、
医学、薬学の基礎及び応用分野において簡便且つ
迅速なエンドトキシン測定法として利用され、例
えば、米国に於ては、医療器具や生物製剤のパイ
ロジエンテストに、制約条件付きではあるが、
LAL−Testの代用が公認されるにまで至つてい
る。 このようなエンドトキシンの特異的検出法の出
現により敗血症、肝硬変症などの重篤症状につい
ての病因論的研究が臨床医学研究者間に於て、近
年とくにさかんとなつている。そして、生体試料
中のエンドトキシンと疾病症状との関連性を探究
する目的で、生体試料中のエンドトキシンを
LAL−Testにより測定しようとする試みが数多
く行われてきた。そのような試みに際して、エン
ドキシンの存在にも拘わらず、カブトガニ・アメ
ボサイト・ライゼートのエンドトキシンによるゲ
ル化現象が阻害されたり、或は又、エンドトキシ
ンが存在しないのにゲル化現象が生起したりする
いわゆる阻害現象や疑陽性現象がおこるというト
ラブルのあることが判明してきた。 更に、このようなトラブルには、その原因物質
が存在するのであろうとの仮説のもとに、生体試
料の前処理によつてそのようなトラブルの原因と
なる原因物質を除去しようという試みもなされた
が、その目的が達成されているという評価は末だ
なされていない。それどころか、そのような前処
理の試みを加えた生体試料を用いたLAL−Test
による臨床病理学的成績は、敗血症、膵胆管癌、
播種性血管内凝固症候群、肝硬変症等の患者血液
試料中のエンドトキシンレベルが、臨床症状や菌
培養の結果や他のパラメデイカルデータと一致し
ないケースが多く見られ、LAL−Testによる生
体試料中のエンドトキシンの検出の有用性をも疑
われつつあるのが現状である。 斯くして、生体試料を用いるLAL−Testの臨
床診断への適用の可否について、再検討を要する
時期に至つている。更に、近年、カブトガニ・ア
メボサイト・ライゼートのエンドトキシンによる
ゲル化現象の発生機構についての生化学的解析が
進んだ結果、該ゲル化現象に関与するエンドトキ
シンの作用を受ける因子と該ゲル化現象に於ける
酵素系の役割とが明確となり、生化学的解析の結
果からも、従来のLAL−Testによる生体試料中
のエンドトキシンの検出測定の妥当性に多くの疑
問が生ずるに至つている。 すなわち、カブトガニ・アメボサイト・ライゼ
ートのエンドトキシンによるゲル化現象の発生機
構についての生化学的解析の結果、カブトガニ・
アメボサイト・ライゼートのゲル化機構は、哺乳
動物の血液凝固系に類似した数種の不活性因子か
らなる系から構成されており、エンドトキシンに
特異的な因子が先ず、エンドトキシン量に比例し
て活性化され、次いで段階的に順次不活性因子
（プロ・エンザイム）が活性因子（エンザイム）
に変換され、最終因子（プロ・クロツテイングエ
ンザイム）を活性化し、活性化クロツテイングエ
ンザイムが凝固性蛋白前駆体コアギユロゲンを基
質として作用してコアギユリン・モノマーとし、
この物質が重合してゲル状蛋白となることが明ら
かになつた〔S.Iwanaga et alFebs.Letter、120、
217（1980）〕。 斯くして、プロクロツテイングエンザイムがエ
ンドトキシンにより直接活性化を受けてクロツテ
ングエンザイムとなら、これがコアギユロゲンに
作用してゲル化を生ずるという従来から云われて
きた作用機構とは異つた機構によつて上記ゲル化
現象が起こることが解明された。 更に、カブトガニ・アメボサイト・ライゼート
の凝固系と、哺乳動物の血液凝固系の対比によ
り、前者におけるコアギユロゲンが後者における
フイブリノゲンに、前者におけるクロツテングエ
ンザイムが後者におけるXa因子に、そして前者
におけるプロクロツテイングエンザイム活性化酵
素が後者におけるトロンビンに、夫々、類似した
性質を有することが判明した。これらの新たに判
明した事実の妥当性は、哺乳動物の血液中に存在
する上記凝固系因子やトリプシンなどの蛋白水解
酵素によつても、カブトガニ・アメボサイト・ラ
イゼートはゲル化することから確認される。 又更に、生体試料にエンドトキシン調製品（例
えば、大腸菌からのエンドトキシンE.
coliO111B₄；Difco 社製品）を添加し、LAL−
Testを用いて、該生体試料中のエンドトキシン
を検出し、その検出度から該試料中のエンドトキ
シン量を確認する方法が採用されているが、血液
試料を用いて該方法を行つた場合、添加したエン
ドトキシン量に見合つた検出レベルが確認され
ず、LAL−Testによるゲル化が阻害されること
が判明している。 上述のように、従来のLAL−Testによる生体
試料中のエンドトキシンの検出測定の妥当性には
多くの疑問が生ずるに至つており、生体試料を用
いるLAL−Testの臨床診断への適用の可否もし
くは意義について再検討を要する時期に至つてい
るのが実情であり、生体試料中のエンドトキシン
の測定に際して、該試料中に存在するカブトガ
ニ・アメボサイト・ライゼート成分による凝固系
に関与する因子を適確に除去しなければ、LAL
−Testによつて、正確に且つ信頼性及び再現性
をもつて、エンドトキシンを検出測定することが
できないのは勿論のこと、測定の意味さえも全く
失われるであろうことは明らかである。 本発明者等は、同一出願人の先に開発したカブ
トガニ・アメボサイト・ライゼート利用の合成基
質を用いるエンドトキシンの高感度検出定量方法
（特開昭54−15797号；米国特許第4188264号；西
ドイツ国特許公告公報DE2740323号）を利用し
て、従来、LAL−Testに際して、生体試料前処
理法として公知の前処理法について詳細な検討を
行つた。 その結果、従来、血液前処理法として評価され
てきたクロロホルム処理法〔J.Levin、et al；J.
Lab.Clin、Med.、75、903（1970）〕、酸性化法
〔R.B.Reinhold et al；Proc.Soc−exp.Biol.
Med.、137、334（1971）、加熱法〔M.S.
Cooperstock、Lancet(i)1272（1975）〕により前処
理した血液試料を用いて、エンドトキシンを正確
に且つ信頼性をもつて検出測定することは、実際
上、不可能であるという重大な事実を発見した。 更に研究を進めた結果、後にExamplesに於て
実験的に詳しく示すとおり血液試料にエンドトキ
シンの既知量を添加し、上記従来法により前処理
した検体試料中のエンドトキシン検出レベルを、
上記合成基質法による定量により検討した結果、
クロロホルム処理法、酸性化法のいずれの場合に
も、血液試料中に存在するカブトガニ・アメボサ
イト・ライゼート成分の凝固系に作用する妨害因
子が残存し、エンドトキシンの真の存在量を、正
確に且つ信頼性をもつて検出測定することは不可
能であることがわかつた。又、上記加熱法の場合
には、血液試料中の妨害酵素活性を完全に失活さ
せることができるが、この試料を用いたエンドト
キシン検出レベルは、該試料の種類や希釈度の差
異により、対照に比して1/3〜３倍というような
大巾な数値変動を示し、エンドトキシンの真の存
在量を信頼度よく検出測定できないことがわかつ
た。 本発明者等は、従来慣用されてきた前処理した
血液試料を用いたエンドトキシン検出測定におけ
る上述の如き技術的トラブルを克服し得る新しい
前処理手段を開発することによつて正確に且つ信
頼性をもつて、且つ又、優れた再現性をもつて、
生体試料中に存在するエンドトキシンをカブトガ
ニ・アメボサイト・ライゼート成分を用いて測定
する方法を提供すべく更に研究を行つてきた。 その結果、生体試料を、該試料中にカブトガニ
凝固系酵素基質切断活性が検出されなくなる条件
下で酸処理した試料を用いることによつて、正確
に且つ優れた信頼性をもつて、再現性良く、該試
料中に存在する真のエンドトキシン量を、カブト
ガニ・アメボサイト・ライゼート成分を用いて検
出測定できることを発見した。更に、この方法は
実際の臨床的応用においても充分な評価をうけら
れる優れた方法であることがわかつた。 斯くして、本発明者等の研究によれば、前述し
たように、従来LAL−Testの臨床診断への適用
の有用性が疑問視されていた多くのトラブルが一
挙に解決でき、それ自体公知の凝固法（ゲル化
法）或は合成基質法などにより、カブトガニ・ア
メボサイト・ライゼート成分を用いて生体試料中
に存在するエンドトキシンを検出測定して、医
薬、医学の基礎及び臨床診断を含む応用分野に大
きく貢献することが可能となることがわかつた。 従つて、本発明の目的は顕著に改善されたエン
ドトキシンの測定方法を提供するにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的なら
びに利点は、以下の記載から一層明らかとなるで
あろう。 カブトガニ・アメボサイト・ライゼート成分を
用いて、凝固法或は合成基質を用いて生体試料中
に存在するエンドトキシンを検出測定する方法そ
れ自体は、よく知られており、例えば、丹羽允
「臨床検査」、23、343〜348（1979）、“リムルステ
ストによる内毒素微量定量”；Bacterial
Endotoxins Test／Biological Tests、USPXX、
＜85＞；米国特許第4188264号（特開昭54−15797
号；西ドイツ特許公告DE2740323号）などに詳細
に記載されており、本発明方法の実施に利用でき
る。 本発明方法においては、カブトガニ・アメボサ
イト・ライゼート成分を用いて、上記の如きそれ
自体公知の方法で生体試料中に存在するエンドト
キシンを検出測定するに際して、該生体試料を該
試料中にカブトガニ凝固系酵素基質切断活性が検
出されなくなる条件下で酸処理する。すなわち、
該生体試料中のエンドトキシン非依存性酵素活性
（hydrolytic activity of endotoxin−
independent enzymes）が検出されなくなるよう
に酸処理する。 既知の従来公知の酸性化法に於ては、１mlの血
漿を0.1mlの25％氷酢酸（2.9N、PH2.2）を用い
て、PH4.0で処理され、引き続いて中和される。
この酸性化法によつては、後に実験的に示すとお
り、カブトガニ凝固系酵素基質切断活性が検出さ
れ、真のエンドトキシン量の測定に影響を与える
因子が存在することを示す。従つて、この酸性化
法によつて処理された生体試料を用いて真のエン
ドトキシン量を測定することはできない。 本発明方法において、生体試料を、該試料中の
カブトガニ凝固系酵素基質切断活性が検出されな
くなる条件下に酸処理するに際して、pKa25℃値
（25℃におけるpKa値）が３以下の酸を用いて、
PH３以下の条件下で処理するのがよい。 このような酸処理に用いる酸の例としては、モ
ノ−、ジ−、トリ−クロル酢酸の如きpKa25℃値
が３以下の中酸や塩素酸、臭素酸の如きハロゲン
酸、過塩素酸の如き過ハロゲン酸、塩酸、硫酸、
硝酸などの如きpKa25℃値が１以下の強酸を例示
することができる。 本発明においては、生体試料中に存在し得る蛋
白質類や細胞顆粒が有するカブトガニ・アメボサ
イト・ライゼートによる測定に影響を与える因子
が失活するような酸化作用乃至変性作用をこれら
夾雑成分に及ぼし、これらを不溶性沈殿物として
測定系外に除去し得るような酸処理が行われる。
このために、生体試料中のカブトガニ凝固系酵素
基質切断活性が検出されなくなる条件下に酸処理
が行われる。利用する酸の種類、濃度、処理条件
などを適宜に選択することによつて、生体試料中
のカブトガニ凝固系酵素基質切断活性が検出され
なくなる処理が可能となることが発見された。 生体試料中にカブトガニ凝固系酵素基質切断活
性が検出されなくなる条件は、使用する酸につい
て、予め実験的に容易に設定することができる。
上記予備実験は、例えば以下のようにして行うこ
とができる。試料のアミダーゼ活性を、あらかじ
め合成基質Boc−Leu−Gly−Arg−PNAを用い
て測定し、次いで、該試料を使用する適当な酸を
用いてPH３以下の条件下で温度、時間条件を選択
して処理し、生じた沈殿を遠沈除去した後、上清
のPHを塩基を用いて中和し再度合成基質を用いて
処理ずみ試料中にアミダーゼ活性が確認出来なく
なる条件の範囲を設定する。 本発明方法によれば、例えば上述のようにして
予め設定された条件に従つて、前記例示の如き酸
を用いて酸処理を行い、処理系中に沈殿してくる
変性失活沈殿物を、例えば、紙別、遠心分離
の如き手段で処理系から除去したのち、系のPHを
中性条件に戻した生体試料を用いて、それ自体公
知の手法を利用して該生体試料中のエンドトキシ
ンをカブトガニ・アメボサイト・ライゼート成分
を用いて測定することができる。 従来法で処理された生体試料を用いた場合とは
異なつて、本発明方法に従つて酸処理された生体
試料を用いることによつて、生体試料中の阻害原
因物質や疑陽性原因物質の影響から解放されて、
正確に且つ優れた信頼性をもつて、再現性良く、
生体試料中に存在する真のエンドトキシン量を、
カブトガニ・アメボサイト・ライゼート成分を用
いて検出測定することができる。 本発明で利用する生体試料としては、例えば、
血漿、血清、血液画分であるアルブミン、グロブ
リンなどの試料、腹水、関節液、尿などの循環液
や体内外の浸出排泄液の如きエンドトキシンが吸
着されやすい蛋白質や細胞顆粒を含む生体試料を
例示することができる。 本発明方法によれば、病気の種類、生体試料の
種類などに影響されることなしに、生体試料中の
エンドトキシンを優れた正確さ、高い信頼性をも
つて再現性よく且つ迅速に検出測定することが可
能となる。 本発明方法は、広い範囲のエンドトキシン血症
患者の生体試料中のエンドトキシンの検出及び測
定に利用することができ、このような患者症例と
しては、例えば、以下の如き症状を例示すること
ができる。 菌血症、腹膜炎、髄膜炎、尿路感染症、術後感
染症の如きグラム陰性細菌の感染により発症した
疾病、肝炎、肝硬変等の肝疾患の原因として網内
系不全が予測される疾病、胆道系に生ずる急性化
膿性胆管炎、胆嚢炎総胆道管結石症等と腸内細菌
群の因果関係予測、腸閉塞症、潰瘍性大腸炎、膵
炎DIC（播種性血管内凝固症候群）、癌、糖尿病、
腎炎等の末期の網内系機能不全の判定に用いられ
る。 以下、比較例と共に実施例により、本発明方法
の数例について更に詳しく例示する。 (1) 生体試料の採取、調製：− 健常人或は患者の体液（血漿、血清、腹水、
関節液、髄液、尿）を細菌やエンドトキシンの
汚染を伴わないように充分注意して採取する。 例えば、血漿は、ヒトの前腕肘静脈から真空
採血管（ベノジエクトチユーブ：テルモ(株)製
品、日本）を用いて、各種抗凝固剤（ヘパリ
ン、クエン酸ナトリウム、EDTA−２・ナト
リウム等）を収容した試験管に採取し、遠心下
（1500〜1800rpm、10分間）に血球と血漿に分
離し、血小板を含む画分を採取して血漿試料
（PRP）とした。又、血清は、ヒトの肘静脈か
ら採取した静脈血を清浄なガラス製スピツツ試
験管に採取し、室温に30分間静置して凝固を生
じさせ、生じた血餅を、2500〜3000rpm、10分
の条件で遠心し、上澄液を別の試験管に分取し
て血清試料とした。 腹水、関節液、髄液は、局部穿刺により採取
した分泌滲出液を用いた。 (2) エンドトキシンの測定：− 特開昭44−15797（米国特許第4188264号；西
ドイツ国特許公告公報DE2740323号）に基いて
商品化されたエンドトキシン微量定量試薬パイ
ロデツク（PYRODIC商品名：生化学工業株式
会社、日本、製品）を用いて、合成基質法によ
るLAL−Testにより行つた。大腸菌からのエ
ンドトキシンE.coli O111B₄に換算した値で示
した。 (3) カブトガニ凝固系酵素基質切断活性及びその
測定：− カブトガニ凝固系酵素基質切断活性（以下、
アミダーゼ活性と略称することがある）は、カ
ブトガニ・アメボサイト・ライゼート非存在下
に、カブトガニ・アメボサイト・ライゼート中
に存在する凝固蛋白コアギユロゲンの切断部分
構造をモデルとして調製されたペプチド性合成
基質Boc・Leu・Gly・Arg・PNA（生化学工業
株式会社、日本、製品）に対する基質切断活性
を示す。上記(2)エンドトキシンの測定に準じて
測定した遊離PNA（パラニトロアニリン）量を
対応するエンドトキシンE.coli O111B₄量に換
算した値で示した。 (4) 生体試料の処理：− (4‐1) 本発明例〔過塩素酸（PCA）処理法〕 前記(1)の生体試料0.1mlに、５％過塩素酸
水溶液を終濃度が1.5％となるように添加し、
37℃で20分間インキユベートした。形成され
た沈殿物を、3000rpm、15分の条件で遠心
し、上澄液を採取してこれを0.2NのNaOH
水溶液を用いてPH6.5〜8.0の中性附近に中和
し、酸処理生体試料を得た。 (4‐2) 本発明例〔トリクロル酢酸（TCA）処理
法〕 前記(1)の生体試料0.1mlに、５％トリクロ
ル酢酸水溶液を同量添加し、45℃で10分間イ
ンキユベートした。形成された沈殿物を、
3000rpm、15分の条件で遠心し、上澄液を採
取してこれを0.1NのNaOH水溶液を用いて
PH6.5〜8.0の中性附近に中和し、酸処理生体
試料を得た。 (4‐3) 本発明例〔硝酸（HNO₃）処理法〕 前記(1)の生体試料0.1mlに、３％HNO₃水
溶液の同量を添加し、40℃で10分間インキユ
ベートした。形成された沈殿物を、
3000rpm、15分の条件で遠心し、上澄液を採
取してこれを0.2NのNaOH水溶液を用いて
PH6.5〜8.0の中性附近に中和し、酸処理生体
試料を得た。 (4‐4) 比較例〔クロロホルム処理法〕 J.Lab.Clin、Med.、75903（1970）に記載
されたところに従つて、前記(1)の生体試料
（ヘパリン血漿）４容に対し、クロロホルム
１容を加え、25℃で60分間はげしく振盪撹拌
したのち、1100ｇで10分間、遠心すると、三
層に分離する。この中間層を分取して、クロ
ロホルム処理生体試料とする。 (4‐5) 比較例〔酸性化処理法〕 Proc.Soc.exp.Biol.Med.、137、334（1971）
に記載されところに従つて、前記(1)の生体試
料0.1mlに、25％氷酢酸（2.9N、PH2.2）0.1ml
を添加して系のPHを4.0±0.1に低下させ、続
いて50％（Ｗ／Ｖ）無水二塩基性燐酸カリ緩
衝液（50％K₂HPO₄、PH9.4）の0.2mlを添加
して血漿のPHを6.2±0.1に戻して酸性化処理
生体試料を得た。 (4‐6) 比較例〔加熱処理法〕 Lancet(i)1272（1975）に記載されたところ
に従つて、前記(1)の生体試料（血漿）をパイ
ロジエンフリーの滅菌蒸留水を用いて３倍に
希釈し、100℃10分間加熱して加熱処理生体
試料を得た。 (4‐7) 比較例〔アルカリ処理法〕 前記(1)の生体試料0.2mlに、0.2NのNaOH
水溶液0.2mlを添加して、37℃で10分間イン
キユベートしたのち、0.2N HCl水溶液0.2ml
を加えてPH6.5〜8.0の中性附近に中和し、ア
ルカリ処理生体試料を得た。 実施例１及び比較例１〜４ 前記(4)の（４−１）〜（４−３）に記載した本
発明例の酸処理生体試料、前記（４−４）〜（４
−７）に記載した比較例処理生体試料及び無処理
の前記(1)の生体試料の夫々について、前記(3)に従
つて、アミダーゼ活性を測定した。その結果は、
下掲第１表のとおりであつた。 【表】 上掲第１表の結果に示されているように、本発
明方法に従つて酸処理された生体試料及び比較試
料中、加熱処理ならびにアルカリ処理された生体
試料では、試料中のアミダーゼ活性の残存は認め
られず、消失していることがわかる。しかしなが
ら、比較試料中、クロロホルム処理ならびに酸性
化処理された生体試料においては、対照試料（無
処理）よりアミダーゼ活性が大となつたり或はア
ミダーゼ活性は実質的に消失せず、カブトガニ凝
固系酵素基質切断活性が留保されており、生体試
料中の真のエンドトキシン量を正確に測定するこ
とは不可能であることがわかる。 尚、第１表に於て、対照試料（無処理）に示さ
れているように、他の生体試料とは異つて髄液に
は、通常、アミダーゼ活性は見られない。しかし
試料採取時や患者症状によつて、血液の混入など
の原因でアミダーゼ活性の認められる場合があ
る。上記実験の結果、生体試料中のアミダーゼ活
性が完全に消失していることのわかつた試料につ
いて、以下の実施例２及び比較例５、６のテスト
を行つた。 実施例２及び比較例５、６ 前記実施例１及び比較例１〜４で得られた結果
に基いて、生体試料中のアミダーゼ活性を完全に
消失せしめることのわかつた本発明酸処理及び比
較のための加熱処理ならびにアルカリ処理を採用
してテストを行つた。 後掲第２表に示した生体試料に、予め定められ
た既知量のエンドトキシンを添加した後、実施例
１及び比較例１、２と同様に処理した試料群、及
びこれら生体試料を同様に処理した後、予め定め
られた既知量のエンドトキシンを添加した試料群
について、前記(2)に記載の方法で、該エンドトキ
シン量を測定し、添加した既知量のエンドトキシ
ン量に対する検出測定されたエンドトキシン量の
割合（％）で検出率を示す。 テストの結果を下掲第２表に示した。尚、第２
表には、本発明酸処理生体試料前記（４−１）〜
（４−３）中、PCA処理試料についてのデーター
を代表例として示したが、他の本発明試料につい
ても、ほぼ同様な結果が得られた。 又、表中、（×３）、（×６）、（×９）は、夫々、
（測定時における）試料の希釈倍率を示す。 【表】 上掲第２表に明らかなとおり、前記第１表に示
したテストに於て生体試料中のアミダーゼ活性の
消失が認められた加熱処理試料又はアルカリ処理
試料を用いた測定結果は、添加したエンドトキシ
ンの量と相関関係を全く示さずに、添加したエン
ドトキシンのほんの一部しか検出されなかつたり
或は又数倍の検出率を示したりすること、更に試
料の希釈の度合によつて検出率が大巾に変化する
ことがわかる。斯して、これら比較例の手法で処
理された生体試料を用いて、試料中の真のエンド
トキシンの量を正確に且つ信頼性をもつて再現性
よく検出測定することはできないことがわかる。 これに対して、本発明の酸処理生体試料を用い
た場合には、生体試料の種類、エンドトキシンの
添加時が処理の前の場合と後の場合との相違、希
釈の度合などに、拘わりなしに、ほぼ100％の検
出率で、正確に且つ信頼性をもつて再現性よく検
出測定することが可能となることがわかる。 更に、上記実施例２及び比較例５、６に於ける
と同様にして、血漿及び血清を生体試料として処
理した後、夫々の試料中に残存する蛋白を、
Lowry法（O.H.Lowry、et al；J.Biol.Chem.、
193、265（1951））により定量した、結果を下掲第
３表に示した。尚、表中の数値の単位はmg蛋白／
ml試料であり、数値は３回の実験の平均値で示し
てある。血漿の欄の下段は使用した抗凝固剤を示
す。更に、表中には前記（４−５）比較例〔酸性
化処理〕で得た生体試料についても同様に行つた
蛋白定量の結果を示した。 【表】 【表】 上掲第３表の実験結果に示されているように、
未処理（対照）試料中の蛋白が、比較処理例の加
熱処理、アルカリ処理及び酸性化処理では、ほと
んど除去されていないのに対し、本発明の酸処理
を行つた場合には＜１mg/mlオーダーの極めて微
量にまで充分な除蛋白効果が達成されていること
がわかる。 周知のように、血中成分がカブトガニ凝固系酵
素と交差反応をすることや一般的な蛋白の保護効
果などからみて、測定しようとするエンドトキシ
ンに実質的な失活作用を及ぼすことなしに充分な
除蛋白効果を達成することは、測定の正確性、信
頼性、再現性などの点から極めて望ましいことで
ある。そして、上掲第３表及び前掲第２表の実験
結果から、本発明方法によれば、このような希望
が有利に達成されることが理解できる。 実施例 ３ 生体試料中に存在するLAL−Test阻害因子及
びアミダーゼ活性、さらに測定しようとするエン
ドトキシンに対して吸着能を有する蛋白質類や細
胞顆粒の如き妨害因子を、エンドトキシンに不都
合な失活作用を及ぼすことなしに、分解乃至変性
除去できることが、本発明方法における酸処理の
最も重要な特色である。 本発明方法における上記特色の優れた作用効果
を示すために、E.coliO111B₄由来のエンドトキ
シンを添加した血漿サンプルを本発明のPCA処
理、TCA処理、HNO₃処理に賦した場合を例に、
これら酸処理を行つた血漿試料（PRP：前記(1)
参照）、並びに生理食塩液中にE.coli O111B₄由
来のエンドトキシンを添加したのち、上記各々の
酸処理を行つた三つのコントロール試料につい
て、添加したエンドトキシンの検出率及び該処理
血漿試料（PRP）中の残存アミダーゼ活性を測
定した結果を後掲第４表に示す。測定は以下のよ
うにして行つた。 健常血漿0.1mlに、血漿１ml当り1000pgになる
ようにエンドトキシン溶液を添加したのち、
PCA水溶液、TCA水溶液及びHNO₃水溶液を、
夫々、添加して、各試料の終濃度が、０％（対
照：添加せず）、0.5％、１％、1.25％、2.0％、
2.5％、５％及び10％となるように調製した。こ
れら試料を37℃で10分間インキユベートし、次い
で3000rpm、15分の条件下に遠心処理して、上澄
液50〜100μを採取し、0.1〜0.2NのNaOH水溶
液を用いてPH6.5〜8.0となるように中和して、こ
れを被検試料液とした。エンドトキシンの測定
は、前記(2)に記載の方法に従つて、合成基質とし
て前記(3)に記載したペプチド性合成基質を用いて
行つた。 更に、対照として、血漿試料の代りに生理食塩
水（注射用）を用いて同様なテストを行い、その
測定値を100として、検出率（％）を算出した。 又、健常者の血漿試料（PRP）に、前記エン
ドトキシン溶液の代りに、生理食塩水を添加した
のち、前記同様に、PCA処理、TCA処理及び
HNO₃処理した試料群について、上記と同様にし
て、残存アミダーゼ活性を測定した。 【表】 ＊ 酸処理した試料中のエンドトキシン非依存
性酵素活性
上掲第４表の結果に一例を示したように、酸処
理剤の種類によつて、或る濃度以上になると、血
漿試料又は生理食塩水中でのエンドトキシンそれ
自体の分解と予測される検出率の低下が見られる
が、本発明方法によれば、酸処理剤の種類及び／
又は処理条件などを予め実験的に適宜に選択設定
することによつて、アミダーゼ活性の影響の無視
し得る条件下で、生体試料中のエンドトキシンの
真の値を、正確に且つ高度な信頼性をもつて再現
性良く、検出測定できることが容易に理解できよ
う。 以下、更に臨床データにより、本発明方法実施
の数例について説明する。 実施例 ４ 健常人及びエンドトキシン血症患者から、前記
(1)に記載の手法で採取した血漿試料（PRP）を
用い、本発明方法に従つてPCA処理した酸処理
PRPを用い、前記(2)の測定手法に従つて、前記
(3)記載のペプチド性合成基質を用いて、これら処
理血漿試料中のエンドトキシンの実測を行つた。 その結果を、添付第１図に示した。第１図の例
に示されているように、健常人（normal：図中
Ａ）に於ては、エンドトキシンは０〜0.02ng/ml
の間に集つて分布していることがわかる。これに
対して、エンドトキシン血症患者群〔図中、Ｂは
肝炎（hepatitis）患者、Ｃは肝硬変
（livercirrhosis）患者、Ｄは感染症（sepsis）患
者、Ｅは悪性腫瘍（mailignant tumor）患者、
Ｆは白血病（leukemia）患者〕に於ては、エン
ドトキシンは０〜１ng/mlの広い範囲にわたつ
て、夫々、異なつた分布様式で分布しており、健
常人とは明瞭に区別できる分布状態を示してお
り、本発明方法によつて、エンドトキシンを正確
に且つ高度な信頼性をもつて再現性良く検出測定
できる事実と相俟つて、本発明方法が、診断上、
きわめて有力な手段として注目すべき手法を提供
するものであることが理解できよう。 実施例 ５ T.K.敗血症（endotoxemia）患者（38♀）の
血漿試料、U.H.肝硬変症（liver cirrhosis）患者
（67〓）の血清試料、M.S.尿路感染症患者（43
♀）の尿試料、S.O.膵胆管癌患者（54〓）の腹水
試料について、前実施例４と同様にしてエンドト
キシン検出測定を行ない、エンドトキシンの確認
されたこれら生体試料に検出測定されたエンドト
キシン量と同量のエンドトキシンE.Coli O111B₄
を、添加して、エンドトキシンの検出測定を行つ
た。 上記生体試料の夫々について、各々、PCA処
理、TCA処理、HNO₃処理した酸処理試料群を
作成し、上記エンドトキシン溶液を、各試料につ
いて最初の検出測定テストで測定されたエンドト
キシン量の２倍の濃度となるように、これら各試
料に添加したのち、前実施例４と同様にして、エ
ンドトキシンを測定した。上記処理を、エンドト
キシン溶液の添加後に行つた試料群についても、
同様なテストを行つた。 その結果を、後掲表５〜表８に示した。これら
表に示した結果から明らかなように、病気及び生
体試料の種類の如何に拘わらず、添加したエンド
トキシンのほぼ100％が回収され、更に、この結
果は、生体試料の酸処理前にエンドトキシンを添
加しても、酸処理後に添加しても同様であること
がわかる。このことは、本発明方法に従つて酸処
理した場合には、添加エンドトキシンが、なんら
の失活変性も生ずることがなく、更に、添加した
エンドトキシンと被検液との間の相互作用による
検出阻害や増感などの不都合な非特異的現象も伴
わずに、添加したエンドトキシンがほぼ理論量で
回収できることを意味し、本発明方法による測定
結果の優れた正確さ及び高度な信頼性ならびに再
現性を一層明らかにするものである。 【表】 【表】 【表】 【表】 以上に詳しく述べたとおり、本発明によれば生
体試料たとえば体液やその調製物中のエンドトキ
シンを優れた正確性、信頼性及び再現性をもつて
検出測定することができる。したがつて、本発明
方法の実施に利用できるエンドトキシン測定用具
として、例えばpKa25℃値が３以下の酸(a)とカブ
トガニ・アメボサイト・ライゼート成分(b)との組
み合わせもしくはこの組み合わせを含むエンドト
キシン測定用キツトを例示することができる。す
なわち、本発明方法の実施に利用できる測定用キ
ツトとして、被験試料の酸処理用のpKa25℃値が
３以下の酸(a)を収容した容器及びカブトガニ・ア
メボサイト・ライゼート成分(b)を収容した容器の
組み合わせもしくはこの組み合わせを含む測定用
キツトが提供できる。 このような測定用キツトは、さらにエンドトキ
シン測定用合成基質、中和用アルカリ、稀釈用も
しくは溶解用の緩衝液、カツプリング試薬、酵素
反応停止剤、蒸留水その他の稀釈用液などの如
き、測定に利用する各種の剤を収容した容器を、
適宜、更に組み合せたキツトの形態とすることが
できる。

【図面の簡単な説明】

添付第１図は、実施例４に記載したエンドトキ
シン測定の結果を示す図面である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ カブトガニ・アメボサイト・ライゼート成分
   を用いて生体試料中に存在するエンドトキシンを
   測定する方法において、該試料中のカブトガニ凝
   固系酵素基質切断活性が検出されなくなる条件下
   に酸処理した生体試料を用いることからなり、該
   酸処理を25℃におけるpKa値が３以下の酸を用い
   てPH３以下の条件下に行うことを特徴とするエン
   ドトキシンの測定方法。