JPH10507794A - 印刷紙からインク、コーティング及びトナーを除去するための単一成分セルラーゼの利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、リサイクル中に単一成分セルラーゼを利用することを含んで成る、印刷紙をインク除去及びコーティング除去するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 印刷紙からインク、コーティング及びトナーを除去するための単一成分セルラー ゼの利用 1. 発明の分野 本発明は単一成分セルラーゼを利用して印刷紙のリサイクル中にインク、コー ティング及びトナーを除去するための方法に関する。 2. 発明の背景 増大していく量の様々な印刷紙流のリサイクルの促進は世界中の現象となりつ つある。これは特に、かかる試みが幅広く実施されていなかった北米の如き領域 における現象である。一部のグレードに関して、例えば古いダンボールに関して 、米国におけるリサイクル率は現在50％以上となっている。 混り合った事務廃棄物を含む高級品のグレードの一部は同じような再利用率と なっておらず、それ故重大な廃棄問題となっている。 これはポリマーインク、コーティング及びトナー、例えば非接触式融着レーザー プリンターインク、コピートナー、UV／EB硬化インク、ワニス上層及びコート紙 の除去の困難性に基づく。化学インク除去剤、例えば水酸化ナトリウム、珪酸ナ トリウム及び過酸化水素もレーザーインク及びコピートナー除去のためによく働 く。特に、高いpH値でのカルシウム充填剤の可溶化が生じうる。コーティング、 非接触式トナー及びインクの機械的分散には高資本及び作業費の双方がかかわる 。更に、パルプファイバー化学における不可逆的な変化が、有意な割合いの機械 パルプファイバーがファーニッシュの中に含まれているときに生じうる。 コピー紙、レーザー印刷紙、古雑誌及び古新聞紙のインク除去処理を改善する ために酵素が従来技術において利用されている。例えば、PCT WO 91／14819（古 雑誌及び新聞紙−塩基性pH）；Jeffriesら、1994，Tappi Journal 77：173-179 （コピー及びレーザープリント紙）；Kimら、Proceedings of the 1991 Tappi C onference，pp．1023-1030(古新聞紙−酸性pH)；Prasadら、1993、Appita 46 ： 289-292(コピー及びレーザープリント紙)；並びにPrasadら、1993，Nordic Pulp and Paper Journal 2 ：284-286(古新聞紙)、を参照のこと。 しかしながら、上記の文献はそれぞれ多成分酵素しか使用していない。それは 様々なタイプの酵素活性を含む。その他の代替物は考慮されていない。多成分セ ルラーゼの利用は数多くの欠点を強いる。第一に、このような多成分セルラーゼ は多種多様な酵素活性体を含み、その多くはインク除去にとって不要である。こ のような不要な酵素は不要な分解反応を及ぼし得、そして潜在的に収率のロスを 及ぼし、そしてパルプのファイバー強度を弱める。第二に、天然の多成分酵素を 使用した場合にはバッチ間差が往々にして起こり、この場合の標準化は総合した 特徴に基づかねばならない。第三に、多成分セルラーゼは微生物からしか単離し 得ないため、かかるセルラーゼの単離はやや費用がかさむ。組換DNA 法は応用さ れていない。 従って、例えばレーザーインク及びコピートナーを含むプリント及び書き込み 用グレートの印刷紙並びに新聞紙のための改善されたインク除去工程のニーズが ある。従って、本発明の目的は高品質印刷紙及び新聞紙を経済的にリサイクルす るための方法を提供する。 3. 発明の概要 本発明者は驚くべきことに、多成分酵素である従来技術の酵素と 異なり、単一成分のセルラーゼを印刷紙からインク、コーティング及びトナーを 除去するために利用できることを見い出した。従って、従来技術の教示に反して 、インク除去工程において多成分セルラーゼを利用する必要はない。 単一成分セルラーゼは従来技術において開示されている多成分セルラーゼより もいくつかの長所を有する。所望の最終製品が得られるように単一成分セルラー ゼの正確な混合物を仕立てる機会は多成分セルラーゼでは可能でなかった長所で ある。単一成分セルラーゼは多成分セルラーゼよりもより簡単に単離でき、その 理由はそれらが様々な方法、例えばセルラーゼをコードする組換DNA 配列の発現 の利用又は所定の微生物からの単離により得られうるからである。更に、単一成 分セルラーゼは一般に本発明の方法において利用されうる界面活性剤に一般に適 合性である。 本発明の方法は、（ａ）前記印刷紙を約３％以上の稠度においてパルプ処理す る；（ｂ）この印刷紙を、前記パルプスラリーからインク、コーティング及びト ナーが遊離するのに有効な量の少なくとも一種の単一成分セルラーゼで処理する ；そして（ｃ）前記パルプスラリーから遊離したインク、コーティング及びトナ ーを分離させる；工程を含んで成る。 本発明の方法を利用して除去したインク、コーティング及びトナーには、限定 することなく、非接触レーザーインク、新聞の印刷に一般的に利用されているレ タープレスインク、雑誌プリント、オフセットプリントインク、紫外線又は電子 線硬化インク、コーティング、及びトナー、例えばコピートナーが含まれる。 本発明の一の態様においては、印刷紙を大まかにパルプ処理し、詳しくは約２ 分〜約10分パルプ処理する。次いで酵素を加え、そしてパルプ処理を酵素処理の 最中続ける。他方、酵素処理の後に更な るパルプ処理を続けてよい。パルプスラリーはパルプ処理の完了後に希釈してよ い。 別の態様において、印刷紙を約20分以上パルプ処理する。次いで酵素を加え、 そしてパルプスラリーを酵素で処理する。更なるパルプ処理は行わない。パルプ 処理は酵素処理の前及び／又は後に任意的に希釈してよい。 本発明の更なる別の態様において、酵素を水の中に懸濁した印刷紙に加えてよ い。この印刷紙を同時にパルプ処理及びセルラーゼ処理して処理済みパルプスラ リーを得；そして遊離したインク、コーティング及びトナーをパルプスラリーか ら分離させる。 本発明の方法において、一種の酵素のみ、即ち、単一成分セルラーゼをパルプ スラリーに加えてよい。別の態様において、少なくとも２種類の単一成分セルラ ーゼをパルプスラリーに順次又は一緒に加える。別の態様においては、多成分セ ルラーゼと単一成分セルラーゼとをパルプスラリーに順次又は一緒に加えてよい 。 4. 図面の簡単な説明 図１はNovozym(登録商標)342で処理後の印刷写真コピー／レーザープリンター 紙のインク除去を示す。 図２はヒュミコラ・インソレンス(Humicola insolens)エンドグルカナーゼＶ で処理後の印刷写真コピー／レーザープリンター紙のインク除去を示す。 図３はヒュミコラ・インソレンスエンドグルカナーゼＩで処理後の印刷写真コ ピー／レーザープリンター紙のインク除去を示す。 図４はヒュミコラ・インソレンスエンドグルカナーゼＩによる低稠度トナー除 去に由来する白色度の結果を示す。 図５はヒュミコラ・インソレンスエンドグルカナーゼＩによる白 色度及び汚れ計測数結果を示す。 5. 発明の詳細な説明 本発明の方法は、（ａ）パルプ処理；（ｂ）酵素処理；及び（ｃ）パルプスラ リーからのインク、コーティング及びトナーの除去；の工程を含んで成る。本発 明の方法は任意的にパルプスラリーの酸性化及び／又はパルプスラリーの希釈を 含んで成りうる。これらの工程それぞれを以下に詳細する。 5.1. パルプ処理 紙産業において利用されている慣用の高稠度紙を本発明の実施において利用す ることができる。パルプ稠度は約３％以上であるべきであり、そして好ましくは 約 3.5％〜約40％、そして最も好ましくは約10％〜約20％とする。 一の態様において、印刷紙を約２分〜10分かけて大まかにパルプ処理してよい 。大まかにパルプ処理した紙は肉眼で見ることのできるファイバー束をまだ含み つづけており、一方完全にパルプ処理された紙は目に見えるファイバー束を有さ ないであろう。次いで酵素を加え、そしてパルプ処理を酵素処理中続ける。他方 、酵素処理の前、詳しくは約20〜約 120分前に印刷紙を完全にパルプ処理してよ い。pHは約 6.5〜約10、そして最も好ましくは約 7.0〜約8.5 の範囲にしてよい 。温度は約35℃〜約75℃の範囲にしてよい。更なる別の態様において、酵素を廃 紙に直接加え、そしてパルプ処理と酵素処理とを同時に、約20〜約 120分かけて 約35℃〜約75℃で行ってよい。 パルプ処理／酵素処理の最中に、又はこの工程の後、しかしながら浮遊（floa tation）工程の前に界面活性剤を加えてもよい。界面活性剤は好ましくは市販の エトキシル化ノニル又はオクチルフェノ ールで代表される非イオン性の種類のものとする。例えばParkら、1992 Biotech nology and Bioengineering 39：117-120により開示されている多種多様な非イ オン性界面活性剤が本用途において有効であろう。 5.2. 希釈 パルプ処理が終了したら、パルプスラリーを水又はリサイクル処理水で約２倍 以上希釈してよい。最終稠度は約 0.5％〜約 3.5％の範囲であってよい。酵素処 理の前にパルプ処理を完了させるなら、パルプスラリーは以下に記載のパルプ処 理後及び／又は酵素処理後に希釈する。 5.3. 酸性化 パルプスラリーのpHが約 8.5を超えたなら、パルプスラリーは酸性化すべきで ある。パルプスラリーを酵素処理の前に酸性化する。酸性化後のpHは好ましくは 約 6.5〜8.5 とする。 本発明の方法における酸性化剤は鉱酸、例えば硫酸であってよい（希釈酸の形 態で添加）。また、強酸又は弱塩基の塩、例えば硫酸アルミニウムを利用してよ く、その性質はそれを紙産業において有用なものとする。 有機酸（例えばグルコン酸又はクエン酸）を、遊離カルシウムと封鎖カルシウ ムとのバランスを調整するために部分的に又は全体的に使用してもよい。このよ うな酸は脂肪酸のカルシウム塩をインク除去工程において浮遊助剤として利用す るときに極めて有用である。 5.4. 単一成分セルラーゼ処理 本発明の方法において利用する酵素は単一成分セルラーゼである。本明細書に おいて定義する「単一成分セルラーゼ」はセルロースを加水分解し、そしてその 他のセルラーゼ成分を本質的に含まない 酵素である。特定のセルラーゼの例はDalboge and Hansen，1994，Mol．Gen．Ge n．243：253-260 に開示されている。特定の態様において、この単一成分セルラ ーゼは、例えば、内部β−１，４−グルコシド結合の切断を触媒するエンド−β −Ｄ−１，４−グルカナーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ 、EC 3.2.1.4）；非還元鎖末端からのグルコースの遊離を触媒するセロビオヒド ロラーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、EC 3.2.1.91）； 非還元鎖末端からのセロビオースの遊離を触媒する１，４−β−Ｄ−グルカング ルコヒドロラーゼEC 3.2.1.74 ；又はセロビオースのグルコースに至る切断を触 媒するセロビアーゼ(β−グルコシダーゼEC 3.2.1.21)でありうる。 単一成分セルラーゼは、セルロース分解酵素を産生できることで知られる微生 物、例えばヒュミコラ、サーモマイセス(Thermomyces)、バチルス（Bacillus） 、トリコデルマ(Trichoderma)、フサリウム（Fusarium）、マイセリオフトラ（M yceliophthora）、ファネロシャテ(Phanerochaete)、シゾフィルム(Schizophyll um)、ペニシリウム(Penicillium)、アスペルギルス(Aspergillus)及びゲオトリ カム(Geotricum)の種に由来しうる。菌類は当業界公知の手順を利用して培養で きうる（例えば、Bennett，J．W．and LaSure，L．（編）、More Gene Manipula tions in Fungi，Academic Press，CA，1991を参照のこと）。単一成分セルラー ゼは、遠心又は濾過、塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清液又は濾液のタン パク質性成分の沈殿、それに続く様々なクロマトグラフィー手順、例えばイオン 交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマ トグラフィー等により、培地及びその他の酵素化合物から回収されうる。 単離した単一成分セルラーゼを例えばSDS-PAGE及び当業界公知の 手順を利用して特性決定する。一の態様において、セルラーゼ、特にエンド−β −Ｄ−１，４−グルカナーゼはセルラーゼのセルロース分解活性を決定すること によりアッセイできうる。詳しくはセルロース分解酵素、例えばエンド−β−Ｄ −１，４−グルカナーゼはカルボキシ−メチルセルロース(CMC)を加水分解し、 それ故インキュベーション混合物の粘度を高める。得られる粘度の低下は振動粘 度計（例えばSofraserフランス由来のMIVI3000）により決定できうる。酵素のセ ルロース分解活性はECU アッセイにより定量できうる。ECU アッセイはカルボキ シ−メチルセルロース(CMC)の溶液の粘度を下げるサンプルの能力を測定するこ とによってサンプル中に存在する触媒活性の量を定量する。 他方、セルラーゼはアモルファスセルロースに対する活性についてアッセイさ れうる。かかる活性を有するセルラーゼの例はエンド−β−Ｄ−１，４−グルカ ナーゼ及びセロビオヒドロラーゼである。しかしながら、セロビオヒドロラーゼ はCMC に対する活性をもたない。 更に、セロトリオースに対するセルラーゼ活性も決定できうる。 詳しくは、ｋ_cat・Ｓ^-1で表示するセロトリオースに対するセルラーゼ活性は複 合アッセイ： セロトリオース→グルコース＋セロビオース(cat：セルラーゼ) グルコース＋Ｏ₂＋H₂O→グルコナーゼ＋H₂O₂(cat：グルコースオ キシダーゼ) H₂O₂＋ABTS^R→ABTS^Ox(cat：ペルオキシダーゼ） それに続く 418nm（ABTS^Oxの最大吸収は418nm にある）での光学測定により 決定できる。ABTS^Rは２，２′−アジノ−ジ−〔３−エチルベンズチアゾリンス ルホネート（６）〕であり、そしてBoerhinger Mannheim より商業的に入手でき る。ｋ_cat・Ｓ^-1はLineweav er-Burk プロットから計算できる。計算のために以下の定数を使用する：セルラ ーゼ：ε＝66,310Ｍ^-1・cm^-1及びABTS：ε＝0.0323Mmole^-1・cm^-1。 他方、単一成分セルラーゼは組換DNA 手順を利用して得られうる。単一成分セ ルラーゼをコードする核酸配列はゲル又はcDNA起源であってよく、そして例えば 適当な生物のゲノム又はcDNAライブラリーを用意し、そして例えばこの単一成分 セルラーゼのアミノ酸配列に基づいて調製した合成オリゴヌクレオチドプローブ を利用する標準技術（Sambrookら、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual 第２版、Cold Spring Habor，1989 参照）に従うハイブリダイゼーションにより この単一成分セルラーゼ全体又は一部をコードする核酸についてスクリーニング することにより得られうる。 この核酸配列は確立された標準方法、例えばS．L．Beaucageら（1981）Tetrah edron Letters 22，pp 1859-1869及びMatthes ら（1984）The EMBO J．3： 801- 805 に記載のホスホアミジット法により合成的に調製することもできうる。ホス ホアミジット法に従うと、オリゴヌクレオチドを例えば自動DNA シンセサイザー で合成し、精製し、ライゲーションし、そして適当なベクターの中にクローニン グする。 最後に、この核酸配列は合成、ゲノム又はcDNA起源のフラグメントを標準技術 に従って（適宜）ライゲーションすることにより調製した合成起源とゲノム起源 との複合体、合成起源とcDNA起源との複合体、又はゲノム起源とcDNA起源との複 合体であってよく、このフラグメントはDNA 構築体全体の様々な部分に相当する 。 本発明の方法において単一成分セルラーゼの発現のために利用する細胞は、培 養すると大量の本発明の単一成分セルラーゼを産生する細胞であるものが適当で ある。上記の如き、この細胞はもとから 本発明の単一成分セルラーゼを産生しうるものであってよいが、しかし好ましく はこの単一成分セルラーゼをコードする核酸配列で形質転換された本発明の細胞 とする。細胞は組換タンパク質を産生するための宿主として従来から利用されて いる原核又は真核細胞のいづれでもよく、例えば限定することなく、哺乳動物細 胞、昆虫細胞、植物細胞又は菌類細胞であり、そして好ましくは細菌又は菌類の 如き微生物である。「菌類」なる語は糸状菌及び酵母を含んで成ることを意図す る。 適当な細菌の例はバチルス（Bacillus）属のグラム陽性菌、例えばバチルス・ スブチリス(B．subtilis)、バチルス・リシェニホルミス（B．licheniformis） 、バチルス・レンタス(B．lentus)、バチルス・ブレビス(B．brevis)、バチルス ・ステアロサーモフィルス（B．stearothemophilus）、バチルス・アルカロフィ ルス(B．alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス（B．amyloliquefa ciens）、バチルス・コアギュランス（B．coagulans）、バチルス・メガテリウ ム(B．megaterium)、バチルス・サーキュランス（B．circulans）、バチルス・ ロータス(B．lautus)、並びにストレプトマイセス（Streptomyces）属のグラム 陽性菌、例えばストレプトマイセス・リビダンス(S．lividans)である。適当な グラム陰性菌の例にはエッシェリヒア(Escherichia)属の細菌、例えばＥ．コリ( E．coli)が含まれる。細菌宿主細胞の形質転換は例えばプロトプラスト形質転換 によって行うか、又は周知の態様でコンピテント細胞を利用することにより行っ てよい。その他の適当な細菌細胞の例はシュードモナス(Pseudomonas)種の細胞 、例えばシュードモナス・セパシア（P．cepacia）、シュードモナス・フラギ（ P．fragi）、シュードモナス・グラジオリ(P．gladioli)、シュードモナス・フ ルオレセンス（P．fluorescens）、シュードモナス・スタッツ ェリ(P．stutzeri)、シュードモナス・アルカリジェンス（P．alcaligenes）、 シュードモナス・シュードアルカリジェンス（P．pseudoalcaligenes）、シュー ドモナス・プチダ(P．putida)、シュードモナス・グルメ(P．glumae)又はシュー ドモナス・アエルギノーザ(P．aeruginosa)の細胞である。 他方、この細胞は菌類、即ち酵素又は糸状菌の細胞であってよい。酵母は例え ばサッカロマイセス(Saccharomyces)属の細胞、例えばＳ．セレビジエ(S．cerev isiae)であってよい。糸状菌宿主生物は例えばアスペルギルス(Aspergillus)種 の株、例えばＡ．ニガー（A．niger）、Ａ．ニドゥランス(A．nidulans)又はＡ ．オリザ(A．oryzae)であってよい。アスペルギルス宿主細胞を形質転換し、そ して組換タンパク質の発現を得るために利用する技術は適宜EP 238,023に記載さ れている。他方、菌類宿主細胞はフサリウム（Fusarium）種の株、例えばＦ．オ キシスポルムであってよく、その形質転換は例えばMalardier ら1989，Gene 78 ：147-156 に記載の通りにして実施してよい。 発現を得るため、単一成分セルラーゼをコードする核酸配列には通常プロモー ターが先行している。プロモーターは選定の宿主細胞において強力な転写活性を 示し、且つアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラー ゼ又は解糖酵素の如き細胞外又は細胞内タンパク質をコードする遺伝子に由来し うる任意の核酸配列であってよい。適当なプロモーター、特に細菌宿主を利用す るときのプロモーターは、Ｅ．コリのlac オペロンのプロモーター、ストレプト マイセス・コエリカラー(S．coelicolor)アガラーゼ遺伝子dagAプロモーター、 バチルス・リシェニホルミスαのプロモーター、バチルス・リシェニホルミス・ α−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエ ンス・α−ア ミラーゼ（amyQ）のプロモーター、又はバチルス・スブチリスxylA及びxinB遺伝 子のプロモーターである。菌類宿主における転写にとって有用なプロモーターの 例はＡ．オリザTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei) アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸 安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー又はＡ．アワモリ（A．awamori）グルコアミ ラーゼ（gluA）、リゾムコール・ミーヘイ・リパーゼ、Ａ．オリザ・アルカリ性 プロテアーゼ、Ａ．オリザ・トリオースホスフェートイソメラーゼ又はＡ．ニド ゥランス・アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。好まし いのはTAKA−アミラーゼ及びgluAプロモーターである。 単一成分セルラーゼの発現に関与するその他の配列には終止及びポリアデニル 化配列、並びにリボソーム結合性部位が含まれ、そしてプロモーターと同一の起 源に由来するのが適切でありうる。ベクターは更に、ベクターを課題の宿主細胞 において複製させるようにする核酸配列、例えば適当な複製起点を含んで成りう る。 このベクターは選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞の欠陥を補完するよ うな遺伝子、例えばＢ．スブチリスもしくはＢ．リシェニホルミスに由来するda l 遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテ トラサイクリン耐性の如き抗生物質耐性を授けるものも含んで成ってよい。アス ペルギルスの選択マーカーの例にはamdS，pyrG，argB，niaD及びsC（ヒグロマイ シン耐性を授けるマーカー）が含まれる。アスペルギルス宿主細胞における使用 に好ましいのはＡ．ニドゥランス又はＡ．オリザのamdS及びpyrGマーカーである 。よく利用されている哺乳類マーカーはジヒドロフォレートリダクターゼ（DHFR ）遺伝子である。更に、選択は例えば WO 91／17243 に記載の同時形質転換によ り成し遂げら れうる。 単一成分セルラーゼをコードする核酸配列を含んで成るDNA 構築体、プロモー ター、ターミネーター及びその他の要素をそれぞれライゲーションし、そしてそ れらを複製にとって必須の情報を含む適当なベクターに挿入するのに利用される 手順は当業者に公知である（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning，Cold Sp ring Harbor，NY，1989 を参照のこと）。 上記に定義した本発明のDNA 構築体又は発現ベクターのいづれかを含んで成る 細胞をこの単一成分セルラーゼの組換生産における宿主細胞として好適に使用す る。この宿主細胞は、好都合には組換宿主細胞が得られるようにDNA 構築体を組 込むことによりDNA 構築体で形質転換させることができる。組込みが一般に有利 と考えられ、なぜならDNA 配列が細胞の中で安定的に維持される傾向があるから である。宿主染色体へのDNA 構築体の組込みは慣用の方法に従って、例えば相同 又は異種組換により実施されうる。他方、細胞を別のタイプの宿主細胞との関係 で上述した通りに発現ベクターで形質転換させてよい。 得られる組換宿主細胞の発酵のために本発明の方法において利用される培養液 又は培地は課題の細胞を増殖させるのに適当な任意の慣用の培地であってよい。 適当な培地、例えば最小又は複合培地は商業的供給者から入手できるものである か、又は（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ において）公表された処方に従って調製したものであってよい。 この単一成分セルラーゼは培養液から、慣用の手順、例えば限定することなく 、遠心又は濾過により培養液から細胞を分離させ、必要ならば、細胞の破壊を経 て、硫酸アンモニウムの如き塩により上清液又は濾液のタンパク質性成分を沈殿 させ、次いで様々なクロマ トグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロ マトグラフィー等を行うことにより回収できうる。実際の回収方法は課題の酵素 の種類に依存する。 特定の態様において、この単一成分セルラーゼはアモルファスセルロースに対 してセルラーゼ活性を示すセルラーゼ、例えばエンド−β−Ｄ−１，４−グルカ ナーゼである。好適な態様において、この単一成分セルラーゼはセロトリオース の加水分解を触媒する例えばエンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼである。特 定の態様において、このエンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼはヒュミコラ・ インソレンス、例えばヒュミコラ・インソレンス株DSM 1800（ブダペスト条約の 規則に従い、1981年10月１日にDeustche Sammlung von Mikrourganismen，Masch eroder Weg 1B，D-3300 に寄託）に由来しうる。エンド−β−Ｄ−１，４−グル カナーゼは独立のセルロース結合性ドメインを保有し得、それ故セルロース基質 の結晶性領域中のセルロース鎖の加水分解を引き起こすことができる（例えば、 エンドグルカナーゼＶ）。エンドグルカナーゼＶはＨ．インソレンシから単離さ れ、そして約43kDa の分子量及び約5.2 のpIを有し、そして引用することで本明 細書に組入れる1992年10月28日提出の米国出願第940,680 号に記載されている。 他方、エンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼは独立のセルロース結合性ドメイ ンを有さないことがあり、それ故セルロース系基質のアモルファス領域において 作用する（例えばエンドグルカナーゼＩ）。エンドグルカナーゼＩは約50kDa の 分子量及び約5.5 のpIを有する。これはＨ．インソレンスから単離され、そして アスペルギルスの中でクローニング及び発現され、そして引用することで本明細 書に組入れる1992年10月28日提出の米国出願第940,680 号に記載されている。 添加するセルラーゼの用量はオーブン乾燥印刷紙に対しては約0. 02〜 1.0％（ｗ／ｗ）の範囲とする。酵素処理時間は約35℃〜約75℃で約５分〜 約 120分とする。 5.5. パルプスラリーからのインク、コーティング及びトナーの分離 酵素処理の後、インク粒子をパルプスラリーから遊離させる。次いでインクを 当業界公知の方法、例えば機械式インク除去、例えば浮遊；化学−機械式インク 除去；及び凝固化学によりパルプから分離させることができうる（例えば、McBr ide，1994，Pulp and Paper 1994年４月、Miller Freeman Publishers，San Fra ncisco，CA，p．44参照のこと）。合格したパルプを次に洗浄してよい。 インク及びコーティング分離の後、インク除去したパルプは慣用の方法による 製紙に適する。 6. 実施例 6.1. 実施例１ 6.1.1. 材料及び方法 110ｇの風乾した（a.d.）１平方インチの写真コピー／レーザープリント白色 紙を予め温めておいた脱イオン水（40℃）中に５％の稠度が達成されるように徐 々に加え、British 紙破砕機(Testing Machines Inc.，Amityville，NYより供給 ）に入れた。この時点でのpHは9.2 であった。事前破砕の後、pHを４Ｎの硫酸で 7.5 に下降調整した。バッファー溶液(0.05Ｍのリン酸ナトリウム、pH7.0)の中 に希釈した所望量のNovozym(登録商標)342(Novo Nordisk A／S；ヒュミコラ・イ ンソレンスに由来し、そして米国特許第4,435,057号に記載；比活性675ECU／ｇ ）、エンドグルカナーゼＩ（比活性2,500ECU／ｇ）又はエンドグルカナーゼＶ（ 比活性7,500ECU／ｇ）のいづれかを加え、そして破砕を更に20分続けた。エンド グルカナー ゼＩ及びエンドグルカナーゼＶもヒュミコラ・インソレンスに由来し、そして米 国出願第940,680 号に記載されている。 処理した破砕パルプをLamortインク除去セル（Lamort SA，Virty-le-Francois 、フランス）中の50℃の約14Ｌの水道水に加えた。パルプ混合物を30分撹拌して 破砕工程から存在する捕促空気を全て除去した。供給パルプ白色度データー点の ためにこの時点で１Ｌのサンプルを回収した。インク除去セルを始動させ、そし て1,100rpmの回転スピードで10分間動かした。この10分の間に頂部に浮遊するイ ンク粒子の定状的な手作業除去を行った。これら失格品を集め、濾過し、乾かし 、そして秤量した。 セルの中に残っている合格品を排水し、そしてこのパルプの一部から白色度パ ッドを作った。合格パルプ４リットルを１リットルづつTyler 標準80メッシュス クリーンに通してパルプ洗浄を促進させた。この手順由来のパルプを集め、そし て2.5 リットルの脱イオン水に懸濁し、そしてこの洗浄パルプから白色度パッド を作った。失格品又はスクリーンを通過した材料を濾過し、乾かし、そして秤量 した。 白色度パッドを、200 メッシュプラスチックスクリーンの敷いてあるブフナー ろう斗の中の15cmの濾紙の上で形成させた。最小パッド重量は３ｇとした。湿っ たパッドを吸水紙の間にはさみ、そしてTappi 再染色環の中に入れ、その間大気 圧レベルで乾燥させた。白色度の値はPhotovolt モデル577 白色度メーター(Pho tovolt Corp.，Indianapolis，IN 46225)を利用し、パルプパッドの頂点及び底 部の双方上で６つの個々の測定値をとることにより得た。これらの値を平均した 。使用する最終パッド白色度は頂部と底部測定値との平均とした。 6.1.2. 結果 Novozym(登録商標)342を利用して得られる結果を図１に示す。各サンプル時点 はインク除去セル供給物から、浮遊工程後から、及び浮遊合格品の洗浄後から集 めたサンプルを代表する３つの時点を含む。図１，２及び３において、これらの サンプル時点はそれぞれ黒色、白色及び灰色の棒で示す。白色度の上昇は25μｌ ／100o.d.廃棄物ｇの添加率において最大に達した。 エンドグルカナーゼＶを利用して得られる結果を図２に示す。コントロール、 25及び50μｌの用量を通じての応答曲線の概形はNovozym(登録商標)342 と類似 していた。Novozym(登録商標)342に関して認められる供給白色度値の上昇はこの 場合は認められなかった。 エンドグルカナーゼＩを利用して得られる結果を図３に示す。Novozym(登録商 標)及びエンドグルカナーゼＶについて認められる低用量での用量：性能至適は なかった。調べた用量域にわたり、白色度は上昇し続けた。供給白色度レベルは 用量の増大とともに上昇した。より大きいインク粒子の存在は、洗浄工程にわた り観察されたわずかな白色度の上昇に対し、浮遊セルにわたり認められた大きな 白色度の上昇により増幅された。 この結果は、多成分調製品の代わりにエンドグルカナーゼＩを利用することに よりはるかに優れたインク除去が得られうることを示す。 6.2. 実施例２ 6.2.1. 材料及び方法 Ｈ．インソレンスDSM 1800由来のエンドグルカナーゼＩを簡単な実験において 非接触プリントした木材非含有紙に対して試験した。それはまず廃棄物を脱イオ ン水の中で５％の稠度、45℃で30分、7.5 の初期pHでパルプ処理することを含む 。このパルプをインク除去 セルの中で約２％の稠度にまで希釈し、そして0.05Ｍのリン酸バッファーpH7.5 中の必須量のエンドグルカナーゼＩを加えた。それを50℃で更に30分撹拌した。 インク除去セルを充填し、そして10分の浮遊サイクルを行った。40分の間、パル プのpHは８〜8.2 に登っていった。その後、先の実施例と同様に、合格パルプを 洗浄した。浮遊段階を始める前に供給ストックサンプルを取り出した。浮遊段階 の終了時にサンプルを採取した。 6.2.2. 結果 エンドグルカナーゼＩについて示す結果を図４及び５に示す。エンドグルカナ ーゼＩは至適のない応答曲線を示した。洗浄パルプの白色度は酵素用量を増やす と上昇し続けた。応答レベルは約300ECU／kg廃棄物で水平となった。図５に示す 結果は、白色度値がインク含有量に反比例することを示す。 本発明は本明細書において開示する特定の態様に限定されず、なぜならこれら の態様は本発明のいくつかの観点の例示であるからである。あらゆる均等な態様 が本発明の範囲に属する。本発明の様々な改良がなされることを当業者は理解す る。かかる改良は請求の範囲内に属するであろう。 多種多様な文献を本明細書において挙げており、それらは引用することで本明 細書に組込まれる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年１０月２３日 【補正内容】 エンドグルカナーゼＶを利用して得られる結果を図２に示す。コントロール、 25及び50μｌの用量を通じての応答曲線の概形はNovozym(登録商標)342 と類似 していた。Novozym(登録商標)342に関して認められる供給白色度値の上昇はこの 場合は認められなかった。 エンドグルカナーゼＩを利用して得られる結果を図３に示す。Novozym(登録商 標)及びエンドグルカナーゼＶについて認められる低用量での用量：性能至適は なかった。調べた用量域にわたり、白色度は上昇し続けた。供給白色度レベルは 用量の増大とともに上昇した。より大きいインク粒子の存在は、洗浄工程にわた り観察されたわずかな白色度の上昇に対し、浮遊セルにわたり認められた大きな 白色度の上昇により増幅された。 この結果は、多成分調製品の代わりにエンドグルカナーゼＩを利用することに よりはるかに優れたインク除去が得られうることを示す。 6.2. 実施例２ 6.2.1. 材料及び方法 Ｈ．インソレンスDSM 1800由来のエンドグルカナーゼＩを簡単な実験において 非接触プリントした木材非含有紙に対して試験した。それはまず廃棄物を脱イオ ン水の中で５％の稠度、45℃で30分、7.5 の初期pHでパルプ処理することを含む 。このパルプをインク除去セルの中で約２％の稠度にまで希釈し、そして0.05Ｍ のリン酸バッファーpH7.5 中の必須量のエンドグルカナーゼＩを加えた。それを 50℃で更に30分撹拌した。インク除去セルを充填し、そして10分の浮遊サイクル を行った。40分の間、パルプのpHは８〜8.2 に登っていった。その後、先の実施 例と同様に、合格パルプを洗浄した。浮遊段階を始める前に供給ストックサンプ ルを取り出した。浮遊段階 の終了時にサンプルを採取した。 6.2.2. 結果 エンドグルカナーゼＩについて示す結果を図４及び５に示す。エンドグルカナ ーゼＩは至適のない応答曲線を示した。洗浄パルプの白色度は酵素用量を増やす と上昇し続けた。応答レベルは約300ECU／kg廃棄物で水平となった。図５に示す 結果は、白色度値がインク含有量に反比例することを示す。 多種多様な文献を本明細書において挙げており、それらは引用することで本明 細書に組込まれる。 請求の範囲 １．印刷紙からインク、コーティング及びトナーを除去する方法であって、 （ａ）前記印刷紙を３％以上の稠度でパルプ処理してパルプスラリーを得る； （ｂ）このパルプスラリーを、このパルプスラリーからインク、コーティング 及びトナーを遊離させるのに有効な量の少なくとも一種の単一成分セルラーゼで 処理する；そして （ｃ）この遊離したインク、コーティング及びトナーをこのパルプスラリーか ら分離する； 工程を含んで成る方法。 ２．工程（ａ）における稠度が 3.5％〜 4.5％である、請求項１記載の方法。 ３．工程（ａ）における稠度が10％〜20％である、請求項１記載の方法。 ４．工程（ａ）のパルプスラリーのpHが6.5 以上である、請求項１記載の方法 。 ５．工程（ａ）のパルプスラリーのpHを8.5 以上にする、請求項１記載の方法 。 ６．工程（ｂ）の前に工程（ａ）のパルプスラリーのpHを酸性化剤の添加によ り6.5 〜8.5 のpHに下げることを更に含んで成る、請求項５記載の方法。 ７．前記印刷紙を工程（ａ）において２分〜10分パルプ処理する、請求項１記 載の方法。 ８．工程（ｂ）の前記パルプスラリーの酵素処理中に前記パルプスラリーを少 なくとも20分更にパルプ処理することを含んで成る請 求項７記載の方法。 ９．前記印刷紙を工程（ａ）において少なくとも20分パルプ処理する、請求項 １記載の方法。 10．工程（ａ）の後に前記パルプスラリーを少なくとも２倍希釈することを更 に含んで成る、請求項１記載の方法。 11．前記パルプスラリーを工程（ｂ）の前に希釈する、請求項10記載の方法。 12．前記パルプスラリーを工程（ｂ）の後に希釈する、請求項10記載の方法。 13．前記単一成分セルラーゼがエンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼである 、請求項１記載の方法。 14．前記エンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼがセロトリオースの加水分解 を触媒できるものである、請求項13記載の方法。 15．前記エンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼがヒュミコラ・インソレンス に由来する、請求項13記載の方法。 16．前記エンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼがエンドグルカナーゼＩであ る、請求項15記載の方法。 17．前記エンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼがエンドグルカナーゼＶであ る、請求項15記載の方法。 18．前記単一成分セルラーゼがセロビオヒドロラーゼである、請求項１記載の 方法。 19．前記パルプスラリーを工程（ｂ）において単一成分セルラーゼで少なくと も５分処理する、請求項１記載の方法。 20．前記パルプスラリーを工程（ｂ）において単一成分セルラーゼで30℃〜75 ℃の温度で処理する、請求項１記載の方法。 21．前記遊離したインク、コーティング及びトナーを浮遊により前記パルプス ラリーから分離させる、請求項１記載の方法。 22．浮遊後、前記パルプスラリーを洗浄する、請求項21記載の方法。 23．前記パルプスラリーを複数種の単一成分セルラーゼで処理することを含ん で成る、請求項１記載の方法。 24．工程（ａ）のパルプスラリーを単一成分セルラーゼで処理することを更に 含んで成る、請求項１記載の方法。 25．印刷紙からインク、コーティング及びトナーを除去するための方法であっ て： （ａ）水の中に懸濁した印刷紙からインク、コーティング及びトナーを遊離さ せるのに有効な量の少なくとも一種の単一成分セルラーゼをこの懸濁印刷紙に加 える； （ｂ）同時に、３％以上の稠度において、工程（ａ）のこの懸濁した印刷紙を 前記単一成分セルラーゼで処理する及び前記印刷紙をパルプ処理し、パルプスラ リーを得る；そして （ｃ）このパルプスラリーから遊離したインク、コーティング及びトナーを分 離させる； 工程を含んで成る方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フランクス，ニール，イー. アメリカ合衆国，ノースカロライナ 27614，ラレ，ノーウッド オークス ド ライブ 5824 (72)発明者 バツェウィッツ，スティーブン，イー. アメリカ合衆国，コネチカット 06897, ウィルトン，ハルバット 199 (72)発明者 ホルム，ハンス，クリスチャン デンマーク国，デーコー−2820 ゲント フ，カミンデバイ 33

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．印刷紙からインク、コーティング及びトナーを除去する方法であって、 （ａ）前記印刷紙を約３％以上の稠度でパルプ処理してパルプスラリーを得る ； （ｂ）このパルプスラリーを、このパルプスラリーからインク、コーティング 及びトナーを遊離させるのに有効な量の少なくとも一種の単一成分セルラーゼで 処理する；そして （ｃ）この遊離したインク、コーティング及びトナーをこのパルプスラリーか ら分離する； 工程を含んで成る方法。 ２．工程（ａ）における稠度が約 3.5％〜約 4.5％である、請求項１記載の方 法。 ３．工程（ａ）における稠度が約10％〜約20％である、請求項１記載の方法。 ４．工程（ａ）のパルプスラリーのpHが約6.5 以上である、請求項１記載の方 法。 ５．工程（ａ）のパルプスラリーのpHを約8.5 以上にする、請求項１記載の方 法。 ６．工程（ｂ）の前に工程（ａ）のパルプスラリーのpHを酸性化剤の添加によ り約6.5 〜約8.5 のpHに下げることを更に含んで成る、請求項５記載の方法。 ７．前記印刷紙を工程（ａ）において約２分〜約10分パルプ処理する、請求項 １記載の方法。 ８．工程（ｂ）の前記パルプスラリーの酵素処理中に前記パルプスラリーを少 なくとも約20分更にパルプ処理することを含んで成る 請求項７記載の方法。 ９．前記印刷紙を工程（ａ）において少なくとも約20分パルプ処理する、請求 項１記載の方法。 10．工程（ａ）の後に前記パルプスラリーを少なくとも約２倍希釈することを 更に含んで成る、請求項１記載の方法。 11．前記パルプスラリーを工程（ｂ）の前に希釈する、請求項10記載の方法。 12．前記パルプスラリーを工程（ｂ）の後に希釈する、請求項10記載の方法。 13．前記単一成分セルラーゼがエンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼである 、請求項１記載の方法。 14．前記エンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼがセロトリオースの加水分解 を触媒できるものである、請求項13記載の方法。 15．前記エンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼがヒュミコラ・インソレンス に由来する、請求項13記載の方法。 16．前記エンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼがエンドグルカナーゼＩであ る、請求項15記載の方法。 17．前記エンド−β−Ｄ−１，４−グルカナーゼがエンドグルカナーゼＶであ る、請求項15記載の方法。 18．前記単一成分セルラーゼがセロビオヒドロラーゼである、請求項１記載の 方法。 19．前記パルプスラリーを工程（ｂ）において単一成分セルラーゼで少なくと も約５分処理する、請求項１記載の方法。 20．前記パルプスラリーを工程（ｂ）において単一成分セルラーゼで約30℃〜 約75℃の温度で処理する、請求項１記載の方法。 21．前記遊離したインク、コーティング及びトナーを浮遊により前記パルプス ラリーから分離させる、請求項１記載の方法。 22．浮遊後、前記パルプスラリーを洗浄する、請求項21記載の方法。 23．前記パルプスラリーを複数種の単一成分セルラーゼで処理することを含ん で成る、請求項１記載の方法。 24．工程（ａ）のパルプスラリーを単一成分セルラーゼで処理することを更に 含んで成る、請求項１記載の方法。 25．印刷紙からインク、コーティング及びトナーを除去するための方法であっ て： （ａ）水の中に懸濁した印刷紙からインク、コーティング及びトナーを遊離さ せるのに有効な量の少なくとも一種の単一成分セルラーゼをこの懸濁印刷紙に加 える； （ｂ）同時に、約３％以上の稠度において、工程（ａ）のこの懸濁した印刷紙 を前記単一成分セルラーゼで処理する及び前記印刷紙をパルプ処理し、パルプス ラリーを得る；そして （ｃ）このパルプスラリーから遊離したインク、コーティング及びトナーを分 離させる； 工程を含んで成る方法。