JPH10509135A

JPH10509135A - 抗−ｇｐ４８抗体の能動的誘導もしくは受動免疫、および単離されたｇｐ４８タンパク

Info

Publication number: JPH10509135A
Application number: JP8510394A
Authority: JP
Inventors: カートビー．オスター、; チャン−ホハン、
Original assignee: ヴェリゲンインコーポレイテッド
Priority date: 1994-09-15
Filing date: 1995-09-15
Publication date: 1998-09-08
Also published as: AU3591095A; EP0781296A1; WO1996008511A1; US5830476A; CA2200087A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、単離されたｇｐ４８糖タンパク、抗−ｇｐ４８抗体で受動免疫する方法、および抗−ｇｐ４８抗体を生成するための能動免疫の方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】抗−ｇｐ４８抗体の能動的誘導もしくは受動免疫、および単離されたｇｐ４８タンパク発明の背景米国特許５，２８６，８５２（この全てをここで参照として引用する）において、特定のＨＩＶ−１溶解単離物（メリーランド州コロンビア、アドヴァンスト・バイオテクノロジーズ社（Advanced Biotechnologies Inc.）、およびバッファロー、セルラー・プロダクツ社（Cellular Products，Inc．）から得られるＨＩＶ−１溶解物（lysate））で免疫されたブタが、ＨＩＶ−１ウエスタンブロット（例えば、米国エピトープ（Epitope）社製のオルガノン・テクニカ（Organon Teknika）からのＨＩＶ−１ウエスタンブロット）において46,000ダルトン〜53 ,000ダルトンの範囲の領域に現れる糖タンパクに特異性を有する抗体を生成することが示された。このバンドはブロードなバンドとして現れ、ｇｐ４８と名付けられた。ｇａｇ（ｒｐ２４）およびｅｎｖ（ｒｇｐ１６０、ｒｇｐ１２０、Ａｇｍｅｄ）のような組み換えＨＩＶ−１タンパクで免疫されたブタは、ｇｐ４８に反応性のある抗体を生成しない。’８５２特許に記載されているように、ＨＩＶ−１溶解物中に存在するこのタンパクの正確な起源は立証されなかったが、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）であるヒト細胞からの細胞膜タンパクまたはＨＩＶ−１タンパクに関連していると考えられた。ＨＩＶ−１に感染したヒト、およびＡＩＤＳを患っているヒトにおける抗−ｇｐ４８ブタ免疫血清（ＰＡＳＳＨＩＶ−１^TMとして調製されたもの）のインビボでの効果が、オスター（Osther）らにより記載された（オスター（Osther，K.）ら、ＡＩＤＳ１９９２、第６巻、１４７５頁、ここに参照として組み入れる）。ＰＡＳＳＨＩＶ−１を受け入れた患者の一部は正常なＣＤ４数を有し、免疫能力があると考えられた。現在までに、約２０〜３０人の患者が、ＰＡＡＳＳＨＩＶ−１を５日間の間に毎日０．３〜１５グラムを投与するサイクルで少なくとも１回静脈内輸液が行われた。ＨＩＶ−１感染者およびＡＩＤＳ患者の受動的な治療に用いられる抗体製剤中における抗−ｇｐ４８の存在は、確かに、感染の拡大から保護するのに重要であるようだ。発明の概要本発明は、抗−ｇｐ４８抗血清との免疫反応性により同定される単離されたｇｐ４８タンパクを提供する。単離されたｇｐ４８は、他のソースからのｇｐ４８関連タンパクの単離のため、およびアッセイ手順中におけるそのようなタンパクの同定のための特異的マーカーもしくは標準タンパクとして有用である。例えば、ｇｐ４８タンパクの存在について試験すべき臨床サンプル単離物、培養単離物、組織単離物や他のサンプルを試験する場合などである。ｇｐ４８タンパクは、ＣＤ４＋細胞、ウィルス溶解物、Ｈ９細胞、組織および器官から単離することができる。好ましい態様においては、ｇｐ４８はＨ９細胞から単離される。本発明は、有効な量のｇｐ４８タンパクで哺乳動物を免疫することを備える能動免疫により哺乳動物において抗−ｇｐ４８抗体を発生させる方法も提供する。一つの態様において、ｇｐ４８タンパクは実質的に精製されている。別の態様においては、ｇｐ４８タンパクは、細胞溶解物の一成分であるか、ウィルス溶解物の一成分であるか、タンパク混合物の一成分であるか、もしくは組み換えＤＮＡから製造されるものである。本発明は、さらに、有効な量の抗−ｇｐ４８抗体で免疫化することを備える哺乳動物の受動免疫方法を提供する。好ましい態様において、抗−ｇｐ４８抗体は、ブタ起源のものである。別の態様においては、抗−ｇｐ４８抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり、ＨＩＶ−１ウィルスと組み合わせて投与され、異種のタンパクまたは組織と共に導入される。本発明は、タンパクと抗−ｇｐ４８抗体とを組み合わせて哺乳動物を免疫することを備えるタンパクの免疫原性を能動的にまたは受動的に低下させる方法をも提供する。図面の簡単な説明図１は、抗−ｇｐ４８陽性血清への血清学的転換（セロコンバージョン、sero conversion）を示す一連のＨＩＶ−１ウエスタンブロットストリップ（１〜１７）である。ｇｐ４８タンパクは、４８〜５２とマークされた領域に単離される。図２は、抗−ｇｐ４８陽性血清への血清学的転換（セセロコンバージョン、se roconversion）を示す一連のＨＩＶ−２ウエスタンブロットストリップ（１〜１７）、陰性対照ストリップ（Ｎ）および陽性ＨＩＶ−２ストリップ（Ｐ）である。ｇｐ４８タンパクは、４８とマークされた領域に単離される。図３は、ｇｐ４８の溶離プロフィールを示す。図４ａは、クーマシーブルー染色によるカラムからのタンパクの分析を示し、図４ｂは、ｇｐ４８についてのウエスタンブロット上の移されたタンパクを示す。発明の詳細な説明ＨＩＶ−１溶解物（ｇｐ４８を含む）に対するブタ抗体を、上述のＨＩＶ−１感染者またはＡＩＤＳ患者に投与（５日の期間中、毎日14グラムまでのブタの免疫グロブリンＧ）したところ、静脈内輸液の前、途中、後の患者からの血清サンプルについて行ったＨＩＶ−１ウエスタンブロットは、ウエスタンブロット上で抗ＨＩＶ−１抗体の増加を示す場合があった。驚くべきことに、実質な量（１４グラムまで）のブタＩｇＧ抗−ｇｐ４８の注入後においてさえも、患者の血清中には通常、いかなる抗−ｇｐ４８抗体も決して検出されず、ＨＩＶ−１溶解物に共通の他のタンパクに対する通常の抗体のみであった。驚くべきことに、ヒトの患者においては、彼らのＨＩＶ−１感染段階（無症候感染から進行したＡＩＤＳまで）に拘わらず、抗−ｇｐ４８はこの免疫化条件の下で吸着または結合され、ｇｐ４８が患者に存在していることを示していた。ある患者は、結果的に抗−ｇｐ４８を産生するように血清学的に転換（セロコンバート、seroconvert）された。実施例は、ｇｐ４８タンパクのソースの決定およびこのタンパクの特性付けを示している。抗−ｇｐ４８抗体をＨＩＶ−１ウィルス溶解物での免疫化により生成し得ること（’８５２特許）が示されているが、驚くべきことに、ＨＩＶ−２ウィルス溶解物およびＨ９細胞による免疫化によっても同じ応答が生じるということが示された。対照実験では、ＨＩＶタンパクによる免疫化によっては抗−ｇｐ４８が生成しなかったことが示された。ｇｐ４８は、ＣＤ４＋細胞上に見出される膜表面タンパクであることが示された。すなわち、抗−ｇｐ４８とＨＩＶ−１とは、ｇｐ４８膜タンパクの部分を含む細胞膜上の一つの領域に対して競いあうであろう。それにより、ＨＩＶ−１感染個体の受動免疫療法において用いられる製剤中の抗−ｇｐ４８は、感染していないＣＤ４＋細胞への引き続いて起こるＨＩＶ−１感染の防止に積極的に関与する。ＨＩＶ感染患者における古典的なＡＩＤＳの症状が無いことに抗−ｇｐ４８が関係することのインビボでの証拠がある。すなわち、既に存在している抗−ｇｐ４８抗体を有する患者は、ＨＩＶ−１感染に対して保護され、ＨＩＶ−１感染の拡大を制限し得る。臨床的にテストされた患者の少なくとも一人が、ＨＩＶ−１ウエスタンブロットで抗−ｇｐ４８陽性であり、ＰＣＲによりＨＩＶ−１感染の証拠が示された。この患者は、１９８６年にＨＩＶ−１ウエスタンブロットで試験したときに、抗 −ｇｐ４８陽性に血清学的に転換（セロコンバート、seroconvert）した。今日まで、古典的なＨＩＶ−１タンパクに対する同定可能な抗体により定義される古典的なＨＩＶ−１感染のいかなる証拠も示していないが、抗−ｇｐ４８陽性を維持している。この患者は１９８７年に腎臓移植を受け、この種の患者は腎臓の拒絶を防止するために免疫抑制剤を摂取するという事実によりＨＩＶ−１関連症状を呈することが予期されているので、このことは一層驚くべきことである。すなわち、患者に抗−ｇｐ４８抗体が存在することにより、患者は少なくとも進行性のＨＩＶ−１感染に対して保護されている。従って、本発明のタンパクと方法は、ＨＩＶ−１感染、ＨＩＶ−２感染およびＣＤ４＋細胞への結合を引き起こす他のレトロウィルス感染に対する別のワクチン接種手段を提供する。本発明は、例えばＨＩＶ−１株のようなウィルスにおける構造的な突然変異に影響を受けないワクチンを提供する。すなわち、本発明は、抗−ｇｐ４８抗血清との反応性により同定される単離されたｇｐ４８タンパクを提供する。本発明は、タンパクの精製中にｇｐ４８関連タンパクを検出するのに有用な組成物を提供する。ｇｐ４８タンパクは、サイズマーカーおよびタンパク標準として有用である。ｇｐ４８タンパクは、血清または組織サンプル中において特異的抗−ｇｐ４８抗体を検出するのに有用である。単離されたｇｐ４８タンパクは、被検者において抗−ｇｐ４８免疫応答を発生させるための被検者の能動免疫に有用である。さらに、本発明は、被検者において抗−ｇｐ４８抗体を発生させるための被検者の能動または受動免疫する方法を提供する。すなわち、本発明の方法は、ｇｐ４８に対する特異的な免疫応答を発生させ、それらに対する抗体を製造するのに有用である。本発明の方法は、ｇｐ４８に対する特異的な免疫応答を得るための有用な方法を提供する。オクタロニー（Ouchterlony）免疫拡散法を用いて、患者中のブタ免疫グロブリン（ＨＡＰＡ）に対するいかなるヒト抗体も検出することができなかった。一部の血清をブタＩｇＧウエスタンブロットを用いて試験したが、やはりヒト抗ブタ抗体（ＨＡＰＡ）は示されなかった。すなわち、抗−ｇｐ４８タンパクを用いての外来タンパクの免疫化は、外来タンパクの免疫原性を変性し得る。すなわち、本発明はまた、抗−ｇｐ４８抗体と組み合わせて行う免疫化によりタンパクの免疫原性を低下させる。以下の実施例は説明のためのものであり、本発明の開示を限定する意図はない。実施例１ＨＩＶ−１溶解物からの抗−ｇｐ４８不活性化ＨＩＶ−１溶解物で免疫されたブタにおける血清学的転換（セロコンバージョン、seroconversion）を示すために、タンパク濃度０．９０ｍｇ／ｍｌの不活性化ＨＩＶ−１溶解物（ＨＴＬＶ−IIIＢ．オルガノン・テクニカ社（Org anon Teknika）製）を１接種当たり１００μｇの投与量で用いて一匹のブタを免疫した。最初の接種は、フロイントの完全アジュバント中に乳化させたＨＩＶ− １溶解物からなり、これを皮下投与した。第２の免疫化は、フロイントの不完全アジュバント中に乳化させたＨＩＶ−１からなり、これを２日目に皮下投与し、第３の免疫化は１７日目に行い、第４の免疫化は３１日目に行った。ＨＩＶ−１ウエスタンブロットストリップ（パン・データ・システムズ社（Pa n Data Systems Inc．）製）での抗−ｇｐ４８抗体の最初の出現は、ストリップＮｏ．６（図１、ＨＩＶ−１ブロットの写真）上でＨＩＶ−１の特異的なタンパクバンドと共に観察された。ストリップＮｏ．６を、１１日目に採取した血液からの血清サンプルと反応させた。ｇｐ４８タンパクは、ブタにおいて高い免疫原性を示した。および適当な条件下において、いかなる被験体においても同じ免疫応答は認められていない。実施例２ＨＩＶ−２溶解物からの抗−ｇｐ４８驚くべきことに、Ｈ９細胞のようなＣＤ４＋細胞から誘導されたＨＩＶ−２溶解物でブタを免疫すると、ＨＩＶ−２ウエスタンブロットにより示されるようにｇｐ４８に対する反応が見られ、ＨＩＶ−１ウエスタンブロットと同様であることがわかった（ＨＩＶ−２ウエスタンブロット、ワシントン州シアトル、ジェネティック・システムッズ社（Genetic Systems）製；図２）。不活性化されたＨＩＶ−２溶解物で免疫されたブタにおける血清学的な転換（セロコンバージョン、seroconversion）を研究するために、タンパク濃度０．８６ｍｇ／ｍｌの不活性化ＨＩＶ−２溶解物（ヒルクレスト・バイオロジクス社（ Hillcrest Biologics Inc,）製）を１接種当たり１００μｇの投与量で用いて一匹のブタを免疫した。最初の接種は、フロイントの完全アジュバントと混合したＨＩＶ−２溶解物からなり、これを皮下投与した。第２の免疫化は、フロイントの不完全アジュバントと混合したＨＩＶ−２からなり、これを２日目に皮下投与し、第３の免疫化は１７日目に行い、第４の免疫化は３１日目に行った。ＨＩＶ−２ウエスタンブロットストリップ（ジェネティック・システムズ社（Gene tic Systems Inc.）製）上での抗−ｇｐ４８抗体の最初の出現は、ストリップＮｏ．１１（図２）上でＨＩＶ−２の特異的なタンパクバンドと共に観察された。ストリップＮｏ．１１を、２３日目に採取された血液からの血清サンプルと反応させた。これらの結果は、ＨＩＶ溶解物により検出されるように、ＨＩＶ−２の免疫化によって抗−ｇｐ４８応答が生じ得ることを示している。実施例３Ｈ９細胞からの抗−ｇｐ４８驚くべきことに、溶解されたＨ９細胞のみでブタを免疫すると、抗−ｇｐ４８抗体が産生されることもわかった。一匹のブタ（混合ヨークシャー）を、１９８７年１２月にオシオーラのゴットフライド・ケラーマンズ・ファーム（Gottfried Kellermann's Farm）からの感染していないＨ９細胞溶解物の上澄で免疫した。上澄のタンパク濃度は測定しなかった。ブタをフロイントの完全アジュバント１ｍｌと混合した上澄１ｍｌで免疫した。追加の免疫の投与はフロイントの不完全アジュバントと混合し、２〜３週間毎にブタの首に皮下投与した。１〜２回の追加免疫の後、ブタの耳の静脈から採取した血液をＨＩＶ−１ウエスタンブロット（ＨＩＶ−１クィックウエスタンブロット、ベリーゲン社（Verigen Inc.）製）でテストした。拡散したタンパクバンドがｇｐ４８領域で検出され、それは、Ｈ９（ＣＤ４＋）細胞からの細胞成分に対する抗体をブタが生成したことを示している。このブタからの血清は、ＨＩＶ−１ウエスタンブロットストリップで試験したときに、ｇｐ４８に対する抗体反応のみを含むようであった。このことは、ｇｐ４８タンパクがＨ９細胞培養物から生じ、ＣＤ４＋ヒト細胞系からを意味するもので、細胞が不死のＴ細胞リンパ芽球細胞系であっても、ｇｐ４８タンパクが生成されることを示している。ＣＤ４＋細胞がその細胞膜の一部としてｇｐ４８タンパクを有することが予想される。Ｈ９細胞を用いて繰り返されるこの免疫化試行は同様な結果を示すはずである。これらの結果は、ｇｐ４８タンパクが免疫するために用いられる細胞系の一成分であり、ＨＩＶ溶解物中の存在は細胞から失われた結果であって、ＨＩＶによるものではないことを示している。実施例４対照実験．Ａ．ブタをｇｐ１２０、ｇｐ１６０および組み換えｐ２４（ｒｐ２４）組み換えＨＩＶタンパクで免疫したとき、ブタにおいて抗−ｇｐ４８抗体が発生しないことがわかった。オシオーラ（Osceola）のゴットフライド・ケラーマンズ・ファーム（Gottfri ed Kellermann's Farm）で３匹のヨークシャー混合養育ブタを、組み換えｇｐ１６０（ｒｇｐ１６０）、組み換えｇｐ１２０（ｒｇｐ１２０）および組み換えｐ２４（ｒｐ２４）でそれぞれ免疫し、また、マサチューセッツ州、イースト・エイカー・ファーム（East Acr e Farm）の一匹のブタ（混合ヨークシャー）をｒｇｐ１２０ＭＮで免疫した。ブタに、最初の接種として、フロイントの完全アジュバントと混合したこれらの組み換えタンパクのいずれかを皮下注射し、ついで、その後の接種として、フロイントの不完全アジュバントと混合したこれらの組み換えタンパクのいずれかを皮下注射した。これらのブタから得られた高免疫血清をＨＩＶ−１ウエスタンブロットにおいて試験すると、免疫に用いた組み換えタンパクに特異的な抗体が存在した。しかしながら、前記ｇｐ４８領域では反応がなかった。結果は、抗−ｇｐ４８の反応が上記組み換えＨＩＶ−１タンパクのいかなるものによっても誘発されないことを示している。Ｂ．免疫していないヨークシャー混合養育ブタから血液を採取し、ＨＩＶ−１ウエスタンブロットにおいて試験した。これらのいかなるブタにおいても抗−ｇｐ４８の反応は見られず、これは、抗−ｇｐ４８が免疫されていないブタ中に既に存在している抗体ではないことを示している。Ｃ．抗−ｇｐ４８抗血清サンプルを、ＨＩＶ−１組み換えウエスタンブロットストリップにおいて試験した。これらのＨＩＶ−１組み換えウエスタンブロットストリップでは反応は検出されず、これは、ｇｐ４８がこれらの種類のストリップ（ブリティッシュ・バイオテック・アンド・チロン（British Biotech and Chiron））上のＨＩＶ−１関連エピトープの一部ではないことを示している。実施例５ｇｐ４８熱感受性ヒト抗−ｇｐ４８血清と抗−ｇｐ４８活性を有するブタ血清とを比較すると、ストリップ上の反応タンパクの局在化および現れる方が類似していることがＨＩＶ−１ウエスタンブロットで明らかである。（ＨＩＶ−１溶解物のような）ｇｐ４８含有タンパク製剤を６０℃に加熱して不活性化し、次にニトロセルロース紙上にブロットを転写（トランスブロット（transblotte））し、次にブタまたはヒトからの抗−ｇｐ４８血清と反応させると、タンパクの反応がかなり低下し、これは、ｇｐ４８が熱感受性であることを示している。ｇｐ４８含有タンパク製剤を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と混合し、次に９０℃に加熱して不活性化し、ニトロセルロース紙上にブロットを転写（トランスブロット（tr ansblotte））し、ヒトまたはブタからの抗−ｇｐ４８血清と反応させると、ｇｐ４８の反応は観察することができない。ＳＤＳはｇｐ４８タンパクを保護していない。実施例６Ｈ９細胞からのｇｐ４８の検出：特性付けＡ．感染していないＨ９細胞を１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させ、遠心分離により採集する。次に、可溶性タンパクを抽出するために、固められた細胞を、０．５％ＮＰ４０１５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．５４中に再懸濁する。細胞抽出物の可溶性と不溶性の両方のフラクションを、ブタまたはヒト抗−ｇｐ４８血清を用いてウエスタンブロットによりｇｐ４８の存在について検査すると、可溶性の相からはブロットされたタンパク中にｇｐ４８の反応を検出することができたが、不溶性の相からは検出することはできなかった。感染していないＨ９細胞から細胞膜タンパクを分離するとき、細胞を溶解して精製していないと、上澄はｇｐ４８を含み、それはウエスタンブロットでブロットすると抗−ｇｐ４８血清と反応するだろう。すなわち、ｇｐ４８タンパクは、細胞表面に比較的緩く結合している細胞表面タンパクである。ウィルス溶解物中で見出されるｇｐ４８タンパクは、感染していないＨ９細胞から生じるｇｐ４８と同じ電気泳動による移動性を示す。ウィルス溶解物から生じたものと感染していないＨ９細胞から生じたものの両方のｇｐ４８が、同じ熱感受性を示し、それは、これらのタンパクが共通の物理的／化学的特性を有し、実質的に同じであることを意味する。Ｂ．イオン交換カラムでｇｐ４８タンパクの精製を試みると、膜タンパクに典型的な幾つかの特性、例えば、凝集傾向、洗剤中でのタンパクの向上した溶解性などを示す。Ｈ９細胞中におけるｇｐ４８含有量は、粗く見積もって、総細胞タンパクの０．０１％またはそれ以下である。Ｃ．ＨＩＶ−１溶解物（ｇｐ４８含有）ウエスタンブロットでインキュベーションするためにマウスモノクローナル抗−ＨＬＡクラスＩ抗体（ＤＲ、ＤＱ、ＤＰ）を用いると、先に我々が重なったタンパクバンドを見いだしているｇｐ４８領域の下方において狭い反応バンドが見つかった。抗−ｇｐ４８抗血清とマウスモノクローナル抗−ＨＬＡクラスII抗体とを用いる競合結合アッセイを行うと、マウスモノクローナル抗体は互いに競合せず、異なるタンパクであることがわかった。実施例７感染していないＨ９細胞を、ＰＡＳＳＨＩＶ−１（サンディエゴ、ベリーゲン（Verigen）製）として調製されている精製ブタ抗ＨＩＶ−１溶解物（抗−ｇｐ４８）免疫グロブリンとインキュベーションすると、感染していないＨ９細胞は抗−ｇｐ４８と結合するが、他方、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−IIIＢ）感染のＨ９細胞および感染していないＭｏｌｔ４クローン８細胞は抗−ｇｐ４８と結合しないことがわかった。簡単に言うと、試験は、５×10⁷感染していないＨ９細胞、５×10⁷ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−IIIＢ）感染のＨ９細胞および５×10⁷感染していないＭｏｌｔ４クローン８細胞をそれぞれ、ＰＡＡＳＳＨＩＶ−１の５００μ１を用いて室温で３０分間ペレット化し、ペレット化した細胞およびいずれかの上澄をＨＩＶ−１溶解物ウエスタンブロット（オルガノン・テクニカ社製）に適用するものである。別の試験は、上記のような前述の種類の新しい細胞からの上澄をインキュベーションし、ペレット化の後に、この上澄をＨＩＶ−１ウエスタンブロットと反応させることである。ウエスタンブロットは、感染していないＨ９細胞が一回のインキュベーションによりある程度抗−ｇｐ４８を除去し、新しい細胞で繰り返しインキュベーションするとかなり高度に除去されることを示している。ＨＩＶ−１ウエスタンブロットの結果により示されるように、抗−ｇｐ４８は、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−II IＢ）感染細胞および感染していないＭｏｌｔ４クローン８細胞を含む実験によっては除去されなかった。従って、ＣＤ４＋の感染していないＨ９細胞は、抗−ｇｐ４８を結合し得る利用可能なｇｐ４８細胞膜を有するが、一方、ＨＩＶ−１感染Ｈ９細胞では意味のあるｇｐ４８膜タンパクがなかった。感染したＨ９細胞で表面膜ｇｐ４８タンパクとの反応が起こらない理由は、ｇｐ４８膜タンパクが存在する領域にＨＩＶ− １が（エンベロープタンパクを介して）結合し、それにより抗−ｇｐ４８抗体の結合が妨げられるからであろう。実施例８ｇｐ４８の精製１０％のウシ胎仔血清、０．５ｍｇ／ｍｌのグルタミンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのゲンタミシン（gentamicin）を加えたＲＰＭＩ１４０中でＨ９細胞を増殖させ、６００×ｇで１０分間の遠心分離により採集した。ＰＢＳで一回洗浄した後、固めた細胞を１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０／０．０２ｍＭＭｎＣｌ₂／０．２％ツイッタージェント（Zwittergent）３１２洗剤（カルバイオケム（Calbiochem）社）中に再懸濁して、ｇｐ４８を可溶化した。次に、不溶性物質を、１０，０００×ｇで３０分間の遠心分離により除去した。ペレットにはｇｐ４８は見いだされなかった。次に、０．０２ｍＭＭｎＣｌ₂、０．１％ツイッタージェント（Zwitterge nt）３１２および２ｍＭＤＴＴを含む１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で平衡化したレンチル（lentil）レクチンセファロース４Ｂカラムに、上澄を仕込んだ。カラム二本分の体積量の平衡緩衝液で洗浄した後、カラムを２％のメチル−α，Ｄ−マンノピラノシドで溶離した。マンノシド溶離液中に約５０％のｇｐ４８が見いだされたが、大部分の他の細胞成分は流出した。流出液を再びクロマトグラフィーにかけたが、有意量のｇｐ４８タンパクは回収されなかった。この手順により、ｇｐ４８が実質的に精製され、ｇｐ４８はレンチルレクチンとの相互作用に特異的な炭水化物部分を有する糖タンパクであることが示唆される。図３は、レンチルレクチンカラムからの溶離プロフィールを示す。図４ａは、精製途中のタンパクを示す染色されたＳＤＳｐａｇｅゲルを示し、図４ｂは、タンパクゲルから移されたｇｐ４８のウエスタンブロットを示す。当業者は、通常の実験法のみを用いて、ここに記載の発明の具体的態様の均等物を知り、または確認することができる。これらのおよび他の全ての均等物は、以下の請求の範囲に包含される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年４月１２日【補正内容】図面の簡単な説明図１は、抗−ｇｐ４８陽性血清への血清学的転換（セロコンバージョン、sero conversion）を示す一連のＨＩＶ−１ウエスタンブロットストリップ（１〜１７）である。ｇｐ４８タンパクは、４８〜５２とマークされた領域に単離される。試料は１：３０に希釈され、２時間インキュベートし、アルカリフォスファターゼＩｇＧで１：１０００で処理し、２時間インキュベートし、ついでＮＢＴ／ＢＣｉＰで処理した。図２は、抗−ｇｐ４８陽性血清への血清学的転換（セセロコンバージョン、se roconversion）を示す一連のＨＩＶ−２ウエスタンブロットストリップ（１〜１７）、陰性対照ストリップ（Ｎ）および陽性ＨＩＶ−２ストリップ（Ｐ）である。ｇｐ４８タンパクは、４８とマークされた領域に単離される。Ｎは通常の陰性対照であり、ＰはＨＩＶ−２陽性対照である。図３は、レンチルレクチン（lentil lectin）−セファロースのアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたｇｐ４８の溶離プロフィールを示す。フラクション＃１から約＃１０の領域は流出フラクション；フラクション＃１２から約＃２２の領域がα−メチル−Ｄ−マンノシドの溶離物フラクションである。図４ａは、クーマシーブルー染色によるレンチルレクチンカラムからの精製されたタンパクの分析を示し、図４ｂは、ｇｐ４８についてのウエスタンブロット上の移されたタンパクを示す。ＭＷは分子量のマーカー；レーン１は出発物質；レーン２〜６は流出フラクション；レーン７〜１３はα−メチル−Ｄ−マンノシドの溶離物フラクションである。【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１２月６日【補正内容】請求の範囲１．ブタ抗−ｇｐ４８抗血清と反応性があり、ＨＩＶに感染していないＣＤ４＋細胞から単離された単離ｇｐ４８タンパク。２．Ｈ９細胞から単離された請求項１に記載のタンパク。３．哺乳動物を有効な量の請求項１もしくは２に記載のｇｐ４８タンパクで免疫することを備える能動免疫により哺乳動物に抗−ｇｐ４８抗体を発生させる方法。４．ｇｐ４８タンパクが実質的に精製されている請求項３に記載の方法。５．ｇｐ４８タンパクが細胞溶解物の一成分である請求項３に記載の方法。６．ｇｐ４８タンパクがタンパク混合物の一成分である請求項３に記載の方法。７．ｇｐ４８タンパクが組み換えＤＮＡから製造されている請求項３に記載の方法。８．有効な量の請求項３、４、５、６または７記載のいづれかの方法により得られた抗−ｇｐ４８抗体で免疫することを備える哺乳動物の受動免疫方法。９．抗−ｇｐ４８抗体がブタ起源のものである請求項８に記載の方法。１０．抗−ｇｐ４８抗体がポリクローナルである請求項８に記載の方法。１１．抗−ｇｐ４８抗体がモノクローナルである請求項８に記載の方法。１２．抗−ｇｐ４８抗体をＨＩＶ−１ウィルスと組み合わせて投与する請求項８に記載の方法。１３．抗−ｇｐ４８抗体を任意の異種タンパクまたは組織と共に導入する請求項８に記載の方法。１４．請求項３、４、５、６または７記載のいづれかの方法により得られた抗−ｇｐ４８抗体と組み合わせたタンパクで哺乳動物を免疫することを備えるタンパクの免疫原性を能動的または受動的に低下させる方法。１５．感染していないＣＤ４＋細胞からのｇｐ４８タンパクを精製することを備えるｇｐ４８タンパクの単離方法。１６．感染していないＨ９細胞からのｇｐ４８タンパクを精製することを備えるｇｐ４８タンパクを単離する工程。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/10 Ｃ０７Ｋ 16/10 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ブタ抗−ｇｐ４８抗血清と反応性のある単離されたｇｐ４８タンパク。２．ＣＤ４＋細胞から単離された請求項１に記載のタンパク。３．Ｈ９細胞から単離された請求項１に記載のタンパク。４．哺乳動物を有効な量のｇｐ４８タンパクで免疫することを備える能動免疫により哺乳動物に抗−ｇｐ４８抗体を発生させる方法。５．ｇｐ４８タンパクが実質的に精製されている請求項４に記載の方法。６．ｇｐ４８タンパクが細胞溶解物の一成分である請求項４に記載の方法。７．ｇｐ４８タンパクがウィルス溶解物の一成分である請求項４に記載の方法。８．ｇｐ４８タンパクがタンパク混合物の一成分である請求項４に記載の方法。９．ｇｐ４８タンパクが組み換えＤＮＡから製造されている請求項４に記載の方法。１０．有効な量の抗−ｇｐ４８抗体で免疫することを備える哺乳動物の受動免疫方法。１１．抗−ｇｐ４８抗体がブタ起源のものである請求項１０に記載の方法。１２．抗−ｇｐ４８抗体がポリクローナルである請求項１０に記載の方法。１３．抗−ｇｐ４８抗体がモノクローナルである請求項１０に記載の方法。１４．抗−ｇｐ４８抗体をＨＩＶ−１ウィルスと組み合わせて投与する請求項１０に記載の方法。１５．抗−ｇｐ４８抗体を任意の異種タンパクまたは組織と共に導入する請求項１０に記載の方法。１６．抗−ｇｐ４８抗体と組み合わせたタンパクで哺乳動物を免疫することを備えるタンパクの免疫原性を能動的または受動的に低下させる方法。