JPH10507372A - ブタの生殖・呼吸症候群（ｐｒｒｓ）を惹起するウイルスの新規弱毒化株、それに由来するワクチンおよび診断キットならびにそれらの取得方法。 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ブタの生殖・呼吸症候群（ＰＲＲＳ）として知られるブタの疾病を惹起するウイルスの新規弱毒化株（ＣＮＣＭパスツール研究所Ｉ−１６４２）を、ＭＡ−１０４サル腎細胞から得られた新規クローン（ＣＮＣＭパスツール研究所Ｉ−１６４３）を用いてのそれの弱毒化・複製方法とともに、記述する。その無害性および高い免疫原性のため、該新規株は、ＰＲＲＳの早期診断および該疾病の効果的な予防処置の両方を可能にするワクチンおよび診断キットを得ることを可能ならしめる。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称： ブタの生殖・呼吸症候群（ＰＲＲＳ）を惹起するウイルスの新規弱毒化株、そ れに由来するワクチンおよび診断キットならびにそれらの取得方法。 発明の属する分野 この発明は、ブタの生殖・呼吸症候群（porcine reproductive and respira-t ory syndrom）（ＰＲＲＳ）として知られるブタの疾病を惹起するウイルスの新 規弱毒化株に関する。サル腎細胞から得られた新規細胞クローン（cell clone） を用いることによる毒性株の弱毒化・複製方法は、ＰＲＲＳの早期診断および該 疾病の効果的な予防処置の両方を可能にするワクチンおよび診断キットの調製を 可能ならしめる。 先行技術 １９８７年に、北米において、その時点では「不思議なブタの疾患」またはＭ ＳＤと定義され、のちに「ブタ不妊および呼吸症候群」またはＳＩＲＳとして知 られるに至ったブタの疾病がはじめて発見された。１９９０年には、きわめて類 似した症候群が中欧においてはじめて発見され、その後、スペインを含めての他 の欧州諸国に拡がった。最初、欧州では、その疾患は「ブタ流行性流産・呼吸症 候群」またはＰＥＡＲＳと呼ばれ、最終的に「ブタ生殖・呼吸症候群」またはＰ ＲＲＳと呼ばれるようになった。この名称は、該疾病に関して世界的に受け入れ られるようになった。 ＰＲＲＳの発症因子は、オランダではじめて単離され、レリスタッド（Lelyst ad）ウイルスと名付けられた、ＲＮＡがカプセルに包まれた小型ウイルスである ことが既に知られている。このウイルスはアルテルヴィリダエ（Arterviridae） 群に属するということが示唆された。このウイルスは、特許出願ＰＣＴ ＷＯ− ９２／２１３７５および欧州特許ＥＰ−Ｂ−０５８７７８０（スティッヒティン グ・セントラール・ディーゲネースクンディッヒ・インスティトゥート）に記載 されており、後者の出願は前者に由来するものである。これらの出願のために、 上記ウイルスの分離株がパリのパストゥール研究所に番号Ｉ−１１０２として寄 託された。 北米タイプは、特許出願ＰＣＴ ＷＯ−９３／０３７６０（コリンズら）およ び欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０５２９５８４（ベーリンガー・インゲルハイム）に 記載されているように、欧州型ウイルスの単離とほとんど同時に単離された。こ れらの出願のために、上記ウイルスの分離株がアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション（ＡＴＣＣ）に番号ＶＲ−２３３２として寄託された。 欧州型ウイルスと北米型ウイルスとは、血清学的反応性に関してのみならず、 有意ＲＮＡ断片のヌクレオチド配列の相同性の度合いに関しても、明らかに相違 している。欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０６７６４６７（アクゾ）の最初の２頁に、 広範囲に及ぶ文献を引用して、かかる差が詳細に説明されている。上記特許出願 においては、欧州型および米国型ウイルスはかなりの昔に明確に枝分かれしたと 結論されている。従って、これらのタイプの一方にもしかして有効なワクチンは 他のタイプに対してはほとんど無効かまたは全く無効であろうと予想できる。 欧州および米国の双方のウイルスタイプから異なる株が単離されている。各々 の株はそれ自身の特有の特性を有し、いくつかの株が特許出願の対象となってい る。たとえば、特許出願ＰＣＴ ＷＯ−９３／０７８９８（アクゾ）は、ＣＮＣ Ｍ（パスツール研究所）に番号Ｉ−１１４０として寄託されている一欧州株およ びそれに由来するワクチンを記載している。特許出願ＰＣＴ ＷＯ−９３／１４ １９６および欧州特許出願ＥＰ−Ａ−５４１４１８（ローヌ・メリュー）はとも に同一の優先権基礎出願に由来するものであるが、それらはフランスで単離され て、ＣＮＣＭ（パスツール研究所）に番号Ｉ−１１５３として寄託されている新 規な株を記述している。欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０５９５４３６（ソルヴェー） は最初に記述したものよりもより毒性のある米国型の新規な株およびそのワクチ ンを記載している。この株はＡＴＣＣに寄託されているが、該特許出願中では寄 託番号が詳述されていない。最後に、スペイン特許出願ＥＳ−Ａ−２０７４９５ ０号は、他の欧州株および米国株とは相違する、いわゆる「スペイン株」を記載 している。この「スペイン株」は、欧州動物細胞培養コレクション（ＥＡＣＣＣ ）に番号Ｖ９３０７０１０８として寄託されている。 要するに、ＰＲＲＳ発症因子が多くの変種を見せること、該疾病と効果的に戦 うためには、ブタに感染するウイルス株のタイプに応じて異なるタイプのワクチ ンが必要であることは、明らかであると思われる。 雌ブタにおいては、該疾病の特徴は、食欲不振、無食欲、生殖障害（流産、早 産、死産または弱小子ブタの出産、およびミイラ変性した、またはしていない、 胎子の死）である。ときには、感染した雌ブタが死ぬこともありうる。それほど 頻繁ではない徴候として、耳、腹部または陰部の一過性の青色がある；そのため に、該疾病は最初、オランダでは「青色流産」、英国では「青耳」として知られ ていた。子ブタでは、これらの症状は齢依存的である。新生子ブタでは、呼吸困 難および筋振戦が観察されることもあるが、より加齢した子ブタでは、後肢の不 全麻痺および運動失調の方がより頻繁である。疾病突発の最盛期には、１日齢の 間の死亡率は限られているが、１０日齢の子ブタでは８０％に達しうる。一過的 であるが、感染した肥育ブタは摂食量が減じ、より多くの呼吸問題を呈する。 疾病の潜伏期はきわめてさまざまで、５日から３７日に及ぶ（Ｉ．Ｂ．ロバー トソン、欧州連合ＰＲＲＳセミナー、１１：４〜５、ブリュッセル、１９９１年 ）。疾病の蔓延がきわめて遅いこともあるが、飼育場が襲われたときには、該疾 病が数か月間居残ることがある（Ｂ．サッカー、ＳＩＲＳに関する国際シンポジ ウム、セントポール／ミネソタ、１９９２年）。 Ｇ．ウェンスフォールトら（ザ・ヴェテリナリ・クォータリー（The Vet．Qua rt．），１３：１２１〜１３０、１９９１年）に記載されていうように、免疫ペ ルオキシダーゼ法（免疫ペルオキシダーゼ単層アッセイ、以下ＩＰＭＡ）により 、感染後６日までに、該ウイルスに対する抗体が検出される。抗体価は５日後に １／２０，０００に達することもあり、通常１２か月間以上持続する。しかし、 ブタによっては、Ｖ．オーリンガーら、メレディス、Ｍ．Ｄｅ．ケンブリッジブ タ疾病情報センター、１９９２年１２月が報告しているように、４〜５か月後に は血清学的に陰性となる。これらの著者らは、感染後、種々の器官からウイルス を単離することができたが、ウイルス力価は、感染６週間後に、肺、血清、血漿 および血球ホモジネートにおいて１０4 ＴＣＩＤ50（５０％組織培養感染価 ）に達した。このことは、ウイルスおよび抗体が数週間共存しうることを示して いる。さらに、疾病突発に際して生き残った動物が感受性のブタの感染源として 働きうることがよく知られている。感染後１日目からウイルス血症を検知でき、 それは５６日間続くこともあるが、通常はそれよりも短い。 血液原性のウイルス蔓延の場合、ウイルスは雌ブタの胎盤に到達できる。該ウ イルスが胎盤を通過して、胎仔の死を惹起することが明らかにされている。極大 胎仔感受性は、妊娠の最後の１／３の期間中に見られる。さらに、該ウイルスは 胎仔中でそれを死亡させることなく複製できる。しかし、ミイラ変性または自己 消化胎仔から該ウイルスは単離されたことはない。 子ブタにおいて、該疾病の発症は、初乳から獲得した母体抗体のレベルが減少 したときに起こる。妊娠の最後の１／３の期間に感染した雌ブタからの生産子ブ タのうちで、初乳摂取前に該ウイルスに対する抗体をもつ子ブタの若干の例が観 察されている。通常、これらの動物は、出生時にウイルス血症をも示す（Ｃ．テ ルプストラら、Ｖｅｔ．Ｑ．１３：１３１〜１３６、１９９１年）。 多数のマクロファージの破壊にもかかわらず、ＰＲＲＳ惹起ウイルスの免疫抑 制活性は、明瞭には証明されていない。しかし、関連二次感染はしばしばであっ て、養豚場での深刻な経済的損失を引き起こす。 今日、ＰＲＲＳウイルスは、ブタ個体数の多い国の大部分において見出すこと ができる。 現在、ＰＲＲＳは、ＰＲＲＳウイルス感染により助長される直接的および間接 的な経済的損失のために、養豚分野を襲うもっとも重要な疾病の一つである。 ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）培養中に産生される不活化ワクチンの使用 は、実験室レベルでは好ましい結果を与えるが、養豚場条件下での効果は、部分 的に、環境条件ならびにワクチン接種動物の管理に依存する。 ＰＲＲＳウイルスに対する免疫生成物の獲得を阻害してきた問題の一つは、ウ イルスの複製のための適当な基質の入手可能性が限られていることである。 最近まで、ＰＲＲＳウイルスは、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）培養中で 増幅させうるだけであった（Ｇ．ウェンスフォールトら、ザ・ヴェテリナリ・ク ォータリー、１３：１２１〜１３０、１９９１年）。これらのマクロファージの 取得のためにある一定齢の無疾病ブタを使用する必要があることは、いくつかの 短所を伴う。さらに、異なる動物に由来する細胞基質は常に変異しやすいため、 回収されたＰＡＭにおいてウイルス感染に対する感受性が保証されなかった。こ のことが、質が一定した均質な抗原バッチの生産における重要な不利益を生じ、 各々のバッチを評価して、その感受性を測定する必要があった。 これらの理由すべてのために、安定し、連続した細胞宿主の入手可能性の低い ことが、細胞基質中でのＰＲＲＳウイルス複製ならびに弱毒化変種の選択に基づ いた変異株取得戦略の研究を著しく妨げてきた。 解決すべき主要な問題の一つは、ＰＡＭ中でのウイルス複製はそれらの破壊を 惹起するので、ＰＡＭ中でのウイルスの複製を避けながら、毒性ウイルスを中和 する必要のあることである。 従って、形質転換細胞系統に由来する安定な基質にウイルスを適応させること が、弱毒化変異株を得ることならびに不活化ワクチンを調製すること、かくして ＰＡＭの依存性および変異性を排除する適当な手段を提供することになるであろ う。 特許出願ＰＣＴ ＷＯ９４／１８３１１（マイルズ）は、市販のＭＡ−１０４ として知られている細胞系統に由来し、特許出願人によってＭＡ−１０４（Ｍ） と名付けられたアフリカミドリザル腎細胞系統に由来し、クローン９００９Ｂと 名付けられた独特のクローン中で、あるＰＲＲＳウイルス株を増殖させることを 提案している。該特許出願においては、該独特のクローンの寄託が述べられてお らず、従って、特許の実施、再現が困難である。 発明の目的 本発明の目的は、ＰＲＲＳの予防において、高効率で、ブタ用の無害性ワクチ ンを安定に、かつ再現可能なやり方で得ることを可能ならしめる新規ＰＲＲＳウ イルス弱毒化株である。 本発明の別の一目的は、高力価でＰＲＲＳウイルス増殖を支持でき、選択され た弱毒化株ウイルスの安定した回収・収穫を可能ならしめうる安定なサル腎細胞 系統ＭＡ−１０４由来の新規細胞クローンならびに該細胞クローンの取得法にあ る。 本発明の他の一目的は、該新規弱毒化株およびその変異株から得ることのでき るＰＲＲＳ病に有効なワクチンならびにその取得法である。 本発明のさらに一つの目的は、該新規弱毒化株およびその変異株から得ること のできるＰＲＲＳ病診断キットならびにその取得法である。 発明の詳細な説明 本発明が目的とするＰＲＲＳウイルスの弱毒株は、スペインの養豚場の感染ブ タから単離された病原性株の弱毒化により導かれる。説明の妥当性を満たすため に、この弱毒化株は、パスツール研究所の国立微生物培養コレクション（ＣＮＣ Ｍ）に寄託番号Ｉ−１６４２のもとに寄託されている。寄託日は１９９５年１１ 月２３日である。 病原性株の弱毒化および弱毒化株の複製は、著者らによりＣｌｏｎ−８と名付 けられた、やはり本発明の対象である細胞系統の継代によってなされた。このク ローンは、ＭＡ−１０４として知られている市販のサル腎細胞系統に由来する。 やはり説明の妥当性を満たすため、Ｃｌｏｎ−８の寄託が、上記と同じ日に、パ ストゥール研究所のＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−１６４３のもとになされている。 まず、該市販細胞系統ＭＡ−１０４のクローン化を行い、Ｃｌｏｎ−８（クロ ーン−８）を選択・分離した。このクローン化は、細胞を適当な増殖培地（たと えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するアールの最小必須培地（アールＭＥＭ） に懸濁させ、懸濁液を種々濃度で平板培養し、クローンを選択し、トリプシン処 理し、それらクローンを培養フラスコ中で生育させることにより達成された。こ うして得られた各クローンを、上記の手法を用いて、十分に分化したクローンが 得られるまで、順次クローン化した。 不規則な挙動を示すクローンおよび増幅困難なクローンを捨てたのち、選択し たクローンを、出発ＰＲＲＳウイルス病原性株に対する感染感受性に関して試験 した。Ｃｌｏｎ−８は、その高いウイルス株感受性（高いＴＣＩＤ₅₀）ならびに 得られるウイルス収穫物の再現性および一致度（コンシステンシー）のゆえに選 択したものである。 前記病原性株を、好ましくは３４℃での、Ｃｌｏｎ−８の培養中での継代複製 により弱毒化させた。複製生存能力を評価するために感染性ウイルス粒子含量を 求め、適応度を評価する目的で細胞変性効果（ＣＰＥ）を調べた。得られた結果 によれば、該ウイルスは、少なくとも２０回の継代の間、Ｃｌｏｎ−８中で生存 能力を失うことなく複製でき、達成された弱毒化により、その抗原活性を保持す る実際上無害性のウイルスが与えられる。 その結果、本発明の対象であるＰＲＲＳウイルスの弱毒化株が、安定して、か つ産業的に再現可能に、得られ、かくして、ＰＲＲＳワクチンおよびＰＲＲＳ診 断キットの双方を得るためのそれの使用が容易になる。 病原性株または弱毒化株のいずれかに感染させたブタ群の間での比較試験は、 弱毒化株がそれに感染した動物に対して無害であることを、明瞭に示している。 他方、本発明の対象である弱毒化株は、血清学的に陰性のブタにおいて高い複製 効率を示し、筋肉内経路により２００ＴＣＩＤ₅₀という低い用量で接種した動物 にセロコンバーションを誘発させることができる。このようにして誘発された抗 体は、少なくとも８０日間は持続する。 従って、本発明の対象である弱毒化株は、ＰＲＲＳに対するブタの予防処置の ためのワクチンを調製するためのすぐれた基礎となる。かかるワクチンは、当業 者に周知の任意の方法を用いて、水性分散液、油性乳濁液、リポソーム組成物、 凍結乾燥形態などの種々の慣用的形態に調製することができる。ワクチン組成物 は、免疫刺激剤、乳化剤、安定剤などの種々の佐剤によって補完できる。ワクチ ンは、筋肉内または皮下、鼻腔内、気管内、皮膚、経皮または皮内の各経路によ って投与できる。 ワクチンの効果量はきわめて任意に変えることができ、好ましい形態では、本 発明の対象である弱毒化株物１０²から１０⁶ＴＣＩＤ₅₀にわたる。 やはり本発明の対象である得られたワクチンは、多価ワクチンとして、他の生 または不活化ブタワクチンとともに、あるいは生または不活化細菌とともに、処 方することができる。 当業者にとって自明であるが、本発明の対象であるウイルス株に由来するウイ ルス抗原を含有するワクチン、たとえば、任意の慣用的方法、たとえば熱的また は化学的方法を用いて完全に不活化した形で該株を含有するワクチン、莢膜含有 ワクチン、該株のＲＮＡ断片など、を調製することもできる。 本発明の対象である弱毒化株は、血清学的に陽性の動物において抗体を検出で きる抗原要素を含有する診断キットを、慣用的手法を適用して調製するのに使用 することもできる。たとえば、ＰＲＲＳ抗体検出のためのＩＰＭＡの操作法は、 つぎの工程を包含しうる： ａ）本発明の対象である弱毒化株を、培養マイクロプレート中で、各ウエルが約 ２０〜４０の感染粒子に感染するようにして、安定な細胞培養、好ましくはＣｌ ｏｎ−８に適応させる。 ｂ）感染細胞を、既知の固定剤を用いて、固相に固定する。 ｃ）それらをマイクロプレート中でインキュベートし、続いてマイクロプレート 中の当該抗体をＩＰＭＡ手法により染色することにより、ブタ血清抗体を検出す る。 図面の簡単な説明 本明細書には、４図を載せた２頁が添付されており、それらは本明細書の一部 をなすものである。図面には、下記が、説明的に、ただし非限定的に、示されて いる： 図１は、本発明の対象である弱毒化株を鼻腔内経路によって接種した妊娠雌ブ タにおける直腸温の推移を表わす二次元図を示す。 図２は、本発明の対象である弱毒化株を接種した雌ブタから生まれた子ブタの 体重の推移を表わす二次元図を示す。 図３は、本発明の対象である弱毒化株を接種した雌ブタの子において、ＩＰＭ Ａにより求めた初乳抗体の動態を表わす二次元図を示す。雌ブタ１および１０の 子の出生時の低い抗体価は、子ブタによっては、血液採取の瞬間にはいまだ初乳 を飲んでいなかったということによる。 図４は、本発明の対象である弱毒化株を２００、２，０００および２０，００ ０ＴＣＩＤ50だけ筋肉内経路によって接種した子ブタにおける体液応答の推移を 表わす三次元図を示す。 実施例 本発明の説明をより正確に例証するために、いくつかの操作実施例を示す。か かる実施例は、範囲を限定するものと考えてはならない。 実施例１。安定なサル腎細胞系統ＭＡ−１０４からの細胞クローンの取得 選択したＰＲＲＳ病原性株の６回の継代培養を、欧州動物細胞培養コレクショ ン（ＥＡＣＣＣ）から供給された安定なサル腎細胞系統ＭＡ−１０４（寄託番号 ８５１０２９１８）を用い、プラスチック製培養フラスコ中、ウシ胎児血清（Ｆ ＢＳ）１０％を加えたアールのＭＥＭ培地中、３７℃で、ＣＯ₂添加なしに、静 的培養細胞単層を成長させることにより、実施した。各継代培養において、接種 から６〜７日後にウイルス収穫物を集めた。 ウイルス収穫物の収量を調べるため、該細胞系統に該病原性株を種々の多重感 染度（以下ＭＯＩ）で接種した。得られたウイルス収穫物の収量は低く（１０³ 〜１０⁴ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ）、４回の適応継代培養後でも、ワクチン生産に使用 するには不十分であった。 これらの実験において、感染細胞の一部のみが毒性ウイルスに感受性で、残余 の細胞は感染に無反応性であることが観察された。このため、該病原性株に完全 に感受性の細胞集団の選択を目的として、この細胞系統をクローン化した。 クローン選択はつぎのようにして行った： 該細胞系統の懸濁液を、２０％のＦＢＳを含有するアールのＭＥＭ培地で希釈 配した。プレートを、５％ＣＯ₂中３７℃で８日間インキュベートした。３日後 に、細胞を１個だけ含有するウエルを顕微鏡観察によって選び、８日後にトリプ シン処理した。このようにして、４４クローンを得た。その後、得られたクロー ンを、培養フラスコ中で、５ｘ１０⁷細胞／ｍｌの懸濁液が得られるまで、増殖 させた。これらの細胞をその後、同じ操作法を用いて、２回目、３回目とクロー ン化した。 ３回目のクローン化ののち、得られた４４のクローンを、６ｘ１０⁶細胞／ｍ ｌの細胞を含有する各クローンの細胞懸濁液２５ｍｌが得られるまで増殖させた 。このプロセスを通じて使用培地は２０％ＦＢＳを含有していた。 これらのクローンを、それらの増殖・生存能力に従って、さらに選択した。 実施例２。細胞クローンＣｌｏｎ−８の選択 上記実施例で得たクローンを、それらの増殖効率に従って評価し、増幅上の問 題があったり、異常な形態を示したり、３７℃での維持が困難なものを捨てた。 この予備選択後に３５クローンが廃棄され、残った９クローンを選択した。 選択した細胞クローンを、ＰＡＭ培養中での第８代のウイルス継代（Ｐ−８） ＰＲＲＳウイルス病原性株の懸濁液で感染させた（Ｍ．ブルームベルグら、ヴェ テリナリー・マイクロバイオロジー（Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂ．）４２，３６１〜 ３７１、１９９４年に記載されている通り）。該細胞クローンへの適応は前もっ て行った：８０〜９０％被覆（コンフルエント）単層をウイルス懸濁液と６日間 接触させ、つぎに−８０℃で凍結し、２４時間後に解凍することにより、ウイル スを３７℃で３継代複製させた。 １０％のＦＢＳおよびゲンタマイシン（０．４ｍｇ／ｍｌ）を加えたアールの ＭＥＭを感染培地として用いた。抗菌性化合物も抗酵母性化合物も採用しなかっ た。このようにして得られた各ウイルス収穫物を、対応する細胞クローン中で力 価測定した。結果を解析後、それら９クローンはウイルス感染に感受性であり、 力価は１０^4.2ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ以上であると結論された。それらの結果を表Ｉ に示す。 表Ｉに見られるように、未クローン化細胞系統はきわめて低いウイルス感受性 を示し、それゆえ、有効なワクチンを得るための抗原としてのそれの使用は実用 可能性がないと思われる。表Ｉはまた、いくつかのクローン、とくにＣｌｏｎ− ８が、未クローン化細胞系統よりも該ウイルスに対してより感受性であることを 示している。Ｃｌｏｎ−８はとくに際立ったいる。Ｃｌｏｎ−８からのウイルス 収穫物では、１０⁶ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌまでもの力価を得ることができる。 上記の結果に従って、Ｃｌｏｎ−８を選択した。このクローンの信頼性を調べ るために、いくつかのアッセイを実施した。種々のアッセイにおいて、ウイルス 収穫物の力価は高度に再現性があり、１０⁵〜１０⁷ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌの間の値を 示した。 実施例３．弱毒化ウイルス株の取得． 本発明の対象である弱毒化ウイルス株は、Ｃｌｏｎ−８細胞培養中で選択した 病原性株を３４℃において複製させることにより取得する。 ウイルス感染Ｃｌｏｎ−８細胞の単層を、ＣＰＥが発現するまで、３４℃に維 持した。３７℃に維持した培養におけるよりも常に２４〜４８時間遅れて、ＣＰ Ｅが検出された。しかし、両温度で発現するＣＰＥ特性には有意の差は見られな かった。 生じたウイルス収穫物を、Ｃｌｏｎ−８細胞の単層を用いて、力価測定した。 さらに、ＩＰＭＡによってウイルスの同一性をチェックした。 全面被覆（コンフルエンス）に近い７５ｃｍ²のＣｌｏｎ−８細胞単層にウイ ルスを接種し、３４℃で２時間放置して、吸着させた。つぎに、単層に感染培地 を加えた。感染培地は、１０％ＦＢＳを補足し、前もって３４℃に加温しておい たアールの改良最小必須培地であった。 ７５ｃｍ²フラスコを３４℃のインキュベータに入れ、明瞭なＣＰＥが観察さ れるまで、毎日チェックした。細胞単層の８０〜９５％がＣＰＥを示したとき（ 通常は感染後５日目と７日目との間）、ウイルス収穫物を採取した。つぎに、そ のウイルス収穫物を２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄みを力価測定して、ウイ ルス力価（ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ）を求めた。 上記の方法を用いて、２０代の継代培養を行った。継代培養Ｐ．１、Ｐ．５、 Ｐ．１０、Ｐ．１５およびＰ．２０でウイルス含量を評価した。結果は、該ウイ ルスが、Ｃｌｏｎ−８細胞単層中、３４℃で、なんら生存能力を失うことなく、 少なくとも継代培養Ｐ．２０まで、複製しうることを証明している（表II）。 さらなる結果は、Ｃｌｏｎ−８細胞単層は、０．００１のＭＯＩで感染しうる ことを確認した。 つぎの実施例に記述した通りにして実施した試みは、Ｐ．２０由来ウイルス株 はブタに対して無害であることを示した。 実施例４．弱毒化ウイルス株の生物学的特性決定およびそれによる予防接種の効 果． 本発明の対象である弱毒化株の取得に用いた出発ウイルス株は、病原性株であ る。妊娠雌ブタに対する主たる作用は、早産ならびに弱い、死亡したおよび／ま たはミイラ変性した新生子ブタである。感染した雌ブタは抑うつ状態をも示し、 感染から４〜５日に３〜５日間の軽度の食欲不振期間を示す。 ４頭の雌ブタ（参照番号０１、０２、０３および０６）に１０^6.6ＴＣＩＤ₅₀ の出発病原性株を鼻腔内経路により感染させた。２頭の未感染雌ブタ（参照番号 ７３および７４）を対照として用いた。結果を表IIIに示す。 感染雌ブタの１頭のみが予定日に分娩した。感染雌ブタは、それぞれ２、０、 ５および６頭の死産子ブタを分娩し、２、４、２および１頭の弱い子ブタを分娩 した。弱い子ブタは出生後数日で死亡した。離乳時に、各対照雌ブタからの平均 １１頭の子ブタが生存していた。各感染雌ブタからの子ブタは平均６．５頭しか 離乳時に生存していなかった。離乳時、子ブタの平均体重は、４，６２１ｇ（感 染雌ブタからの子ブタ）および５，３６５ｇ（対照雌ブタからの子ブタ）であっ た。生まれつき弱い子ブタのホモジナイズした肺から、病原性ＰＲＲＳウイルス が単離された。チャレンジ感染後、感染雌ブタおよびそれらの子の双方がセロコ ンバーションを示した。 本発明の対象である弱毒化ウイルス株の生物学的特性決定は、両性のブタを用 いての特異的試験に基づいて行った。無害性試験は、ＰＲＲＳの突発が検出され たことのない小規模養豚場からの血清学的陰性の３頭の妊娠雌ブタで実施した。 ウイルスに対する感受性が極大になる妊娠の最後の１／３に、それらの雌ブタに 接種した。妊娠７８日目と９３日目との間に、１０⁶ＴＣＩＤ₅₀／雌ブタの用量 の弱毒化ウイルスを鼻腔内経路により投与した。ウイルス接種後、３頭の雌ブタ の生理的定数は変化しないままであり、直腸温は正常パラメータの範囲内にあっ た（図１参照）。それら３頭の雌ブタは、やはり予定日に分娩した。得られた結 果を表IVに示す。 ３頭の雌ブタはそれぞれ１３、４および１６頭の子ブタを生んだ。新生子ブタ の活力度は正常と考えられた。しかし、２頭の雌ブタの子に、数頭のミイラ変性 子ブタが見出された。これらの雌ブタからの一腹子の数が多いことを考慮に入れ ると、それは正常と考えることができる。子ブタの体重の推移は、全例において 正常と考えられ（図２参照）、観察期間（４５日）の終わりまで正常パラメータ の範囲内にあった。ＰＲＲＳウイルス感染に関連している可能性のある衰弱およ び障害の症状は、いずれの子ブタにも見られなかった。さらに、新生子ブタから の血液試料にも、血清試料にも、ＰＲＲＳウイルスは検出されなかった。 ウイルス接種から２１〜３６日の妊娠雌ブタからの血液試料にも、血清試料に も、ＰＲＲＳウイルスは検出されなかった。これらの事実のすべてが、野性型ウ イルスの感染に対してまさにもっとも感受性の範疇である妊娠雌ブタにおける弱 毒化ＰＲＲＳ株の無害性を証明している。接種妊娠雌ブタからの新生子ブタから 得たすべての血清試料が、慣用の手法を用いてＰＡＭ培養中のＰＲＲＳウイルス の存在をスクリーニングしたとき、陰性であることが見出された。弱毒化ウイル スを接種したそれら３頭の雌ブタは、分娩後４５日に１／４８０のＩＰＭＡ力価 の液性抗体を有しており、それは、その日からほとんど偏差を示すことなく安定 していた。雌ブタは、接種から２１日で早くも血清学的に陽性であることが見出 された。図３に見られるように、接種雌ブタからの子ブタは初乳を飲んだのちに 血清学的に陽性であることが見出され、少なくとも７５日齢になるまで血清学的 に陽性のままであった。 妊娠の最後の１／３の時期にある１２頭の妊娠雌ブタの群について、さらに無 害性試験を実施した。８頭の雌ブタに、３９ワクチン用量（１０⁵ＴＣＩＤ₅₀） を筋肉内接種し、残りの４頭の雌ブタは対照として用いて、弱毒化株が生殖パラ メータに及ぼす影響を評価した。予定日に分娩した接種雌ブタの生理学的パラメ ータに変化は認められなかった。結果を表Ｖに示す。この表でおいて認められる ように、８頭の接種雌ブタも４頭の対照雌ブタもともに正常な数の子ブタを分娩 した。子ブタも正常な生活力を有していた。 本発明の対象である弱毒化ウイルスは、ＰＲＲＳ血清学的陰性ブタにおいて効 率的に複製する。これは、筋肉内投与されたわずか２００ＴＣＩＤ₅₀が複製でき て、ブタにおいてセロコンバーションを惹起できる。図４で見ることができるよ うに、誘発された抗体は、接種動物中で少なくとも５２日間存続する。 本発明の対象である弱毒化ウイルスは、８頭の筋肉内接種子ブタの群と一緒に しておいた４頭の未接種対照子ブタに蔓延しない。ウイルスが未接種動物に伝播 されないという事実は、該弱毒化株がワクチンとして適合していることを実証し ている。さらに、予防接種ブタにおいて、白血球減少その他の臨床徴候は観察さ れず、該弱毒化ウイルスが、筋肉内投与したときにも無害であることを示してい る。接種子ブタの平均８６％が、接種から１１日後に早くも血清学的に陽性とな った。 本発明の対象である弱毒化ウイルスは、予防接種ブタにおいて、病原性ＰＲＲ Ｓ株によるチャレンジ感染の臨床効果を阻止する保護的免疫応答を誘発する。す なわち、４週齢の予防接種子ブタを該病原性ウイルスに感染させたとき、それら の７５％においてなんらの臨床症状も認められなかった。他方、表ＶＩに見られ るように、予防接種しなかった対照子ブタの８０％が、実験感染ののちに有意の 直腸温上昇を経験した。さらに、実験感染から１９日後に実施した剖検では、予 防接種子ブタは、対照の予防接種なしの子ブタよりも有意に少ない肺病変を示し た。同様に、実験感染後に病原性ウイルスが見出されたのは、予防接種動物の２ ５％においてのみであったが、予防接種していない対照動物では、８０％におい て感染後少なくとも１２日までに病原性ウイルスを検出できた。 寄託微生物に関する情報 ブダペスト条約に従い、この発明の対象であるウイルス株および細胞Ｃｌｏｎ −８は、国際寄託機関であるパリ（フランス）のパスツール研究所国立微生物培 養コレクション（ＣＮＣＭ）に寄託された。 これらの寄託物は、ブダペスト条約に特定されている条件下に、公衆が入手可 能である。しかし、このことをもって、本発明の対象を実施して、本特許出願人 の権利を侵害することとなるライセンスであると解することはできない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/06 Ｃ１２Ｎ 7/08 7/08 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ， ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 リエラ プハダス ペレ スペイン国 エ−17001 ヒロナ ２−１ ５．エスク．２ パスセイク カナレハ ス (72)発明者 サウビ ロカ ナルスィス スペイン国 エ−17820 バンヨレス ３ カリェ アンヘル ギメラ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． １９９５年１１月２３日付でなされた、パストゥール研究所のＣＮＣＭの 受託番号Ｉ−１６４２の寄託株に本質的に相当する、ブタ生殖・呼吸症候群（Ｐ ＲＲＳ）として知られているブタの疾病を惹起するウイルスの弱毒化株。 ２． 請求項１のウイルス株および／またはそれに由来する少なくとも１種のウ イルス抗原を含有することを特徴とする、ブタ生殖・呼吸症候群（ＰＲＲＳ）と して知られている疾病に対してブタを保護するためのワクチン。 ３． ウイルス抗原が不活性化されたウイルスであることを特徴とする請求項２ のワクチン。 ４． １０²ないし１０⁶ＴＣＩＤ₅₀の該弱毒化ウイルス株を含有することを特徴 とする請求項２のワクチン。 ５． ワクチン用量が、１０²ないし１０⁶ＴＣＩＤ₅₀の該弱毒化ウイルス株によ って産生される量に相当する量のウイルス抗原を含有することを特徴とする請求 項２または３のワクチン。 ６． 追加の免疫賦活アジュバント（additional immunostimulating adjuvats ）および／または乳化剤および／または安定剤を含有することを特徴とする請求 項２〜５のいずれか一項に記載のワクチン。 ７． 追加の生のまたは不活性化されたブタウイルス類の何れかを、単独で、ま たは組み合わせて、含有することを特徴とする請求項２ないし６のいずれか一項 に記載のワクチン。 ８． 追加の生のまたは不活性化された細菌を含有することを特徴とする請求項 ２〜６のいずれか一項に記載のワクチン。 ９． １９９５年１１月２３日付けパストゥール研究所のＣＮＣＭの受託番号Ｉ −１６４３の寄託株に本質的に相当する、サルの安定腎臓細胞系ＭＡ−１０４に 由来の細胞クローン。 １０． 請求項９の細胞クローン中で順次の継代培養（succesive passages）に よる有毒株の一時変異（modification）に本質的によることを特徴とする、ＰＲ ＲＳウイルスの弱毒化株の取得方法。 １１． 順次の継代培養において３４℃の温度を維持することを特徴とする請求 項１０に記載の方法。 １２． 請求項９の細胞クローン中で請求項１のウイルス株を増殖させることに 本質的によることを特徴とする、ＰＲＲＳに対する活性ワクチンを調製する方法 。 １３． 該ウイルス株を３４℃で増殖させることを特徴とする請求項１２の方法 。 １４． 得られた弱毒化株を、請求項６のアジュバントの存在下または不存在下 に、水性分散液または油性乳濁液、リポソーム組成物もしくは凍結乾燥形態に処 方することを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。 １５． 得られた弱毒化株をそれが完全に不活性化するまで熱的または化学的に 不活性化することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。 １６． 請求項１の弱毒化株および／またはそれに由来する少なくとも１種のウ イルス抗原を包含することを特徴とするＰＲＲＳ診断方法。 １７． 少なくともつぎの工程： ａ）培養マイクロプレート上で、請求項１の弱毒化株を、安定な細胞培養中で、 各ウエルが約２０ないし４０の感染粒子で感染されるような方法で、生育するよ うに該株を適応すること、 ｂ）既知の固定剤を用いて、感染細胞を固相へ固定すること。 ｃ）ブタ血清をマイクロプレート上でインキュベートし、ＩＰＭＡ手法によりそ れを染色することによる該ブタ血清から抗体を検出すること、 を包含するＰＲＲＳ抗体検出方法。 １８． 安定な細胞培養が請求項９の細胞クローンであることを特徴とする請求 項１７に記載の方法。 １９． ＰＲＲＳとして知られているブタの疾病に対するワクチンを製造するこ とを特徴とする請求項１の弱毒化ウイルス株の使用。 ２０． ＰＲＲＳとして知られているブタの疾病を検出するために診断用キット を作ることを特徴とする請求項１の弱毒化ウイルス株の使用。