JPH10509080A - 細胞間マトリックス微粒子を備えた生重合体フォーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生重合体溶液を重合してゲルを形成し、そのゲルを凍結乾燥し、更に紫外線放射によって架橋して、生重合体フォームを形成する。このフォームはコラーゲン溶液で満たし、この組合わせを凍結乾燥する。又はこのフォームを、細胞間マトリックス微粒子を含んだコラーゲン溶液で満たす。そしてこの組合わせを凍結乾燥し、よって細胞間マトリックス微粒子が付着したフォームを形成する。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞間マトリックス微粒子を備えた生重合体フォーム 発明の背景 コラーゲンスポンジ又はフォーム（発泡体）は止血剤として長らく使用され、 最近では生体内の組織修復用の骨組みとして、また三次元での細胞機能の研究の ための様々な細胞タイプのシーディング用の生体内研究ツールとして利用されて きた。コラーゲンスポンジは免疫抗原性は低く、細胞が付着し、相互作用を及ぼ し、分解可能な自然発生的な構造を備えた蛋白質からなっている。しかし多くの 場合コラーゲンスポンジは、上記の目的などで使用するために、ある程度の湿潤 強度及び溶解に対する所定の抵抗を与えるため通常は架橋される。一般的に、細 胞を囲む細胞間マトリックスとの細胞及び組織相互作用において、架橋によって 細胞中の他の分子や細胞に対して通常の結合部位が減少させたり、劣化したりす る。また、コラーゲンスポンジ、ゼラチンスポンジ、ポリビニルスアルコールポ ンジは、細胞の細胞間マトリックス環境に典型的に存在する生物学的な活動を欠 いている。しかし、その欠損によって架橋されたコラーゲンスポンジは試験管内 では殆ど再生を誘発しないし、試験管内の細網及び臓器モデルとしてはあまり役 に立たない。 よって、ここに上述した問題を解決又は改善する、優れた生重合体フォームを 提供する必要性が存在する。 発明の要約 本発明は、スポンジ及び細胞間マトリックス微粒子を備えたフォームを形成す る方法を含む。 このスポンジは、生重合体フォーム及び細胞間マトリックス微粒子から形成さ れている。本発明の方法は、生重合体溶液を形成する段階と、この生重合体溶液 の中の生重合体を重合して生重合体格子を形成する段階を含む。この生重合体格 子は、架橋してフォームを形成し、凍結乾燥する。コラーゲン溶液中に浮遊して いる細胞間マトリックス微粒子を凍結乾燥したフォームに付加して細胞間マトリ ックス微粒子を備えた生重合体フォームを形成する。 本発明には、多くの利点がある。その一つは、様々に利用法がある３次元モデ ル系が形成できることである。これらの利用法には、基礎及び応用研究に用いら れる装置、癌などの疾病状態を研究するために異常な細胞を植え付ける植付け床 、このフォーム内又は上で培養された癌細胞を殺す能力のある作用物質を選択す ることで化学療法戦略を決定するための診断テストとして使用される装置、及び このフォーム内又は上の細胞が接触させられる様々な物質の毒性をテストするた めの装置などが含まれる。 発明の詳細な説明 本発明の方法及び装置の特徴や詳細は、添付の図面を参照して以下に更に詳し く説明されており、特許請求の範囲で明確に述べてある。異なった図面の同様な 符号番号は同様の部材を示している。本発明の実施例は、説明の目的で記載され ており、発明を限定的に意味するものではないことは理解されるはずである。本 発明の主要な特徴は、その範囲から逸脱せずに様々な実施例によって実現可能で ある。特に記載されていなければ、全ての割合や百分率は重量を基にしたもので ある。 生重合体は、生物学的適合性を備えたフォーム（発泡体）又はスポンジ状構造 を形成できるものが好ましい。この生重合体は無毒及び生物被吸収性である。更 に、この生重合体が分解された生成物も無毒である。これらの生重合体には、コ ラーゲン、アルギン酸、ポリビニルアルコール、及びトロンビンと反応してフィ ブリンを生成するラミニン、フィブロネクチン、フィブリノーゲンのような蛋白 質を含む。生重合体の好適な原料物質はコラーゲンを含み、とりわけ損傷を与え ずに得られ、羊膜に入った状態の出産が近い家畜ブタの胎児の皮膚からなる。コ ラーゲンを得るためのその他の原材料としては、ブタ、ウシ、ヒツジ、海洋性動 物や、真皮、腱、歯組織、結合組識などの器官がある。胎児の組織は、通常の組 織内では幾つかの異なる成段階で存在する様々の分子要素を含んでいるので有利 で都合がよい。複数の生重合体を組み合わせて使用してもよい。一実施例では、 生重合体はコラーゲン及びフィブロネクチンである。生重合体は帯、シート、チ ューブ等の様々な形状のフォームを形成するために使用できる。これらの形状は 取り替える組織や身体部分形状に形成された人工器官とすることができる。細胞 間マトリックス微粒子をこの生重合体に結合してもよい。 細胞間マトリックスの微粒子は特定の組織から取り出すことが出来る。これら の微粒子は２つの情報特性を備えている。最初の特性は分子多様性で、２番目は 微細構成であり、これらの２つの情報特性は上記極微粒子を生成した後も保存さ れる。細胞間マトリックスの異なる分子間の好適な関連も極微粒子を調製する際 に維持される。 細胞間マトリックスには指示を与える特性が有り、それが取り囲んだり、それ に接して形成される細胞の活動を誘導する。細胞分裂、形態形成、分化、細胞構 築、再生を引き起こすための細胞プログラムの実行は、細胞間マトリックスから 発せられる信号によるので、一般的な細胞間マトリックス及び特定の組織から得 られた細胞間マトリックスの分子多様性及び微細構成を示す実際のマトリックス 成分を備えたコラーゲンスポンジやフォーム等の３次元骨組は強化されることに なる。 細胞間マトリックスの微粒子は、細胞発達に必要な成長因子を含むシトキニン を含んでいてもよい。これらの生物分子因子は通常の組織内では、例えば細胞分 裂、形態形成、及び分化などの異なる成長段階で存在する。これらの因子のなか には、生体内での組織修理に必要な信号を提供する刺激分子がある。成長因子を 含むこれらのシトキニンは、細胞間マトリックス極微粒子の一部であって、移植 片から取り替え対象となる自然組織の機能的代替物への変換の刺激となる。この 変換は、組織細胞を近接の類似の細胞や、循環や、幹細胞レザバーから可動化す ることによって達成される。その変換によって細胞分裂や形態形成や分化が促進 される。細胞は、生物被吸収性である人工器官に付着し、これらの人工器官を代 替組織へと再成形する。 細胞の成長に必要な成長因子は、細胞間マトリックスの構造要素に付着する。 これら構造要素は蛋白質、糖たんぱく質、プロテオグリカン、グリコサミノグリ カンを含む。これら成長因子は、細胞により生成および分泌され、細胞間マトリ ックスに結合して、様々な方法で細胞の行動を制御する。これらの因子には、表 皮成長因子、繊維芽細胞成長因子（塩基性及び酸性）、インスリン成長因子、神 経成長因子、肥満細胞成長因子、血小板に起因する成長因子、βトランスフォー ミング成長因子、散乱因子、肝細胞成長因子、シュヴァン細胞成長因子などがあ る。アダムス等による「細胞間マトリックスによる発達と分化の調整」、発達Ｖ ｏｌ．１１７、１１８３−１１９８頁（１９９３）（以下、アダムス等と称す） 及びクレイス等編「細胞間マトリックス及び癒着性蛋白質ガイドブック」オック スフォード大学出版（１９９３）（以下、クレイス等と称す）には、発達と分化 の調整を行なう細胞間マトリックス成分についてまとめられており、関連する調 整機能について及び成長因子と細胞間マトリックス分子が様々の方法で相互に作 用して細胞の行動を調節することが述べられている。更にアダムス等には、成長 因子と細胞間マトリックス蛋白質の関連の実例及び、細胞間マトリックスが微小 環境の重要な部分をなし、成長因子と協力して発達と分化の調整の中心的役割を 果たしていることを説明している。アダムス等及びクレイス等の教示はここに編 入される。 移植組織を製造するための細胞間マトリックス微粒子の生成方法には、生きた 細胞を含む組織源を冷凍して、その生きた細胞が分断され細胞残存物が形成され る段階を含む。この組織源は次に低温粉砕して微粒子を製造する。粉砕した微粒 子は解凍してシトキニンを含む細胞間マトリックス微粒子を残すように処理され る。シトキニンという用語には、成長因子、インターロイキン、インターフェロ ン、群生刺激因子などを含む。洗浄工程により、細胞残存物は除去されるが、細 胞成長、形態形成、及び分化に必要な成長因子やその他の因子は除去されない。 細胞間マトリックスは凍結乾燥され、所望であれば更に破片にする。 移植組織を製造するための細胞間マトリックス微粒子を生成する一方法が、１ ９９２年８月７日に出願された米国特許出願番号第０７／９２６，８８５号に、 「移植組織の細胞間マトリックス製造方法」という発明の名称で開示されており 、 その教示はここに編入される。移植組織を製造するための細胞間マトリックス微 粒子を生成するこの方法は、生きた細胞を含む結合組識源を冷凍して、その生き た細胞が分断され細胞残存物が形成される段階を含む。この結合組識源は処理さ れて、細胞残存物は除去されるが、細胞成長、形態形成、及び分化に必要な成長 因子を残すようにして、細胞間マトリックスを生成する。細胞間マトリックスは 凍結乾燥され、破片にする。細胞間マトリックスは更に細胞形質組成物及び核組 成物を除去して、組織成長に必要な成長因子を残すように処理され、細胞間マト リックス微粒子を生成する。一実施例では、３次元マトリックスにおいてコラー ゲン繊維と関連した細胞間マトリックス微粒子は培養した細胞に露出されるが、 その際に培養した細胞が細胞間マトリックス微粒子のみに、或はコラーゲン繊維 にも付着して移植組織を形成するような方法で露出される。 被覆工程は、細胞間マトリックスをコラーゲンフォームに加える段階の前に行 われてもよいし、並行して行われてもよい。この細胞間マトリックスを加える目 的は、細胞及び分子結合部位は架橋の結果損傷しているので、コラーゲンフォー ムの表面にこうした結合部位を設けることである。更には、コラーゲンのような マトリックス重合体を他の蛋白質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、 ＥＣＭ酵素、シトキニン（成長因子を含む）、グリコシドに結合させた典型的に は５０から５００マイクロメーターのサイズの合成微小構造物を、コラーゲンフ ォームの表面に塗布溶液と共に塗布する湿った又は乾燥した微粒子の形状で形成 できる。選択した成分は、化学的或は静電気的に生重合体に結合させたり、微粒 子格子内部又はこの格子を脱水したものの内部に含有させることも出来る。 コラーゲンを組織から抽出する一つの好適な方法では、コラーゲン源はブタの 胎児を含む。胎児は子宮内において子宮が端部を紐で結ばれて破壊されていない 状熊で冷凍される。解剖の１２時間から２４時間前に子宮を冷凍室から取出して 、摂氏４度に保った冷蔵室に入れる。この子宮は、まだ９０％は冷凍状態にある はずだが、無菌の大型の洗い桶に移しかえる。折り曲げられた状態の子宮をでき るだけ早く、丁寧に直線状に伸ばす。子宮の外表面は、１％の漂白剤を含んだミ リ−Ｑ（商標）水で１０分間の洗浄を２回行なう。その後、無菌のミリ−Ｑ（商 標）水で洗浄を２回行ない子宮を滅菌する。 クリーンルームにて、組織握持用の大型の無菌鉗子、大型の鋏、無菌の手袋、 マスク、フード、ガウンを使用或は着用して、主血管の反対の表面から子宮の全 長を開く。この際に胎児の羊膜に触れたり、傷つけたりしないように注意する。 子宮の外面に触れた器具は、７０％のエチルアルコールで洗浄し、ブンゼンバー ナーで無菌にする。各胎児は子宮から静かに持ち上げ、へそは子宮から少なくと も２ｃｍの箇所で切断する。まだかなり凍った状態にある胎児をステンレススチ ール製の皿に載せる。 無菌手袋を用いて、羊膜を取り除き、胎児を無菌ガラス皿に移しかえる。無菌 のメス（例えば１１番）で各足部の周りの皮膚を円形切開する。皮膚にメスを入 れ、各肢の内表面に沿って体幹の腹側の表面の正中線まで切開する。正中線切開 を体幹の腹側に沿って尻尾から頚部まで行なう。この際、その下層の筋肉組織を 切らないように注意する。頭部の周囲を皮膚のみを切るように円形切開する。こ こで皮膚を体から剥がす。剥がした皮膚は氷で冷やした無菌容器（蓋付きの１リ ットル容量の遠心分離ボトル）に移す。皮膚はそれと同量の無菌の氷と合せ、粉 砕した組織は、燐酸緩衝液を含む食塩水（ＰＢＳ）を約３３％とミリ−Ｑ（商標 ）水（つまり１対２の比率で）を２０リットル用意し、その中で３０分の間隔を 置いて２回洗浄する。この２回の洗浄の間に組織が沈降する。組織は、複数の１ リットル容量の遠心分離ボトルに均等に分け入れ、各ボトルに０．５モルの酢酸 及び４ミリモルのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加える。これらの遠心 分離ボトルは約摂氏４度に保って７日間ローラーボトル装置上に載置する。 この皮膚処理開始後の８日目に、遠心分離ボトルを５，０００ｒｐｍの回転速 度で３０分間回転させる。得られた上清は無菌の大型ガラス瓶（２０乃至５０リ ットル）に無菌状態で収集し、４層の無菌チーズクロスで濾過する。無菌の塩化 ナトリウムをこの溶液に加え、約０．９モルにする。１時間ほど攪拌した後、一 夜摂氏４度に保った冷蔵室で保管する。そしてコラーゲンを再浮遊させる。この 全食塩沈降溶液及び沈降物は、複数の１リットル容量の無菌遠心分離ボトルに分 け入れ、１リットルボトルを６つセット可能なローターを用いて７，２８０ｇの 重力で、それらのボトルを５，０００ｒｐｍの回転速度で３０分間回転させる。 得られた上清を除去し、ペレットは続けて処理される。各遠心分離ボトル内のペ レットに、ｐＨ２．５で０．５モルの酢酸及び４ミリモルのエチレンジアミン四 酢酸（ＥＤＴＡ）を加える。ペレットはこの媒体中で分散させて、摂氏４度の気 温で約１６時間ジャイレータ振盪機の中で振り混ぜる。各ボトルをこの０．５モ ルの酢酸及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液でゆすいで、ペレットを ６リットル容量のフラスコにつぎ込んで移す。フラスコの中でペレットは無菌の ガラス棒で分散させる。フラスコは、摂氏４度の気温で２４時間振盪機に載置し 、可溶化と再浮遊の程度を調べる。０．５モルの酢酸及びエチレンジアミン四酢 酸（ＥＤＴＡ）溶液を追加して全体の量を５リットルにしてもよい。 無菌の塩化ナトリウムをフラスコに追加して全体の量を７リットルに増加する 。１時間以上に亘り時々攪拌した後、一夜摂氏４度に保った冷蔵室で保管して塩 類を沈殿させる。 内容物を振り混ぜて、複数の１リットル容量の無菌処理した遠心分離ボトルに 分け入れ、７，２８０ｇの重力で、それらのボトルを５，０００ｒｐｍの回転速 度で３０分間回転させる。第２回目の再浮遊を第１回目の再浮遊に関して述べた 工程と同じ様に実行する。しかし、６リットルで再浮遊を行なう代わりに、総量 ２リットルをこの再浮遊工程で使用する。フラスコは、必要なら量を調整して一 夜摂氏４度に保った冷蔵室で振り混ぜる。 溶液は、１００リットルの氷温の０．０５％で０．５モルの酢酸に透析バッグ を介して接触させて透析するが、その条件は６，０００から８，０００ＭＷ（分 子量）カットオフのスペクトラポア透析バッグを用いて約２０から２４時間の間 、３回ほど摂氏４度に保った冷蔵室で透析する。透析バッグは無菌のメスで切り 開き、内容物を無菌の容量２５０ｍｌ（ミリリットル）の遠心分離ボトルに分け 入れ、１０，０００ｒｐｍ（１３，０００ｇの重力）の回転速度で１時間回転さ せる。上清は無菌の密封したボトルに入れ、保管する。 ０．５ｍｌの上清を部分標本として取出し、同量の濃縮塩化水素に加えて、コ ラーゲン濃度をヒドロキシプロリンアッセイを使って測定する。コラーゲンは、 中空繊維フィルターを用いて理論濃度の５ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。濃度はヒド ロキシプロリンアッセイを使って確認できる。 上記手順で準備された生重合体溶液をウェル容器に容れる。この容器に容れる 前に、そのコラーゲン溶液は発泡しなくなるまで真空でガス抜きされる。実施例 の中には、その溶液をおよそ３０分間、５乃至１０ｍｍＨｇの圧力に晒らす例も ある。そのウェル容器に、フォームの所要の厚みで決まる一定量の生重合体を満 たす。直径およそ１．２センチメートルの容器は４．０マイクロリットルの溶液 で満たされて、厚さおよそ１．５ミリメートルのフォームが作られる。ウェル容 器の大きさ及び形状には制限がなく、凍結乾燥物の所要の形状が作れればよい。 各容器の生重合体の濃度はコラーゲンが１ミリリットル当たり０．３ミリグラム から１０ミリグラムの間で、生成物の所要の密度によって決められる。好適な一 実施例では、濃度がおよそ１ミリリットルあたり３．０ミリグラムの溶液が使用 されている。コラーゲン溶液を液体の状態から直接凍結乾燥することが可能だが 、好適な実施例のなかには、コラーゲン溶液を水酸化アンモニヤ蒸気に晒し２９ パーセント溶液から重合したり、或いはコラーゲン溶液に塩基を加えてゲルを生 成しつつｐＨ７にすることによって重合したりする例もある。重合率は温度に比 例するので、その率は容器中のコラーゲン溶液の温度調節によって制御できる。 この溶液の重合化及びコラーゲンの格子の形成後、この格子は凍結乾燥の前に 或いはその後に波長およそ２５４ｎｍの紫外線放射によって架橋される。凍結乾 燥前に架橋される場合は、照射強度はおよそ１平方センチメートル当たり０．３ ８ｘ１０の７乗倍マイクロジュールでよい。凍結乾燥後に架橋される場合は、こ の照射強度は上述の値のおよそ４倍でよい。紫外線の被曝量は所要の架橋の程度 によっては増加してもよい。０．５ｘＰＢＳ中１５ミリモルカーボジアミドとの 化学的架橋もまた利用される。 フォーム形成のために利用される凍結乾燥作業手順は、凍結、排気、加熱の一 サイクルからなり、そのサイクルは重合体の濃度の関数として変化させる。つま り、共融温度と呼ばれる素材全体が凍結するための必要最小凍結点が溶液中或は 重合格子中の生重合体の濃度によって異なるからである。一実施例として、コラ ーゲンを保存凍結乾燥してフォームを形成するサイクルがある。そのサイクルは まず、約１２時間およそ摂氏マイナス３０度に保ち、その後およそ摂氏マイナス ２６度にその温度を上げて約１２時間そのままの温度で保持する。その後残余の サイクルで、０．０１乃至０１ミリバールの真空状態にし、その間に温度をおよ そ摂氏マイナス１０度からマイナス１５度の間になるまで上げ、そのままの温度 を８時間保ち、その後更に摂氏プラス２０度まで上げて、その温度を８時間保つ 。 ゲル状態で生成物が架橋される場合は、そのフォームはその凍結乾燥後に処理 が可能である。そうでない場合は、そのフォームはそれが準備されてから架橋さ れる。凍結乾燥され、架橋されたフォームは、次の段階で以下のような溶液で満 たされるその成型容器から除去される必要はない。これらの溶液とは次のうちの 一つである。１）およそ１ミリリットル当たり０．３から１０ミリグラムの範囲 の濃度の架橋されていないコラーゲン溶液であり、直径およそ１．２センチメー トルの容器に対して加えられる溶液量はおよそ０．４ミリリットル位となる。２ ）上記（１）と同様のものであるが、コラーゲン溶液に細胞間マトリックス微粒 子を混入したものを含んだ溶液。３）上記（１）と同様のものに、例えば以下の ような細胞間マトリックス成分中のどれかを単独か或いは組み合わせたものを含 むもの。この細胞間マトリックス成分には、蛋白質、糖蛋白質、プロテオグリカ ン、細胞間マトリックス酵素、更に成長因子、インターリューキン、インターフ ェロン、細胞コロニー刺激因子、及びグリコシドのようなシトキニンが含まれる 。４）上記（１）と同様のものであるが、水化或いは脱水化状態にあるコラーゲ ン或いは他の生重合体或いはヒドロゲルの極微粒子を加えた溶液であり、その極 微粒子には細胞間マトリックス成分が結合せずに注入されており、その球状の極 微粒子構造の計測直径はおよそ５０マイクロメートルと５００マイクロメートル の間である。５）重合体物質が微粒子に化学的或いは静電気的に結合しているも の。 上記容器に上述の溶液のうちの一つを満たした後に、それぞれの種類の溶液の 所要の共融温度が選択されて、二回目の凍結乾燥サイクルへ進む。しかしながら 、今回は生成物は架橋されることはなく、コラーゲン皮膜及びコラーゲン溶液に 組み込まれたその他の如何なる成分の生物学的活動もこの処理で影響を受けるこ とはない。 上記に記載されたような最終或は中途寸法が直径１．０乃至１．２センチメー トル、厚みは１．０乃至５．０ミリメートル或いはそれ以上のフォームディスク は、細胞培養用に使用されるコーニングコスター型のトランスファー容器に挿入 される。トランスファー容器に挿入されるフォーム挿入物は、上記に記載の４種 類のうちのどれでもよい。即ち、コラーゲン溶液で皮膜されていないもの、コラ ーゲン溶液で皮膜されたもの、或いは上記に記載のどの形態であれ細胞間マトリ ックス成分を含むコラーゲン溶液で皮膜されたものである。各フォームディスク には組織培養媒体の中で組織細胞が植え付けられる。フォーム（開放型細胞フォ ームであるが）の間隙を占有する為に選択される細胞は通常は細胞間マトリック スで包まれているタイプのものである。一実施例では、組織細胞が中和されたコ ラーゲンの溶液中に混入されて、そのために細胞がフォームの中でコラーゲンゲ ルで包まれるようになっているものがある。この実施例では、他の表現型の細胞 、特に内皮、表皮或いは中皮細胞がゲルの下方表面或いは上方表面で平板培養さ れ、それによって２、３のあるいはそれ以上の種類の細胞と同等な組織を構成す る。 上述のように細胞間マトリックス成分を含む様々な種類のコラーゲン溶液で処 理された人工器官の形状をしたシート、チューブ、ロッド、カップ及びその他の 形状のフォームは、人体の代替器官として利用されることになる。例えば、１． ０平方センチメートルの矩形であって、１乃至３ミリメートルの厚みがあり、そ こに架橋されたコラーゲンのエプロン紐状体を備えたものは歯周の人工器官とな り得る。この例はフォームの全表面を、歯及びその周囲を形成する組織から得ら れた細胞間マトリックス微粒子で被覆したものである。その微粒子は選定された 細胞間マトリックス成分が検査され、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−Ｂ２、ＰＤＧＦ、ＩＬ １α、デコリン及びＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンが含まれていることが示される 。人工歯周器官は、治療用生体吸収器官として歯周病に罹っている患者に対して 、当業者がそれらに普通に実践しているような方法で治療中の歯を処置した後に 取り付けられる。本マトリックスは、歯を歯茎骨に固定する歯周じん帯や、その 歯茎骨を取り巻く結合組織や、その歯茎骨自体の再生を誘発することができる。 フォームはその成分のおかげで組織細胞に認識される。即ち、細胞がその成分か ら信号を受け取り、その成分に付着して再成形することができるからである。含 まれるＦＧＦ成分のおかげでフォームは脈管形成性があり、毛細引力循環を引き 起こす能力をもつ。製造される人工器官の各々のに対して、特定の組織用或いは 一般的な組織用の細胞間マトリックス成分が、組織形成及び再生に必要な情報を 伝達するために利用されることになる。 人工器官として設計され又細胞間マトリックス成分を備えるフォームは、移植 に先立って組織細胞を植え付けすることができる。例えばチューブの形状をなす 人工血管は、送出後ゲル状になる中和されたコラーゲン溶液中で送出される滑ら かな筋肉細胞を内部に植え付けられ、外膜性線維芽細胞を外部に植え付けられ、 そして内皮細胞を管腔表面に植え付けられる。同様に、微粒子で被覆されたフォ ームには、膵臓内分泌腺の細胞のような腺細胞が、移植の前及び（或いは）後の 細胞増殖促進手段として植え付けられる。よって細胞が植え付けられたフォーム 移植片の移植後及び血管新生後に、機能代替する腺の発達が期待できるものであ る。 張力が顕著に増大する２倍の密度のフォームもまた形成することができる。以 下の手順はあらゆる形状をしたフォーム物質に適用できる。フォームが任意の形 状をした型の中で凍結乾燥され、通常の方法で架橋される。その後そのフォーム は先ず無菌緩衝剤で、更に脱イオン化水で入念に洗浄される。その洗浄されたフ ォームが更に成型される場合は、所望の型に入れて、その型の上で或いはその型 の輪郭にそって成形或いは形成することができる。成形及び洗浄済みのフォーム 及び平坦な洗浄済みのフォームは無菌環境でおよそ摂氏３７度を超えない温度で 空気乾燥される。 同等物 ここに説明された発明の具体的な実施例の同等物が可能であることは、当業者 には直ちに、又は単純な実験のみを行えば明らかであろう。これらの同等物は、 以下の特許請求の範囲に包含されるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１月３０日 【補正内容】 （国際出願日における明細書６頁の差し替え） 移植組織を製造するための細胞間マトリックス微粒子の生成方法には、生きた 細胞を含む組織源を冷凍して、その生きた細胞が分断され細胞残存物が形成され る段階を含む。この組織源は次に低温粉砕して微粒子を製造する。粉砕した微粒 子は解凍してシトキニンを含む細胞間マトリックス微粒子を残すように処理され る。シトキニンという用語には、成長因子、インターロイキン、インターフェロ ン、群生刺激因子などを含む。洗浄工程により、細胞残存物は除去されるが、細 胞成長、形態形成、及び分化に必要な成長因子やその他の因子は除去されない。 細胞間マトリックスは凍結乾燥され、所望であれば更に破片にする。 移植組織を製造するための細胞間マトリックス微粒子を生成する一方法が、１ ９９４年２月１７日に公開されたＰＣＴ公開番号第ＷＯ９４／０３５８４号に、 「移植組織の細胞間マトリックス製造」という発明の名称で開示されており、Ｗ Ｏ９４／０３５８４号の教示はここに編入される。移植組織を製造するための細 胞間マトリックス微粒子を生成するこの方法は、生きた細胞を含む結合組識源を 冷凍して、その生きた細胞が分断され細胞残存物が形成される段階を含む。この 結合組識源は処理されて、細胞残存物は除去されるが、細胞成長、形態形成、及 び分化に必要な成長因子を残すようにして、細胞間マトリックスを生成する。細 胞間マトリックスは凍結乾燥され、破片にする。細胞間マトリックスは更に細胞 形質組成物及び核組成物を除去して、組織成長に必要な成長因子を残すように処 理され、細胞間マトリックス微粒子を生成する。 請求の範囲（翻訳文） １． ブタから得られた生重合体繊維によって囲まれた間隙を備えた生重合体マ トリックスを含む生重合体フォーム。 ２． 前記生重合体がコラーゲン、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ラミニ ン、フィブリノーゲン、及びフィブロネクチンからなるグループから選択された 請求項１に記載の生重合体フォーム。 ３． 前記生重合体が少なくとも２種類の異なる生重合体の混合物を含む請求項 １に記載の生重合体フォーム。 ４． 前記生重合体がコラーゲンである請求項２に記載の生重合体フォーム。 ５． 前記コラーゲンがブタの胎児コラーゲンである請求項４に記載の生重合体 フォーム。 ６． 前記フォームの前記間隙を占有する細胞を更に含む請求項１に記載の生重 合体フォーム。 ７． 細胞間マトリックス微粒子を更に含む請求項１に記載の生重合体フォーム 。 ８． 前記生重合体フォームが架橋されている請求項１に記載の生重合体フォー ム。 ９． コラーゲン被膜を更に含む請求項１に記載の生重合体フォーム。 １０． コラーゲンで被覆された生重合体フォームを形成する方法であって、 ブタから得られた生重合体の溶液を作成し、 前記生重合体溶液中の前記生重合体を架橋し、 前記生重合体溶液を凍結乾燥し、生重合体フォームを形成する、段階からなる 方法。 １１． 前記架橋段階の前または後に、前記生重合体溶液中の前記生重合体を重 合して生重合体格子を形成する段階を更に含む請求項１０に記載の方法。 １２． 前記架橋段階が前記凍結乾燥の後に行われる請求項１０に記載の方法。 １３． 前記生重合体がコラーゲンを含む請求項１０に記載の方法。 １４． 前記コラーゲンがブタの胎児コラーゲンを含む請求項１３に記載の方法 。 １５．請求項１０に記載の方法で形成される生重合体フォーム。 １６． コラーゲンで被覆された生重合体フォームを形成する方法であって、 生重合体溶液を作成し、 前記生重合体溶液中の前記生重合体を重合し、それによって生重合体格子を形 成し、 前記生重合体格子を架橋し、 前記生重合体格子を凍結乾燥してフォームを形成し、 前記凍結乾燥されたフォームにコラーゲン溶液を付加し、コラーゲンで被覆さ れた生重合体フォームを形成する、段階からなる方法。 １７． 前記コラーゲン溶液が細胞間マトリックス微粒子を含む請求項１６に記 載の方法。 １８． 前記生重合体がコラーゲンを含む請求項１６に記載の方法。 １９． 前記コラーゲンがブタのコラーゲンである請求項１８に記載の方法。 ２０． 細胞間マトリックス微粒子を含んだ前記フォームを凍結乾燥する段階を 更に含む請求項１６に記載の方法。 ２１． 前記付加段階後に、前記コラーゲン溶液及びフォームを凍結乾燥し、よ ってコラーゲンで被覆されたフォームを形成する段階を更に含む請求項１７に記 載の方法。 ２２． 細胞間マトリックス微粒子の被膜を備えた生重合体フォームを形成する 方法であって、 生重合体溶液を作成し、 前記溶液を凍結乾燥し、それによって前記生重合体溶液からフォームを形成し 、 コラーゲン溶液中で浮遊した細胞間マトリックス微粒子で前記フォームを被覆 し、 細胞間マトリックス微粒子で被覆された前記フォームを凍結乾燥し、それによ って細胞間マトリックス微粒子で被覆された生重合体フォームを形成する、段階 からなる方法。 ２３． ２倍密度生重合体フォームを形成する方法であって、 生重合体溶液を作成し、 前記生重合体溶液中の前記生重合体を架橋し、 前記生重合体溶液を凍結乾燥しフォームを形成し、 前記フォームを洗浄し、 前記フォームが選択された形状を備えるように成形し、 前記の成形されたフォームを乾燥する、段階からなる方法。 ２４． 前記架橋段階の後に、前記生重合体溶液中の前記生重合体を重合して生 重合体格子を形成する段階を更に含む請求項２３に記載の方法。 ２５． 前記架橋段階が前記凍結乾燥の後に行われる請求項２３に記載の方法。 ２６． 請求項２３に記載の方法で形成される２倍密度生重合体フォーム。 ２７． 生重合体フォームと、 細胞間マトリックス微粒子と、を含むスポンジ。 ２８． 前記生重合体がコラーゲン、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ラミ ニン、フィブリノーゲン、及びフィブロネクチンからなるグループから選択され た請求項２７に記載のスポンジ。 ２９． 前記生重合体が少なくとも２種類の異なる生重合体の混合物を含む請求 項２７に記載のスポンジ。 ３０． 前記生重合体がコラーゲンである請求項２８に記載のスポンジ。 ３１． 前記コラーゲンがブタのコラーゲンである請求項３０に記載のスポンジ 。 ３２． 前記コラーゲンが架橋されたコラーゲンを含む請求項３０に記載のスポ ンジ。 ３３． 前記コラーゲンが架橋されていないコラーゲンを含む請求項３０に記載 のスポンジ。 ３４． 前記細胞間マトリックス微粒子が、前記フォーム全体に分散されている 請求項２７に記載のスポンジ。 ３５． 前記細胞間マトリックス微粒子が、前記フォームを満たすコラーゲン溶 液内で分散されている請求項３４に記載のスポンジ。 ３６． コラーゲン溶液中の細胞間マトリックス微粒子の浮遊物が前記生重合体 フォームの表面に被覆される請求項１に記載のスポンジ。 ３７． 前記生重合体フォーム及び前記浮遊物が冷凍乾燥される請求項３６に記 載のスポンジ。 ３８． チューブ形状の請求項１に記載の生重合体フォーム又は請求項２７に記 載のスポンジを含む血管人工器官。 ３９． 前記チューブが、内部には滑らかな筋肉細胞を植え付けられ、外部には 外膜性線維芽細胞を植え付けられ、管腔表面には内皮細胞を植え付けられる請求 項３８に記載の血管人工器官。 ４０． 請求項１に記載の生重合体フォーム又は請求項２７に記載のスポンジを 含む腺移植片であって、前記フォームに腺細胞が植え付けられた腺移植片。 ４１． 前記腺細胞が膵臓から得られた請求項４０に記載の腺移植片。 ４２． 請求項１に記載の生重合体フォーム又は請求項２７に記載のスポンジを 含む歯周人工器官であって、前記生重合体フォーム又は前記スポンジに歯周靭帯 細胞が植え付けられた歯周人工器官。 ４３． 細胞間マトリックス微粒子を更に含む請求項４２に記載の歯周人工器官 。 ４４． 歯周病の治療方法であって、エプロン形状に形成された請求項１に記載 の生重合体フォーム又は請求項２７に記載のスポンジの紐を歯の周囲に結び付け 、前記エプロンを歯周靭帯修復を必要とする歯の部分に固定する歯周病の治療方 法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ａ）生重合体フォームと、 ｂ）細胞間マトリックス微粒子と、を含むスポンジ。 ２． 前記生重合体フォームがコラーゲンを含む請求項１に記載のスポンジ。 ３． 前記コラーゲンが架橋されたコラーゲンを含む請求項２に記載のスポンジ 。 ４． 前記コラーゲンが架橋されていないコラーゲンを含む請求項２に記載のス ポンジ。 ５． 前記コラーゲンが生重合体内部でゲルを形成する請求項２に記載のスポン ジ。 ６． 細胞間マトリックス微粒子が、前記フォームを満たすコラーゲン溶液内で 分散されている請求項１に記載のスポンジ。 ７． コラーゲン溶液中の細胞間マトリックス微粒子の浮遊物が前記生重合体フ ォームの表面に被覆される請求項１に記載のスポンジ。 ８． 前記生重合体フォームと浮遊物が架橋される請求項７に記載のスポンジ。 ９． 前記細胞間マトリックス微粒子が前記生重合体フォーム内部で含浸されて いる請求項７に記載のスポンジ。 １０． コラーゲンで被覆されたフォームを形成する方法であって、 ａ）生重合体溶液を作成し、 ｂ）前記生重合体溶液中の前記生重合体を重合し、それによって生重合体格子 をつくり、 ｃ）前記生重合体格子を架橋してフォームを形成し、 ｄ）前記フォームを凍結乾燥し、 ｅ）前記凍結乾燥されたフォームにコラーゲン溶液を付加し、それによって前 記コラーゲンで被覆されたフォームを形成する、段階からなる方法。 １１． 前記コラーゲン溶液が細胞間マトリックス微粒子を含む請求項１０に記 載の方法。 １２． 前記生重合体がコラーゲンを含む請求項１１に記載の方法。 １３． 前記架橋が紫外線照射により行われる請求項１２に記載の方法。 １４． 細胞間マトリックス微粒子を含む前記フォームが更に凍結乾燥される請 求項１１に記載の方法。 １５． コラーゲンで被覆されたフォームを形成する方法であって、 ａ）生重合体溶液を作成し、 ｂ）前記生重合体溶液中の前記生重合体を重合し、それによって生重合体格子 を形成し、 ｃ）前記生重合体格子を紫外線照射で架橋して生重合体フォームを形成し、 ｄ）前記フォームを凍結乾燥し、 ｅ）前記凍結乾燥されたフォームにコラーゲン溶液を付加し、 ｆ）前記コラーゲン溶液及びフォームを凍結乾燥して、それによって前記コラ ーゲンで被覆されたフォームを形成する、段階からなる方法。 １６． 前記コラーゲン溶液が細胞間マトリックス微粒子を含む請求項１５に記 載の方法。 １７． 前記生重合体がコラーゲンを含む請求項１６に記載の方法。 １８． 前記の重合された生重合体が架橋される請求項１７に記載の方法。 １９． 細胞間マトリックス微粒子の被膜を備えた生重合体フォームを形成する 方法であって、 ａ）生重合体溶液を作成し、 ｂ）前記溶液を凍結乾燥し、それによって前記生重合体溶液からフォームを形 成し、 ｃ）コラーゲン溶液中で浮遊した細胞間マトリックス微粒子で前記フォームを 被覆し、 ｄ）細胞間マトリックス微粒子で被覆された前記フォームを凍結乾燥し、それ によって細胞間マトリックス微粒子で被覆された生重合体フォームを形成する、 段階からなる方法。 細胞間マトリックス微粒子を備えた生重合体フォーム