JPH10507352A - ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の調製およびそれに使用可能な細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の調製およびそれに使用可能な細胞に関する。また、本発明は、該細胞の調製に用いられる発現プラスミドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の調製およびそれに使用可能な細胞 本発明は、ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の提供およびそれに使用可能な細胞に関す る。さらに、本発明は、該細胞の調製に用いられる発現プラスミドに関する。 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｓ）は、パルボウイルス科に属する単鎖ＤＮＡウ イルスである。ＡＡＶｓは、その複製のために、ヘルパーウイルス、特にアデノ ウイルスまたはヘルペスウイルスを必要とする。ヘルパーウイルスの非存在下で は、ＡＡＶｓは、宿主の細胞ゲノム内、特に染色体１９および１７それぞれの特 異的部位に組み込まれる。 ヒトＡＡＶ−２型の４．６５ｋｂの長さの直鎖状ゲノム上に、３つのウイルス の機能が存在した。１４５ｂｐの長さの「逆方向反復」は、複製起点ならびに組 み込みおよびパッケージングのシスシグナルとして働く。ｃａｐ遺伝子は、３つ の構造蛋白質をコードし、ｒｅｐ遺伝子は、多機能性調節蛋白質ファミリーをコ ードする。Ｒｅｐ７８およびそのＣ末端のスプライス化Ｒｅｐ６８に対するｍＲ ＮＡは、ｐ５プロモーターから開始する。２種のＮ末端切断化Ｒｅｐ７８および Ｒｅｐ６８である、それぞれＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、ｐ１９プロモータ ーの制御下で発現される。Ｒｅｐ蛋白質は、ＡＡＶのＤＮＡの複製に必要である 。また、Ｒｅｐ蛋白質は、ＡＡＶ遺伝子の調節に必要とされる。 ＡＡＶｓは、動物における腫瘍発生を抑制する。さらに、ＡＡＶｓは、癌遺伝 子により生じる細胞のトランスフォーメーションならびに誘導されたＤＮＡ増幅 を抑制する。また、ＡＡＶｓは、抗増殖効果を有する。 ＡＡＶのＲｅｐ蛋白質は、前記活性に応答可能であると考えられる。しかし、 個々のＲｅｐ蛋白質およびその領域へのこれらの活性それぞれの割り当て（assi gnment）は、現存しない。しかし、かかる割り当ては、ＡＡＶｓを治療上用いる ことを可能にするために必要である。この割り当てを達成する可能性は、Ｒｅｐ 蛋白質に変異を有するＡＡＶｓの研究にある。しかし、野生型ＡＡＶを含まない ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の提供は、現在成功していない。しかし、それらは、前 記研究に必須である。 従って、本発明の目的は、ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体を、前記欠点を有すること なく得ることが可能な方法を提供することにある。 本発明によれば、このことは、請求の範囲で定義された要旨により達成される 。 従って、本発明の要旨は、ＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質７８およびＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋 白質５２ならびにＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質４０および／またはＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白 質６８を安定に発現する細胞に関する。Ｒｅｐ蛋白質７８、Ｒｅｐ蛋白質５２お よびＲｅｐ蛋白質４０を発現する細胞が好ましい。 本発明に記載の細胞は、通常の方法により調製することができる。公知の細胞 株であるＨｅＭ１が、出発材料として好適に用いられる（“5th Parvovirus Wor kshop”，Chrystal River，Florida，U.S.A.,November 10-14，1993 参照）。こ れらの細胞は、ＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質７８およびＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質５２を発 現し、Ｒｅｐ７８発現は、デキサメタゾンで誘導可能なMMTV-LTRにより制御され る。Ｒｅｐ４０をコードする発現プラスミドおよび／またはＲｅｐ６８をコード する発現プラスミドおよび両方のＲｅｐ蛋白質をコードする発現プラスミドで、 それぞれ、ＨｅＭ１細胞をトランスフェクトする。Ｒｅｐ４０に対する発現プラ スミドが好ましく用いられ、発現プラスミドｐＣＭＲｅｐ４０が特に好ましい。 それは、公知のベクターpKEX-2-XL のNot1およびXba1制限部位間にＲｅｐ４０を コードするＤＮＡを含んでいる(Rittner，K．H．et al.，Methods Mol．Cell．B iol．２(1991),176-181)。ｐＣＭＲｅｐ４０を、１９９４年１０月７日に、ＤＳ Ｍ９４９１の項目で、および１９９４年１０月１０日に、ＤＳＭ９４８８の項目 でＤＳＭ（微生物および培養細胞のドイツタイプコレクション）に寄託した。そ れもまた、本発明の要旨である。 ｐＣＭＲｅｐ４０の形質転換により得られた細胞は、ＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質で あるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０を安定に発現する。これらの細胞 を、細胞株He 10-1、He 22-2 およびHe5-5 として、１９９４年９月２８日に、 それぞれ、DSM ACC2193、DSM ACC2192 およびDSM ACC2191 の項目でＤＳＭに寄 託した。さらに、細胞を、細胞株HeCM1gとして、１９９４年８月３０日に、DSMA CC2185 の項目でＤＳＭに寄託した。 本発明の他の要旨は、ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の提供方法に関する。かかる方 法は、下記工程からなる： （ａ）ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡを用いる本発明の細胞の形質転換、 （ｂ）ＡＡＶ複製を可能にする手段、特にＡＡＶヘルパーウイルスを用いる（ ａ）の形質転換細胞の処理、および （ｃ）（ｂ）で得られたｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の単離。 好ましい態様において、工程（ａ）において、グルココルチコイド受容体をコ ードする発現プラスミドで共形質転換を行う。当該分野に熟練せる者であれば、 それらに精通している。例えば、発現プラスミドＨＧＯが公知である（Kumar，V .，et al.，Cell 51(1987)，941-951）。 さらに、工程（ａ）は、ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体による本発明の細胞の感染を 含む。また、当該分野に熟練せる者であれば、前記工程を行うために必要なすべ ての技術に精通している。マニアティスらのMolecular Cloning: A laboratory manual(1982)，Cold Spring Harbor，New York を、追加により参照する。 「ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡ」という用語は、ベクター中に任意に存在 し、ｒｅｐ遺伝子中に変異を有するＡＡＶゲノムからなるものである。かかる変 異は、特に、１以上のヌクレオチドの欠失、挿入および／または置換であっても よい。また、ＡＡＶ−ＤＮＡは、Ｒｅｐをコードする全領域の欠失であってもよ い。また、ＲｅｐをコードするＤＮＡは、それぞれ、外来蛋白質（外来ペプチド ）をコードするＤＮＡおよび「アンチセンス」ＲＮＡをコードするＤＮＡにより 、一部または全部置換されていてもよい。外来蛋白質（外来ペプチド）および「 アンチセンス」ＲＮＡは、それぞれ、遺伝子治療法に好適である。従って、「ｒ ｅｐ陰性ＡＡＶ変異体」という用語は、「ｒｅｐ陰性ＡＡＶベクター」という用 語を含む。 さらに、「ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡ」という用語は、前記記載の変異 に加えて、他のＡＡＶ−ＤＮＡ領域にさらなる変異も含むＤＮＡからなる。これ らは、例えば、ｃａｐ遺伝子中の変異であってもよい。かかる場合、発現可能な ＡＡＶｃａｐ遺伝子が本発明の細胞中に存在していることを必要とする。それは 、ＡＡＶの複製を可能にする手段、例えば、ＡＡＶヘルパーウイルスにより挿入 されることができる。当該分野に熟練せる者であれば、ＡＡＶｃａｐ遺伝子を例 えば、ＡＡＶヘルパーウイルス中に挿入する方法に精通している。 「ＡＡＶヘルパーウイルス」という用語は、ＡＡＶｓの複製を可能にするウイ ルスからなる。これらのウイルスは、特に、アデノウイルス２型等のアデノウイ ルスおよびヘルペスウイルスである。 本発明により、ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体を調製することが可能である。細胞中 のＲｅｐ蛋白質の一過性の発現で起こるような組換えの発生が避けられるので、 これらは、野生型ＡＡＶを含まない。従って、本発明は、Ｒｅｐ蛋白質を個々の Ｒｅｐ蛋白質およびそれらの領域それぞれに帰属する活性を制限するということ に基づいて説明する。このことにより、癌の治療におけるＡＡＶの使用に不可欠 である癌抑制原理としてＡＡＶの作用様式を詳細に研究することが可能である。 さらに、本発明は、遺伝子治療のためのウイルスベクターとして使用できる組換 えＡＡＶｓを提供する可能性を供する。本発明のｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体は、こ の目的のために使用できる遺伝子および遺伝子断片を産生することができる。従 って、本発明は、遺伝子治療に使用できるベクターの調製の躍進を説明する。図面の簡単な説明 ： 図１は、ｐＣＭＲｅｐ40発現プラスミドにおけるＲｅｐをコードするＤＮＡの ダイアグラムを示す。開始ATG トリプレットおよび終止コドンTGA を示し、これ らは野生型ＡＡＶゲノムの開始ATG トリプレットおよび終止コドンTGA に対応す る。Ｒｅｐ４０がスプライシングなしで発現できるようにするために、イントロ ン（位置:1907-2227）が部位特異的突然変異導入により除かれる。 本発明を、実施例により説明する。実施例１：He10-1 細胞株を用いたＡＡＶ−Ｒｅｐ変異体の調製 既知のｐＴＡＶ２−３ ＡＡＶ−Ｒｅｐ変異体のＤＮＡを用いて、He10-1細胞 を形質転換する。ｐＴＡＶ２−３は1045番目の位置に「フレームシフト」変異が あり、それによって全ての４つのＲｅｐ蛋白質が不活性化される(ヘイルブロン( Heilbronn)，Rら、J.Virol. 64(1990),3012-3018 参照)。この細胞をアデノウイ ルス−２(MOI=10-20)で感染させる。その後10^-6M デキサメタゾンでこれらを誘 導する。 約30時間後、細胞の一部を集め、全細胞ＤＮＡを単離する。ＤＮＡを制限酵素Xba I とDpn I でそれぞれ切断し、サザンブロットにより解析する。この目的の ために、³²ＰラベルされたＡＡＶ−ＤＮＡをハイブリダイゼーション試料として 使用する。制限酵素Xba I はＡＡＶ−ＤＮＡを切断せず、および制限酵素Dpn I は真核生物に複製されたＤＮＡを切断しない。複製されたｐＴＡＶ２−３ ＤＮ Ａを得る。 さらに、集めなかった細胞の上清を、凍結融解を繰り返し、超音波処理に供す る。上清をHe10-1細胞で力価測定する。ＡＡＶの感染の検出を、ｒｅｐ陰性のＡ ＡＶに特異的な³²Ｐラベルされたプローブを用いたハイブリダイゼーションによ り行う。感染したｒｅｐ陰性のＡＡＶ粒子を検出する。 前記実施例は、本発明の細胞によりｒｅｐ陰性のＡＡＶ変異体を提供できるこ とを示す。実施例２：ＨｅＣＭ１ｇ細胞株を用いたｒｅｐ陰性のＡＡＶ変異体の提供 ＨｅＣＭ１ｇ細胞株を前記ｐＴＡＶ２−３ ＡＡＶ−Ｒｅｐ変異体と発現プラ スミドＨＧＯにより、共形質転換する。この細胞にアデノウィルス−２(MOI=10- 20)を感染させる。その後、それらを10^-6(10^-7)Ｍのデキサメタゾンで誘導する 。 この細胞を、アデノウイルスにより引き起こされる細胞変性効果が最大になる （約４８時間）までインキュベートし、その後、低張緩衝液中でフライヤータウ (Frier-Tau)溶解と超音波処理により集めru。細胞の破片を遠心分離し、ＡＡＶ 粒子は上清に含まれる。これらもまた感染力があることが分かる。 前記実施例は、本発明の細胞によりｒｅｐ陰性のＡＡＶ変異体が提供され得る ことを強調する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 ヘルシェル，クリスティーナ ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69121 フルトヴェンクレルシュトラッ セ 43 (72)発明者 ビュルクレ，アレキサンデル ドイツ連邦共和国 ライメン デー− 69181 ハンス−トーマ−シュトラッセ 18 (72)発明者 クラインシュミット，ユルゲン ドイツ連邦共和国 バメンタル デー− 69245 ヴァイヴィーゼンヴェーク ５ (72)発明者 ヘーレル，マルクス ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69121 ドッセンハイマー ラントシュ トラッセ 75 (72)発明者 ツアー ハウゼン，ハラルド ドイツ連邦共和国 ヒルシュベルク デー −69493 イム シャイブリンク ６ (72)発明者 シャンボーン，ピエール フランス国 イルキルシュ セデ エフ− 64004 ボア ポスタレ 163，インスティ テュ デ ジェネティケ エ デ ビオロ ジェ モレキュレー エ セユレー (72)発明者 ハイルブロン，レジーネ ドイツ連邦共和国 プラネック デー− 82152 エーゲンホフェンシュトラッセ ４ベー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質７８およびＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質５２ならびにＡＡＶ −Ｒｅｐ蛋白質４０および／またはＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質６８を安定に発現する 細胞。 ２．ＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質７８、ＡＡＶ−Ｒｅｐ蛋白質５２およびＡＡＶ−Ｒｅ ｐ蛋白質４０を安定に発現することを特徴とする請求項１記載の細胞。 ３．細胞株He 10-1（DSM ACC2193）、He 22-2（DSM ACC2192）、He5-5（DSM ACC 2191）およびHeCM1g(DSM ACC2185)である請求項２記載の細胞。 ４．ｐＣＭＲｅｐ４０(DSM 9491; DSM9488)である発現プラスミド。 ５．ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の提供方法であって、下記工程からなる方法： （ａ）ｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡを用いる請求項１〜３いずれか記載の 細胞の形質転換、 （ｂ）ＡＡＶ複製を可能にする手段、特にＡＡＶヘルパーウイルスを用いる（ ａ）の形質転換細胞の処理、および （ｃ）（ｂ）で得られたｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体の単離。 ６．工程（ａ）において、グルココルチコイド受容体をコードする発現プラスミ ドで共形質転換を行うことを特徴とする請求項５記載の方法。 ７．工程（ａ）のｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡが、ｒｅｐ遺伝子中に１以上 の欠失、挿入および／または置換を含むことを特徴とする請求項５または６記載 の方法。 ８．ｒｅｐ遺伝子が、工程（ａ）のｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡ中で欠失し ていることを特徴とする請求項５または６の方法。 ９．ｒｅｐ遺伝子が、工程（ａ）のｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡ中で外来遺 伝子により少なくとも一部が置換されていることを特徴とする請求項５または６ の方法。 １０．ＡＡＶヘルパーウイルスが、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスであ ることを特徴とする請求項５〜９いずれか記載の方法。 １１．ＡＡＶ複製を可能にする手段、特にＡＡＶヘルパーウイルスが、発現可能 なｃａｐ遺伝子を含む条件下で、工程（ａ）のｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異体のＤＮＡ が、ｃａｐ遺伝子にさらなる変異を含むことを特徴とする請求項５〜１０いずれ か記載の方法。 １２．請求項５〜１１いずれか記載の方法により得られるｒｅｐ陰性ＡＡＶ変異 体。