JPH10508469A

JPH10508469A - ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）菌からのヘモグロビン受容体

Info

Publication number: JPH10508469A
Application number: JP8513482A
Authority: JP
Inventors: ストジルヤコビック，イゴール; ソ，マグダレーン; ファ，ビビアン; ヘフロン，フレッド; ナッシ，グザビエール
Original assignee: オレゴン・ヘルス・サイエンシーズ・ユニバーシティ
Priority date: 1994-10-18
Filing date: 1995-10-17
Publication date: 1998-08-25
Also published as: FI971634A0; HUT77048A; NO971768L; WO1996012020A3; US7026157B1; WO1996012020A2; AU705509B2; AU4007395A; US6121037A; NO971768D0; CA2203116A1; FI971634A7

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規な細菌ヘモグロビン受容体タンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子に関する。細菌ヘモグロビン受容体タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、該核酸を含有する組換え発現構築物、それで形質転換した細胞、該ヘモグロビン受容体タンパク質の抗体およびエピトープについて分離、特徴化、診断的および治療的使用を対象としている。本発明は、ネイセリア（Ｎeisseria）種、特に N．meningitidis、その各血清型、および N．gonorrhoeae からのヘモグロビン受容体タンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子に特に関する。本発明のタンパク質、エピトープ、抗体、核酸の診断的および治療的使用の方法も提供され、Neisseria 種の病原菌の感染に対してヒトを免疫化するのに有効なワクチンを製造するために本発明のタンパク質、エピトープ、抗体および核酸を使用することが含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】ネイセリア（Ｎeisseria）菌からのヘモグロビン受容体本発明は、National Institute of Health 許可Ｒ０１ＡＩ３２４９３およびＲ０１ＡＩ２２９３３の下に政府支援によりなされた。米国政府は本発明について一定の権利を有する。発明の背景１.発明の分野本発明は、ある細菌種、特にＮeisseria菌種についてのヘモグロビン受容体遺伝子およびそれからコードされるタンパク質に関する。より特定的には、本発明は、ヘモグロビン受容体遺伝子Ｎeisseriaに対するワクチンおよび抗体を製造するのに有用なポリペプチドおよびペプチド、およびインビトロでこれらのポリペプチドおよびペプチドを製造する方法および手段に関する。更に、Ｎeisseria感染を検定し処置するのに有用な診断および治療方法および試薬、新規かつ効果的な抗Ｎeisseria剤を開発する方法も提供する。２.発明の背景Ｎeisseriaeは、ヒト病原性のpyogenic cocciの２種のグラム陰性菌、すなわちＮeisseria meningitidisおよびＮeisseria gonorrhoeaeを含む細菌の１属である。Ｎ.meningitidisはヒトの細菌髄膜炎の主な原因であり、特に小児に多い。この疾患は、感染者の鼻咽腔に細菌が無症状で保持され、血液および脳脊髄膜へ侵入することを特徴とする。Ｎeisseria meningitidisは、世界中で小児および健常成人における細菌髄膜炎の主な原因の一つである。この疾患が重篤なのは、髄膜炎菌感染が健康であった者を２４時間以内に死に至らしめることから明らかである。Ｎ.meningitidis はポリサッカライド莢膜を有し、その成分の抗原性ポリサッカライド分子は多種であって様々な血清型（serotype）に分類されている。そのうち、血清型Ａは代表的な流行株であり、ＢおよびＣ株は一般的な流行株であり、Ｃ株は時に爆発的な流行をもたらす。Ａ株として知られるすべては、その外側の膜上に同じタンパク質抗原を有し、一方血清型Ｂは主な外側膜タンパク質抗原（ポリサッカライドに対して）の存在に基づく多くの血清型すなわち分類型を有する。Ｎ.meningitidisなどの病原体の生存は、その宿主の一連の防衛メカニズムを打破する能力にかかっている。侵入細菌に対する非特異的防衛メカニズムは、鉄が殆どの細菌病原体に必要な栄養であるので、組織における鉄の活性を制限することにある（Weinberg，1984，Physiological．Rev．64;65-102）。ヒトの非常に大部分の鉄は、ヘモグロビン（７６％）またはフェリチン（２３％）の形で細胞外に存在している。残りは、トランスフェリンおよびラクトフェリンなどの宿主の鉄−結合タンパク質に細胞外で結びついて発見され得る（Otto et al.,1992 ,Crit．Rev．Microbiol．18:217-233）。病原細菌は、非常に特殊でかつ効果的な鉄同化システムをつくりあげてこの鉄 −制限的環境に適応している。これら細菌の大多数はサイドローフォア、小さい非タンパク質鉄キレートを分泌し、これは、その鉄に対する非常に高い親和性（ III）によって、環境からごく少量の鉄を集め、細菌細胞に鉄をもどす（Baggs a nd Neilands，1987，Microbiol．Rev．51:509-518; Braun and Hantke，1991，i n Winkelmann(ed.)，Handbook of Microbial Iron Chelates，CRC Press: Boca Raton，Fla.,pp107-138）。一方、Ｎeisseriae種（Archilbald and DeVoe,1979，FEMS Microbiol.Lett.6: 159-162;Mickelson et al.,1982，Infect．Immun.35:915-920; Dyer et al.,198 7，Infect．Immun．55:2171-2175），Haemophilus influenzae（Coulton and Pa ng，1983，Curr．Microbiol.9:93-98; Schryvers，1988，Mol．Microbiol.2:467 -472; Jarosik et al.,1994，Infect.Immun.62:2470-2477），Vibrio cholerae( Stoebner and Payne,1988，Infect．Immun．56:2891-2895;Henderson and Payne ,1994，J.Bacteriol.176:3269-3277），Yersiniae(Stojiljkovic and Hantke，1 992．EMBO J.11:4359-4367）およびActinobacillus pleuropneumoniae（Gerlach et al.,1992，Infect.Immun.60:3253-3261）などのいくつかの病原細菌は、宿主から鉄を引き離すのに、より洗練されたメカニズムを発展させている。これらの病原体は、ラクトフェリン、トランスフェリンおよびヘム含有化合物などの宿主の鉄結合タンパク質と直接的に結合することができ、そしてこれらを鉄の唯一の供給源として利用する。Ｎ.meningitidisの悪性における鉄の重要性は、動物モデルシステムとしてマウスを用いたインビボ研究によって明らかにされた（Calver et al.,1976，Can. J.Microbiol.22:832-838; Holbien et al.,1981，Infect.Immun.34:120-125）。特殊な鉄−調節外膜受容体は、Ｎeisseriaeにおいてラクトフェリン−およびトランスフェリン−鉄の結合および利用に関与していることが示されている（Schr yvers and Morris，1988，Infect.Immun.56:1144-1149 and Mol.Microbiol.2:28 1-288; Legrain et al.,1993，Gene 130:81-90; Pettersson et al.,1993，Infe ct.Immun.61:4724-4733 and 1994，J.Bacteriol.176:1764-1766）。これらの受容体は、他のグラム陰性菌のサイドロフォアおよびビタミンＢ１２の受容体と、有意のアミノ酸類似性を、および、おそらく鉄取り込みメカニズムをも共有している（Cornelissen et al.,1993，J.Bacteriol.174:5788-5797）。対照的に、ヘモグロビン、ヘモ鉄および同様の成分を利用するＮeisseriaeのメカニズムは、現在のところ報告されていない。最近、ヘモグロビン−結合および／またはヘミン−結合活性を有するいくつかのタンパク質が鉄制限Ｎ.meningitidisおよびＮ.gonorrhoeaeのすべての膜において見い出されている。 Lee and Hill,1992，J.gen.Microbiol.138:2647-2656は、Ｎ.meningitidisの分離した外側膜によって特殊なヘモグロビン結合を開示している。 Martek and Lee,1994,Infect.Immun.62:700-703は、Ｎ.meningitidisによるヘム鉄の取得が髄膜炎トランスフェリン−結合タンパク質に関係していないことを開示している。 Lee,1994,Microbiol.140:1473-1480は、Ｎ.meningitidisからのヘミン結合タンパク質の生化学的分離および特徴について記載している。これらのタンパク質はＮ.meningitidisにおけるヘミン利用システムの成分のようではあるが、ヘミンおよび／またはヘモグロビン利用についてのこれらタンパク質の正確な役割は現在も明白でない。Ｎeisseriaの生長が宿主の保有する鉄に依存していることは、新しく、効果的な治療戦略の開発について有望な道程を示すものである。歴史的に、Ｎ.meningi tidisおよびＮ.gonorrhoeae両者の感染は、スルホン剤で化学予防的に処置されて来た。しかし、スルホンアミド抵抗性株の発生と共に抗生物質療法などの他の治療法の必要が生じて来た。さらに最近では、薬剤療法では高価ペニシリンの投与が選択さえている。しかし、感染後早く治療を始めないと、抗菌療法の成功率は低くなっている。淋菌感染もペニシニン、アミノシリン、アモニシリン、テトラサイクリン塩酸塩およびスペクチノマイシンで治療されている。不幸なことに、ペニシリナーゼ −生産菌による感染の発症が増加しているので、いくつかの新しい、より高価な β−ラクタム抗生物質が治療に用いられている。存在している抗生物質が淋病の重症を軽減しているという事実にもかかわらず、これらの使用は全人口における感染の発症を低下していない。髄膜炎感染症の予防は、化学的予防法および免疫予防法によって試みられた来た。現在、リファンピンおよびミノサイクリンが使用されているが、この治療の感染者に密に接触するヒトについてのみであり、多くの欠点がある。meningococ cal髄膜炎に対する唯一の市販ワクチンはその主要成分として細菌ポリサッカライド莢膜を有する。成人でこのワクチンは血清型Ａ、Ｃ、ＹおよびＷＩ３５に対して効く。血清型Ｂに対しては効果がなく、また小児で血清型Ｃ株に対して効果がない。このように、Ｎ.gonorrhoeaeに対しては免疫的予防処置はなされていない。従って、必要なのは、より効果的で、長い効力のワクチンを含むmeningococca l髄膜炎および淋病に対する予防的療法であり、これはＮ.meningitidisのすべての血清型およびＮ.gonorrhoeaeのすべての血清型に交叉して有効でありたい。付言すると、meningococcalおよびgonococcal感染に対するよりよい方法を必要としている。本発明の要約本発明は、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質をコードする遺伝子のクローニング、発現および機能的特徴付に関する。より特定的には、本発明は、Ｎeisser ia種特にＮeisseria meningitidisおよびＮ.gonorrhoeaeからのヘモグロビン受容体タンパク質をコードする遺伝子に関する。本発明は、新規の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸の種類を含む。本発明はまた、これらの細胞遺伝子の同核ヘモグロオビン受容体タンパク質の推論アミノ酸配列を提供する。本発明は、形質転換細胞の培養物、望ましくは細菌細胞であり、本発明のヘモグロビン受容体タンパク質を発現する形質転換細菌細胞の培養物において、核酸、核酸ハイブリッド化プローブ、ヘモグロビン受容体タンパク質を発現し得る組換え発現構築物を供給する。本発明はまた細胞特にＮeisseriaなどの細胞においてヘモグロビン受容体タンパク質遺伝子を不活性化するための遺伝子ノックアクトベクター、例えば、相同遺伝子組換えおよび他のメカニズム、およびヘモグロビン受容体タンパク質帰無ミュータント細胞の培養物を提供する。本発明は、本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質の相同的製法およびヘモグロビン受容体タンパク質に対する抗体およびそのエピトープを提供する。この受容体タンパク質を特徴化する方法、およびこの受容体に関する薬理学的利用特に殺菌的、静菌的利用の薬剤の開発においてタンパク質を使用する方法もまた本発明により提供されるものである。他の本発明の実施態様において、本発明の抗Ｎeisseriaヘモグロビン受容体タンパク質抗体の使用を含括する診断法およびその試薬が提供される。さらなる実施態様において、本発明の抗Ｎeisseriaヘモグロビン受容体タンパク質抗体の使用を含括する治療法およびその薬剤が提供される。さらに、核酸ハイブリッド化法および／またはインビトロ増幅方法を用いて、Ｎeisseria感染の存在を知るためのプローブとして本発明の抗Ｎeisseriaヘモグロビン受容体タンパク質抗体の使用を含括する診断法およびその試薬が提供される。本発明の追加の実施態様として、本発明のＮeisseriaヘモグロビン受容体遺伝子およびそのフラグメントのアンチセンス転写および形質転換ノックアウトベクターを生産するための形質発現構築物を含む、本発明のＮeisseriaヘモグロビン受容体タンパク質をコードする核酸の使用からなる治療方法およびその薬剤がある。本発明はまた、Ｎeisser ia種細菌に病原感染に対する非発症関連免疫の発生のためのワクチンの成分として、Ｎeisseriaヘモグロビン受容体タンパク質およびそのエピトープを提供する。第１の観点では本発明は、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。望ましい実施態様として、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質遺伝子をＮeisseria種の細菌から分離する。特定的に望ましい実施態様においてヘモグロビン受容体タンパク質遺伝子はＮeisser ia meningitidis血清型Ｃから分離する。この実施態様の特定例において、核酸は、Ｎ.meningitidis遺伝子ＤＮＡの３.３kilobase(ｋb)BamＨＩ/ＨindIIIフラグメントを有している。この実施態様において、ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン受容体遺伝子を含有する、７９２アミノ酸をコードするＮ.meningitidis遺伝子ＤＮＡの２３７６ヌクレオチドの開放読み枠を含む。本発明の実施態様においてＮ.meningitidisヘモグロビン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は図２（配列番号１）に示した配列である。ここに開示されたＮ.meningitidis遺伝子は、必要な程度に、そこにコードされたタンパク質のアミノ酸配列によって定義されていることが分かるであろう。このアミノ酸配列は図２に示す（配列番号２）。図２（配列番号１）に示した特定のヌクレオチド配列は、遺伝子暗号の縮重により、ヘモグロビン受容体タンパク質をコードする均等のヌクレオチド配列の多くの一つにすぎないこと、およびこのような他のすべての均等のヌクレオチド配列が本発明の開示したヌクレオチド配列の範囲に明らかに入ること、が理解されるであろう。また、このヌクレオチド配列のいかなるミュータントあるいは対立遺伝子変形も、天然に生じたものあるいはインビトロでの化学的あるいは遺伝子学的修飾によるもののいずれであっても、本発明に含まれる。かかる変種は、ここに開示したＮ.meningitidisヘモグロビン受容体タンパク質に対応するヌクレオチド配列として、基本的に同じヌクレオチド配列を有すると理解される。本発明の本観点の他の特定的に望ましい実施態様において、ヘモグロビン受容体ヌクレオチド遺伝子はＮeisseria meningitidis、血清型Ａから分離される。この実施態様の特定例において、核酸は、Ｎ.meningitidis、血清型Ａ遺伝子ＤＮＡの２３７３basepair（bp）ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを含む。この場合、ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン受容体遺伝子を含む７９０アミノ酸をコードするＮ.meningitidis遺伝子ＤＮＡの２３７３ヌクレオチドの開放読み枠を含む。本発明のこの実施態様においてＮ.meningitidisヘモグロビン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は、図７（配列番号３）に示す配列である。ここに開示されたＮ.meningitidis遺伝子は、必要な程度に、そこにコードされたタンパク質のアミノ酸配列によって定義されていることが分かるであろう。このアミノ酸配列は図７に示す（配列番号４）。図７（配列番号３）に示した特定のヌクレオチド配列は、遺伝子暗号の縮重により、ヘモグロビン受容体タンパク質をコードする均等のヌクレオチド配列の多くの一つにすぎないこと、およびこのような他のすべての均等のヌクレオチド配列が本発明の開示したヌクレオチド配列の範囲に明らかに入ること、が理解されるであろう。また、このヌクレオチド配列のいかなるミュータントあるいは対立遺伝子変形も、天然に生じたものあるいはインビトロでの化学的あるいは遺伝子学的修飾によるもののいずれであっても、本発明に含まれる。かかる変種は、ここに開示したＮ.meningitidisヘモグロビン受容体タンパク質に対応するヌクレオチド配列として、基本的に同じヌクレオチド配列を有すると理解される。本発明の本観点の他の特定的に望ましい実施態様において、ヘモグロビン受容体ヌクレオチド遺伝子はＮeisseria meningitidis、血清型Ｂから分離される。この実施態様の特定例において、核酸は、Ｎ.meningitidis、血清型Ａ遺伝子ＤＮＡの２３７６basepair（bp）ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを含む。この場合、ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン受容体遺伝子を含む７９１アミノ酸をコードするＮ.meningitidis遺伝子ＤＮＡの２３７３ヌクレオチドの開放読み枠を含む。本発明のこの実施態様においてＮ.meningitidisヘモグロビン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は、図８（配列番号５）に示す配列である。ここに開示されたＮ.meningitidis遺伝子は、必要な程度に、そこにコードされたタンパク質のアミノ酸配列によって定義されていることが分かるであろう。このアミノ酸配列は図８に示す（配列番号６）。図８（配列番号５）に示した特定のヌクレオチド配列は、遺伝子暗号の縮重により、ヘモグロビン受容体タンパク質をコードする均等のヌクレオチド配列の多くの一つにすぎないこと、およびこのような他のすべての均等のヌクレオチド配列が本発明の開示したヌクレオチド配列の範囲に明らかに入ること、が理解されるであろう。また、このヌクレオチド配列のいかなるミュータントあるいは対立遺伝子変形も、天然に生じたものあるいはインビトロでの化学的あるいは遺伝子学的修飾によるもののいずれであっても、本発明に含まれる。かかる変種は、ここに開示したＮ.meningitidisヘモグロビン受容体タンパク質に対応するヌクレオチド配列として、基本的に同じヌクレオチド配列を有すると理解される。本発明の本観点の他の特定的に望ましい実施態様において、ヘモグロビン受容体ヌクレオチド遺伝子はＮeisseria gonorrhoeaeから分離される。この実施態様の特定例において、核酸は、Ｎ.gonorrhoeae遺伝子ＤＮＡの２３７８basepair（ bp）ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントを含む。この場合、ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン受容体遺伝子を含む７９１アミノ酸をコードするＮ.gonorrh oeae遺伝子ＤＮＡの２３７３ヌクレオチドの開放読み枠を含む。本発明のこの実施態様においてＮ.gonorrhoeaeヘモグロビン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は、図９（配列番号７）に示す配列である。ここに開示されたＮ.gonorrhoeae遺伝子は、必要な程度に、そこにコードされたタンパク質のアミノ酸配列によって定義されていることが分かるであろう。このアミノ酸配列は図９に示す（配列番号８）。図９（配列番号７）に示した特定のヌクレオチド配列は、遺伝子暗号の縮重により、ヘモグロビン受容体タンパク質をコードする均等のヌクレオチド配列の多くの一つにすぎないこと、およびこのような他のすべての均等のヌクレオチド配列が本発明の開示したヌクレオチド配列の範囲に明らかに入ること、が理解されるであろう。また、このヌクレオチド配列のいかなるミュータントあるいは対立遺伝子変形も、天然に生じたものあるいはインビトロでの化学的あるいは遺伝子学的修飾によるもののいずれであっても、本発明に含まれる。かかる変種は、ここに開示したＮ.gonorrhoeaeヘモグロビン受容体タンパク質に対応するヌクレオチド配列として、基本的に同じヌクレオチド配列を有すると理解される。本発明はまた細菌ヘモグロビン受容体タンパク質を提供する。望ましい実施態様において細菌ヘモグロビン受容体タンパク質はＮeisseria種の細胞から分離される。特定の望ましい実施態様において、ヘモグロビン受容体タンパク質はＮei sseria meningitidisから分離される。この具体的な特定の例においてタンパク質はＮ.meningitidis血清型Ｃから由来し、７９２のアミノ酸配列を含んでいる。本発明のこの実施態様において、Ｎ.meningitidis血清型Ｃヘモグロビン受容体タンパク質のアミノ酸配列は図２に示す配列である（配列番号２）。他の実施態様においてタンパク質はＮ.meningitidis血清型Ａから由来し、７９０のアミノ酸配列を含んでいる。本発明のこの実施態様において、Ｎ.meningitidis血清型Ａヘモグロビン受容体タンパク質のアミノ酸配列は図７に示す配列である（配列番号４）。さらに他の実施態様においてタンパク質はＮ.meningitidis血清型Ｂから由来し、７９１のアミノ酸配列を含んでいる。本発明のこの実施態様において、Ｎ.meningitidis血清型Ｂヘモグロビン受容体タンパク質のアミノ酸配列は図８に示す配列である（配列番号６）。本発明の実施態様においてタンパク質はＮ.gonorrhoeaeから由来し、７９１のアミノ酸配列を含んでいる。本発明のこの実施態様において、Ｎ.gonorrhoeaeヘモグロビン受容体タンパク質のアミノ酸配列は図９に示す配列である（配列番号８）。また、本発明の範囲に明示的に含まれるのは、関係の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質、とくにＮeisseria種から分離されたタンパク質であり、これらは、基本的におなじアミノ酸配列を有し、ここに記載したＮ.meningitidisおよびＮ.gonorrhoeaeのヌクレオチド配列によりコードされるヘモグロビン受容体タンパク質として基本的に同じ生物的性質を有する。他の観点では、本発明は大略８５.５kiloＤalton（kＤ）の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質またはその誘導体を提供し、この大きさは、その翻訳後修飾前のタンパク質の大きさであると理解される。また、還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したところでは９０ｋＤの受容体を提供する。望ましい実施態様において細菌ヘモグロビン受容体タンパク質がＮeisseria種の細菌から分離される。特に望ましい実施態様において細菌ヘモグロビン受容体タンパク質がＮeisseria meningitidis種の細菌から分離される。本発明の本観点の１実施態様において、タンパク質はＮ.meningitidis 血清型Ｃから分離され、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質および望ましいその誘導体のアミノ酸配列は、図２に示す細菌ヘモグロビン受容体タンパク質のアミノ酸配列である（配列番号２）。本発明の本観点の第２の実施態様において、タンパク質はＮ.meningitidis血清型Ａから分離され、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質および望ましいその誘導体のアミノ酸配列は、図７に示す細菌ヘモグロビン受容体タンパク質のアミノ酸配列である（配列番号４）。本発明の本観点の第３の実施態様において、タンパク質はＮ.meningitidis血清型Ｂから分離され、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質および望ましいその誘導体のアミノ酸配列は、図８に示す細菌ヘモグロビン受容体タンパク質のアミノ酸配列である（配列番号６）。本発明の本観点の１実施態様において、タンパク質はＮ.gonorrhoeae から分離され、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質および望ましいその誘導体のアミノ酸配列は、図９に示す細菌ヘモグロビン受容体タンパク質のアミノ酸配列である（配列番号８）。本発明は、ここに提供されるヌクレオチド配列から誘導されるヌクレオチドプローブを提供する。本発明は、細菌メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または細菌ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から分離されるプローブ、およびここに提供される配列情報を利用して合成的にまたはインビトロ増幅法によりつくられるプローブを含む。本発明は、オリゴヌクレオチド、ニック− トランスレートランダムプライムオリゴヌクレオチドまたは本発明を具体化するｃＤＮＡあるいはゲノムクローンを用いて作製したインビトロ増幅プローブ、および本発明を具体化するｃＤＮＡあるいはゲノムクローンのヌクレオチド配列情報を用いて化学的に合成したオリゴヌクレオチドおよび他の合成プローブを特に含むが、これらに限定されない。本発明の別の対象は、ヒトのＮeisseria感染の診断の生物学的試料におけるＮ eisseria種の細菌、特にＮ.meningitidisおよびＮ.gonorrhoeaeの存在を検出するため、ヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを提供することである。これらの生物学的試料には、血液、尿、精液、粘液、脳脊髄液、腹膜液、腹水を含み、同様に口腔、尿道、肛門、直腸および他の器官の上皮から収集した細胞も含む。本発明は、本発明の核酸実施態様におけるヌクレオチド配列によりコードされるペプチドも含む。本発明は、ヘモグロビン受容体タンパク質−特異抗体の産生のための抗原として用いられる、天然のおよび合成のペプチドのいずれをも含む。本発明はまた、モノクローナル抗体などの抗体、かかる抗体を産生する細胞および細胞培養物をも含む。本発明はまた、本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に対する、またはそのエピトープ抗体を提供する。本発明の対象は、本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に免疫学的に活性な抗体を提供することでもある。本発明のより特定の対象は、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に対するモノクローナル抗体を提供することである。望ましい実施態様において、Ｎeisseria種の細菌から分離された細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に対する抗体が得られる。特に望ましい実施態様において、この抗体は、Ｎeisseria meningitidis血清型Ａ、ＢまたはＣから分離された細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に特異的である。別の特に望ましい実施態様において、この抗体は、Ｎeisseria gonorrhoeaeから分離された細胞ヘモグロビン受容体タンパク質に特異的である。かかる抗体を産生するハイブリドーマ細胞ラインも本発明の対象である。かかる細胞ラインは、非免疫グロブリン産生マウスミエローマ細胞ラインと本発明の精製ヘモグロビン受容体タンパク質により免疫されたマウス由来の脾細胞または細菌ヘモグロビン受容体タンパク質の抗原またはエプトープを発現する細胞との融合の結果として生産され得る。本発明はまた、かかる抗体を産生するハイブリドーマ細胞ラインを提供し、生きているマウスに注射されて、かかる抗体を含む腹水をマウスから提供する。望ましい実施態様において、提供される抗体はＮei sseria種の細菌から分離された細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に対する。特に望ましい実施態様において、かかる抗体は、Ｎeisseria meningitidis血清型Ａ、ＢまたはＣから分離されたヘモグロビン受容体タンパク質に特異的である。別の特に望ましい実施態様において、かかる抗体は、Ｎeisseria gonorrhoeaeから分離されたヘモグロビン受容体タンパク質に特異的である。本発明の更なる対象は、本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質の免疫活性エピトープを提供することである。本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に対する免疫活性のキメラ抗体も本発明の範囲内である。望ましい実施態様において、提供される抗体およびエピトープは、Ｎeisseria種細菌から分離される細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に対してつくられるかあるいは誘導されるものである。望ましい特定的実施態様において、提供される抗体およびエピトープは、Ｎeisseria meningitidis血清型Ａ、ＢまたはＣから分離される細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に対してつくられるか、あるいは誘導されるものである。望ましい実施態様において、提供される抗体およびエピトープは、Ｎeisseria gonorrhoeaeから分離される細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に対してつくられるか、あるいは誘導されるものである。本発明は、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質をコードするヌクレオチドを含む組換え発現構築物を提供し、この構築物は、構築物で形質転換された細胞の培養においてコードヘモグロビン受容体タンパク質を発現し得る。かかる構築物の望ましい実施態様は、図２に示されるＮeisseria meningitidis血清型Ｃヘモグロビン受容体タンパク質であり（配列番号１）、かかる構築物は、構築物で形質転換された細胞の培養においてコードヘモグロビン受容体タンパク質を発現し得る。かかる構築物の望ましい他の実施態様は、図７に示されるＮeisseria menin gitidis血清型Ａヘモグロビン受容体タンパク質であり（配列番号３）、かかる構築物は、構築物で形質転換された細胞の培養においてコードヘモグロビン受容体タンパク質を発現し得る。かかる構築物の他の望ましい実施態様は、図８に示されるＮeisseria meningitidis血清型Ｂヘモグロビン受容体タンパク質であり（配列番号５）、かかる構築物は、構築物で形質転換された細胞の培養においてコードヘモグロビン受容体タンパク質を発現し得る。本発明はまた、ＺＮ.gonor rhoeaeから分離されるヘモグロビン受容体タンパク質遺伝子をコードする組換え発現構築物を提供する。かかる構築物の望ましい特定的実施態様は、図９に示されるＮeisseria gonorrhoeaeヘモグロビン受容体タンパク質であり（配列番号７）、かかる構築物は、構築物で形質転換された細胞の培養においてコードヘモグロビン受容体タンパク質を発現し得る。本発明はまた、本発明の組換え発現構築物で形質転換された細胞、望ましくは細菌細胞の培養物を提供する。かかる形質転換は、形質転換構築物中でコードされた細菌ヘモグロビン受容体タンパク質を発現することができ、また発現した。本発明はまた、本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質を含む原始核細胞膜のタンパク質調製物をその範囲に含む。原始核細胞膜は、本発明の組換え発現構築物で形質転換した原始核細胞膜の培養物から誘導される。本発明はまた、ヒトにおけるＮeisseria種の細菌感染の存在の検定のための診断試薬およびその試薬を用いた方法を提供する。望ましい実施態様において、かかる診断試薬は、細胞ヘモグロビン受容体タンパク質に免疫学的に活性な抗体を含む。望ましい実施態様においてかかる抗体は、Ｎeisseria種の細菌から分離された細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に対してつくられる。特に望ましい実施態様において、かかる抗体は、Ｎeisseria meningitidis血清型Ａ、ＢまたはＣから分離された細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に特異的である。他の特に望ましい実施態様において、かかる抗体は、Ｎeisseria gonorrhoeaeから分離された細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に特異的である。本発明の本観点の他の実施態様は、診断用試薬および試薬を用いた方法を提供し、この試薬は細菌ヘモグロビン受容体遺伝子を含む核酸ハイブリダイデイションプローブである。望ましい実施態様においてヘモグロビン受容体タンパク質遺伝子はＮeisseria種の細菌から分離される。特定の望ましい実施態様においてヘモグロビン受容体タンパク質遺伝子はＮeisseria meningitidisから分離される。本発明のこの実施態様の特定の例において、核酸プローブは、Ｎ.meningiti dis血清型ＣゲノムＤＮＡの３.３kilobase（kb）ＢamＨＩ／ＨindIIIフラグメントの特殊にハイブライズされたフラグメントを含む。この実施態様において、ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン受容体遺伝子を含む７９２アミノ酸をコードするＮ.meningitidis血清型ＣゲノムＤＮＡの２３７６ヌクレオチドの開放読み枠のすべてまたは特殊にハイブライズされたフラグメントを含む。本発明のこの実施態様において、Ｎ.meningitidis血清型Ｃヘモグロビン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は、図２に示される配列である（配列番号１）。本発明のこの他の実施態様の特定の例において、核酸プローブは、Ｎ.meningitidis血清型ＡゲノムＤＮＡの２３７３ｂｐ、ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントの特殊にハイブライズされたフラグメントを含む。この実施態様において、ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン受容体遺伝子を含む７９０アミノ酸をコードするＮ.meningitidi s血清型ＡゲノムＤＮＡの２３７０ヌクレオチドの開放読み枠のすべてまたは特殊にハイブライズされたフラグメントを含む。本発明のこの実施態様において、Ｎ.meningitidis血清型Ｂヘモグロビン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は、図７に示される配列である（配列番号３）。本発明の他の実施態様の特定の例において、核酸プローブは、Ｎ.meningitidis血清型ＢゲノムＤＮＡの２３７６ｂｐ、ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントの特殊にハイブライズされたフラグメントを含む。この実施態様において、ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン受容体遺伝子を含む７９１アミノ酸をコードするＮ.meningitidis血清型ＢゲノムＤＮＡの２３７３ヌクレオチドの開放読み枠のすべてまたは特殊にハイブライズされたフラグメントを含む。本発明のこの実施態様において、Ｎ.meningitidis血清型Ｂヘモグロビン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は、図８に示される配列である（配列番号５）。本発明はまたＮ.gonorrhoeaeから分離された細菌ヘモグロビン受容体遺伝子を含む核酸ハイブリダイデイションプローブを提供する。本発明のこの実施態様の特定の例において、核酸プローブは、Ｎ.gonorrhoeaeゲノムＤＮＡの２３７８ｂｐ、ポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントの特殊にハイブライズされたフラグメントを含む。この実施態様において、ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン受容体遺伝子を含む７９１アミノ酸をコードするＮ.meningitidi s血清型ＡゲノムＤＮＡの２３７３ヌクレオチドの開放読み枠のすべてまたは特殊にハイブライズされたフラグメントを含む。本発明のこの実施態様において、Ｎ.gonorrhoeaeヘモグロビン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は、図９に示される配列である（配列番号７）。用語“特殊な−ハイブリダイズ”は、細菌ヘモグロビン受容体遺伝子をコードする核酸フラグメントを記述するのに用いられているときは、かかるフラグメントの核酸ハイブリダイデイションが高ストリンジェンシイ条件で安定であることを意味している。“高ストリンジェンシイ”は分子生物学の当業者に理解されているところである。本発明はまた、ヒトにおけるＮeisseria種の細菌感染を処置する薬剤およびそれを用いる方法を提供する。望ましい実施態様において、かかる薬剤は、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に免疫学的に活性な抗体を含む。特定の望ましい実施態様において、かかる抗体はＮeisseria meningitidis血清型Ａ、ＢまたはＣから分離されたヘモグロビン受容体タンパク質に特異的である。他の望ましい実施態様において、かかる抗体はＮeisseria gonorrhoeaeから分離されたヘモグロビン受容体タンパク質に特異的である。本発明のこの観点において提供される薬剤は、適当なアジュバントなどの薬学的に許容される担体中の抗体である。他の実施態様において、かかる抗体は、Ｎeisseria種の細菌、とくにＮ.meningitidi sおよびＮ.gonorrhoeaeに対して有効な殺菌または静菌剤と共有的に共役している。本発明のこの観点の他の実施態様は、治療薬剤およびかかる薬剤を使用する方法を提供し、この薬剤は本発明の組換え発現構築物またはアンチセンス方向にヘモグロビン受容体をコードする核酸を発現するその相同体を含む。望ましい実施態様において細菌ヘモグロビン受容体タンパク質遺伝子はＮeisseria種の細菌から分離される。特に望ましい実施態様において細菌ヘモグロビン受容体タンパク質遺伝子はＮeisseria meningitidisから分離される。本発明のこの実施態様の特定の例において核酸は、Ｎ.meningitidis血清型ＣゲノムＤＮＡの３.３kiloba se（kb）ＢamＨＩ／ＨindIIIフラグメントの特殊なハイブリダイズフラグメントを含む。この実施態様において、ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン受容体遺伝子を含む７９２アミノ酸をコードするＮ.meningitidis血清型ＣゲノムＤＮＡの２３７６ヌクレオチドの開放読み枠のすべてのまたは特殊な−ハイブリダイズフラグメントを含む。本発明のこの実施態様において、Ｎ.meningitidis血清型Ｃヘモグロビン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は図２に示すヌクレオチド配列である（配列番号１）。本発明のこの実施態様の他の例において、ヌクレオチドプローブは、血清型ＡゲノムＤＮＡの２３７３ｂｐポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントの特殊な−ハイブリダイズフラグメントを含む。この実施態様において、ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン受容体遺伝子を含む７９０アミノ酸をコードするＮ.meningitidis血清型ＡゲノムＤＮＡの２３７０ヌクレオチドの開放読み枠のすべてのまたは特殊な−ハイブリダイズフラグメントを含む。本発明のこの実施態様において、Ｎ.meningitidis血清型Ａヘモグロビン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は図７に示すヌクレオチド配列である（配列番号３）。本発明のこの実施態様の他の例において、ヌクレオチドプローブは、血清型ＢゲノムＤＮＡの２３７６ｂｐポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントの特殊な−ハイブリダイズフラグメントを含む。この実施態様において、ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン受容体遺伝子を含む７９１アミノ酸をコードするＮ.meningitidis 血清型ＢゲノムＤＮＡの２３７３ヌクレオチドの開放読み枠のすべてのまたは特殊な−ハイブリダイズフラグメントを含む。本発明のこの実施態様において、Ｎ.meningitidis血清型Ｂヘモグロビン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は図８に示すヌクレオチド配列である（配列番号５）。本発明はまた、本発明の組換え発現構築物またはアンチセンス方向にヘモグロビン受容体をコードする核酸を発現するその相同体を提供し、その核酸はＮ.gonorrhoeaeから分離された細菌ヘモグロビン受容体遺伝子をコードする。本発明の望ましい実施態様において、ヌクレオチドプローブは、Ｎ.gonorrhoeaeゲノムＤＮＡの２３７８ｂｐポリメラーゼ連鎖反応増幅フラグメントの特殊な−ハイブリダイズフラグメントを含む。この実施態様において、ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン受容体遺伝子を含む７９１アミノ酸をコードするＮ.gonorrhoeaeゲノムＤＮＡの２３７３ヌクレオチドの開放読み枠のすべてのまたは特殊な−ハイブリダイズフラグメントを含む。本発明のこの実施態様において、Ｎ.gonorrhoeaeヘモグロビン受容体遺伝子のヌクレオチド配列は図９に示すヌクレオチド配列である（配列番号７）。本発明はまた、本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質の生化学的活性を阻害し、助長し、または調節する能力を有する化合物をスクリーニングする方法、およびヘモグロビン受容体タンパク質に特異である新規アゴニストおよびアンタゴニスト化合物、および殺菌および静菌薬剤をインビトロでスクリーニングするのに使用する方法を提供する。望ましい実施態様において、本発明の組換え発現構築物で形質転換した細胞はかかる化合物と結びついており、その化合物の結合能力および他の既知ヘモグロビン受容体アゴニスト、ヘモグロビンおよびヘミンなど、およびアンタゴニストとの結合についての化合物の効力を検定した。他の望ましい実施態様に、これらの効力の定量的分析がある。本発明はまた、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質、望ましくはＮeisseria種、特に望ましくはＮ.meningitidisから誘導されるタンパク質の既知または未知の殺菌性または静菌性相同体、アゴニストまたはアンタゴニストの検定に有用である。本発明はまた、Ｎeisseria種の病原菌の感染に対してヒトを免疫にするワクチンを提供し、このワクチンは、本発明のヘモグロビン結合タンパク質またはその抗原性フラグメントを含む。望ましい実施態様において、本発明のワクチン、本発明のヘモグロビン受容体結合タンパク質またはその抗原性フラグメントを発現する細胞を含み、かかる細胞はヒトで生長するのに適応する弱毒化細菌であり、すなわちかかる細胞は非病原性であり、細菌症、エンドトキシン症または敗血症をおこさない。かかる弱毒化細胞には、Ｓalmonella種の弱毒化株、例えばＳalm onella typhiおよびＳalmonella typhimuriumあるいは他の弱毒化細菌種が含まれる。本発明はまたワクチンとして有用なここに開示した組換え発現構築物を提供する。このワクチンは、動物に与えられて、そこのコードされた細菌ヘモグロビン受容体タンパク質抗原に対する免疫反応を生じる。本発明の特定の望ましい具体例は、下記のいくつかの望ましい実施態様についての詳細な記述および請求の範囲から明らかにされるであろう。図面の説明本発明の上記およびその他の目的、本発明の様々な特徴、並びに、本発明自身は、添付の図面と照らして読めば下記の説明から一層充分に理解できる。図１は、実施例２に記載した、Ｎ.meningitidisコスミドクローンおよびそのサブクローンの制限酵素消化地図の略図である。図２は、３.３kbＢamＨＩ／ＨindIII ＤＮＡフラグメントにコードされているＮ.meningitidisヘモグロビン受容体タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列を例示説明するものである。図３は、Ｎ.meningitidisヘモグロビン受容体遺伝子産物のイン・ビトロ発現の結果を示すおよそ９０キロダルトンのタンパク質と、分子量マーカーとして使用した約３０.０キロダルトンの分子量を有するβ−ラクタマーゼタンパク質の染色ＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥ電気泳動ゲルの写真を表す。図４は、Ｎ.meningitidisトランスフェリン受容体Ｔbp１（配列番号９）、Ｎ. meningitidisラクトフェリン受容体ＬbpＡ（配列番号１０）、およびＮ.meningi tidisヘモグロビン受容体ＨmbＲ（配列番号２）の部分間のアミノ酸配列比較を表す。図５は、ＤＩＧ非放射性ＤＮＡ標識および検出キット（Boehringer Mannheim Biochemicals、インディアナ州、インディアナポリス）を用いて標識したプローブとしてhmb遺伝子のＢamＨＩ−ＳalＩフラグメントを用いる、Ｎ.meningitidis ８０１３およびＭＣ８０１３hmbＲ変異体由来の染色体ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション分析を例示説明するものである。レーン１は、ＣlaＩで消化したＮ.meningitidis株ＭＣ８０１３由来のＤＮＡを含有し、レーン２は、ＣlaＩで消化したＭＣ８０３１hmbＲＤＮＡであり、レーン３は、ＢamＨＩおよびＳalＩで消化したＭＣ８０１３ＤＮＡであり、レーン４は、ＢamＨＩおよびＳalＩで消化したＭＣ８０１３hmbＲＤＮＡである。図６は、インビトロラット乳児感染モデルにおけるＮ.meningitidis野生型（ＭＣ８０１３）およびhmbＲ変異株を用いる感染過程を示すグラフである。各株を３匹の乳児同系交配ルイスラットに腹膜内注射した（２×１０⁶ＣＦＵ）。結果は、同様に実施した２つの実験の平均を表している。図７は、２３７３bpポリメラーゼ連鎖反応増幅ＤＮＡフラグメント上にコードされているＮ.meningitidis、血清型Ａヘモグロビン受容体タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を例示説明するものである。図８は、２３７６bpポリメラーゼ連鎖反応増幅ＤＮＡフラグメント上にコードされているＮ.meningitidis、血清型Ｂヘモグロビン受容体タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号５）および推定アミノ酸配列（配列番号６）を例示説明するものである。図９は、２３７６bpポリメラーゼ連鎖反応増幅ＤＮＡフラグメント上にコードされているＮ.gonorrhoeaeヘモグロビン受容体タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号７）および推定アミノ酸配列（配列番号８）を例示説明するものである。図１０は、Ｎ.meningitidis、血清型Ａ（配列番号３）、血清型Ｂ（配列番号５）、および血清型Ｃ（配列番号１）に由来する、およびＮ.gonorrhoeae（配列番号７）に由来する、ヘモグロビン受容体タンパク質間の核酸配列比較の略図を表し、ここで、遺伝子転写の方向は、矢印の方向であり、下記の略字は、制限エンドヌクレアーゼ部位を表す：ＨはＨind IIIを表し、ＮはＮotＩを表し、ＢgはＢglＩを表し、Ｂsは、ＢssＨＩを表し、Ｎrは、ＮruＩを表し、ＣlはＣlaＩを表し、ＰはＰstＩを表し、ＳaはＳacＩを表し、ＡvはＡvaＩを表し、ＢはＢamＨＩを表し、ＳはＳalＩを表し、ＥＶはＥcoＲＶを表し、ＳhはＳphＩを表し、Ｓy はＳtyＩを表す。図１１は、Ｎ.meningitidis、血清型Ａ（配列番号４）、血清型Ｂ（配列番号６）、および血清型Ｃ（配列番号２）由来の、およびＮ.gonorrhoeae（配列番号８）由来のヘモグロビン受容体タンパク質間のアミノ酸配列比較を表す。好ましい実施態様の詳細な説明本明細書で使用した“細菌ヘモグロビン受容体”の用語は、特にヘモグロビン誘導化ヘミン、同じくその他に由来するヘミンのかかる細菌の外膜からペリプラズム間隙への転移を媒介する、グラム陰性菌の外膜からなる細菌のタンパク質を表す。本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質は、まず、実質的に図２（配列番号２）、図７（配列番号４）、図８（配列番号６）、および図９（配列番号８）に表した配列であるアミノ酸配列を特徴とする。本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質は、更に、図２（配列番号２）、図７（配列番号４）、図８( 配列番号６)、および図９（配列番号８）に表したアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有することを特徴とする。この定義は、天然由来の変種および変異タンパク質、並びに、ヒトにより遺伝子工学的に作られた変種を包含することを意図する。本発明により提供される、クローン化し、単離し、さらに精製した核酸は、最も好ましくはNeisseria meningitidis種、およびそれらの各種血清型、およびNe isseria gonorhoeae種を含む、Neisseria種の生物体の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質をコードするものであることができる。本発明により提供される核酸ハイブリダイゼーションプローブは、図２（配列番号１）、図７（配列番号３）、図８（配列番号５）、および図９（配列番号７）に表したようなヘモグロビン受容体タンパク質のヌクレオチド配列の全部または特異的にハイブリダイズするフラグメント、または核酸ハイブリダイゼーションに効果的なそれらのあらゆる部分を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。このような核酸ハイブリダイゼーションプローブの混合物もまた、本発明のこの実施態様の範囲内である。本明細書に与えた核酸プローブは、とりわけ、感染の結果としてヒトにおいて、汚染された生物学的試料および標本において、食料品および供給水において、またはヒトと接触するに至る場合があるあらゆる物質において、細菌の存在を検出するのに有用である。特定のハイブリダイゼーションは、本発明の核酸プローブが、高ストリンジェンシー条件下で細菌由来のＤＮＡまたはＲＮＡに対して安定な特異的ハイブリダイゼーションを形成できることを意味すると理解され、ここで“高ストリンジェンシー”と云う用語は、当業者には理解されるはずである（例えば、Sarnbrook等、1989、Molecular Cloning:A Laborat ory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,N.Y. およびHames and Higgins編、1985、Nucleic Acid Hybridization，IRL Press， Oxford，U.K.）。ハイブリダイゼーションは、これらに限定されないが、サザン・ブロット・ハイブリダイゼーション、ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション、インシツ・ハイブリダイゼーション、およびポリメラーゼ連鎖反応生成物ＤＮＡに対するサザン・ハイブリダイゼーションを含む常套技術を用いて達成されると理解される。こうして、本発明は、細菌ヘモグロビン受容体遺伝子およびｍＲＮＡ転写物のインビトロ増幅を擁護するプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチド類、特にオリゴヌクレオチド対を提供するものと理解される。遺伝子工学手段によりクローン化遺伝子から細菌ヘモグロビン受容体タンパク質などのタンパク質を生産することは、当分野ではよく知られている。従って、下記は、この分野の概観として解釈されるものであり、本分野の十分な現状を反映するものではない。本発明のヘモグロビン受容体タンパク質は、Neisseria種以外の細菌を含む細菌によるかかるタンパク質の発現が、該形質転換細菌のある種の栄養要求性変異株を補完できることから、特に有利である。これらの変異株は、補完できなければ、鉄(III)を含む生長培地を補足せずには生存できないものである。本開示では、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質をコードするＤＮＡは、化学合成によるか、適切な細胞からｍＲＮＡの逆転写物をスクリーニングすることによるか、適切な細胞からゲノムライブラリーをスクリーニングすることによるか、または、これらの方法を組み合わせることによる。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングは、本明細書に開示した細菌ヘモグロビン受容体タンパク質の核酸配列情報から創製したオリゴヌクレオチドプローブを用いて実施できる。プローブは、既知の方法に従い、検出可能な基、例えば、蛍光基、放射性原子、または化学発光基で標識して、在来のハイブリダイゼーションアッセイに使用することもでき、詳細は下記実施例に記載している。別法として、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質をコードする核酸は、本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質から導かれる核酸配列情報に対応する適切なＰＣＴオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の使用により得ることもできる。特に下記実施例９に開示している、Mullis等の米国特許４,６８３,１９５号およびMulisの４,６８３,２０２号参照。またあるいは、このような細菌ヘモグロビン受容体タンパク質をコードする核酸は、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質遺伝子で形質転換させた栄養要求性細胞から単離し、それによって、鉄（I II）の不足に対する栄養要求性を緩和できる。本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質は、いずれも、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質をコードする核酸を含む組換え発現構築物で形質転換させた宿主細胞中で合成できる。このような組換え発現構築物は、複製可能なＤＮＡ構築物であるベクターを含むこともできる。ベクターを用いて、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質をコードするＤＮＡを増幅させるか、および／または細菌ヘモグロビン受容体タンパク質をコードするＤＮＡを発現させるかのいずれかである。本発明のためには、組換え発現構築物は、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質をコードする核酸が、適切な宿主細胞において細菌ヘモグロビン受容体タンパク質の発現をもたらし得る適切な制御配列に実施可能に連結している、複製可能なＤＮＡ構築物である。このような制御配列の必要性は、選択した宿主細胞および選んだ形質転換法によって変わる。一般に、細菌の制御配列は、転写プロモーター、転写を制御する所望のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位（シャイン−ダルガノ配列）配列、および転写および翻訳の終止を制御する配列を含む。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。必要とされるのは、通常は複製の起点により与えられる宿主内複製能力、および形質転換体の認識を容易ならしめるための選択遺伝子のみである。Sambrook等、1989、上記、参照。本発明を実施するのに有用なベクターには、プラスミドおよびウイルス由来の構築物があり、ファージおよび特にバクテリオファージ、および組み込み可能なＤＮＡフラグメント（即ち、相同的組換えにより宿主ゲノムに組み込み可能なフラグメント）を含む。ベクターは、宿主ゲノムから独立して複製および機能するか、または、ある場合では、ゲノム自身に組み込まれることもある。適切なベクターは、目的の発現宿主と適合する種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有する。好ましいベクターはpＬＡＦＲ２である（Riboli等、1991、Microb.Pathogen.10:393-403参照）。形質転換宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて製造され、かつ細菌ヘモグロビン受容体タンパク質をコードする核酸を含む組換え発現構築物で形質転換させたか、またはトランスフェクションさせた細胞である。好ましい宿主細胞は、Ne isseria種、特に、N.meningitidis、同じく、Salmonella typhi、およびSalmone lla typhimurium種、およびEsherichia coli栄養要求性変異細胞（hemA aroB）の細胞である。形質転換宿主細胞は、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質を発現できるが、核酸ハイブリダイゼーションプローブＤＮＡをクローニングまたは増幅する目的で形質転換した宿主細胞は、受容体タンパク質を発現する必要はない。発現に際し、本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質は、典型的には、宿主細胞外膜に局在するであろう。Sambrook等、上記、参照。細菌細胞、特に、Neisseria種の細胞およびある種のE.coli変異体の細胞の培養物は、組換え細菌ヘモグロビン受容体タンパク質合成に望ましい宿主である。主に、不足の鉄（III）に対して栄養要求性の細菌細胞はいずれも、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質形質転換細胞を選択的に生育させるのに有用である。しかしながら、このためには、E.coli hemA aroB変異体のような十分な特徴を有する栄養要求体が好ましい。本発明は、本発明の形質転換細胞により産生される細菌ヘモグロビン受容体タンパク質の均質組成物を提供する。このような均質組成物はいずれも、かかる均質組成物中に少なくとも９０％含まれる細菌ヘモグロビン受容体タンパク質からなることを意図する。本発明は、また、本明細書に記載したように、本発明の組換え発現構築物による形質転換の結果として細菌ヘモグロビン受容体タンパク質を発現する細胞由来の膜調製物を提供する。本発明による、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質、それらのペプチドフラグメントおよびかかるタンパク質を発現する細胞由来の膜は、かかる細菌ヘモグロビン受容体タンパク質を発現する病原性微生物によるヒトでの細菌感染に対して効果的なワクチンの生産に使用することができる。このようなワクチンは、好ましくは、Neisseria種、最も好ましくはＮ.meningitidis、およびＮ.gonorhoeae の細菌に対する免疫学的応答を生じるのに効果的である。本明細書に開示したように、組換え発現構築物もまた、動物へ導入して、そしてコードされた細菌ヘモグロビン受容体タンパク質抗原に対する免疫学的応答を産生せしめるために、それ自身がワクチンとして、本発明により生産されるワクチンの範囲内に包含される。有効成分としてポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を含有するワクチンの調製は、当分野では十分に理解されている。典型的には、このようなワクチンは、注射用製剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかで調製される。しかしながら、注射の前に、液体溶液または懸濁液状態にするのに適した固体形態もまた調製できる。この製剤は乳剤化してもよい。免疫学的有効成分は、医薬的に許容でき、かつ有効成分と適合する賦形剤と混合されることも多い。適切な賦形剤は、例えば、水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、または同等物、およびそれらの組み合わせである。更に、所望ならば、ワクチンは、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはワクチンの有効性を高めるアジュバントなどの少量の補助物質を含有してもよい。このワクチンは、通常、注射、例えば、皮下または筋肉内注射のいずれかにより、非経口投与される。その他の投与方法に適した別の製剤には、坐剤、およびある場合では、経口製剤がある。坐剤の場合、典型的な結合剤および担体として、例えば、ポリアルカレングリコール類、またはトリグリセライド類が含まれ、そのような坐剤は、０.５％ないし１０％、好ましくは１ないし２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、例えば、医薬品に適した等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、および同等物などの通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、遅延放出製剤、または粉末の形態を取り、有効成分を１０％ないし９５％、好ましくは２５ないし７５％含有する。本発明のポリペプチドは、中性または塩形態としてワクチン製剤にすることができる。医薬的に許容され得る塩類には、酸付加塩類（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）および例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸、および同種物などの有機酸により形成されるものがある。遊離カルボキシル基で形成される塩類は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄（III）などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、および同種物などの有機塩基から誘導するこができる。その他の実施態様では、本発明に従い、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質またはそれらのペプチドフラグメントが、かかるタンパク質を発現する細胞の無傷の細胞膜に存在するようなワクチンを提供する。好ましい実施態様では、これらの実施態様に有用な細胞は、ヒトでの生育に適応させた細胞の弱毒化変種を含む。最も好ましくは、該細胞は、ヒトでの生育に適応させた細胞の弱毒化変種、即ち、明らかな疾病、または菌血症、内毒血症、または敗血症などのその他の病理学的症状を引き起こさないような細胞である。本発明では、“弱毒化”細胞とは、かかる細胞を動物に導入したときに、かかる細胞が生存可能であるか、生存するか、加熱弱毒化、化学的弱毒化、または遺伝子的弱毒化または不活性化されるか、または死滅するかどうかにかかわらず、感染、疾病、敗血症、内毒素性ショック、発熱性ショック、またはその他の、動物、最も好ましくはヒトへのワクチン投与に対する深刻かつ不都合な反応を引き起こさない原核細胞および真核細胞を包含すると理解される。当業者ならば、ワクチン接種のある種の僅かな副作用、例えば、短期間発熱、筋肉痛、全身倦怠、および異なるタイプの様々なワクチンを用いるワクチン接種に対するその他のよく知られた反応が、本発明のワクチンを用いる動物への、好ましくはヒトへのワクチン接種に付随することが予想できると認識されるであろう。このような、急性の短期間かつ生命を脅かさない副作用は、本発明のワクチン、および本明細書に表した“弱毒化”の定義内にあるような副作用を引き起こすワクチンの本明細書定義に包含される。このような弱毒化細胞の好ましい例は、Salmonella種、好ましくはSalmonella typhiおよびSa lmonella typhimuriumの弱毒化変種、同じくその他の弱毒化細菌種を含む。特に、本発明のこれらの実施態様のワクチンは、いわゆる“生の”弱毒化細胞製剤、並びに、熱または化学的不活性化細胞製剤を包含すると理解されるものである。本発明のその他の実施態様は、動物に導入したときに、ヘモグロビン受容体タンパク質の直接発現にコンピーテントな組換え発現構築物中、本発明の核酸からなるＤＮＡワクチンであるワクチン類を提供する。好ましい実施態様では、このようなＤＮＡワクチンは、本発明のヘモグロビン受容体をコードする核酸がプロモーター要部、最も好ましくはサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーターまたはサルウイルス４０の初期遺伝子プロモーターに実施可能に連結している、組換え発現構築物からなる。本発明のＤＮＡワクチンは、好ましくは筋肉内注射により投与するが、当業者によれば、経口、経皮、直腸、経鼻、肺へのエアロゾル投与を含む適切な投与経路、またはその他の臨床的に許容され得る投与経路はどれでも使用できる。一般に、本発明のワクチンは、投与形態に適合する方法、および治療上有効であり、かつ免疫原性である量で投与する。投与量は、処置される対象、対象の免疫系が抗体を合成する能力、および望まれる保護の度合いによって変わる。投与に必要とされる有効成分の正確な量は、実施者の判断に左右され、また、各個人に特有である。しかしながら、適切な投与量範囲は、個体当たり数百ミクログラムの有効成分のオーダーである。初回投与および追加免疫注射に適した様式もまた変わり得るが、典型的には、初回投与に続いて１または２週間間隔で二次注射または他の投与を行う。本発明の組換え発現構築物は、普通はヘモグロビン受容体タンパク質を発現しない細菌細胞を形質転換させて、その後この受容体を発現させるという分子生物学においても有用である。このような細胞は、とりわけ、受容体結合活性アッセイ、ワクチン生産などに有用な細胞膜調製物を製造するための中間体物として有用であり、ある実施態様では、とりわけそれら自身が、上記のワクチンまたはワクチン成分として使用できる場合もある。そのため、本発明の組換え発現構築物は、在来のスクリーニングプロトコールよりも有利に低い費用で有用な可能性のある殺菌剤および静菌剤をスクリーニングする方法を提供する。本発明の構築物および培養物は、究極的なインビボ活性および毒理学アッセイに対する要望を完全に満たしてはいないが、毎年、天然源から合成、発見、または抽出される莫大な数の有用な可能性のある殺菌剤および静菌剤についての重要な第１スクリーニング段階を提供するものである。更に、このような殺菌剤または静菌剤を選抜して、下記により詳細に開示したとおり、これらのタイプの細菌における感染毒性に関連する栄養物摂取経路を利用し、そうして、インビボで重い感染の発症に関連する細菌を選択的にターゲティングする。また本発明は、両方の機能性細菌ヘモグロビン受容体タンパク質、かかるタンパク質を含む膜、かかるタンパク質を発現する細胞、およびかかるタンパク質のアミノ酸配列を提供する。それによって、本発明は、目下利用可能な技術（Walt ers,“Computer-Assisted Modeling of Drugs”，Klegerman & Groves編、1993 、Pharmaceutical Biotechnology、Interpharm Press：イリノイ州、バッファロー・グローブ、165-174頁参照）を用いて新規な治療上有効な抗菌剤の合理的薬剤デザインを可能にするのに十分な構造的および機能的活性情報を提供する。本発明の核酸およびオリゴヌクレオチド類は、Neisseria種のヘモグロビン受容体タンパク質発現病理学的生物体により引き起こされる、ヒトにおける細菌感染を検出するための診断手段として有用である。このような診断用試薬は、上記のとおり、本発明の核酸ハイブリダイゼーションプローブからなり、対になったオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを包含する。本発明により提供される方法は、生物学的試料中の病原性細菌の存在を検出するためのブロットハイブリダイゼーション、インシツ・ハイブリダイゼーション、およびインビトロ増幅技術を含む。本明細書に記載した方法を用いて有利にスクリーニングされる適切な生物学的試料には、血漿、血清、リンパ、髄液、精液、粘膜組織試料、生検試料、およびその他の細菌感染の可能性のある部位がある。本発明の方法が、水、食糧、医薬品、および感染の可能性のある供給源をスクリーニングするために使用することもできることも期待される。本発明は、また、本発明により提供された、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質またはそれらのエピトープに対して免疫学的に反応性である抗体を提供する。本発明により提供された抗体は、当分野ではよく知られた方法を用いて、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質またはそれらのエピトープを発現する細胞、粗製膜調製物であるかまたは当分野でよく知られた方法を用いて精製した膜のいずれかである、かかる細胞由来の細胞膜、または異種タンパク質と融合させ、かつ細菌、酵母、または真核細胞における遺伝子工学手段を用いて発現させた、融合タンパク質、特に本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質タンパク質のエピトープからなる融合タンパク質を含むタンパク質で常用の生化学的手段を用いて様々な均質度でかかる細胞から単離したものの精製調製物を接種することにより動物に産生させることができる。確立されたインビトロ合成法を用いて製造し、所望によっては、アミノ酸の異種配列とコンジュゲートさせた合成ペプチドもまた、本発明のこれらの抗体産生法に包含される。このような接種のために使用される動物には、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、および霊長類を含む各種の個体がある。接種に好ましい動物は、齧歯動物（マウス、ラット、ハムスターを含む）およびウサギである。最も好ましい動物は、マウスである。かかる接種または本発明で使用されるその他のあらゆる手段に使用できる細胞は、分子または遺伝子工学の結果として本発明により提供される細菌ヘモグロビン受容体タンパク質を自然に発現するあらゆる細胞、または本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質を発現するあらゆる細胞または細胞ライン、またはそれらの任意のエピトープ、または、物理的、生化学的、または遺伝子的手段により内生または異種細菌ヘモグロビン受容体タンパク質の発現を増大するように処置されているあらゆる細胞を含む。好ましい細胞は、本発明の組換え発現構築物で形質転換させ、かつ唯一の鉄（III）源としてヘミンまたはヘモグロビンを補足した培地で生育させたE.coli栄養要求性変異株hemA aroB細胞、およびNeisseria 種の細胞である。本発明は、また、このような細胞、好ましくはＥ．coli細胞の表面に提示される、本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質またはそのフラグメントのエピトープと免疫学的に反応性のモノクローナル抗体を提供する。このような抗体は、当業者に既知の方法を使用して製造される。本発明により提供されるモノクローナル抗体は、本発明によりまた提供され、当分野で既知の方法で製造される、ハイブリドーマ細胞ラインにより製造される(ＨarlowおよびＬane，1988，Ａnti bodies：ＡＬaboratory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress , Ｃold Ｓpring Ｈarbor，Ｎ.Ｙ.参照)。ハイブリドーマ細胞ラインは、ミエローマ細胞ラインの個々の細胞と、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質の均一調整物、それからなる膜、該タンパク質を発現する細胞または細菌ヘモグロビン受容体タンパク質のエピトープで免疫化した動物由来の脾臓細胞の融合により製造される。これらは、それ自体を使用するか、または上記のように、異種または融合タンパク質構築物を含んで使用される。本発明で使用するミエローマ細胞ラインは、マウス、ラット、ハムスター、霊長類およびヒト由来の系を含む。好ましいミエローマ細胞ラインは、マウス由来であり、最も好ましいマウスミエローマ細胞ラインは、P3X63-Ag8.653である。免疫化後に脾臓を得る動物は、ラット、マウスおよびハムスター、好ましくはマウス、最も好ましくはＢalb/cマウスである。脾臓細胞とミエローマ細胞は、不活性化Ｓendaiウイルスとのインキュベーションおよびポリエチレングリコール(ＰＥＧ)存在下でのインキュベーションを含むがこれらに限定されない、当分野で既知の多くの方法を使用して融合する。細胞融合に最も好ましい方法は、４５％ (ｗ／ｖ)ＰＥＧ−１４５０溶液存在下でのインキュベーションである。ハイブリドーマ細胞ラインから産生されるモノクローナル抗体は、インビトロ細胞成育由来の細胞培養上清液から回収できる；あるいは、ハイブリドーマ細胞を動物、最も好ましくはマウスの皮下および／または腹腔洞に注射でき、モノクローナル抗体を血液および／または腹水から得る。本発明により提供されるモノクローナル抗体は、また、当業者に既知の組換え遺伝子法で製造される。本発明は、このような方法で製造された抗体を含み、この抗体は本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質に対し免疫学的に活性である。本発明はまた、このような抗体のＦ(ａｂ)およびＦ(ａｂ)₂フラグメントを含むが、これらに限定されない。フラグメントは、タンパク質分解的開裂、化学的合成または遺伝子工学法によるこのようなフラグメントの製造を含むが、これらに限定されない多くの方法で製造される。本発明はまた、当業者に既知の方法で製造される、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質のエピトープと免疫学的に反応性の一本鎖抗体も含む。本明細書で使用する抗体およびフラグメントは、種々の方法により標識、好ましくは放射標識できる。例えば、生物学的に活性な分子はまたジエチレントリアミン五酢酸(ＤＰＴＡ)またはブロモアセチルアミノベンジルエチルアミンジアミン四酢酸(ＢＡＢＥ)の環状無水物との結合により、放射ヌクレオチドでも標識できる。放射技術の更なる記載は、両方とも、本明細書に参考として包含させる、Ｈnatowich et al.(1983，Ｓcience 220:613-615)およびＭeares et al.(1984，Ａnal．Ｂiochem．142:68-78)参照。本発明は、また、受容体分子内に存在する配列および／または配列の構造を含む、本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質のエピトープも含む。このエピトープは、天然に存在し得るかまたは受容体分子のタンパク質分解的開裂およびエプトープ含有ペプチドの単離により得られるか、または当業者に既知の方法を使用したエピトープ含有ペプチドの合成により得られる。本発明はまた、遺伝子工学技法の結果産生され、遺伝子工学的原核または真核細胞により製造されるエピトープペプチドも含む。本発明はまた、細菌ヘモグロビン受容体タンパク質由来エピトープに免疫学的に反応性の軽鎖および重鎖ペプチドからなるキメラ抗体も含む。本発明の態様のキメラ抗体は、天然に存在する抗体由来のものおよび当業者に既知の遺伝子工学法により製造されたキメラ抗体も含む。本発明により、またヒトにおける細菌ヘモグロビン受容体タンパク質を発現する病原性生物による感染の検出および処置についての診断および治療法も提供される。このような方法に使用する診断試薬は、本発明の抗体、最も好ましくはモノクローナル抗体を含む。このような抗体は、固相酵素免疫測定法(ELISA)、放射免疫測定(ＲＩＡ)、ウエスタンブロット検定、免疫学的滴定検定、免疫学的分散検定(Ｏuchterlony検定のような)および当業者に既知の他の方法を含むが、これらに限定されない慣用の免疫学的方法で使用される。本明細書に記載の免疫学的方法においては、本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質由来で、このような抗体に免疫学的に交差反応性のエピトープもまた含む。更なる診断的検定は、本発明の核酸またはその特異的ハイブリダイズフラグメントを使用した、細菌ゲノムＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡの感受性検出のための核酸ハイブリダイゼーション検定を含む。このような検定は、サザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロット、スロットブロット等のような種々のブロット検定およびポリメラーゼ連鎖反応検定(ＰＣＲ)、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応検定(ＲＴ−ＰＣＲ)、リガーゼ連鎖反応検定(ＬＣＲ)のようなインビトロ増幅検定および当業者に既知のものを含む。本発明の方法に使用する検出された診断フラグメント、ポリモルフィスム検定結合制限フラグメント(ＲＦＬＰ)のアナログの特異的制限エンドヌクレアーゼ消化はまた本発明の範囲内である。本発明はまた本発明の細菌ヘモグロビン受容体タンパク質を発現する微生物、最も好ましくはＮeisseria種の細菌により引き起こされる、ヒトにおける感染の処置に使用される治療法および薬剤も提供する。このような方法に使用する薬剤は、それ自体または感染細菌に対して有効な殺細菌または静細菌試薬または他の抗生物質化合物と組み合わせた本発明の抗体を含む。このような態様において、本発明の抗体は、更に、好適な薬学的に許容可能な担体およびアジュバントまたは必要に応じて他の補助的成分を含む医薬組成物を構成する。好適な担体は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびこれらの組み合わせである。加えて、所望により、医薬製剤は、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤または他の抗体の効果を促進する化合物のような少量の補助物質を含み得る。これらの態様において、本発明の薬剤は、ヒト免疫系の細胞毒性細胞により認識される抗体で細菌に免疫学的に“付箋を付ける”か、または細菌ヘモグロビン受容体タンパク質により感染微生物に抗微生物薬を特異的に送達することにより、感染細胞を標的とするのに働く。更なる治療試薬は、本発明の核酸またはそのフラグメント、このような核酸の特異的アンチセンスを含む。このようなアンチセンス核酸は、それ自体またはアンチセンス発現に特異的な組換え発現構築物に包含されて使用し得、構築物は、感染に応答可能な細菌病原体に伝染性の細菌ウイルス、好ましくはバクテリオファージの一部に組み入れられるように遺伝子操作される。これらの態様において、本発明のアンチセンス核酸の細菌細胞への挿入は、細菌ヘモグロビン受容体の発現を阻害、弱めまたは廃止し、それにより細菌感染の毒性を減少させ、より有効な抗細菌介在を可能にする。更なる態様において、バクテリオファージは、細菌ヘモグロビン受容体遺伝子の“ノックアウト”コピーを有して提供され、それによりファージは感染細菌の内因性ヘモグロビン受容体遺伝子の遺伝子的変異を、例えば、細菌ヘモグロビンの受容体遺伝子の外因性のノックアウトコピーと感染微生物の内因性ヘモグロビン受容体遺伝子の同種組換えにより達成する。以下の実施例は、本発明の具体的態様およびその種々の使用を説明する。それらは、説明の目的でのみ記載し、本発明を限定するものと取るべきではない。実施例１プラスミド、細菌および培養物本明細書で使用するプラスミドおよび細菌は、表１に記載する。Ｅ．coli株は、慣用的に、５−アミノレベルリン酸および５０mg／Ｌヘミンクロリドを必要に応じて添加したルリア−ベルタニ(ＬＢ)ブロスで成育させた。Ｎ．meningitidis ８０１３は、血清グループＣ臨床単離体であった(Ｎassif et al.，1993，Ｍol ．Ｍicrobiol．8:719-725)。髄膜炎菌は、慣用的に、Ｋellogg et al.(1963，Ｍ ol．Ｍicrobiol．6:591-597)記載のように添加された、ＧＣＢ寒天(Ｄifco)で慣用的に成育させ、３７℃で５％ＣＯ₂雰囲気下インキューベトした。髄膜炎菌の形質転換を、Ｎassif et al.(1992，Ｍol．Ｍicrobiol．6:591-597)記載のように行った。必要な場合、以下の抗生物質をＥ．coliに対して使用した：リファンピシン、１００mg／Ｌ；テトラサイクリン、１５mg／Ｌ；カナマイシン、３０mg ／Ｌ；クロラムフェニコール、２０mg／Ｌ；カルベニシリン、１００mg／Ｌ。Ｎ eisseriaeに対しては、１００mg／Ｌのカナマイシンを必要な場合使用した。実施例２Ｎeisseria meningitidisからのヘモグロビン受容体遺伝子の栄養要求株補足性クローニングヘミンおよび／またはヘモグロビン鉄取り込みに関与する、Ｎ．meningitidis 外膜を同定するために、Ｙ．enterocokiticaおよびＶ．choleraeヘミン受容体を同定するために以前試みられたのと同様の、栄養要求株補足性クローニングを使用した(ＳtojiijkovicおよびＨantke，1992，ＥＭＢＯＪ．11:4359-4367；Ｈen dersonおよびＰayne，1994，Ｊ．Ｂacteriol，176:3269-3277参照)。この概念は、グラム陰性菌の外膜がヘミン不浸透性であり(ＭcＣonvilleおよびＣharles，1 979，Ｊ．Ｍicrobil.，113:165-168)、従って、Ｅ．coliポルフィリン生合成変異株は外因的に供給されたヘミン上では成育できないという事実に基づく。Ｎ． meningitidis外膜ヘミン受容体遺伝子を備えている場合、Ｅ．coliポルフィリン変異株はそのポルフィリン源として外因的に供給されたヘミンを使用できる。Ｎ．meningitidis 8013のコスミドバンクが、既知のコスミドクローニング法を使用して製造された(Sambrook et al.，1989，同書)。Ｎ．meningitidis細菌ＤＮＡをＭboＩで部分的に消化し、シュークロース勾配でサイズ分画し、コスミドベクターｐＬＡＦＲ２(Ｒiboli et al，1991，Ｍicrob．Ｐathogen．10:393-4 03)のＢamＨＩ部位にクローン化した。このコスミドバンクをＥ．coli hem Ａ aroＢＲif^r受容株に、結合プラスミドpRK2013::Tn9を使用した３親交配により移動させた。交配混合物を、ヘミンクロリド(５０mg／Ｌ)、０.１mＭ２,２ ’−ジピリジルおよびリファンピシン(１００mg／Ｌ)含有選択プレートにおいた。外因的供給ヘミン上で成育する幾つかのクローンを一晩のインキュベーション後に単離した。これらの形質転換体のヘミン利用表現型を、コスミドを天然Ｅ．coli hemＡ a roＢ細胞のコスミドに再挿入することにより、およびヘミン−供給プレートでの成育を追跡することにより試験した。Ｅ．coli株のヘミンまたはヘモグロビンを単独鉄源として利用する能力を、先に記載のように試験した(ＳtrojiljkovicおよびＨantke，1992，同書)。５０μＭデフェロキサミンメシレート(鉄キレート化剤、Ｓigma Ｃhemical Ｃo.，Ｓt．Ｌouis，ＭＯから得た)含有ＬＢ寒天上で細胞を成育させた。試験化合物(特記しない限り、５mg／ml貯蔵溶液２０μＬ) を浸み込ませたフィルターディスク(１／４インチ、Ｓchleichner＆Ｓchuell，Ｉnc.，Ｋeene，ＮＨ)をこれらのプレート上においた。一晩、３７℃、５％ＣＯ₂ で成育させた後、ディスクの回りの成育ゾーンを追跡した。この検定で試験した鉄結合タンパク質(すべてＳigma Ｃhemical Ｃo.から得た)は、ヒト、ヒヒ、ウシおよびマウス由来のヘモグロビン、ウシヘミン、ヒトラクトフェリン(９０％鉄飽和)およびヒトトランスフェリン(９０％鉄飽和、Ｂoehringer Ｍannheim Ｂiochemicals，Ｉndianapolis，ＩＮ)であった。全６個のヘミン利用陽性コスミドを、これらのプロトコールを使用して得た。このような検定を使用した結果を表IIに示す。実施例３ヘミン利用陽性コスミドの制限酵素消化地図作製実施例２のようにして得た６個のヘミン利用陽性コスミドのコスミドＤＮＡを、ＣlaＩで消化し、得られたフラグメントをＣlaＩ−消化ｐＳＵ(ＳＫ)ベクター (Ｓtratagene，ＬaＪolla，ＣＡ)にクローン化した。コスミドcos２２由来の６k bＣlaＩフラグメントを含む一つのサブクローン(得られたプラスミドは、pＩＲＳ５０８と命名)を測定し、実施例２記載のようなＥ．coli hemＡ aroＢ検定により、ヘミンおよびヘモグロビンの利用を確認した。cos４４の１１kb ＣlaＩフラグメントを含む他のこのようなクローンをまた測定し、これらの栄養要求変異細胞のヘミン利用を確認した。制限分析およびサザンハイブリダイゼーションは、cos２２およびcos４４由来のＤＮＡフラグメントが関連していないことを示す。コスミドクローンｐＩＲＳ５０８の推測される制限酵素消化地図を図１に示す。プラスミドｐＩＲＳ５０８は、Ｅ．coli hemＡ aroＢが、ヘモグロビン上での成育がヘミン上よりいくらかは弱いが、ヘミンおよびウシヘモグロビンを鉄源として使用することを可能にした(表II)。更なるサブクローニングがその挿入物のＢ amＨＩ／ＨindIIIフラグメントのヘミン／ヘモグロビン利用部位に位置する。ヘモグロビン受容体遺伝子をコードする配列(hmbＲと命名)に加えて、Ｎeisseria 挿入物要素(IS1106)の配列およびＮeisseria小反復要素(ＩＲ１)をまたその図１に示す。実施例４Ｎeisseriaヘモグロビン受容体遺伝子をコードするコスミドクローンのヌクレオチド配列分析 hmbＲ遺伝子およびそのプロモーター領域を有する３.３kb ＢamＨＩ−ＨindI II ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を、Ｓequenase ２.０キット(Ｕ.Ｓ．Ｂiochemicals，Ｃleveland，ＯＨから得た)を用いたジデオキシ連鎖反応停止法を使用して測定し、ＢioＲad電気泳動システムおよびＡutoＲeadキット(Ｐhar macia，Ｕppsala，ＳＥから得た)およびＡＬＦ−３７０自動sequenator(Ｐharma cia，Ｕppsala，Ｓweden)を使用して分析した。配列決定のためのプラスミドサブクローンは、hmbＲ遺伝子の異なる制限部位を用いたＥrase-a-Ｂaseキット(Ｐ romega Ｂiotech，Ｍadison，ＷＩから得た)を使用したネステッド欠損(nested deletion)アプローチにより製造した。hmbＲ遺伝子のヌクレオチドおよび推測されるアミノ酸配列を図２に示す。開放読み枠(ＯＲＦ)は、Ｎ．meningitidis、配列の４７０位で開始し、罫線分子量８５.５kＤaの７９１アミノ酸のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする血清型Ｃヘモグロビン受容体タンパク質をコードする。シン−デルガーノ配列(ＳＤ)が４６０位で見られる。ＨmbＲ受容体タンパク質は、タンパク質の残基２２から２４にシグナルペプチダーゼＩ認識配列を含み(下線)、外膜タンパク質であるという事実と一致する。典型的Ｆur結合ヌクレオチド配列(“Ｆur ボックス”と命名)が、hmbＲ遺伝子のプロモーター領域に見られた(図２)。ＹersiniaeおよびＶivrioにおけるヘミン利用と同様に、Ｎeisseriaにおけるヘミンおよびヘモグロビン利用は、鉄誘発可能表現型として知られている(ＷestおよびＳparling，1985，Ｉnfect．Ｉmm un．47:388-394；Ｄyer et al.，1987，Ｉnfect．Ｉmmun．55:2171-2175)。グラム陰性細菌において、多くの鉄利用遺伝子の条件発現は、Ｆur−抑制遺伝子のプロモータ部位における１９bp不完全二分子反復(Ｆur−ボックス)を認識するＦur リプレッサーにより制御されている。近年、異なるグラム陰性細菌のＦur−制御遺伝子の同定のための遺伝子スクリーン(FURUTA)が記載され(Ｓtojiljkovic et al.，1994，Ｊ．Ｍol．Ｂiol．236:531-545)、この検定をhmbＲ発現がこの方法で制御されているか試験するために使用した。簡単に、Ｆur−ボックス配列を有するプラスミドを、Ｆur−制御lac融合を染色体中に有するＥ．coli株(Ｈ１７１７)に形質転換する。このＦur−制御lac融合の発現は通常抑制される。多重コピーＦur−ボックス配列のプラスミドへの挿入は、利用可能Ｆurリプレッサーを力価測定し、すなわち、Ｆur−制御lac融合の発現を確認する(この表現型はFURTA 陽性と呼ぶ)。このスクリーンを使用して、FURTA陽性結果を産生するコスミドｐＩＲＳ５０８由来の最小挿入フラグメントは、プラスミドｐＩＲＳ５２８に含まれる０.７kb ＢamＨＩ−ＮotＩＤＮＡフラグメントであった(図１参照)。この結果は、０.７kb ＢamＨＩ−ＮotＩフラグメントがＦur−ボックスを有し、hmb Ｒプロモーター由来の遺伝子発現がfur−タイプオペロンにより制御されることを示す。Ｎ．meningitidis、血清型Ｃヘモグロビン受容体タンパク質を、Ｐromega Ｂi otech(Ｍadison，ＷＩ)のＥ．coli Ｓ30抽出系を使用してインビトロで発現させた。インビトロで発現された３.３kb ＢamＨＩ−ＨindIIIフラグメントは９０k Ｄaタンパク質をコードし、それは非処理ＨmbＲ受容体の予定された分子量に大きさで対応する。観察された９０ＫのＭ_rを示すＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥ分析を、図３に示す。 hmbＲ遺伝子の直ぐ下流(図２の位置の２９５５から３０００bp)が、Ｎ．gonor rhoeaeのＰIII遺伝子(Ｇotschlich et al.，1987，Ｊ．Ｅxp．Ｍed．165：471-4 82)のフランキング配列を９９％同一の短いヌクレオチド配列であるこが判明した。この最初の２６bpは、Ｎ．gonorrhoeae小反復要素の逆反復(ＩＲ１)の半分を示す。この要素は、Ｎ．gonorrhoeaeおよびＮ．meningitidisの両方の約２０コピーに見られる(Ｃorreia et al.，1988，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．263：12194-121 98)。３０２７からＣlaＩ(3984)制限部位のヌクレオチド配列の分析(ＢamＨＩ( １)からＨindIII(３３７０)の配列のみ図２に示す)は、ＩＳ１１０６要素の存在を示す(Ｋnight et al.，1992，Ｍol．Ｍicrobiol．6：1565-1573)。興味深いことに、ＩＳ１１０６逆反復と同じ配列は、ＩＲ１要素とＩＳ１１０の相同性の始めとの間に見られなかった。これらの結果は、Ｎ．meningitidis由来の、Ｎ．meningitidisゲノムＤＮＡの３.３kbのＢamＨＩ／ＨindIIIフラグメントに含まれる、新規ヘモグロビン受容体タンパク質遺伝子のクローニングおよび同定と矛盾しない。実施例５Ｎ．meningitidisヘモグロビン受容体タンパク質とＮeisseriaラクトフェリンおよびトランスフェリン受容体タンパク質のアミノ酸配列の比較トランスフェリン(Ｔbp１；Ｌegrain et al.，1993，Ｇene 130：81-90)、ラクトフェリン(ＬbpＡ；Ｐettersson et al.，1993，Ｉnfect．Ｉmmun．61：4724 -4733および1994，Ｊ．Ｂacteriol．176：1764-1766)とＮ．meningitids由来のヘモグロビン受容体(ＨmbＲ)の比較を図４に示す。比較は、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラムパッケージ(Ｉntelligenetics，Ｐalo Ａlto，ＣＡ)のＣＬＡＳＴＡＬプログラムで行った。タンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端セグメントのみを示す。星印は同一性を示し、点はアミノ酸レベルの同一性を示す。ラクトフェリンおよびトランスフェリン受容体は、アミノ酸配列で４４.４％の同一性を共有することが判明した。他方、これらのタンパク質と本明細書に記載のヘモグロビン受容体の相同性は有意に弱いことが判明した(ラクトフェリンと２２％アミノ酸配列同一性およびトランスフェリン受容体と２１％)。実施例６Ｎ．meningitidisヘモグロビン受容体によるヘミン輸送のＴonＢ／ＥxbＢＤ−依存性鉄含有鉄媒体物、あるコリシンおよびビタミンＢ１２のＥ．coli外膜を通過しての輸送は、３つの細胞質膜タンパク質：ＴonＢ、ＥxbＢおよびＥxbＤに依存することが知られている(Ｐostle 1990，Ｍol．Ｍicrobiol．133：891-898；Ｂrau nおよびＨantke，1991，Ｗinkelmann(ed.)，Ｈandbook of Ｍicrobial Ｉron Ｃ helates，ＣＲＣＰress，Ｂoca Raton，Ｆla.，pp.107-138)。ＹersiniaおよびＨemophilusにおいて、ヘミン取り込みはＴonＢ−依存性方法であることが示された(ＳtojiljkovicおよびＨantke，同書；Ｊarosik et al.，1994，Ｉnfect．Ｉmmun．62:2470-2477)。外膜受容体と機械的ＴonＢ細胞質の直接相互作用を通して、受容体に結合した基質は、周辺質に吸収される(Ｈeller et al.，1988，Ｇene 64：147-153；ＳchofflerおよびＢraun，1989，Ｍolec．Ｇen．Ｇenet．2 17：378-383)。この直接相互作用は、機械的ＴonＢと関連した膜タンパク質の特異的アミノ酸配列に関連する。グラム陰性細菌の全てのＴonＢ依存性受容体は、その一次構造に幾つかの高い相同性の領域を含む(ＬundriganおよびＫadner，1986，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．261 ：10797-10801)。実施例５に記載のアミノ酸配列比較において、全ての２つのタンパク質の推定ＴonＢ−ボックスは下線を引く。ＨmbＲ受容体のカルボキシル末端は、非常に保存された末端フェニルアラニンを含み、７８２位アルギニン残基は外膜局在シグナルの一部であると考えられる(Ｓtruyve et al.，1991，Ｊ．Ｍ ol．Ｂiol．218：141-148；Ｋoebnik，1993，Ｔrends Ｍicrobiol．1：201)。成熟ＨmbＲタンパク質の６残基において、アミノ酸配列−ＥＴＴＰＶＫＡ−は幾つかのグラム陰性受容体のいわゆるＴonＢ−ボックスの配列と同じである。興味深いことに、ＨmbＲの推定ＴonＢ−ボックスは、Ｅ．coli鉄媒体物受容体のＴonＢ −ボックスよりむしろＮ．gonorrhoeaeトランスフェリン受容体のＴonＢ−ボックスとより相同性である(Ｃornelissen et al.，1992，Ｊ．Ｂacteriol．174：5 788-5797)。ＨmbＲ受容体の配列を他のＴonＢ−依存性受容体と比較した場合、Ｙ．enterocolitica ＨemＲ受容体と最も高い相同性が見られ、Ｎeisseria受容体とでは相同性はそれほど高くなかった。Ｎ．meningitidis、血清型Ｃヘモグロビン受容体のＴonＢ−依存性性質を証明するために、hmbＲをＥ．coli ＥＢ５３のexbＢおよびtonＢ変異株に挿入し、ヘミンおよびヘモグロビンをポルフィリンおよび鉄源として使用する株の能力を測定した。これらの検定においてＥ．coli ＥＢ５３の両方の変異株は、機能的hm bＲ存在下で、ヘミンをポルフィリン源としても鉄源としても使用できなかった( 表２)。ヘモグロビンの鉄源としての使用はまた影響を受けた(表２)。これらの結果は、野生型Ｅ．coliのＴonＢにおけるこの遺伝子の発現が、実施例２に記載の実験において、ヘミンおよびヘモグロビンの単一鉄源としての使用によると支持されているため、本発明のＮ．meningitidisヘモグロビン受容体タンパク質であるhmbＲ遺伝子生産物が、ＴonＢ依存性であるという見解と一致する。実施例７ hmb Ｒ遺伝子生産物がＮ．meningitidisにおけるヘモグロビン受容体タンパク質であるという機能的証明表IIに記載のデータに示されるように、Ｅ．coliに発現された場合、hmbＲはヘミンおよびヘモグロビンの両方の使用を媒体するが、ヘモグロビン使用はヘミン使用より少ない。HmbＲ受容対がＮ．meningitidisにおいて同じ特性を有するか調べるために、hmbＲを１.２kbカナマイシンカセット(aphA-3；Ｎassif et al .,1991同書)で不活性化し、野生型Ｎ．meningitidis８０１３クローン６(血清型Ｃ)細胞に形質転換した。これらのＫｍ−耐性形質転換体の染色体hmbＲコピーの不活性化は、図５に示すようにサザンハイブリダイゼーションによって確認した。図５に見られるように、野生型Ｎ．meningitidisゲノムＤＮＡは、hmbＲ遺伝子のコピー１つのみを含む(レーン１および３)。Ｋｍ^r形質転換体において、野生型遺伝子を含むＤＮＡフラグメントのサイズは、１.２kb増加し、これはＫan カセットのサイズである(図５、レーン２および４)。異なる鉄含有化合物の利用の能力を試験する場合、これらの変異細胞は、源(ヒト、ウシ、ヒヒ、マウス)に拘わらず、ヘモグロビン−結合鉄を利用できないことが判明した。変異株のヘモグロビン−ハプトグロブリンの利用の能力は、野生型Ｎ．meningitidis株が鉄源としてヘモグロビン−ハプトグロブリンを使用できないため、試験しなかった。しかしながら、変異株は、ヘミン鉄、ラクトフェリンおよびトランスフェリン−結合鉄ならびにクエン酸−鉄は使用できた(表II)。ヘモグロビンの鉄含有要素がヘミンであるため、ヘモグロビン受容体は、ヘミンを周辺質に輸送できることが予期される。実際、本明細書に記載のクローニング概念は、クローン場合髄膜炎菌受容体がヘミンをＥ．coli周辺質に輸送できる能力に依存している。これらの結果は、Ｎ．meningitidisが、ヘミン−含有化合物の取り込みに関与する少なくとも２つの受容体を有することにより強く示される。一つは本明細書に記載のヘモグロビン受容体であり、ヘミンをよびヘモグロビンの両方の鉄源としての使用を可能にする。他方のＮ．meningitidisの推定受容体は、ヘミン受容体であり、ヘミンのみの利用を可能にする。この概要は、Ｅ．coli ＥＢ５３のヘミン利用を可能にする幾つかのコスミドクローンの単離とまた矛盾しない。これらのコスミドのＤＮＡは、我々のhmbＲとハイブリダイズせず、これらのクローンは、ヘミンのＮ．meningitidis細胞の周辺質への輸送を可能にする構造的に別の受容体タンパク質をコードすることが示される。実施例８ hmb Ｒ変異Ｎ．meningitidis細胞のビルレンスのインビボ弱毒化Ｎ．meningitidisにおけるインビボのヘモグロビンおよびヘミン清掃系の重要性を試験するために、Ｎ．meningitidis、血清型ＣのhmbＲ変異株および野生型を、５日令仔ラットに接種し、血液および脳脊髄液から回収される細菌の数を追跡した。これらの実験において、Ｎ．meningitidis，血清型Ｃのビルレンス効果は、仔近交系Ｌewisラット(Ｃharles Ｒiver，Ｓaint Ａubin les Ｅlbeufs，Ｆ rance)を使用したＮassif et al.(1992，同書)の記載と本質的に同じであった。近交系ラットは、個体差異を最小にするために使用した。簡便に、８０１３株を３動物継代により反応性にした。この３回目の継代後、一定量の細菌を−８０℃ に凍結した。感染中の変化が一つの本質的無毒変異株の選択により起こり得るという可能性を避けるために、８０１３の動物継代凍結ストック由来の一つの一定量をhmbＲ変異株由来の染色体ＤＮＡに形質転換し、得られたＫan^r形質転換体を更に精製することなく貯蔵し、−８０℃で凍結した。各実験において、全ての仔ラットは同じ同腹仔であった。Ｎ．meningitidis８０１３を一晩成育させ、２× １０⁶細菌を仔ラットに腹腔内注射した。これらのラットを各髄膜炎菌株に使用した。感染経過を、表示時間における血液回収により２４時間にわたり追跡した。２４時間目にラットを殺し、脳脊髄液(ＣＳＦ)を回収し、コロニー形成単位( ＣＦＵ)を測定した。各実験を繰り返した；同じ結果がどちらでも得られた。これらの実験結果を図６に示す。ヘモグロビンを鉄源として使用できないhmb Ｒ^-株は、野生型株と比較した場合、感染動物の血液から有意に少ない数で回収された。変異株および野生型株の両方とも脳脊髄液からの細菌の単離により示されるように、血液−脳関門をまだ通過できた。これらの結果は、ヘモグロビンがインビボ成育中のＮ．meningitidisの重要な鉄源であることを示す。実施例９Ｎ．meningitidis血清型およびＮ．gonorrhoeae由来のヘモグロビン受容体遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応増幅 hbＲ遺伝子およびそのプロモーターを有する３.３kb ＢamＨＩ−ＨindIIIＤＮ．meningitidisＡフラグメントのヌクレオチド配列から、Ｎ．meningitidis血清型ＡおよびＢならびにＮ．gonorrhoeae ＭＳ１１Ａ由来の相同性ヘモグロビン受容体タンパク質のインビトロ増幅の特異的オリゴヌクレオチドプロマー(promer) の領域を下記のように決定した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ；Ｓaik i et al.，1988，Ｓcience 230：1350-1354)を使用したインビトロ増幅のために開発した；Ｎ．meningitidis、血清型Ａのヘモグロビン受容体タンパク質増幅のために 5'-AAACAGGTCTCGGCATAG-3'(センスプライマー)(配列番号１１) 5'-CGCGAATTCAAACAGGTCTCGGCATAG-3'(アンチセンスプライマー)(配列番号１２); Ｎ．meningitidis、血清型Ｂのヘモグロビン受容体タンパク質増幅のために 5'-CGCGAATTCAAAAACTTCCATTCCAGCGATACG-3'(センスプライマー)(配列番号１３) 5'-TAAAACTTCCATTCCAGCGATACG-3'(アンチセンスプライマー)(配列番号１４)；Ｎ．gonorrhoeae ＭＳ１１Ａのヘモグロビン受容体タンパク質増幅のために 5'-AAACAGGTCTCGGCATAG-3'(センスプライマー)(配列番号１５) または 5'-CGCGAATTCAAACAGGTCTCGGCATAG-3'(センスプライマー)(配列番号１６) および 5'-CGCGAATTCAAAAACTTCCATTCCAGCGATACG-3'(アンチセンスプライマー)(配列番号１７) または 5'-TAAAACTTCCATTCCAGCGATACG-3'(アンチセンスプライマー)(配列番号１８)。Ｎ．meningitidis血清型ＡまたはＢまたはＮ．gonorrhoeae種由来のゲノムＤＮＡは、細菌細胞壁の酵素消化、タンパク質分解、プロテアーゼおよびＲＮase 消化、フェノールおよび／またはクロロホルムのような有機溶媒での抽出およびエタノール沈殿を含む標準技術(Ｓambrook et al.，同書)を使用して製造した。粗ＤＮＡ調整物もまた使用した。ゲノムＤＮＡの量(典型的に約０.１μｇ)を各増幅反応に使用した。ＰＣＲ増幅反応は、約２０ピコモルの各増幅プライマーおよび２００ナノモルの各デオキシヌクレオチド三リン酸を含む好適な緩衝液中でのＰfuポリメラーゼ(Ｓtratagene，ＬaＪolla，ＣＡ)および／またはＴaqポリメラーゼ(Ｂoehringer Ｍannheim，Ｇermany)を含む。増幅反応は、以下のスキームに従って行った：最初のサイクル９５℃で５分５１℃で２分７２℃で６分２−１３サイクル９５℃で４５秒４９℃で３５秒７２℃で１０分１４−３０サイクル９５℃で２５秒４７℃で３５秒７２℃で１０分増幅反応が終了すると、ＤＮＡフラグメントを平滑末端、またはＥcoＲＩ消化後、ＥcoＲＩ消化ｐＳＵＫＳまたはｐＷＫＳ３０ベクターにクローン化し、細菌に形質転換した。次いで、陽性選択クローンを、上記実施例４のように配列した組換え挿入体の存在について分析した。これらの実験の結果、Ｎ．meningitidis血清型ＡおよびＢおよびＮ．gonorrho eae ＭＳ１１Ａのヘモグロビン受容体遺伝子をコードする３つのクローンをクローン化し、これらの遺伝子の配列を測定した。これらの遺伝子の各核酸配列を図７(Ｎ．meningitidis、血清型Ａ)、８(Ｎ．meningitidis、血清型Ｂ)および９( Ｎ．gonorrhoeae ＭＳ１１Ａ)に示す。異なるＮ．meningitidis血清型およびＮ．gonorrhoeae ＭＳ１１Ａ由来のクローン化ヘモグロビン受容体間の相同性の割合を、上記実施例５に記載のように核酸およびアミノ酸比較により検討した。これらの比較の結果をそれぞれ図１０および１１に示す。３つのＮ．meningitidis血清型およびＮ．gonorrhoeae ＭＳ１１Ａ由来のヘモグロビン受容体遺伝子は、８６.５％から９３.４％の相同性であることが分かった；最も相同な核酸はＮ．meningitidis血清型ＢとＣおよび最も異なる核酸はＮ．meningitidis血清型ＢとＮ．gonorrhoeae ＭＳ１１Ａであった (図１０および表III)。すべての４つのＮeisseria種由来のヘモグロビン受容体タンパク質は、相互に、Ｎ．gonorrhoeae ＭＳ１１ＡとＮ．meningitidis血清型Ｂの８７％相同からＮ．meningitidis血清型ＡとＢの９３％相同の範囲の高い割合の相同性を示す(図１１)。この比較において、すべての４つの受容体は８４. ７％アミノ酸配列同一性および１１.６％までの配列類似性(すなわち、アミノ酸配列中の同じ部位の化学的に関連したアミノ酸残基)を有することが判明した。非保存アミノ酸残基は、ヘモグロビン受容体タンパク質の予定された地形学的構造における外部ループに対応するアミノ酸配列の領域に集まって発見された。上記の記載は本発明のある具体的な態様を記載し、それに相当なすべての修飾または置換が添付の請求の範囲に記載のように本発明の精神および範囲内であることは理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 ＡＤＺＡ６１Ｋ 39/395 ＡＤＺＤＣ０７Ｋ 14/22 Ｃ０７Ｋ 14/22 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ソ，マグダレーンアメリカ合衆国97221オレゴン州ポートランド、サウス・ウエスト・フォーティエイス・ドライブ 777番 (72)発明者ファ，ビビアンアメリカ合衆国97219オレゴン州ポートランド、サウス・ウエスト・フォース・アベニュー7011番 (72)発明者ヘフロン，フレッドアメリカ合衆国97068オレゴン州ウエスト・リン、ヒルサイド・ドライブ17887番 (72)発明者ナッシ，グザビエールフランス、エフ−75015パリ、リュ・ミオリ36番

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｎeisseria種からのヘモグロビン受容体タンパク質をコードする、分離および精製された組換え核酸。２．核酸が配列番号２に示されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有するヘモグロビン受容体タンパク質をコードする、請求項１の分離および精製された組換え核酸。３．核酸が配列番号４に示されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有するヘモグロビン受容体タンパク質をコードする、請求項１の分離および精製された組換え核酸。４．核酸が配列番号６に示されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有するヘモグロビン受容体タンパク質をコードする、請求項１の分離および精製された組換え核酸。５．核酸が配列番号８に示されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有するヘモグロビン受容体タンパク質をコードする、請求項１の分離および精製された組換え核酸。６．Ｎeisseria種からのヘモグロビン受容体タンパク質の均質調製物。７．タンパク質が配列番号２に示されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有する、請求項６のヘモグロビン受容体タンパク質の均質調製物。８．タンパク質が配列番号４に示されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有する、請求項６のヘモグロビン受容体タンパク質の均質調製物。９．タンパク質が配列番号６に示されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有する、請求項６のヘモグロビン受容体タンパク質の均質調製物。１０．タンパク質が配列番号８に示されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有する、請求項６のヘモグロビン受容体タンパク質の均質調製物。１１．Ｎeisseria種からのヘモグロビン受容体タンパク質をコードする核酸を含む、組換え発現構築物。１２．請求項１１の組換え発現構築物を含む形質転換細胞培養物。１３．核酸が配列番号２に示されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有するヘモグロビン受容体タンパク質をコードする、請求項１１の組換え発現構築物。１４．核酸が配列番号４に示されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有するヘモグロビン受容体タンパク質をコードする、請求項１１の組換え発現構築物。１５．核酸が配列番号６に示されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有するヘモグロビン受容体タンパク質をコードする、請求項１１の組換え発現構築物。１６．核酸が配列番号８に示されたアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有するヘモグロビン受容体タンパク質をコードする、請求項１１の組換え発現構築物。１７．請求項１３、１４、１５または１６の組換え発現構築物を含む形質転換細胞培養物。１８．Ｎeisseria種からのヘモグロビン受容体タンパク質の抗原性エピトープに免疫学的に活性な抗体またはその抗原結合フラグメント。１９．モノクローナル抗体である請求項１８の抗体。２０．配列番号２に示したヘモグロビン受容体タンパク質の抗原性エピトープに免疫学的に活性な、請求項１８の抗体またはその抗原結合フラグメント。２１．配列番号４に示したヘモグロビン受容体タンパク質の抗原性エピトープに免疫学的に活性な、請求項１８の抗体またはその抗原結合フラグメント。２２．配列番号６に示したヘモグロビン受容体タンパク質の抗原性エピトープに免疫学的に活性な、請求項１８の抗体またはその抗原結合フラグメント。２３．配列番号８に示したヘモグロビン受容体タンパク質の抗原性エピトープに免疫学的に活性な、請求項１８の抗体またはその抗原結合フラグメント。２４．Ｎeisseria種からのヘモグロビン受容体タンパク質の抗原性エピトープ。２５．ヘモグロビン受容体タンパク質が配列番号２に示したタンパク質である請求項２４の抗原性エピトープ。２６．ヘモグロビン受容体タンパク質が配列番号４に示したタンパク質である請求項２４の抗原性エピトープ。２７．ヘモグロビン受容体タンパク質が配列番号６に示したタンパク質である請求項２４の抗原性エピトープ。２８．ヘモグロビン受容体タンパク質が配列番号８に示したタンパク質である請求項２４の抗原性エピトープ。２９．疾患状態がＮeisseria種の細菌によるものであり、試薬が請求項１８、２０、２１、２２または２３の抗体を含む、ヒトにおける疾患状態を診断するための試薬。３０．疾患状態がＮeisseria種の細菌によるものであり、試薬が請求項１９の抗体を含む、ヒトにおける疾患状態を診断するための試薬。３１．疾患状態がＮeisseria種の細菌によるものであり、試薬が請求項１の核酸を含む、ヒトにおける疾患状態を診断するための試薬。３２．疾患状態がＮeisseria種の細菌によるものであり、試薬が請求項２、３、４または５の核酸を含む、ヒトにおける疾患状態を診断するための試薬。３３．疾患状態がＮeisseria種の細菌によるものであり、薬剤が請求項１８、２０、２１、２２または２３の抗体を含む、ヒトにおける疾患状態を治療するための薬剤。３４．疾患状態がＮeisseria種の細菌によるものであり、薬剤が請求項１９の抗体を含む、ヒトにおける疾患状態を治療するための薬剤。３５．疾患状態がＮeisseria種の細菌によるものであり、薬剤が請求項１の核酸またはそのアンチセンス相同体を含む、ヒトにおける疾患状態を治療するための薬剤。３６．疾患状態がＮeisseria種の細菌によるものであり、薬剤が請求項２、３、４または５の核酸またはそのアンチセンス相同体を含む、ヒトにおける疾患状態を治療するための薬剤。３７．疾患状態がＮeisseria種の細菌によるものであり、薬剤が請求項１１、１３、１４、１５または１６の組換え発現構築物またはその相同体（ヘモグロビン受容体をコードする核酸をアンチセンス方向に発現する）を含む、ヒトにおける疾患状態を治療するための薬剤。３８．モノクローナル抗体である請求項２０、２１、２２または２３の抗体。３９．請求項１９または３８のモノクローナル抗体を産生する細胞ライン。４０．ヒトにおけるＮeisseria種の細菌による疾患を治療する方法で、薬学的に許容される担体中の請求項３３、３４、３５、３６または３７の薬剤の治療上の有効量を投与する過程を含む方法。４１．ヒトにおけるＮeisseria種の細菌による疾患を診断する方法で、請求項２９、３０、３１または３２の検出可能レベルの試薬の量をヒトからの生物学的試料に、試薬がＮeisseria細菌に特異的に結合する条件で接触せしめ、そして生物学的試料への特異的結合量を検出する過程を含む方法。４２．ヘモグロビン結合タンパク質またはその抗原性フラグメントを含むヒトのＮeisseria種の細菌感染に対する免疫を与えるのに効果的なワクチン。４３．請求項６、７、８、９または１０のヘモグロビン受容体タンパク質を含む、請求項４２のワクチン。４４．Ｎeisseria種からのヘモグロビン受容体タンパク質またはその抗原性フラグメントをコードする核酸を含む、請求項４２のワクチン。４５．請求項２、３、４、５、１１、１３、１４、１５または１６の核酸を含む、請求項４４のワクチン。４６．請求項１７の形質転換細胞培養物の細胞を含む、請求項４２のワクチン。４７．細胞が弱毒化細菌細胞である、請求項４８のワクチン。４８．細胞がＳalmonella細胞である、請求項４７のワクチン。４９．請求項２４、２５、２６、２７または２８のヘモグロビン受容体タンパク質のエピトープを含む、請求項４２のワクチン。