JPH10507905A

JPH10507905A - ヒト血清による溶解耐性生産者細胞系で生産されるレトロウイルスベクター

Info

Publication number: JPH10507905A
Application number: JP8507620A
Authority: JP
Inventors: ペンシエロ，マイケル; コリンズ，メアリ，ケイ．，エル．; コセット，フランソワ−ロワック; タケウチ，ヤスヒロ; ワイス，ロビン，エイ．
Original assignee: ジェネティックセラピーインコーポレイテッド; インスティチュートオブキャンサーリサーチ−ロイヤルキャンサーホスピタル
Priority date: 1994-08-17
Filing date: 1995-08-17
Publication date: 1998-08-04
Also published as: WO1996004934A1; EP0769968B1; CA2196208A1; US6329199B1; EP0769968A1; EP0769968A4; US5952225A; DE69533959D1; ATE287732T1

Abstract

(57)【要約】ヒト血清による不活性化に耐性であるレトロウイルスベクター。このレトロウイルスベクターはヒト血清による溶解に耐性である細胞系で生産され、このような細胞系はＨＯＳ，Ｍｖ−１−Ｌｕ，ＨＴ１０８０，ＴＥ６７１、およびヒト２９３細胞系、同じくそれらのものから誘導される細胞系を含む。このレトロウイルスベクターは生体内遺伝子伝達媒体としてとりわけ有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト血清による溶解耐性生産者細胞系で生産されるレトロウイルスベクターこの出願は、１９９５年８月１７日受理された（米国）出願番号０８／２９１，７６５号を部分継承し、また１９９５年５月２６日受理された同出願番号０８／４５１，２１５号を部分継承するものであり、これらはここで引用例として組込まれている。この発明は、ヒト血清による不活性化に耐性であるレトロウイルスベクターに関する。より詳細には、この出願はヒト血清による溶解耐性である細胞から生成されるレトロウイルスベクターに関する。も一つの見地において、この発明はこのようなベクターを使用する遺伝子治療に関する。発明の背景レトロウイルスはこれまでまた現在でも望ましい遺伝子を細胞に導入するために使用されており、また数多くの遺伝子治療実験に使用されている（ミラー、ネイチャー、３７５巻、４５５−４６０ページ（１９９２年））。コーネッタ、他、核酸研究および分子生物学の進歩、３６巻、３１１−３２２ページ（１９９０年）およびコーネッタ、他、ヒト遺伝子治療、１巻、１５−３０ページ（１９９０年）はヒトＡＤＡ遺伝子を含む両種性マウス白血病レトロウイルスをサルに静脈内注入することを教えている。レトロウイルス投与の後、サルでは臨床疾患は観察されなかった。レトロウイルスは血液循環により急速に浄化され、このような浄化はウイルスを不活性化する補体により部分的に実現された。いくつかの実験において、生体内細胞への遺伝子直接伝達が企てられた。例えば組換えレトロウイルスによる単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの腫瘍への伝達がそれであった（オールドフィールド、他、ヒト遺伝子治療、４巻、３９−６９ページ（１９９３年））。これらの実験に関して、マウス白血病ウイルス両種性菌株（ＭＬＶ−Ａ）パッケージング細胞がマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞内に構築され、組換えレトロウイルスを生産するために使用されている。しかしＮＩＨ３Ｔ３細胞で生産されるマウス白血病ウイルスはヒト血清により急速に不活性化される。このような不活性化は補体カスケードの活性化の結果である。まずＣ型レトロウイルス感染性の阻害は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）の４個の菌株、およびテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）の包膜特異性を持つモロニー肉腫ウイルス（ＭＬＶ）プソイドタイプ（ｐｓｅｕｄｏ−ｔｙｐｅ）、あるいはサル肉腫関連性ウイルス（ＳＳＡＶ）が新鮮ではあるが非加熱ヒト血清により不活性化された報告で示された（ウェルシュ、他、ネイチャー、２５７巻、６１２−６１４ページ（１９７５年）；ウェルシュ、他、ウイルス学、７４巻、４３２−４４０ページ（１９７６年））。これらウイルスのヒト血清による溶解、並びにネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４、サル肉腫関連性ウイルス（ＳＳＡＶ）、ヒヒ内因性ウイルスＭ２８（ＢａＥＶ）およびＤ型ウイルスメーソンファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）のヒト血清による溶解はビリオンからの逆転写酵素の放出により示された（ウェルシュ、他、１９７５年；ウェルシュ、他、１９７６年；シャーウィン、他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２１巻、６ −１１ページ（１９７８年））。補体は枯渇され、あるいは欠損ヒト血清はウイルス溶解を生じさせることを達成できず、また補体の消費はウイルスがヒト血清に加えられた時に観察された（ウェルシュ、他、１９７５年）。マウス肉腫ウイルスは溶解が示されＭＬＶビリオンに対するＣ１ｑ成分の直接の抗体非依存性誘発が続いて生じた（クーパー、他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１４４巻、９７０−９８４ページ（１９７６年））。ｐ１５Ｅ膜内外タンパク質であるとして提案された７．５のｐＩを有する分離された１５キロダルトンのビリオンタンパク質は誘発成分であることが示された（バーソロミュー、他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１４７巻、８４４−８５３ページ（１９７８年））。しかし、マウス細胞で作られたレトロウイルスはヒト血清、主として蔗糖エピトープＧａｌ（１−３）Ｇａｌエピトープにより、天然抗体により不活性化されることが発見された（タケウチ、他、未刊行データ）。図面の簡単な説明この発明はこれから以下の図面と関連して説明される。図１Ａおよび１Ｂは、ＮＩＨ３Ｔ３およびミンクＭｖ−１−Ｌｕ細胞から生成されるＭＬＶ−ＡおよびＲＤ１１４ウイルスの新鮮なヒト血清によるウイルス不活性化の時間経過のグラフである。図２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，２Ｄおよび２Ｅはヒト血清に対する異なった細胞系から生産された異なったウイルスの感受性を描いたグラフである。図３は、各種生産者細胞系に対する新鮮なヒト血清の細胞毒性を描いたグラフである。図４は、ヒト血清の異なった８個のサンプルに対するミンクＭｖ−１−Ｌｕ，ＨＯＳ、およびＴＥ６７１細胞系から生産されたＭＬＶ−Ａ，ＭＬＶ−Ｘ、およびＲＤ１１４の感受性を描いたグラフを示す。図５はプラスミドｐＧ１の構造の図式である。図６はプラスミドｐＧ１にある多重クローニング部位の配列である。図７はプラスミドｐＧ１の地図である。図８はプラスミドｐＮ２の地図である。図９はプラスミドｐＧ１Ｎａの地図である。図１０はＶＳＶ−Ｇレトロウイルス包膜を持つレトロウイルスベクターの力価のグラフであり、ここで前記ウイルスはヒト血清あるいは不活性化胎仔ウシ血清に露出した際にｇｐ７Ｃ誘導マウス細胞系により生産された。図１１はヒト血清あるいは不活性化胎仔ウシ血清に露出した際にＣＡＫ８細胞系により生産されるレトロウイルスベクターの力価のグラフである。図１２はヒト血清あるいは不活性化胎仔ウシ血清に露出した際にＰＡ３１７細胞系により生産されるレトロウイルスベクターの力価のグラフである。図１３はヒト血清に１８０分間露出した際にＣＡＫ８細胞系により生産されるレトロウイルスベクターの力価のグラフである。また、図１４はヒト血清に１８０分間露出した際にＰＡ３１７細胞系により生産されるレトロウイルスベクターの力価のグラフである。発明の概要レトロウイルスベクターがヒト血清による溶解に耐性である細胞系から生産される際に、このようなレトロウイルスベクターはヒト血清による補体不活性化に耐性であり、またこのような補体耐性は包膜がマウスＣ型両種性レトロウイルスからのものであったにせよ使用される包膜に必ずしも依存するものではないことを出願人は発見した。かくしてこの発明は、ヒト血清による溶解に耐性である細胞系により生産されてきたレトロウイルスベクターに向けられる。この発明は更にこのようなレトロウイルスベクターを使用する遺伝子治療に向けられ、ここでこのレトロウイルスベクターは一つの治療薬をコード化する少なくとも１個のポリヌクレオチドを含む。発明の詳細な説明この発明の一つの見地に従って、ヒト血清による不活性化に耐性の一つのレトロウイルスベクターが提供される。このレトロウイルスベクターは、ヒト血清による溶解に耐性である細胞系から生産された。ヒト血清による溶解に耐性である細胞系は必ずしもそれに限定されないが、ＨＯＳ，ＴＥ６７１，ＨＴ１０８０，Ｍｖ−１−Ｌｕ、およびヒト２９３細胞系、あるいはＨＯＳ，ＴＥ６７１，ＨＴ１０８０，Ｍｖ−１−Ｌｕ、もしくはヒト２９３細胞系から誘導される細胞系である。ここで使用される「ＨＯＳ，ＴＥ６７１，ＨＴ１０８０，Ｍｖ−１−Ｌｕ、もしくはヒト２９３細胞系から誘導される細胞系」という用語は、各種のｇａｇ，ｐｏｌ、およびｅｎｖタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む１個もしくはそれ以上の発現ベクター（例えばプラスミドベクターあるいはレトロウイルスベクターもしくはレトロウイルスベクターゲノム）を用いて前記の細胞系の一つを形質移入することにより形成される細胞系を意味する。ｇａｇおよびｐｏｌレトロウイルスタンパク質は、必ずしもそれに限定されないが、モロニーマウス白血症ウイルス，ラウス肉腫ウイルス，ＲＤ１１４，ＢａＥＶ，ＧＡＬＶ，ＳＳＡＶ，ＦｅＬＶ−Ｂ，ヒト免疫不全ウイルス、およびトリ白血症ウイルスを含むいずれかかレトロウイルスから得ることができる。選択肢として、ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質は修飾され、あるいはキメラｇａｇ／ｐｏｌ構築物であることができる。包膜は両種性包膜，エコトロピック包膜、あるいはキセノトロピック包膜、もしくは両種性およびエコトロピック部分を含む包膜であることができる。この包膜は、必ずしもそれに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス，ラウス肉腫ウイルス，ＲＤ１１４，ＢａＥＶ，ＧＡＬＶ，ＳＳＡＶ，ＦｅＬＶ−Ｂ，両種性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−Ａ），ヒト免疫不全ウイルス，トリ白血症ウイルスおよびＮＺＢウイルスを含むいずれかのレトロウイルスから得ることができる。選択肢として、ｅｎｖタンパク質は修飾されるかあるいはキメラｅｎｖ構築物であり、あるいは水泡性口内炎ウイルスおよびＨＶＪウイルスなどの非レトロウイルスから得ることができる。このような細胞は更に例えば選択的マーカーをコード化するポリヌクレオチドなどのような他のポリヌクレオチドを含むことができる。ヒト血清による溶解に耐性である細胞系で生産された両種性包膜およびマウス白血病ウイルスベースレトロウイルスを含むレトロウイルスを含むレトロウイルスが、ヒト血清による不活性化（とりわけ補体不活性化）に耐性であり得るということを出願人は思いがけず発見した。かくしてこのようなレトロウイルスは遺伝子治療手順において動物宿主に生体内投与するのに適切である。一つの実施例において、レトロウイルスベクターは細胞を以下に記載するレトロウイルスプラスミドベクターを用いて形質移入することにより生産することができる。選択肢として、レトロウイルスベクターは細胞をも一つのパッケージング細胞から得るレトロウイルスベクターを用いて感染させることにより生産することができる。細胞はまたレトロウイルスパッケージング機能で提供される。パッケージング機能は複製コンピテントレトロウイルスにより提供され、あるいはｇａｇ，ｐｏｌ、およびｅｎｖタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む１個もしくはそれ以上の発現ベクター（例えばプラスミドベクター）を用いて細胞系を安定的に形質移入することにより提供される。ここで使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、またリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む。この用語は更に一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、同じく一本鎖および二本鎖ＲＮＡを含む。この用語はまたメチル化あるいはキャップポリヌクレオチドなどを含む。ここで使用されるように、「レトロウイルスプラスミドベクター」という用語は、５’および３’レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）配列を含む全体あるいは一部のレトロウイルスゲノムを含むプラスミド，パッケージングシグナル（Ψ ）を意味し、また治療薬あるいは選択マーカーなどのような対象となるタンパク質あるいはポリペプチドをコード化する１個もしくはそれ以上のポリヌクレオチドを含む。「治療」という用語は一般的な意味で用いられ、治療薬，予防薬、および置換薬を含む。一つの実施例において、レトロウイルスベクターはモロニーマウス白血病ウイルスから誘導され、前記のようなベクターのＬＮシリーズのものであり、更にベンダー、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻、１６３９−１６４９ページ（１９８７年）およびミラー、他、バイオテクニクス、７巻、９８０−９９０ページ（１９８９年）で説明されている。このベクターはマウス肉腫ウイルスから誘導されるパッケージングシグナルの一部、および突然変異ｇａｇ開始コドンを持つ。ここで使用される「突然変異」という用語は、ｇａｇ開始コドンが欠失あるいは変更され、ｇａｇタンパク質あるいは断片もしくはその切形が発現されないようにされていることを意味する。も一つの望ましい実施例において、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルスから誘導され、少なくとも４個のクローニング、あるいは制限酵素認識部位を含み、ここで少なくとも２個の部位は１０，０００塩基対で１個以下の真核遺伝子出現頻度を有する。すなわち制限産物は少なくとも１０，０００塩基対の平均ＤＮＡサイズを有する。望ましいクローニング部位は、ＮｏｔＩ，ＳｎａＢＩ，ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩよりなるグループから選択される。もっとも望ましい実施例において、レトロウイルスプラスミドベクターはこれらすべてのクローニング部位を含む。このベクターは更に１９９４年１１月１７日受理された米国特許出願番号０８／３４０，８０５号、および１９９１年７月２５日に公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９１／１０７２８号で説明されており、いずれもその全体が引用例としてここに組込まれている。このようなクローニング部位を含むレトロウイルスプラスミドベクターが使用される時、更に一つのシャトルクローニングベクターも提供され、これは少なくとも２個のクローニング部位を含みそれはレトロウイルスプラスミドベクターに局在するＮｏｔＩ，ＳｎａＢＩ，ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩよりなるグループから選択される少なくとも２個のクローニング部位と適合し得る。シャトルクローニングベクターは、更に、シャトルクローニングベクターからレトロウイルスプラスミドベクターに転移し得る一つの治療薬をコード化する少なくとも１個の望ましいポリヌクレオチドを含む。シャトルクローニングベクターは基本「バックボーン」ベクターあるいは断片から構築することができ、これに対してクローニングあるいは制限酵素認識部位を含む１個あるいはそれ以上のリンカーが結合される。クローニング部位に含まれるものは、前記の適合性あるいは相補性クローニング部位である。シャトルベクターの制限部位に対応する末端を持つ遺伝子およびもしくはプロモーターは、従来の技術でシャトルベクターに結合される。シャトルクローニングベクターは原核システムにあるポリヌクレオチド配列を増幅するのに使用することができる。シャトルクローニングベクターは一般に原核システム、とりわけ細菌で使用されるプラスミドから調製される。かくして例えば、シャトルクローニングベクターはｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８などのプラスミドから誘導することができる。レトロウイルスプラスミドベクターは１個もしくはそれ以上のプロモーターを含む。使用される適切なプロモーターは必ずしもそれに限定されないが、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター含み、これらはミラー、他、バイオテクニクス、７巻、９号、９８０−９９０ページ（１９８９年）に記載されており、あるいは他のいずれかのプロモーター（例えば、必ずしもそれに限定されないが、ヒストン，ｐｏｌ，III、およびβ−アクチンプロモーターを含む真核細胞プロモーターなどの細胞プロモーター）を含む。使用される他のウイルスプロモーターは必ずしもそれに限定されないが、アデノウイルスプロモーター，ＴＫプロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択は、ここに含まれる教訓から当業者にとっては明らかであろう。使用される他のレトロウイルスプラスミドベクターは、必ずしもそれに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス，ラウス肉腫ウイルス，トリ白血症ウイルス，ＮＺＢウイルス，ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４，ネコ白血病ウイルスＢ（ＦｅＬＶ−Ｂ），サル肉腫関連性ウイルス（ＳＳＡＶ），ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）、およびテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）などより誘導されるレトロウイルスプラスミドベクターを含む。しかしこの発明の範囲は特定のレトロウイルスベクターに限定されるものでないことは理解されねばならない。レトロウイルスプラスミドベクターに含まれる治療薬をコード化するポリヌクレオチドは、必ずしもそれに限定されないが、ＴＮＦ−αなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子をコード化するポリヌクレオチド；インターフェロン−α，インターフェロン−β、およびインターフェロン−γなどのようなインターフェロンをコード化する遺伝子；ＩＬ−１，ＩＬ−２、およびインターロイキン２から１４までのようなインターロイキンをコード化する遺伝子；ＧＭ−ＣＳＦをコード化する遺伝子；アデノシンデアミナーゼつまりＡＤＡをコード化する遺伝子；リンパ球の成長因子であるリンホカインなどの細胞成長因子をコード化する遺伝子；表皮成長因子（ＥＧＦ）およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）をコード化する遺伝子；溶解性ＣＤ４をコード化する遺伝子；因子VIII；因子IX；シトクロームｂ；グルコセレブロシダーゼ；Ｔ細胞レセプター：ＬＤＬレセプター，コレステロール移送および代謝に含まれるＡｐｏＥ，ＡｐｏＣ，ＡｐｏＡＩおよびその他の遺伝子；アルファ１抗トリプシン（α１ＡＴ）遺伝子；インシュリン遺伝子；ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子；ＣＦＴＲ遺伝子；ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、例えば単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子など、サイトメガロウイルスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、および水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子などのような負の選択マーカー、あるいは「自殺」遺伝子；抗体の抗原結合領域，Ｂ型肝炎あるいは非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの複製を阻害するアンチセンス配列などのようなウイルスの複製を阻害するアンチセンス配列などのＦｃレセプター；アンチセンスｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチド；また必ずしもそれに限定されないがマンガン・スーパーオキシドジムスターゼ（Ｍｎ−ＳＯＤ），カタラーゼ，銅亜鉛スーパーオキシドジムスターゼ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ），細胞外スーパーオキシドジムスターゼ（ＥＣ−ＳＯＤ）、およびグルタチオンレダクターゼなどのような抗酸化剤；組織プラスミノーゲン活性因子（ｔｐＡ）；尿プラスミノーゲン活性因子（ウロキナーゼ）；ヒルジン；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子；酸化窒素シンターゼ；血管活性ペプチド；脈管形成ペプチド；ドーパミン遺伝子；ジストロフィン遺伝子；β−グロビン遺伝子；α−グロビン遺伝子；ＨｂＡ遺伝子；ｒａｓ，ｓｒｃ、およびｂｃ１遺伝子などのプロトオンコジーン；ｐ５３およびＲｂなどの腫瘍サプレッサー遺伝子；ＬＤＬレセプター；乳癌，卵巣癌，胃癌および子宮内膜癌などを治療するヘレグリン−αタンパク質遺伝子；Ｔ細胞抗原レセプターのβ鎖に含まれるエピトープに特異的なモノクローナル抗体；多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子；リボザイムをコード化するポリヌクレオチド；アンチセンスポリヌクレオチド；アンギオテンシン転換酵素の、導管平滑筋カルシウムチャネルの、あるいはアドレナリンレセプターの競合的阻害剤として作用する分泌ペプチドをコード化する遺伝子、および中枢神経系内のアミロイドプラークを分解する酵素をコード化するポリヌクレオチドを含む。しかしこの発明の範囲はいずれか特定の治療薬に限定されるものではないことは理解されねばならない。治療薬をコード化するポリヌクレオチドは適切なプロモーターの制御下にある。使用されるプロモーターは必ずしもそれに限定されないが、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ヒストンプロモーター；ｐｏｌII Iプロモーター，βアクチンプロモーター；ＭＭＴＶプロモーター，メタロチオネインプロモーターなどの誘導プロモーター；熱ショックプロモーター；アデノウイルスプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；Ｂ１９パルボウイルスプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純性ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ；ヒト成長ホルモンプロモーター、およびＭｘＩＦＮ誘発プロモーターを含む。このプロモーターは更に治療薬をコード化するポリヌクレオチドを制御する天然プロモーターでもあり得る。しかしこの発明の範囲は特定の外部遺伝子あるいはプロモーターに限定されるものではないことは理解されねばならない。も一つの実施例において、レトロウイルスベクターは、ヒト血清による溶解に耐性である細胞系に野生型レトロウイルスを導入し、耐性レトロウイルスベクターを細胞系から回収することにより生産される。一つの実施例において、レトロウイルスはラウス肉腫ウイルス，ＲＤ１１４，ＢａＥＶ，ＳＳＡＶ，ＦｅＬＶ− Ｂ，ＧＡＬＶ，トリ白血症ウイルス、およびマウス白血病ウイルス、例えば必ずしもそれに限定されないが、菌株４０７０Ａおよび１５０４を含むモロニーマウス白血病ウイルスあるいは両種性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−Ａ）などよりなるグループから選択される。望ましくは、細胞系はＨＯＳ，ＴＥ６７１，ＨＴ１０８０，Ｍｖ−１−Ｌｕ，ヒト２９３細胞、あるいはそれらのものから誘導される細胞系よりなるグループから選択される。一つの望ましい実施例において、レトロウイルスはＭＬＶ− Ａであり、また細胞系はＨＯＳ細胞系である。レトロウイルスベクターが前記のレトロウイルスを前記の細胞系に導入することにより生産される場合、前記のレトロウイルス／細胞系の組合せにより生産される生成レトロウイルスベクターがヒト血清で見出されるヒト補体タンパク質による不活性化に耐性であることを出願人は発見した。選択肢として、レトロウイルスベクターは、ヒト血清による溶解に耐性であるプレパッケージング細胞（すなわちｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む細胞）に、レトロウイルスｅｎｖタンパク質のような包膜タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含むプラスミドベクター；および５′ＬＴＲならびに３′ＬＴＲ，パッケージングシグナル、および対象となるタンパク質あるいはポリペプチドをコード化する少なくとも１個のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスプラスミドベクターを導入することにより生産することができる。ｇａｇおよびｐｏｌレトロウイルスタンパク質は必ずしもそれに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス，ラウス肉腫ウイルス，ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４，ＢａＥＶ，テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、サル肉腫関連性ウイルスＳＳＡＶ，ＦｅＬＶ−Ｂ，ヒト免疫不全ウイルス，ＮＺＢウイルス、およびトリ白血症ウイルスを含むいずれかのレトロウイルスから得ることができる。選択肢として、ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質は修飾されあるいはキメラｇａｇ／ｐｏｌ構築物であり得る。包膜は必ずしもそれに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス，両種性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−Ａ），ラウス肉腫ウイルス，ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４，ＢａＥＶ，テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ），ＳＳＡＶ，ＦｅＬＶ−Ｂ，ヒト免疫不全ウイルス，ＮＺＢウイルス、およびトリ白血症ウイルスを含むいずれかのレトロウイルスから得られる。包膜はまた両種性およびエコトロピック部分を含む包膜である。選択肢として、ｅｎｖタンパク質は修飾されあるいはキメラｅｎｖ構築物でありもしくは水泡性口内炎およびＨＶＪウイルスなどのような非レトロウイルスから得られる。かくしてこの発明のも一つの見地に従って、ヒト血清による不活性化に耐性のレトロウイルスベクターが提供されるが、これはヒト血清による溶解に耐性であるプレパッケージング細胞系に、包膜タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含むプラスミドベクターを導入することにより生産された。このプラスミドベクターはレトロウイルスから得られるがレトロウイルスはモロニーマウス白血病ウイルス，ラウス肉腫ウイルス，ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４，ＢａＥＶ，ＳＳＡＶ，ＦｅＬＶ−Ｂ，テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ），両種性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−Ａ），ヒト免疫不全ウイルス，ＮＺＢウイルス，トリ白血症ウイルスから選択されるものを含む。レトロウイルスベクターはまたプレパッケージング細胞系に、両種性およびエコトロピック部分を含み、あるいは水泡性口内炎ウイルスあるいはＨＶＪウイルスなどの非レトロウイルスから得られる、もしくは修飾されもしくはキメラｅｖｎ構築物である包膜を導入することにより生産され、また５′ＬＴＲ，３′ＬＴＲ，パッケージングシグナル、及び対象となるタンパク質あるいはポリペプチドをコード化する少なくとも１個のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスプラスミドベクターを導入することにより生産された。更にこの発明のも一つの見地に従って、前記の包膜タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含むヒト血清による不活性化に耐性のレトロウイルスベクターを生成するためのパッケージング細胞系が提供される。望ましくはパッケージング細胞系は、ｇａｇおよびｐｏｌレトロウイルスタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む一次プラスミドベクター、および前記の包膜タンパク質をコード化する二次プラスミドベクターを含む。このパッケージング細胞系はヒト血清による溶解に耐性である。代替的実施例において、パッケージング細胞系は望ましいｇａｇ，ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含む単一プラスミドを補体耐性細胞に導入することにより構築することができる。前記の通り、ｇａｇおよびｐｏｌレトロウイルスタンパク質をコード化するポリヌクレオチドはいずれかのレトロウイルスから得ることができるが、このレトロウイルスは必ずしもそれに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス，両種性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−Ａ），ラウス肉腫ウイルス，ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４，ＢａＥＶ，テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ），ＳＳＡＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ，ＮＺＢウイルス、およびトリ白血症ウイルスを含む。選択肢として、ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質は修飾され、あるいはキメラｇａｇ／ｐｏｌ構築物である。一般に、ｇａｇおよびｐｏｌレトロウイルスタンパク質をコード化するポリヌクレオチドは、適切なプラスミドベクターに含まれる。一つの実施例において、ｇａｇおよびｐｏｌレトロウイルスタンパク質はモロニーマウス白血病ウイルスから得ることができ、デイノス、他、アメリカ合衆国科学アカデミー紀要、８５巻、６４６０−６４６４ページ（１９８８年）に記載されているように、ｐＣＲＩＰｅｎｖ−で知られるプラスミドに含まれる。も一つのプラスミドベクターはいずれかのレトロウイルスあるいは非レトロウイルスから得られる包膜タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含み、このレトロウイルスは必ずしもそれに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス，ラウス肉腫ウイルス，ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４，ＢａＥＶ，ＳＳＡＶ，ＦｅＬＶ−Ｂ，テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ），両種性マウス白血病ウイルス（ＭＬＡ−Ａ），ヒト免疫不全ウイルス，ＮＺＢウイルス、およびトリ白血症ウイルスであり、また非レトロウイルスは水泡性口内炎ウイルスおよびＨＶＪウイルス、あるいは修飾もしくはキメラｅｎｖ構築物である。一つの選択肢として、包膜タンパク質は両種性およびエコトロピック部分を含む。ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコード化するプラスミドベクター、およびｅｎｖタンパク質ならびに前記のレトロウイルスプラスミドベクターは次いで一つの細胞に形質移入され、この細胞はヒト血清溶解に耐性でありヒト血清による不活性化に耐性のレトロウイルス粒子を生成する無ヘルパーパッケージング細部系を提供しそれは例えば前記記載の一つの包膜タンパク質などのようなｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を含み、この包膜タンパク質はいずれかのレトロウイルスあるいは非レトロウイルスから得ることができる。そのレトロウイルスは必ずしもそれに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス，ラウス肉腫ウイルス，ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４，ＢａＥＶ，ＳＳＡＶ，ＦｅＬＶ− Ｂ，テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ），両種性マウス白血病ウイルス（ＭＬＡ−Ａ），ヒト免疫不全ウイルス，ＮＺＢウイルス、およびトリ白血症ウイルスを含み、あるいは非レトロウイルスは水泡性口内炎ウイルスおよびＨＶＪウイルスを含み、もしくは修飾あるいはキメラ構築物、あるいは両種性およびエコトロピック部分を含む包膜から包膜タンパク質を得ることができる。このような細胞系は更に前記記載のものを含む治療薬のような対象となるタンパク質あるいはポリペプチドをコード化する少なくとも１個のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスプラスミドベクターを含む。かくしてこのパッケージング細胞系は、治療薬をコード化する少なくとも１個のポリヌクレオチドをも含むヒト血清による不活性化に耐性であるレトロウイルスベクターを生成する生産者細胞系になる。このようなレトロウイルスベクター粒子は前記のもののような遺伝子治療方法で使用することができ、ヒト宿主に前記のもののような用量で投与することができる。望ましい実施例において、レトロウイルスベクターはヒト２９３細胞系あるいはヒト２９３細部系から誘導される細胞系である細胞系から生産される。驚いたことに、レトロウイルスベクターがヒト２９３細胞系あるいはヒト２９３細胞系から誘導される細胞系から生産される時、このようなレトロウイルスベクターがヒト血清による補体不活性化に耐性であり、またその補体耐性は包膜がたとえ両種性包膜であるにせよ使用する包膜に依存しないということを出願人は発見した。ヒト２９３細胞系およびヒト２９３細胞系から誘導される細胞系はヒト血清による溶解に耐性である。ここで使用される「ヒト２９３細胞系あるいはヒト２９３細胞系から誘導される細胞系」という用語は、ヒト２９３細胞系（ＡＴＣＣ番号、ＣＲＬ１５７３）（グラハム、他、遺伝子ウイルス学ジャーナル、３６巻、５９−７２ページ（１９７７年））、あるいは各種のｇａｇ，ｐｏｌ、およびｅｎｖタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む１個もしくはそれ以上の発現ベクター（例えばプラスミドベクター）で２９３細胞を形質移入することにより形成された細胞系を意味する。包膜は両種性包膜、エコトロピック包膜あるいはキセノトロピック包膜である。選択肢として、包膜は水泡性口内炎、あるいはＶＳＶ、もしくは以下に述べられる他のウイルスから得ることができる。この細胞はまた他のポリヌクレオチド、例えば選択的マーカーをコード化するポリヌクレオチドなどを含む。この細胞系の例は必ずしもそれに限定されないが、２９３Ｔ／１７（ＡＴＣＣ番号、ＣＣＲＬ１１２６８）；アンジュ−６５（ＡＴＣＣ番号、ＣＣＲＬ１１２６９）；ボスク２３（Ｂｏｓｃ２３）（ＣＣＲＬ１１２７０）およびＣＡＫ８、つまりビング細胞系として知られているもの（ＡＴＣＣ番号、ＣＣＲＬ１１５５４）を含む。この細胞系は更にピア、他、アメリカ科学アカデミー紀要、９０巻、８３９２−８３９６ページ（１９９３年９月）および１９９４年９月１日公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／１９４７８号にも記載されている。前記細胞系で生産された両種性包膜およびマウス白血病ウイルスベースレトロウイルスを含むレトロウイルスが、不活性化（とりわけ補体不活性化）あるいはヒト血清による溶解に耐性であるということを出願人は思いがけなく発見した。かくしてこのレトロウイルスは遺伝子治療手順において動物宿主に生体内投与をするのに適している。動物に生体内投与されるレトロウイルスベクターはヒト２９３細胞系にレトロウイルスパッケージング機能を提供することにより生産することができる。このパッケージング機能は、複製能レトロウイルスにより提供されるか、もしくはｇａｇ，ｐｏｌ、及びｅｎｖタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む１個もしくはそれ以上の発現ベクター（例えばプラスミドベクター）を含む一過性システムにより提供される。この機能はまた、２９３細胞系をｇａｇ，ｐｏｌ、およびｅｎｖタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む１個もしくはそれ以上の発現ベクター（例えばプラスミドベクター）でしっかりと形質移入することにより提供することができる。ｇａｇ，ｐｏｌ、およびｅｎｖタンパク質をコード化するポリヌクレオチドで２９３細胞を提供することに加えて、２９３細胞は更に前記の通りレトロウイルスプラスミドベクターで形質移入される。レトロウイルスプラスミドベクターは、ヒト２９３細胞系あるいはヒト２９３細胞系から誘導される細胞系であるパッケージング細胞系に形質移入され、それによりこのパッケージング細胞系はヒト血清による不活性化に耐性であるレトロウイルスベクターを生成する一つの生産者細胞系となる。ヒト２９３細胞から誘導されるパッケージング細胞系は、例えばサルウイルス４０（ＳＶ４０）巨大腫瘍抗原などのタンパク質を形質転換する形質転換により細胞系を不死化することにより生成される。選択肢として、２９３Ｔあるいは２９３Ｅなどの不死化２９３細胞系を利用することができる。一度適切な２９３細胞系が選択されると、これらの細胞を例えばモロニーマウス白血病ウイルスｇａｇ／ｐｏｌタンパク質のようなレトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコード化するプラスミド、およびヒグロマイシンのような選択的マーカーを含むプラスミドでこれらの細胞を同時形質移入する必要がある。個々のヒグロマイシン耐性クローンは分離されｇａｇタンパク質（ｐ１５，ｐ１２，ｐ３０、およびｐ１０）の存在および逆転写酵素（ＲＴ）活性を知るため選別される。決まったこととして、ｐ３０およびＲＴの最高水準を発現するクローンはプレパッケージング細胞系を示している。パッケージング細胞系を生成するためには、プレパッケージング細部系を、ｅｎｖ含有プラスミドおよび一次段階で使用されたものとは異なる選択マーカー（例えばピューロマイシン耐性等）を含むプラスミドと共に同時形質移入する必要がある。もしｅｎｖ成分が細胞に対して有毒であれば、多くの融合誘導包膜の場合がそうであるが、その時はこれを誘導プロモーターから発現する必要がある。クローンが次いで選別され、適切なパッケージング細胞系が選ばれる。このようなパッケージング細胞系は更にピア、他、１９９３年９月、あるいは１９９４年９月１日に公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／１９４７８で開示された通りに調製することができる。一つの実施例において、パッケージング細胞系はＣＡＫ８（あるいはビング）細胞系（ＡＴＣＣ番号、ＣＣＲＬ１１５５４）でこれは両種性包膜発現パッケージング系であり、このような細胞系で生成されるレトロウイルスは両種性包膜を有する。も一つの実施例において、細胞系はボスク２３（ＡＴＣＣ番号、ＣＣＲＬ１１２７０）であり、これは両種性包膜発現パッケージング系であり、このような細胞系で生成されるレトロウイルスはエコトロピック包膜を有する。更にも一つの実施例において、パッケージング細胞系は水泡性口内炎ウイルスＧ、つまりＶＳＶ−Ｇ包膜タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含み、それにより生成するレトロウイルスはそのような包膜を含む。このような包膜タンパク質はバーンズ、他、アメリカ科学アカデミー紀要、９０巻、８０３３−８０３７ページ（１９９３年）に更に記述されている。ウイルス包膜をコード化し、パッケージング細胞系に含まれる他のポリヌクレオチドは、必ずしもそれに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）の包膜、ラウス肉腫ウイルス包膜、ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４包膜、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）包膜、サル肉腫関連性ウイルス（ＳＳＡＶ）包膜、両種性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−Ａ）包膜、ヒト免疫不全ウイルス包膜、トリ白血症ウイルス包膜、内因性キセノトロピックＮＺＢウイルス包膜、また必ずしもそれに限定されないがＨＶＪウイルス包膜などのパラミクソウイルス科の包膜などをコード化するポリヌクレオチドを含む（モリシタ、他、アメリカ科学アカデミー紀要、９０巻、８４７４ −８４７８ページ（１９９３年））。ポリヌクレオチドは更に修飾あるいはキメラ包膜をコード化する。かくしてこの発明のも一つの見地に従って、補体耐性レトロウイルスベクターが提供され、これはＨＯＳ，ＴＥ６７１，ＨＴ１０８０，Ｍｖ−１−Ｌｕ、およびヒト２９３細胞系よりなるグループから選択される細胞系、あるいはＨＯＳ，ＴＥ６７１，ＨＴ１０８０，Ｍｖ−１−Ｌｕ、およびヒト２９３細胞系から誘導される細胞系よりなるグループから選択される細胞系から生産され、それはＶＳＶ−Ｇ包膜タンパク質，モロニーマウス白血病ウイルス包膜，ラウス肉腫ウイルス包膜，ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４包膜，テナガザル白血病ウイルス包膜，ヒヒ内因性ウイルス包膜，サル肉腫関連性ウイルス包膜，両種性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−Ａ）包膜，ヒト免疫不全ウイルス包膜，トリ白血症ウイルス包膜，ＮＺＢウイルス包膜、およびＨＶＪウイルス包膜よりなるグループから選択される包膜を含む。加えてレトロウイルスの包膜は、レトロウイルスが「標的化」されるように修飾される。すなわちレトロウイルス包膜は、望ましい標的細胞上のレセプターと結合するタンパク質あるいはポリペプチドを含む。このような標的細胞は必ずしもそれに限定されないが、血球を含む一次細胞を含み、有核血球並びに始原細胞およびその前駆体のすべての形態のものを含む一次細胞，肝細胞，上皮細胞，リンパ球、および悪性および非悪性腫瘍を含む腫瘍細胞を含む。レトロウイルスベクターは動物に治療効果を生むのに有効な量で生体内で動物に投与される。動物はヒトおよび非ヒト霊長類を含む哺乳類である。レトロウイルスベクターは全身に、例えば静脈内あるいは動脈内もしくは腹腔内で投与される。ベクターは更に皮下あるいは筋肉内で投与される。ヒト血清による不活性化に耐性であるレトロウイルスベクターは細胞を生体内で形質導入し、これにより形質導入細胞は生体内で治療薬を発現する。レトロウイルスベクターは動物に治療効果を生み出すのに有効な量で動物に投与される。一般にレトロウイルスベクターは、少なくとも１０⁵ｃｆｕの量で投与され、また一般にその量は１０¹²ｃｆｕを越えるものではない。望ましくは、レトロウイルスベクターは約１０⁶ｃｆｕから約１０¹⁰ｃｆｕの量で投与される。投与されるべき正確な用量は、年令，身長，体重、および治療される性，治療される疾患、およびその発病度を含む各種因子に依存する。レトロウイルスベクターは、薬理許容担体、例えば食塩水などで患者に投与される。他の薬理担体は、必ずしもそれに限定されないが、鉱油，ミョウバン、およびリポソームなどの脂質小胞である。適切な薬理担体の選択はここに含まれる教訓から当業者の範囲内にあるものと見做される。一つの実施例において、生体内で形質導入される真核細胞は一次ヒト細胞である。治療薬をコード化する遺伝子は臨床的な有用性を有するいずれかの遺伝子、例えば治療遺伝子あるいはマーカー遺伝子であってよい。望ましくは一次ヒト細胞は血球である。ここで使用される「血球」という用語はすべての形態の有核血球並びに始原細胞およびその前駆体を含むことを意味する。血球により運ばれる遺伝子は血球の治療効果を直接高めるいずれかの遺伝子であってもよい。血球により運ばれる遺伝子は血友病の治療に有用な凝固因子（例えば第VIII因子あるいは第IX因子）をコード化する遺伝子のような通常は持っていない治療効果を血球が可能にするいずれかの遺伝子であってもよい。この遺伝子は治療効果を持つ１個もしくはそれ以上の産物をコード化できる。適切な遺伝子の例は、ＴＮＦ，インターロイキン（インターロイキン１−１２），インターフェロン（α，β，γ−インターフェロン），Ｔ細胞レセプタータンパク質および抗体と結合するＦｃレセプターなどのサイトカインをコード化する遺伝子である。レトロウイルスベクターは必ずしもそれに限定されないが、アデノシンデアミナーゼ欠損症，鎌型赤血球貧血症，地中海貧血症，血友病，糖尿病，α抗トリプシン欠損症、アルツハイマー病などの脳疾患，成長疾患および心臓病などの他の疾病、例えばコレステロールが代謝されるような変更および免疫システムの欠陥により起きる疾病などを含む各種の疾病の治療に有用である。一つの実施例において、レトロウイルスベクターは負の選択マーカーを含む。負の選択マーカーは例えばウイルスチミジンキナーゼであり、より詳細には単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である。このレトロウイルスベクターは生体内でヒト患者にある腫瘍細胞（とりわけ癌細胞）に投与される。レトロウイルスベクターが腫瘍細胞を形質導入した後に、患者はガンシクロビルあるいはアシクロビルなどの相互作用薬を与えられ、この作用薬はすべての複製細胞（すなわち腫瘍細胞）を殺すために負の選択マーカーにより発現されるタンパク質と相互作用し、複製細胞は負の選択マーカーを含むレトロウイルスベクターで形質導入された。前記記載のレトロウイルスベクターは更に遺伝子治療の有効性を決定するために動物モデルに投与される。例えば、ヒト血清による溶解に耐性である細胞系で生産され、治療薬をコード化する一つのポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターは同じ種の動物に異なった量で投与される。動物における遺伝子治療の有効性を決定することから、ヒト患者に投与されるレトロウイルスベクターの有効量が決定される。も一つの実施例において、ヒト血清による溶解に耐性であり、前記のようなレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入され、治療薬をコード化する１個もしくはそれ以上のポリヌクレオチドを含み、それによりその細胞が生産者細胞になる細胞が、生体内で患者に投与され、これにより生産者細胞は治療薬をコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクター粒子を生体内で生成する。このような実施例は例えば脳腫瘍および頭並びに頸部腫瘍などの（悪性および良性腫瘍を含む）腫瘍の治療にとりわけ適している。例えば生産者細胞は負の選択マーカーを含むレトロウイルスプラスミドベクターを含む。次いで生産者細胞は腫瘍に投与され、それにより生産者細胞は負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクター粒子を生成する。生産者細胞により生成されるレトロウイルスベクター粒子は腫瘍細胞を形質導入し、これにより腫瘍細胞は負の選択マーカーを生産する。相互作用薬の患者への投与により、形質導入腫瘍細胞は殺される。選択肢として、レトロウイルスベクターは試験管内で真核細胞を形質導入し、これにより真核細胞は治療薬の試験管内生産に関し試験管内で培養され、あるいは選択肢として、形質導入真核細胞は遺伝子治療手順の一部として宿主に投与され、これにより形質導入真核細胞は宿主内生体内で治療薬を発現する。この発明のも一つの見地に従って、生成するレトロウイルスベクターが生産される細胞系にレトロウイルスを導入することよりなるヒト血清による不活性化に耐性であるレトロウイルスベクターを識別する方法が提供される。ヒト血清による不活性化に対して生成するレトロウイルスベクターの耐性が次いで決定される。ヒト血清による不活性化に対する生成レトロウイルスベクターの耐性の決定は以下の実施例に記載される方法を用いて行われる。この発明のも一つの見地に従って、ヒト血清による不活性化に耐性のレトロウイルスベクターを生産する方法が提供される。この方法はヒト血清による溶解に対する細胞の耐性を決定することよりなる。ヒト血清による溶解に対する細胞の耐性は以下に記述されているもののような方法により決定される。レトロウイルスベクターは次いでヒト血清による溶解に耐性であるこれらの細胞から生産される。実施例この発明は今や下記の実施例に関連して記述されるが、しかしこの発明の範囲はそれに限定されるものではない。実施例１マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号、ＣＲＬ１６５８）が新生子ウシ血清１０％で補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養された。ミンクＭＶ−１−Ｌｕ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６５８４）は胎仔ウシ血清１０％の入ったＤＭＥＭで培養された。ＭＦＧｎ１ｓｌａｃＺゲノム（フェリー、他、アメリカ科学アカデミー紀要、８８巻、８３７７−８３８１ページ（１９９１年））がＮＩＨ３Ｔ３に導入され、（マウス白血病ウイルスＡに含まれる）ｌａｃＺでの感染によりＭｖ−１− Ｌｕ細胞が、テイラー、他、ウイルス学ジャーナル、６７巻、６７３７−６７４１ページ（１９９３年）に記載されているようにΨＣＲＩＰパッケージング系含有ＭＦＧｎ１ｓｌａｃＺゲノムから生産された。ＭＦＧｎ１ｓｌａｃＺは５′ＬＴＲ，３′ＬＴＲ，パッケージングシグナル、およびｌａｃＺ遺伝子を含むモロニーマウス白血病ウイルスベースレトロウイルスベクターである。希釈を制限する細胞クローニングの後、予備救急実験で高力価のｌａｃＺプソイドタイプを与えるクローンが選別された。ヘルパーウイルスを含有するｌａｃＺプソイドタイプはこれらの細胞クローンを複製能のＭＬＶ−Ａ１５０４菌種で感染させることにより生産された（ラシード、他、ウイルス学ジャーナル、１９巻、１３−１８ページ（１９７６年）；サマフェルト、他、ウイルス学、１７６巻、５８−６９ページ（１９９０年）；テイラー、他、（１９９３年））。ウイルスは無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（イギリス国、ジブコ）で収穫された。収穫の１日前に細胞は１回Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄され、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで３７℃、１時間保温された。培地は次いで新鮮Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで置換され、細胞は一晩培養された。培養上澄みは収穫され、０．４５μｍフィルターで濾過され、アリコートされ、ウイルス貯蔵物として使用まで−７０℃で貯蔵された。すべてのウイルス貯蔵物は適切な検定細胞に関して２ ×１０⁴から４×１０⁶までにわたるもとのｌａｃＺ力価を有していた。ヒト血清は正常な患者から収穫され、アリコートされ、使用まで−７０℃で凍結された。この血清の一部は５６℃で１時間熱不活性化された。４０μｌのウイルス貯蔵物が等量の新鮮ヒト血清あるいは熱不活性化ヒト血清とｐＨ７、ヘペス緩衝液２０ｍＭで混合され、３７℃で１時間培養された。培養の後、ウイルス血清混合物は連続的に１：１３から１：１，３００までポリブレン８μｇ／ｍｌを加えたＤＭＥＭ／ＦＣＳ１０％で希釈され、２４ウエルプレートでＴＥ６７１上に平板培養された。検定細胞は感染１日前に２４ウエルプレートに５×１０⁴細胞／ウエルで播種された。感染４時間後ウイルスは除去され、細胞は成長培地で培養された。感染２日後細胞は原位置Ｘ−ｇａｌで染色され、ｌａｃＺ正のコロニーが記述通りに計数された（テイラー、他、１９９３年）。新鮮（Ｆ）および熱不活性化（ＨＩ）血清処置の相対力価（％）が図１Ａで示される。図示の通り、図１ＡでＮＩＨ３Ｔ３細胞からのｌａｃＺ（ＭＬＶ−Ａ）が３Ｔ３Ａとして示され、Ｍｖ−１−Ｌｕ細胞からのｌａｃＺ（ＭＬＶ−Ａ）はミンクＡとして示される。図１Ａで示されるように、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞から生産されたウイルスは急速に不活性化された。ヒト血清への露出５分間でウイルス力価は３−ｌｏｇ以上減少した。Ｍｖ−１−Ｌｕ細胞から生産されたウイルスも不活性化された。ヒト血清への露出１時間後ウイルス力価は２−ｌｏｇ減少した。も一つの実験において、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびミンクＭｖ−１−Ｌｕ細胞は前記の通り培養された。ＭＦＧｎ１ｓｌａｃＺゲノムはＮＩＨ３Ｔ３およびＭｖ−１−Ｌｕ細胞に導入され次いでｌａｃＺプソイドタイプの高力価のクローンが前記の通り選別された。ヘルパーウイルスを含むｌａｃＺ（ＲＤ１１４）が全長プロウイルスＤＮＡ（ｓｃ３ｃ、エス．オブライアン博士により提供され、リーブス、他、ウイルス学ジャーナル、５２巻、１６４−１７１ページ（１９８４年）に詳細に記載されたもの）を用いる形質移入によりＭＦＧｎ１ｓｌａｃＺゲノムを用いてＮＩＨ３Ｔ３から獲得された。高力価のｌａｃＺプソイドタイプを与える細胞クローンが選択された。ヘルパー細胞を含むｌａｃＺプソイドタイプは前記の通り複製能ＲＤ１１４ウイルスを用いてＭＦＧｎ１ｓｌａｃＺを含有するＭｖ−１−Ｌｕ細胞の感染により生産された（テイラー、他、１９９３年）。このウイルスはＯｐｔｉ−ＭＥＭで収穫され、０．４５μｍフィルターを通して濾過され、使用まで−７０℃で凍結された。すべてのウイルス貯蔵物は適切な検定細胞上に２×１０⁴から４×１０⁶までにわたるもとのｌａｃＺ力価を有していた。ウイルス貯蔵物は前記の通り等量の新鮮ヒト血清あるいは加熱不活性化ヒト血清と混合され、前記の通り培養された。ウイルス血清混合物は次いで前記の通りＴＥ６７１細胞上で平板培養され、ウイルスが次いで除去され、細胞は前記の通り成長培地で培養された。細胞は次いで原位置Ｘ−ｇａｌで染色され、ｌａｃＺ正のコロニーが前記の通り計数された。新鮮（Ｆ）熱不活性化（ＨＩ）血清処置に対する相対力価（％）が図１Ｂで示される。図１Ｂで示されるように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞から得られるｌａｃＺ（ＲＤ１１４）は３Ｔ３ＲＤで示され、ミンクＭｖ−１−Ｌｕ細胞から得られるｌａｃＺ（ＲＤ１１４）はミンクＲＤで示される。図１Ｂで示されるように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞から生産されたｌａｃＺ（ＲＤ１１４）の力価は正常ヒト血清に露出すると５分以内で２−ｌｏｇ減少したが、一方Ｍｖ−１−Ｌｕ細胞から生産されたｌａｃＺ（ＲＤ１１４）はヒト血清への１時間の露出に対して耐性であった。図１Ａおよび１Ｂで示されるように、ウイルス不活性化に責任のあるヒト血清の活性は不安定であった。図１Ａおよび１Ｂに示される結果はＭｖ−１−Ｌｕにより生産されるウイルスがＮＩＨ３Ｔ３細胞により生産されるウイルスよりもより耐性であることを示している。実施例２異なった細胞系から生産されるウイルスのヒト血清に対する感受性マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＰＧ１３（ミラー、他、ウイルス学ジャーナル、６５巻、２２２０−２２２４ページ（１９９１年）ＡＴＣＣ番号１０６８６）、ＧＰ＋ＥＡＭ１２（マーコヴィッツ、他、ウイルス学、１６７巻、４００−４０６ページ（１９８８年））、およびＧＰ＋Ｅ８６（マーコヴィッツ、他、ウイルス学ジャーナル、８２巻、１１２０−１１２４ページ（１９８８年））パッケージング細胞系が新生子ウシ血清１０％で補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養された。ミンクＭｖ−１−Ｌｕ，イヌＣｆ２Ｔｈｓ＋Ｌ−（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１４３０），ヒトＨＯＳ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５４３）、およびヒトＴＥ６７１細胞（サマフェルト、他、１９９０年；テイラー、他、１９９３年、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ８８０５）が胎仔ウシ血清１０％で補充されたＤＭＥＭで培養された。ＭＦＧｎ１ｓｌａｃＺゲノムが、テイラー、他、１９９３年に記載された通り、ΨＣＲＩＰパッケージング細胞系（ディノス、他、１９８８年）から生産された（ＭＬＶ−Ａに含まれる）ｌａｃＺによる感染によりＮＩＨ３Ｔ３，Ｍｖ− １−Ｌｕ，Ｃｆ２Ｔｈｓ＋Ｌ−，ＨＯＳ、およびＴＥ６７１細胞に導入された。希釈を制限する細胞クローニングの後、予備救急実験で高力価のｌａｃＺプソイドタイプを持つクローンが選別された。ヘルパーウイルスを含有するｌａｃプソイドタイプはこれらの細胞クローンを複製能ＭＬＶ−Ａ１５０４菌種，ＭＬＶ− ＸＮＺＢ，ＲＤ１１４，ＢａＥＶＭ７，ＳＳＡＶ，ＧＡＬＶ−ＳＦ、およびＦｅＬＶ−Ｂでテイラー、他、１９９３年記載の通り感染させることにより生産された。ウイルスは無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭあるいはＤＭＥＭ／胎仔ウシ血清で収穫され、０．４５μｍフィルターを通して濾過され、使用まで−７０℃で凍結された。ｌａｃＺ（ＲＤ１１４）は全長プロウイルスＤＮＡ（ｓｃ３ｃ、エス．オブライエン博士により提供され、更にリーブス、他、ウイルス学ジャーナル、５２巻、１６４−１７１ページ（１９８４年）に記載されたもの）での形質移入によりＮＩＨ３Ｔ３細胞から得られた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞からの無ヘルパープソイドタイプは、（ＭＬＶ−Ａに含まれる）無ヘルパーｌａｃＺでの形質導入あるいはＭＦＧｎ１ｓｌａｃＺの形質移入のいずれかにより、ＰＧ１３，ＧＰ＋ＥＡＭ１２、およびＧＰ＋Ｅ８６パッケージング細胞系から得られた。Ｍｖ−１−Ｌｕ細胞からの無ヘルパープソイドタイプは、ＭＦＧｎ１ｓｌａｃＺを含有するＭｖ−１−Ｌｕ細胞を、ＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびＭＬＶ−Ｅ，ＭＬＶ−Ａ、あるいはＲＤ１１４包膜遺伝子をコード化する個別の発現プラスミドで形質移入することにより得られた。すべてのウイルス貯蔵物は適切な検定細胞上で２×１０⁴から４× １０⁶までにわたるもとのｌａｃＺ力価を有していた。ヒト血清は次いで正常な個体から収穫され、アリコートされ、使用まで−７０ ℃で凍結された。血清の一部は５６℃、１時間熱不活性化された。ウイルス希釈液４０μｌがｐＨ７、ヘペス緩衝液２０ｍＭ内で新鮮ヒト血清あるいは熱不活性化ヒト血清等量、およびウイルス収穫物からの胎仔ウシ血清２％以下と混合され、３７℃、１時間培養された。培養の後、ウイルス血清混合物はポリブレン８μｇ／ｍｌとともにＤＭＥＭ１ｍｌで希釈され、２４ウエルプレートで検定細胞上で平板培養された。ＭＬＶ−ＥはＮＩＨ３Ｔ３細胞上で検定された。ＭＬＶ−Ａ，ＭＬＶ−Ｘ（レヴィ、サイエンス、１８２巻、１１５１−１１５３ページ（１９７３年）），ＢａＥＶ（ベンヴェニスト、他、ネイチャー、２４８巻、１７−２０ページ（１９７４年））、およびＲＤ１１４（マカリスター、他、ネイチャー・ニュー・バイオロジー、２３５巻、３−６ページ（１９７２年））はＭｖ−１−ＬｕあるいはＴＥ６７１細胞で検定され、ＧＡＬＶ（カワカミ、他、ネイチャー・ニュー・バイオロジー、２３５巻、１７０−１７１ページ（１９７２年）），ＳＳＡＶ（ティーレン、他、全米癌協会ジャーナル、４７巻、８８１−８８９ページ（１９７１年））、およびＦｅＬＶ−Ｂ（ジャレット、他、遺伝子ウイルス学ジャーナル、２０巻、１６９−１７５ページ（１９７３年））はＴＥ６７１細胞で検定された。検定細胞は感染の前日２４ウエルで５×１０⁴細胞／ウエルで播種された。感染の４時間後、ウイルスは除去され、細胞は成長培地で培養された。感染の２日後細胞は原位置Ｘ−ｇａｌで染色されｌａｃＺ正のコロニーはテイラー、他、１９９３年に記載されている通りに計数された。新鮮熱不活性化ヒト血清処置対胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）処置の相対力価（％）が図２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，２Ｄおよび２Ｅで示される。図２ＡはマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞，ＰＧ１３細胞，ＧＰ＋Ｅ８６細胞あるいはＧＰ＋Ａｍ１２細胞から生成されたウイルスに対するウイルス力価を示している。図２ＢはイヌＣｆ２ＴｈＳ＋Ｌ−細胞から生成されたウイルスに対するウイルス力価を示している。図２ＣはミンクＭｖ−１−Ｌｕ細胞から生成されたウイルスに対するウイルス力価を示している。図２ＤはヒトＨＯＳ細胞から生成されたウイルスに対するウイルス力価を示し、また図２ＥはヒトＴＥ６７１細胞から生成されたウイルスに対するウイルス力価を示している。図２Ａで示されるように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、並びにＧＰ８６，ＰＧ１３、およびＧＰ＋Ａｍ１２細胞から生産されたレトロウイルスは、新鮮ヒト血清による不活性化に感受性であった。加えてイヌ細胞系Ｃｆ２ＴｈＳ＋Ｌ−により生産されたウイルスすべてはヒト血清による不活性化に感受性であった（図２Ｂ）。しかし図３Ｃで示されるように、Ｍｖ−１−Ｌｕ細胞で生産された２個のマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−ＡおよびＭＬＶ−Ｘ）はヒト血清に対し感受性であったが、ＲＤ１１４，ＢａＥＶ、およびＧＡＬＶウイルスはヒト血清による不活性化には耐性であった。ＭＬＶ−ＸはＨＯＳあるいはＴＥ６７１細胞で生産された時、ヒト血清による不活性化に感受性であることが発見された（図２Ｄおよび２Ｅ）。ＭＬＶ−ＡはＨＯＳ細胞により生産された時、補体不活性化に耐性であることが発見された。ＲＤ１１４およびＢａＥＶはこれらの細胞系で生産された時耐性であることが発見された。ＧＡＬＶおよびＦｅＬｖ−Ｂはこれらの細胞系により生産された時部分的に耐性であり、またＧＡＬＶと密接に関連するＳＳＡＶ（デラッサス、他、ウイルス学、１７３巻、２０５−２１３ページ（１９８９年））は耐性であった。ＲＤウイルス遺伝子産物がヒト血清に対する耐性を与えられたかを決定するために、前記記載されたようにＭＬＶｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をＭＬＶあるいはＲＤ１１４ｅｎｖ遺伝子と組合せて発現することによりＭｖ−１−Ｌｕ細胞から組換えビリオンが生産された。無ヘルパープソイドタイプは、ＭＦＧｎ１ｓｌａｃＺ／Ｍｖ−１−Ｌｕ細胞を、ＭＬＶｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子、およびＭＬＶ −Ａ，ＭＬＶ−Ｅ、あるいはＲＤ１１４ｅｎｖ遺伝子をコード化する個別の発現プラスミドで形質移入することにより得られた。ｇａｇ／ｐｏｌプラスミドはディノス、他、１９８８年に記載されたｐＣＲＩＰｅｎｖ−であった。ＭＬＶ−Ａ，ＭＬＶ−Ｅ、あるいはＲＤ１１４ｅｎｖ遺伝子を発現するプラスミドは、ＭＬＶ−Ａ，ＭＬＶ −Ｅ、あるいはＲＤ１１４ｅｎｖ遺伝子をＦＢ２９ＬＴＲプロモーターの下流に挿入することにより、ハード、他、ウイルス学ジャーナル、６５巻、４０２６− ４０３２ページ（１９９０年）に記載されたＦＢ３から誘導された。下記の表１に示されたＭＬＶ−Ａウイルス、菌種４０７０Ａはディノス、他、１９８８年に記載されている。下記表１に示されるように、ＲＤ１１４包膜を持つビリオンは、３個の新鮮ヒト血清サンプルでの１時間処置に対して耐性であったが、一方両種性あるいはエコトロピックＭＬＶ包膜を持つものはより感受性であった。これは包膜配列が補体活性化を誘導するウイルスタンパク質としてのｐ１５Ｅの役割と一致して感受性を制御できるということを示している（バーソロミュー、他、１９７８年）。実施例３ＭＦＧｎ１ｓｌａｃＺプロウイルスを含むＮＩＨ３Ｔ３，Ｍｖ−１−Ｌｕ，Ｃｆ２ＴｈＳ＋Ｌ−，ＨＯＳ、およびＴＥ６７１細胞が、実施例１および２に記載されたように、ＭＬＶ−Ａ，ＭＬＶ−Ｘ、あるいはＲＤ１１４ウイルスで感染された。２×１０⁶未感染あるいは感染細胞は次いでＥＤＴＡで平板から除去され、洗浄され、３７℃、１時間クロム酸〔⁵¹ Ｃｒ］ナトリウム（１ｍＣｉ／ｍｌ、エイマシャム）２００μｌで再懸濁された。標識後細胞は洗浄されＦＣＳ１０％を加えたＤＭＥＭで再懸濁された。３７ ℃、３０分の培養の後、細胞は遠心分離で収集され、無血清ＤＭＥＭで洗浄され、また２×１０⁶細胞／ｍｌで無血清ＤＭＥＭで再懸濁された。細胞懸濁液５０ μｌがＶ底マイクロタイタウエル内で血清希釈液１００μｌと混合された。血清希釈液は２／３，２／９，２／２７および２／８１であった。平板は３７℃、１時間培養され、無細胞上澄みに放出されたパーセント特異的⁵¹Ｃｒが下記の式で決定された。ＮＰ４０はノニデット４０（Nonidet40、シグマ）である。この検定の結果は図３で示される。図３で示されるように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣｆ２ＴｈＳ＋Ｌ−細胞はヒト血清による溶解にきわめて感受性であった。Ｍｖ−１−Ｌｕ，ＨＯＳ、およびＴＥ６７１細胞は溶解に耐性であった。細胞のウイルス感染はその感受性に影響を与えなかった。Ｍｖ−１−ＬｕあるいはＨＯＳ細胞のＭＬＶ−ＡあるいはＭＬＶ−Ｘでの感染はそれらにヒト血清による溶解に感受性を与えなかった。ヒト血清による溶解から未感染細胞を保護することができる細胞因子は、ミンクおよびヒト細胞から生産されるビリオンに組込まれることをこれらのデータは示唆している。選択肢として、ヒト血清による細胞溶解を高める細胞因子は、マウスおよびイヌから生産されるビリオンに組み込まれる。この後者の可能性は、マウスおよびイヌ細胞で作られたレトロウイルスが主として蔗糖エピトープ、Ｇａｌ（α１−３）Ｇａｌエピトープの認識を経て天然抗体によりヒト血清で不活性化されることが発見されたという観察により支援された（タケウチ、他、未刊行データ）。感染生産者細胞の溶解に影響されないウイルス効果はまた、一定の細胞から生産されるウイルスの他と異なった感受性を制御する。実施例４実施例１および２で記述されたミンクＭｖ−１−Ｌｕ細胞，ＨＯＳ細胞、あるいはＴＥ６７１細胞から生産されたＭＬＶ−Ａ，ＭＬＶ−Ｘ、およびＲＤ１１４ウイルスは正常なヒト血清の８個のサンプル（以下ＮＨＳ−１からＮＨＳ−８として引用）で３７℃、１時間処置され、次いでウイルスはＴＥ６７１細胞で平板培養された。生存ｌａｃＺプソイドタイプの相対力価（％）およびＦＣＳ処置が図４での相対力価の平均値と一緒に示されている。図４で示されるように、Ｍｖ−１−ＬｕあるいはＨＯＳ細胞から生産されるＲＤ１１４は一般に耐性であった。ＴＥ６７１細胞で得られた結果は不活性のより変化に富むパターンを示していた。前記の結果は、不活性化に対する耐性が生産者細胞系が得られる動物の種に依存するだけでなく特定の種からの細胞系の間でも変化することを示している。実施例５ＭＬＶ−ＡおよびＲＤ１１４ウイルスが実施例１および２で記述されたようにＮＩＨ３Ｔ３細胞あるいはミンクＭｖ−１−Ｌｕ細胞から生産された。ウイルスは無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで収穫された。実施例４からの血清サンプルＮＨＳ−１，ＮＨＳ−３、およびＮＨＳ−７が１個のＣ２欠損患者、２個のＣ７欠損患者、および１個のＣ９欠損患者からの血清サンプルとともにこの実施例で使用された。すべての血清サンプルはアリコートされ、使用まで−７０℃で凍結された。一つの実施例において、サンプルＮＨＳ −７はコブラ蛇毒因子で処置され、ＮＨＳ−７のも一つの部分は１：３の希釈を受け、ＮＨＳ−７の一部分はＣ１で処置された。コブラ蛇毒因子（ＣＶＦ）処置は固相ＣＶＦで行われた。すなわちＣＶＦはセファロースＣＬ−４Ｂと結合された。血清サンプルは血清ｍｌ当りコブラ蛇毒２５μｇで一晩３７℃で処置された。コブラ蛇毒は更にフォーゲル、自然毒ハンドブック、５巻、ハ虫類および両生類毒、チュー編、マーセル・デッカー、ニューヨーク、１４７ページ（１９９１年）に記述されている。Ｃ１処置ＮＨＳ−７はＮＨＳ−７、１部をＣ１、２部（全Ｃ４枯渇を与えるように滴定されたもの）で３７℃、１時間処置することで調製された。ウイルスは実施例１および２の手順に従ってヒト血清による不活性化をテストされた。この結果は下記の表２で血清サンプル処置に対する相対力価（％）対ＦＣＳ処置として示される。表２で示されるように、Ｃ２ＤはＣ２欠損サンプルであり、Ｃ７Ｄ−１およびＣ７Ｄ−２はＣ７欠損サンプル、またＣ９ＤはＣ９欠損サンプルである。も一つの実験において、ＮＩＨ３Ｔ３あるいはミンクＭｖ−１−Ｌｕ細胞から生成されたＭＬＶ−ＡおよびＲＤ１１４ウイルスは逆転写酵素検定で血清サンプルＮＨＳ−３，ＮＨＳ−７、およびＣ７Ｄ−２による溶解をテストされた。この検定で細胞上澄み１２ｍｌが無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで密集生産者細胞から収穫され、低速遠心分離および０．４５μｍでの濾過により清澄化された。ウイルスは超遠心分離（１２，０００×ｇ、１時間、４℃）で濃縮された。ウイルスペレットは次いで冷却Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１２０μｌで懸濁され、４試験管（各３０ μｌ）にアリコートされた。０．５％トリトン３００μｌ、ＦＣＳ、およびヒト血清が加えられ、試験管は１時間３７℃で培養された。逆転写酵素検定はゴフ、他、ウイルス学ジャーナル、３８巻、２３９−２４８ページ（１９８１年）に記述された通り測定された。トリス（１Ｍ、ｐＨ８．０）５μｌ，ジチオスレイトール（０．１Ｍ）５μｌ，ＭｎＣｌ₂（０．０４Ｍ）２．５μｌ，ＫＣｌ（１Ｍ）１０μＬ，プライマー・テンプレート（ポリ（ｒＡ）１ｍｇ／ｍｌ、ｐ（ｄＴ）１２−１８、ファルマチア）１μｌ，水３１．５μｌ，³Ｈ−ＴＴＰ（〔Ｍｅ^- ³ Ｈ］トリリン酸チミジン０．１ｍＣｉ／ｍｌ、エイマシャム）およびウイルス／血清混合物２０μｌを含む逆転写酵素ミックス８０μｌが９６ウエルプレートのウエルに加えられた。２重の反応が３７℃で培養された。重合ＴＴＰが収穫機を用いて２×ＳＳＣで予備湿潤化されたＤＥ８１フィルターマットで遊離ＴＴＰから分離された。フィルターは３０秒２×ＳＳＣで洗浄され、乾燥され、各スポットが計数された。血清から放出されたパーセント特異的逆転写酵素が下記の式で評価された。この検定の結果は下記の表３で示される。表２で示される結果は、コブラ蛇毒因子あるいは補体成分Ｃ１のいずれかの追加により、正常ヒト血清からの補体の枯渇が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞あるいはＭｖ−１−Ｌｕ細胞から生産されるＭＬＶ−Ａ、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞から生産されるＲＤ１１４を不活性化する能力を欠失させる結果となったということである。かくして前に報告（ウェルシュ、他、１９７５年）された通り、ヒト血清によるＭＶＬ−ＡおよびＲＤ１１４の不活性化は補体に帰因するものであった。Ｃ１の付加は補体活性化の古典的な代謝経路を激減させる。従って前記のデータはヒト血清によるレトロウイルスの不活性化に関する古典的な代謝経路を含むことについてのこれまでの報告と一致する（クーパー、他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４４巻、９７０−９８４ページ（１９７６年））。補体の古典的代謝経路を誘発できないＣ２欠損血清もまた、表２で示されるようにＭＬＶ−ＡあるいはＲＤ１１４を不活性化することができなかった。古典的および代替的代謝経路Ｃ７およびＣ９双方に共通する補体成分２個が欠損する血清は未だウイルス不活性化に有効であった（表２）。Ｃ７およびＣ９は補体媒介溶解の最終段階に含まれ、また膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の成分である。かくして前記のデータは、Ｃ７沈着に先立つ段階がレトロウイルスの感染力を阻害するのに十分なものであったことを示す。加えて前に報告（ウェルシュ、他、１９７５年）された通り、正常なヒト血清はビリオンから逆転写酵素放出を行うことが可能であった（表３）。表２および３で示される結果は、Ｍｖ−１−Ｌｕ細胞から生産されるＭＬＶ−ＡがＲＤ１１４よりも溶解に感受性であり、またＮＩＨ３Ｔ３から生産されるウイルスはＭｖ− １−Ｌｕ細胞から生産されるウイルスよりも感受性であったことを示していた。しかしウイルス感染力を阻害するＣ７欠損血清はビリオン溶解を誘発することができなかった。前記のデータは、古典的代謝経路による補体活性化のいくつかの段階がビリオン溶解の最終段階の前にヒト血清によるレトロウイルス感染の阻害に十分であることを示している。実施例６ＭＦＧｎ１ｓｌａｃＺゲノムおよび複製能ＲＤ１１４あるいはＭＬＶ−Ａウイルスは、実施例２で記述されたようにＴＥ６７１細胞により生産されたヘルパー正のｌａｃＺプソイドタイプを用いる感染によりＨＴ１０８０細胞に導入された。感染の５日後ウイルスは実施例１に記述された通りＯｐｔｉ−ＭＥＭで収穫された。新鮮（Ｆ）あるいは熱不活性化（ＨＩ）ヒト血清サンプルＮＨＳ−１，ＮＨＳ−２、あるいはＮＨＳ−（６）の１種を用いるウイルスの不活性化が実施例２で記述された通りに検定された。その結果はヒト血清処置対ＦＣＳ処置の相対力価として以下の表４で示される。表４で示されるように、ＨＴ１０８０で生産されるＲＤ１１４ウイルスはヒト血清による不活性化に耐性であることがわかり、また一方ＨＴ１０８０細胞で生産されるＭＬＶ−Ａウイルスは新鮮ヒト血清に感受性であることが判明した。実施例７ｐＧ１Ｎａの構築プラスミドｐＧ１ＮａはプラスミドｐＧ１から誘導される。プラスミドｐＧ１はｐＬＮＳＸから構築される（パーマー、他、血液、７３巻、４３８−４４５ページ）。プラスミドｐＧ１の構築戦略は図５で示される。５′モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）ＬＴＲを含む１．６キロベースＥｃｏＲＩ断片、および３′ＬＴＲバクテリア複製起点ならびにアンピシリン耐性遺伝子を持つ３．０キロベースＥｃｏＲＩ／Ｃ１ａＩ断片が別個に分離された。７個のユニーククローニング部位を含むリンカーが、次いでＥｃｏＲＩ／Ｃ１ａＩ断片とそれ自身を閉じるために使用され、かくしてプラスミドｐＧ０を生成した。プラスミドｐＧ０は、５′ＬＴＲを含む１．６キロベースＥｃｏＲＩ断片をｐＧ０のユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入することによりベクタープラスミドｐＧ１を生成するのに使用された（図７）。かくしてｐＧ１（図７）は、ＭｏＭｕＳＶより誘導される５′部分、真正ＡＴＧ出発コドンがＴＡＧに突然変異されたｇａｇのショート部分（ベンダー、他、１９８７年）、５′から３′までのＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ，ＳｎａＢＩ，Ｓａ１Ｉ，ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＡｐａＩ、およびＣ１ａＩの部位を含む５４塩基対多重クローニング部位（ＭＣＳ）、および塩基対７７６４から７８１３（ヴァン．ビヴァレン他、コールド・スプリング・ハーバー、２巻、５６７ページ、１９８５年に記載されている数による）までのＭｏＭｕＬＶの３′部分で構成されるレトロウイルスベクターバックボーンよりなる（図６）。ＭＣＳは、ｐＧ１プラスミド，ｎｅｏ^r遺伝子，βガラクトシダーゼ遺伝子，ヒグロマイシン^r遺伝子、およびＳＶ４０プロモーターの非切断制限酵素のスクリーンを基礎として最大数のユニーク挿入部位を生成するように設計された。ベクターｐＧ１ＮａはｐＧ１およびｐＮ２から構築された（アーメンターノ、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻、１６４７−１６５０ページ（１９８７年））。ｐＧ１ＮａはｐＮ２をＥｃｏＲＩおよびＡｓｕＩＩで切断し（図８）、ｎｅｏ^R遺伝子を含むＥｃｏＲＩ／ＡｓｕＩＩ断片の末端で注入し、またｐＧ１Ｎａを形成するためにこの断片をＳｎａＢＩ消化ｐＧ１に結合することにより構築された（図９）。実施例８細胞生存能力に関するヒト血清の効果を決定するために、ヨウ化プロピジウム（propidium iodide;PI）を使用するフローサイトメトリーベースの検定がＨＯＳ細胞およびＮＩＨ３Ｔ３ＴＫ細胞について行われた。付着細胞はトリプシン消化で収穫され、最初の生存能力がトリプシンブルー排除により評価された。細胞は新鮮ヒト血清あるいは熱不活性化ヒト血清で３７℃、３０分培養され、次いでＰＢＳで２回洗浄された。ベクトン・ディキソン・ファクスキャンでの分析の直前に、ＰＩ（最終濃度０．８μｇ／ｍｌ）が加えられた。データの分析はＦＬ２（レッド）蛍光で行われ、生存細胞パーセントはＰＩ染色（死滅）および非染色（生存）細胞を最良に分離することで計数された。その結果は下記の表５で与えられる。上記の結果はＨＯＳ細胞がヒト血清に耐性であることを示している。ｐＧ１ＮａはエコトロピックＰＥ５０１細胞系（５×１０⁵細胞）にリン酸カルシウム沈殿で形質移入された。形質移入の後、ベクター上澄み１０ｍｌが５× １０⁵両種性ＰＡ３１７細胞の培養物に加えられた。ベクター上澄みのＰＡ３１７細胞への追加の後、細胞はＧ４１７の存在下で培養された。選択された細胞集団は両種性ベクターＧ１Ｎａを生成する。選択された細胞集団からの、またＧ１Ｎａを含むベクター上澄み（５−１０ｍｌ）は、ＨＯＳ細胞およびＮＩＨ３Ｔ３ＴＫ細胞を感染させるために使用された。感染の２４時間後ベクター上澄みは除去され、安定した集団が生成されるまで細胞がＧ４１８で選択された。選択されたＨＯＳ／Ｇ１ａＮａあるいはＮＩＨ３Ｔ３ＴＫ／Ｇ１Ｎａ集団がサブ密集密度でＴ２５フラスコ内で平板培養された。翌日、細胞単層はポリブレンの存在下で複製能両種性レトロウイルスである４０７０Ａで感染された。感染８時間後ウイルス上澄みは除去され、細胞には新鮮培地が再供給された。細胞が一度密集に到達すると、それは１：１０の希釈で分割された。このサイクルは更に２回繰り返され、すべての細胞が野生型ウイルスで感染することが確実に行われた。２４時間後細胞が密集に到達すると上澄みは集められた。野生型４０７０ＡおよびプソイドタイプＧ１Ｎａ双方を含むウイルス上澄みは１０分２，０００ｒｐｍで回転（４℃）され、次いで０．４５μｍフィルターを通して濾過された。濾過上澄みは小さなアリコートに分割され、急速冷凍し乾燥され、長期貯蔵のため−７０℃に移された。濾過ウイルス上澄み１０マイクロリットルが新鮮ヒト血清（ＨＳ）、熱不活性化ヒト血清（ΔＨＳ）、あるいは熱不活性化ＦＢＳ（ΔＦＢＳ）９０マイクロリットルと３７℃、４５分混合された。培養の後ウイルス血清混合物にはポリブレンを含むＤＭＥＭ１ｍｌが加えられ、同じ培地で１０倍連続希釈が行われた（希釈の数を準備されたい）。各希釈物の１ｍｌが二重にして直ちにＮＩＨ３Ｔ３ＴＫ細胞のサブ密集単層上で１２時間３７℃で平板培養された。翌日ウイルス培地は除去され、Ｇ４１８、０．８ｍｇ／ｍｌを含む新鮮ＤＭＥＭで置換された。不活性化は熱不活性化ヒト血清の存在下で得られた力価をヒト血清の存在下で得られた力価で除去することで決定された。結果は下記の表６で与えられる。前記の結果は、ヒト血清による溶解に耐性である両種性マウス白血病ウイルスベースのベクターをＨＯＳ細胞が生産できることを示している。実施例９この実施例はＰＡ３１７細胞から生産される両種性包膜、ヒトＣＡＫ８細胞からの両種性包膜、あるいは安定したマウス細胞系（ｇｐ７ｃ）からのＶＳＹ−Ｇ包膜のいずれか一つを包含するｐＧ１Ｎａを含むレトロウイルスベクターの感受性を比較する。ＣＡＫ８細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＣＲＬ１１５５４）は２９３Ｔ細胞系から誘導された（ピア、他、アメリカ科学アカデミー紀要、９０巻、８３９２−８３９６ページ（１９９３年９月））。ＣＡＫ８細胞系は両種性４０７０Ａレトロウイルスから誘導されるレトロウイルス包膜をコード化するポリヌクレオチドを含み、ここで４０７０Ａレトロウイルスの３５Ｃ末端アミノ酸をコード化するポリヌクレオチド配列がエコトロピックウイルスの３５Ｃ末端アミノ酸をコード化するポリヌクレオチドで置換される。２９３Ｔ／１７と名付けられたクローンが２９３Ｔ集団から分離されたが（デュ・ブリッジ、他、分子細胞生物学、７巻、３７９−３８７ページ（１９８７年））、それは１０⁶／ｍｌ以上の力価でＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染させる能力のあるレトロウイルス上澄みを生産し、次いで野生型モロニーウイルス（ｐＺａｐ）（シューメーカー、他、ウイルス学ジャーナル、４０巻、１６４−１７２ページ（１９８１年））、およびβ−ガラクトシダーゼ発現レトロウイルスベクターｐＢＮＤ８（ピア、他、１９９３年）で一過性形質移入を行った。ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、ｐＣｒｉｐＥｎｖ−（ディノス、他、アメリカ科学アカデミー紀要、８５巻、６４６０−６４６４ページ（１９８８年））は包膜領域で突然変異を含有し、パッケージング部位を欠失し、また３′ＬＴＲをＳＶ４０ポリ（Ａ）部位で置換するが、このプラスミドはヒグロマイシン耐性を与えるプラスミドと一緒に２９３Ｔ／１７細胞に形質移入された（バーナード、他、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１５８巻、２３７ −２４３ページ（１９８５年））。個別クローンが選択され、逆転写酵素活性が検定され（ゴフ、他、ウイルス学ジャーナル、３８巻、２３９−２４８ページ（１９８１年））、また一つのクローン、アンジュー６５（Ａｎｊｏｕ６５）が最高の逆転写酵素活性を有していた。両種性包膜発現構築物、ｐＣｒｉｐＡＭｇａｇ−（ディノス、他、１９８８年）はｇａｇ領域で突然変異を含有し、パッケージング部位を欠失し、また３′ＬＴＲを置換するが、この構築物はｇｐｔ耐性遺伝子を発現するプラスミドと一緒にアンジュー６５細胞に形質移入された（ジェイシン、他、遺伝子と発育、２巻、１３５３−１３６３ページ（１９８８年））。個別クローンが選択され、高力価のβガラクトシダーゼ発現レトロウイルスを生産する能力が検定された。１個のクローンが１０⁶／ｍｌを越える力価のβ−ｇａｌレトロウイルスを生産し、ｐＢＮＤ８を用いる形質移入が続いて行われた。希釈サブクローニングが２回続けて実施され、ＣＡＫ８、つまりビング細胞系を生み出した。両種性Ｇ１Ｎａレトロウイルス上澄みは、ピア、他、１９９３年に記載されているようにＣＡＫ８パッケージング細胞系あるいはＰＡ３１７細胞の一過性形質移入により形成された。レトロウイルス上澄みは感染４８時間後に収穫された。ＶＳＶ−ＧプソイドタイプＧ１Ｎａレトロウイルスベクター（テネシー、メンフィス、セイント・ジュード・チルドレンズ・リサーチ・ホスピタル、エリオ・ヴァーニン博士の提供によるもの）はテトラサイクリン誘導プロモーターおよびエコトロピックｇａｇ／ｐｏｌの下でＶＳＶ−Ｇを含有する安定したマウス細胞系（ｇｐ７Ｃ）から調製された。ＳＶ４０初期プロモーターの制御下でモロニーＭｕＬＶのｇａｇおよびｐｏｌコード化成分を構造的に発現する細胞系であるＧＰ７Ｃ（メリーランド、ゲイザーズバーグ、ジェネティック・セラピー、インコーポレイテッド）は、プラスミドｐＭ２−ＳＶＧＰをチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ）３Ｔ３細胞（メリーランド、ロックヴィル、ＡＴＣＣ）（ラッセル、他、ヒト遺伝子治療、６巻、６３５−６４１ページ（１９９５年））に、ヒグロマイシンに対する耐性を与える転写カセットを含有するプラスミド、ｐＨＲ５と同時形質移入することにより導入して誘導された（リー、他、ウイルス学ジャーナル、６４巻、３８４４−３８５２ページ（１９９０年））。ｐＭ２−ＳＶＧＰの構築は多重段階を必要とした。まず完全ｐｏｌ遺伝子および多数のｇａｇ遺伝子を含有するｐＭＬＶ−Ｋからの５１３１塩基対ＰｓｔＩ−Ｓｃａｌ断片（ミラー、他、ウイルス学ジャーナル、４９巻、２１４−２２２ページ（１９８４年））がｐＵＣ−ΔＧＰを形成するためにｐＵＣ１８に挿入された。ｇａｇ遺伝子の５′末端を含有するｐＵＣ−ＧＰはコンセンサスコザック配列（コザック、分子生物学ジャーナル、１９６巻、９４７− ９５０ページ（１９８７年））と一緒に１４１塩基対配列を（４個のオーバーラッピングオリゴを使用して）ｐＵＣ−ΔＧＰのＰｓｔＩ部位に挿入することにより構築された。ｐＵＣ−ＧＰからの完全ｇａｇ／ｐｏｌコード化領域は平滑ＥｃｏＲＩ断片としてｐＭＥＴ２−ＰＡのＳｎａＢＩ部位に挿入され、平滑ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてＬＮＳＸからのＳＶ４０プロモーター（ミラー、他、バイオテクニクス、７巻、９８０−９９０ページ（１９８９年））が次いでｐＭ２−ＳＶＧＰを形成するため（平滑化）ＮｏｔＩ部位にクローンされた。ｎｅｏ^R遺伝子を含むレトロウイルスベクターゲノム（Ｇ１Ｎａ）が両種性ベクター粒子を生成する生産者クローン（Ｇ１Ｎａ．４０、メリーランド、ゲイザーズバーグ、ジェネティック・セラピー、インコーポレイテッド）から培養培地に露出することによりＧＰ７Ｃ細胞に導入された（Ｇ１Ｎａ．４０はＰＡ３１７細胞系をｐＧ１Ｎａで形質導入して生成された）。個別クローンはＧ４１８選別で分離され、それぞれからの培養培地はＲＮＡスロットブロット分析によりベクターＲＮＡの内容を検定された。見かけ上最高の力価を持つＧＰ７ＣＮと名付けられたクローンが選択された。テトラサイクリン耐性オペロンの成分を用いてＶＳＶ−Ｇを誘発的に発現する細胞を誘導する最初のステップは、ＧＰ７ＣＮ細胞をｐＵＨＤ１５−１と同時形質移入することであり、後者はＣＭＶ１Ａ（ゴッセン、他、アメリカ科学アカデミー紀要、８９巻、５５４７−５５５１ページ（１９９２年））およびｐＵＨＤ −ピューロ２の制御の下で配列をコード化するキメラｔｅｔ^R／ＶＰ１６トランスアクチベーターを包含している。ｐＵＨＤ−ピューロ２はｐＪ６Ωピューロ（モーゲンスターン、他、核酸研究、１８巻、３５８７−３５９６ページ（１９９０年））からの６３０塩基対Ｃ１ａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＩＣ２０Ｒ（マーシュ、他、遺伝子、３２巻、４８１−４８５ページ（１９８４年））に挿入することにより構築され、これによりＥｃｏＲＩ部位でピューロ^R遺伝子に隣接させる。ピューロ^R遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ断片は、次いでｐＵＨＤ１０Ｓ（フォーネロッド、他、オンコジーン、１０巻、１７３９−１７４８ページ（１９９５年））に結合し、ｐＵＨＤ−ピュロールを形成する。ｐＵＨＤ−ピュロールはＳｐｈＩ部位を含有し、これはＡＴＧトリヌクレオチドをその認識配列の一部として直接ピューロ^R遺伝子に対する５′として含む。ＳｐｈＩ部位はＳａ１Ｉでの部分消化により除去され、ＨｉｎｄＩＩＩでの完全消化、部位の平滑化および再結合へと続き、ｐＵＨＤ−ピューロ２を形成する。いくつかのクローンが分離され、更に一過性検定でｔｅｔ^R／ＶＰ１６配列の誘発機能が選別され、続いてｔｅｔ⁰最小プロモーター、ｐｔｅｔ⁰−ＬａｃＺの制御の下でβガラクトシダーゼコード化配列を含むプラスミドを用いて形質移入された。ｐｔｅｔ⁰ＬａｃＺは、７部分ｔｅｔ⁰配列およびＣＭＶ１Ａプロモーター（ゴッセン、他、１９９２年）を含むｐＵＨＤ１０−３からの４３９塩基対ＸｈｏＩ−ＳａｃＩＩ断片をｐ６１０ＺＡ（コザリー、他、真核遺伝子に関するオクスフォード調査、マクリーン、編、６巻、１４５−１７８ページ（１９８９年））にあるＬａｃＺ遺伝子の上流に挿入することにより構築された。テトラサイクリンで培養された細胞からの溶菌液の検定で低いβガラクトシダーゼ活性を示しまたテトラサイクン無しで培養された細胞の溶菌液では高水準の活性を示したＧＰ７ＣＮ−ｔＴＡと名付けられたクローンが選択された。ＧＰ７ＣＮ−ｔＴＡ細胞は次いでｐＵＨＤ１０−ＧおよびｐＴＫ５−１０９とともに同時形質移入された。ｐＵＨＤ１０−ＧはＶＳＶ−Ｇコード化配列を含む１６５５塩基対ＥｃｏＲＩ断片をｐＵＨＤ１０−Ｓに挿入することにより構築された（フォーネロッド、他、１９９５年）。ｐＴＫ５−１０９はチミジンキナーゼに対するコード化配列をこの遺伝子の単純性ヘルペスウイルスプロモーターを含むプラスミドに挿入することにより構築された（マックナイト、核酸研究、８巻、５９４５−５９６４ページ（１９８０年））。チミジンキナーゼマーカーが選別のため使用された。個別クローンが次いでテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を含む培地で分離された。テトラサイクリン除去７２時間後に、細胞溶菌液が各クローンから調製されウエスタンブロット分析により誘発性ＶＳＶ−Ｇ発現を検査された。クローンは高い発現を示すものが選択された。補体不活性化研究のために下記の血清が使用された。１．ヒト血清２．熱不活性化ヒト血清、ここで熱不活性化は５５℃、３０分の培養で達成された。また、３．胎仔ウシ血清（バイオ・ホウィッタッカー、ロット番号４Ｍ０４５４）、５５℃、３０分で不活性化されたもの。レトロウイルス上澄みは次いで前記血清サンプルのいずれかと１：１０の割合で混合され３０分３７℃で培養された。血清が加えられない各上澄みの対照サンプルは氷上で保存された。サンプル１００μｌが次いでレトロウイルス上澄みおよび血清の各混合物から除去され、熱不活性化胎仔ウシ血清（Ｄ１０）１０％を含みポリブレン８μｇ／ｍｌで補充されたＤＭＥＭ（バイオ・ホウィッタッカー）１０ｍｌに直接加えられる。生成サンプルのそれぞれは次いで前記培地プラスポリブレンで連続的に１０^-5まで希釈される。希釈サンプルそれぞれはＮＩＨ３Ｔ３ＴＫ細胞のサブ密集単層に直接平板培養された。感染２４時間後、ウイルス上澄みは除去されＤ１０含有Ｇ４１８（０．８ｍｇ／ｍｌ）で置換された。コロニー形成単位（ＣＦＵ′_s）が感染７日後に計数された。図１０で示されるように、ＶＳＶ−ＧプソイドタイプＧ１Ｎａのレトロウイルスベクターがヒト血清で３０分培養された時、力価の３５倍減少が観察された。熱不活性化仔ウシ血清では力価の損失は見られず、熱不活性化ヒト血清では最小力価損失（約２倍）が観察された。ＶＳＶ−Ｇプソイドタイプレトロウイルスベクターで得られた結果とは対照的に、ＣＡＫ８細胞系から生産された両種性Ｇ１Ｎａベクターはヒト血清の存在下で完全に安定していたが（図１１）、一方ＰＡ３１７細胞から生産されたＧ１Ｎａベクターはヒト血清で３０分培養の後力価の５０倍の損失を生じた（図１２）。実施例１０レトロウイルス上澄みおよびヒト血清サンプルが相対比率１：１０で混合され実施例９で記述されたように３７℃で培養された。各上澄みの対照サンプルは血清と混合されず氷上で保存された。３０分，６０分，１２０分、および１８０分で１００μｌのサンプルが除去され、熱不活性化胎仔ウシ血清（Ｄ１０）１０％を含みポリブレン８μｇ／ｍｌで補充されたＤＭＥＭ１０ｍｌに直接加えられた。各時点でサンプルは次いで前記培地およびポリブレンで連続して１０^-5まで希釈され、ＮＩＨ３Ｔ３ＴＫ細胞のサブ密集単層に直接平板培養された。感染２４時間後、ウイルス上澄みが除去され、Ｄ１０含有Ｇ４１８で置換された。ＣＦＵ′_sは感染７日後に計数された。図１３で示されるように、ＣＡＫ８細胞系から生産された両種性Ｇ１Ｎａベクターはヒト血清１時間存在下で安定しており、続いて２時間後には力価の損失は３．５倍となった。図１４で示されるように、培養３０分内でヒト血清存在下でＰＡ３１７誘導Ｇ１Ｎａレトロウイルスの力価損失は４０倍である。培養２時間後力価の減少は７７倍である。この明細書で引用されたすべての特許（公開特許出願を含む），公開公報、およびデータベースアクセス番号および貯蔵アクセス番号は、そのような各個別の特許，公開情報およびデータベースアクセス番号および貯蔵アクセス番号が特異的かつ個別的に引用例として組み込まれたかのように同じ範囲で全体としてここに特異的に組み込まれている。しかしこの発明の範囲は特に記述されたもの以外に実施することができ、しかも以下の請求の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/22 Ｃ１２Ｎ 7/00 38/28 5/00 Ｂ 38/46 Ａ６１Ｋ 37/02 39/395 37/26 48/00 37/54 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/66 7/00 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ペンシエロ，マイケルアメリカ合衆国，20842 メリーランド, ディッカーソン，ボールズビルロード 20910 (72)発明者コリンズ，メアリ，ケイ．，エル. イギリス国，ダブリュ１アール３エルエヌロンドン，ビークストリート 73 (72)発明者コセット，フランソワ−ロワックイギリス国，エスダブリュ６３ユーユーロンドン，ランリーガーデンズ，ネイピアコート 48 (72)発明者タケウチ，ヤスヒロイギリス国，エスダブリュ18 ５ジェイジェイロンドン，スミートンロード 81 (72)発明者ワイス，ロビン，エイ. イギリス国，エヌイー１エスエスロンドン，サイプラスアベニュー 25

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト血清による不活性化に耐性の一つのレトロウイルスベクターであって、前記レトロウイルスベクターがヒト血清による溶解に耐性である細胞系で生産されていることを特徴とするレトロウイルスベクター。２．請求の範囲第１項記載のレトロウイルスベクターであって、ここで前記細胞系がＨＯＳ，ＴＥ６７１，ＨＴ１０８０，Ｍｖ−１−Ｌｕ、およびヒト２９３細胞系あるいはＨＯＳ，ＴＥ６７１，ＨＴ１０８０，Ｍｖ−１−Ｌｕ、もしくはヒト２９３細胞系から誘導される一つの細胞系よりなるグループから選択されることを特徴とするレトロウイルスベクター。３．請求の範囲第１項記載のレトロウイルスベクターであって、ここで前記レトロウイルスベクターが（ａ）ラウス肉腫ウイルス，トリ白血症ウイルス，ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４，ＢａＥＶ，サル肉腫関連性ウイルス，ＦｅＬＶ−Ｂ，ＧＡＬＶ，モロニーマウス白血病ウイルス、および両種性マウス白血病ウイルスよりなるグループから選択される一つのレトロウイルスをヒト血清による溶解に耐性である一つの細胞系に導入することにより、また（ｂ）ヒト血清による不活性化に耐性の前記レトロウイルスベクターを前記細胞系から回収することにより生産されていることを特徴とするレトロウイルスベクター。４．前記レトロウイルスがネコ内因性ウイルスＲＤ１１４であることを特徴とする請求の範囲第３項記載のレトロウイルスベクター。５．前記レトロウイルスがヒヒ内因性ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第３項記載のレトロウイルスベクター。６．前記レトロウイルスがサル肉腫関連性ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第３項記載のレトロウイルスベクター。７．前記レトロウイルスがネコ白血病ウイルス−Ｂであることを特徴とする請求の範囲第３項記載のレトロウイルスベクター。８．前記レトロウイルスがラウス肉腫ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第３項記載のレトロウイルスベクター。９．前記レトロウイルスがトリ白血症ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第３項記載のレトロウイルスベクター。１０．前記レトロウイルスがテナガザル白血病ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第３項記載のレトロウイルスベクター。１１．前記レトロウイルスが両種性マウス白血病ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第３項記載のレトロウイルスベクター。１２．請求の範囲第３項記載のレトロウイルスベクターであって、ここで前記細胞系がＨＯＳ，ＴＥ６７１，ＨＴ１０８０，Ｍｖ−１−Ｌｕ、およびヒト２９３細胞系、あるいはＨＯＳ，ＴＥ６７１，ＨＴ１０８０，Ｍｖ−１−Ｌｕもしくはヒト２９３細胞系より誘導される一つの細胞系よりなるグループから選択されることを特徴とするレトロウイルスベクター。１３．前記レトロウイルスが両種性マウス白血病ウイルスでありまた前記細胞系がＨＯＳ細胞系であることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のレトロウイルスベクター。１４．前記細胞系がヒト２９３細胞系あるいはヒト２９３細胞系から誘導される一つの細胞系であることを特徴とする請求の範囲第１２項記載のレトロウイルスベクター。１５．前記レトロウイルスベクターが一つの治療薬をコード化する少なくとも１個のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求の範囲第３項記載のレトロウイルスベクター。１６．ヒト血清による不活性化に耐性の一つのレトロウイルスベクターであって、前記レトロウイルスベクターは（ａ）ヒト血清による溶解に耐性のプレパッケージング細胞にプラスミドベクターおよびレトロウイルスプラスミドベクターを導入し、（ｉ）一つのプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルス，両種性マウス白血病ウイルス，ラウス肉腫ウイルス，ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４，ＢａＥＶ，ＳＳＡＶ，ＦｅＬＶ−Ｂ，テナガザル白血病ウイルス，ヒト免疫不全ウイルス，トリ白血症ウイルス，ＮＺＢウイルス，水泡性口内炎ウイルス、およびＨＶＪウイルスからなるグループから選択されるウイルスから得られる一つの包膜タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含み、（ii）レトロウイルスプラスミドベクターは５′ＬＴＲ，３′ＬＴＲ，パッケージングシグナルおよび対象となるタンパク質あるいはポリペプチドをコード化する少なくとも１個のポリヌクレオチドを含み、また（ｂ）レトロウイルスベクターがヒト血清による不活性化に耐性である前記パッケージング細胞により生産される前記レトロウイルスベクターを回収することにより生産されていることを特徴とするレトロウイルスベクター。１７．前記包膜タンパク質がネコ内因性ウイルスＲＤ１１４から得られることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のレトロウイルスベクター。１８．前記包膜タンパク質がヒヒ内因性ウイルスから得られることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のレトロウイルスベクター。１９．前記包膜タンパク質がサル肉腫関連性ウイルスから得られることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のレトロウイルスベクター。２０．前記包膜タンパク質がネコ白血病ウイルス−Ｂから得られることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のレトロウイルスベクター。２１．前記包膜タンパク質がテナガザル白血病ウイルスから得られることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のレトロウイルスベクター。２２．前記包膜タンパク質が両種性マウス白血病ウイルスから得られることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のレトロウイルスベクター。２３．前記包膜タンパク質がトリ白血症ウイルスから得られることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のレトロウイルスベクター。２４．前記包膜タンパク質がヒト免疫不全ウイルスから得られることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のレトロウイルスベクター。２５．前記包膜タンパク質がＮＺＢウイルスから得られることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のレトロウイルスベクター。２６．前記包膜タンパク質が水泡性口内炎ウイルスから得られることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のレトロウイルスベクター。２７．前記包膜タンパク質がＨＶＪウイルスから得られることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のレトロウイルスベクター。２８．対象となるタンパク質あるいはポリペプチドをコード化する前記少なくとも１個のポリヌクレオチドが一つの治療薬をコード化することを特徴とする請求の範囲１６項記載の方法。２９．ヒト血清による不活性化に耐性のレトロウイルスベクターを生産するための一つのパッケージング細胞系であって、前記パッケージング細胞系はヒト血清による溶解に耐性であり、またこの細胞系はモロニーマウス白血病ウイルス，両種性マウス白血病ウイルス，ラウス肉腫ウイルス，ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４，ＢａＥＶ，ＳＳＡＶ，ＦｅＬＶ−Ｂ，テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ），ヒト免疫不全ウイルス，ＮＺＢウイルス，トリ白血症ウイルス，水泡性口内炎ウイルス、およびＨＶＪウイルスよりなるグループから選択されるウイルスから得られる包膜タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含むことを特徴とするパッケージング細胞系。３０．前記レトロウイルスｅｎｖタンパク質がネコ内因性ウイルスＲＤ１１４から得られることを特徴とする請求の範囲第２９項記載のパッケージング細胞系。３１．前記レトロウイルスｅｎｖタンパク質がヒヒ内因性ウイルスから得られることを特徴とする請求の範囲第２９項記載のパッケージング細胞系。３２．前記レトロウイルスｅｎｖタンパク質がサル肉腫関連性ウイルスから得られることを特徴とする請求の範囲第２９項記載のパッケージング細胞系。３３．前記レトロウイルスｅｎｖタンパク質がＦｅＬＶ−Ｂから得られることを特徴とする請求の範囲第２９項記載のパッケージング細胞系。３４．前記レトロウイルスｅｎｖタンパク質がテナガザル白血病ウイルスから得られることを特徴とする請求の範囲第２９項記載のパッケージング細胞系。３５．前記包膜タンパク質が両種性マウス白血病ウイルスから得られることを特徴とする特許請求の範囲第２９項記載のパッケージング細胞系。３６．前記包膜タンパク質がトリ白血症ウイルスから得られることを特徴とする特許請求の範囲第２９項記載のパッケージング細胞系。３７．前記包膜タンパク質がヒト免疫不全ウイルスから得られることを特徴とする特許請求の範囲第２９項記載のパッケージング細胞系。３８．前記包膜タンパク質がＮＺＢウイルスから得られることを特徴とする特許請求の範囲第２９項記載のパッケージング細胞系。３９．前記包膜タンパク質が水泡性口内炎ウイルスから得られることを特徴とする特許請求の範囲第２９項記載のパッケージング細胞系。４０．前記包膜タンパク質がＨＶＪウイルスから得られることを特徴とする特許請求の範囲第２９項記載のパッケージング細胞系。４１．ヒト血清による不活性化に耐性のレトロウイルスベクターを生産するための一つの生産者細胞系であって、前記生産者細胞系はヒト血清による溶解に耐性であり、また第一プラスミドベクター，第二プラスミドベクター、およびレトロウイルスプラスミドベクターを含み、前記第一プラスミドベクターはレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含み、前記第二プラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルス，両種性マウス白血病ウイルス，ラウス肉腫ウイルス，ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４，ヒヒ内因性ウイルス，サル肉腫関連性ウイルス，ネコ白血病ウイルスＢ，テナガザル白血病ウイルス，ヒト免疫不全ウイルス，ＮＺＢウイルス，トリ白血症ウイルス，水泡性口内炎ウイルス、およびＨＶＪウイルスよりなるグループから選択されるウイルスから得られる包膜タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含み、また前記レトロウイルスプラスミドベクターは５′ＬＴＲ，３′ＬＴＲ，パッケージングシグナル、および対象となるタンパク質あるいはポリペプチドをコード化する少なくとも１個のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする生産者細胞系。４２．ＨＯＳ，ＴＥ６７１，ＨＴ１０８０，Ｍｖ−１−Ｌｕ、およびヒト２９３細胞系、またＨＯＳ，ＴＥ６７１，ＨＴ１０８０，Ｍｖ−１−Ｌｕ、およびヒト２９３細胞系から誘導される細胞系から選択される細胞系から生産される一つの補体耐性レトロウイルスであって、それはｇａｇ，ｐｏｌ、およびｅｎｖタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含み、ここで前記包膜タンパク質はＶＳＶ−Ｇ包膜タンパク質；モロニーマウス白血病ウイルス包膜；ラウス肉腫ウイルス包膜；ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４包膜；テナガザル白血病ウイルス包膜；ヒヒ内因性ウイルス包膜；サル肉腫関連性ウイルス包膜；両種性マウス白血病ウイルス包膜；ヒト免疫不全ウイルス包膜；トリ白血症ウイルス包膜；ＮＺＢウイルス包膜；およびＨＶＪウイルス包膜よりなるグループから選択されることを特徴とする補体耐性レトロウイルス。４３．前記包膜タンパク質がＶＳＶ−Ｇ包膜タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第４２項記載のレトロウイルス。４４．前記細胞系がヒト２９３細胞系あるいはヒト２９３細胞系から誘導される一つの細胞系であることを特徴とする請求の範囲第４２項記載のレトロウイルス。４５．一つの補体耐性レトロウイルスであって、ＶＳＶ−Ｇ包膜タンパク質；モロニーマウス白血病ウイルス包膜；ラウス肉腫ウイルス包膜；ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４包膜；テナガザル白血病ウイルス包膜；ヒヒ内因性ウイルス包膜；サル肉腫関連性ウイルス包膜；両種性マウス白血病ウイルス包膜；ヒト免疫不全ウイルス包膜；トリ白血症ウイルス包膜；ＮＺＢウイルス包膜；およびＨＶＪウイルス包膜よりなるグループから選択される包膜を含むことを特徴とする補体耐性レトロウイルス。４６．前記包膜がＶＳＶ−Ｇ包膜タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第４５項記載のレトロウイルス。４７．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、請求の範囲第１５項記載のレトロウイルスベクターを宿主に投与し、前記レトロウイルスベクターは前記宿主に治療効果を産むのに有効な量で投与されることよりなることを特徴とする方法。４８．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、請求の範囲第２８項記載のレトロウイルスベクターを宿主に投与し、前記レトロウイルスベクターは前記宿主に治療効果を産むのに有効な量で投与されることよりなることを特徴とする方法。４９．ヒト血清に耐性であるレトロウイルスベクターを識別する一つの方法であって、生成レトロウイルスベクターが生産される細胞系にレトロウイルスを導入し、またヒト血清による前記生成レトロウイルスベクターの不活性化を決定することよりなることを特徴とする方法。５０．ヒト血清による不活性化に耐性のレトロウイルスベクターを生産する一つの方法であって、ヒト血清による溶解に対する細胞の耐性を決定し、ヒト血清による溶解に耐性であると決定された細胞からレトロウイルスベクターを生産することよりなることを特徴とする方法。５１．動物を治療薬で処置する一つの手順であって、治療薬をコード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターを動物に投与し、前記レトロウイルスベクターはヒト２９３細胞系あるいはヒト２９３細胞系から誘導される細胞系である一つの細胞系で生産されていることよりなることを特徴とする手順。５２．前記レトロウイルスベクターが静脈内で投与されることを特徴とする請求の範囲第５１項記載の手順。５３．前記細胞系がＣＡＫ８細胞系であることを特徴とする請求の範囲第５１項記載の手順。５４．前記レトロウイルスベクターが約１０⁵ｃｆｕから約１０¹²ｃｆｕまでの量で投与されることを特徴とする請求の範囲第５１項記載の手順。５５．前記レトロウイルスベクターが約１０⁶ｃｆｕから約１０¹⁰ｃｆｕまでの量で投与されることを特徴とする請求の範囲第５４項記載の手順。５６．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、請求の範囲第４２項記載のレトロウイルスベクターを宿主に投与し、前記レトロウイルスベクターが前記宿主に治療効果を産むのに有効な量で投与されることよりなることを特徴とする方法。５７．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、請求の範囲第４５項記載のレトロウイルスベクターを宿主に投与し、前記レトロウイルスベクターが前記宿主に治療効果を産むのに有効な量で投与されることよりなることを特徴とする方法。