JPH10507523A

JPH10507523A - 化合物のスクリーニング方法

Info

Publication number: JPH10507523A
Application number: JP8513295A
Authority: JP
Inventors: カシス，ショウキ
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1994-10-12
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 1998-07-21
Anticipated expiration: 2015-10-12
Also published as: US5681708A; JP2977283B2; EP0786084A4; EP0786084A1; WO1996012185A1

Abstract

(57)【要約】特定の蛋白−蛋白複合体を解離させる新しいクラスの化学物質の同定方法。抗体を用いて標的蛋白−蛋白複合体を特異的に定量する。

Description

【発明の詳細な説明】化合物のスクリーニング方法発明の分野本発明は、蛋白−蛋白複合体による生化学的シグナル変換により生じる異状を阻害する成分のスクリーニングに関する。より詳細には、本発明は、特異的蛋白 −蛋白複合体を解離させる剤を同定する方法に関する。発明の背景蛋白−蛋白相互作用は生化学的シグナル変換における鍵となる要素であることが知られている。これらの変換の阻害が疾病状態の一部である場合には、特異的蛋白複合体を解離させあるいはその形成を阻害する剤は器官に対して治療効果を有すると期待されるであろう。特異的蛋白−蛋白相互作用による生化学的シグナル変換の重要性についての代表例は、Ｔ−リンパ球活性化カスケードである。抗原生成細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の膜結合生成物に結合した場合、Ｔリンパ球は外来抗原を優先的に認識する。抗原／ＭＨＣ複合体と抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）を有するＴリンパ球との間の分子相互作用は、最終的にはリンホカイン生成、ヘルパー／インデューサーまたは細胞障害性／サプレッサーＴ細胞機能の発現およびクローン増殖を引き起こす一連のプログラムされた生化学的出来事を開始することによりＴ細胞活性化を誘導する。Weiss et al.,Ann.Rev.Immunol.4,5 93〜619(1986)およびRudd et al.,Immunol.Rev.111,225〜266(1989)参照。Ｔ細胞表面分子であるＣＤ４およびＣＤ８は、外来抗原の認識においてＴｃＲ／ＣＤ３複合体と共働し、それぞれＭＨＣクラス１１およびクラスＩ抗原の非多型性領域との相互作用による３分子認識ユニットに貢献する。これらの相互作用の過程において、ＣＤ４およびＣＤ８分子は独立した細胞内シグナルを伝達し(B ierer et al.,Ann.Rev.Immunol.7,579〜599(1989)およびBierer et al., Immunol.Rev.111,267〜294(1989)）、結果生じるＴｃＲ／ＣＤ３複合体との凝集はＴ細胞の増殖をおおいに促進する（Eichmann et al.,Eur.J.Immunol.17,643〜 650(1987)およびAnderson et al.,J.Immunol.139,678〜682(1987)）。モノマーＣＤ４および２−サブユニット（αおよびβ）ＣＤ８は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、短い細胞質ドメインを有するトランスメンブラン糖蛋白である。ＣＤ４はＴヘルパー／インデューサーリンパ球上に優先的に発現されるが、ＣＤ８は細胞障害性およびサプレッサーＴリンパ球上に優先的に発現される（Reinhertz et al.,Immunol.Rev.81,95〜129(1985)およびSno wet al.,J.Biol.Chem.258,14675〜14681(1983)）。ＣＤ４およびＣＤ８のα鎖のヘテロダイマーは、ｓｒｃ−関連の、リンパ球特異的蛋白であるチロシンキナーゼｐ５６^lck（Ｌｃｋ）のユニークなアミノ末端ドメインの一部に細胞質中の尾によって物理的に結合していることが見いだされている。Rudd et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,5190〜5194(1988)およびVeil lette et al.,Cell,55,301〜308(1988)参照。受容体チロシンキナーゼから類推すると、Ｌｃｋ／ＣＤ４およびＬｃｋ／ＣＤ８複合体はおそらく、Ｔ細胞増殖および分化を誘導するシグナルの発生において必須の役割を果たしているであろう。さらに、多くの実験的アプローチにより、Ｌｃｋの存在はＴ細胞活性化に必須であることが示されている。Straus et al.,Cell,70,585〜593(1992)；Chan et al.,Ann.Rev.Immunol.12,555〜592(1994)；Molina et al.,Nature,357,161〜164 (1992)；およびVeillette et al.,Nature,338,257〜259(1989)参照。休止Ｔリンパ球において、細胞のＬｃｋの５０〜６０％がＣＤ４に結合している。遺伝学的および変異の分析についての研究により、ＭＨＣクラスＩＩにより抑制されているヘルパーＴリンパ球中に見いだされる、先に生じた無傷のＬｃｋ／ＣＤ４複合体が、外来抗原に対するこれらの細胞の機能的応答に必須であることが示されている。Miceli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,2623〜2627(199 1)；Glaichenhaus et al.,Cell,64,511〜520(1991)；およびTurner et al.,Cell ,60,755〜765(1990)参照。それゆえ、ＣＤ４／Ｌｃｋ複合体を選択的に解離させる剤、あるいは複合体形成を阻害する剤は、in vitroにおいてＴ細胞活性化を阻害すると期待され、Ｔ細胞特異的免疫抑制剤となるだろう。かかる剤は自己免疫疾患および／または同種移植片拒絶反応の治療に有用であると期待される。ＭＨＣクラス−Ｉに限定されたＴリンパ球の抗原に対する応答におけるＬｃｋ／ＣＤ８複合体の中心的役割を支持する直接的証拠は存在しないが、ＣＤ８−陽性Ｔリンパ球の活性化および増殖を誘導するシグナルの発生においてＣＤ８／Ｌｃｋ複合体が必須の役割を果たしている可能性があると考えられている。さらに、ＣＤ−８陽性細胞障害性Ｔリンパ球は移植における組織毒性の発生の原因であると考えられている。それゆえ、選択的にＬｃｋ／ＣＤ８複合体を解離させる剤、あるいは複合体形成を阻害する剤は同種移植片拒絶反応の治療に有用であると期待される。ＣＤ−４またはＣＤ−８結合Ｌｃｋ量を測定する現在の方法は、［³²Ｐ］ラジオアイソトープを用いる免疫複合体キナーゼアッセイによるＣＤ４またはＣＤ８免疫沈降においてＬｃｋを検出するような免疫沈降法あるいはウェスタンブロッティング法を包含する慣用的で労力の要る方法に依存している。これらの方法はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーを必要とする。よって、ＣＤ４／ＬｃｋおよびＣＤ８／Ｌｃｋ複合体を解離させる剤のごとき蛋白−蛋白複合体解離剤を見つけるためには、特異的標的蛋白複合体を測定するための簡単で高処理量のアッセイが存在する必要がある。発明の概要したがって、本発明の１の態様は、推定上の解離化合物の存在下または不存在下におけるＥＬＩＳＡに基づくアッセイにより標的蛋白複合体を定量することを含む、標的蛋白複合体を解離させることのできる化合物の同定方法である。本発明のもう１つの態様は、下記工程：ａ）同一の第１および第２の標的蛋白複合体を用意し；ｂ）第１の標的蛋白複合体を推定上の標的蛋白複合体解離化合物を含む組成物と接触させ；ｃ）第１および第２の標的蛋白複合体を別々に、標的蛋白複合体の第１の成分に特異的な固相の第１の抗体と反応させて第１および第２の捕捉された蛋白複合体を形成し；ｄ）第１および第２の捕捉された蛋白複合体を別々に、標的蛋白複合体の第２の成分に特異的な第２の抗体と反応させて第１および第２の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体を形成し：次いで、ｅ）第１および第２の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体を定量し、それにより、第２の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体に対する第１の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体の減少量により標的蛋白複合体を解離させる化合物が示されるを含む、標的蛋白複合体を解離させることのできる化合物の同定方法である。本発明のさらにもう１つの態様は、ＣＤ４／ｐ５６^lckおよびＣＤ８／ｐ５６^l ^ck Ｔ細胞受容体複合体を解離させることのできる化合物の同定方法である。図面の簡単な説明図１は本発明具体例をスキーム的に説明したものである。図２は標的蛋白複合体に対する本発明方法の選択性を説明したものである。発明の詳細な説明本発明の１の態様は、標的蛋白複合体を解離させることのできる化合物の同定方法である。一般的には、推定上の解離化合物の存在下または不存在下におけるＥＬＩＳＡに基づくアッセイにより標的蛋白複合体を定量することを含む、標的蛋白複合体を解離させることのできる化合物の同定方法を用いる。本発明方法によれば、標的蛋白複合体を解離させることのできる化合物は、容易で、高処理量で、特異的な無細胞アッセイにより同定される。本発明方法は、薬剤の発見に有用である。標的蛋白複合体は、２種またはそれ以上の蛋白が非共有結合的に結合している蛋白複合体であり、複合体成分の解離および／または相互作用の阻害は治療効果を有するであろう。標的蛋白複合体を解離させる化合物は複合体成分の再結合および初期結合を阻害することも、当業者により認識されるであろう。標的蛋白成分は細胞内または細胞外起源いずれのものであってもよい。本発明の１の具体例において、標的蛋白複合体を発現する細胞の抽出物により、あるいは組み換え法により、同一の第１および第２の標的蛋白複合体が提供される。これとは別に、第１および第２の標的蛋白複合体に結合している無傷の細胞によっても複合体が提供される。次いで、第１の蛋白複合体を、推定上の標的蛋白複合体解離化合物を含む組成物と接触させる。標的蛋白複合体解離化合物としてスクリーニングされうる組成物は、種々の単独もしくは結合有機分子、または天然産物抽出物、土壌抽出物および醗酵ブロスのごとき有機分子混合物を包含する。細胞抽出物調製プロトコール、ならびに標的蛋白複合体の成分をコードしている構造遺伝子または結合領域をコードしている遺伝子フラグメントの異種の系におけるクローニングおよび発現のような組み換え法のごとき、第１および第２の標的蛋白複合体を得る方法は当該分野においてよく知られている。無傷の細胞を得るための全細胞培養法も当該分野においてよく知られている。無傷の細胞を推定上の解離化合物と接触させた後、細胞抽出物を調製する。第１および第２の標的蛋白複合体を別々に、標的蛋白複合体の第１の成分に特異的な固相の第１の抗体と反応させる。第１の抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または単離ＩｇＧであってもよい。好ましくは、第１の抗体は標的蛋白複合体の第１の成分に高い親和性を有する。最も好ましくは、第１の抗体はモノクローナルである。好ましくはマイクロタイタープレートウェルへの吸着により、抗体を固体基材に結合させる。第１の抗体と標的蛋白複合体の第１の成分との反応により、可溶性標的蛋白複合体が溶液から除去され、第１および第２の固相に捕捉された蛋白複合体が形成される。第１および第２の捕捉された蛋白複合体を別々に、標的蛋白複合体の第２の成分に特異的な第２の抗体と反応させる。第２の抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または単離ＩｇＧであってもよい。好ましくは、第２の抗体は標的蛋白複合体の第２の成分に高い親和性を有する。最も好ましくは、第２の抗体は単離ＩｇＧである。第２の抗体と標的蛋白複合体の第２の成分との反応により、固相に捕捉された蛋白／第２の抗体複合体が生じる。捕捉された第１および第２の蛋白／第２の抗体複合体の量を定量する。第２の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体に対する第１の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体の減少量が標的蛋白複合体を解離させる化合物を示す。第１および第２の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体の定量は、酵素またはビオチンに共有結合した三次抗体反応物を用いる酵素結合免疫吸着に基づく（ＥＬＩＳＡに基づく）アッセイによる。三次抗体は第２の抗体と反応し、次いで、未結合抱合体を洗浄し、発色性または蛍光基質を添加する。結合酵素抱合体により基質が加水分解されると、発色または蛍光を発するレポーター分子生成物は生じる。生成したレポーター生成物量は試験混合物中に存在する標的蛋白複合体量に比例する。典型例はＥＬＩＳＡに基づくアッセイであり、例えば、第２の抗体はウサギ起源であり、三次セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ抱合ヤギ・抗−ウサギＩｇＧ（HRP-GARIG）は捕捉された蛋白／第２の抗体複合体と反応する。発色性ペルオキシダーゼ基質である。−フェニレンジアミン二塩酸の減少により、複合体化したHRP-GARIGを検出する。他の検出法はビオチン−ストレプトアビジン、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼおよびウレアーゼを包含する。試験化合物を欠く対照に対して減少したレポーター分子のシグナルによって標的蛋白複合体を解離させる試験化合物を同定する。本発明方法により標的蛋白複合体の解離を引き起こすものと同定された場合、開裂剤である可能性のある剤を２次スクリーニングにおいて試験して、無傷の細胞に対するそれらの有効性を直接確認する。天然産物抽出物のごとき混合物を試験する場合、当該分野でよく知られた化学的および／または物理的分離法に混合物を供して混合物から活性化合物を単離することが望ましいかもしれない。また、精製工程の間、対象とする化合物の存在をモニターするためのバイオアッセイとして本発明方法を用いることも望ましいかもしれない。代表的な標的蛋白複合体は、Ｔ細胞活性化カスケードにおける必須成分である、ヘルパーＴリンパ球に存在するＣＤ４／Ｌｃｋ複合体である。本発明方法により同定される選択的なＣＤ４／Ｌｃｋ複合体解離剤は、選択的免疫抑制治療および同種移植片拒絶反応の治療の開発のための先導化合物を提供するであろう。無傷のＴ細胞、Ｔリンパ球抽出物により第１および第２のＣＤ４／ｐ５６^lck 複合体がにより提供されるか、あるいは組み換え法により提供される。好ましくは、無傷の細胞または細胞抽出物を用いる場合、それらは、急性リンパ芽球ＣＤ −４陽性ヒト・Ｔ−細胞系であるＣＥＭ細胞から提供される。ＣＤ−４陽性、ＣＤ−８陽性胸腺Ｔリンパ球細胞系であるＳｕｐＴ１も好ましい。まず、提供されたＣＤ４／ｐ５６^lck複合体を、ＣＤ４／ｐ５６^lck複合体解離化合物を含む組成物と接触させる。次いで、第１および第２のＣＤ４／ｐ５６^lc ^k 複合体を、固相に結合したＣＤ４抗体と反応させて捕捉されたＣＤ４／ｐ５６^l ^ck 複合体を形成させる。無傷の細胞を用いる場合、細胞を推定上の解離化合物と接触させた後、細胞抽出物を調製する。好ましくは、ＣＤ４抗体はＯＫＴ４のごときモノクローナル抗体である。他のＣＤ４モノクローナル抗体を本発明方法に用いてもよい。捕捉されたＣＤ４／ｐ５６^lck複合体をｐ５６^lck抗体と反応させて捕捉されたＣＤ４／ｐ５６^lck／ｐ５６^lck抗体複合体を形成させる。好ましくは、ｐ５６^lck抗体は、ｐ５６^lckのアミノ末端またはカルボキシ末端の一部に対して生成された抗−ｐ５６^lckＩｇＧである。最も好ましくは、ｐ５６^lck抗体をｐ５６^lckのカルボキシ末端の一部に対して生成させる。上記ＥＬＩＳＡに基づくアッセイにより、捕捉されたＣＤ４／ｐ５６^lck／ｐ５６^lck抗体複合体を検出する。対照に対するレポーター生成物の減少により、ＣＤ４／ｐ５６^lck複合体を解離させる化合物を同定する。もう１つの代表的な標的蛋白複合体は、いくつかのＴリンパ球サブセットに存在するＣＤ８／Ｌｃｋ複合体である。本発明方法により同定される選択的なＣＤ８／Ｌｃｋ複合体解離剤は、選択的免疫抑制治療および同種移植片拒絶反応の治療の開発のための先導化合物（lead compounds）を提供するであろう。ＣＤ４／Ｌｃｋに関する上記方法においてＣＤ８抗体を用いること、好ましくはモノクローナル抗体を用いることにより、ＣＤ８／Ｌｃｋ複合体の正確な測定および複合体解離剤の同定が可能になる。本発明方法は標的蛋白複合体に対して選択的であり、複合体の未結合成分を検出しない。ＣＤ４／Ｌｃｋの具体例において、本発明方法は、ＣＥＭおよびＳｕｐＴ１のごとき培養ＣＤ４−陽性／Ｌｃｋ−陽性Ｔ細胞系を用いる場合、１００００個程度の少ないＴ細胞からの抽出物中の複合体を検出することができ、ウェルあたり６.０ｘ１０⁵個までの細胞当量について直線関係が成り立つ。また、複合体量の１０％程度の小さな変化の検出できる。ＣＤ８／Ｌｃｋの具体例において、本発明方法は、ＳｕｐＴ１のごとき培養Ｌｃｋ−陽性／ＣＤ８−陽性Ｔ細胞系を用いる場合、４００００個程度の少ない細胞からの抽出物中の複合体を検出でき、ウェルあたり１.２５ｘ１０⁵個までの細胞当量について直線関係が成り立つ。ＣＤ４／ＬｃｋおよびＣＤ８／Ｌｃｋの両方の具体例において、本発明方法は、ＣＤ４モノクローナル抗体およびＣＤ８モノクローナル抗体でそれぞれコーティングされたプレートを用いて、新しく調製されたヒト・末梢血リンパ球からの抽出物中のＣＤ４／ＬｃｋおよびＣＤ８／Ｌｃｋ複合体を検出できる。下記の詳細な、しかも限定的でない実施例を参照して本発明を説明する。実施例ＣＤ４／Ｌｃｋ解離アッセイＴ細胞系ＣＥＭ（ＡＴＣＣＣＣＬ１１９）由来の急性リンパ芽球ＣＤ４− 陽性ヒト・Ｔ細胞を、１０％熱不活性化ウシ・胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地中の懸濁液として３７℃で増殖させて細胞密度を０.８〜１.２ｘ１０⁶ 個／ｍｌとした。細胞をペレット化させ、４℃においてＣａおよびＭｇ不含のD ulbeccoのリン酸緩衝化セイライン（Ｄ−ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、十分量の新たに調製した抽出バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ８.０、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＮａＦ、３％ＮＰ−４０、０.１ｍＭバナジン酸Ｎａ、０.１ｍＭＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌＴＬＣＫ）に細胞ペレットを再懸濁して１ｍｌ中１.０ｘ１０⁸個とすることにより界面活性剤によるＣＥＭ細胞抽出物を調製した。均一な懸濁液を得られるまで氷上で細胞ペレットをゆるやかに再懸濁して、時々ボルテックス撹拌しながら少なくとも３０分間氷上に保った。次いで、懸濁液を２９０００ｘｇで３０分、４℃で遠心分離し、透明な細胞抽出物上清をきれいな試験管に移し、氷上に置いた。０.５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０.０５％（ｖ／ｖ）Tween20を含有する氷冷ＰＢＳ（０.１Ｍリン酸塩、０.１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７.４）（ＰＢＴ）で細胞抽出物を１６倍希釈して６.２５ｘ１０⁶個の細胞当量／ｍｌとした。解離剤候補をｄｄＨ₂Ｏで希釈して１ｍｇ／ｍｌとし、その１０μｌのCorningプレートウェルに添加した。体積９０μｌの希釈細胞抽出物（５.６ｘ１０⁵個の細胞当量）を有機溶媒を含むCorningプレートウェルに添加して最終候補剤濃度０.１ｍｇ／ｍｌとした。代表的な有機溶媒はＤＭＳＯおよびエタノールである。得られた有機溶媒の最終濃度は１％であった。プレートをウォーターバス中３０℃で３０分インキュベーションし、次いで、氷上に移した。別法として、希釈した細胞抽出物を候補剤とともに室温（２２〜２５℃）で２ないし３時間インキュベーションしてもよい。 MaxiSorp^TM（Nunc丸底ウェル）またはTitertekプレートウェルを、１００μｌの０.１ＭＮａＨＣＯ₃,ｐＨ９.２中の２.５μｇ／ｍｌＯＫＴ４ＣＤ４モノクローナル抗体で一晩４℃でコーティングすることにより、ＥＬＩＳＡアッセイプレートを調製した。TitertekおよびCorning ＥＬＩＳＡプレートもうまく使用できる。Ｖ１ドメインの一部分に結合する他のＣＤ４モノクローナル抗体を用いてもよい。すべてのＣＤ４モノクローナル抗体をOrthoから購入し、あるいはＡＴＣＣから利用可能な特定のハイブリドーマから精製した。ＯＫＴ４ハイブリドーマはＡＴＣＣＣＲＬ８００２として利用できる。使用準備ができたらコーティング溶液を除去し、ウェルをＰＢＳで３回すすいだ。０.３ｍｌのＰＢＴをウェル毎に添加することによりブロッキング工程を行い、３７℃で少なくとも３０分インキュベーションした。すべてのＰＢＴを除去し、５０μｌの希釈細胞抽出物を試験ウェルに添加した。抽出バッファー／ＰＢＴ（１：１５,ｖ／ｖ）５０μｌをアッセイブランクウェルに添加した。プレートを密封し、４℃で１時間インキュベーションした。 Carboxy-Luc 抗体（C-Lck）を、Ｌｃｋ分子の少なくとも３０残基に対応するペプチドに対してウサギにおいて得た。市販（Upstate Biotechnology Inc.,カタログ番号０６−１３５）および研究室調製品のＣ−Ｌｃｋを用いた。Ｃ−Ｌｃｋ抗血清のＩｇＧフラクションを精製し、Ｄ−ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ溶液として −７０℃で保存した。一部分を氷冷ＰＢＴで３００倍希釈し、１週間以内に使用した。５０μｌの希釈Ｃ−Ｌｃｋを各ウェルに添加し、プレートを密封し、次いで、４℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、氷冷ＰＢＴ中１：８０００希釈された０.１ｍｌのセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ−ヤギ−抗−ウサギＩｇＧ（HRP-GARIG,Pierceカタログ番号３１４６２）をウェルに添加した。プレートを密封し、４℃で３０分インキュベーションした。２４ｍｌのクエン酸−リン酸バッファー（０.１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０.１Ｍクエン酸でｐＨを５.０に調節）にｏ−フェニレンジアミン二塩酸（ＯＰＤ、Sigma カタログ番号Ｐ−８２８７）を溶解し、次いで、８μｌの３０％Ｈ₂Ｏ₂を添加することによりＨＲＰ基質／発色剤溶液を各プレート用に新たに褐色ビン中に調製した。黄色が観察されるまでプレートを室温で５〜１５分暗所でインキュベーションした。５０μｌの４.５ＭＨ₂ＳＯ₄で発色を停止し、４９０ｎｍで読んだ。典型的なスクリーニング結果を表１に示す。結果をＩＣ₅₀（μＭ）、すなわち、対照に対して５０％の標的ＣＤ４／Ｌｃｋ蛋白複合体を解離した試験化合物濃度で表す。ジェニステイン（Genistein）は化合物５,７−ジヒドロキシ−４'−メトキシイソフラボンである。ＬＣ−Ａ２３およびＬＣ−Ａ２６はそれぞれtyrphostin化合物２−シアノ,３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）アクリロニトリルおよびトランス−２−シアノ,３−（３,４−ジヒドロキシフェニル）アクリルアミドである。クランビンＡ（Crambine A）は地中海産の海綿Crambe crambeからの単離グアニジンアルカロイドである（Tetrahedron Letters 31,6531〜6354(1990)）。ハリトキシン（Halitoxin）は海洋生物から抽出されたピリジニウム化合物を含有する粗混合物である。アッセイの選択性および感度を図２に示す。３つのセルタイプから抽出物を調製した。ＨＳＢＴ細胞系（ＡＴＣＣＣＣＬ１２０.１）はＬｃｋ−陽性／ＣＤ４−陰性である。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を地域のボランティアの献血により得た。これらの標品は典型的にＬｃｋ、ＣＤ４およびＣＤ８について陽性である。ＣＥＭＴ細胞はＬｃｋ−陽性／ＣＤ４−陽性である。ＬｃｋおよびＣＤ４の発現を棒グラフ下の「＋」または「−」で示す。ＣＤ４およびＬｃｋ陰性である細胞系の不存在下では、組み換え可溶性ＣＤ４（ｓＴ４）標品を用いた。ＣＥＭ細胞を５０ｎＭホルボールジブチレート（ＰＤＢｕ）または１００μＭガングリオシドＧＭ１で処理した。それらはＣＤ４／Ｌｃｋ複合体を３７℃でそれぞれ１５分および３０分で解離させた。ＰＤＢｕは、ＣＤ４からＬｃｋを解離させるプロテインキナーゼＣを活性化し、次いで、ＣＤ４をダウンレギュレーションする。ＧＭ１は、ＣＤ４細胞外ドメイン中の領域に結合するグリコソスフィンゴリピドガングリオシドであり、ＬｃｋをＣＤ４から解離させることが示されている。ＰＢＬ、ＨＳＢおよびＣＥＭ細胞の対照標品を処理しなかった。処理細胞標品および対照細胞標品を両方とも１ｘ１０⁸個／ｍｌの密度で抽出した。抽出物をＰＢＴで８倍希釈し、５０μｌの希釈抽出物（６ｘ１０⁵個）または５０μ ｌの０.２ｍｇ／ｍｌｓＴ４を、２５０ｎｇのＯＫＴ４でコーティングしたMaxi sorp^TMプイレートのウェル毎に適用した。図２に示すはじめの５つの結果の棒グラフは、ＣＤ４およびＬｃｋの両方、すなわち、ＣＤ４／Ｌｃｋ複合体を含有する細胞源が存在する場合にのみシグナルがアッセイにおいて発生することを示す。該アッセイは遊離のＬｃｋまたは遊離のＣＤ４を検出しない。よって、Ｌｃｋを含むがＣＤ４を含まないＨＳＢ細胞は該アッセイにおいてシグナルを発生しなかった。ｓＴ４を用いる場合、ＣＤ４／Ｌｃｋ複合体を欠くためシグナルが得られなかった。ＰＢＬおよびＣＥＭ細胞は両方ともＬｃｋおよびＣＤ４を発現する。これら２種の細胞タイプは、アッセイにおいてバックグラウンド（バッファー）の１２ないし１５倍のシグナルを発生することが図２において示されている。図２のおわりの３つの結果の棒グラフは、ＣＤ４／Ｌｃｋ複合体を解離させることが示された処理はアッセイで得られるシグナルの減少を引き起こすことを示す。かくして、ＣＥＭ細胞をＰＤＢｕで処理した場合、発生したシグナルの６０％減が観察された。この結果は、慣用的な検出アッセイにより得られた公表されている結果によく対応している。さらに、ＣＤ４からＬｃｋを解離させるＧＭ１の能力が本アッセイで確認された。本アッセイで得られた他の結果は、Ｌｃｋ抗体のかわりにｓｒｃファミリーのメンバーであるｐ５９^fynおよびｐ５６^lynに対する抗体を複合体の検出に用いた場合、ＣＥＭ細胞の抽出物からはシグナルは発生しないことを示した。さらに、該アッセイは、ＣＤ８−陽性／Ｌｃｋ−陽性Ｔ細胞からの抽出物中のＣＤ８／Ｌｃｋ複合体を検出しなかった。別法として、ＣＥＭ細胞を上記のごとく増殖させ、無血清培地に再懸濁して細胞密度を５ｘ１０⁶個／ｍｌとした。解離剤候補をｄｄＨ₂Ｏで希釈して１ｍｇ／ｍｌとし、その１０μｌをCorningプレートウェルに添加した。上記のごとく、希釈した無傷の細胞のうち９０μｌ（４.５ｘ１０⁵個）を有機溶媒を含むCornin gプレートウェルに添加して最終候補剤濃度を０.１ｍｇ／ｍｌとした。マイクロタイタープレートを遠心分離し、上記のごとく、５０μｌの抽出物（２.２５ｘ１０⁵個の細胞当量）をコーティングされブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートに適用した。得られた結果は上記結果と同様であった。上記アッセイのコーティング工程においてハイブリドーマ（ＡＴＣＣＣＲＬ８０１４）から精製されたＣＤ８モノクローナル抗体（ＯＫＴ８）をかわりに用いることによってＳｕｐＴ１（ＡＴＣＣＣＲＬ１９４２）抽出物中のＣＤ８／Ｌｃｋ複合体を選択的かつ正確に測定した。遊離ＣＤ８および遊離Ｌｃｋは検出されなかった。Ｌｃｋ抗体のかわりにｓｒｃファミリーのメンバーであるｐ５９^fyn およびｐ５６^lynに対する抗体を複合体の検出に用いた場合、シグナルを検出することはできなかった。さらに、該アッセイは、ＣＤ４−陽性／Ｌｃｋ−陽性Ｔ細胞からの抽出物中のＣＤ４／Ｌｃｋ複合体を検出しなかった。本発明の精神または本質的属性から逸脱することなく、他の特定の形態において本発明を具体化することもでき、したがって、本発明の範囲を示すものとしては、上記説明よりもむしろ添付した請求の範囲を参照すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/535 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 21/08 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/535 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．推定上の解離化合物の存在下または不存在下におけるＥＬＩＳＡに基づくアッセイにより標的蛋白複合体を定量することを含む、標的蛋白複合体を解離させることのできる化合物の同定方法。２．下記工程：ａ）同一の第１および第２の標的蛋白複合体を用意し；ｂ）第１の標的蛋白複合体を推定上の標的蛋白複合体解離化合物を含む組成物と接触させ；ｃ）第１および第２の標的蛋白複合体を別々に、標的蛋白複合体の第１の成分に特異的な固相の第１の抗体と反応させて第１および第２の捕捉された蛋白複合体を形成し；ｄ）第１および第２の捕捉された蛋白複合体を別々に、標的蛋白複合体の第２の成分に特異的な第２の抗体と反応させて第１および第２の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体を形成し；次いで、ｅ）第１および第２の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体を定量し、それにより、第２の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体に対する第１の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体の減少量により標的蛋白複合体を解離させる化合物が示されるを含む、標的蛋白複合体を解離させることのできる化合物の同定方法。３．第１および第２の標的蛋白複合体が細胞抽出物により提供される請求項２の方法。４．第１および第２の標的蛋白複合体が組み換え法により提供される請求項２の方法。５．第１および第２の標的蛋白複合体が無傷の細胞により提供される請求項２の方法。６．下記工程：ｂ）１）無傷の細胞から標的蛋白複合体を抽出するをさらに含む請求項５の方法。７．下記工程：ａ）同一の第１および第２のＣＤ４／ｐ５６^lck複合体を用意し；ｂ）第１のＣＤ４／ｐ５６^lck複合体を推定上のＣＤ４／ｐ５６^lck複合体解離化合物を含む組成物と接触させ；ｃ）第１および第２のＣＤ４／ｐ５６^lck複合体を別々に、固相のＣＤ４抗体と反応させて第１および第２の捕捉されたＣＤ４／ｐ５６^lck複合体を形成し；ｄ）第１および第２の捕捉されたＣＤ４／ｐ５６^lck複合体を、ｐ５６^lck抗体と反応させて第１および第２の捕捉されたＣＤ４／ｐ５６^lck／ｐ５６^lck抗体複合体を形成し；次いで、ｅ）第１および第２の捕捉されたＣＤ４／ｐ５６^lck／ｐ５６^lck抗体複合体を定量し、それにより、第２の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体に対する第１の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体の減少量によりＣＤ４／ｐ５６^lck複合体を解離させる化合物が示されるを含む、ＣＤ４／ｐ５６^lckＴ細胞受容体複合体を解離させることのできる化合物の同定方法。８．第１および第２のＣＤ４／ｐ５６^lck複合体がＣＥＭ細胞抽出物により提供される請求項７の方法。９．第１および第２のＣＤ４／ｐ５６^lck複合体が無傷のＣＥＭ細胞により提供される請求項７の方法。１０．下記工程：ｂ）１）無傷の細胞から標的蛋白複合体を抽出するをさらに含む請求項７の方法。１１．ＣＤ４抗体がモノクローナル抗体である請求項７の方法。１２．モノクローナル抗体がＯＫＴ４である請求項１１の方法。１３．ｐ５６^lck抗体が抗−ｐ５６^lck ＩｇＧである請求項７の方法。１４．抗−ｐ５６^lck ＩｇＧがｐ５６^lckのカルボキシ末端に対して生成されたものである請求項１３の方法。１５．下記工程：ａ）同一の第１および第２のＣＤ８／ｐ５６^lck複合体を用意し；ｂ）第１のＣＤ８／ｐ５６^lck複合体を推定上のＣＤ８／ｐ５６^lck複合体解離化合物を含む組成物と接触させ；ｃ）第１および第２のＣＤ８／ｐ５６^lck複合体を別々に、固相のＣＤ８抗体と反応させて第１および第２の捕捉されたＣＤ８／ｐ５６^lck複合体を形成し；ｄ）第１および第２の捕捉されたＣＤ８／ｐ５６^lck複合体を、ｐ５６^lck抗体と反応させて第１および第２の捕捉されたＣＤ８／ｐ５６^lck／ｐ５６^lck抗体複合体を形成し；次いで、ｅ）第１および第２の捕捉されたＣＤ８／ｐ５６^lck／ｐ５６^lck抗体複合体を定量し、それにより、第２の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体に対する第１の捕捉された蛋白／第２の抗体複合体の減少量によりＣＤ８／ｐ５６^lck複合体を解離させる化合物が示されるを含む、ＣＤ８／ｐ５６^lckＴ細胞受容体複合体を解離させることのできる化合物の同定方法。１６．第１および第２のＣＤ８／ｐ５６^lck複合体がＳｕｐＴ１細胞抽出物により提供される請求項１５の方法。１７．第１および第２のＣＤ８／ｐ５６^lck複合体が無傷のＳｕｐＴ１細胞により提供される請求項１５の方法。１８．下記工程：ｂ）１）無傷の細胞から標的蛋白複合体を抽出するをさらに含む請求項１７の方法。１９．ＣＤ８抗体がモノクローナル抗体である請求項１５の方法。２０．モノクローナル抗体がＯＫＴ８である請求項１９の方法。２１．ｐ５６１ｃｋ抗体が抗−ｐ５６^lck ＩｇＧである請求項１５の方法。２２．抗−ｐ５６^lck ＩｇＧがｐ５６^lckのカルボキシ末端に対して生成されたものである請求項２１の方法。２３．請求項１の方法により同定される解離剤。２４．請求項２の方法により同定される解離剤。２５．請求項７の方法により同定される解離剤。２６．請求項１５の方法により同定される解離剤。