JPH10508865A - 抗炎症性活性を有するペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からの１０Ｋｄａ熱ショックタンパクの少なくとも２５％が１〜２５フラグメントと相同な配列を有するアミノ酸２５個からなるペプチドを開示する。本発明のペプチドは抗炎症性活性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗炎症性活性を有するペプチド 本発明は熱ショックタンパクのペプチド誘導体および炎症性病変の治療へのそ の利用に関する。 熱ショックタンパク（以下”ＨＳＰ”と表示する）はストレス状態下の細胞、 特にミコバクテリアによって生産される。ミコバクテリア等の原核生物は高濃度 のＨＳＰを発現し、その一部、例えば６５ｋＤタンパクは免疫優性抗原であり、 したがってワクチン例えば抗結核菌ワクチンとしての利用が期待される［（Ｋａ ｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７，３５１ （１９８７）］。ＷＯ８９/１２４５５には、このような系統のタンパクまたは そのフラグメント、特に６５ｋＤタンパクの非ウイルス性感染に対するワクチン としての利用および免疫反応の誘導に関してヒントが示されている。 当該系統に含まれる特定のタンパクは、各種の病変に有用であると記載されて いる。例えば、ＷＯ ９０/１０４４９には、６５ｋＤのＨＳＰの診断薬としての 利用およびインシュリン非依存性糖尿病治療への利用が開示されている。当該タ ンパクは、自己免疫性関節炎の発現に関与するミコバクテリア特異性エピトープ を有することが知られている［Ｇａｓｔｏｎ，Ｊ．Ｆ．ら,Ｎａｔｕｒｅ，３３ １，１７１（１９８８）］。 １０ｋＤの分子量を有するＨＳＰの配列はＢａｉｒｄ，Ｐ．Ｎ．ら，Ｊ．Ｇｅ ｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１３５，９３１−９３９（１９８９）によって開示され、 結核菌ＢＧＣから得られることが記載されている。一方、Ｍｅｈｒａ，Ｖ．ら， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５，２７５−２８４（１９９２）は、らい菌（Ｍｙ ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）から得られた同一分子量の相同性タン パクを開示している。Ｂａｒｎｅｓ，Ｐ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１４８， １８３５−１８４０（１９９２）は、結核菌から得られた１０ｋＤタンパクが高 い免疫反応性抗原であり、抗結核ワクチンとして有用であることを開示している 。Ｈａｒｔｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ，８９，３３９４−３３９８（１９９２）は、哺乳類において前記の文献に記 載されている１０ｋＤタンパクと相同なタンパクを同定している。 本発明者らは、結核菌のＨＳＰの１〜２５フラグメントと少なくとも２５％が 相同な配列を有するアミノ酸２５個からなるペプチドが抗炎症性活性を有するこ とを発見した。 したがって、本発明は、２５％またはそれ以上が相同で、以下のアミノ酸配列 （配列識別番号１）を有する２５個のアミノ酸からなるペプチドに関する。 ＮＨ₂−Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａ ｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌ ｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ−ＯＨ ここで、Ｎ−末端はアシル化されていてもよい。 特に、アミノ酸配列Ｉを有する１〜２５のペプチドが好ましい。 前記ペプチドは炎症性病変の治療、特にリュウマチ様関節炎の治療に有用であ る。 本発明に係わるペプチドは、従来の化学的ペプチド合成法によって合成する。 この方法は、本来Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．によって開発された固相法（ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６４，３，ｐｐ．１３８５；Ｔｈｅ Ｐｅｐｔ ｉｄｅ １９７９，２，ｐｐ．１−２８４， Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｊ．Ｍｅｉ ｅｎｈｏｆｅr編）である。別の方法として、同様に固相で、フロー法を適用し 、場合によって側鎖を酸に不安定な基で保護したＦｍｏｃ−アミノ酸を用いて合 成することもできる［Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．＆ Ｓｈｅｐｐａｒｄ Ｒ．Ｃ． ，”Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ −ａ Ｐ ｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，Ｏｘｆｏｒｄ， １９８９］。後者の場合、市販の自動的または半自動的合成装置（例えば、Ｍｉ ｌｌｉｇｅｎ^R ９０５０）を用い、固体保持相としてこの合成法に適した樹脂 （例えば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製樹脂ＮｏｖａＳｙｎ^RまたはＭｉｌｌｉｇ ｅｎ ＫＡ製樹脂ＰｅｐＳｙｎ^R）を使用する。通常これらの樹脂はノルロイシ ン残基（内部標準アミノ酸として）を含み、これに合成を行うペプチドを捕捉す るためのアンカー剤が結合している。アンカー剤は、例えばｐ−ヒドロキシメチ ル−フェノキシ酢酸であってもよい。この場合、市販の樹脂のうち、エステル結 合によって樹脂に結合した最初のアミノ酸の保護誘導体のみを含む樹脂であって も よい。一般に、いずれの場合も合成装置製造業者によって提供された標準操作法 および当該分野の専門家にとっては容易に予想できるその改良法にしたがって、 当該装置を用い、ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解させた２０％ピリジンを用 いた脱保護、ＤＭＦを用いた短時間の反復洗浄、アシル化、再度ＤＭＦを用いた 反復洗浄からなる一連の操作を自動的に行ってペプチドの合成を行う。ペプチド を組み立てるための活性化エステルとして単一の保護アミノ酸を用いる。前記エ ステルは、例えばフェノール系エステルまたは１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾ ールまたは３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベン ゾトリアジンエステルまたはそれらの類縁体として、あらかじめ形成させるか、 市販のものを使用するか、単離することなくｉｎ ｓｉｔｕで合成する。実際に は、適切に保護されたアミノ酸を、選択したフェノール誘導体例えばペンタフル オロフェノール、または１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）また は３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリア ジン（ＨＯＤｈｂｔ）の存在下で、例えばジシクロアルキル−カルボジイミド、 ジアルキル−カルボジイミドまたはベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−ト リス−（ジメチルアミノ）−ホスフォニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯ Ｐ）およびそれらの類縁体等の濃縮剤と反応させる。各濃縮工程で、アミノ基に 対して４倍量を使用する。合成段階終了時に、当該分野の専門家にとっては自明 の手順のいずれかを用いて樹脂からペプチドを分離する。例えば、樹脂−ペプチ ド０．５ｇを９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％チオアニソール、３％エ タンジチオール、２％アニソールの混合液約１０ｍｌに懸濁させ、窒素を充填し 、軽く撹拌しながら室温に４時間保つ。ついで、アイスバスで冷却した１０〜２ ０倍量のエチルエーテル中に直接濾過する。濾過または遠心分離により沈澱を集 め、一夜真空乾燥する。ペプチドを適当な緩衝液に溶解させ、凍結乾燥する。別 の方法として、樹脂−ペプチド０．５ｇを、１Ｍのトリメチル−シリル−ブロマ イド（Ｍｅ３ＳｉＢｒ）、１Ｍのチオアニソール、０．２５Ｍのエタンジオール を含むトリフルオロ酢酸液約２５ｍｌに懸濁させ、窒素を充填し、軽く撹拌しな がら全体を０℃に１時間保つ。ついで、樹脂を濾過し、少量の純ＴＦＡで洗浄す る。濾液を濃縮乾固し、残渣をエチルエーテル中で摩砕し、濾過または遠心 分離し、ついで一夜真空乾燥する。ペプチドを適切な緩衝液に溶解させ、凍結乾 燥する。 以下に実施例をあげて、本発明をさらに詳細に説明する。 実施例結核菌からのＨＳＰ−１０の１〜２５フラグメントの合成 配列：Ｈ−Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇ ｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ−ＯＨ 固体保持体［Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＰｅｐＳｙｎ ＫＡ（１００）； 樹脂置換容量０．０９ｍｍｏｌ/ｇ］をＭｉｌｌｉｇｅｎ^R９０５０合成装置のカ ラムに充填し、一連の標準的な脱保護およびアシル化に供した。用いた各単一ア ミノ酸残基はα−アミノ基をＦｍｏｃで保護したものであり、一方側鎖の保護基 はリジンではｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）とし、アスパラギン 酸、グルタミン酸、セリンおよびスレオニンではｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）と した。このように保護したアミノ酸は、ＨＯＤｈｂｔとしてあらかじめ活性化し たセリンおよびスレオニンを除き、いずれもペンタフルオロフェノールエステル としてあらかじめ活性化した。約６０分間で単一および/または二重カップリン グサイクルによって、Ｃ−末端アミノ酸から各単一残基を順次組み込んだ（モル 濃度で４倍量）。樹脂からのペプチドの最終解裂および側鎖からの保護基の解離 は、前記の手順を用い、ペプチド−樹脂０．５ｇの規模で行った。凍結乾燥後、 粗ペプチド（分子量：２６８４；理論収量１２０ｍｇ）１００ｍｇが得られ、収 率は８３％であった。５０ｍｇを半精製逆相カラム(Ｖｙｄａｃ Ｃ４，２５ｘ １ｃｍ)に載せ、溶出溶媒Ａ）０．０８５％ＴＦＡ水溶液で平衡させ、溶出溶媒 Ｂ）アセトニトリル：水（８０：２０）中０．０８５ＴＦＡを用い、流速３．０ ｍｌ/分で０．２７％Ｂ/分のグラジエント溶出を行った。このようにして１３ｍ ｇの製品を得、粗ペプチドに対する最終収率は２６％であった。ペプチドの相対 純度は、逆相Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラム（１５０ｘ４．６ｍｍ）を装着したＨＰＬ Ｃを用い、溶出溶媒Ａ）水：アセトニトリル（９８：２，ｖ／ｖ）中０．０４５ ％および溶出溶媒Ｂ）アセトニトリル中０．０３６％ＴＦＡのグラジエント溶出 により測定した。 ペプチドのアミノ酸組成（表１）は、１％（ｖ／ｖ）のフェノールを含む６Ｎ ＨＣｌを入れた密封小型瓶中で１１０℃、真空下で２２時間加水分解した後、 ＢＥＣＫＭＡＮ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ １２６アミノ酸分析計で測定した。 ペプチド含有量は、８８％であった。ペプチドの分子量は、質量スペクトロメー タ（ＢＩＯＭＡＳＳスペクトロメータ、エレクトロスプレーイオナイザー、クア ドルポール、精度０．０５〜０．０１％）で測定した。理論値：２６８４；分析 値：２６８４。 本発明に係わるペプチドは、以下に述べる薬理試験（アジュバント関節炎試験 ）によって明らかなように各種の起源の異なる炎症性病変の治療に有用である。 熱処理によって不活性化した結核菌（系統Ｃ、ＤＴおよびＰＮ；Ｃｅｎｔｒａ ｌ Ｖｅｔ． Ｌａｂｓ−ＧＢ）を滅菌パラフィン油に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で 懸濁させ、０．１ｍｌをＣＯ₂麻酔下のＷｉｓｔａｒ系ラット１５匹（Ｃ．Ｒｉ ｖｅｒ;体重１３０〜１４０ｇ）に皮内注射した。ラットを各群５匹の３群に分 け、前記の処置から４、５および６日後に関節炎誘導と同じ手順を用い、第１群 にはＰＢＳ １００μｌに溶解させたペプチドＩを５０μｇ／ラット、第２群に はＰＢＳのみを投与し、第３群はなにも投与しなかった。以下の臨床学的採点法 を用い、関節炎の発症を追跡した。評点 症状 ０ 炎症なし １ 軽度の発赤および足底の腫脹 ２ 腱が判別できないほどの足底の腫脹 ３ 足関節にまでひろがった腫脹 ４ 顕著な炎症および足関節の変形 各足底の評点を０〜４までとし、さらにタイに（ｏｎ ｔｈｅ ｔｉｅ）小結 節が認められた場合は別の評点を用い、耳にまで影響が認められた場合にはさら に別の評点を用いた。したがって、最低０から最高１８までの評点を用いた。 結果を表２および３に示す。 したがって、本発明の目的は前記のペプチドを炎症性病変の治療に用いること である。前記の用途に関連した工業的側面を考慮すると、製剤組成物とすること も含まれる。期待される医薬品としての用途として、本発明に係わるペプチドは 非経口的投与用の製剤組成物として調剤し、特に皮内、皮下および関節内に注射 できる製剤に調剤して投与する。皮内および皮下注射用製剤に関しては、有効成 分を再蒸留水に溶解させ、必要であればデキストロースまたは塩化ナトリウム等 の等張剤、ｐ−ヒドロキシ−ベンゾエート等の抗菌性物質および緩衝液、例えば ＰＢＳ等のリン酸緩衝液を添加してもよい。関節内注射用製剤に関しては、前記 のような等張剤をその他の医薬品添加物とともに添加する必要がある。また有効 成分は、４〜８％のマンニトールまたはラクトースを含む復元可能な凍結乾燥製 品として製剤することもできる。薬量は治療すべき病変の種類および強さ等の各 種のパラメータおよび患者の状況（体重、性別、年齢等）によって異なることは 言うまでもない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年１１月４日 【補正内容】 請求の範囲 １．アミノ酸配列Ｉを有するペプチド ２．有効成分として請求項１に記載のペプチドと適当な担体を含む医薬用調製物 ３．請求項１に記載のペプチドの炎症性病変治療用医薬調製物への利用 ４．請求項１に記載のペプチドのリウマチ性関節炎治療用医薬調製物への利用

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フォサッティ、ジャンルカ イタリア国 イ−20099 セスト エッセ. ジョヴァンニ ヴィア ジー． カルド ゥッチ 125 (72)発明者 マスカニ、パオウロ イタリア国 イ−20099 セスト エッセ. ジョヴァンニ ヴィア ジー． カルド ゥッチ 125 (72)発明者 グロモ、ジャーンニ イタリア国 イ−20099 セスト エッセ. ジョヴァンニ ヴィア ジー． カルド ゥッチ 125

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも２５％が相同で、以下のアミノ酸配列Ｉ：ＮＨ₂−Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔ ｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ−ＯＨ（Ｉ）を有する２５個のアミノ酸からなり、必要に応 じてＮ−末端がアシル化されているペプチド ２．アミノ酸配列Ｉを有する請求項１に記載のペプチド ３．有効成分として請求項１または２に記載のペプチドと適当な担体を含む医薬 用調製物 ４．請求項１または２に記載のペプチドの炎症性病変治療用医薬調製物への利用 ５．請求項１または２に記載のペプチドのリウマチ性関節炎治療用医薬調製物へ の利用