JPH10507352A - Preparation of rep-negative AAV mutant and cells usable therefor - Google Patents

Preparation of rep-negative AAV mutant and cells usable therefor

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JPH10507352A
JPH10507352A JP8512845A JP51284595A JPH10507352A JP H10507352 A JPH10507352 A JP H10507352A JP 8512845 A JP8512845 A JP 8512845A JP 51284595 A JP51284595 A JP 51284595A JP H10507352 A JPH10507352 A JP H10507352A
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rep
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mutant
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ヘルシェル，クリスティーナ
ビュルクレ，アレキサンデル
クラインシュミット，ユルゲン
ヘーレル，マルクス
ハウゼン，ハラルド ツアー
シャンボーン，ピエール
ハイルブロン，レジーネ
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ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム スチフトゥング デス エッフェントリヒェン レヒツ
マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツアー フェルデルンク デル ヴィッセンシャフテン エー．ファー．
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の調製およびそれに使用可能な細胞に関する。また、本発明は、該細胞の調製に用いられる発現プラスミドに関する。   (57) [Summary] The present invention relates to the preparation of rep-negative AAV variants and the cells that can be used therefor. Further, the present invention relates to an expression plasmid used for preparing the cell.

Description

【発明の詳細な説明】 ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の調製およびそれに使用可能な細胞 本発明は、ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の提供およびそれに使用可能な細胞に関す る。さらに、本発明は、該細胞の調製に用いられる発現プラスミドに関する。 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｓ）は、パルボウイルス科に属する単鎖ＤＮＡウ イルスである。ＡＡＶｓは、その複製のために、ヘルパーウイルス、特にアデノ ウイルスまたはヘルペスウイルスを必要とする。ヘルパーウイルスの非存在下で は、ＡＡＶｓは、宿主の細胞ゲノム内、特に染色体１９および１７それぞれの特 異的部位に組み込まれる。 ヒトＡＡＶ−２型の４．６５ｋｂの長さの直鎖状ゲノム上に、３つのウイルス の機能が存在した。１４５ｂｐの長さの「逆方向反復」は、複製起点ならびに組 み込みおよびパッケージングのシスシグナルとして働く。ｃａｐ遺伝子は、３つ の構造蛋白質をコードし、ｒｅｐ遺伝子は、多機能性調節蛋白質ファミリーをコ ードする。Ｒｅｐ７８およびそのＣ末端のスプライス化Ｒｅｐ６８に対するｍＲ ＮＡは、ｐ５プロモーターから開始する。２種のＮ末端切断化Ｒｅｐ７８および Ｒｅｐ６８である、それぞれＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、ｐ１９プロモータ ーの制御下で発現される。Ｒｅｐ蛋白質は、ＡＡＶのＤＮＡの複製に必要である 。また、Ｒｅｐ蛋白質は、ＡＡＶ遺伝子の調節に必要とされる。 ＡＡＶｓは、動物における腫瘍発生を抑制する。さらに、ＡＡＶｓは、癌遺伝 子により生じる細胞のトランスフォーメーションならびに誘導されたＤＮＡ増幅 を抑制する。また、ＡＡＶｓは、抗増殖効果を有する。 ＡＡＶのＲｅｐ蛋白質は、前記活性に応答可能であると考えられる。しかし、 個々のＲｅｐ蛋白質およびその領域へのこれらの活性それぞれの割り当て（assi gnment）は、現存しない。しかし、かかる割り当ては、ＡＡＶｓを治療上用いる ことを可能にするために必要である。この割り当てを達成する可能性は、Ｒｅｐ 蛋白質に変異を有するＡＡＶｓの研究にある。しかし、野生型ＡＡＶを含まない ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の提供は、現在成功していない。しかし、それらは、前 記研究に必須である。 従って、本発明の目的は、ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体を、前記欠点を有すること なく得ることが可能な方法を提供することにある。 本発明によれば、このことは、請求の範囲で定義された要旨により達成される 。 従って、本発明の要旨は、ＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質７８およびＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋 白質５２ならびにＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質４０および／またはＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白 質６８を安定に発現する細胞に関する。Ｒｅｐ蛋白質７８、Ｒｅｐ蛋白質５２お よびＲｅｐ蛋白質４０を発現する細胞が好ましい。 本発明に記載の細胞は、通常の方法により調製することができる。公知の細胞 株であるＨｅＭ１が、出発材料として好適に用いられる（“5th Parvovirus Wor kshop”，Chrystal River，Florida，U.S.A.,November 10-14，1993 参照）。こ れらの細胞は、ＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質７８およびＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質５２を発 現し、Ｒｅｐ７８発現は、デキサメタゾンで誘導可能なMMTV-LTRにより制御され る。Ｒｅｐ４０をコードする発現プラスミドおよび／またはＲｅｐ６８をコード する発現プラスミドおよび両方のＲｅｐ蛋白質をコードする発現プラスミドで、 それぞれ、ＨｅＭ１細胞をトランスフェクトする。Ｒｅｐ４０に対する発現プラ スミドが好ましく用いられ、発現プラスミドｐＣＭＲｅｐ４０が特に好ましい。 それは、公知のベクターpKEX-2-XL のNot1およびXba1制限部位間にＲｅｐ４０を コードするＤＮＡを含んでいる(Rittner，K．H．et al.，Methods Mol．Cell．B iol．２(1991),176-181)。ｐＣＭＲｅｐ４０を、１９９４年１０月７日に、ＤＳ Ｍ９４９１の項目で、および１９９４年１０月１０日に、ＤＳＭ９４８８の項目 でＤＳＭ（微生物および培養細胞のドイツタイプコレクション）に寄託した。そ れもまた、本発明の要旨である。 ｐＣＭＲｅｐ４０の形質転換により得られた細胞は、ＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質で あるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０を安定に発現する。これらの細胞 を、細胞株He 10-1、He 22-2 およびHe5-5 として、１９９４年９月２８日に、 それぞれ、DSM ACC2193、DSM ACC2192 およびDSM ACC2191 の項目でＤＳＭに寄 託した。さらに、細胞を、細胞株HeCM1gとして、１９９４年８月３０日に、DSMA CC2185 の項目でＤＳＭに寄託した。 本発明の他の要旨は、ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の提供方法に関する。かかる方 法は、下記工程からなる： （ａ）ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡを用いる本発明の細胞の形質転換、 （ｂ）ＡＡＶ複製を可能にする手段、特にＡＡＶヘルパーウイルスを用いる（ ａ）の形質転換細胞の処理、および （ｃ）（ｂ）で得られたｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の単離。 好ましい態様において、工程（ａ）において、グルココルチコイド受容体をコ ードする発現プラスミドで共形質転換を行う。当該分野に熟練せる者であれば、 それらに精通している。例えば、発現プラスミドＨＧＯが公知である（Kumar，V .，et al.，Cell 51(1987)，941-951）。 さらに、工程（ａ）は、ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体による本発明の細胞の感染を 含む。また、当該分野に熟練せる者であれば、前記工程を行うために必要なすべ ての技術に精通している。マニアティスらのMolecular Cloning: A laboratory manual(1982)，Cold Spring Harbor，New York を、追加により参照する。 「ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡ」という用語は、ベクター中に任意に存在 し、ｒｅｐ遺伝子中に変異を有するＡＡＶゲノムからなるものである。かかる変 異は、特に、１以上のヌクレオチドの欠失、挿入および／または置換であっても よい。また、ＡＡＶ−ＤＮＡは、Ｒｅｐをコードする全領域の欠失であってもよ い。また、ＲｅｐをコードするＤＮＡは、それぞれ、外来蛋白質（外来ペプチド ）をコードするＤＮＡおよび「アンチセンス」ＲＮＡをコードするＤＮＡにより 、一部または全部置換されていてもよい。外来蛋白質（外来ペプチド）および「 アンチセンス」ＲＮＡは、それぞれ、遺伝子治療法に好適である。従って、「ｒ ｅｐ陰性ＡＡＶ変異体」という用語は、「ｒｅｐ陰性ＡＡＶベクター」という用 語を含む。 さらに、「ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡ」という用語は、前記記載の変異 に加えて、他のＡＡＶ−ＤＮＡ領域にさらなる変異も含むＤＮＡからなる。これ らは、例えば、ｃａｐ遺伝子中の変異であってもよい。かかる場合、発現可能な ＡＡＶｃａｐ遺伝子が本発明の細胞中に存在していることを必要とする。それは 、ＡＡＶの複製を可能にする手段、例えば、ＡＡＶヘルパーウイルスにより挿入 されることができる。当該分野に熟練せる者であれば、ＡＡＶｃａｐ遺伝子を例 えば、ＡＡＶヘルパーウイルス中に挿入する方法に精通している。 「ＡＡＶヘルパーウイルス」という用語は、ＡＡＶｓの複製を可能にするウイ ルスからなる。これらのウイルスは、特に、アデノウイルス２型等のアデノウイ ルスおよびヘルペスウイルスである。 本発明により、ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体を調製することが可能である。細胞中 のＲｅｐ蛋白質の一過性の発現で起こるような組換えの発生が避けられるので、 これらは、野生型ＡＡＶを含まない。従って、本発明は、Ｒｅｐ蛋白質を個々の Ｒｅｐ蛋白質およびそれらの領域それぞれに帰属する活性を制限するということ に基づいて説明する。このことにより、癌の治療におけるＡＡＶの使用に不可欠 である癌抑制原理としてＡＡＶの作用様式を詳細に研究することが可能である。 さらに、本発明は、遺伝子治療のためのウイルスベクターとして使用できる組換 えＡＡＶｓを提供する可能性を供する。本発明のｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体は、こ の目的のために使用できる遺伝子および遺伝子断片を産生することができる。従 って、本発明は、遺伝子治療に使用できるベクターの調製の躍進を説明する。図面の簡単な説明 ： 図１は、ｐＣＭＲｅｐ40発現プラスミドにおけるＲｅｐをコードするＤＮＡの ダイアグラムを示す。開始ATG トリプレットおよび終止コドンTGA を示し、これ らは野生型ＡＡＶゲノムの開始ATG トリプレットおよび終止コドンTGA に対応す る。Ｒｅｐ４０がスプライシングなしで発現できるようにするために、イントロ ン（位置:1907-2227）が部位特異的突然変異導入により除かれる。 本発明を、実施例により説明する。実施例１：He10-1 細胞株を用いたＡＡＶ−Ｒｅｐ変異体の調製 既知のｐＴＡＶ２−３ ＡＡＶ−Ｒｅｐ変異体のＤＮＡを用いて、He10-1細胞 を形質転換する。ｐＴＡＶ２−３は1045番目の位置に「フレームシフト」変異が あり、それによって全ての４つのＲｅｐ蛋白質が不活性化される(ヘイルブロン( Heilbronn)，Rら、J.Virol. 64(1990),3012-3018 参照)。この細胞をアデノウイ ルス−２(MOI=10-20)で感染させる。その後10-6M デキサメタゾンでこれらを誘 導する。 約30時間後、細胞の一部を集め、全細胞ＤＮＡを単離する。ＤＮＡを制限酵素Xba I とDpn I でそれぞれ切断し、サザンブロットにより解析する。この目的の ために、32ＰラベルされたＡＡＶ−ＤＮＡをハイブリダイゼーション試料として 使用する。制限酵素Xba I はＡＡＶ−ＤＮＡを切断せず、および制限酵素Dpn I は真核生物に複製されたＤＮＡを切断しない。複製されたｐＴＡＶ２−３ ＤＮ Ａを得る。 さらに、集めなかった細胞の上清を、凍結融解を繰り返し、超音波処理に供す る。上清をHe10-1細胞で力価測定する。ＡＡＶの感染の検出を、ｒｅｐ陰性のＡ ＡＶに特異的な32Ｐラベルされたプローブを用いたハイブリダイゼーションによ り行う。感染したｒｅｐ陰性のＡＡＶ粒子を検出する。 前記実施例は、本発明の細胞によりｒｅｐ陰性のＡＡＶ変異体を提供できるこ とを示す。実施例２：ＨｅＣＭ１ｇ細胞株を用いたｒｅｐ陰性のＡＡＶ変異体の提供 ＨｅＣＭ１ｇ細胞株を前記ｐＴＡＶ２−３ ＡＡＶ−Ｒｅｐ変異体と発現プラ スミドＨＧＯにより、共形質転換する。この細胞にアデノウィルス−２(MOI=10- 20)を感染させる。その後、それらを10-6(10-7)Ｍのデキサメタゾンで誘導する 。 この細胞を、アデノウイルスにより引き起こされる細胞変性効果が最大になる （約４８時間）までインキュベートし、その後、低張緩衝液中でフライヤータウ (Frier-Tau)溶解と超音波処理により集めru。細胞の破片を遠心分離し、ＡＡＶ 粒子は上清に含まれる。これらもまた感染力があることが分かる。 前記実施例は、本発明の細胞によりｒｅｐ陰性のＡＡＶ変異体が提供され得る ことを強調する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Preparation of rep-negative AAV mutant and cells usable therefor The present invention relates to provision of a rep-negative AAV mutant and cells usable for the same. Further, the present invention relates to an expression plasmid used for preparing the cell. Adeno-associated viruses (AAVs) are single-stranded DNA viruses belonging to the Parvoviridae family. AAVs require a helper virus, especially an adenovirus or herpes virus, for their replication. In the absence of helper virus, AAVs integrate into the host cell genome, especially at specific sites on chromosomes 19 and 17, respectively. There were three viral functions on the 4.65 kb long linear genome of human AAV-2. The 145 bp long "reverse repeat" serves as an origin of replication and cis-signal for integration and packaging. The cap gene encodes three structural proteins, and the rep gene encodes a multifunctional regulatory protein family. The mRNA for Rep78 and its C-terminal spliced Rep68 starts from the p5 promoter. Two N-terminal truncated Rep78 and Rep68, Rep52 and Rep40, respectively, are expressed under control of the p19 promoter. The Rep protein is required for AAV DNA replication. Rep proteins are also required for AAV gene regulation. AAVs suppress tumorigenesis in animals. In addition, AAVs suppress cell transformation and induced DNA amplification caused by oncogenes. AAVs also have antiproliferative effects. The AAV Rep protein is thought to be able to respond to the activity. However, the assignment of each of these activities to individual Rep proteins and their regions is non-existent. However, such an assignment is necessary to enable AAVs to be used therapeutically. The potential to achieve this assignment lies in the study of AAVs with mutations in the Rep protein. However, provision of rep-negative AAV mutants without wild-type AAV is currently unsuccessful. However, they are essential for the study. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method by which rep-negative AAV variants can be obtained without the disadvantages. According to the invention, this is achieved by the subject matter defined in the claims. Therefore, the gist of the present invention relates to a cell stably expressing AAV-Rep protein 78 and AAV-Rep protein 52 and AAV-Rep protein 40 and / or AAV-Rep protein 68. Cells expressing Rep protein 78, Rep protein 52 and Rep protein 40 are preferred. The cells according to the present invention can be prepared by a usual method. A known cell line, HeM1, is preferably used as a starting material (see "5th Parvovirus Workshop", Chrystal River, Florida, USA, November 10-14, 1993). These cells express AAV-Rep protein 78 and AAV-Rep protein 52, and Rep78 expression is controlled by dexamethasone-inducible MMTV-LTR. HeM1 cells are transfected with an expression plasmid encoding Rep40 and / or an expression plasmid encoding Rep68 and an expression plasmid encoding both Rep proteins, respectively. An expression plasmid for Rep40 is preferably used, and expression plasmid pCMRep40 is particularly preferred. It contains DNA encoding Rep40 between the Not1 and Xba1 restriction sites of the known vector pKEX-2-XL (Rittner, KH et al., Methods Mol. Cell. Biol. 2 (1991)). 176-181). pCMRep40 was deposited with the DSM (German Type Collection of Microorganisms and Cultured Cells) on October 7, 1994 under the item DSM 9491 and on October 10, 1994 under the item DSM 9488. That is also the gist of the present invention. Cells obtained by transformation of pCMRep40 stably express AAV-Rep proteins Rep78, Rep52 and Rep40. These cells were deposited with DSM as cell lines He 10-1, He 22-2 and He5-5 on September 28, 1994 under the terms DSM ACC2193, DSM ACC2192 and DSM ACC2191, respectively. In addition, cells were deposited with the DSM under the item DSMA CC2185 on August 30, 1994, as cell line HeCM1g. Another aspect of the present invention relates to a method for providing a rep-negative AAV mutant. Such a method comprises the following steps: (a) transformation of the cells of the invention with the DNA of the rep-negative AAV mutant, (b) means for enabling AAV replication, in particular using (A) a helper virus. Treatment of the transformed cells and (c) isolation of the rep-negative AAV mutant obtained in (b). In a preferred embodiment, in step (a), co-transformation is performed with an expression plasmid encoding a glucocorticoid receptor. Anyone skilled in the field is familiar with them. For example, the expression plasmid HGO is known (Kumar, V., et al., Cell 51 (1987), 941-951). Further, step (a) involves infection of the cells of the invention with a rep negative AAV mutant. Also, those skilled in the art are familiar with all the techniques necessary to perform the above steps. Reference is made to Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1982), Cold Spring Harbor, New York. The term "DNA of a rep negative AAV variant" consists of the AAV genome optionally present in a vector and having a mutation in the rep gene. Such a mutation may in particular be a deletion, insertion and / or substitution of one or more nucleotides. Further, the AAV-DNA may be a deletion of the entire region encoding Rep. Further, the DNA encoding Rep may be partially or entirely replaced by a DNA encoding a foreign protein (foreign peptide) and a DNA encoding "antisense" RNA, respectively. Foreign proteins (foreign peptides) and "antisense" RNA are each suitable for gene therapy. Thus, the term “rep negative AAV variant” includes the term “rep negative AAV vector”. Furthermore, the term "DNA of a rep negative AAV mutant" consists of DNA which, in addition to the mutations described above, also contains further mutations in other AAV-DNA regions. These may be, for example, mutations in the cap gene. In such a case, an expressible AAVcap gene needs to be present in the cell of the present invention. It can be inserted by means that allow the replication of AAV, for example, AAV helper virus. Those skilled in the art are familiar with how to insert the AAVcap gene into, for example, an AAV helper virus. The term "AAV helper virus" consists of viruses that allow the replication of AAVs. These viruses are, in particular, adenoviruses such as adenovirus type 2 and herpes viruses. According to the present invention, it is possible to prepare a rep negative AAV mutant. They do not include wild-type AAV as recombination occurs as is the case with transient expression of the Rep protein in cells. Thus, the present invention is described on the basis of limiting the activity attributable to Rep proteins to individual Rep proteins and their respective regions. This makes it possible to study in detail the mode of action of AAV as a principle of cancer suppression which is essential for the use of AAV in the treatment of cancer. Furthermore, the invention offers the possibility to provide recombinant AAVs which can be used as viral vectors for gene therapy. The rep negative AAV variants of the present invention are capable of producing genes and gene fragments that can be used for this purpose. Thus, the present invention describes a breakthrough in the preparation of vectors that can be used for gene therapy. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows a diagram of the DNA encoding Rep in the pCMRep40 expression plasmid. The start ATG triplet and stop codon TGA are shown, which correspond to the start ATG triplet and stop codon TGA of the wild-type AAV genome. To allow Rep40 to be expressed without splicing, the intron (position: 1907-2227) is removed by site-directed mutagenesis. The present invention will be described by way of examples. Example 1 Preparation of AAV-Rep Mutant Using He10-1 Cell Line He10-1 cells are transformed with DNA of a known pTAV2-3 AAV-Rep mutant. pTAV2-3 has a "frameshift" mutation at position 1045, which inactivates all four Rep proteins (Heilbronn, R et al . , J. Virol. 64 (1990), 3012. -3018). The cells are infected with adenovirus-2 (MOI = 10-20). These are then induced with 10 -6 M dexamethasone. After about 30 hours, a portion of the cells is collected and total cellular DNA is isolated. DNA was cleaved respectively with restriction enzymes Xba I and Dpn I, analyzed by Southern blot. For this purpose, 32 P-labeled AAV-DNA is used as hybridization sample. Restriction enzyme Xba I is not cutting the AAV-DNA, and restriction enzyme Dpn I do not cleave DNA replicated in eukaryotes. Obtain replicated pTAV2-3 DNA. Furthermore, the supernatant of the uncollected cells is subjected to repeated thawing and sonication. The supernatant is titrated on He10-1 cells. Detection of AAV infection is performed by hybridization with a 32 P-labeled probe specific for rep negative AAV. Infected rep negative AAV particles are detected. The above examples show that cells of the present invention can provide rep negative AAV mutants. Example 2: Provision of rep negative AAV mutant using HeCM1g cell line HeCM1g cell line is co-transformed with the pTAV2-3 AAV-Rep mutant and the expression plasmid HGO. The cells are infected with adenovirus-2 (MOI = 10-20). They are then induced with 10 -6 (10 -7 ) M dexamethasone. The cells are incubated until the cytopathic effect caused by the adenovirus is maximized (approximately 48 hours), and then harvested in hypotonic buffer by Frier-Tau lysis and sonication. Cell debris is centrifuged and AAV particles are contained in the supernatant. These also prove to be infectious. The above examples emphasize that cells of the invention can provide rep negative AAV variants.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 ヘルシェル，クリスティーナ ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69121 フルトヴェンクレルシュトラッ セ 43 (72)発明者 ビュルクレ，アレキサンデル ドイツ連邦共和国 ライメン デー− 69181 ハンス−トーマ−シュトラッセ 18 (72)発明者 クラインシュミット，ユルゲン ドイツ連邦共和国 バメンタル デー− 69245 ヴァイヴィーゼンヴェーク ５ (72)発明者 ヘーレル，マルクス ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69121 ドッセンハイマー ラントシュ トラッセ 75 (72)発明者 ツアー ハウゼン，ハラルド ドイツ連邦共和国 ヒルシュベルク デー −69493 イム シャイブリンク ６ (72)発明者 シャンボーン，ピエール フランス国 イルキルシュ セデ エフ− 64004 ボア ポスタレ 163，インスティ テュ デ ジェネティケ エ デ ビオロ ジェ モレキュレー エ セユレー (72)発明者 ハイルブロン，レジーネ ドイツ連邦共和国 プラネック デー− 82152 エーゲンホフェンシュトラッセ ４ベー────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), CA, JP, US (72) Inventors Herschel, Christina             Germany Heidelberg Day             −69121 Furtwenklerstraße             C 43 (72) Inventors Bulcle, Alexander             Germany Leimen Day             69181 Hans-Thomas-Strasse             18 (72) Inventor Kleinschmidt, Jürgen             Germany Bamental Day             69245 Weiwiesenweg 5 (72) Inventor Herel, Marx             Germany Heidelberg Day             −69121 Dossenheimer Landsch             Torasse 75 (72) Inventor Tour Hausen, Harald             Hirschberg Day, Germany             −69493 Im Shy Blink 6 (72) Inventor Shamborne, Pierre             Ilekirche-Sed-F-France             64004 Boa Postere 163, Insty             Thu de Genetice et de Biolo             Jé Molecule et Seilleur (72) Inventor Heilbronn, Regine             Germany Planek Day             82152 Egenhofenstrasse             4 baes

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質７８およびＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質５２ならびにＡＡＶ −Ｒｅｐ蛋白質４０および／またはＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質６８を安定に発現する 細胞。 ２．ＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質７８、ＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質５２およびＡＡＶ−Ｒｅ ｐ蛋白質４０を安定に発現することを特徴とする請求項１記載の細胞。 ３．細胞株He 10-1（DSM ACC2193）、He 22-2（DSM ACC2192）、He5-5（DSM ACC 2191）およびHeCM1g(DSM ACC2185)である請求項２記載の細胞。 ４．ｐＣＭＲｅｐ４０(DSM 9491; DSM9488)である発現プラスミド。 ５．ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の提供方法であって、下記工程からなる方法： （ａ）ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡを用いる請求項１〜３いずれか記載の 細胞の形質転換、 （ｂ）ＡＡＶ複製を可能にする手段、特にＡＡＶヘルパーウイルスを用いる（ ａ）の形質転換細胞の処理、および （ｃ）（ｂ）で得られたｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の単離。 ６．工程（ａ）において、グルココルチコイド受容体をコードする発現プラスミ ドで共形質転換を行うことを特徴とする請求項５記載の方法。 ７．工程（ａ）のｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡが、ｒｅｐ遺伝子中に１以上 の欠失、挿入および／または置換を含むことを特徴とする請求項５または６記載 の方法。 ８．ｒｅｐ遺伝子が、工程（ａ）のｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡ中で欠失し ていることを特徴とする請求項５または６の方法。 ９．ｒｅｐ遺伝子が、工程（ａ）のｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡ中で外来遺 伝子により少なくとも一部が置換されていることを特徴とする請求項５または６ の方法。 １０．ＡＡＶヘルパーウイルスが、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスであ ることを特徴とする請求項５〜９いずれか記載の方法。 １１．ＡＡＶ複製を可能にする手段、特にＡＡＶヘルパーウイルスが、発現可能 なｃａｐ遺伝子を含む条件下で、工程（ａ）のｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡ が、ｃａｐ遺伝子にさらなる変異を含むことを特徴とする請求項５〜１０いずれ か記載の方法。 １２．請求項５〜１１いずれか記載の方法により得られるｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異 体。[Claims] 1. AAV-Rep protein 78 and AAV-Rep protein 52 and AAV -Stably expresses Rep protein 40 and / or AAV-Rep protein 68 cell. 2. AAV-Rep protein 78, AAV-Rep protein 52 and AAV-Re The cell according to claim 1, which stably expresses p protein 40. 3. Cell lines He 10-1 (DSM ACC2193), He 22-2 (DSM ACC2192), He5-5 (DSM ACC 2191) and HeCM1g (DSM ACC2185). 4. An expression plasmid that is pCMRep40 (DSM 9491; DSM9488). 5. A method for providing a rep-negative AAV mutant, comprising:   (A) The DNA according to any one of claims 1 to 3, wherein DNA of a rep negative AAV mutant is used. Cell transformation,   (B) using means for enabling AAV replication, in particular using AAV helper virus ( a) treating the transformed cells of   (C) Isolation of the rep negative AAV mutant obtained in (b). 6. In step (a), the expression plasmid encoding the glucocorticoid receptor 6. The method according to claim 5, wherein the co-transformation is carried out with a primer. 7. DNA of the rep negative AAV mutant in step (a) is one or more in the rep gene 7. The method according to claim 5, which comprises a deletion, an insertion and / or a substitution. the method of. 8. the rep gene is deleted in the DNA of the rep negative AAV mutant of step (a) 7. The method according to claim 5, wherein 9. The rep gene is foreign in the DNA of the rep negative AAV mutant of step (a). 7. The method according to claim 5, wherein the gene is at least partially substituted. the method of. 10. The AAV helper virus is an adenovirus or a herpes virus The method according to any one of claims 5 to 9, wherein 11. Means enabling AAV replication, especially AAV helper virus, can be expressed DNA of the rep-negative AAV mutant of step (a) under conditions containing Comprises a further mutation in the cap gene. Or the method described. 12. A rep negative AAV mutation obtained by the method according to any one of claims 5 to 11. body.
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