ES2203650T3 - Concepcion de sonda discontinua que utiliza la cartografia hibritopa. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION PROPORCIONA UN METODO PARA DETECTAR O DETERMINAR UN OLIGONUCLEOTIDO DE UNION QUE INCLUYE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE SE UNE DENTRO DE UNA SECUENCIA CONOCIDA DE NUCLEOTIDOS DE UN ACIDO NUCLEIDO OBJETIVO UTILIZANDO UNA TECNICA DENOMINADA CARTOGRAFIA DE HIBRITOPOS. ESTA INVENCION PROPORCIONA TAMBIEN UN METODO PARA UTILIZAR LA CARTOGRAFIA DE HIBRITOPOS PARA OBTENER SONDAS DISCONTINUAS QUE SE UNEN AL ACIDO NUCLEICO OBJETIVO.

Description

Concepción de sonda discontinua que utiliza la cartografía hibritopa.

Campo industrial

Esta invención pertenece al campo de la química de sondas de nucleótidos y sondas anti-sentido. Más específicamente, esta invención proporciona un método para determinar una sonda discontinua que se une estrechamente a su diana de ácido nucleico para su utilización en diagnóstico o como terapia anti-sentido. Las sondas discontinuas se unen a dos o más regiones no-contiguas de un ácido nucleico diana e incluyen moléculas anti-sentido, ribozimas, sondas de enlazamiento y moléculas de ADN ramificadas.

Antecedentes de la invención

El desarrollo de las herramientas para reconocimiento de ADN y ARN específico respecto a secuencia es de creciente importancia en el área cada vez más extensa de la tecnología de sondas de ácido nucleico, así como en terapias anti-sentido y de ribozimas. El reconocimiento específico de la secuencia de ARN es especialmente arriesgado debido a su estructura conformacional compleja e hibridación intramolecular.

Cload y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. (1991) 113:6324-6326, describe una familia de moléculas de síntesis para el reconocimiento específico de secuencia y específico de estructura de ARN llamadas sondas de oligonucleótidos enlazados (TOPs). Las TOPs consisten en dos oligodesoxiribonucleótidos separados por un enlace sintético flexible. Los dos oligonucleótidos se unen a regiones con una sola hebra, no-contiguas, de la molécula de ARN, y están enlazados por una unidad de fosfodiéster básica que se repite, o una unidad de polietilen glicol que se repite. Los autores de este artículo no sugieren un método de selección de oligonucleótidos superiores para su enlace. Cload y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:437-442, señalan la utilización de una biblioteca de oligonucleótidos al azar para seleccionar oligonucleótidos superiores que se unen a regiones no contiguas de un ARN diana para ser enlazados juntos en una TOP. Los autores, empleando una sede de unión Rev conocida del elemento de respuesta Rev (RRE) del virus de inmunodeficiencia humana (HIV), han buscado un segundo oligonucleótido por enlazado de heptanucleótidos al azar a un octanucleótido que se une a la sede Rev, y análisis de selección (screening) con RNasa H para determinar la sede más fuerte para unión secundaria.

La Publicación europea 0 138 855 describe un método para determinar secuencias de aminoácido antigénicamente activas dentro de una proteína conocida, por síntesis de una serie de péptidos que se solapan que corresponden a secuencias en esa proteína, y posterior análisis de selección de los péptidos frente a suero de anticuerpo generado frente a la proteína para determinar los pétidos que reaccionan con los anticuerpos del suero.

Los autores de la presente invención describen aquí un método para determinar sedes superiores para enlazar oligonucleótidos a un ácido nucleico diana designado como "confección de mapas de hibritopos". La confección de mapas de hibritopos se puede utilizar para identificar sondas discontinuas mejoradas con elevadas constantes de unión.

Descripción de la invención

En un aspecto, la invención proporciona un método de selección de uno o más oligonucleótidos, que presentan la propiedad de unión deseada, desde una pluralidad de oligonucleótidos, por unión a una secuencia de nucleótidos conocida de un ácido nucleico diana, método que comprende las etapas de:

(a) obtención de una pluralidad de oligonucleótidos, comprendiendo cada uno de los oligonucleótidos una primera secuencia de nucleótido complementaria a una porción del ácido nucleico diana que se solapa con la primera secuencia de nucleótido de otro oligonucleótido de la pluralidad de oligonucleótidos por compartir una secuencia parcial común que tiene un punto de partida, respecto a la secuencia de la que derivan, a uno a cuatro nucleotidos de distancia.

(b) contacto de cada uno de los oligonucleótidos con el ácido nucleico diana en condiciones que permiten hibridación específica de oligonucleótidos a la diana y

(c) ensayo en cuanto a la presencia o ausencia de unión específica de oligonucleótido-diana entre cada uno de los oligonucleótidos y el ácido nucleico diana para indicar si cada oligonucleótido se une con la secuencia de nucleótido conocido, seleccionando con ello uno o más oligonucleótidos de unión que presentan la deseada propiedad de unión.

En otro aspecto de la invención se proporciona un método de selección de una sonda discontinua que se une a una secuencia de nucleótido conocida en un ácido nucleico diana, comprendiendo la sonda discontinua (i) al menos dos oligonucleótidos de unión, cada uno de ellos complementario de una región delimitada del ácido nucleico diana, unidos covalentemente, opcionalmente por (ii) una molécula ligando orgánica, método que comprende las etapas de:

(a) selección de al menos un primero y un segundo oligonucleótido de unión que son complementarios de las regiones primera y segunda del ácido nucleico diana, uniéndose el primero y el segundo oligonucleótido más fuertemente al ácido nucleico diana que otros oligonucleótidos que son complementarios a otras regiones del ácido nucleico diana, y donde las regiones primera y segunda no son contiguas;

(b) unión covalente de la menos el primero y el segundo oligonucleótido de unión seleccionados en la etapa (a) en al menos dos combinaciones, opcionalmente con moléculas ligando orgánicas para obtener un juego de sondas discontinuas candidato;

(c) contacto de cada sonda discontinua candidato con el ácido nucleico diana bajo condiciones que permiten hibridación específica de oligonucleótidos a la diana; y

(d) ensayo en cuanto a la presencia o ausencia de unión específica sonda discontinua-diana entre cada una de las sondas discontinuas y el ácido nucleico diana para tener indicación de si cada sonda discontinua se une al ácido nucleico diana, seleccionándose con ello una o más sondas discontinuas;

donde la etapa (a) comprende las etapas de:

(a_{1}) obtener una pluralidad de oligonucleótidos, comprendiendo cada uno de los oligonucleótidos una primera secuencia de nucleótido complementaria a una porción del ácido nucleico diana que se solapa con la primera secuencia de nucleótido de otro oligonucleótido de la pluralidad de oligonucleótidos, por compartir una secuencia parcial común que tiene un punto de partida respecto a la secuencia de la que derivan separado por uno a cuatro nucleótidos;

(a_{2}) contacto de cada uno de los oligonucleótidos con el ácido nucleico diana en condiciones que permiten hibridación específica de oligonucleótidos a la diana;

(a_{3}) ensayo en cuanto a la presencia o ausencia de unión específica oligonucleótido-diana entre cada uno de los oligonucleótidos y el ácido nucleico diana que indicará si cada oligonucleótido se une con la secuencia de nucleótido conocida; y

(a_{4}) selección de al menos dos oligonicleótidos de unión que son los que se unen más fuertemente al ácido nucleico diana.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa un ensayo de confección de mapa de hibritopo de la presente invención.

La Figura 2 muestra un método de optimización de sondas discontinuas de la presente invención.

La Figura 3 muestra los resultados de utilizar el método de confección de mapas de hibritopos de la presente invención para encontrar los oligonucleótidos óptimos que se unen a la región RRE de HIV.

La Figura 4 muestra el efecto de la longitud del oligonucleótido sobre la capacidad de los oligonucleótidos de unión candidatos para unirse a la región RRE de VIH.

La Figura 5 muestra los resultados de un experimento para confirmar la unión de oligonucleótidos de unión candidatos a la región RRE de VIH por escisión con ARNasa H.

La Figura 6 muestra el diseño de un experimento para estudiar los efectos de diseño de sonda discontinua para optimizar la unión a diana.

Las Figuras 7 y 8 presentan los resultados del experimento mostrado en la figura 6.

Modos para llevar a cabo la invención

La invención aquí descrita está relacionada con un trabajo publicado previamente y solicitudes de patente pendientes. Por via de ejemplo, este trabajo consiste en publicaciones científicas, patentes o solicitudes de patente pendientes. En esta memoria descriptiva se emplean las abreviaturas convencionales para nucleótidos y aminoácidos.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, las técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que entran dentro de los conocimientos de esta especialidad. Estas técnicas están explicadas en su integridad en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SEGUNDA EDICION (1989); DNA CLONING, VOLUMENES I Y II (D.N Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait ed., 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney ed. 1986); INMOBILIZED CELLS AND ENZIMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); las series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTOR FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller y Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Méthods in Enzimology, Vol. 154 y Vol. 155 (Wu y Grossman, y Wu eds., respectivamente), Mayer y Walker, eds. (1987). IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, Londres), Scopes (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Segunda edición (Springer Verlag, N.Y.) y HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D.M.Weir y C.C. Blackwell eds. 1986).

Definiciones

El término anti-sentido se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferiblemente ADN, que es complementaria y capaz de formar complejos de doble hebra con una hebra de "sentido" de una molécula de ARN o ADN. La hibridación de un ácido nucleico antisentido con ARNm, por ejemplo, inhibe su traducción a proteínas. Los ácidos nucleicos antisentido pueden ser protectores (si complementan una proteína viral ARNm o ARNm transcrita desde un oncogen activo, por ejemplo), o destructores (si complementan una enzima de célula esencial del huésped, tal como una enzima de preparación previa sin camino alterno efectivo). Véase también G. Zon y col., EP 288.163, que describe la utilización de oligodesoxinucleótidos para inhibición de replicación retroviral y proliferación oncogénica.

El término "marcador", tal como aquí se emplea, se refiere a cualquier átomo o molécula que se puede utilizar para proporcionar una señal detectable (preferiblemente cuantificable), y que puede unirse a un ácido nucleico o proteína. Los marcadores pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radiactividad, colorimetría, difracción de rayos X o absorción, magnetismo, actividad enzimática y similares. Entre los marcadores adecuados se incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radiactivos (en particular ^{32}P y ^{125}I), reactivos densos en electrones, enzimas, y ligandos que tienen asociados de unión específicos. Las enzimas se detectan típicamente por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante (HRP) se detecta normalmente por su capacidad para convertir 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) a pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. Ha de entenderse que la anterior descripción no significa clasificar los diversos marcadores en clases distintas, ya que el mismo marcador puede servir en modos diferentes. Por ejemplo, I^{125} puede servir como marcador radiactivo o como reactivo denso en electrones. La HRP puede servir como enzima o como antígeno para un anticuerpo monoclonal (MAb). Además, se pueden combinar varios marcadores para obtener el efecto deseado. Por ejemplo, MAbs y avidina requieren también marcadores en la práctica de esta invención: así se puede marcar una sonda con biotina, y detectar su presencia con avidina marcada con I^{125}, o con un MAb anti-biotina marcado con HRP, o con una molécula de HRP conjugada a avidina o estreptavidina. Otras permutaciones y posibilidades quedarán de manifiesto para cualquier especialista en la técnica, y se consideran equivalentes.

El término "oligonucleótido" o "polinucleótido" tal como aquí se emplea se refiere a sondas de diagnóstico, sondas antisentido, fragmentos de oligómero para ser detectados, controles de oligómero o ribozimas, y se define como una molécula que comprende dos o más desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependerán de la función final o uso del oligonucleótido. Tal como aquí se emplea, los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" y “ácido nucleico” se refieren de forma genérica a polidesoxiribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), a poliribonucleótidos (que contenían D-ribosa), a cualquier otro tipo de polinucleótido que es un N-glicósido de una base purina o pirimidina, y a otros polímeros que contienen esqueletos no-nucleotídicos (por ejemplo, ácidos nucleicos de proteinas y polímeros sintéticos de ácido nucleico específicos en secuencias que se venden en el comercio como polímeros Neugene™, de Anti-Gene Development Group, Corvallis, Oregon) o uniones no convencionales, siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita emparejar bases y apilar bases, tal como se encuentran en ADN y ARN. No se intenta distinguir en cuanto a longitud entre el término "polinucleótido" y "oligonucleótido", y estos términos se utilizarán indistintamente. Estos términos se refieren únicamente a la estructura primaria de la molécula. Según esto, estos términos incluyen ADN de una sola hebra y de doble hebra, así como ARN de una sola hebra y de doble hebra e híbridos ADN: ARN, e incluyen también tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, marcadores que son conocidos en la técnica, metilación, "remates", sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones de internucleótidos tales como, por ejemplo, las uniones sin carga (por ejemplo metil fosfonatos, fosforotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) y con uniones con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que contienen fracciones laterales, tales como, por ejemplo, proteínas (que incluyen nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), los que tienen intercaladores (por ejemplo acridina, psolareno, etc.) los que tienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen alquilantes, los que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas sin modificar del polinucleótidos u oligonucleótido.

Hay que hacer notar que, tal como aquí se utilizan, los términos "nucleosido", "nucleótido" y "ácido nucleico" incluyen aquellas fracciones que contienen no solamente las bases purina y pirimidina conocidas, sino también otras bases heterocíclicas que han sido modificadas. Estas modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros heterociclos. Los nucleósidos o nucleótidos modificados incluirán también modificaciones sobre la fracción azúcar, por ejemplo, aquella en que uno o más de los grupos hidroxilo están reemplazados por halógeno, grupos alifáticos, o llevan funciones tales como éter, aminas o similares.

Tal como aquí se emplean, un polinucleótido "derivado de" una secuencia designada se refiere a una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia de aproximadamente al menos 6 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 8 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 10-12 nucleótidos, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 15-20 nucleótidos que se corresponde con la región de la secuencia de nucleótidos designada. La expresión “que se corresponde” significa que es homóloga, complementaria o sustancialmente complementaria a la secuencia designada. El polinucleótido derivado no deriva necesariamente físicamente de la secuencia de nucleótido mostrada, sino que puede ser generado de alguna manera, incluyendo, por ejemplo, síntesis química o replicación de ADN o transcripción o transcripción inversa. Además, se pueden modificar combinaciones de regiones que se corresponden con las de la secuencia designada por métodos conocidos en la especialidad para que sean apropiadas al uso a que se destinan.

Habrá que señalar que las secuencias de unión no necesitan tener una complementariedad perfecta para proporcionar homoduplexos. En muchos casos serán suficientes heteroduplexos en los que menos de aproximadamente un 10% de las bases fallan en emparejamiento, ignorando bucles de cinco o más nucleótidos. Según esto, tal como aquí se utiliza, el término "complementario" indica una complementariedad exacta en la que cada base dentro de la región de unión se corresponde exactamente, y "substancialmente complementaria" se refiere a una homología del 90% o mayor.

Tal como aquí se emplea, el término “oligómero” se refiere tanto a cebadores como a sondas y se utiliza intercambiablemente aquí con el término "polinucleótido". El término oligómero no connota el tamaño de la molécula. Sin embargo, los oligómeros no son, típicamente, mayores de 1000 nucleótidos, más típicamente no son mayores de 500 nucleótidos, incluso más típicamente no son mayores de 250 nucleótidos; pueden no ser mayores de 100 nucleótidos y pueden no ser mayores de 75 nucleótidos, y pueden no ser mayores de 50 nucleótidos de longitud.

Tal como aquí se emplea, el término "sonda" se refiere a una estructura que comprende un polinucleótido que forma una estructura híbrida con una secuencia diana, debido a la complementariedad de al menos una secuencia de la sonda con una secuencia en la región de la diana. Las regiones de polinucleotido de las sondas pueden estar compuestas por ADN y/o ARN y/o análogos sintéticos de nucleótidos. Dentro de las sondas se incluyen "sondas de captura" como se definen a continuación.

El término "sonda de captura", tal como aquí se emplea, se refiere a una molécula que comprende un polinucleótido de una sola hebra copulado a un asociado de unión o soporte sólido. La región de polinucleótido de una sola hebra es complementaria de una región de un segundo polinucleótido, y es suficientemente larga y emparejada para proporcionar suficiente afinidad para inmovilizar el segundo polinucleótido a un soporte sólido, directamente o a través de un primer asociado de unión específica para un segundo asociado de unión unido a la superficie de un soporte sólido.

El término "soporte" se refiere a cualquier superficie sólida o semi-sólida a la que se puede anclar un asociado de unión específica. Los soportes adecuados incluyen vidrio, plástico, metal, geles polímeros y similares, y pueden presentar la forma de bolitas, pocillos, varillas de nivel, membranas y similares. Los soportes aquí preferidos son los proporcionados como bolitas de poliestireno o pocillos de placas de microvaloración.

Tal como aquí se emplea, el término "región diana" o "secuencia de nucleótido diana" se refiere a una región de unión de la sonda que contenida dentro la molécula diana. El término "secuencia diana" se refiere a una secuencia con la que una sonda formará un híbrido estable en las condiciones deseadas.

Tal como aquí se emplea, el término "detección o determinación" de una sonda de oligonucleótido o sonda discontinua se refiere a un método de selección donde se ensayan una colección de sondas en cuanto a determinada propiedad biológica, tal como la unión a una diana. El objeto de la determinación es la sonda o sondas que presenten el mejor ejemplo de la propiedad deseada. Para sondas anti-sentido, la propiedad deseada será preferiblemente una unión fuerte. Las sondas útiles para terapias de dos etapas (en las que se añade un primer fármaco, dejando que forme complejo, y añadiendo después una segunda molécula efector insertada dirigidamente al complejo) presentarán una unión persistente, que puede ser ensayada utilizando una baja concentración de sonda para unir y aplicar lavados crecientemente restrictivos para eluir los oligonucleótidos unidos más débilmente. Para las sondas de ribozimas, la propiedad deseada será preferiblemente la unión rápida, que puede seleccionarse por utilización de concentraciones de sonda bajas y tiempos de hibridación cortos.

Tal como aquí se utiliza, el término "ribozima" se refiere a un polinucleótido que tiene la capacidad de catalizar la escisión de un substrato de ácido nucleico diana. En general, una ribozima de la presente invención comprenderá una región catalítica y al menos una región de unión a substrato determinada por la técnica de confección de mapas aquí descrita. Las ribozimas están descritas en términos generales en las Patentes estadounidenses Nos. 5.144.019, 5,168.053, 5.180.818, 5.225.337 y 5.254.678. Las regiones catalíticas de las ribozimas son conocidas en la técnica e incluyen cabeza de martillo, horquilla, delta de hepatitis y ARNasa P.

Tal como aquí se emplea, el término "secuencias que se solapan" se refiere a secuencias de dos oligonucleotidos que comparten una secuencia parcial común. Por ejemplo, los oligonucleótidos GAATTC y AATTCC se solapan en su secuencia común AATTC. Debido a que estos dos oligonucleótidos derivan ambos de la secuencia GAATTCC, pero tienen un punto de partida separado por un nucleótido, se considera aquí que los dos nucleótidos se solapan en un nucleótido.

Tal como aquí se emplea, el término "sonda discontinua" se refiere a un oligonucleótido que tiene dos o más regiones que corresponden a dos o más regiones no-contiguas de un ácido nucleico diana. Las dos o más regiones están unidas covalentemente, ya sea directamente, ya sea a través de una secuencia de nucleótido interviniente, o ya sea a través de una molécula ligando orgánica. Tal como aquí se emplea, el término "sonda discontinua" se refiere a dos o más oligonucleótidos unidos covalentemente por una molécula ligando orgánica. Por "molécula ligando orgánica" se entiende una molécula orgánica espaciadora, esencialmente lineal, capaz de unirse en sus dos extremos a dos oligonucleótidos distintos.

Confección de mapas de hibritopos

En un aspecto de esta invención, se da un método de detección o determinación de la secuencia o secuencias de un ácido nucleico diana que constituye la mejor región diana para una sonda de oligonucleótido. Basándose en esta información, se pueden diseñar las sondas ideales para detección diagnóstica de la diana, o moléculas terapéuticas, tales como sonda-antisentido o ribozima.

Según la presente invención, el método proporcionado comprende las etapas de (a) síntesis u obtención de una pluralidad de oligonucleótidos, comprendiendo cada uno de los oligonucleótidos una primera secuencia de nucleótido que es complementaria de una secuencia dentro de la secuencia de nucleótido conocida, y teniendo los oligonucleótidos primeras secuencias de nucleótido solapantes donde la primera secuencia de nucleótido de la pluralidad de oligonucleótidos solapa la primera secuencia de otro oligonucleótido de la pluralidad de oligonucleótidos en uno a cuatro nucleótidos; (b) contacto de cada uno de los oligonucleótidos con el ácido nucleico diana en condiciones que permitan hibridación específica de oligonucleótidos con la diana; y (c) detección o determinación de la presencia o ausencia de unión específica oligonucleótido-diana entre cada uno de los oligonucleótidos y el ácido nucleico diana para indicar si cada uno de los oligonucleótidos se une con la secuencia de nucleótido conocida, determinándose o detectándose con ello uno o más oligonucleótidos de unión.

A. Síntesis de sonda de ensayo

El método de la presente invención se basa en el concepto de que una molécula de ácido nucleico diana dada, especialmente una diana de ARN, tiene ciertas regiones que contienen secuencias de nucleótido que están más fácilmente disponibles para unirse a la sonda que otras secuencias situadas por otros sitios de la diana. Las sondas preferidas se determinan por síntesis de una pluralidad, o colección de sondas de oligonucleótido candidato ("sondas de ensayo") que corresponden a segmentos de solapamiento del ácido nucleico diana, incubando cada miembro de la colección con la diana; y determinando la cantidad de unión sonda-diana.

La colección de sondas de ensayo, o colección de hibritopos, consiste en un juego de sondas de oligonucleótido, cada una de las cuales comprende una primera secuencia de unión a diana que es complementaria de una secuencia de ácido nucleico dentro de la secuencia de ácido nucleico diana conocida. El juego de sondas de oligonucleótido tiene secuencias de nucleótido solapando secuencias de nucleótido donde la primera secuencia de unión a diana de cada uno de los oligonucleótidos de la colección se solapa con la primera secuencia de unión a diana de otro de los oligonucleótidos de la colección en uno a 20 nucleótidos, preferiblemente uno a 4 nucleótidos, más preferiblemente en 1 nucleótido. La región que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana conocida es generalmente de 6 a 30 nucleótidos, más preferiblemente de 8 a 24 nucleótidos, aún más preferiblemente de 8 a 16 nucleótidos. Las sondas de ensayo son preferiblemente moléculas de ADN de una sola hebra, que contienen opcionalmente uno o más enlaces fosforotioato o grupos 2'-O-metilo.

Además, las sondas de ensayo pueden contener otras secuencias que son útiles en el ensayo de detección de unión a diana. Por ejemplo, las sondas de oligonucleótido pueden contener opcionalmente una segunda secuencia que es una secuencia de reconocimiento de sonda adaptadora que tiene una secuencia de ácido nucleico complementaria de una secuencia de reconocimiento de sonda de ensayo, que se utiliza para capturar la sonda de ensayo directamente o indirectamente en un soporte sólido. Esta región es por lo general de 6 a 30 nucleótidos, más preferiblemente de 8 a 24 nucleótidos, aún más preferiblemente de 8 a 16 nucleótidos. Las sondas de ensayo pueden contener también una tercera secuencia que es una secuencia espaciadora de 1 a 50 nucleótidos, útiles para espaciar la primera secuencia de unión a diana de la segunda secuencia de reconocimiento de sonda adaptadora.

Las sondas de ensayo se obtienen por síntesis de oligonucleótidos individuales por métodos conocidos. Las referencias de antecedentes que se refieren en general a métodos de síntesis de oligonucleótidos incluyen las relacionadas con las síntesis de 5'- a 3'-basándose en el empleo de grupos de protección fosfato de \beta-cianoetilo, como en, por ejemplo, el de Napoli y col. Gazz Chim. Ital (1984) 114:65, Rosenthal y col. Tetrahedron Lett. (1983) 24:1691, Belagaje y Brush, Nuc. Acids Res. (1977) 10:6295, en referencias que describen síntesis de 5'- a 3' en fase solución se incluyen Hayatsu y Khorama, J. Am. Chem. Soc. (1957) 89: 3880, Gait y Sheppard, Nuc. Acids Res. (1977) 4:1135, Cramer y Koster, Angew Chem. Int. Ed. Engl. (1968) 7: 473 y Blackburn y col., J. Chem. Soc. (1967) Parte C 2438.

Adicionalmente, Matteucci y Caruthers, J. Am. Chem. Soc (1981) 103: 3185-91 describen el empleo de fosfocloriditas en la preparación de oligonucleótidos. Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Lett. (1981) 22:1859-62 y Patente estadounidense 4.415.732 describen la utilización de fosforoamiditas para la preparación de oligonucleótidos. Smith, ABL 15-24 (diciembre, 1983) describe síntesis automatizada de oligodesoxiribonucleótidos en fase sólida. Véanse también las referencias allí citadas, así como Warner y col., DNA (1984) 3: 401-11, cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia. T. Horn y M.S. Urdea, DNA (1986) 5: 421-25 describen la fosforilación de fragmentos de ADN sobre soporte sólido utilizando bis(cianoetoxi)-N,N-disisopropilaminofosfina. Véase también, T. Hor y M.S. Urdea, Tetrahedron Lett. (1986) 27:4705-08.

B. Hibridación y detección de sondas de ensayo

Una vez que el juego de la colección de sondas de ensayo ha sido sintetizado, se ponen en contacto las sondas de ensayo individuales con el ácido nucleico diana en condiciones que permiten hibridación específica de oligonucleótidos de sonda de ensayo a la diana, y a continuación se determina la cantidad de unión para cada par sonda-diana. En lo siguiente se incluyen referencias sobre técnicas de hibridación en general: Meinkoth y Wahl, Anal Biochem. (1984) 138:267-84 (revisión de técnicas de hibridación), Leary y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 4045-49 (ADN biotinilado en unión con conjugados avidina-enzima para detección de secuencias de oligonucleótidos específicas); Ranki y col. Gene 21: 77-85 (ensayo de hibridación sandwich), Pfeuffer y Helmrich, J. Biol Chem (1975) 250: 867-76 describen la copulación de guanosina-5'-O-(3-tiotrifosfato) a Sepharose^{R} 4B. Bauman y col., J. Histochem. and Cytochem. 29:227-37 describen el marcado en 3' de ARN con substancias fluorescentes. La solicitud de Patente PCT WO/8302277 describe la adición de fragmentos de ADN de ribonucleótidos modificados para marcar y métodos para analizar tales fragmentos de ADN. Renz y Kurz, Nuc. Acids. Res. (1984) 12: 3435-44, describen la unión covalente de enzimas a oligonucleótidos. Wallace, DNA Recombinant Technology (Woo, S. ed.) CRC Press, Boca Raton, Florida, proporciona un antecedente general del uso de sondas en diagnosis. Chou y Merigan, N. Eng, J. of Med. 308:921-25, describen el empleo de una sonda marcada con radioisótopo para la detección de CMV. Inman, Meth. Enzymol (1974) 34B, 24:77-102, describe procedimientos para unión a poliacrilamidas, mientras que Parikh y col., Meth Enzimol (1974) 34B, 24: 77-102 describen reacciones con agarosa. Alwine y col. Proc. Natl. Acad. Sci USA (1977) 74:5350-54 describen un método de transferir oligonucleótidos desde geles a un soporte sólido para hibridación. Chu y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11: 6513-29, describen una técnica para obtener derivados nucleótidos terminales. Ho y col. Biochemistry (1981) 20:64-67 describen obtención de derivados de nucleótidos terminales a través de fosfato para formar ésteres. Ashley y MacDonald, Anal Biochem. (1984) (1984) 140:95-103 describen un método para preparar sondas a partir de molde unido a superficie. Hebert y Gravel, Can. J. Chem. (1974) 52:187-89 y Rubinstein y col. Tetrahedron Lett. (1975) 17: 1445-48 describen la utilización de compuestos que contienen nitrofenilo como grupos protectores sensibles a la luz. K. Groegke y col. Helvetica Chimica Acta (1990) 73: 608-617 describen el empleo de t-butildimetilsililo para proteger una función hidroxilo.

En un modo de realización preferido de esta invención, se lleva a cabo la hibridación y detección de la sonda por modificación del método descrito en las Patentes USA números 4.868.105 y 5.124.246 para Urdea y col. Estos ensayos de hibridación sandwich en fase solución se llevan a cabo por lo general como sigue y como se muestra en la figura 1. En cada ensayo, se incuba el ácido nucleico diana de una sola hebra en condiciones de hibridación con un exceso de dos sondas de ácido nucleico de una sola hebra: (1) una sonda de ensayo como se ha descrito antes, que tiene una primera secuencia de nucleótido de unión complementaria a la diana y una segunda secuencia de unión que es una secuencia de reconocimiento de sonda adaptadora; y (2) una sonda adaptadora que tiene una primera secuencia de unión que es una secuencia de reconocimiento de sonda de ensayo complementaria de la secuencia de reconocimiento de sonda adaptadora de la sonda de ensayo, una segunda secuencia de unión que es capaz de hibridación específica con un oligonucleótido unido a una fase sólida, y que contiene opcionalmente una secuencia espaciadora de 1 a 50 nucleótidos. El producto resultante es un complejo de ácido nucleico de tres componentes de la sonda de ensayo que forma sandwich entre la diana y la sonda adaptadora. La segunda secuencia de unión y la secuencia espaciadora opcional de la sonda adaptadora permanece como cola de una sola hebra.

En las condiciones de hibridación, este complejo se añade entonces a una fase sólida que lleva unida a ella una sonda de captura (o se incuba simultáneamente con ella). La sonda de captura es un oligonucleótido de una sola hebra que es substancialmente complementario de la segunda secuencia de unión de la sonda adaptadora. El producto resultante comprende el complejo unido a la fase sólida a través del duplexo formado por la sonda de captura unida a la fase sólida y la segunda secuencia de unión de la sonda adaptadora. La fase sólida con complejo unido se separa entonces desde materiales sin unir por lavado.

La secuencia de unión de la sonda adaptadora que es una secuencia de reconocimiento de la sonda de ensayo sustancialmente complementaria a la secuencia de reconocimiento de la sonda adaptadora sobre la sonda de ensayo será de al menos 5 nucleótidos, normalmente de al menos 10 nucleótidos, y no más de aproximadamente 20 nucleótidos. Será típicamente de aproximadamente 10 nucleótidos.

La segunda secuencia de unión de la sonda adaptadora se selecciona para que sea sustancialmente complementaria del oligonucleótido unido a la fase sólida y de esta forma no ser encontrada por secuencias endógenas de la diana. La segunda secuencia de unión puede ser contigua a la primera secuencia de unión o estar separada de ella por una secuencia espaciadora no complementaria intermedia de entre 0 a 50 nucleótidos. La utilización de una región espaciadora corta (o de ninguna) de 1 a 10 nucleótidos impide la extensión de la sonda de ensayo al interior de las moléculas de ácido nucleico diana cuando se unen al soporte sólido a través de la sonda adaptadora y es por tanto preferible cuando se determinan sondas de ensayo que se unen solamente a las superficies externas de las moléculas diana. La sonda puede incluir otras secuencias no-complementarias si se desea. Estas secuencias no-complementarias no deben impedir la unión de la secuencia de unión o hacer que tenga lugar una unión no específica. La sonda adaptadora se puede preparar por procedimientos de síntesis de oligonucleótidos o por clonación, preferiblemente lo primero.

La fase sólida que se utiliza en el ensayo puede estar en partículas o ser una superficie de pared sólida de cualquiera de los diversos recipientes, por ejemplo, tubos de centrífuga, columnas, pocillos de placas de microvaloración, filtros, tubos, etc. Cuando se emplean partículas, estas serán preferiblemente de un tamaño en el intervalo de aproximadamente 0,4 a 200 micras, más habitualmente de aproximadamente 0,8 a 4,0 micras. Las partículas pueden ser de cualquier material conveniente, tal como látex, o vidrio. Las placas de microvaloración constituyen la superficie sólida preferida. El oligonucleótido que es substancialmente complementario de la segunda secuencia de unión de la sonda adaptadora puede unirse de manera estable a la superficie sólida a través de grupos funcionales por procedimientos conocidos.

Se comprenderá que se puede reemplazar la segunda secuencia de unión de la sonda adaptadora y el oligonucleótido unido a la fase sólida con un par ligando-receptor apropiado que formará una unión estable que une la fase sólida a la primera secuencia de unión de la sonda de captura. Entre los ejemplos de estos pares están biotina/avidina, tiroxina/globulina de unión a tiroxina, antígeno/anticuerpo, hidrato de carbono/lectina, y similares.

La relación de sonda adaptadora y sonda de ensayo a moles anticipadas de diana será al menos estequiométrica de cada una y preferiblemente en exceso. Esta relación es preferiblemente de al menos aproximadamente 1,5:1, y más preferiblemente de al menos 2:1. Normalmente estará en el intervalo de 2:1 a 10^{6}:1. Las concentraciones de cada una de las sondas estará por lo general en el intervalo de aproximadamente 10^{-9} a 10^{-2} M, variando las concentraciones de ácido nucleico de la muestra de 10^{-10} a 10^{-8}. Las etapas de hibridación del ensayo durarán por lo general entre aproximadamente 10 minutos y 20 horas, completándose frecuentemente en aproximadamente 1 hora. La hibridación se puede llevar a cabo a temperatura suavemente elevada, generalmente en el intervalo de aproximadamente 20ºC a 80ºC, más habitualmente de aproximadamente 35ºC a 70ºC, en particular 65ºC.

La reacción de hibridación se hace normalmente en un medio acuoso, particularmente un medio acuoso tamponado, que puede incluir diversos aditivos. Los aditivos que se pueden emplear incluyen concentraciones bajas de detergente (0,1 a 1%), sales, por ejemplo, citrato de sodio (0,017 a 0,17M), Ficoll, polivinilpirrolidona, ácidos nucleicos vehículo, proteínas vehículo, etc. Se pueden añadir disolventes no-acuosos al medio acuoso, tal como dimetilformamida, dimetilsulfóxido, alcoholes, y formamida. Estos otros disolventes están presentes generalmente en cantidades que varían entre 2 y 50%.

La rigurosidad del medio de hibridación se puede controlar por la temperatura, concentración de sal, sistema disolvente, y similares. Así, dependiendo de la longitud y naturaleza de la secuencia de interés, se puede variar la rigurosidad. Las condiciones de hibridación preferidas, que son aproximadamente las condiciones fisiológicas, son 37ºC, catión monovalente 0,15 M. Mg^{++} 16 mM y espermidina 1 mM.

El procedimiento utilizado en las etapas de separación del ensayo variará dependiendo de la naturaleza de la fase sólida. En el caso de partículas, se utilizará centrifugación o filtración para la separación de las partículas, descartando el sobrenadante o aislando el sobrenadante. Cuando se ensayan partículas, las partículas se lavarán a fondo, normalmente de una a cinco veces, con un medio tamponado apropiado, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene un detergente tal como SDS. Cuando los medios de separación consisten en una pared o soporte, el sobrenadante se puede aislar o descartar y lavarse la pared de la misma manera que la indicada para las partículas.

El complejo se detecta entonces por marcado de la diana en el complejo unido. La diana se puede marcar antes o después de la formación de complejo. La diana marcada incluirá una o más moléculas ("marcadores") que proporcionan directa o indirectamente una señal detectable. Los marcadores se pueden unir a miembros individuales de la secuencia diana o pueden estar presentes como miembro terminal o cola terminal que tiene una pluralidad de marcadores. En la bibliografía se han descrito varios medios para proporcionar marcadores unidos a la secuencia. Véase, por ejemplo, Leary y col. Proc. Natl. Acad. Sci USA (1983) 80: 4045; Renz y Kurz, Nucl. Acids Res. (1984) 12:3435; Richardson y Gumport, Nucl. Acid. Res. (1983) 11: 6167; Smith y col. Nucl. Acids Res (1985) 13:2399; Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem. (1984) 138:267. Los marcadores estarán unidos covalentemente o no covalentemente a la secuencia complementaria. Los marcadores que pueden emplearse incluyen radionucleidos, substancias fluorescentes, sustancias quimioluminiscentes, tintes, enzimas, substratos de enzima, cofactores de enzima, inhibidores de enzima, subunidades de enzima, iones metálicos, y similares. Entre los marcadores específicos ilustrativos se incluyen fluoresceína, rodamina, rojo Texas, ficoeritrina, umbeliferona, luminol, NADPH, \alpha,\beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc. En un modo de realización preferido, la secuencia diana se marca por incorporación de biotina-UTP a una fracción de los nucleótidos naturales rUTP o dTTP, y luego se incuba con fosfatasa alcalina (AP) conjugada con estreptavidina.

Dependiendo de la naturaleza del marcador, se pueden emplear varias técnicas para detectar la presencia del marcador. Para sustancias fluorescentes, se dispone de un gran número de fluorómetros diferentes. Para sustancias quimioluminiscentes, se dispone de luminómetros o películas. Con las enzimas, se puede proporcionar un producto fluorescente, quimioluminiscente o coloreado y determinarse fluorométricamente, luminométricamente, espectrofotométrica o visualmente. En los ensayos objeto se pueden emplear los diversos marcadores que han sido empleados en inmunoensayos y técnicas aplicables a inmunoensayos.

Una vez realizados todos los ensayos de hibridación, con cada miembro de la colección de sondas, se determinan los miembros que indican el grado más alto de unión a la diana como las mejores sondas candidato. Alternativamente, el método se utiliza para identificar los hibridizantes más rápidos (utilizando períodos de incubación cortos y baja concentración de sondas) o hibridizantes más persistentes (por utilización de concentración baja de sondas, y condiciones de lavado crecientemente rigurosas.).

C. Determinación del tamaño de sonda de ensayo

Una vez que una sonda de ensayo ha sido identificada por los métodos anteriores para estar entre los mejores candidatos, se pueden realizar otros experimentos para determinar el tamaño ideal para la primera secuencia de nucleótido de la sonda complementaria de la secuencia de la diana. Se sintetiza, por métodos convencionales, una colección de sondas de ensayo secundarias, que tienen una secuencia complementaria a la misma región del ácido nucleico diana y un primer extremo idéntico al de la sonda de ensayo candidato, pero cada miembro de la colección de sonda de ensayo secundaria tiene un segundo extremo diferente, como se muestra en la figura 2. Según esto una colección de sondas de ensayo secundarias típica tiene una primera secuencia de nucleótidos que varía en tamaño de aproximadamente 6 a 50, más preferiblemente de aproximadamente 6 a 18 nucleótidos, que abarcan la región del ácido nucleico diana identificada por la sonda o sondas de ensayo mejor candidato. Las sondas de ensayo secundarias se analizan entonces para selección en cuanto al grado más alto de unión a la diana como antes.

Sondas discontinuas

El resultado de la confección de mapas de hibritopos como se ha descrito antes es la identificación de dos o más sondas candidato de secuencia y longitud ideales En otro aspecto de esta invención, se unen dos o más de las sondas candidato covalentemente ya sea directamente o a través de ligandos orgánicos de longitud y composición variable, y después se ensayan como antes para determinar las que tienen el grado más alto de unión a la diana.

Las sondas discontinuas se construyen como los hibritopos de sondas de ensayo anteriores, conteniendo opcionalmente una región que tiene una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia de reconocimiento de sonda adaptadora y/o una región espaciadora como se ha definido antes, y conteniendo también dos o más oligonucleótidos unidos covalentemente directamente o por un espaciador orgánico -Z-, donde -Z- se une al oligonucleótido a través de una fracción azúcar, base o fosfato, y se selecciona del grupo que consiste en arileno, aralquileno de C_{6}-C_{18}, aralquenileno de C_{6}-C_{18}, aralquinileno de C_{6}-C_{18}, alquileno de C_{1}-C_{30}, alquenileno de C_{1}-C_{30}, o alquinileno de C_{1}-C_{30}, que contienen 0 a 6 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, S, N, Si, Se y de 0 a 6 ligandos seleccionados del grupo que consiste en -CO-, -COO-, -CONH, -NHCO-, -S-S-, -SO2-, -CH(OH)-CH(OH)-, -CH(OR^{1})-CH(OR^{1})-, -O-PO(O-)-O-, -O-PO(R^{1})-, -O-PO(OR^{1})-O-, -O-PO(OR^{1})-R^{2}-, -PO(OR^{1})-O-R^{2} donde R^{1} es alquilo inferior y R^{2} es alquileno inferior, -O-((CH2)n-A-)m, y

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donde -A- es -O- o PO_{4}-, n es un entero de 2 a 4 y m es un entero de 1 a 20.

Los modos de realización preferidos de los ligandos orgánicos son "ligandos rígidos" que son ligandos cuyo grado de flexibilidad es limitado. Los ligandos rígidos son conocidos en la especialidad, e incluyen ligandos que contienen uno o más dobles o triples enlaces, o estructuras en anillo, que incluyen arileno sustituido o sin sustituir, aralquileno de C_{6}-C_{18}, aralquenileno de C_{6}-C_{18}, aralquinileno de C_{6}-C_{18}, alquenileno de C_{1}-C_{30}, o alquinileno de C_{1}-C_{30}.

Se construye entonces una colección de sondas discontinuas seleccionando diferentes combinaciones de las mejores sondas de ensayo candidato y longitudes y tipos de ligando variables. Por ejemplo, si la confección de mapas de hibritopos identifica cuatro oligonucleótidos de sonda de ensayo candidato A, B, C y D, entonces se pueden construir sondas de ensayo discontinuas dualmente ligadas como A-B, A-C, A-D, B-C, B-D y C-D. Se pueden construir también sondas de ensayo discontinuas tri-ligadas como A-B-C, A-C-B, B-A-C, A-B-D, A-D-B, etc., como se muestra en la figura 2. La identidad de los enlaces puede ser también variada. Las variaciones de enlaces consisten en series de monómeros unidos juntos en varias longitudes. Por ejemplo una serie de enlaces es trietilen glicol, hexaetilen glicol, nonaetilen glicol. Otra serie es

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En otro modo de realización de esta invención, se pueden formar sondas discontinuas por unión de tres o más secuencias de sonda de ensayo candidato una estructura ramificada, utilizando la tecnología de ADN ramificado como señala la patente U.S. No. 5.124.246 para Urdea y col. En las "sondas discontinuas ramificadas" formadas por esta tecnología, se unen dos secuencias de sonda de ensayo candidato por una molécula ligando orgánica que incluye un monómero de ramificación como se describe en la Patente 5.124.246, que permite la unión de una tercera secuencia de sonda de ensayo candidato. Un ejemplo de un monómero ramificado que tiene tres puntos de unión es

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La colección de sondas discontinuas construida se analiza entonces para selección como antes en cuanto a la unión más alta al ácido nucleico diana. La sonda discontinua con el grado de unión más alto se determina entonces como la mejor sonda candidato. Alternativamente, el método se utiliza para identificar los hibridantes más rápidos (empleando períodos de incubación cortos y concentraciones de sonda bajas) o los hibridantes más persistentes (utilizando una concentración baja de sondas y con condiciones de lavado crecientemente rigurosas).

Utilización de sondas discontinuas

Las sondas discontinuas se pueden utilizar como sondas de diagnóstico, como se describe, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos. 4.868.105 y 5.124.246 para Urdea y col.

Las sondas discontínuas se pueden formular también como sondas anti-sentido o ribozimas. Como sondas antisentido, las sondas discontinuas se pueden modificar. Las sondas discontinuas antisentido no comprenderán generalmente una región que tiene una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia de reconocimiento de sonda adaptadora o una región espaciadora como se ha descrito antes. Adicionalmente, el ácido nucleico antisentido de esta invención es ARN, ADN o un ácido nucleico modificado. Entre los ejemplos, sin limitación, de ácidos nucleicos modificados están los sulfurados resistentes a degradación y derivados de tiofosfato de ácidos nucleicos, y amidas de polinucleosido (Publicación de PCT No. WO91/16331 para Stec y col., Publicación de PCT No. WO 88/07544 para Zon y col; P.E. Nelsen y col. Science (1991) 254: 1497-1500; M. Egholm, JACS (1992) 114:1895-1897). Las modificaciones de diseño particularmente preferidas de los ácidos nucleicos anti-sentido de esta invención son modificaciones que son diseñadas para: (1) aumentar la estabilidad intracelular del ácido nucleico; (2) aumentar la permeabilidad celular del ácido nucleico; (3) aumentar la afinidad del ácido nucleico para la hebra de sentido, o (4) disminuir la toxicidad (si la hay) del ácido nucleico. Muchas de estas modificaciones son conocidas en la especialidad, como se describe en ANTISENSE RESEARCH AND APLICATIONS (S.,T. Crooke y B. Lebleu, eds. CRC Press, 1993). Según esto, los ácidos nucleicos pueden contener bases alteradas o modificadas, azúcares o ligandos, ser suministrados en sistemas especializados tales como liposomas, o pueden tener fracciones conectadas. Estas fracciones conectadas incluyen fracciones hidrófobas tales como lípidos que potencian la interacción con membranas celulares, o fracciones policatiónicas tales como polilisina que actúan como neutralizadores de cargas del esqueleto de fosfato. Los lípidos particularmente preferidos que pueden conectarse son colesteroles. Las fracciones se pueden unir a los terminales 3' o 5' de los ácidos nucleicos y también se pueden unir a través de un ligando base, azúcar o internucleosido.

Otras fracciones pueden ser grupos de rematado colocados específicamente en los terminales 3' o 5' de los ácidos nucleicos para evitar la degradación de exonucleasa. Estos grupos de rematado incluyen, sin que quede limitado a ellos, grupos protectores de hidroxilo conocidos en la técnica, que incluyen glicoles tales como polietilen glicoles, tetraetilen glicol y similares.

Administración

Los compuestos anti-sentido o ribozimas de la invención se pueden administrar por una diversidad de métodos, tales como por vía intravenosa, oral, intramuscular, intraperitoneal, bronquial, intranasal, etc. La vía de administración preferida dependerá de la naturaleza del compuesto y del estado que debe ser tratado. Los compuestos se pueden administrar oralmente si son bien absorbidos y no se degradan sustancialmente al ser ingeridos. Los compuestos se pueden administrar como composiciones farmacéuticas en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden consistir en soluciones acuosas, emulsiones, cremas, pomadas, suspensiones, geles, suspensiones liposómicas, y similares. Según esto, los excipientes adecuados incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y soluciones de etanol, glucosa, sacarosa, dextrano, manosa, manita, sorbita, polietilen glicol (PEG), fosfato, acetato, gelatina colágeno, Carbopol^{R}, aceites vegetales y similares. Se pueden incluir además adecuados conservantes, estabilizantes, antioxidantes, antimicrobianos, y agentes tampón, por ejemplo BHA, BHT, ácido cítrico, ácido ascórbico, tetraciclina y similares. Las bases de cremas o pomadas útiles en la formulación incluyen lanolina, Silvadene® (Marion), Aquaphor® (Duke Laboratories), y similares. Otras formulaciones para uso tópico incluyen aerosoles, vendajes, apósitos de liberación sostenida y similares. Alternativamente, se puede incorporar o encapsular el compuesto en una matriz polímera adecuada o membrana, para proporcionar así un dispositivo de liberación sostenida adecuado para su implantación cercana al lugar que ha de tratarse localmente. Otros dispositivos incluyen catéteres introducidos y dispositivos tales como la minibomba Alzet^{R}. Además, se puede proporcionar el compuesto en forma sólida, especialmente como polvo liofilizado. Las formulaciones liofilizadas contienen típicamente agentes estabilizantes y de volumen, por ejemplo albúmina de suero humano, sacarosa, manita y similares. En Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.) se hace una discusión a fondo de los excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones anti-sentido de la presente invención se pueden preparar para administración farmacéutica. Las preparaciones inyectables y supositorios pueden contener normalmente 1-10 mg del ácido nucleico o análogo de ácido nucleico por ampolla o cápsula. Para pacientes humanos, la dosis diaria es de aproximadamente 0,1-1,000 mg, preferiblemente 1-100 mg (de 10-20 mg/kg a 1000-2000 mg/kg de peso corporal). Sin embargo, la dosis particular para cada paciente depende de una amplia gama de factores, por ejemplo de la eficacia del ácido nucleico particular o del análogo de ácido nucleico utilizado, de la edad, peso, estado general de la salud, sexo, dieta, tiempo y modo de administración, velocidad de eliminación, combinación con otros medicamentos utilizados conjuntamente y gravedad de las enfermedades particulares a las que se aplica la terapia.

Las preparaciones farmacéuticas, dentro del marco de la presente invención, incluyen preparaciones donde los ingredientes activos de las mismas están contenidos en una cantidad eficaz para alcanzar el propósito buscado. Un intervalo preferido es el antes señalado, y la determinación de las cantidades más eficaces para tratamiento entra dentro del conocimiento del especialista.

Además del ácido nucleico y sus análogos sulfurados y fosforotioatados de la presente invención, las preparaciones farmacéuticas pueden contener excipientes y auxiliares adecuados que facilitan el procesado de los compuestos activos. Las preparaciones, en particular aquellas que pueden administrarse por vía oral y que pueden emplearse para el tipo de administración preferido, tales como tabletas, grageas y cápsulas, y preparaciones que pueden administrarse por vía rectal, tales como supositorios, así como soluciones adecuadas para administración parenteral u oral, y composiciones que pueden administrarse bucal o sublingualmente, pueden contener de 0,1 a 99% en peso de ingredientes activos, junto con un excipiente. Un método preferido de administración es el parenteral, especialmente administración intravenosa.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua o dispersable en agua. Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones oleosas inyectables apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones acuosas inyectables pueden contener substancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, por ejemplo, carboximetil celulosa de sodio, sorbita y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes.

Adicionalmente, los compuestos de la presente invención pueden administrarse encapsulados en liposomas, composiciones farmacéuticas donde el ingrediente activo está contenido en forma dispersa o en otra forma de corpúsculos consistente en capas acuosas concéntricas adherentes a capas lipídicas. El ingrediente activo, dependiendo de su solubilidad, puede estar presente tanto en la capa acuosa como en la capa lipídica, o en la forma conocida generalmente como suspensión liposómica. La capa hidrófoba, generalmente pero no exclusivamente, comprende fosfolípidos tales como lecitina y esfingomielina, esteroides tales como colesterol, agentes tensioactivos más o menos iónicos, tales como fosfato de dicetilo, estearilamina, o ácido fosfatídico, y/u otros materiales de naturaleza hidrófoba. Los diámetros de los liposomas varían generalmente entre aproximadamente 15 nm y 5 micras. Los lípidos preferidos en particular para la preparación de liposomas y/o suspensiones de lípidos son DOTMA y DOTAP.

DOTAP es un producto comercial de Boehringer Mannheim, o puede prepararse siguiendo los métodos descritos por L. Stamatatos y col., Biochem. 27:3917-25 (1988); H. Eibl y col., Biophys Chem 10:261-71 (1979). DOTMA es un producto comercial que se vende bajo el nombre de Lipofectin* (de BRL, Gaithersburg, MD), y está descrito por P.L. Felgner y col. Proc. Nat. Acad. Sci USA 84:7413-17 (1987).

La presente invención se ilustra a continuación con referencia a los ejemplos siguientes que indican modos de realización particularmente ventajosos. Sin embargo, hay que señalar que estos modos de realización son solo ilustrativos y no han de considerarse de ningún modo como limitativos de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de hibritopos

Se generó una colección de sondas hibritopos correspondientes a una región de 113 nucleótidos en el elemento de respuesta Rev (RRE) del aislato sf2 del genoma de virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Esta región incluye los nucleótidos 7769-7881 de sf2 del genoma de VIH, y tiene la secuencia (nt 7769) 5'-ATA GTA GGA GCT ATG TTC CTT GGG TTC TTG GGA GCA GCA GGA AGC ACT ATG GGC GCA GTG TCA TTG ACG CTG ACG GTA CAG GCC AGA CAA TTA TTG TCT GGT ATA GTG CAA CA-3' (nt 7881). La colección comprende 96 sondas de desoxiribonuclétido, siendo cada sonda un 28-mero. La porción 5' de cada sonda de la colección era idéntica y consistía en un 10-mero con la secuencia 5'-CCG ACG GAC C-3'. Esta secuencia rica en GC se hibrida con una sonda adaptadora que se utiliza en unión a un soporte sólido. La porción 3' del 18-mero de cada sonda se hibrida con una porción de RRE del VIH, solapando cada porción la secuencia de otra sonda de la colección en un nucleótido. La sonda 1, por ejemplo, tiene una porción 3' que se hibrida a nucleótidos 7769- 7786, la sonda 2 tiene una porción 3' que se hibrida con nucleótidos 770-7787, etc., a través de la sonda 96, que tiene una porción 3' que se hibrida con los núcleótidos 7864-7881. La colección de sondas se sintetiza por química de fosforoamiditas convencional por Genosys Biotechnologies, Inc. (The Woodlands, TX).

Ejemplo 2 Confección de mapas de hibritopos de la región RRE de VIH A. Síntesis de sondas

Se sintetizó una colección de sondas de hibritopos correspondiente a una región de 113 nucleótidos de la región RRE de VIH, como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se sintetizaron también, utilizando los métodos convencionales, sondas adaptadoras que tenían la secuencia 5'-G GTC CGT CGG-(N)_{54}-CT CTT GGA AAG AAA GT-3'. El extremo 5' de la sonda adaptadora se hibrida con las sondas de hibritopos, el extremo 3' se hibrida con una sonda de captura unida a un soporte sólido, y en el centro hay una región espaciadora de 54 bases al azar. Se sintetizó la sonda de captura que tenía la secuencia 5'-CA CTT CAC TTT CTT TCC AAG AG-3' y se unió a pocillos de placa de microvaloración en el extremo 3'.

B. Marcado de la diana

El plasmidio de ADN pBKBH10S contiene una copia de 9,2 kb del genoma de la cepa HXB2 de VIH que carece de la región LTR. Se cortó pBKBH10S con Sac I, y se hicieron transcriptos de ARN de longitud completa del genoma utilizando T7 ARN polimerasa y los 4 rNTPs que incorporan 1 UTP biotinilado para cada 30 UTPs, con un rendimiento de aproximadamente 75 UTPs biotinilados para trascriptos de longitud completa. Los nucleótidos biotinilados son capaces de formar un conjugado con fosfatasa alcalina unida a estreptavidina.

C. Procedimiento de confección de mapas

Se utilizó la colección de 96 sondas hibritopos del ejemplo 1 para confección de mapas de la región RRE de VIH, utilizando diana marcada como la preparada en el ejemplo 2-B, y placa de microvaloración de 96 pocillos recubiertos con sondas de captura como las preparadas en el ejemplo 2-A unidas a cada pocillo. Se equilibraron por separado la diana (10 femtomoles), 500 femtomoles de cada una de las sondas de ensayo, y 1 picomol de sonda adaptadora en tampón de hibridación (NaCl 0,1 M, KOAc 0,05 M, MgCl_{2} 16 mM, espermidina 1 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,5, BSA acetilada al 0,2%) a 37ºC durante 1 hora. Se mezclaron la diana y las sondas y se dejaron equilibrar durante una hora adicional.

Se lavaron los pocillos tres veces con lavado P (0,5 x SSC, 0,1% de SDS). Se añadió fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina (BMB, dilución 1:10.000) y se incubó durante 5 minutos a 37ºC. Se hicieron tres lavados más con lavado P seguido de tres lavados de 0,5xSSC.

Se añadió entonces Lumiphos-plus™ (Lumigen, Southfield, MI) a los pocillos secos, a 50 \mul/pocillo, se incubó a 37ºC durante 30 minutos y se hizo el conteo con luz luminiscente. Los resultados de este ensayo sobre la colección de 96 sondas se muestran en la Figura 3. Se seleccionaron 4 hibritopos, marcados B6, C6, D7 y F8 como los mejores 18-meros de unión. Las regiones RRE VIH complementarias de estas sondas tienen el extremo 5' 7787, 7798, 7811 y 7837, respectivamente.

Ejemplo 3 Optimización del tamaño del hibritopo A. Análisis de hibridación

Tres de los hibritopos seleccionados del Ejemplo 2, B6 (7787), C6 (7798) y D7 (7811) se analizaron para selección en cuanto optimización de tamaños (los números entre paréntesis indican extremo 5' de región RRE de VIH complementaria). Para cada hibritopo seleccionado (primario), se sintetizó un juego de hibritopos secundarios. Cada hibritopo secundario contenía la misma región 5' rica en GC que el hibritopo primario descrito en el Ejemplo 1, y contenía una región 3' de hibridación a la misma región de la RRE de VIH que el hibritopo primario, comenzando por el mismo extremo 5', pero variando en una longitud de 6-23 nucleótidos. Estas colecciones de hibritopos secundarios se analizaron para selección frente a la diana RRE de VIH como se describe en el Ejemplo 2, pero haciendo análisis de selección paralelos a 37ºC y a 53ºC. Los resultados se muestran en la figura 4. En las condiciones fisiológicas, se ve que las longitudes de hibritopo óptimas son alrededor de 12 nucleótidos, mientras que la longitud óptima a 53ºC es de alrededor de 20 nucleótidos. A temperaturas fisiológicas tiene lugar una unión detectable significativa de hibritopos de 10 nucleótidos o menos, lo que indica una fuente potencialmente significativa de hibridación no-específica si se utilizan tales longitudes. Por esta razón, el análisis de RNAsa H se llevó a cabo sobre hibritopos secundarios más cortos.

B. Análisis de ARNsa H

Se hizo un minitranscripto de ARN RRE VIH 205-mero a partir de pBKBH10S utilizando el sistema Promega Riboprobe II Core System, incorporando ^{32}P-GTP a una actividad específica de 8 x 10^{6} cpm/p moles. El minitranscripto se pasó a una columna Nensorb y se eluyó con etanol al 50%, precipitó, se volvió a suspender en agua y se almacenó congelado.

Cada reacción de RNasa H contenía 105 cpm de minitranscripto, preincubado a 37ºC durante una hora en
20 \mul de tampón que contenía Tris 50 mM pH 7,5, MgCl_{2} 16 mM, espermidina 1 mM, KOAc 50 mM, NaCl 0,1 M y una unidad de inhibitasa (inhibidor de nucleasa). Los hibritopos secundarios individuales se añadieron a 0,5 \muM y se incubaron a 37ºC durante una hora. Se añadieron 10 unidades de RNasa H a cada reacción y se incubaron durante 30 minutos. Se añadieron 5 \mul de tampón de terminación (5% de SDS, 250 ng/\mul de proteinasa K, EDTA 75 mM) a cada reacción y se incubó a 65ºC durante 15 minutos. Se calculó la eficacia de la escisión por exploración de Ambis del producto que se desliza sobre un gel de poliacrilamida desnaturalizada al 5%. Los resultados, mostrados en la figura 5, demuestran que hay una hibridación significativa de 6- y 8-meros a 37ºC, pero una selección óptima de sondas permitirá concentraciones de sonda más bajas.

Ejemplo 4 Sondas discontinuas

Se utilizaron varios de los hibritopos secundarios analizados en el Ejemplo 3 como la base para diseñar una sonda discontinua como se esquematiza en la Figura 6. Se estudió una región de 37-meros de la RRE de VIH utilizando hibritopos secundarios de longitudes variables correspondientes a B6, C6 y D7, unidos de forma continua o con un espaciador

-O-(CH_{2}CH_{2}-O-CH_{2}CH_{2}-O-CH_{2}CH_{2}-O-)_{2}

("espaciador Z-Z") donde hay nucleótidos no dirigidos intervinientes como se indica en el diagrama de la Figura 7. Por ejemplo, la sonda #1 de la figura 7 es una sonda continua que se hibrida con nucleótidos 1-25 de la diana mostrada en la Figura 6. La sonda #8 es una sonda discontinua que contiene tres oligonucleótidos que corresponden a nucleótidos 1-7, 14-23 y 26-34, cada segmento unido por un espaciador Z-Z. Las sondas discontinuas incluyen también la región rica en 5'GC descrita en el Ejemplo 1 A. Los resultados del uso de sondas discontinuas en el ensayo del Ejemplo 2 se muestran en la Figura 8. Los resultados indican que las sondas continuas sin espaciadores tenían un comportamiento pobre, mientras que las sondas discontinuas con un espaciado de 4-6 nucleótidos entre regiones de hibridación mostraban mayores eficacias de hibridación más altas que las sondas continuas con el mismo número de nucleótidos.

Ejemplo 5 Utilización de confección de mapas para encontrar compuestos de plomo con actividad anti-VIH A. Ensayo de transfección transitoria

Se cultivaron en placa células HeLa en placas de seis pocillos. Los sobrenadantes de cultivo se separaron al día siguiente, y se les añadió medio que contenía 0,2, 0,4, 0,6 o 1 mM de los oligómeros de fosforotioato (16-meros) descrito en la sección 5-B dada a continuación a pocillos duplicados. Se añadió entonces ADN proviral de VIH-1 (y vehículo) precipitado con fosfato de calcio a cada uno de los pocillos. Al día siguiente, se lavaron las células y se añadió medio fresco que contenía el oligómero apropiado. Se recogió el medio de cultivo tres días después de iniciación de la transfección, y se determinaron los niveles de p24 de VIH-1. Los niveles de p24 de VIH-1 se compararon con los de cultivos que no habían recibido oligómero, así como los que recibieron una preparación de oligómeros completamente al azar de longitud similar, (N)_{17}. Un oligonucleótido se consideraba un inhibidor en este ensayo si reducía el nivel de p24 al menos dos veces más que el control oligonucleótido al azar.

B. Ensayo de eficacia anti-sentido de sondas seleccionadas desde mapas de hibritopos

Se sintetizaron un total de once sondas para la RRE de VIH descrita en el Ejemplo 1 como oligonucleótidos fosforotioatados 16-meros. Dado que la posición del extremo 5' de la sonda es lo más crucial para hibridación eficaz, se suprimieron desde el extremo 3' dos nucleótidos de las sondas de 16-meros utilizadas en el análisis de selección descrito antes. Esta modificación ayuda a reducir efectos no específicos. Cada sonda candidato se incubó con células HeLa a concentraciones entre 0,2 y 1\muM y las células se transfectaron con ADN de VIH-1. Tres días más tarde, después de una incubación continua con sonda, se determinaron niveles de p24.

La Tabla 1 dada a continuación muestra los resultados. Un oligonucleótido se consideraba un inhibidor en el ensayo biológico de p24 si reducía el nivel de p24 al menos dos veces más que el control de oligonucleótido al azar; se consideraba un hibridante eficaz en el ensayo de confección de mapas si generaba al menos el doble de unidades RLU (unidades ligeras relativas) de la sonda media.

TABLA 1

Sonda de fosforotioato	Número	Unión:	Unión:	Inhibición de
Anti-RRE		Transcripto	ARN viral	plegado
Sondas eficaces:
GCGCCCATAGTGCTTC	7807	0,4	4,2	9,1;19,0
CGCCCATAGTGCTTCC	7806	0,5	1,9	4,2;19,0
CACTGCGCCCATAGTG	7811	2,0	0,4	3,1;5,4
AATTGTCTGGCCTGTA	7843	0,6	2,5	2,7
Sondas ineficaces
GTCAATGACACTGCGC	7819	0,6	3,5	1,1
AGCGTCAATGACACTG	7822	0,4	0,1	0,7
GACAATAATTGTCTGG	7849	0,6	22	0,4;0,8
AAGAACCCAAGGAACA	7780	0,5	1,9	0,5
GCTCCCAAGAACCCAA	7786	2,4	0,4	0,5
CAAGAACCCAAGGAAC	7781	0,2	0,5	0,3
AGACAATAATTGTCTG	7850	0,4	2,4	0,1

El "Número" en la Tabla 1 anterior es la posición 5' sobre la diana SF2 de VIH a la que se une el extremo 3' de la sonda progenitora de 18-mero. La unión a ambos, el transcripto y el ARN viral se expresa como RLU unidas con el oligo ensayo/RLU unidas con el oligo medio. Ambos se determinaron con sondas de ADN de 18-meros. La inhibición de plegado (I) se calculó como: I = oligo al azar p24/oligo de ensayo p24, utilizando sonda 1 \muM.

Cuatro sondas mostraron alguna efectividad biológica (7806, 7807, 7811, y 7843). Dos sondas no se hibridaron ni al transcripto ni al ARN viral (7881, 7822) y eran ineficaces biológicamente. Dos sondas se hibridaron eficazmente al transcripto (7786, 7811) y una de ellas (7811) era eficaz biológicamente. Las otras siete sondas se hibridaron eficazmente a ARN viral (dejando que 1.9\sim2,0) y tres de estas eran biológicamente eficaces. Por análisis de selección las sondas "ganadoras" en el ensayo de hibridación ya fuera al transcripto o al virus, los cuatro ganadores biológicos pudieron detectarse con justo nueve sondas ensayadas.

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La "tasa de aciertos" exacta de sondas frente a VIH no se conoce (se necesitarían cientos de sondas ensayadas para conocer este número), pero es muy improbable que sea distinta a próxima a 4/9. Un especialista en la técnica se dará cuenta que el empleo de complejos de ribonucleoproteína aislada de células (en vez de ARN viral desproteinizado o transcriptos in vitro) proporcionarían un Mapa de Hibritopos más preciso de los lugares accesibles con tasas de aciertos incluso más altas.

Claims (12)

1. Un método de selección de uno o más oligonucleótidos que presentan la propiedad de unión deseada desde una pluralidad de oligonucleótidos por unión a una secuencia de nucleótido conocida de un ácido nucleico diana, método que comprende las etapas de:

(a) obtención de una pluralidad de oligonucleótidos, comprendiendo cada uno de los oligonucleótidos una primera secuencia de nucleótido complementaria a una porción del ácido nucleico diana que se solapa con la primera secuencia de nucleótido de otro oligonucleótido de la pluralidad de oligonucleótidos por compartir una secuencia parcial común que tiene un punto de partida, respecto a la secuencia de la que derivan, uno a cuatro nucleotidos aparte.

(b) contacto de cada uno de los oligonucleótidos con el ácido nucleico diana en condiciones que permiten hibridación específica de oligonucleótidos a la diana y

(c) ensayo en cuanto a la presencia o ausencia de unión específica oliginucleótido diana entre cada uno de los oligonucleótidos y el ácido nucleico diana que indica si cada oligonucleótido se une con la secuencia de nucleótido conocido, seleccionando con ello uno o más oligonucleótidos de unión que presentan la deseada propiedad de unión.

2. El método según la reivindicación 1 donde la primera secuencia de cada uno de los oligonucleótidos de la pluralidad de oligonucleótidos se solapa con la primera secuencia de otro oligonucleótido de la pluralidad de oligonucleótidos por compartir una secuencia parcial común que tiene un punto de partida, respecto a la secuencia de la que derivan, separado por un nucleótido.

3. El método según la reivindicación 1 donde cada oligonucleótido de la pluralidad de oligonucleótidos comprende además una región que tiene una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia de reconocimiento de sonda adaptadora complementaria de una secuencia de reconocimiento de sonda de ensayo en una sonda adaptadora, y otra etapa (b) que comprende las etapas de:

(b_{1}) proporcionar: (i) un oligonucleótido de sonda de captura unido a un soporte sólido, teniendo la sonda de captura una secuencia de ácido nucleico complementaria de una secuencia de reconocimiento de sonda de captura; (ii) un oligonucleótido de sonda adaptadora que comprende una región que tiene la secuencia de reconocimiento de sonda de captura, una región espaciadora variable de 0 a 50 nucleótidos; y una región que tiene una secuencia de reconocimiento de la sonda de ensayo;

(b_{2}) combinación, en un medio líquido bajo condiciones de unión, de pares complementarios, cada oligonucleótido con el ácido nucleico diana, sonda de captura y sonda adaptadora para formar complejos soporte-sonda unida-diana; y

(b_{3}) lavado del soporte sólido para formar complejos soporte-sonda unida- diana substancialmente libres de diana sin unir.

4. El método según la reivindicación 3 donde en la etapa (c), se determina la presencia o ausencia de unión específica oligonucleótido-diana por etapas que comprenden:

(c_{1}) marcado del ácido nucleico diana; y

(c_{2}) detección de la presencia de complejos soporte-sonda unida-diana por detección de la presencia de marcador en el complejo, detectando así la unión específica oligonucleótido-diana.

5. El método según la reivindicación 4 donde en la etapa (c_{1}) la diana se marca por incorporación de biotina-UTP, y el marcador es detectado en la etapa (c_{2}) por las etapas que comprenden:

(c_{2a}) incubación de los complejos soporte-sonda unida-diana con fosfatasa alcalina (AP) unida covalentemente a avidina o estreptavidina para formar complejos soporte-diana unida-AP;

(c_{2b}) eliminación por lavado de AP: y

(c_{2c}) incubación de los complejos soporte-diana unida-AP con un substrato de AP y seguimiento de la conversión del substrato.

6. Un método de selección de una sonda discontinua que se une a una secuencia de nucleótido conocida en un ácido nucleico diana, comprendiendo la sonda discontinua (i) al menos dos oligonucleótidos de unión que son complementarios a una región distinta del ácido nucleico diana, unido covalentemente, opcionalmente por (ii) una molécula ligando orgánica, método que comprende las etapas de:

(a) selección de al menos un primero y segundo oligonucleótidos de unión que son complementarios con las regiones primera y segunda del ácido nucleico diana, uniéndose los oligonucleótidos primero y segundo más fuertemente al ácido nucleico diana que otros oligonucleótidos que son complementarios de otras regiones del ácido nucleico diana, y donde las regiones primera y segunda no son contiguas;

(b) unión covalente a al menos los oligonucleótidos de unión primero y segundo seleccionados de la etapa (a) en al menos combinación de dos, opcionalmente con moléculas ligando orgánicas para obtener un juego de sondas discontinuas candidato;

(c) contacto de cada sonda discontinua candidato con el ácido nucleico diana bajo condiciones que permiten hibridación específica de oligonucleótidos con la diana; y

(d) ensayo en cuanto a la presencia o ausencia de unión específica sonda discontinua-diana entre cada una de las sondas discontinuas y el ácido nucleico diana para determinar si cada sonda discontinua se une al ácido nucleico diana, seleccionando con ello una o más sondas discontínuas;

donde la etapa (a) comprende las etapas de:

(a_{1}) obtención de una pluralidad de oligonucleótidos, comprendiendo cada uno de los oligonucleótidos una primera secuencia de nucleótido complementaria de una porción del ácido nucleico diana que se solapa con la primera secuencia de nucleótido de otro oligonucleótido de la pluralidad de oligonucleótidos por compartir una secuencia parcial común que tiene un punto de partida, respecto a la secuencia de la que derivan, uno a cuatro nucleótidos aparte;

(a_{2}) contacto de cada uno de los oligonucleótidos con el ácido nucleico diana bajo condiciones que permiten hibridación específica de oligonucleótidos con la diana;

(a_{3}) ensayo en cuanto a presencia o ausencia de unión específica oligonucleótido-diana entre cada uno de los oligonucleótidos y el ácido nucleico para indicar si cada oligonucleótido se une con la secuencia de nucleótido
conocida; y

(a_{4}) selección de al menos dos oligonucleótidos de unión que son los que se unen más fuertemente al ácido
nucleico diana.

7. El método según la reivindicación 6, donde la etapa (a) comprende además, después de la etapa (a_{4}), las
etapas de:

(a_{5}) para cada uno de los oligonucleótidos de unión primero y segundo seleccionados en la etapa (a_{4}), obtención de una pluralidad de oligonucleótidos secundarios, teniendo cada oligonucleótido secundario un extremo 5' de su primera secuencia idéntico al de la primera secuencia de oligonucleótido seleccionado y teniendo una secuencia complementaria para la misma región de ácido nucleico diana, donde la longitud de la primera secuencia para cada nucleótido secundario que es complementaria al ácido nucleico diana es diferente de la longitud de la primera secuencia para los otros nucleótidos de la pluralidad de nucleótidos secundarios;

(a_{6}) contacto de cada uno de los oligonucleótidos secundarios con el ácido nucleico diana bajo condiciones que permiten la hibridación específica de oligonucleótidos secundarios con la diana;

(a_{7}) ensayo en cuanto a la presencia o ausencia de unión específica oligonucleótido secundario-diana entre cada uno de los oligonucleótidos secundarios y el ácido nucleico diana para indicar si cada oligonucleótido secundario se une con la secuencia de nucleótido conocida; y

(a_{8}) para cada uno de los oligonucleótidos de unión primero y segundo, seleccionar el oligonucleótido secundario que se une el que más fuertemente al ácido nucleico diana.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, donde las fracciones de ligando orgánico se seleccionan del grupo que consiste en arileno, aralquileno de C_{6}-C_{18}, aralquenileno de C_{6}-C_{18}, aralquinileno de C_{6}-C_{18}, alquileno de C_{1}-C_{30}, alquenileno de C_{1}-C_{30}, o alquinileno de C_{1}-C_{30}, que contienen 0 a 6 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, S, N, Si, Se y 0 a 6 ligandos del grupo que consiste en -CO-, -COO-, -CONH,
-NHCO-, -NHCO-, -S-S-, -SO_{2}-, -CH(OH)-CH(OH)-, -CH(OR^{1})-CH(OR^{1})-, -O-PO(O^{-})-O-, -O-PO(R^{1})-, -O-PO(OR^{1})-O-, -O-PO(OR^{1})-R^{2}-, -PO(OR^{1})-O-R^{2} donde R^{1} es alquilo inferior y R^{2} es alquileno inferior, -O-((CH_{2})_{n}-A-)_{m} y donde -A- es -O- o PO_{4}-, n es un entero de 2 a 4 y m es un entero de 1 a 20.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el oligonucleótido se selecciona como una sonda anti-sentido.

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 donde la sonda discontinua se selecciona como sonda anti-sentido.

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el oligonucleótido se selecciona como una sonda de ribozima.

12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 donde la sonda discontinua se selecciona como sonda de ribozima.