JPH10508314A - 白血球の濃縮法および濃縮用バッグセット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 高度の細胞生存率をもつ、高濃度の白血球によって形成された治療用品。白血球は、全血中に存在する正常集団から次のようにして分離される。すなわち、全血を容器に入れ、凝固を防ぎながら、試薬と遠心によって一方が白血球を極端に多量に含む、そのような二成分に分離し、その白血球濃縮物をさらに区分けし、その白血球を凍結することによって行なう。

Description

【発明の詳細な説明】 白血球の濃縮法および濃縮用バッグセット 発明の分野 下記の発明は、一般には、白血球の治療的利用、白血球を自然において通常見 られる以上の高密度の集団に凝集させることによって、白血球を分離する方法、 および、濃縮工程を促進するように一定配置に並べられ一組のバッグ使用によっ て白血球を濃縮する方法、および、その白血球を保存する方法に関する。 発明の背景 胎盤・臍帯血（PB）は、多数の造血幹細胞や原初細胞を含んでおり、それらが 、遺伝疾患、事故、または、医療処置のために損傷された骨髄を修復するさいに 、PB に対して並外れた治療能力を与えることが現在では認められている。通常 の移植用に骨髄を採取する場合と同様に、PB も、そのような移植組織を受けと る受容者に対して特異的な反応を引き起こす可能性のある免疫細胞を含んでいる が、成人免疫細胞と違って、PB 中の免疫細胞は、受容者に対する、損傷的免疫 反応を引き起こす傾向が低いか、おそらくは、はるかに低いと思われる。受容者 の細胞および組織に対する移植組織片免疫反応のもたらす臨床症状は、「移植片 対ホスト疾患」(GVHD)と呼ばれる。典型的な臨床処置としては、移植片に対する 受容者自身の免疫反応を、薬や放射線療法によって抑える。これは、それによっ て、免疫細胞や、その他の造血細胞を減少ないし、除去し、さらに、そうするこ とによって、移植片の拒絶をもたらすようなホスト対移植片免疫反応を回避する ためである。これら、移植片対ホスト、および、ホスト対移植片間免疫反応の主 な標的は、HLA（ヒト白血球抗原）系の遺伝子によってコードされた抗原である こと、ならびに、骨髄移植の成否は、供与者と、受容者とが HLA 抗原を共有 するか否かに依存することがこれまでに実証されている。受容者の体内に認めら れるものと同じ父方・母方の HLA 遺伝子を受け継いだ兄弟・姉妹の供与者の場 合、HLA が同一であり、したがって、この観点からは最適である。そのような、 HLA が同じ兄弟・姉妹の供与者を持たない患者は、もっと遠い親戚や、全然関 係のない供与者からの移植片を受け入れざるをえない。HLA 系は、いくつかの、 飛び離れた遺伝子を含んでおり、しかも、その各々が、全集団において極端に多 くの数の抗原的に異なる変種を発現するのであるから、そのような遠い親戚の供 与者や、無関係の供与者からの移植片は、さまざまな数の HLA 不適合因子を含 むことが予想される。もっとも、各供与者における特異的変種を特定し、その H LA 抗原が、受容者のものに適合するような供与者を選択することによって、可 能な供与者の中から適当な供与者を選ぶことができるなら話は別であるが。この ような選択を有意に高い成功率で実行するためには、多数の、HLA 抗原既知の供 与候補者群を用意しておくことが必要である。血縁関係の無い供与者からの PB の場合、ランダムな胎盤から採取した、HLA 種別特定済み凍結単位を収容するバ ンクを設立することが必要である。これまで、もっとも広く行なわれている PB の凍結方法は、全 PB 単位に、等量の冷凍保存液を加えることであった。しかし 、この方法には二重の不都合があった。すなわち、各凍結保存単位の容積がきわ めて大きなものとなること、および、おそらく有害と思われる、比較的大量の冷 凍保存液が、最終的に、そのような PB 単位を受けいれる受容者に投与されるこ とである。冷凍保存液、ならびに、ヘモグロビン、それも、幹細胞と原初細胞の 方は保護するが、赤血球は保護しないというような凍結・解凍法のために破壊さ れた赤血球から放出されたヘモグロビンを投与することは、一般に有毒作用を持 つ、特に、受容者の腎臓のような特定臓器に対して有毒作用を持つ。さらに、大 量の凍結単位を有効な数だけ保存するには、多数のフリーザーが必要であること は論理的に帰結されるところであるから、したがって、それにともなって、立ち 上げのコストや運転コストも増大する。本出願人は、不必要な成熟赤血球や、等 量の血漿を除去することにより、PB 単位の容量を実質的に減少させる実際的な 方法を開発した。この明細書は、その方法、および、特別に設計された一組の合 成樹脂バッグと連結管について記載する。これらのバッグと連結管は、必要な幹 細胞と原初細胞を、手間や、汚染の危険を最小にしながら所期の濃度に濃縮する のを促進することを意図したものである。実質的には、本方法は、実験的な、時 間のかかる検査室工程を、血液銀行における日常操作に変えるものである。 下記の明細書は、本特許工程に対して先駆的であるという意味においてのみ、 本出願人が意識した従来技術の代表である。しかしながら、ここに謹んで明言す るのであるが、これらの特許のいずれも、単独でも、あるいは、考えられるどの ような組み合わせにおいても、後述する本発明へのヒントを授けるものでも、明 らかにするものでもなかった。 その他の従来技術（著者、表題、日付、関係ページ、その他を含む）Pablo Ru binstein，Richard E．Rosenfield，John W．Adamson and Cladd E．Stevens（ ニューヨーク血液センター、リンドレー・エフ・キンボール（Lindsley F．Kimb all）研究所）「非血縁者による骨髄再建用保存胎盤血液」（1993年５月）全論 文。 発明の要約 本発明の治療用品は、次の点で有用である。まず第一に、PB の最初の採取体 における幹および原初細胞の全てを、または、ほとんど全てを、最小の、予測可 能なスペースしか必要としない、小さな、均一な容量の中に回収できることであ る。第二に、PB 単位処理に関して一貫した方法を適用できることである。これ によって、操作者の熟練によらない、日常的に信頼できる用品が得られる。第三 に、おそらく有害と考えられる冷凍保存液や、遊離ヘモグロビンの作用を最小に することができる。 本発明によって改良される製品の特質の第一点は、全 PB において、他の成分 から、白血球（造血幹細胞と原初細胞を含む）を分離する方法、および、そのよ うにして得られた白血球の生存率が保持されるそのやり方である。すなわち、細 菌やかびによる汚染、有害作用を持つと考えられる薬品、過度の遠心力や、浸透 圧アンバランスを回避することによって、高い生存率を維持する。通常、細菌、 及び／又は、かびによる汚染は、PB または、PB から得られた白血球懸濁液を、 準備操作の過程で大気に曝露すると起こる。化学的な傷害は、共存する赤血球を 溶解したり、白血球を凝集したりするために、ある種の薬品を使用すると起こる ことがある。また、物理的傷害は、血液の細胞成分をその密度に応じて、すなわ ち、遠心性層化によって分離するさいに過度の遠心速度をもちいるために起こる 。さらに、本発明による方法は、分離された白血球が、室温で、冷凍保存液に長 時間曝露されるのを回避させ、さらに、細胞内に浸透した冷凍保存液自体による 有害作用をも回避させる。この曝露を回避するのが有利なのは、このような曝露 は、浸透圧アンバランスにより、白血球と、その中に含まれる幹および原初細胞 の生存率の低下を招くからである。 本発明の特質のもう一点は、一組の、互いに連結した合成樹脂容器（バッグと 呼ぶ）である。本発明によるこの一組のものは、白血球、および、白血球に含ま れる幹および原初細胞の選択的濃縮を可能にしながら、しかも、それらの細胞の 高い生存率や、環境からの感染性微生物による汚染防止を低下させない。全 PB は、親バッグに集め、その後、適当な化学的構造と、物理的形態と容量を持った 一連のバッグを通過させながら処理し、最後に、−196℃の液体窒素で凍結させ た、採取 PB 中のほとんどの白血球を含む分離分画を、特別設計のフリーザー・ バッグに保存する。中間工程には物質添加が含まれる。すなわち、これによって 、赤血球の凝集を促進したり、上清を連結する衛星バッグに移送することによっ て、成分の分離を促進するためである。特別設計のバッグ、および、連結する全 体系により、分離した白血球濃縮体に対し冷凍保存液の添加が可能となる。この 連結全体系により、細胞の最高生存率を維持するのに必要な、正確な、ゆっくり したスピードで、冷凍保存液を、白血球に添加することが可能になる。 冷凍・保存に使用されるバッグは、白血球を、異なる、それぞれ別のチェンバ ーに分離するのに用いられる、互いに連結した、切り離し可能な、複数の区画を 持つ。主要区画となる一つのチェンバーは、白血球の大部分を保存するためのも のである。小さい方の区画は、バッグ内容の小分画の保存に用いられる。この場 合、この小分画は、解凍することなく主要区画から切り離してもよく、また、必 要に応じてただちに切り離して、対応する白血球細胞分画中に含まれる造血幹細 胞や原初細胞を別に解凍し、その後インビトロで希釈してもよい。もう一つの、 それに続くチェンバーには、ごく少量の白血球懸濁液の分液が含まれる。これは 、その単位の移植の適性を検査したり、特定の受容者に対する供与組織の適性を 評価したりするさいに用いることを意図したものである。凍結用バッグには、ま た、その取り外し部分個々の外表面に独特のマークが設けられている。これは、 その中に保存される特定単位の同定のためであって、冷凍保管庫の指定区域への 保存、指定区域からの取り出しを容易にするためのものである。凍結用バッグの 外面にはさらに、自動化装置による、指定保存区域への冷凍バクの保管、指定区 域からの凍結用バッグの取り出しをそれぞれ促進するための手段が備えられてい る。 発明の目的 従って、PB 由来の造血幹細胞・原初細胞を、新規な、治療的により有効な形 で調製する手段を与えることが本発明の主要目的である。本製品は、高度の細胞 生存率を持つ、高濃度の白血球を含むバッグである。 本発明のもう一つの目的は、前記目的による治療用品を生産するための、新規 で、有効な方法を提供することである。 本発明のもう一つの目的は、前記治療用品を開発する方法と共同して使用され る、無菌の、相互に連結した一組のバッグを供給することでる。 本発明のもう一つの目的は、投与に必要とされるまでの長時間、治療有効量を 冷凍保存環境下に保持するように形成された、冷凍保存バッグを供給することで ある。 本発明のもう一つの目的は、それを用いることによって、治療有効量が分配さ れる複数の区画を備えた前記凍結用バッグを供給することである。すなわち、そ の複数区画によって、凍結用バッグから各種分液が治療方針にそって切り離され 、いくつかの目的に使用されることが可能になる、そのような凍結用バッグを供 給することである。 最初の利点から見てみると、胎盤由来の幹細胞を育成する装置を供給すること が本発明の一つの目的である。すなわち、その装置は、胎盤からの血液を収納す るのに好適な第一の血液バッグ、その血液バッグの中にあって凝固を防止する手 段、血液バッグに対して着脱可能に結合する試薬手段、第 1の血液バッグから上 清を分離し、かつ、その上清を白血球バッグに移す手段、白血球バッグの中の血 漿から白血球を分離する手段、白血球バッグに着脱可能に結合する血漿バッグで 、白血球バッグから排除された血漿を収納するためのバッグ、および、白血球バ ッグに機能的に結合する冷凍保存手段で、白血球バッグの内容を幹細胞凍結用バ ッグに転送するための手段を併せ持つ。 第二の利点から見てみると、胎盤幹細胞を含む、濃縮され、一部精製された白 血球懸濁液の調製法を供給するのが本発明の目的である。すなわち、その方法は 、胎盤からの血液を、第 1の血液バッグに収め、試薬手段をこの血液バッグに結 合させ、遠心して、第 1の血液バッグから、白血球富裕上清を分離し、この上清 を白血球バッグに収め、血漿バッグを、この白血球バッグに着脱可能に結合させ 、この白血球バッグから、血漿バッグに血漿を排出させることから成る。次に、 白血球バッグに冷凍保存手段を結合し、白血球バッグの内容を、幹細胞凍結用バ ッグに移送し、幹細胞凍結用バッグをその内容ごと冷凍する。 第三の利点から見てみると、少なくとも 80％ の白血球細胞（幹および原初細 胞を含む）を含む治療用品であって、しかも、90％ を越える生存率を持ち、赤 血球が、最初の PB 採集体のものの 10％ を越えない、そのような治療用品を供 給することが本発明の目的である。 上記の目的、および、その他の目的は、以下の詳細な記載を、添付の図面と併 せて考察するならば、自ずと明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 第 1 図は、本発明によって設けられた、幹細胞処理バッグの模式図である。 第 2 図は、第 1 図に示した凍結用バッグの詳細図である。 第 3 図は、第 2 図と同様の図であるが、凍結用バッグの内部を示す。 第 4 図は、本発明による方法を示すフローチャートである。 好ましい態様の記述 さて、ここで図を参照すると、同じ符号は、図は違っても、同じ部分を指して いるが、この図において、符号 100 は、本発明による装置を指す。 実質上、装置 100 は、3 列のバッグが、全体として一組のバッグセットを形 成すると見なすことができる。個々のバッグには、着脱可能な結合手段が備えら れている。これは、無菌条件下においてのみ、その複数のバッグに選択的注入が 実行されるようにするためのものである。本発明のある好ましい実施形態におい ては、バッグ 100 の配列は、6 個のバッグから成る。すなわち、血液バッグ 10 が第 1 列を形成し、試薬バッグ 20、白血球バッグ 30、血漿バッグ 40、およ び、冷凍保存バッグ 50 が第 2 列を形成し、幹細胞凍結用バッグ 60 が第 3 列 を形成する。臍帯血（すなわち、胎盤と臍帯からの血液）は、血液バッグ 10 に 導かれる。このバッグにはあらかじめ抗凝固剤が投与されてある。次に、第 2 列を、血液バッグ 10 に接続する。分離用試薬を、試薬バッグ 20 からの導管 2 6 を通じて血液バッグに導く。血液バッグ 10 の遠心を次に行なう。白血球を含 む上清が排除されて、白血球バッグ 30 の中に入る。ただちに、追加の遠心を行 なう。次に、上清血漿を排除して血漿バッグ 40 の中に入れる。これにより、残 査としての白血球は、白血球バッグ 30 の中に残される。冷凍保存液バッグ 50 からの冷凍保存液が、導管 59 を通じて白血球バッグにゆっくりと移送される。 その後、白血球バッグ 30 の内容は、幹細胞凍結用バッグ 60 に移送され、その 後、今後の使用に備えて液体窒素中に凍結・保存される。 第 1 図を参照しながらさらに詳細に言うと、全血、胎盤血、および、臍帯血 は、クエン酸、リン酸およびデキストロース（CPD）のような抗凝固剤を備えた 血液バッグ 10 に収納される。説明の都合上、この血液バッグの中に 100ml の 血液が収納されていると仮定しよう。通常、臍帯血においては、割合として 1 個の非赤血球細胞（簡単のため、この非赤血球細胞を、白血球と表示できると仮 定しよう）に対し、1,000 個の赤血球細胞が認められる。当然のことながら、血 液中を循環する、主な、識別可能で、機能的な細胞としては、赤血球、好中・好 酸・好塩基・顆粒細胞、B-、T-，および、非B-、非T-リンパ球、単球、および、 血小板がある。これら成熟細胞は、形態的に識別可能な分裂性前駆細胞から由来 し、また、必要に応じて、そのような細胞にとって代わられそれぞれの系統を維 持する。例えば、赤血球系列では赤血球芽細胞、顆粒細胞系列では骨髄芽細胞、 骨髄前駆細胞、および、骨髄細胞であり、血小板に対しては巨核球である。前駆 細胞は、さらに原始的な細胞から由来するが、一方、この原始的細胞は単純に二 つの大きなサブグループに分割される。すなわち、幹細胞と原初細胞である。も ちろん、新生児の血液も、その他の細胞成分を含んでいる。もっとも、本発明の 本質をぼやかさないように、ここではこれ以上論じないが。血液バッグ 10 は、 少なくとも二つの導入口を備えている。第 1の導入口が臍帯血を受け入れると同 時に、第 2 の導入口は、封印される。通常、封印は、無菌性を確保するために 、加熱封印が行なわれる。第 2 の導入口 4 は、結合されたスパイク 22 により 、導管 26 を介して、前述した第 2 列目バッグの内の分離用試薬バッグ 20 と 、さらに、導管 32 を介して白血球バッグ 30 と連絡する。血液バッグ 10 には さらに、第 3 の導入部 6 が設けられている。これは、最初に抽出した臍帯血の 標本を保存しておくことが好ましいと考えられる場合には、標本用試験管を備え るようにしてもよい。導入部 6 は、バッグ 10 に対して、また別の連結を形成 してもよい。 一旦、臍帯血が血液バッグ 10 に導入されると、CPD のような抗凝固剤と混合 することにより、胎盤血の凝固が防止され、血液は、いつでも試薬バッグ 20 中 に含まれる試薬との混合ができるようになる。試薬を血液バッグに導入し、混合 させてから、バッグを正確なスピードで遠心し、白血球富裕上清を、白血球バッ グ 30 に排出する。この試薬は、赤血球の沈降を促進するためのものである。す なわち、赤血球の沈降は、ごく軽い遠心段階（50 x G x 5 分）で急激に加速さ れる。分離用試薬の添加と、遠心の作用によって、80〜95％ の白血球を含むが 、赤血球は、最初に採取した血液中の赤血球の 10％ 未満しか含まない、そのよ うな上清が得られる。これによって、赤血球の存在は、（白血球に比べて）約90 ％ 減少する。白血球バッグの中では、いまや、白血球数に対する赤血球数の比 は、約 1 対 100 に減少している。 通常、白血球からの、赤血球の有効分離を促進する試薬の作用機構については 、臆説の域を出ておらず、その物理過程に関しては仮説があり、その分離過程を 記述するモデルがあるにすぎない。そのような試薬のある特長から、次のような 仮説が導かれている。すなわち、その試薬の添加により、懸濁液溶媒の誘電強度 が増し、したがって、電荷分散性が増し、そのため、赤血球が均一な懸濁状態を 保とうとする性向が阻害される。もう一つの考えでは、試薬の高分子が、２個以 上の赤血球に結合し、それらの赤血球を凝集させ、独特の「綿棒」を形成する、 という。すなわち、赤血球円板の平面で重なりあったゆるい集塊を形成する、と いう。しかしながら、この作用によって、それについて考えられる物理モデルの 如何によらず、赤血球と白血球の分離、比較的軽度の、弱い、短い遠心で可能と なる。この遠心は、赤血球の沈殿を加速し、白血球を、浮遊した、もとのままの 状態に保とうとする。ある好ましい実施態様においては、一旦、バッグ 20 の試 薬を血液バッグ 10 の中に導き、50gs で約 5 分遠心すると、有効な分離を実現 することができた。 電荷分散性を変える、すなわち、構成成分の誘電強度を変える試薬は、比較的 広範囲の有効物質の中から選ぶことができる。6% 濃度のヘプタスターチは、臨 床血処理においては、その効力、コスト、広範囲な利用度の点で今のところ好適 例として挙げることができる。一方、デキストラン、ゼラチン、変性又は未変性 澱粉のような天然高分子、または、ポリエチレングリコールやポリビニール・ピ ロリドンのような合成薬品、および、その他の多くのものが、条件の許すかぎり 、代用可能である。同様の効果は、抗体類や、レクチン類のように、その分子が 2 個以上の赤血球に強烈に結合する物質をによっても実現される。いずれにし ろ、試薬バッグの中に収められた、これら、赤血球冷凍沈殿試薬のいずれか一つ を、試薬バッグ 20 から、出口 24 から枝管 26 を通じ、さらに出口スパイク 2 2 を経て導入口 4 から、または、さらに別のやり方として、導入口 6 から血液 バッグ 10 内に滴下する。 バッグ 10 内部における試薬と血液の混合の後に、軽度の遠心を行ない、分離 を実行する。分離は、血漿、大部分の白血球、少数部分の赤血球から成る上清を 、白血球バッグ 30 に排出することによって行なう。すなわち、Ｔ型アダプター 34 によってスパイク 22 とバッグ 30 を連結する枝管 32 を通じて行なう。Ｔ 型アダプターは、枝管 26 と枝管 32 の分岐を可能にする。赤血球の大部分はバ ッグ 10 に残る。 白血球富裕混合液は、枝管 26 に動作的に嵌合したクランプ 28 によって、試 薬バッグへの侵入を阻止される。白血球バッグ 30 の導入口 36 に達した白血球 富裕混合液は、さらに続く処置への準備を整えたことになる。 一つの例として、最初に、100ml の PB が、血液バッグ 10 に収められたと仮 定しよう。好ましい実施例では、十分な容量のヒドキシエチル澱粉（ヘプタスタ ーチ、デュポン (Dupont)）を、試薬バッグ 20 に供給する。すなわち、バッグ1 0 の PB 採集液の 1/5 容量に等しい容量を添加するだけの容量が供給されてい る。この実施例においては、100ml の 1/5 は、20ml に等しい。通常、70ml の 白血球富裕上清血漿（試薬液を含む）が形成され、これが、白血球バッグ 30 に 排出される。一旦このバッグに収めてから、中身を、さらに、400 × G × 10 分の遠心にかける。通常、白血球バッグに導いた 70ml の内、55ml が血漿バッ グ 40 に排出される。したがって、約 15ml の高度に濃縮された白血球用品がバ ッグ 30 に残される。バッグ 40 に移送された上清は、血漿、抗凝固剤、および 、試薬の大部分を含むが、細胞はほとんど含まない。 白血球バッグ 30 には導出口 38 が設けられている。この出口は、Ｔ型アダプ ター 44 と抵抗管 46 を直列につなげた枝管 42 を通じて、血漿バッグ 40 と連 絡する。上清は、白血球バッグ 30 から、導管 42 から、導入口 48 を通じて血 漿バッグ 40 に排出される。一旦、上清が血漿バッグ 40 に導入されると、血漿 バッグ 40 は封印され、白血球バッグ 30 から切り離される。 次に、冷凍保存液バッグ 50 から冷凍保存液が、白血球バッグ 30 に導入され る。冷凍保存液バッグ 50 には、出口 52、枝管 54、および、抵抗要素 56 が、 配管 54にそって設けられている。これによって、冷凍保存液バッグは、Ｔ型ア ダプター 44 を介して、白血球バッグ 30 の導入口 38 と流体疎通性の連絡を持 つ。通常、3.8ml の冷凍保存液が、白血球バッグ 30 内に含まれる 15ml 中に導 入される。冷凍保存液の白血球バッグ 30 への導入は、比較的低速度で実行する のがきわめて好ましい。通常、3.8ml の冷凍保存液は、20 分の間隔をかけて白 血球バッグへ導入される。一方、その間、冷凍保存液を、白血球バッグの中身と 、手ないし、旋回攪拌装置によって絶えず混合する。好ましい冷凍保存液として は、ジメチルスルフォキシド（DMSO）（細胞内冷凍保存液）を、細胞外冷凍保存 液であるデキストランで 50% に希釈したものが挙げられる。本発明の一つの特 長は、抵抗要素 56 によって、細胞内冷凍保存液が、白血球バッグ 30 にきわめ て低速でしか進入できないようになっていることである。このため、細胞内冷凍 保存液は、濃度を増し、白血球バッグ 30 の内部に収められた白血球に浸透する が、その際、細胞に傷害を与えない。同様の効果を挙げるために、抵抗要素 56 の代わりに、計測器 58 を、枝管 54 に挿入し（もしも、管腔の狭小では、定常 な流速が得られないのであれば）、それによって、導入口 38 と流体連絡を取っ てもよい。計測器 58 はポンプであってもよい。また、一法として、冷凍保存液 バッグとポンプ設置は、注射器、または、その他の計測装置と交換してもよい。 なぜなら、このような装置は、冷凍保存液を、白血球バッグ 30 にゆっくりと添 加することを助けるからである。 冷凍保存液の物理的に予想される過程は、DMSO が、白血球膜を透過し、凍結 して細胞内で結晶化するにつれ、細胞内水の容量を減少させ、それによって、細 胞壁に損傷を与えるというものである。デキストランや、様々の溶解性澱粉、タ ンパク、糖などの細胞外性冷凍保存液は、白血球周囲に細胞外層を与え、これが 、細胞を絶縁被覆し、凍結時に、水が結晶を形成しようとする傾向、さらに、そ れによって細胞外液の浸透圧を過度に高くしようとする傾向から、細胞を守る。 もしも適当な処置を施さなければ、このいずれも、細胞壁の全体性を乱し、細胞 生存率を低下させる可能性のあるものである。比較的長時間にわたって、指定の 速度で冷凍保存液を供給することによって、細胞生存率は最大になる。なぜなら 、DMSO が、細胞内に拡散し、細胞膜横断性の平衡を実現することができ、かつ 、デキストランが周囲の血漿中に均一に希釈されるのに十分なほどの時間が与え られるからである。 好ましい実施態様の一例として、白血球バッグ 30 内の 15ml の白血球に対し て、3 と 8/10 ml の冷凍保存液が添加されたとしよう。この添加によって、バ ッグ30 内のDMSO の濃度は、10% になる。白血球バッグ 30 にはもう一つ出口 6 2 がある。これは、幹細胞凍結用バッグ 60 からのスパイク 64 を無菌的に受け 入れる。白血球バッグ 30 は、クランプ 67 によって調節される導管 66 によっ て、幹細胞凍結用バッグ 60 と連絡する。導入口 68 は、直立管を形成するよう 特殊の形態を取る。これによって、幹細胞混合液の直立柱が保持され、一連の区 画 70 への分配が可能になる。その後、これらの区画は、互いに、加熱封印 72 により隔てられる。これらの標本 70 は、一旦、ある特定の幹細胞凍結用バッグ 60 が、受容候補者にとって適当として選択されたあとで、輸血前に HLA の最 適適合を再確認するさいに、または、その他のテストのために使用することがで きる。 幹細胞凍結用バッグ 60 は、さらに、バッグ 60 の本体内部に複数の区画を持 つという特徴を有する。各区画には、特定単位の同定のためにマーク 75が印さ れており、これらは一連の防御壁を形成する。特に、幹細胞凍結用バッグ 60 は 、少なくとも第 1 の大区画 74 と、第 2 の小区画76とから成る。通常、大区画 74 と小区画 76 の比は、大区画（80％）、小区画（20％）である。バッグ 60 のこの区画は加熱封印 80 によって仕切られている。これらの区画が、充満後、 82 の両位置で加熱封印されると、幹細胞凍結用バッグは、互いに密着はしてい るが、独立な、二つの白血球容器を形成することになる。 各区画は、独自の出口と連絡する。大区画 74 は、独自の導入口 84 に連絡し 、小区画 76 も独自の導入口 86 に連絡する。さらに、加熱封印位置は、切り取 り線となる境界線 81を含んでいてもよい。この切り取り線は、大区画 74 を、 解凍することなく、小区画から切り離すためのものである。小区画 76 に含まれ る幹細胞は、その他の用途、例えば、幹細胞や原初細胞を、継代培養液中で培養 することによって、有効細胞の数を増やす用途のために割り当てることもできる 。大区画 74 の幹細胞は、移植材料として投与するまで静かに放置する。凍結用 バッグ 60 と、直立管・導入口 68 とは、ほとんど厚みを持たない。このような 特殊な寸法の意図するところは、区画 76、74、および、70 の白血球がみな均一 な、極小の厚みを持ち、それによって、その後の凍結処方が、ほぼ同一の調節速 度において凍結条件を実行できるようにするためである。 ある好ましい実施例では、約 19ml の治療用品が、凍結用バッグ 60 の中に含 まれる。幹細胞凍結用バッグ 60 は、例えば、液体窒素に浸して、徐々に極低温 に下げて凍結し、恒久保存とする。これによって、幹細胞は、一旦解凍されたな らば、量を回復し、高度の細胞生存性を示し得る状態で保存される。 ある凍結用バッグ 60 中の幹細胞を、移植処置に用いることが一旦決定された ならば、その幹細胞は、幹細胞と構成成分とが、固相から液相へと相転換する温 度にまで上げられ解凍される。次に、この幹細胞を洗浄し、凍結前に添加された 冷凍保存液を取り除く。できれば、この洗浄は、等張液で、コロイドが好ましい が、DMSO を除去するものであることが好ましい。例えば、5% のアルブミンと10 % のデキストランを、生食液に溶解した混合液を用いて、細胞外環境の DMSOを 希釈し、第二に、白血球内部の DMSO の濃度を下げる。その後、混合液を 400gs で、10 分間遠心し、上清を傾斜除去する。 前述したように、濃縮白血球は、3.8ml の冷凍保存液添加前に、約 15ml の容 量として存在していた。幹細胞凍結用バッグに収めると、約 4ml が第 2 区画76 に収納され、15ml が、第 1区画74に保持される。実際には、前述の 4ml よりわ ずかに少ない容量が割り当てられる。というのは、区画 70 に含まれる幹細胞標 本が、全体として、最大 1ml 含まれるからである。いずれにしろ、洗浄前の、 解凍済み白血球および幹細胞懸濁液は、容量として、10% の冷凍保存液を含む。 希釈、遠心、および、上清廃液後、沈殿した幹細胞（通常、3ml 未満）をもう一 度、受容者に投与するのに十分な容量まで、すなわち、15ml 以上に、希釈する 。この第 2 の希釈により、DMSO の濃度は、1% 未満になる。したがって、保持 される DMSO の量は、1/10g の桁になる。これは、従来の数値と比べるとはるか に少ない。従来においては、通常、10% DMSO が200ml、すなわち、この化合物が 20g も含まれていた。 さらに、上に開示された本発明に記載される治療用量は、特別の効力を持つ。 なぜなら、上記の処理によって、白血球から、これまでに受容者に対して悪化作 用を持つことが明らかにされている赤血球、血漿、冷凍保存液、遊離ヘモグロビ ンなどの大部分が取りのぞかれてあるからである。さらにまた、この処方では、 幹細胞・原初細胞の浸透圧を、10% DMSO 溶液の 1000 ミリオスモル以上に対し 、300ミリオスモルという正常範囲に回復させているからである。 凍結用バッグに保存される幹細胞は、液体窒素を用いて実現できるような極低 温に維持しなければならない。白血球細胞を 20ml の容量で供給することによっ て、従来、10 倍も大きい容量を持つ冷凍保存胎盤血（全血）に対し、保存スペ ースを確保することが問題とされていたが、その問題が、本発明による白血球分 離による、スペース要求の縮小によって解決された。 本発明の一つの特質として、投与される最終用品における DMSO が比較的低濃 度であることが挙げられる。もう一つの特質として、幹細胞や原初細胞の目立っ た損失なく、単位の中に含まれる赤血球を10 倍低い濃度に抑えたことが挙げら れる。赤血球数の低下は、解凍標本におけるヘモグロビン量を減少させ、さらに は、赤血球不適合性に関連する不都合を抑える。さらに、解凍後の用量に含まれ る白血球の生存率は、通常、従来のものの 3 から 4 倍も高い。これは、特に、 受容者自身の血漿に希釈して投与した場合はそうなる。試みとして、解凍白血球 を、20ml の血漿に希釈して、生存率を計測してみた。従来技術においては、洗 浄前の白血球生存率は、通常、20% の桁である。本発明によれば、DNA 蛍光染色 法、または、その他の生存率試験法を用いて調べてみると、単核細胞は 20% を はるかに越え、通常、90% 生存率よりも高かった。前記のように解凍して得たこ のような白血球濃縮物からの幹細胞・原初細胞を培養し、形成されたコロニーの 数に基づいて推定して得た生存細胞の数も、もとの数の 90% を越えていた。 これまでの議論は、胎盤幹細胞由来の臍帯血を用いることの好適性を中心に展 開してきたのであるが、その他の、抹消性幹細胞も同様に処理して、効果を表わ すことができる。さらに、本発明をこのように説明したことにより、前述し、か つ、以下に請求項で記載する本発明の範囲や、正統的な含意から逸脱することな しに、バッグセット、試薬や冷凍保存液の化学的性質、処理工程の詳細に多数の 構造的改良や調整を加えることが可能であることは、自ずから明らかであろう。

【手続補正書】 【提出日】１９９８年１月７日 【補正内容】 （１）請求の範囲を別紙の通り補正する。 （２）明細書第１４頁第２９行目の「抹消」を『末消』と補正する。 請求の範囲 １．供給源から血液を受け入れるのに適合した第 1 の血液バッグ； 前記血液バッグの中にあって凝固を阻止するための手段；前記血液バッグに分離 可能に結合される試薬；前記第 1 血液バッグから、血漿上清を含む白血球を分 離し、これを衛星白血球バッグに収納する手段；前記白血球バッグにおいて、血 漿から白血球を分離する手段；および前記白血球バッグに分離可能に結合し、前 記白血球バッグから排出される上清血漿を受け入れるための衛星血漿バッグ；を 組み 合わせて包含する、血液細胞を濃縮するためのシステム。 ２．さらに、前記白血球バッグに動作的に結合された冷凍保存手段を含む、請 求項１記載のシステム。 ３．さらに、幹細胞凍結用バッグを含み、このものは、前記白血球バッグに動 作的に結合し、前記白血球バッグからの内容を、前記幹細胞凍結用バッグに移送 するためのものである、請求項２記載のシステム。 ４．前記幹細胞凍結用バッグが内部に複数の区画を含む、請求項３記載のシス テム。 ５．前記複数の区画が前記区画を封鎖して独立した分離領域に分割する手段と 、前記分離領域において前記凍結用バッグの区画領域の由来を指示するための手 段を含む、請求項４記載のシステム。 ６．前記凍結用バッグの前記内容から冷凍保存液を洗浄除去するための手段を 含む、請求項５記載のシステム。 ７．さらに、前記白血球バッグに導入される前記冷凍保存液を計測するため の手段を含む、請求項６記載のシステム。 ８．さらに、一つのバッグから別のバッグへの通路を狭めるためのクランプ手 段を含む、請求項７記載のシステム。 ９．血液を第 1 の血液バッグに収納し；前記血液バッグの中の凝固を阻止し ；試薬手段を前記血液バッグに結合させ；前記第 1 の血液バッグから上清を分 離し、その上清を白血球バッグに収納し；前記白血球バッグにおいて血漿から白 血球を分離し；そして血漿バッグを前記白血球バッグに分離可能に結合させて、 白血球バッグから血漿を前記血漿バッグに排出させることを特徴とする、胎盤幹 細胞を濃縮する方法。 １０．さらに、冷凍保存手段を前記白血球バッグに結合させる工程を含む、請 求項９記載の方法。 １１．さらに、前記白血球バッグの内容を幹細胞凍結用バッグに移送し、幹細 胞凍結用バッグの内容を凍結する工程を含む、請求項１０記載の方法。 １２．さらに、前記幹細胞凍結用バッグの内容をその内容を凍結させる前に分 離して、複数の区画に分配する工程を含む、請求項１１記載の方法。 １３．さらに、幹細胞凍結用バッグの区画領域において、その中に含まれる細 胞の起源を特定できるようラベルする工程を含む、請求項１２記載の方法。 １４．さらに、幹細胞凍結用バッグから、その区画の一つを分離して、その内 容を確認する工程を含む、請求項１３記載の方法。 １５．幹細胞凍結用バッグの適合性を確認した段階で、そのバッグの内容を解 凍する工程を含む、請求項１４記載の方法。 １６．幹細胞凍結用バッグの 1区画の内容から、冷凍保存液を洗浄除去する工 程を含む、請求項１５記載の方法。 １７．幹細胞凍結用バッグの洗浄した内容を希釈し、その内容を患者に注入す る工程を含む、請求項１６記載の方法。 １８．溶液中の白血球を含み、それが、赤血球 100 個当たり少なくとも 1 個 の白血球という構成割合を持ち、幹、および、原初細胞の生存率が 80% を越え るものであることを特徴とする治療用品。 １９．溶液中の前記白血球において、細胞内の冷凍保存液濃度が 1% 未満であ る請求項１８記載の用品。 ２０．幹および原初細胞の浸透圧が、300 ミリオスモルの範囲にある請求項１ ８記載の用品。 ２１．前記用品の処方用量が10〜20ミリリットルの範囲にある、請求項２０記 載の用品。 ２２．幹、および、原初細胞が、最初に供与された血液に対して、約 90% の 割合で存在する、請求項２１記載の用品。 ２３．もとの血液供与体から、90% の赤血球の減少が見られる、請求項１８記 載の用品。 ２４．溶液中の白血球を含み、赤血球 100 個当たり少なくとも 1 個の白血球 という構成割合を持ち、下記の工程を経て形成される治療用品： 血液を、第 1 の血液バッグに収納し、 前記血液バッグの中の凝固を阻止し、 試薬手段を、前記血液バッグに結合させ、 前記第 1 の血液バッグから上清を分離し、その上清を白血球バッグ に収納し、 前記白血球バッグにおいて血漿から白血球を分離し、 血漿バッグを、前記白血球バッグに分離可能に結合させて、白血球バ ッグから血漿を、前記血漿バッグに排出させ、 冷凍保存手段を、前記白血球バッグに結合させ、 前記白血球バッグの内容を幹細胞凍結用バッグに移送し、 幹細胞凍結用バッグの内容を凍結し、 前記幹細胞凍結用バッグの内容を、その内容を凍結する前に、複数の 区画域に分配し、 幹細胞凍結用バッグの区画域を、その中に含まれる細胞の起源を特定 できるようにラベルし、 幹細胞凍結用バッグの区画の一つを、その内容を確認できるように取 り外し、 そのバッグの適合性を確認した段階で、幹細胞凍結用バッグの内容を 解凍し、 幹細胞凍結用バッグの一つの区画域の内容から冷凍保存液を洗浄除去 し、そして、 幹細胞凍結用バッグの洗浄された内容を希釈し、患者にその内容を注 入する。 ２５．胎盤血、臍帯血及び／又は末梢供与血から、赤血球と血漿の少なくとも 90% を、造血幹細胞および原初細胞が、少なくとも 80% の生存率を持つような 構成を維持しながら除去する方法であって、統合的、無菌的装置において下記の 工程を実行することを含む方法： 胎盤血、臍帯血、及び／又は、末梢供与血を、抗凝固剤と接触させて 、前記供与血の凝固を防ぎ、 前記抗凝固処理を施した血液を、凝集塊惹起性試薬と接触させて、前 記供与血に含まれる少なくとも 90% の赤血球が、凝集塊を形成するのを促進さ せ 、 前記凝集塊惹起性試薬に接触させた血液を軽度に遠心し、第 1 の沈 殿と、第 1 の上清とを得る、ただし、ここに、前記第 1 の沈殿は、前記供与血 に含まれる赤血球の少なくとも 90% を含む、 前記第 1 の上清を分離し、 前記第 1 の上清を遠心して、第 2 の沈殿と第 2 の上清を得る、た だし、ここに、前記第 2 の上清は、前記供与血に含まれる血漿の少なくとも 90 % を含む、かつ、 前記第 2 の上清を除去し、それによって、少なくとも 80% の生存率 を持つ造血幹細胞および原初細胞、ならびに、前記供与血に含まれる赤血球と血 漿の 10% 未満、から成る組成を保持する。 ２６．前記、統合された無菌装置が、一連の、互いに連結したバッグから成る 、請求項２５記載の方法。 ２７．前記抗凝固剤が、クエン酸、リン酸、および、デキストロースから成る 、請求項２５記載の方法。 ２８．凝集塊惹起剤がヒドロキシエチル澱粉から成る、請求項２５記載の方法 。 ２９．さらに、前記組成を、冷凍保存液に対して、十分な速度と量において接 触させ、それによって、前記組成に含まれる細胞を損傷することなく、冷凍保存 された組成を得、かつ、前記冷凍保存された組成を凍結する工程を含む、詰求項 ２５記載の方法。 ３０．前記冷凍保存液がジメチルスルフォキシドから成る、請求項２９記載の 方法。 ３１．前記冷凍保存液がさらにデキストランから成る、請求項３０記載の方法 。 ３２．冷凍保存された懸濁液中のジメチルスルフォキシドの最終濃度が 10%で ある、請求項３０記載の方法。 ３３．胎盤血、臍帯血、及び／又は、末梢供与血から、赤血球と血漿の少なく とも 90% を、造血幹細胞および原初細胞が少なくとも 80% の生存率を持つよう な構成を維持しながら除去する方法であって、下記の工程を、一連の、互いに連 結されたバッグにおいて、無菌的な条件下で実行することを含む方法： ある血液バッグの中の胎盤血、臍帯血及び／又は末梢供与血を、抗凝 固剤と接触させて、前記供与血の凝固を防ぎ、 前記血液バッグの中の、前記抗凝固処理を施した血液を、凝集塊惹起 性試薬と接触させて、前記供与血に含まれる少なくとも 90% の赤血球が、凝集 塊を形成するのを促進させ、 前記血液バッグを軽度に遠心し、第 1 の沈殿と、第 1 の上清とを得 る、ただし、ここに、前記第 1 の沈殿は、前記供与血に含まれる赤血球の少な くとも 90% を含む、 前記第 1 の上清を分離して、白血球バッグに導入し、 前記白血球バッグを遠心して、第 2 の沈殿と第 2 の上清を得る、た だし、ここに、前記第 2 の上清は、前記供与血に含まれる血漿の少なくとも 90 % を含む、そして、 前記第 2 の上清を血漿バッグに排出し、それによって、少なくとも8 0% の生存率を持つ造血幹細胞および原初細胞、ならびに、前記供与血に含まれ る赤血球と血漿の 10% 未満、から成る組成を、前記白血球バッグ中に保持する 。 ３４．前記抗凝固剤が、クエン酸、リン酸、および、デキストロースから成 る、請求項３３記載の方法。 ３５．前記凝集塊惹起剤がヒドロキシエチル澱粉から成る、請求項３３記載の 方法。 ３６．さらに、前記組成を、冷凍保存液に対して、十分な速度と量において接 触させ、それによって、前記組成に含まれる細胞を損傷することなく、冷凍保存 された組成を得、かつ、前記冷凍保存された組成を凍結する工程を含む、請求項 ３３記載の方法。 ３７．前記冷凍保存液がジメチルスルフォキシドから成る、請求項３６記載の 方法。 ３８．前記冷凍保存液がさらにデキストランから成る、請求項３７記載の方法 。 ３９．冷凍保存された懸濁液中のジメチルスルフォキシドの最終濃度が 10%で ある、請求項３８記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 コエルホ、フィリップ・ヘンリー アメリカ合衆国、カリフォルニア州、エ ル・ドラド・ヒルズ、ジオット・ウェイ 121 (72)発明者 スティーヴンス、クラッド・イー アメリカ合衆国、ニューヨーク州、ニュー ヨーク、イースト・シックスティフォー ス・ストリート 420、アパートメント ダブリュ８エフ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．供給源から血液を受け入れるのに適合した第 1 の血液バッグ； 前記血液バッグの中にあって凝固を阻止するための手段；前記血液バッグに分離 可能に結合される試薬；前記第 1 血液バッグから、血漿上清を含む白血球を分 離し、これを衛星白血球バッグに収納する手段；前記白血球バッグにおいて、血 漿から白血球を分離する手段；および前記白血球バッグに分離可能に結合し、前 記白血球バッグから排出される上清血漿を受け入れるための衛星血漿バッグ；を の組み合わせて包含する、血液細胞を濃縮するためのシステム。 ２．さらに、前記白血球バッグに動作的に結合された冷凍保存手段を含む、請 求項１記載のシステム。 ３．さらに、幹細胞凍結用バッグを含み、このものは、前記白血球バッグに動 作的に結合し、前記白血球バッグからの内容を、前記幹細胞凍結用バッグに移送 するためのものである、請求項２記載のシステム。 ４．前記幹細胞凍結用バッグが内部に複数の区画を含む、請求項３記載のシス テム。 ５．前記複数の区画が前記区画を封鎖して独立した分離領域に分割する手段と 、前記分離領域において前記凍結用バッグの区画領域の由来を指示するための手 段を含む、請求項４記載のシステム。 ６．前記凍結用バッグの前記内容から冷凍保存液を洗浄除去するための手段を 含む、請求項５記載のシステム。 ７．さらに、前記白血球バッグに導入される前記冷凍保存液を計測するため の手段を含む、請求項６記載のシステム。 ８．さらに、一つのバッグから別のバッグへの通路を狭めるためのクランプ手 段を含む、請求項７記載のシステム。 ９．血液を第１の血液バッグに収納し；前記血液バッグの中の凝固を阻止し； 試薬手段を前記血液バッグに結合させ；前記第 1 の血液バッグから上清を分離 し、その上清を白血球バッグに収納し；前記白血球バッグにおいて血漿から白血 球を分離し；そして血漿バッグを前記白血球バッグに分離可能に結合させて、白 血球バッグから血漿を前記血漿バッグに排出させることを特徴とする、胎盤幹細 胞を濃縮する方法。 １０．さらに、冷凍保存手段を前記白血球バッグに結合させる工程を含む、請 求項９記載の方法。 １１．さらに、前記白血球バッグの内容を幹細胞凍結用バッグに移送し、幹細 胞凍結用バッグの内容を凍結する工程を含む、請求項１０記載の方法。 １２．さらに、前記幹細胞凍結用バッグの内容をその内容を凍結させる前に分 離して、複数の区画に分配する工程を含む、請求項１１記載の方法。 １３．さらに、幹細胞凍結用バッグの区画領域において、その中に含まれる細 胞の起源を特定できるようラベルする工程を含む、請求項１２記載の方法。 １４．さらに、幹細胞凍結用バッグから、その区画の一つを分離して、その内 容を確認する工程を含む、請求項１３記載の方法。 １５．幹細胞凍結用バッグの適合性を確認した段階で、そのバッグの内容を解 凍する工程を含む、請求項１４記載の方法。 １６．幹細胞凍結用バッグの１区画の内容から、冷凍保存液を洗浄除去する工 程を含む、請求項１５記載の方法。 １７．幹細胞凍結用バッグの洗浄した内容を希釈し、その内容を患者に注入す る工程を含む、請求項１６記載の方法。 １８．溶液中の白血球から成り、それが、赤血球 100 個当たり少なくとも 1 個の白血球という構成割合を持ち、幹、および、原初細胞の生存率が 80% を越 えるものであることを特徴とする治療用品。 １９．溶液中の前記白血球において、細胞内の冷凍保存液濃度が 1% 未満であ る請求項１８記載の用品。 ２０．幹および原初細胞の浸透圧が、300 ミリオスモルの範囲にある請求項１ ８記載の用品。 ２１．前記用品の処方用量が10〜20ミリリットルの範囲にある、請求項２０記 載の用品。 ２２．幹、および、原初細胞が、最初に供与された血液に対して、約 90% の 割合で存在する、請求項２１記載の用品。 ２３．もとの血液供与体から、90% の赤血球の減少が見られる、請求項１８記 載の用品。 ２４．溶液中の白血球から成り、それが形成された赤血球 100 個当たり少な くとも１個の白血球という構成割合を持つ治療用品であって、下記の工程を経て 形成される治療用品： 血液を、第 1 の血液バッグに収納し、 前記血液バッグの中の凝固を阻止し、 試薬手段を、前記血液バッグに結合させ、 前記第 1 の血液バッグから上清を分離し、その上清を白血球バッグ に収納し、 前記白血球バッグにおいて血漿から白血球を分離し、 血漿バッグを、前記白血球バッグに分離可能に結合させて、白血球バ ッグから血漿を、前記血漿バッグに排出させ、 冷凍保存手段を、前記白血球バッグに結合させ、 前記白血球バッグの内容を幹細胞凍結用バッグに移送し、 幹細胞凍結用バッグの内容を凍結し、 前記幹細胞凍結用バッグの内容を、その内容を凍結する前に、複数の 区画域に分配し、 幹細胞凍結用バッグの区画域を、その中に含まれる細胞の起源を特定 できるようにラベルし、 幹細胞凍結用バッグの区画の一つを、その内容を確認できるように取 り外し、 そのバッグの適合性を確認した段階で、幹細胞凍結用バッグの内容を 解凍し、 幹細胞凍結用バッグの一つの区画域の内容から冷凍保存液を洗浄除去 し、そして、 幹細胞凍結用バッグの洗浄された内容を希釈し、患者にその内容を注 入する。 ２５．胎盤血、臍帯血及び／又は抹消供与血から、赤血球と血漿の少なくとも 90% を、造血幹細胞および原初細胞が、少なくとも 80% の生存率を持つような 構成を維持しながら除去する方法であって、統合的、無菌的装置において下記の 工程を実行することから成る方法： 胎盤血、臍帯血、及び／又は、抹消供与血を、抗凝固剤と接触させて 、前記供与血の凝固を防ぎ、 前記抗凝固処理を施した血液を、凝集塊惹起性試薬と接触させて、前 記供与血に含まれる少なくとも 90% の赤血球が、凝集塊を形成するのを促進し 、 前記凝集塊惹起性試薬に接触させた血液を軽度に遠心し、第 1 の沈 殿と、第 1 の上清とを得る、ただし、ここに、前記第 1 の沈殿は、前記供与血 に含まれる赤血球の少なくとも 90% を含む、 前記第 1 の上清を分離し、 前記第 1 の上清を遠心して、第 2 の沈殿と第 2 の上清を得る、た だし、ここに、前記第 2 の上清は、前記供与血に含まれる血漿の少なくとも 90 % を含む、かつ、 前記第 2 の上清を除去し、それによって、少なくとも 80% の生存率 を持つ造血幹細胞および原初細胞、ならびに、前記供与血に含まれる赤血球と血 漿の 10% 未満、から成る組成を保持する。 ２６．前記、統合された無菌装置が、一連の、互いに連結したバッグから成る 、請求項２５記載の方法。 ２７．前記抗凝固剤が、クエン酸、リン酸、および、デキストロースから成る 、請求項２５記載の方法。 ２８．凝集塊惹起剤がヒドロキシエチル澱粉から成る、請求項２５記載の方法 。 ２９．さらに、前記組成を、冷凍保存液に対して、十分な速度と量において接 触させ、それによって、前記組成に含まれる細胞を損傷することなく、冷凍保存 された組成を得、かつ、前記冷凍保存された組成を凍結する工程を含む、請求項 ２５記載の方法。 ３０．前記冷凍保存液がジメチルスルフォキシドから成る、請求項２９記載 の方法。 ３１．前記冷凍保存液がさらにデキストランから成る、請求項３０記載の方法 。 ３２．冷凍保存された懸濁液中のジメチルスルフォキシドの最終濃度が 10% である、請求項３０記載の方法。 ３３．胎盤血、臍帯血、及び／又は、抹消供与血から、赤血球と血漿の少なく とも 90% を、造血幹細胞および原初細胞が少なくとも 80% の生存率を持つよう な構成を維持しながら除去する方法であって、下記の工程を、一連の、互いに連 結されたバッグにおいて、無菌的な条件下に実行することから成る方法： ある 血液バッグの中の胎盤血、臍帯血及び／又は抹消供与血を、抗凝固剤と接触させ て、前記供与血の凝固を防ぎ、 前記血液バッグの中の、前記抗凝固処理を施した血液を、凝集塊惹起 性試薬と接触させて、前記供与血に含まれる少なくとも 90% の赤血球が、凝集 塊を形成するのを促進し、 前記血液バッグを軽度に遠心し、第 1 の沈殿と、第 1 の上清とを得 る、ただし、ここに、前記第 1 の沈殿は、前記供与血に含まれる赤血球の少な くとも 90% を含む、 前記第 1 の上清を分離して、白血球バッグに導入し、 前記白血球バッグを遠心して、第 2 の沈殿と第 2 の上清を得る、た だし、ここに、前記第 2 の上清は、前記供与血に含まれる血漿の少なくとも 90 % を含む、そして、 前記第 2 の上清を血漿バッグに排出し、それによって、少なくとも8 0% の生存率を持つ造血幹細胞および原初細胞、ならびに、前記供与血に含まれ る赤血球と血漿の 10% 未満、から成る組成を、前記白血球バッグ中に保持する 。 ３４．前記抗凝固剤が、クエン酸、リン酸、および、デキストロースから成る 、請求項３３記載の方法。 ３５．前記凝集塊惹起剤がヒドロキシエチル澱粉から成る、請求項３３記載の 方法。 ３６．さらに、前記組成を、冷凍保存液に対して、十分な速度と量において接 触させ、それによって、前記組成に含まれる細胞を損傷することなく、冷凍保存 された組成を得、かつ、前記冷凍保存された組成を凍結する工程を含む、請求項 ３３記載の方法。 ３７．前記冷凍保存液がジメチルスルフォキシドから成る、請求項３６記載の 方法。 ３８．前記冷凍保存液がさらにデキストランから成る、請求項３７記載の方法 。 ３９．冷凍保存された懸濁液中のジメチルスルフォキシドの最終濃度が 10% である、請求項３８記載の方法。