JPH10509595A

JPH10509595A - ハイブリトープマッピングを用いる不連続プローブの設計

Info

Publication number: JPH10509595A
Application number: JP8517717A
Authority: JP
Inventors: マークエル．コリンズ，
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1994-12-05
Filing date: 1995-12-05
Publication date: 1998-09-22
Also published as: DE69531309T2; WO1996017955A3; EP0795033A2; US5747248A; WO1996017955A2; EP0795033B1; US5736327A; AU4595996A; ES2203650T3; DE69531309D1; CA2207011A1; ATE245197T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ハイブリトープマッピングと呼ばれる技術を用いて、標的核酸の公知のヌクレオチド配列内で結合するヌクレオチド配列を含む、結合オリゴヌクレオチドを、検出または決定する方法を提供する。本発明は、ハイブリトープマッピングを用いて標的核酸に結合する不連続プローブを得る方法をまた、提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ハイブリトープマッピングを用いる不連続プローブの設計技術分野本発明は、ヌクレオチドプローブおよびアンチセンスプローブ化学の分野に属する。より具体的には、本発明は、診断用における使用のためにまたはアンチセンス治療として、核酸標的にきつく結合する不連続プローブを決定する方法を提供する。不連続プローブは、標的核酸の2つ以上の非隣接領域に結合する。不連続プローブとして、アンチセンス分子、リボザイム、連結(tetherd)プローブおよび分枝DNA分子が含まれる。発明の背景 DNAおよびRNAの配列特異的認識のための道具は、核酸プローブ技術、ならびにアンチセンスおよびリボザイム治療学の成長分野において益々重要である。RNA の配列特異的認識は、その複合な立体配座構造および分子内ハイブリダイゼーションに起因して、とりわけ難しい。 CloadおよびSchepartz，J ．Am．Chem．Soc.（1991）113:6324-6326は、連結オリゴヌクレオチドプローブ（TOP）と呼ばれる、RNAの配列特異的認識および構造特異的認識のための合成分子のファミリーを開示している。TOPは、柔軟な合成連結鎖（tether）により分離された2つのオリゴデオキシリボヌクレオチドからなる。この2つのオリゴヌクレオチドは、RNA分子の非隣接一本鎖領域に結合し、そして反復する非塩基性ホスホジエステル単位、または反復するポリエチレングリコール単位によってつながれる。この論文において著者らは、つながれるべき優れたオリゴヌクレオチドを選択する方法を示唆していない。CloadおよびSchep artz，J ．Am．Chem．Soc.（1994）116:437-442は、標的RNAの非隣接領域に結合し、TOP中ともに連結される優れたオリゴヌクレオチドを選択するために、無作為オリゴヌクレオチドライブラリーを使用することを教示している。著者らは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）Rev応答エレメント（RRE）中の公知のRev結合部位を用い、Rev部位に結合するオクタヌクレオチドに無作為なヘプタヌクレオチドを連結し、RNase Hを用いてスクリーングすることにより、二次結合について最も強力な部位を決定して、第2のオリゴヌクレオチドを検索した。欧州公開公報第0 138 855号は、公知のタンパク質内の抗原的に活性なアミノ酸配列を決定する方法を記載しており、この方法では、そのタンパク質内の配列に対応する一連の重複ペプチドを合成し、次いでそのタンパク質に対して惹起した抗体血清に対してペプチドをスクリーニングし、その血清抗体と反応するペプチドを決定する。本発明者らは、本明細書中で、「ハイブリトープマッピング」と呼ばれる、標的核酸にオリゴヌクレオチドを結合するための優れた部位を決定する方法を記載する。ハイブリトープマッピングは、高い結合定数を有する改善された不連続プローブを同定するために使用され得る。発明の開示本発明の第１の局面において、標的核酸の公知のヌクレオチド配列内で結合するヌクレオチド配列を含む結合オリゴヌクレオチドを検出または決定する方法が提供され、この方法は以下の工程を包含する：（a）多数のオリゴヌクレオチドを得る工程であって、各オリゴヌクレオチドはこの公知のヌクレオチド配列内の配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含み、そしてオリゴヌクレオチドは、重複する第1のヌクレオチド配列を有し、多数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドの第1のヌクレオチド配列は、多数のオリゴヌクレオチド中の別のオリゴヌクレオチドの第1のヌクレオチド配列と1〜4ヌクレオチドで重複する、工程；（b）標的に対するオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、各オリゴヌクレオチドを標的核酸と接触させる工程；（c）各オリゴヌクレオチドが公知のヌクレオチド配列内で結合するかどうかを示すために、各オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の特異的なオリゴヌクレオチド−標的結合の存在の有無を検出または決定する工程であって、それによって 1以上の結合オリゴヌクレオチドを決定または検出する、工程。本発明の別の局面において、標的核酸内の公知のヌクレオチド配列に結合する不連続プローブを検出または決定する方法が提供され、不連続プローブは、（i ）標的核酸の異なる領域にそれぞれ相補的である少なくとも2つの結合オリゴヌクレオチドを含み、直接または（ii）有機リンカー分子によって共有結合され、該方法は以下の工程：（a）標的核酸の第1および第2の領域にそれぞれ相補的である、少なくとも第1および第2の結合オリゴヌクレオチドを決定する工程であって、該第1および第2の結合オリゴヌクレオチドは、該標的核酸の他の領域に相補的である他のオリゴヌクレオチドよりも該標的核酸に強く結合し、該第1および第2の領域は隣接していない、工程；（b）工程（a）で決定した２つ以上のオリゴヌクレオチドを、少なくとも2つの組み合わせで、直接または有機リンカー分子を用いて、共有結合し、一組の候補不連続プローブを得る工程；（c）標的に対するオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、各候補不連続プローブを、該標的核酸と接触させる工程；および（d）各不連続プローブが標的核酸を結合するかどうかを示すために、各不連続プローブと標的核酸との間の特異的な不連続プローブ−標的結合の存在の有無を検出または決定し、それによって1以上の不連続プローブを決定または検出する工程。不連続プローブを検出する上記の方法の好ましい局面ににおいて、工程（a）は以下の工程を包含する：多数のオリゴヌクレオチドを得る工程であって、各オリゴヌクレオチドは、公知のヌクレオチド配列内の配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含み、オリゴヌクレオチドは、重複する第1のヌクレオチド配列を有し、多数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドの第1のヌクレオチド配列は、多数のオリゴヌクレオチド中の別のオリゴヌクレオチドの第1のヌクレオチド配列と、1〜4ヌクレオチドで重複する、工程；標的に対するオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、各オリゴヌクレオチドを、標的核酸と接触させる工程；各オリゴヌクレオチドが公知のヌクレオチド配列内で結合するかどうかを示すために、各オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の特異的なオリゴヌクレオチド −標的結合の存在の有無を検出または決定し、それにより1つ以上の結合オリゴヌクレオチドを決定または検出する工程；標的核酸に最も強く結合する少なくとも2つの結合オリゴヌクレオチドを選択する工程。図面の簡単な説明図1は、本発明のハイブリトープマッピングアッセイを示す。図2は、本発明の不連続プローブを至適化する方法を示す。図3は、本発明のハイブリトープマッピング法を用いてHIV RRE領域に結合する至適なオリゴヌクレオチドを見出した結果を示す。図4は、候補結合オリゴヌクレオチドが、HIV RRE領域へ結合する能力に対するオリゴヌクレオチドの長さの効果を示す。図5は、HIV RRE領域に対する候補結合オリゴヌクレオチドの結合をRNAse H切断によって確認した実験の結果を示す。図6は、標的結合を至適化するための不連続プローブ設計の効果を研究するための実験の計画を示す。図7および8は、図6に示す実験の結果を示す。発明の実施態様本明細書中に記載の本発明は、以前刊行された研究および係属中の特許出願を利用している。例えば、そのような研究は科学論文、特許または係属中の特許出願からなる。上述および後述において引用するこれらの刊行物および出願はすべて、参考として本明細書中に援用する。ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略号を、本明細書で使用する。本発明の実施には、特に意図しない限り、分子生物学、微生物学、組換えDNA 、および免疫学の従来技術を用い、これらは当業者の範囲内である。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えばSambrookら，MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL,第2版（1989）；DNA CLONING,第1巻および第2巻（D.N．Glov er編,1985）；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS（M.J．Gait編,1984）；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION（B.D．HamesおよびS.J．Higgins編,1984）；TRANSCRIPTION AND TRANSLATION（B.D．HamesおよびS.J.Higgins編,1984）；ANIMAL CELL CULTURE （R.I．Freshney編,1986）；IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES（IRL Press,1986 ）；B．Perbal，A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING（1984）；シリーズ、METHODS IN ENZYMOLOGY（Academic Press，Inc.）；GENE TRANSFER VECTORS F OR MAMMALIAN CELLS（J.H．MillerおよびM.P．Calos編,1987,Cold Spring Harbo r Laboratory），Methods in Enzymology、第154巻および第155巻（それぞれWu およびGrossman,ならびにWu編），MayerおよびWalker編（1987），IMMUNOCHEMIC AL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY（Academic Press，London），Scop es,（1987），PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE,第2版（Spring er-Verlag，N.Y.）およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,第I〜IV巻（D. M.WeirおよびC.C．Blackwell編,1986）を参照のこと。定義：用語「アンチセンス」は、RNA分子またはDNA分子の「センス」鎖と相補的であり、それと２本鎖複合体を形成し得る核酸分子、好ましくはDNAをいう。mRNAとアンチセンス核酸とのハイブリダイゼーションは、例えば、タンパク質へのその翻訳を阻害する。アンチセンス核酸は、（例えば、ウイルスタンパク質mRNAまたは活性オンコジーンから転写されたmRNAを相補する場合）保護的であり得、または（必須の宿主細胞酵素（例えば、効果的でない代替経路を有するハウスキーピング酵素）を相補する場合）破壊的であり得る。G.Zonら、EP288,163（これはレトロウイルス複製およびオンコジーンを増殖する阻害のためのオリゴデオキシヌクレオチドの使用を開示する）もまた参照のこと。本明細書で使用する用語「標識」は、検出（好ましくは、定量）シグナルを提供するために使用され得、そして核酸分子またはタンパク質に接着され得る任意の原子または分子をいう。標識は、蛍光、放射活性、比色分析、Ｘ線回析またはＸ線吸収、磁気、酵素活性などにより検出可能なシグナルを提供し得る。適切な標識としては、蛍光体、発色団、放射活性原子（特に³²Ｐおよび¹²⁵Ｉ）、電子密度試薬、酵素、および特異的結合対を有するリガンドが挙げられる。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)は、通常、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)を、分光光度計で定量し得る青色色素に変換する、その能力により検出される。同じ標識がいくつかの異なる方法において作用し得るので、上記の記載は、種々の標識を異なるクラスに分類することを意味しないことが理解されるべきである。例えば、¹²⁵Ｉは放射活性標識として、または電子密度試薬として作用し得る。HRPは、酵素として、またはモノクローナル抗体(MAb)に対する抗原として作用し得る。さらに、望ましい効果のために種々の標識を組合せ得る。例えば、MAbおよびアビジンはまた、本発明の実施において標識を必要とする：従って、ビオチンを用いてプローブを標識し、そして¹²⁵Ｉで標識したアビジンを用いて、あるいはHRPで標識した抗ビオチンMAbを用いて、またはアビジンまたはストレプトアビジン結合HRP分子を用いて、その存在が検出され得る。他の変更および可能性は、当業者には容易に明白であり、そして等価物として考慮される。本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、診断プローブ、アンチセンスプローブ、検出されるためのオリゴマーフラグメント、オリゴマーコントロール、またはリボザイムをいい、そして２つ以上（好ましくは、３つ以上）のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子として定義される。その正確な大きさは、多くの因子に依存し、順に最終的な機能またはオリゴヌクレオチドの使用に依存する。本明細書中に使用する用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、ポリマーが、DNAおよびRNAで見出されるような、塩基対および塩基の積み重ね (base stacking)が可能な形態において、ヌクレオ塩基を含む場合、ポリデオキシヌクレオチド（２-デオキシ-Ｄ-リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ-リボースを含む）、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮグリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格（例えば、Ne ugene^TMポリマーとしてAnti-Gene Development Group,Corvallis,Oregonから市販されているタンパク質核酸および合成配列特異的核酸ポリマー）、または標準的でない結合を含む他のポリマーにあてはまるべきである。用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」とを長さで区別することは意図されず、そしてこれらの用語は互換的に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、これらの用語は、２本鎖および１本鎖DNA、ならびに２本鎖および１本鎖RNAおよびDNA:RNAハイブリッドを含み、そして公知のタイプの修飾物（例えば、当業者には公知の標識、メチル化、「キャップ」、１以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換）、ヌクレオチド間修飾物（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど）を有するもの、および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジオエートなど）を有するもの））、付属部分（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナル配列、ポリLリジンなど）を含むもの、インターカラター（アクリジン、プソラレンなど）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射活性金属、ホウ素、酸化金属など）を含むもの、アルキレーターを含むもの、修飾結合（アルファアノマー核酸など）を有するもの、ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの非修飾形態を含む。用語「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、公知のプリン塩基およびピリミジン塩基だけでなく、改変された他のヘテロサイクリック塩基もまた含むそれらの部分を含有することが認識される。このような改変は、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、あるいは他のヘテロサイクルを含む。改変ヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、糖部分の改変を含み、例えば、ここで、１以上の水酸基はハロゲン、脂肪基で置き換えられるか、またはエーテル、アミンなどで官能化される。本明細書中で使用する設計された配列に「由来する」ポリヌクレオチドは、設計されたヌクレオチド配列の領域に対応する、およそ少なくとも約６ヌクレオチドの配列、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチドの配列、さらに好ましくは少なくとも約10〜12ヌクレオチドの配列、そしてなおより好ましくは少なくとも約 15〜20ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列をいう。「対応する」は、相同であり、相補的であり、または実質的に設計された配列に対して相補的であることを意味する。得られたポリヌクレオチドは、示されたヌクレオチド配列に必ずしも物理的に由来するものではないが、任意の様式（例えば、化学合成または DNA複製または逆転写あるいは転写を含む）で生成され得る。さらに、設計された配列の領域に対応する領域の組合せが、意図される方法と一致するように当業者には公知の方法で改変され得る。結合配列は、ホモ二本鎖を提供するために完全な相補性を有する必要はないことが認識される。多くの状況において、二本鎖は、約10％より少ない塩基がミスマッチである場合、十分であり、５以上のループは考慮しない。従って、本明細書中で使用する用語「相補的な」は、正確な相補性を意図し、ここで、結合領域中の各塩基は正確に対応し、そして「実質的に相補的な」は、90％以上のホモロジーを意図する。本明細書中で使用する用語「オリゴマー」は、プライマーおよびプローブの両方をいい、本明細書中で用語「ポリヌクレオチド」と互換的に使用される。用語オリゴマーは、分子の大きさを意味しない。しかし、典型的には、オリゴマーは、長さにおいて1000ヌクレオチドよりも大きくはなく、より典型的には、500ヌクレオチドよりも大きくはなく、なおより典型的には、250ヌクレオチドよりも大きくない；それらは、100ヌクレオチドよりも大きくなくてよく、75ヌクレオチドよりも大きくなくてよく、そしてまた50ヌクレオチドより大きくなくてもよい。本明細書で使用する用語「プローブ」は、標的領域中の配列を有するプローブにおける少なくとも１つの配列の相補性により、標的配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドからなる構造をいう。プローブのポリヌクレオチド領域は、DNA、および/またはRNA、および/または合成ヌクレオチドアナログからなり得る。「補捉プローブ」は、以下に定義されるようにプローブ中に含まれる。本明細書で使用する用語「補捉プローブ」は、結合対または固体支持体に結合される１本鎖ポリヌクレオチドからなる分子をいう。１本鎖ポリヌクレオチド領域は、第２のポリヌクレオチドの領域に対して相補的であり、そして直接、または固体支持体の表面に結合した第２の結合対に特異的な第１の結合対により、第２のポリヌクレオチドを固体支持体に固定するに十分な親和性を与えるために十分長くかつ適合している。用語「支持体」は、特異的な結合対が固定され得る、任意の固体または半固体表面をいう。適切な支持体としては、ガラス、プラスチック、金属、ポリマーゲルなどが挙げられ、そしてビーズ、ウェル、計量棒、メンブレンなどの形態をとり得る。現在、好ましい支持体は、ポリスチレンビーズまたはマイクロタイターディッシュウェルとして提供される。本明細書中で使用する用語「標的領域」または「標的ヌクレオチド配列」は、標的分子中に含まれる領域に結合するプローブをいう。用語「標的配列」は、所望の条件下でプローブが適切なハイブリッドを形成する配列をいう。本明細書中で使用する用語、オリゴヌクレオチドプローブまたは不連続的なプローブの「検出または決定」は、選択の方法をいい、ここでプローブのプールは、標的に対する結合のような特定の生物学的特性についてアッセイされる。決定の目的は、プローブ（単数または複数）が所望の特性の最もよい例を示すことである。アンチセンスプローブについて、所望の特性は、好ましくは強い結合である。２段階治療（ここで、第１の薬剤が添加され、複合体され得、次いで、複合体に標的化された第２のエフェクター分子が添加される）に有用なプローブは、不変の結合を示すはずであり、不変の結合は、結合のために低いプローブ濃度を使用し、そして漸増するストリンジェントな洗浄を適用して、さらに弱い結合オリゴヌクレオチドを溶出することによりアッセイされ得る。リボザイムプローブについて、所望の特性は、好ましくは、急速な結合であり、低いプローブ濃度および短いハイブリダイゼーション時間を用いることにより選択され得る。本明細書中で使用する用語「リボザイム」は、標的核酸基質の切断を触媒する能力を有するポリヌクレオチドをいう。一般に、本発明のリボザイムは、触媒領域、および本明細書中に記載のマッピング技術により決定される少なくとも１つの基質結合領域を含む。リボザイムは、一般に、米国特許番号第5,144,019号、同第5,168,053号、同第5,180,818号、同第5,225,337号および同第5,254,678号において記載される。リボザイムの触媒領域は、当該分野において公知であり、そしてハンマーヘッド、ヘアピン、ヘパティティスデルタ、およびRNAseP型を含む。本明細書中で使用する用語「重複配列」は、部分的な共通配列を共有する２つのオリゴヌクレオチド配列をいう。例えば、オリゴヌクレオチドGAATTCおよびAA TTCCは、それらの共通配列AATTCにおいて重複する。これらの２つのオリゴヌクレオチドは両方とも、配列GAATTCCに由来するが、１ヌクレオチド離れて開始点を有する。２つのヌクレオチドは、本明細書で１つのヌクレオチドにより重複することが記載されている。本明細書中で使用する用語「不連続プローブ」は、標的核酸の２つ以上の不連続領域に対応する２つ以上の領域を有するオリゴヌクレオチドをいう。２つ以上の領域は、直接的に、介在ヌクレオチド配列によるか、または有機リンカー分子によるかのいずれかにより共有結合している。本明細書中で使用する用語「不連続プローブ」は、有機リンカー分子により共有結合される２つ以上のオリゴヌクレオチドをいう。「有機リンカー分子」により、２つの異なるオリゴヌクレオチドのその２つの末端に接着され得る、本質的に線状のスペーサー有機分予が意味される。ハイブリトープマッピング本発明の１つの局面において、オリゴヌクレオチドプローブに対して最適の標的領域を構成する標的核酸の配列（単数または複数）を検出または決定する方法が与えられる。この情報に基づいて、標的の診断的検出用の理想的プローブ、あるいはアンチセンスプローブまたはリボザイムのような治療分子が設計され得る。本発明に従って、提供されるその方法は次の工程を包含する：（a）多数のオリゴヌクレオチドを合成または得る工程であり、ここで各オリゴヌクレオチドが公知のヌクレオチド配列内の配列に相補的な第１のオリゴヌクレオチド配列を含み、オリゴヌクレオチドは重複する第１のヌクレオチド配列を有しており、多数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドの第１のヌクレオチド配列が、多数のオリゴヌクレオチド中の別のオリゴヌクレオチドの第１のヌクレオチド配列と１〜４ヌクレオチドで重複する；（b）標的に対するオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、各オリゴヌクレオチドと標的核酸とを接触させる工程；および（c）各オリゴヌクレオチドが公知のヌクレオチド配列内で結合するかどうかを示すため、各オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の特異的オリゴヌクレオチド−標的結合の存在の有無を検出または決定し、それによって１つ以上の結合するオリゴヌクレオチドを決定または検出する工程。Ａ．試験プローブ合成本発明の方法は、ある所与の標的核酸分子（とりわけRNA標的）がその標的上の他の場所に位置する他の配列よりも、プローブ結合用で容易に利用しやすいヌクレオチド配列を含む特定の領域を有するという考えに基づいている。標的核酸の重複するフラグメントに対応する多数または候補オリゴヌクレオチドプローブ（「試験プローブ」）群を合成する工程；その群の各構成要素と標的とを共にインキュベートする工程；およびプローブ−標的結合の量を決定する工程により、好ましいプローブが決定される。試験プローブ群、またはハイブリトープ群は、各オリゴヌクレオチドプローブが公知の標的核酸配列内の核酸配列に相補的な第１の標的結合配列を含む、一組のオリゴヌクレオチドプローブからなる。この一組のオリゴヌクレオチドプローブは、重複するヌクレオチド配列を有しており、ここで群中の各オリゴヌクレオチドの第１の標的結合配列は、その群中の別のオリゴヌクレオチドの第１の標的結合配列と１〜20ヌクレオチド、好ましくは１〜４ヌクレオチド、より好ましくは１ヌクレオチドで重複している。公知の標的核酸配列に相補的な領域は一般に６〜30ヌクレオチド、より好ましくは８〜24ヌクレオチド、さらにより好ましくは８〜16ヌクレオチドである。試験プローブは一本鎖DNA分子であることが好ましく、必要に応じて１つ以上のホスホロチオエート結合または2'-O-メチル基を含む。さらに、この試験プローブは、標的結合を検出するためのアッセイに有用な他の配列を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは必要に応じて、試験プローブ認識配列に相補的な核酸配列を有するアダプタープローブ認識配列である第２の配列を含み得、これは試験プローブを固体支持体に直接または間接的に捕捉するために使用される。この領域は一般に６〜30ヌクレオチド、より好ましくは８〜24ヌクレオチド、さらにより好ましくは８〜16ヌクレオチドである。またこの試験プローブは、１〜50ヌクレオチドのスペーサー配列である第３の配列を含み得、これは第１の標的結合配列を第２のアダプタープローブ認識配列から間隔を置いて離されるのに有用である。試験プローブは公知の方法による個々のオリゴヌクレオチドの合成によって作成される。一般にオリゴヌクレオチドの合成法に関する背景文献は、β-シアノエチルリン酸保護基の使用に基づく5'→3'合成に関するものとして、例えばde N apoliら、Gazz Chim Ital（1984）114:65、Rosenthalら、Tetrahedron Lett（19 83）24:1691、BelagajeおよびBrush、Nuc Acids Res（1977）10:6295などが含まれ、液相5'→3'合成を記述している文献としては、HayatsuおよびKhorana、J Am Chem Soc （1957）89:3880、GaitおよびSheppard、Nuc Acids Res（1977）4:113 5、CramerおよびKoster、Angew Chem Int Ed Engl（1968）7:473、およびBlackb urnら、J Chem Soc（1967）Part C 2438を含む。さらに、MatteucciおよびCaruthers，J Am Chem Soc（1981）103:3185-91はオリゴヌクレオチドの製造におけるホスホクロリダイトの使用について記述している。BeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Lett（1981）22:1859-62および米国4,415,732号はオリゴヌクレオチドの製造に関するホスホルアミダイトの使用について記述している。Smith，ABL 15-24（1983年12月）は、自動固相オリゴデオキシリボヌクレオチド合成を記述している。また、そこに引用されている文献およびWarnerら、DNA（1984）3:401-11も参照のこと（これらの開示は参考として本明細書の中に援用される）。T．HornおよびM.S．Urdea，DNA（1986）5:421- 25は、ビス(シアノエトキシ)-N,N-ジイソプロピルアミノホスフィンを用いる固体支持DNAフラグメントのリン酸化について記述している。T．HornおよびM.S．U rdea，Tetrahedron Lett（1986）27:4705-08もまた参照のこと。Ｂ．試験プローブのハイブリダイゼーションおよび検出一旦、試験プローブ群の組が合成されれば、標的に対する試験プローブオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、個々の試験プローブが標的核酸との接触に供され、そして次いで各プローブ−標的対に関する結合量が決定される。ハイブリダイゼーション技術に関する文献としては一般に以下ものが挙げられる：MeinkothおよびWahl、Anal Biochem（1984）138:26 7-84（ハイブリダイゼーション技術の総説）；Learyら、Proc Natl Acad Sci US A （1983）80:4045-49（特異的オリゴヌクレオチド配列検出用のアビジン−酵素結合と組み合わせるビオチニル化DNA）；Rankiら、Gene 21:77-85（サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ）。PfeufferおよびHelmrich、J Biol Chem（1 スフェート）のカップリングについて記述している。Baumanら、J Histochem an d Cytochem 29:227-37は、蛍光剤を用いたRNAの3'-標識化について記述している。PCT出願WO/8302277は、DNAフラグメントに対する標識用修飾リボヌクレオチドの付加とそのようなDNAフラグメントの分析法について記述している。RenzおよびKurz、Nuc Acids Res（1984）12:3435-44はオリゴヌクレオチドへの酵素の共有結合について記述している。Wallace、DNA Recombinant Technology（Woo，S. 編）CRC Press、Boca Raton，Floridaは、診断におけるプローブの使用に関する一般的背景を提供している。ChouおよびMerigan、N Eng J of Med 308:921-25は、CMV検出用放射性同位体標識プローブの使用について記述している。Inman、Me th Enzymol （1974）34B,24:77-102は、ポリアクリルアミドへ連結するための手順を記述しており、一方Parikhら、Meth Enzymol（1974）34B,24:77-102は、アガロースとのカップリング反応について記述している。Alwineら、Proc Natl Ac ad Sci USA （1977）74:5350-54は、ゲルからハイブリダイゼーション用固体支持体にオリゴヌクレオチドを移す方法を記述している。Chuら、Proc Natl Acad Sc i USA 11:6513-29は、末端ヌクレオチドを誘導体化する技術について記述している。Hoら、Biochemistry（1981）20:64-67は、エステルを形成するためにリン酸によって末端ヌクレオチドを誘導体化することを記述している。AshleyおよびMa cDonald、Anal Biochem（1984）140:95-103は、表面結合テンプレートからプローブを調製する方法を報告している。HebertおよびGravel，Can J Chem（1974）52 :187-89およびRubinsteinら、Tetrahedron Lett（1975）17:1445-48は、光感受性保護基としてのニトロフェニル含有化合物の使用について記述している。K ．Groegkeら、Helvetica Chimica Acta（1990）73:608-617は、ヒドロキシル官能基を保護するためのt-ブチルジメチルシリルの使用を開示している。本発明の好ましい実施態様において、試験プローブのハイブリダイゼーションおよび検出は、Urdeaらの米国特許第4,868,105号および第5,124,246号に開示された方法の改良により行われる。このような液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは、下記および図１に示すように一般的に行われる。各アッセイにおいては、一本鎖標的核酸は、ハイブリダイゼーション条件下で過剰の２つの一本鎖核酸プローブとともにインキュベートされる：（1）標的に対して相補的な第１の結合ヌクレオチド配列およびアダプタープローブ認識配列である第２の結合配列を有する、前記の試験プローブ；および（2）試験プローブ上のアダプタープローブ認識配列に相補的な試験プローブ認識配列である第１の結合配列、固相に結合されたオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし得る第２の結合配列とを有し、そして必要に応じて１〜50ヌクレオチドのスペーサー配列を含むアダプタープローブ。得られる生成物は、標的とアダプタープローブとの間に挟まれた試験プローブの三成分核酸複合体である。第２の結合配列および必要に応じて付加されるアダプタープローブのスペーサー配列は一本鎖テイルとして残る。次に、ハイブリダイズする条件下で、この複合体は次に、それに結合する捕捉プローブを有する固相に添加される（またはその固相と同時にインキュベートされる）。その捕捉プローブはアダプタープローブの第２の結合配列に実質的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドである。得られる生成物は、固相に結合した捕捉プローブおよびアダプタープローブの第２の結合配列により形成される二本鎖を介して固相に結合した複合体を含む。次に、結合した複合体を有する固相が、洗浄により未結合の物質から分離される。試験プローブ上のアダプタープローブ認識配列に実質的に相補的な試験プローブ認識配列であるアダプタープローブの結合配列は、少なくとも５ヌクレオチド、通常は少なくとも10ヌクレオチドであって、約20ヌクレオチドを超えない。代表的には約10ヌクレオチドである。アダプタープローブの第２の結合配列は、固相に接着したオリゴヌクレオチドに実質的に相補的であり、標的内の内在配列により出遭わないように選択される。第２の結合配列は第１の結合配列に隣接し得るか、または0〜50ヌクレオチドの間の中間非相補的スペーサー配列により第１の結合配列から間隔を置いて離され得る。１〜10ヌクレオチドの短いスペーサー領域（または全くなし）を使用すると、アダプタープローブを介して固体支持体に結合したときに、試験プローブの標的核酸分子内部への伸長が妨害され、そしてそれゆえ標的分子の外表面にのみ結合する試験プローブを決定する場合にはこれが好ましい。所望であれば、このプローブは、他の非相補的配列を含み得る。これらの非相補的配列は、結合する配列の結合を妨害するか、または非特異的結合が発生する原因になってはならない。アダプタープローブは、オリゴヌクレオチド合成手順またはクローニングにより調製され得るが、前者が好ましい。このアッセイにおいて使用される固相は、微粒子または種々のあらゆる容器（例えば遠心管、カラム、マイクロタイタープレートウェル、フィルター、管類など）の固体壁面であり得る。微粒子を使用する場合、それらは約0.4〜200ミクロン、より通常には約0.8〜4.0ミクロンの範囲の大きさであることが好ましい。この微粒子は、ラテックスまたはガラスのようなあらゆる便利な物質であり得る。マイクロタイタープレートは好ましい固体表面である。アダプタープローブの第２の結合配列に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドは、公知の手順により、官能基を介して固体表面に安定に接着させ得る。アダプタープローブの第２の結合配列および固相に結合されたオリゴヌクレオチドを、捕捉プローブの第１の結合配列に固相を接合する安定な結合を形成する適切なリガンド−受容体対で置換し得ることは理解される。そのような対の例はビオチン/アビジン、チロキシン/チロキシン-結合グロブリン、抗原/抗体、炭水化物/レクチンなどである。予期される標的のモル数に対するアダプタープローブおよび試験プローブの比率はそれぞれ少なくとも化学量論的、好ましくは過剰である。この比率は少なくとも約1.5：1であることが好ましく、そして少なくとも2：1であることがより好ましい。通常は2：1〜10⁶：1の範囲である。各プローブの濃度は、一般に約10^-9 〜10^-2Ｍの範囲であり、試料核酸濃度は10^-10〜10^-8Ｍの範囲で変化する。このアッセイのハイブリダイゼーション工程は一般に約10分〜20時間を要し、約１時間内に完了することが多い。ハイブリダイゼーションは穏やかに上昇させた温度、一般的には約20℃から80℃、より通常は約35℃〜70℃（特には65℃）の範囲で行なわれ得る。ハイブリダイゼーション反応は通常、水性媒体（特に緩衝化水性媒体）中で行われ、この媒体は種々の添加物を含み得る。使用され得る添加物として、低濃度の界面活性剤（0.1〜１％）、塩（例えば、クエン酸ナトリウム）（0.017〜0.17 Ｍ）、フィコール、ポリビニルピロリドン、キャリア核酸、キャリアタンパク質などが挙げられる。ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール、およびホルムアミドなどの非水性溶媒がその水性媒体に添加され得る。これらの他溶媒は、一般に２〜50%の範囲の量で存在する。ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、溶媒系などによって制御され得る。従って、問題の配列の長さと性質に依存して、そのストリンジェンシーは変化する。生理学的条件に近い好ましいハイブリダイゼーション条件は、37℃、0.15M一価陽イオン、16mM Mg⁺⁺、および１mMスペルミジンである。このアッセイの分離工程において使用される手順は、固相の性質に依存して変化する。微粒子については、遠心分離やろ過によって微粒子の分離、上清の廃棄、または上清の単離が提供される。その微粒子がアッセイされる場合、その微粒子は、適切な緩衝化媒体（例えば、SDSのような界面活性剤を含むリン酸緩衝化生理食塩水（PBS））で十分に（通常は１〜５回）洗浄される。分離手段が壁または支持体である場合は、上清は単離または廃棄され、微粒子用に示したものと同じ様式で壁が洗浄され得る。次に、その複合体は、結合した複合体中の標的の標識化によって検出される。その標的は、複合体形成の前または後に標識され得る。標識化された標的は、検出可能なシグナルを直接または間接的に提供する１つ以上の分子（「標識」）を含む。その標識は、標的配列の個々の構成要素に結合され得るか、または複数の標識を有する末端構成要素または末端テイルとして存在され得る。配列に結合した標識を提供する種々の手段が文献に報告されている。例えば、Learyら、Proc Natl Acad Sci USA （1983）80:4045；RenzおよびKurz，Nucl Acids Res（1984）12 :3435；RichardsonおよびGumport、Nucl Acids Res（1983）11:6167；Smithら、Nucl Acids Res（1985）13:2399；MeinkothおよびWahl、Anal Biochem（1984 ）138:267を参照のこと。標識は、相補的配列に共有結合または非共有結合のいずれかにより結合され得る。使用され得る標識としては、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤、色素、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、酵素サブユニット、金属イオンなどが挙げられる。例示的な特定の標識として、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン、ウンベリフェロン、ルミノール、NADPH、α-β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが含まれる。好ましい実施態様においては、標的配列は、天然のrUTPまたはdTTPヌクレオチドの画分へのビオチン-UTPの取り込むことにより標識化され、そして次にこれをストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（ AP）と共にインキュベートされる。標識の性質に依存して、種々の技術が標識の存在を検出するために用いられ得る。蛍光剤については、多くの異なる蛍光計が利用可能である。化学発光剤については、ルミノメーターやフィルムが利用可能である。酵素を用いて、蛍光、化学発光、または着色生成物が提供され得、これは蛍光測定法、発光測定法、分光測光法、または肉眼で測定され得る。免疫アッセイに使用されてきた種々の標識および免疫アッセイに適用可能な技術が本アッセイに関して使用され得る。すべてのハイブリダイゼーションアッセイが、試験プローブ群の各構成要素について行なわれた後、標的に対して最も高い程度の結合を示す構成要素が決定され、最適な候補プローブとする。あるいは、この方法は、最速のハイブリダイザーを（短時間のインキュベーションおよび低濃度のプローブを使用することにより）同定するか、または最も持続性の高いハイブリダイザーを（低濃度のプローブを使用し、洗浄条件のストリンジェンシーを増大させることによって）同定する。Ｃ．試験プローブサイズの測定一旦、前記の方法で、試験プローブが最適な候補の間にあることが同定されれば、さらなる実験が、標的配列に相補的なプローブの第１のヌクレオチド配列に関して理想的なサイズを決定するため行われ得る。標的核酸の同じ領域に相補的な配列および候補試験プローブと同一の第１の末端を有する第２の試験プローブ群が、標準的な方法により合成される。しかし、第２の試験プローブ群の各構成要素は、図２に示すように異なる第２の末端を有する。従って、代表的な第２の試験プローブ群は、約６〜50、より好ましくは約６〜18ヌクレオチドのサイズの範囲にあり、最適な候補試験プローブ（単数または複数）により同定される標的核酸の領域にひろがる第１のヌクレオチド配列を有する。次いで、この第２の試験プローブは、標的に対する最も高度な結合について前記のようにスクリーニングされる。不連続プローブ前記のハイブリトープマッピングの結果、理想化された配列および長さの２つ以上の候補プローブが同定される。本発明の別の局面において、２つ以上の候補プローブが直接的にまたは種々の長さと組成の有機リンカーを用いて互いに共有結合的に接合され、そして次に、それらを前記のようにアッセイすることによって、標的に対して最も高度な結合を持つものを決定する。不連続プローブは前記の試験プローブハイブリトープのように構築され、これは必要に応じて先に定義したアダプタープローブ認識配列および/またはスペーサー領域である核酸配列を有する領域を含有し、そしてまた直接もしくは有機スペーサー-Z-により共有結合的に接合した２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。ただし-Z-は糖、塩基、またはリン酸部分を介してオリゴヌクレオチドに結合され、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Si、およびSeからなる群より選択される０〜６個のヘテロ原子および-CO-、-COO-、-CONH-、-NHCO-、-S-S-、-SO₂-、-CH(OH)-CH(OH)-、-CH( OR¹)-CH(OR¹)-、-O-PO(O^-)-O-、-O-PO(R¹)-、-O-PO(OR¹)-O-、-O-PO(OR¹)-R²-、 -PO(OR¹)-O-R²（ここでR¹は低級アルキルであり、R²は低級アルキレンである）、-O-((CH₂)_n-A-)_mおよび（ここで-A-は-O-または-PO₄-を表し、ｎは２〜４までの整数であり、ｍは１〜2 0までの整数を表す）からなる群より選択される0〜6つの結合とを含むアリーレン、C₆−C₁₈アラルキレン、C₆−C₁₈アラルケニレン、C₆−C₁₈アラルキニレン、C₁ −C₃₀アルキレン、C₁−C₃₀アルケニレン、またはC₁−C₃₀アルキニレンからなる群より選択される。有機リンカーの好ましい実施態様は、柔軟度が制限されるリンカーである「リジッドリンカー(rigid linker)」である。リジッドリンカーは当該技術分野で公知であり、１つ以上の二重または三重結合または環構造を含有するリンカー（置換または非置換アリーレン、C₆−C₁₈アラルキレン、C₆−C₁₈アラルケニレン、C₆ −C₁₈アラルキニレン、C₁−C₃₀アルケニレン、またはC₁−C₃₀アルキニレンを含む）が挙げられる。次に不連続プローブ群が、最適な候補試験プローブの異なる組み合わせを選択し、そしてリンカーの長さおよびタイプを変えることにより構築される。例えば、ハイブリトープマッピングが４つの候補試験プローブオリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、ＣおよびＤを同定する場合、A-B、A-C、A-D、B-C、B-DおよびC-Dという二重連結不連続試験プローブが構築され得る。図２に示すように、A-B-C、A-C-B、B- A-C、A-B-D、A-D-Bなどの三連結不連続試験プローブも構築され得る。連結鎖の特性も変えられ得る。好ましい連結鎖のバリエーションは、種々の長さに接合された単量体の系列である。例えば、ある連結鎖系列は、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ノナエチレングリコールである。別の系列は下図の通りである。本発明の別の実施態様において、不連続プローブは、Urdeaらの米国特許第5,1 24,246号に記載の分枝DNA技術を用いて、３つ以上の候補試験プローブ配列を分枝構造結合することにより、形成され得る。この技術により形成される「分枝不連続プローブ」において、２つの候補試験プローブ配列は、上記特許第5,124,24 6号に記載の、第３の候補試験プローブ配列の接合を許容する分枝単量体を含む有機リンカー分子により接合される。３つの結合点を持つ分枝単量体の例を下図に示す。次に、構築した不連続プローブ群が、標的核酸に対して最高の結合を有するものについて、前記のようにスクリーニングされる。次いで、最も高度な結合を有する不連続プローブが最適な候補プローブであることが決定される。あるいは、この方法は、（短時間のインキュベーションおよび低濃度のプローブを用いることにより）最速のハイブリダイザーを同定するために、または（低濃度のプローブを使用し、洗浄条件のストリンジェンシーを増大させることにより）最も持続性の高いハイブリダイザーを同定するために使用される。不連続プローブの使用不連続プローブは、例えばUrdeaらの米国特許第4,868,105号および第5,124,24 6号に記述されているように、診断用プローブとして使用できる。また、不連続プローブをアンチセンスプローブまたはリボザイムとして製剤化することもできる。不連続プローブをアンチセンスプローブとして改良してもよい。不連続アンチセンスプローブは、一般的には前記のようなアダプタープローブ認識配列またはスペーサー領域である核酸配列を持つ領域を含まない。さらに、本発明のアンチセンス核酸はRNA、DNAまたは修飾核酸である。修飾核酸の例は、核酸の分解耐性硫化誘導体およびチオリン酸誘導体ならびにポリヌクレオシドアミド（StecらのPCT公報WO91/16331；ZonらのPCT公報WO88/07544；P.E．Nelsen ら，Science（1991）254:1497-1500；M．Egholm，JACS（1992）114:1895-1897）であるが、これらに限定されない。特に好ましい本発明アンチセンス核酸の設計変更は、（1）該核酸の細胞内安定性を増大させるため、（2）該核酸の細胞透過性を増大させるため、（3）センス鎖に対する該核酸の親和性を増大させるため、あるいは（4）該核酸に毒性があるならば、その毒性を減少させるために設計される変更である。ANTISENSE RESEARCH AND APPLICATIONS（S.T．CrookeおよびB. Lebleu編，CRC Press，1993）に記述されているように、このような改良の多くは当該技術分野で公知である。したがって、核酸は、改変または修飾された塩基、糖または結合を含有し得、リポソームのような特殊化した系で送達され得、または結合部分を有し得る。このような結合部分には、細胞膜との相互作用を促進する脂質のような疎水性部分、またはリン酸骨格の電荷中和剤として働くポリリジンのようなポリカチオン性部分が含まれる。結合され得る特に好ましい脂質はコレステロールである。これらの結合部分は、核酸の3'末端か5'末端に結合し得、かつ、塩基、糖またはヌクレオシド結合を介して結合し得る。その他の部分は、エキソヌクレアーゼ分解を防止するための、特に核酸の3'末端または5'末端に配置されるキャッピング基であり得る。このようなキャッピング基には、当該技術分野で公知のヒドロキシル保護基（ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールを含む）が含まれるが、これらに限定されない。投与本発明のアンチセンス化合物またはリボザイム化合物は、様々な方法（例えば静脈内、経口、筋肉内、腹腔内、気管支、鼻孔内など）によって投与することができる。好ましい投与経路は、化合物の性質と処置しようとする症状に依存する。化合物が摂取時に十分に吸収され、実質的に分解されない場合は、経口投与することができる。化合物を医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて、医薬組成物として投与してもよい。そのような組成物は水溶液、乳剤、クリーム、軟膏、懸濁液、ゲル、リポソーム懸濁液などであり得る。したがって、適切な賦形剤には、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液およびエタノールの溶液、グルコース、ショ糖、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（PEG）、ホスフェート、アセテート、ゼラチン、コラ剤、抗菌剤および緩衝剤（例えばBHA、BHT、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリンなど）を追加してもよい。調剤に有用なクリームまたは軟膏基材には、まれる。他の局所製剤にはエアロゾル、包帯、徐放性パッチなどが含まれる。また、化合物を適切なポリマーの基質または膜に取り込むか、またはカプセル化することによって、局所的に処置しようとする部位近くへの移植に適した徐放送達ような装置が含まれる。さらに、化合物を固形で（とりわけ凍結乾燥粉末として）提供することもできる。凍結乾燥製剤は代表的には安定化剤と増量剤（例えばヒト血清アルブミン、ショ糖、マンニトールなど）を含む。医薬的に許容される賦形剤に関する詳細な議論はRemington's Pharmaceutical Sciences（Mack Pub ．Co.）に記載されている。本発明のアンチセンス組成物を医薬的投与のために調製することができる。注射製剤と座剤は通常、１アンプルまたは１カプセルあたり１〜10mgの核酸または核酸アナログを含む。ヒト患者の場合、日用量は約0.1〜1,000mg、好ましくは１〜100mg（10〜20mg/kg体重から1000〜2000mg/kg体重まで）である。しかし、各患者に関する特定の投与量は、例えば、使用する特定の核酸または核酸アナログの効力、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間と投与形式、排出速度、一緒に使用される他の薬物との組み合わせ、および治療を適用する特定の疾患の重篤度など、広範な因子に依存する。本発明に包含される医薬製品には、その活性成分が意図する目的を達成するのに有効な量で含まれている製品が含まれる。好ましい範囲は前記したが、処置に最も有効な量の決定は当該分野の技術に包含される。医薬製剤は、本発明の核酸とその硫化およびチオリン酸化アナログに加えて、適切な賦形剤と活性化合物の加工を容易にする助剤を含み得る。製剤、とりわけ経口投与でき、好ましい投与法に使用できる製剤（錠剤、糖衣錠、カプセルなど）および直腸内に投与できる製剤（座剤など）ならびに非経口投与や経口投与に適した溶液剤および頬または舌下に投与できる組成物は、0.1〜99重量％の活性成分を賦形剤と共に含み得る。好ましい投与法は非経口投与、とりわけ静脈内投与である。非経口投与に適した製剤には、水溶型もしくは水分散型活性化合物の水溶液が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁液も適切な油状注射懸濁液として投与できる。適切な親油性の溶媒または担体には脂肪油（例えば、ごま油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が含まれる。水性注射懸濁剤は懸濁液の粘性を増大させる物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および/またはデキストラン）を含んでもよい。また懸濁剤は必要に応じて安定化剤を含んでもよい。さらに、本発明の化合物をリポソーム中にカプセル化して、脂質層に付着した同心円状の水層からなる微粒子中に活性成分が分散または多様に存在して含まれている医薬組成物として投与してもよい。活性成分はその溶解度によって、水層と脂質層の両方に存在するか、あるいはいわゆるリポソーム性懸濁液として存在し得る。疎水層は一般に（必ずしもそうではないが）レクチンやスフィンゴミエリンなどのリン脂質、コレステロールなどのステロイド、リン酸ジセチル、ステアリルアミンまたはホスファチジン酸のような多かれ少なかれイオン性を有する界面活性剤、および/または他の疎水性物質を含む。リポソームの直径は一般に約15nm〜５ミクロンの範囲である。リポソームおよび/または脂質懸濁剤の調製にとりわけ好ましい脂質はDOTMAとDOTAPである。 DOTAPはBoehringer Mannheimから市販されているし、L．Stamatatosら，Bioch em 27:3917-25（1988）；H．Eiblら，Biophys Chem 10:261-71（1979）に記述されている方法に従って製造することもできる。DOTMAはLipofectin^*（BRL,Gaithe rsburg，MDから入手できる）という名前で市販されており、P.L．Felgnerら，Pr oc Nat Acad Sci USA 84:7413-17（1987）に記述されている。次に、とりわけ有利な実施態様を説明する下記実施例を参照して本発明を説明するが、これらの態様は単なる実例であって、決して本発明を限定するものと解釈してはならない。実施例実施例１ハイブリトープ合成ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）ゲノムのsf2単離物のRev応答要素（RRE）内の 113ヌクレオチド領域に対応するハイブリトーププローブプールを作成した。この領域はHIV sf2ゲノム内のヌクレオチド7769-7881を含み、（nt7769）5'-ATA G TA GGA GCT ATG TTC CTT GGG TTC TTG GGA GCA GCA GGA AGC ACT ATG GGC GCA G TG TCA TTG ACG CTG ACG GTA CAG GCC AGA CAA TTA TTG TCT GGT ATA GTG CAA C A-3’（nt7881）という配列を持つ。このプールは96個のデオキシリボヌクレオチドプローブからなり、各プローブは28量体である。プール中の各プローブの5' 部分は同一で、5'-CCG ACG GAC C-3'という配列の10量体からなる。この高GC含有配列は固体支持体への結合に使用されるアダプタープローブにハイブリダイズする。各プローブの3'側の18量体部分はHIV RREの一部にハイブリダイズし、この部分のそれぞれはプール中のもう１つのプローブの配列と１ヌクレオチドづつ重複している。例えばプローブ１はヌクレオチド7769-7786にハイブリダイズする3'部分を持ち、プローブ２はヌクレオチド7770-7787にハイブリダイズする3' 部分を持つというように、ヌクレオチド7864-7881にハイブリダイズする3'部分を持つプローブ96まで続く。このプローブプールはGenosys Biotechnologies，I nc.（The Woodlands，TX）による標準的ホスホルアミダイト化学で合成した。実施例２ HIV RRE 領域のハイブリトープマッピング A．プローブ合成 HIV RRE領域の113ヌクレオチドに対応するハイブリトーププローブプールを実施例１のように合成した。標準的な方法を用いて、5'-G GTC CGT CGG-(N)₅₄-CT CTT GGA AAG AAA GT-3'という配列を持つアダプタープローブも合成した。アダプタープローブの5'末端はハイブリトーププローブにハイブリダイズし、3'末端は固体支持体に結合した捕捉プローブにハイブリダイズする。そして中間は54個の無作為な塩基からなるスペーサー領域である。5'-CA CTT CAC TTT CTT TCC AA G AG-3'という配列を持つ捕捉プローブを合成し、その3'末端を微量滴定プレートのウェルに結合した。 B．標的の標識化 DNAプラスミドpBKBH10SはLTR領域を欠くHIVのHXB2株のゲノムの9.2kbコピーを含有する。pBKBH10SをSac Iで切断し、ゲノムの全長RNA転写物をT7 RNAポリメラーゼと4種類のrNTPを用いて30UTPにつき１ビオチニル化UTPを組込みながら作成して、全長転写物あたり約75ビオチニル化UTPとした。このビオチニル化ヌクレオチドはストレプタビジンに結合したアルカリホスファターゼとの複合体を形成することができる。 C．マッピング操作実施例2-Bで調製した標識標的と、各ウェルに結合した捕捉プローブ（実施例2 -Aで調製したもの）で覆われた96ウェル微量滴定プレートを用い、実施例１の96 ハイブリトーププローブプールでHIV RRE領域をマッピングした。標的（10フェムトモル）、500フェムトモルの各試験プローブ、および１ピコモルのアダプタープローブを、37℃のハイブリダイゼーション緩衝液（0.1M NaCl，0.05M KOAc, 16mM MgCl₂, 1mMスペルミジン，50mM Tris-HCl pH7.5，0.2％アセチル化BSA）中で別々に１時間平衡化した。標的とプローブを混合し、さらに１時間平衡化させた。ウェルを洗浄液P（0.5×SSC，0.1%SDS）で３回洗浄した。ストレプタビジン結合アルカリホスファターゼ（BMB,１:10,000希釈）を加え、37℃で５分間インキュベートした。洗浄液Pでさらに３回洗浄した後、0.5×SSCで３回洗浄した。次に、乾燥ウェルに50μl/ウェルのLumiphos-plus（Lumigen，Southfield，MI ）を加え、37℃で30分間インキュベートし、発光カウント数を決定した。96プローブプールに対するこのアッセイの結果を図３に示す。B6、C6、D7およびF8と命名した４つのハイブリトープを最適な結合性18量体として選択した。これらのプローブに相補的なHIV RRE領域はそれぞれ7787、7798、7811および7837を5'末端とする。実施例３ハイブリトープサイズの最適化 A．ハイブリダイゼーション分析実施例２で選択したハイブリトープのうち３つ、すなわちB6（7787）、C6（77 98）およびD7（7811）をサイズの最適化についてスクリーニングした（括弧内の数字は相補的なHIV RRE領域の5'末端を示す）。選択した（一次）ハイブリトープのそれぞれについて、一組の二次ハイブリトープを合成した。各二次ハイブリトープは実施例１に記載の一次ハイブリトープと同じ5'高GC含有領域を含有し、一次ハイブリトープと同じHIV RRE領域（同じ5'末端に始まるが長さは６〜23ヌクレオチドの間で変化する）にハイブリダイズする3'領域を含有した。これらの二次ハイブリトーププールを実施例２に記載のHIV RRE標的に対してスクリーニングしたが、スクリーニングは37℃と53℃で並行して行なった。その結果を図４に示す。生理学的条件では最適ハイブリトープ長が12ヌクレオチド付近のようであり、53℃での最適長は20ヌクレオチド付近である。10ヌクレオチド以下のハイブリトープの有意な検出できる結合が生理学的温度で起こり、このような長さを使用した場合の非特異的ハイブリダイゼーションの潜在的に有意な原因の存在が示される。そこで、より短い二次ハイブリトープに対してRNAse H分析を行なった。 B．RNAse H分析 205量体のHIV RRE RNAミニ転写物を、Promega Riboprobe II Core Systemを用いて、比活性8×10⁶cpm/pmolの³²P-GTPを組込みながら、pBKBH10Sから作成した。ミニ転写物をNensorbカラムにかけて、50%エタノール中に溶出させ、沈降させ、水に再懸濁し、凍結保存した。各RNase H反応液は10⁵cpmのミニ転写物を含み、これを50mM Tris pH7.5，16mM MgCl₂,１mMスペルミジン，50mM KOAc，0.1M NaClおよび１単位のインヒビターゼ（ヌクレアーゼ阻害剤）を含む20μl緩衝液中、37℃で１時間予備インキュベートした。0.5μMの各二次ハイブリトープを加え、37℃で１時間インキュベートした。10単位のRNase Hを各反応液に加え、30分間インキュベートした。５μlの停止緩衝液（５％ SDS，250ng/μlプロテイナーゼK，75mM EDTA）を各反応液に加え、65℃で15分間インキュベートした。５％変性ポリアクリルアミドゲルにかけた生成物のAmbis走査から切断効率を計算した。図５に示す結果は、６量体と８量体の有意なハイブリダイゼーションが37℃で起こることを立証しているが、最適プローブ選択によってより低いプローブ濃度を可能にする。実施例４不連続プローブ実施例３で分析したいくつかの二次ハイブリトープを図６に図式化する不連続プローブ設計の基礎として利用した。HIV RREの37量体領域を、連続にもしくは- O-(CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-)₂スペーサー（「Z-Zスペーサー」）を用いて連結したB6、C6およびD7に対応する様々な長さの二次ハイブリトープ（図７の表で説明するように、標的にされないヌクレオチドが介在する）を用いて調べた。例えば図７のプローブ＃1は、図６に示す標的のヌクレオチド1-25にハイブリダイズする連続プローブである。プローブ＃8は、ヌクレオチド1-7、14-23および2 6-34に対応する３つのオリゴヌクレオチドを含有する不連続プローブであり、各セグメントがZ-Zスペーサーで連結されている。不連続プローブは実施例1Aに記載の5'高GC含有領域をも含む。実施例２のアッセイで不連続プローブを用いた結果を図８に示す。これらの結果は、スペーサーを持たない連続プローブがあまり機能しないのに対して、ハイブリダイズする領域間に４〜６ヌクレオチド間隔を持つ不連続なプローブが、同じヌクレオチド数を持つ連続プローブよりも高いハイブリダイゼーション効率を発揮することを示している。実施例５抗HIV活性を持つリード化合物を発見するためのハイブリトープマッピングの使用 A．仮トランフェクションアッセイ HeLa細胞を６ウェルにプレートした。翌日、培養上清を除去し、0.2、0.4、0. 6または１mMのチオリン酸オリゴマー（16量体；下記実施例5-Bに記載）を含む培地を２つ一組のウェルに加えた。次に、リン酸カルシウム沈降HIV-1プロウイルス（およびキャリアー）DNAを各ウェルに加えた。翌日、細胞を洗浄し、適切なオリゴマーを含む新鮮な培地を加えた。トランスフェクション開始の３日後に培養培地を収集し、HIV-1 p24のレベルを決定した。そのHIV-1 p24レベルを、オリゴマーを加えなかった培養物のレベルおよび同じぐらいの長さの完全に無作為化したオリゴマーの調製物(N)₁₇を加えた場合のレベルと比較した。オリゴヌクレオチドがp24レベルを無作為オリゴヌクレオチド対照の少なくとも２倍減少させる場合に、それをこのアッセイにおける阻害剤と見なした。 B．ハイブリトープマップから選択したプローブのアンチセンス効力の試験実施例１に記載のHIV RREに対する合計11種類のプローブを16量体チオリン酸オリゴヌクレオチドとして合成した。このプローブの5'末端の位置は効果的なハイブリダイゼーションにとって最も重要なので、前記のスクリーニングに使用した18量体プローブの２ヌクレオチドを3'末端から欠失させた。この修飾は非特異的効果の減少に役立つ。各候補プローブを0.2と１μMとの間の濃度でHeLa細胞と共にインキュベートし、細胞にHIV-1 DNAをトランスフェクションした。３日後、プローブと共に連続的にインキュベートした後、p24レベルを決定した。以下の表１はその結果を示している。オリゴヌクレオチドがp24レベルを無作為オリゴヌクレオチド対照の少なくとも２倍減少させれば、それをこのp24生物学的アッセイにおける阻害剤と見なし、平均プローブのRLUを少なくとも２倍にするならば、それをこのマッピングアッセイにおける効果的ハイブリダイザーと見なした。上記表１中の「番号」は18量体の親プローブの3'末端が結合するHIV SF2標的の5'位置である。転写物とウイルスRNAに対する結合は共に、試験オリゴで結合したRLU/平均オリゴで結合したRLUとして表す。両方は、18量体DNAプローブを用いて決定した。阻害倍率（I）は、１μMプローブを用いて、I＝p24無作為オリゴ /p24試験オリゴと計算した。４つのプローブがいくつかの生物学的効力を示した（7806、7807、7811および 7843）。２つのプローブは転写物にもウイルスRNAにもハイブリダイズせず（778 1，7822）、これらは生物学的にも無効であった。２つのプローブが転写物に効果的にハイブリダイゼーションし（7786，7811）、そのうちの１つ（7811）は生物学的に有効であった。他の７つのプローブはウイルスRNAに効果的にハイブリダイズし（1.9〜2.0を与える）、そのうちの３つは生物学的に有効であった。転写物かウイルスに対するハイブリダイゼーションアッセイで「勝者」となったプローブをスクリーニングすることによって、試験したたった９種類のプローブのうち全部で４種類の生物学的勝者が検出された。 HIVに対するプローブの正確な「成功率 (hit rate)」はわかっていない（この数字を知るには何百というプローブを生物学的に試験する必要がある）が、4/ 9などということはまずないだろう。当業者は、（タンパク質を除去したウイルスRNAまたはインビトロ転写物よりもむしろ）細胞から単離したリボヌクレオタンパク質複合体を使用すれば、さらに高い成功率を持つアクセスし得る部位のより正確なハイブリトープマップが得られるはずであることを理解するだろう。特定の実施態様に言及して本発明を説明したが、本願は、添付の請求の範囲と思想から逸脱することなく当業者がなし得る変化や置換をも包含すると解釈される。

Claims

【特許請求の範囲】１．標的核酸の公知のヌクレオチド配列内で結合するヌクレオチド配列を含む結合オリゴヌクレオチドを検出または決定する方法であって、以下の工程：（a）多数のオリゴヌクレオチドを得る工程であって、各オリゴヌクレオチドは公知のヌクレオチド配列内の配列に相補的である第1のヌクレオチド配列を含み、そして該オリゴヌクレオチドは、重複する第１のヌクレオチド配列を有し、該多数のオリゴヌクレオチド中の該各オリゴヌクレオチドの第１の配列は、該多数のオリゴヌクレオチド中の別のオリゴヌクレオチドの第１の配列と、１〜４ヌクレオチドで重複する、工程；（b）標的に対するオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、該各オリゴヌクレオチドを、該標的核酸と接触させる工程；および（c）該各オリゴヌクレオチドが該公知のヌクレオチド配列内で結合するかどうかを示すために、該各オリゴヌクレオチドと該標的核酸との間の特異的なオリゴヌクレオチド−標的結合の存在の有無を検出または決定する工程であって、それによって１以上の結合オリゴヌクレオチドを決定または検出する、工程、を包含する方法。２．請求項１に記載の方法であって、前記多数のオリゴヌクレオチド中の、前記各オリゴヌクレオチドの第１の配列が、該多数のオリゴヌクレオチド中の別のオリゴヌクレオチドの第１の配列と１ヌクレオチドだけ重複する、方法。３．請求項１に記載の方法であって、前記多数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドが、アダプタープローブ中の試験プローブ認識配列に相補的なアダプタープローブ認識配列である核酸配列を有する領域をさらに含み、そしてさらに工程（b）が以下の工程：（b₁）（i）固体支持体に結合した捕捉プローブオリゴヌクレオチド、該捕捉プローブは、捕捉プローブ認識配列に相補的な核酸配列を有し、（ii）捕捉プローブ認識配列を有する領域、０〜５０ヌクレオチドの可変スペーサー領域、および試験プローブ認識配列を有する領域を含むアダプタープローブオリゴヌクレオチドを提供する、工程；（b₂）液体媒体中、相補対が結合する条件下で、各オリゴヌクレオチドを、標的核酸、捕捉プローブ、およびアダプタープローブとを混合して、支持体結合プローブ−標的複合体を形成する工程；および（b₃）該固体支持体を洗浄して、非結合の標的を実質的に含まない支持体結合プローブ−標的複合体を形成する工程、を包含する方法。４．請求項３に記載の方法であって、工程（c）において、（c₁）前記標的核酸を標識する工程；（c₂）複合体中の標識の存在を検出することによって、前記支持体結合プローブ −標的複合体の存在を検出し、それによって特異的なオリゴヌクレオチド−標的結合を検出する工程、を包含する工程によって、特異的なオリゴヌクレオチド−標的結合の存在の有無を検出または決定する、方法。５．請求項４に記載の方法であって、工程（c₁）において、標的をビオチン-U TPの取り込みによって標識化し、そして（c_2a）前記支持体結合プローブ−標的複合体を、アビジンまたはストレプトアビジンに結合したアルカリホスファターゼ（AP）と共にインキュベートして、支持体結合プローブ−標的−AP複合体を形成する工程；（c_2b）非結合APを洗浄により取り除く工程、および（c_2c）支持体結合−標的−AP複合体を、AP基質と共にインキュベートし、そして基質の変換をモニターする工程、を包含する工程により、工程（c₂）で、標識を検出する、方法。６．標的核酸内の公知のヌクレオチド配列に結合する不連続プローブを検出または決定する方法であって、該不連続プローブは、（i）該標的核酸の異なる領域にそれぞれ相補的である少なくとも２つの結合オリゴヌクレオチドを含み、必要に応じて（ii）有機リンカー分子によって共有結合され、該方法は以下の工程：（a）該標的核酸の第１および第２の領域に相補的である、少なくとも第１および第２の結合オリゴヌクレオチドを決定する工程であって、該第１および第２の結合オリゴヌクレオチドは、該標的核酸の他の領域に相補的である他のオリゴヌクレオチドよりも該標的核酸に強く結合し、該第１および第２の領域は隣接していない、工程；（b）工程（a）で決定した少なくとも該第１および第２の結合オリゴヌクレオチドを、少なくとも2つの組み合わせで、必要に応じて該有機リンカー分子を用いて、共有結合し、一組の候補不連続プローブを得る工程；（c）標的に対するオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、各候補不連続プローブを、該標的核酸と接触させる工程；（d）該各不連続プローブが該標的核酸を結合するかどうかを示すために、該各不連続プローブと該標的核酸との間に特異的な不連続プローブ−標的結合の存在の有無を検出または決定し、それによって１以上の不連続プローブを決定または検出する工程、を包含する、方法。７．請求項６に記載の方法であって、工程（a）が次の工程：（a₁）多数のオリゴヌクレオチドを得る工程であって、各オリゴヌクレオチドは、公知のヌクレオチド配列内の配列に相補的である第１のヌクレオチド配列を含み、該オリゴヌクレオチドは、重複する第1のヌクレオチド配列を有し、該多数のオリゴヌクレオチド中の該各オリゴヌクレオチドの第１の配列は、該多数のオリゴヌクレオチド中の別のオリゴヌクレオチドの配列と、１〜４ヌクレオチドで重複する、工程；（a₂）標的に対するオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、該各オリゴヌクレオチドを、該標的核酸と接触させる工程；（a₃）該各オリゴヌクレオチドが該公知のヌクレオチド配列内で結合するかどうかを示すために、該各オリゴヌクレオチドと該標的核酸との間の特異的なオリゴヌクレオチド−標的結合の存在の有無を検出または決定する工程；（a₄）該標的核酸に最も強く結合する少なくとも２つの結合オリゴヌクレオチドを選択する工程、を包含する、方法。８．請求項７に記載の方法であって、前記多数のオリゴヌクレオチド中の前記各オリゴヌクレオチドの第１の配列が、該多数のオリゴヌクレオチド中の別のオリゴヌクレオチドの第１の配列と１ヌクレオチドだけ重複する、方法。９．請求項７に記載の方法であって、工程（a）が、工程（a₄）の後に、さらに以下の工程：（a₅）工程（a₄）で選択した、各第１および第２の結合オリゴヌクレオチドに対する、多数の二次オリゴヌクレオチドを得る工程であって、各二次オリゴヌクレオチドは、選択したオリゴヌクレオチドの第１の配列に同一である該第１の配列の5'末端および、該標的核酸の同じ領域に相補的な配列を有し、標的核酸に相補的である該各二次ヌクレオチドの第１の配列の長さは、該多数の二次ヌクレオチド中の他のヌクレオチドの第１の配列長さとは異なる、工程；（a₆）標的に対する二次オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、該各二次オリゴヌクレオチドを該標的核酸と接触させる工程；（a₇）該各二次オリゴヌクレオチドが前記公知のヌクレオチド配列内で結合するかどうかを示すために、該各二次オリゴヌクレオチドと該標的核酸との間の特異的な二次オリゴヌクレオチド−標的結合の存在の有無を検出または決定する工程；（a₈）該各第１および第２の結合オリゴヌクレオチドについて、該標的核酸に最も強く結合する該二次オリゴヌクレオチドを選択する工程、を包含する、方法。１０．請求項６に記載の方法であって、前記有機リンカー部分が、アリーレン、C₆−C₁₈アラルキレン、C₆−C₁₈アラルケニレン、C₆−C₁₈アラルキニレン、C₁ −C₃₀アルキレン、C₁−C₃₀アルケニレン、またはC₁−C₃₀アルキニレンからなる群より選択され、O、S、N、SiおよびSeからなる群より選択される０〜６個のヘテロ原子と、-CO-、-COO-、-CONH-、-NHCO-、-S-S-、-SO₂-、-CH（OH）-CH（OH ）-、-CH（OR¹）-CH（OR¹）-、-O-PO（O^-）-O-、-O-PO（R¹）-、-O-PO（OR¹）-O -、-O-PO（OR¹）-R²-、-PO（OR¹）-O-R²、ここでR¹は、低級アルキルであり、R² は、低級アルキレンであり、-O-（（CH₂）_n-A-）_m、ここで、-A-は、-O-または- PO₄-であり、nは、２から４までの整数であり、mは、１から２０までの整数である、からなる群より選択される０〜６個の結合とを含む方法。１１．請求項１に記載の方法によって決定されるヌクレオチド配列を含む、アンチセンスプローブ。１２．請求項６に記載の方法によって決定されるヌクレオチド配列を含む、不連続アンチセンスプローブ。１３．請求項１に記載の方法によって決定されるヌクレオチド配列を含む、リボザイムプローブ。１４．請求項６に記載の方法によって決定されるヌクレオチド配列を含む、不連続リボザイムプローブ。