JPH10510146A

JPH10510146A - 改変されたプロテイナーゼインヒビター

Info

Publication number: JPH10510146A
Application number: JP8516669A
Authority: JP
Inventors: ジョンアトキンソン，ホワード; ジョンマックファーソン，マイケル; エドワードアーウィン，ピーター
Original assignee: University of Leeds
Current assignee: University of Leeds
Priority date: 1994-11-21
Filing date: 1995-11-20
Publication date: 1998-10-06
Also published as: EP1231274A3; US6680424B2; US20030221209A1; EP1231274A2; RU2182598C2; AU715747B2; US20040172687A1; WO1996016173A3; WO1996016173A2; EP0793722A2; CA2205356A1; AU3877095A

Abstract

(57)【要約】本発明は、プロテイナーゼインヒビターに関する。詳細には、その効果を高めるために改変されたシスタチンまたは合成的に製造された対応物に関する。この改変は、タンパク質構造における部位特異的変異、および／またはハイブリッド分子の生産のいずれかを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】改変されたプロテイナーゼインヒビター本発明は、プロテイナーゼインヒビター、詳細には新規のプロテイナーゼインヒビター、このようなインヒビターを生産する方法、およびこのようなインヒビターを含む生産物およびプロセッサーに関する。プロテイナーゼはタンパク質を分解する酵素である。その基質特異性は、非常に様々であり、従って分類の目的のための基礎を形成しない。むしろ、一般的には、これらの酵素は、それぞれが担う触媒反応の性質に従って分類される。従って、プロテイナーゼは、セリンプロテイナーゼ、システインプロテイナーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ、およびメタロプロテイナーゼと呼ばれる４つのグループに分けられる。セリンプロテイナーゼおよびシステインプロテイナーゼは、両方とも、広範かつ多様であり、そして原核生物および真核生物（植物および動物を含む）の両方において見出される。対照的に、アスパラギン酸プロテイナーゼは、真核生物にのみ見出されるようである。これらの酵素はタンパク質の分解に使用されるので、この酵素の起源および/または所在は、それらが所定の生物に対して有益であるかまたは有害であるかどうかを決定する。例えば、これらの酵素が病原体または寄生体または害虫により使用される場合、それらは典型的には宿主細胞組織の分解に使用され、従って有害である。細菌、真菌、植物、昆虫、線虫等のような病原体、寄生体または害虫は、宿主に有害な、宿主細胞組織を分解するプロテイナーゼを産生する。例えば、真菌による１年間の世界の穀物の損失は10億ポンドを越える。病原体 Botrytis cinereaは、主に経済的に重要である。なぜなら、これは30の農作物植物種で病気を引き起こし、温室における深刻な損失、ブドウ栽培における深刻な損失、ならびに果実および野菜の収穫後の病気の結果としての深刻な損失を招くからである。この主要な病原体は、殺菌剤を用いて克服され得るが、不運にも、それを制御するための殺菌剤の使用に関連した不利が存在する。これらには、殺菌剤の使用に関連した財政上の負担、消費者の不安を伴う、毒性の殺菌剤の使用から生じる潜在的な環境的危険、および殺菌剤に対する病原体耐性の主要な問題が挙げられる。さらに、大量の殺菌剤は、病原性真菌の限られた範囲のみに対して効果的である。上記の不利はまた、例えば以下のような他の病原体、寄生体、または害虫に対して製造される合成試薬の使用にも共通である：昆虫または特定の昆虫、細菌または特定の細菌、および他の真核生物。真核生物は以下のものを含むが、これらに限定されない：原生動物（例えば、アメーバ類、腸寄生性鞭毛虫類および繊毛虫類）、住血鞭毛原生虫（例えば、リーシュマニアまたはトリパノソーマ）、胞子虫類（例えば、マラリアの原因となる胞子虫類）、節足生物(arthropod-borne organism)；繻虫(例えば、吸虫類(trematodes)または吸虫類(flukes))、オビクラゲ、鉤頭動物、線虫、イヌベンチュウ、センモウチュウ、鉤虫、フィラリア、旋尾線虫;節足動物(例えば、ダニ(acarina)またはダニ(mites)、真ダニ、カメムシ類、シラミ、ノミ(flee))、双翅類(例えば、カ、ウジ、および蝿幼虫症(myias is)を含む、病気を運搬するハエ)。プロテイナーゼの阻害が、病原体感染後、自然に起こることは公知である。例えば、Phytophthora infestansによる感染の後、真菌に抵抗し得る種々のトマトにより、プロテイナーゼインヒビターのレベルの増加を示すことが示されてきた (1)。抵抗性とプロテイナーゼインヒビター産生能との間の関係は、病原体、害虫、および寄生病の制御における良好な効果のために使用されている。例えば、出願人に公知の最も関連した先行技術において、プロテイナーゼインヒビター、動物由来の卵白シスタチンを、選択された単子葉植物（例えば、穀物、飼草(for age)、または牧草(turf grass)）、あるいは双子葉植物（例えば、野菜、管(tub e)または糖作物）に組換えで導入することにより、植物害虫が制御される(EP 03 48 348)。同様に、植物の線虫害虫は、タバコ、トマト、ワタ、脂肪種子のセイヨウアブラナ、野菜作物、または観賞植物に組換えで導入されたプロテイナーゼインヒビターである植物由来のササゲトリプシンインヒビターを使用して制御された(EP 0 502 730)。さらに、プロテイナーゼインヒビターは、薬剤または食物のいずれかで、宿主種へ理想的に投与され得る抗寄生体タンパク質として使用され得る(英国特許出願第94 03819.7号)。従って、プロテイナーゼの効果を中和するためにプロテイナーゼインヒビターを使用し、そしてその結果、病原体、寄生体、または害虫の効果と戦うことは公知である。特に、特定のプロテイナーゼインヒビター（例えばシステインプロテイナーゼインンヒビター）を提供する植物をトランスジェニック的に生成することは公知である。しかし、本発明の目的は、その非改変型の等価物または天然のプロテイナーゼインヒビターの効力より高い効力を有する改変されたプロテイナーゼインヒビターを提供すること；あるいはまた、１つの実施態様においてハイブリッドプロテイナーゼインヒビターを提供するために、プロテイナーゼインヒビターを合成的に製造することおよび改変することである。本発明者らの発明の１つの局面において、本発明者らは、シスタチンとして公知のプロテイナーゼインヒビターの群に焦点を当てた。約25個のシスタチンのタンパク質配列が公知である。構造類似性の同定に対する基準を提供するために、これらの配列のアラインメント研究に着手することが可能である。植物シスタチンと動物シスタチンとの間には、その２つを正当に分類する十分な差異が存在することが示された。実際に、植物シスタチンのオリザシスタチンＩ Oc-I［図３に示したDNA配列構造］、および動物シスタチンの卵白シスタチンとの比較により、全体のアミノ酸保存は高くないことを示す有意な数の差異が明らかにされる。さらに、動物シスタチンおよび植物シスタチンの結合特性には、有意な差異が存在する。従って、解離定数Kiは、例えば、卵白シスタチンでは５×10^-12ＭのK iであるが、植物シスタチンOc-I(イネ由来)では３×10^-8のKiであるというように変化する。多くのシスタチンのアラインメントデータを図１に示す。アミノ酸を１〜181 まで番号をつける。モチーフQVVAG（またはQLVAG）によって示される保存された阻害部位が、アラインメントアミノ酸100〜104に存在することが見られ得る。さらに、アラインメントアミノ酸160〜161において、保存されたPWモチーフが存在することが見られ得る。この保存は、公知の配列構造の約2/3で生じ、そして構造的研究から、タンパク質の機能すなわちプロテイナーゼの阻害に関わっていると考えられる。しかし、低いKi値を持ついくつかのシスタチンは、このPWモチーフを有さず、従って、シスタチン機能における重要性は明らかではない。他の研究により、組換えで新規のシスタチンが製造された。例えば、プロホルモンのタンパク質分解的な変換において、コラーゲンの細胞外分解において、および悪性細胞を有する正常組織の浸透において、タンパク質およびペプチドの細胞内代謝に関与するヒトシステインプロテイナーゼインヒビターのシスタチンＣが改変された。研究者らは、シスタチンＣを、配列構造中の合計120のアミノ酸は保持しつつ、５〜17位、55〜59位および/または68位の１つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸により置換し、改変した。一定の活性を有すると考えられる動物由来シスタチンＣを提供するために、改変が試みられた。(WO 88/09384)。驚くべきことに、本発明者らは、植物シスタチン(例えば、オリザシスタチン( Oc-I))の部位特異的変異誘発が、その結合特性を向上し得、従ってプロテイナーゼの阻害における酵素の効力を向上し得ることを見出した。この部位特異的変異誘発は、植物シスタチンのアミノ酸配列構造の86位のアミノ酸のアスパラギン酸の除去を含み、この除去は、Kiを13倍、すなわち2.3×10^-9Ｍに向上させる。この改変は、図１に示したアラインメントアミノ酸の163位のアスパラギン酸（記号Ｄ）の除去により示される。明らかに、植物シスタチンのKiの向上は、動物シスタチンのKi、および特に卵白シスタチンのKiを越えない。しかし、種をトランスジェニックと交雑する自由な研究方法についての関心が高まっている。すなわち、ある種に別の種からの遺伝子を専ら導入することであり、例えば、植物にヒトタンパク質をコードするヒト遺伝子を導入することであり、そしてその逆も成り立つ。遺伝子操作の結果の理解が完了するまで、注意の側から誤りを犯すことに対し用心し、従って遺伝子操作に対しより合理的なアプローチを採用した。従って、世界中の植物育種家は、その構造的、生化学的、および生理学的機能が、植物タンパク質のものと同一であるか、または実質的に類似しているか、あるいは一致しているかのいずれかであるように、植物由来のタンパク質、あるいは植物タンパク質と顕著に類似したタンパク質を用いて、植物病と戦うことを好んだ。この字句範疇には、ハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。さらに、低いKi値をもつ多くの動物シスタチンは、これまで特徴づけられた植物シスタチンにおいて見出されない、いくつかのジスルフィド結合を有する。従って、正しいタンパク質フォールディングを確実にするために、植物系において少なくとも部分的に植物シスタチンを使用することは、慎重であり得る。従って、本発明者らの植物プロテイナーゼインヒビター、特に植物シスタチン、および本発明者らのハイブリッドプロテイナーゼインヒビターの部位特異的改変は、植物プロテーナーゼインヒビターの少なくとも一部分を含む場合、植物系における使用で限定的ではない好ましい新規の改変されたタンパク質を提供した。図１に示すアラインメントアミノ酸配列における、アラインメントアミノ酸10 4上の保存は、ほとんどないことに注意すべきことである。従って、これにより本発明者らの観察は、全くより驚くべきものになる。前のシスタチンの部位特異的な改変の研究は、先に指摘した高度に保存されたQVVAGモチーフに集中したが、この領域の改変は通常好ましくないものであった（12）。本発明の目的は、上記に引き続き、少なくともプロテイナーゼに対するその結合に関して向上した効力を有する新規のプロテイナーゼインヒビターを提供することである。さらに本発明の目的はまた、新規のプロテイナーゼインヒビター、しかし、好ましくは排他的ではなく、第１の種由来のプロテイナーゼインヒビターの一部および第２の種由来のプロテイナーゼインヒビターの一部を含むハイブリッド分子もまた含む、理想的には向上した効力を有するプロテイナーゼインヒビターを提供することである。本発明のさらなる目的は、新規のタンパク質の全てまたは一部、あるいは同じタンパク質をコードするDNAの全てまたは一部を含む生産物、およびこの新規のタンパク質および/またはDNAの使用を提供することである。本発明の第１の局面によれば、その対応する天然に存在する対応物により、それが相互作用するプロテイナーゼの阻害をより効果的にするために改変または製造されたプロテイナーゼインヒビターが提供される。理想的には、前記プロテイナーゼインヒビターは、より強くプロテイナーゼに結合する。従って、その天然の対応物より少なくとも10倍低い値のKiを有する合成プロテイナーゼインヒビターが提供される。例えば、3×10^-8Ｍから少なくとも3×10^-9 ＭへのKiの変化が、このようなKiにおける改善を示す。本発明の第２の局面によれば、タンパク質のKiを少なくとも10倍低下させる、少なくとも１つの部位特異的なアミノ酸の欠失および／または置換を含むプロテイナーゼインヒビターが提供される。好ましくは、タンパク質はシスタチンであり、そして理想的には、その部位特異的欠失または置換は、Oc-Iのアミノ酸配列構造の86位アスパラギン酸の欠失、あるいは、シスタチンのようなプロテイナーゼインヒビターを並べた図１で示すアミノ酸配列構造のアラインメントの163位アスパラギン酸の欠失、あるいは、関連するプロテイナーゼインヒビターまたはシスタチンの機能的な対応物の欠失のいずれかである。あるいは、部位特異的改変は、削除されたアスパラギン酸の機能的特性を考慮して、逆の特性を有する、前記部位における前記アスパラギン酸の代用できるアミノ酸への置換に関する。本発明の第３の局面によれば、図２に示すDNA配列構造の全部または一部が提供され、そのDNA配列構造は本発明の第１の局面によるタンパク質の例をコードする。本発明の全てのタンパク質、または対応するDNA配列構造は、少なくとも部分的には、プロテイナーゼ産生により引き起こされるか、または特徴づけられる症状の疾患との戦いにおいて有用性を有する。従って、新規のタンパク質および対応するDNA配列構造は、このような疾患の状態を予防、軽減、または緩和するために直接的または間接的に用いられ得る。例えば、プロテイナーゼによるタンパク質分解を含む、病原性、害虫性または寄生性の状態を患う宿主生物は、本発明の少なくとも１つのタンパク質を受容することにより処置され得る。処置は、本発明の前記のタンパク質を直接疾患生物に適用することにより、例えば、殺虫剤、殺菌剤などのような化学薬剤、または薬物の形態で、あるいは代わりに、本発明の前記タンパク質の遺伝配列構造を宿主生物のゲノムに導入し、そして前記本発明のタンパク質の、疾患と戦うために装備された宿主細胞体による発現を確実にすることにより行われる。前記の段落における、１またはそれ以上の任意の本発明のタンパク質は、前記のように用いられ得る。例えば、本発明のタンパク質の選択された組み合わせ、すなわち、部位特異的改変を含むタンパク質および／またはハイブリッドタンパク質は、１またはそれ以上の任意のプロテイナーゼの効果に対抗するために用いられ得る。理想的には、形質転換生物は植物である。本発明のさらなる局面によれば、本発明のタンパク質を発現するために宿主生物を改変する工程または形質転換する工程を包含する、タンパク質分解の損傷に対する耐性を付与する方法が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、本発明のDNA配列構造の全部または一部を包含する構築物が提供される。前記構築物は、プラスミドまたはベクターを包含する。本発明のなおさらなる局面によれば、理想的には、病原性、寄生性または害虫性のタンパク質分解状態に対する薬物として、本発明のタンパク質またはDNA構造の使用が提供される。本発明のさらなる局面によれば、本発明のタンパク質を包含する、病原性、寄生性、または害虫性の疾患に対して効果的な組成物が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、本発明のタンパク質をコードするDNA、そして理想的には図２で示すDNAを用いて形質転換したトランスジェニック植物が提供される。このDNAは、本発明のタンパク質を発現し得るために適切なプロモーター配列に連結される。理想的には、発現は、一般的に、植物内の、または植物との害虫、病原体、または寄生体相互作用の現場のいずれかである。参考文献13に例示されるように、植物の病原体、寄生体、または害虫の現場からプロモーターを同定するための一般的な方法が提供される。あるいは、またはさらに、発現は、所定の選択された時期で起こるように選択され得る。好ましくは、前記形質転換植物は、穀物作物、野菜作物、オイル作物、糖作物、飼草（forage）または牧草（turf grass）、線維植物、薬草（herbalspice）植物、果実作物、あるいは任意の装飾的な植物である。本発明のなおさらなる局面によれば、本発明のタンパク質をコードするDNA、そして理想的には、図２に示すDNAを包含する形質転換生物、植物、またはその他のものが提供される。その結果、前記タンパク質は、その提供源の目的のために収穫され得る。好ましくは、前記構築物は、本発明のタンパク質の発現を確実にするための適切なプロモーターとともに提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、病原体、寄生体、または害虫を制御するための方法が提供され、これは、前記の病原体、寄生体、または害虫を本発明のタンパク質に曝す工程を包含する。本発明のさらなる局面によれば、病原体、寄生体、または害虫を制御するための本発明のタンパク質の使用が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、表２に示すプライマー、あるいは、本明細書中に記載されるようにプライマーが依然として機能し得る、それらに対する付加、欠失、または改変を有する同様の性質のプライマーの１またはそれ以上が提供される。本発明の改変されたプロテイナーゼインヒビターはまた、同一、または異なる界、門、種、目、科、属、種のいずれかに由来するプロテイナーゼインヒビターの新規の組み合わせを包含し得る。例えば、動物由来のプロテイナーゼインヒビターの画分（単数または複数）は、植物由来のプロテイナーゼインヒビターの画分（単数または複数）と組み合わされ得、これらのすべて、あるいは１またはそれ以上は、効力を改善するために前記の改変を含んでもよく、また含まなくてもよい。あるいは、植物プロテアーゼインヒビターの異なる種類またはタイプが、新規の植物プロテイナーゼインヒビターを提供するために組み合わされ得るか、または動物プロテイナーゼインヒビターの異なる種類またはタイプは、新規のプロテイナーゼインヒビターを提供するために組み合わされ得る。これらのすべて、あるいは１またはそれ以上は、効力を改善するために前記の改変を含んでもよく、また含まなくてもよい。本発明のなおさらなる局面によれば、タンパク質、および／または第１のプロテイナーゼインヒビター由来の第１の部分、および少なくとも１つの別のプロテイナーゼインヒビター由来の少なくとも１つの別の部分を含有するDNA配列が提供される。本発明の好ましい実施態様は、本発明のなおさらなる局面のDNA配列が、対応するタンパク質が宿主細胞組織のような標的組織内で生産され得る構築物において提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、本発明のなおさらなる局面のDNA配列構造を用いて形質転換した標的組織または宿主細胞組織が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、第１のシスタチン由来の第１の部分、および少なくとも１つの別のシスタチン由来の少なくとも１つの部分を含むタンパク質が提供される。好ましい実施態様は、前記DNA配列または前記タンパク質の前記第１の部分は、それぞれ植物由来のシスタチンDNAまたはタンパク質を含有し、そして前記の少なくとも１つの別の部分は、それぞれ動物由来のシスタチンDNAまたはタンパク質を含有する。理想的には、前記動物由来のDNAまたはタンパク質は、動物由来のシスタチンの活性部位由来のDNAまたはタンパク質に対応する；そして好ましくは、前記植物由来のシスタチンDNAまたはタンパク質は、構造部位（単数または複数）または前記植物由来のシスタチン由来のDNAまたはタンパク質に対応する。あるいは、前記DNA配列またはタンパク質は、植物由来のシスタチンの異なる種類またはタイプを包含する。あるいはさらに、前記DNA配列またはタンパク質は、動物由来のシスタチンの異なる種類またはタイプを包含する。本発明のなおさらなる局面によれば、前記のハイブリッドプロテイナーゼインヒビターおよび前記部位特異的改変の両方を含む、新規のプロテイナーゼインヒビターに関するタンパク質および／またはDNA配列構造が提供される。本発明のプロテイナーゼインヒビターのすべては、プロテイナーゼの効果に対抗するため、およびこのような効果に関する方法において使用するために適用される。従って、一般的に言えば、本発明は、改善された機能活性を現すタンパク質の再設計に関する。部位特異的改変、またはアミノ酸配列の領域は、所望の特性を現すタンパク質の対応する領域（いくつかの生物由来の）または設計された合成配列のいずれかを用いて置き換えられる。元のタンパク質のアミノ酸配列骨格は、理想的には最終ハイブリッド分子において維持される。本発明は、以下の図のみに関する例示により記載される。図１は、多くのシスタチンのアラインメント配列構造を示す。図２は、本発明の新規のタンパク質のDNA配列構造を示す。図３は、イネのシステインプロテイナーゼインヒビター、オリザシスタチンOc -IのDNA配列構造を示す。図４は、A.rhizogenes形質転換トマトの根に寄生している雌G.pallidaの増殖に対するシスタチン発現の効果を示す。線虫の体長を、その外面積（μm²）で表す；ａはコントロールであり、ｂおよびｃは、それぞれ、Oc-IおよびOc-IΔD86 の発現である。図５は、計45μgのPI(単数または複数)をウェル中央に添加後、寒天上での６日間の胞子から真菌への成長の抑制を示す。図６は、それぞれに対応するプロテイナーゼに曝したときの、種々のハイブリッドプロテイナーゼインヒビターの相対的な阻害のパーセンテージを示す。表１は、天然の状態または特定の改変を受けたときにおける、種々のシスタチンの解離定数Kiを示す。表２は、PCR反応に用いた23個のオリゴヌクレオチドプライマー(P1〜23)およびクローニングに用いた２つのリンカー(L1〜2)の配列を示す。表２aは、ハイブリッド分子を製造するためにPCR反応に用いたプライマー(P24 〜39)の配列を示す。表３は、作製されたハイブリッド分子の性質を示す。棒線はOc-Iタンパク質の長さを示し、黒く影をつけた範囲はCEWCアミノ酸配列に置換された範囲を表す。材料および方法菌株およびベクター DNAの調製および操作プラスミドDNAをアルカリ溶解法（２）によりE-coli培養物から精製した。制限消化およびライゲーション反応を、製造者の推奨を用いて行った。DNAフラグメントを、製造者のプロトコルに従って電気溶出(electroelution)チャンバー(I BI)を用いてアガロースゲルから回収した。オリゴヌクレオチドをApplied Biosy stems 381A装置で合成し、さらなる精製を、「改変部位II」部位特異的変異誘発プロトコルで用いたオリゴヌクレオチドに対してのみ、逆相COPクロマトグラフィーカートリッジ(Cruachem.Glasgow，UK)を用いて行った。二本鎖プラスミドDN AのDNA配列決定を、製造者の指示に従って、Sequenaseバージョン2.0(Amersham) を用いて行った。シスタチンおよびC.elegansプロテイナーゼインヒビターのクローニング OC-Iを、公開された配列データ（３）から設計したプライマーP1およびP2（表２を参照のこと）を用い、そしてクローニングを助けるための制限酵素部位の添加とともにOryza sativa L.japanicaのゲノムDNAから増幅した。イントロンを、遺伝子ソーイング（SOEing）のPCR技術(４a＆４b)により取り除き、ここでプライマーの対P1/P3およびP2/P4を２つのエクソンを増幅するために用いた。これらの産物を次いでプライマーP1およびP4で増幅することにより一緒にソーイングし、そして産物を、SmaI/EcoRI消化のpBluescriptにクローン化した。クローン化したコード領域の配列を、Oc-Iの公開されたデータ（３）との比較により確認した。C.elegansシステインプロテアーゼ遺伝子（gcp-I）の増幅およびイントロンの除去を、配列情報（５）から設計したプライマーP5-8（表２）を用いる類似の方法で行った。最終PCR産物をpBluescriptにクローン化し、配列解析により確認した。ササゲシステインプロテアーゼインヒビター、CCPI（６）についてのDNA配列情報を用いて、オリゴヌクレオチドプライマー、P9およびP10を設計した（表２）。CCPI遺伝子（P.Shewry教授の好意的な提供）を有するcDNAクローンとともに、これらのプライマーをPCR増幅に用い、産物を、PCRプライマーに組み込まれた BamHIおよびHindIII部位を利用して、発現ベクターであるpQE30(Qiagen，Califo rnia，USA)に直接クローン化した。遺伝子を、IV型pQE発現ベクター（Qiagen，C alifornia，USA）（BamHI／HindIII）にクローン化し、そしてタンパク質をE-co li M15[pREP4]株で発現させた。変異誘発ａ）Ｎ末端欠失 pΔ24Oc-Iと称する、Oc-Iの５’末端に大きな72bpの欠失を生成するために、p QE30/Oc-IをSmaIおよびHincIIで消化し、大きなフラグメントをアガロースゲルより精製し、取り除いた。63bpの欠失(pΔ21Oc-Iと称する)を作製するために、P QE30/Oc-IをBamHIおよびHincIIで制限し、そしてゲル精製した。５’の直後から HincII部位までの９bpの領域を、エンテロキナーゼ認識部位をコードしている配列とともに、アニールされたオリゴヌクレオチドリンカーL1およびL2を精製フラグメントに結合させることにより再導入した。ｂ）Ｃ末端欠失エキソヌクレアーゼIII/マングビーンヌクレアーゼ(mung bean nuclease)欠失（２）を実施して、遺伝子の３’末端で24、27、30および33bpの欠失を生成した。ｃ）点変異「Unique Site Elimination」(USE)ストラテジー(Pharmacia，Upsalla Sweden )を使用し、以下のアミノ酸改変を有する変異形態のOc-Iを生じるプライマーP11 〜P20（表２）を用いて、単一コドン改変を発現する構築物を生成した。i)81と8 2との間でのLeuの挿入。ii)E13；D86；A74；M85の欠失；iii)D86N；E89L；Q91L ；P83A；W84A(置換前のアミノ酸、位置、置換後のアミノ酸)の置換。Oc-IをベクターpALT-Ex2(Promega，Madison，USA)にサブクローン化することを含む「Alter ed Sites II」システム(Promega，Madison，USA)を用いて、P83、W84およびD86 のコドンがアンバー終止コドン(TAG)に変化した変異体を生成した。オリゴヌクレオチド(P21-P23)を用いて、表２に示すようにこれを行った。ここで、アンバー終止コドンを太字で示し、そしてSacI部位(GAGCTC)を除いた点変異を小文字で示す（この変化はアミノ酸配列を改変しない）。このSacI部位が存在しないことを、変異体の診断試験として用いた。「Interchange」法(Promega，Madison，US A)を用いて、変異体クローンの12個の特異的アンバー抑制株への導入により、アンバー終止コドンにおける、Cys，Glu、Phe、Gly、His、Pro、Arg、Lys、 Gln、Ser、およびTyrへのアミノ酸変化を生成した。 E coliにおけるOc-Iおよびgcp-1の発現 Oc-Iを、１段階のニッケルキレート親和性を可能にするためのベクターによりコードされている６つのＮ末端ヒスチジン残基を含むpQE30（「QIAexpression」システム）から発現した。Oc-Iタンパク質を、pQE30由来の発現プラスミドを有しているE.coli M15[pREP4]の１１培養物から精製した。20mlの一晩培養物を１リットルのLB培地に接種し、37℃でＡ₆₀₀が0.7〜0.9になるまで増殖させた。IPT Gを最終濃度２mMになるように加え、さらに２時間増殖させ続けた。細胞を10000 gで10分間遠心分離して採集し、12mlの超音波処理緩衝液（50mM Na₂HPO₄，300mM NaCl)に再懸濁し、−20℃で一晩保存した。サンプルを解凍し、３本の15mlチューブにアリコートし、氷上で短いパルス（３×30秒）で超音波破砕した。細胞残渣を遠心分離（10000g）によりペレットにし、約0.5〜0.7mlのNi-NTA樹脂スラリー(Qiagen，California，USA)を各チューブに加え、氷上でおだやかに１時間混合した。樹脂を回収し（1000g、１分）、５mlの洗浄緩衝液（50mM Na₂HPO₄(pH 6 .0)，500mM NaCl，40mMイミダゾール、４℃、0.5時間）で５回洗浄した。タンパク質を１mlの溶出緩衝液(50mM Na₂HPO₄，300mM NaCl，100mM EDTA)で溶出し、そして樹脂を1000g、１分間で再ペレット化し、さらに２回溶出を繰り返した。 C.elegansのプロテイナーゼglp-1を同様の方法で発現させた。 Δ21Oc-Iは、Ｎ末端の６ヒスチジン(６×His-tail)と短縮型Oc-Iタンパク質のＮ末端残基との間に、エンテロキナーゼ認識配列（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）を含んだ。エンテロキナーゼ(Boeringer)を使用して、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーにより６×His-tailから精製されたΔ21Oc-Iから、６×His-tailを切断した。「Centricon 10s」(Amicon)を使用し、製品により提供される指示に従って、混在しているエンテロキナーゼからOc-Iを分離した。 Kiの決定シスタチンのKiを決定するために、Barrettの方法（７）に従って生化学アッセイを行い、そしてKi値をAbeら（３）の記載のように計算した。 SDS PAGEおよびウェスタンブロット解析すべての精製タンパク質をSDS-PAGEにより解析した（８）。ウェスタンブロットを「mini protein II」（Biorad，Hertfordshire，UK）のプロトコルに従い、 PVDF膜（Millipore，Massachusetts，USA）を用いて行った。抗体産生 Oc-Iに対するポリクローナル抗体を、雄Wistarラット（６週齢）において惹起した。100μgのOc-Iを含む最終容量300mlで４週間間隔で３回腹腔内に注入した。最初の注入はタンパク質乳液と完全フロイントアジュバントとを１：１(v/v) の割合で、２回目および３回目の注入は不完全フロイントアジュバントを用いた以外は同様に行った。最後の注入の10日後、血液を回収し、４℃で凝固させ、そして5000g、10分間の遠心分離を行った。得られた血清を回収し、50％(v/v)グリセロール中で−70℃で保存した。この血清は、1000分の１希釈でELISAに最良の結果をもたらし、天然および変性させたOC-Iタンパク質の両方を認識した。 ELISA ELISAを、トランスジェニック根におけるシスタチンの発現レベルを決定するために行った。約２mmの根切片を液体窒素中で粉砕し、15ml容Falconチューブに移し、１mlの0.5×PBSを注ぎこみ、可溶性タンパク質画分が溶解するように４℃ で15分間振とうした。タンパク質をアセトンで沈殿させ、沈殿物をコーティング緩衝液（15mM Na₂HCO₃、34mM NaHCO₃(pH 9.6)）に再懸濁した。タンパク質濃度を標準的なアッセイにより決定した（14）。Maxisorbマイクロタイタープレートのウェルを100mgのタンパク質で48時間、４℃でコートした。プレートを、抗Oc- I抗体（10,000分の１希釈）でブロックした。活性を、基質を加えることにより検出し、発色が進んだら、サンプルの吸光度を405nmで計測した。異なる量のOc-Iを、非形質転換根より抽出した総タンパク質の100mgのアリコートに加え、そして同時に未知のサンプルを用いたELISAにおいて、総可溶性タンパク質中の０〜２％の範囲のOc-Iの内部基準を提供するために使用した。 C.elegansの培養 Wood（９）の記載のように、E.coli OP50細胞のローン(lawn)を有するNGM寒天上でCaenorhaboditis elegansを培養した。寒天プラグを新鮮な培地に挿入する前に集団を５日間維持した。必要であれば、ポリマー化直前にシスタチンを2.5m g1^-1の最終濃度で添加した。単一の線虫を非補充固形寒天プレートからOc-I、Δ D86 Oc-I、またはBSAを含むプレートに移す。必要であれば、各処置について10 回の反復を行った。トランスジェニックトマトの根培養 Oc-I誘導体遺伝子をベクターpBIN19にクローン化し、次いで、標準プロトコル (15)に従ってLycopersicon esculentun cv Ailsa Craigの形質転換において使用するために、電気形質転換によりAgrobacterium rhizogenes LBA9402株に導入した。続いて、根を、最初の選択の間、Gamborgs B5ビタミンおよび３％スクロース(w/v)および0.2％phytagel(w/v)に100mg1^-1カナマイシンを補充した0.5×Mura shigeおよびSkoogの基礎塩混合物の固形培地上で増殖させた。ウェスタンブロットを用いて、推定される形質転換根におけるOc-Iまたは変異体の存在を確認した。 Globodera pallidaによる根の攻撃 J2をG.Pallidaのシスト(cyst)から得、使用前に十分に滅菌した。胞子を２〜３日間水道水に浸し、その後室温で0.1％(v/v)マラカイトグリーンに一晩浸した。次いで、シストを水道水で８時間洗浄した後、抗生物質混合物（８mgm1^-1ストレプトマイシンサルフェート、６mgm1^-1ペニシリンＧ、6.13mgm1^-1ポリマイシンＢ、５mgm1^-1テトラサイクリン、１mgm1^-1アンフォテリシンＢ）に４℃で一晩浸した。次いで、シストをフィルター滅菌した水道水で洗浄し、そしてフィルター滅菌したジャガイモ根拡散物(diffusate)内のハッチ(hatch)にセットした。J2の一晩ハッチを計測し、そして10分間、以下の抗生物質で連続的に滅菌した；0.1 ％ストレプトマイシンサルフェート、0.1％ペニシリンＧ、0.1％アンフォテリシンＢ、および0.1％セチルトリメチルアンモニウムブロミド(Cetavlon)。短時間の微小遠心分離処理の間に線虫をペレット化した。これらをフィルター滅菌した水道水で十分に洗浄し、直ちに使用した。形質転換株の根を、４週間培養し、２cm長のものを新鮮な培地に移した。さらに３〜４日後、35のJ2を含む５mlのアリコートを、先端から約１cmの活発に成長している根のそれぞれにピペッティングした。１cm²片の滅菌GFAろ紙を、感染を助けるためにその範囲に置き、24時間後に取り除いた。採集したとき、感染した根をペトリディッシュから取り除き、水で洗浄し、１％(w/v)次亜塩素酸ナトリウム中に２分間置いた。初期の時点で、根を沸騰している0.1％酸性フクシン水溶液中に１分間入れ、水で洗浄し、そして次いで線虫の視覚化を容易にするために酸性化させたグリセロール中で60℃、一晩洗浄した。その後の時点では、線虫は染色しなくても視覚化され得、そして根から切除される。線虫を顕微鏡(DBRM，Leica)下で50〜200×の倍率で観察し、そして横断面範囲を顕微鏡に取り付けた画像解析機(Quantimet 5000C;Leica)を用いて計測した。抗真菌活性の証明本発明者らは、pQE30（上記参照）における発現後回収されたPIが抗真菌活性を有することを示した。45μgの回収PIを、１μg/μlで、B.cinerea（2.2×10⁴/ プレート）の胞子を含むアガープレート内の中央ウェルに加えた。胞子は発芽せず、真菌は、CPTIまたはOc-Iが中央ウェルから寒天内に分散された場所では成長しなかった。有効な効果は、数週間存続し、そしてセリンおよびシステインPIの組み合わせにより増大された。特に適切には、Oc-IΔD86が天然型Oc-Iより効果的である（図３）。本発明者らはまた、PIが、Aspergillus fumigatus（哺乳動物の真菌性病原体；図５）およびErwinia carotovora（植物の細菌性病原体）を含む他の微生物に対しても効果を有することを確立した。このことは、この適用を支持する２つの重要な点を示している。すなわち、(i)このアプローチは種々の異なる真菌に対して広く有効である(ii)タンパク質操作は真菌に対するPIの効果を増大し得る。ハイブリッド遺伝子の形成ニワトリ卵白システイン(CEWC)は、Oc-IまたはOc-IΔD86のいずれもより有効なインヒビターである。本発明者らは、より有効な阻害特性を有する本質的に植物起源の遺伝子を作製するために、Oc-Iのフラグメントを対応するCEWC配列に置換した。材料および方法 cewcの対応領域を用いたoc-IのＮ末端の置換３’末端でオーバーラップしている２つのオリゴヌクレオチドプライマー（P2 4およびP25）を合成した。これらをアニーリングし、そしてDNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を用いて充填し、CEWCの成熟形態のＮ末端、SEDRSRLL GAPVPVD（残基１〜15、CEWCナンバリング）をコードする二本鎖完全長配列を生成した。プライマーP26およびP27を、コード配列のはじめの51bpを欠失したoc-I を増幅するのに使用した。oc-Iおよびcewc配列を、次いでソーイング（4aおよび 4b）として公知のPCR反応によって結合させ、oc-nterm 1-15と呼ばれるハイブリッド遺伝子を生成した。 cewcの対応領域を用いた中央のQVVAGおよびoc-Iの周辺領域の置換２個目のハイブリッド分子を、Oc-Iの活性部位を含有する三部分ウエッジ(tri partite wedge)の中央ループをCEWCの対応する部分で置換することにより構築した。一緒になった場合、CEWC配列YSSRVVRVISAKRQLVSGIKYILQ（残基40〜63）をコードする、４つのオリゴヌクレオチド（P28、P29、P30、およびP31）を合成した。プライマー対P28/P29およびP30/P31をアニーリングし、そしてDNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）を用いて処理し、その後合わせてソーイングされる２つの二本鎖フラグメントを生成した。Ｎ末端領域およびＣ末端領域の両方をコードするoc-Iフラグメントを、それぞれプライマーP32/P33およびP27/P34を用いて増幅した。合成cewc配列（P28〜P31）は、oc-IのＮ末端フラグメントにソーイングされ、次いで、oc-IのＣ末端フラグメントにソーイングされ、ハイブリッド遺伝子glvsg40-63を生成した。 cewcの対応領域を用いたoc-IのＣ末端の置換上記のＮ末端をコードするものと同一の方法で、プライマーP35およびP36を用いて、Ｃ末端20アミノ酸、FVVYSIPWLNQIKLLESKCQ（残基97〜116）をコードするc ewcの領域を生成した。プライマーP32およびP37を、コード配列の末端の51bpが欠失したoc-Iを増幅するのに使用した。oc-I配列およびcewc配列は合わせてソーイングされ、oc-cterm97-116と呼ばれるハイブリッドを生成した。より短いcewc配列を用いるハイブリッドの生成より短いcewc領域がハイブリッドシスタチンにおける天然型Oc-Iより大きな阻害能力を付与し得るどうかを決定するために、より小さなCEWC領域を含有するさらなるハイブリッド分子を生成した。このようなハイブリッドタンパク質は、元来の植物分子のより多くのアミノ酸配列を保持する。２つのプライマーP38およびP39は、USE変異誘発反応に使用される場合、oc-qlvsg52-60およびoc-pw101-10 7と呼ばれる２つのハイブリッド遺伝子を生成した。これらは、それぞれ隣接するcewc残基RQLVSGIKY（残基52〜60、重要なcewc活性部位[12]）およびSIPWLNQ（残基101〜107、Ｃ末端の重要な領域[16]）をコードした。ハイブリッド分子のマトリックスの生成 oc-Iの多数の区画が対応するcewc配列によって置換されているハイブリッド分子を、oc-I内に都合良く位置している制限酵素部位を利用することによって生成した。天然のoc-IまたはＮ末端ハイブリッド遺伝子のいずれかのＮ末端をコードする配列を、HincII制限消化によって除去した。天然のoc-IまたはＣ末端ハイブリッド遺伝子のいずれかのＣ末端をコードする配列を、FocI制限消化によって除去した。あるハイブリッド遺伝子由来のフラグメントを、他のハイブリッド遺伝子由来のフラグメントに連結することによって、２つまたは３つの元来のoc-Iフラグメントがcewcのフラグメントによって置換されたさらなるハイブリッド分子を生成した。全部で15のハイブリッド遺伝子を構築した（表３）。結果モデル化タンパク質配列アラインメントを、OWLデータベースより選択されたタンパク質配列を整列させるためのSOMAPプログラムを用いて作成した。システインプロテイナーゼ配列の最初のアラインメントは、システインプロテイナーゼファミリーを通しての高度の保存性を証明するのに役立ち、そしてまた本発明者らの第一の標的として、パパインを使用することが不合理でないことを確証した。２番目に整列させた利用可能な配列の25のシステインプロテイナーゼインヒビター（表１）を生成した。これは、以前に同定された保存アミノ酸を強調するのに役立ち、配列の特徴を有するシステインプロテアーゼインヒビターの公知のKi値を比較するための根拠、変異誘発ストラテジーの設計で使用される情報を提供する。構造的なモデル化のために、ニワトリ卵白シスタチン（10）およびヒトステフィン(stefin)B／パパイン複合体（11）の座標(co-ordinate)が、Bode教授より好意的に供給された。これらを、OcIの三次元モデルを構築するのに用い、次いで本発明者らのモデルが合理的な立体化学を有することを確実にするために、Xplo rプログラムを用いて、エネルギーを最小にした。 C.elegansシステインプロテアーゼのクローニング発現および精製パパインおよび線虫プロテアーゼの両方に対するKi値の決定を可能にするために、E.coli gcp-1調製物からC.elegansシステインプロテイナーゼを発現させ、精製し、そして精製度を決定するためにSDS PAGEによって分析した。シスタチンの発現および変異誘発 E.coliから発現され、そして精製されたシスタチンおよびOc-I変異体タンパク質を、精製度のレベルを決定するためにSDS PAGEによって分析した。システインプロテイナーゼインヒビターのアラインメント（図１）は、オリザシスタチンが、リーダー配列を有さず（トウモロコシホモログとは異なる）、従って、細胞内で生産されるらしいことを示す。３つの野生型インヒビターであるササゲプロテアーゼインヒビター(CCPI)、トウモロコシシスタチンII、およびOc-IについてのKi の決定は、それらが類似した阻害活性を有することを証明した。研究の開始時点では、CCPIは、特徴付けられなかった。これらの理由のため、Oc-Iを、変異分析のために選択した。以前に公表された報告は、Oc-IのＮ末端で切断された形態が、天然のタンパク質よりわずかに効果があることを示唆した。しかし、これらの変異Oc-Iタンパク質は、Oc-Iの21および24アミノ酸を欠失しているが、それらは、ベクター配列によってコードされるＮ末端配列を保持しており、従ってそのプロテイナーゼとの相互作用を付与し得る。この問題を試験するために、Ｎ末端の24および21アミノ酸欠失、ならびにＣ末端の８、９、10、11および12アミノ酸欠失を有するタンパク質を発現させた。これらの変異タンパク質形態のKiを、パパインまたはC.eleg ansプロテアーゼ、gcp-1のいずれかを用いて決定した（表１）。切断されたタンパク質のいずれも野生型Oc-Iより低いKiを有さないことが見いだされ、そして21 および24アミノ酸欠失物の両方が不活性であった。このことは、他の研究者の結果が、活性を付与する付加的なベクター残基によるものであることを示唆する。タンパク質配列アラインメントおよびOc-Iのモデルを、シスタチンの公表されたKi値とともに、Oc-Iの阻害能力を向上させ得る変異を同定するために使用した。アミノ酸E13およびD86を独立に欠失させた。残基E13の欠失は、パパインまたはgcp-1のいずれに対してもOc-IのKiに影響を与えなかった。残基Δ86の欠失は、パパインについては７nMから0.5nMに、そしてC.elegansプロテアーゼ、gcp-1 については８nMから0.6nMに、Oc-IのKiを約13倍低くした（表１）。D86の周辺のインヒビターの領域を、さらなる変異誘発の標的とした。表１は、C.elegansシステインプロテアーゼに対してアッセイした、全てのさらなる変異に対するKi値を示す。これらの値から、全ての置換変異がKiの増加をもたらす（これは、効力の減少を示唆する）ことが明白である。野生型Oc-IのKi値に対して類似のKi値またはわずかに減少したKi値を示す唯一の変異は、残基M85の欠失であった(gcp-1 で８nMから7.1nMに)。 C.elegansに対するシスタチンのインビボでの影響食餌試験(feeding trial)を、線虫発育におけるプロテアーゼインヒビターの影響を試験するためにC.elegansを使用して行った。通常の寒天上で雌雄同体が明らかになるとすぐに、それらをOc-I、Oc-IΔD86、CCPI、またはBSAのいずれかを含む個々のプレートに移し、そして産卵を観察した。培養培地に関係なく、雌雄同体は、平均数約300個の卵を産んだ。これらの卵の半分を、インヒビターを添加しない通常のプレートに移した。この卵を孵化させ、そしてC.elegans幼生の発達をモニターした。全ての条件で95％より多くの卵力孵化し、Oc-I、Oc-IΔ D86、CCPI、およびBSA補充培地より回収した卵から孵化した幼生のそれぞれ94％、92.5％、97％、および96％の発育が完了した。第二の実験において、通常の条件下で孵化した幼生を、上記のタンパク質で補充された培地に移した。50の幼生を、４つの幼生期L1、L2、L3、およびL4が支配的である発育時間と対応する６時間、12時間、24時間、および30時間で移した。孵化後６、12、または24時間でOc-I、Oc-IΔD86、またはCCPIで補充された培地に移された場合、いずれの幼生も成体まで発育しなかった。シスタチン補充培地で発育できなかった幼生は活動休止状態になり、そして新鮮な非補充プレートへの移転において回復できなかった。これらの幼生はまた、移動できないか、または繰り返される触覚刺激に対して応答できず、そして結局死滅する。しかし、孵化後30時間で移された幼生の76％は、発育して、成体の雄または雌雄同体期に達する。BSAを含有する培地上で生まれ、そして通常の培地に移された卵から孵化したすべての幼形は、成体線虫に発育した。 Globodera pallidaに対するシスタチンのインビボでの効果 Oc-IおよびOc-IΔD86を用いた予備的なアッセイは、両方の抗Oc-Iポリクローナル抗体が両方のタンパク質を同等によく認識することを証明した。ELISAは、O c-Iを発現する形質転換されたトマトの毛状根における最も高い発現レベルが、全可溶性タンパク質の0.54＋0.02％であることを証明した。類似したアッセイは、比較研究のために選択された、全可溶性タンパク質画分の0.51＋0.01％の類似した発現レベルを有するOc-IΔD86株を同定した。２つのトランスジェニックシスタチン株および非形質転換コントロールにおける線虫の発達を、約１週間間隔で６週間、数本の根から回収した個体について測定した。画像解析は、線虫の輪郭の面積の値を提供した。これらの値の平均は、図４に３つの根株の時間に対して示される。統計的分析を、演繹的対照（12）を伴う１元配置分散分析を使用して実施し、各々の日の測定のコントロールに対して２つのシスタチン株を比較した。この分析は、１、２、４、５、および６週間で有意により低い輪郭面積（P<0. 05）を証明する。さらに、Oc-IΔD86株（P<0.05；SNK）の動物と他の２つの株とを対比して４から６週間の間でサイズにおいて有意な増加は生じなかった。CEWC による阻害が独断的に100％として決定されたUrwinら（16）に記載の比較アッセイを、表３に記載の最初の７つのハイブリッド分子に実施した。７つの中で、わずかに１つの、57CEWC残基を含むOC-NTERM1-15QVLSG40-63CTERM97-116は、約90 ％の阻害を示した。これは、天然のOc-I（約60％）およびOc-IΔD86（約88％）より高い。残りの６つのハイブリッド分子に観察される阻害のレベルは、減少した（図６）。考察表１で示されたデータから、隣接している85位でのメチオニンの欠失がパパイン阻害にわずかな影響しか与えない一方、アミノ酸86位のアスパラギン酸の除去は、Ki値をおよそ13〜14倍改良することを見い出し得る。さらに、86位でのアスパラギン酸の他の12のアミノ酸による置換は、Kiに不利益な影響を与える。従って、１つのアミノ酸の除去（従って、タンパク質のバックボーンを短くすること）は、Kiを改良させる重要な因子であると思われる。さらに、86位でのアミノ酸の除去は、重要であると思われる。本発明者らは、この残基を有するループは、他のシスタチンの構造とさらに類似した構造をもたらし、おそらくプロテイナーゼを有するアミノ酸83位およびアミノ酸84位での上記の保存されたPW部位の相互作用を改良する、アミノ酸アスパラギン酸86の欠失を有する分子の阻害部位の一部であると考える。表１では、天然のおよび改変されたプロテイナーゼインヒビターの効力が、パパインおよび同様に細菌を摂食する(bacteria-feeding)線虫C.elegans由来のgcp -1を顧慮して決定されたことが理解され得る。さらに、本明細書中に示される他の情報は、改変されたタンパク質が、プロテイナーゼを阻害するのに効果的であり、そのため機能的に活性であることを示す。さらに、ハイブリッド分子に関する本発明者らのデータは、タンパク質を操作すること、および特にプロテイナーゼインヒビターの機能的な有効性が改良されるように、動物タンパク質の少なくとも一部を含むように植物タンパク質を改変すること（すなわち、植物タンパク質の機能的な有効性が動物タンパク質の機能的な有効性に近づくこと）が可能であることを示す。本発明者らのデータは、天然のプロテイナーゼインヒビターの実施可能な発現レベルでの昆虫の不適当な調節の以前の報告が、本出願で証明されたようなタンパク質操作を用いることによって克服され得ることを示す。本発明者らは、タンパク質操作がKi値を減少させ得、同様にKi値を改良し得、同様に有効な植物保護のために植物において発現されなければならない有効な最小タンパク質レベルを減少させ得ることを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/99 9/99 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＥＤ // Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＥＤ 37/64 ＡＤＺ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アーウィン，ピーターエドワードイギリス国エルエス13 ４エヌエフリーズ，ブランリー，スウィンノウクローズ 86

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１つの部位特異的アミノ酸欠失を含むシスタチンであって、該欠失がオリザシスタチンＩの86位のアスパラギン酸、あるいはオリザシスタチンＩのタンパク質配列構造を有するホモログまたはアナログのタンパク質配列構造のアラインメント後の該ホモログまたは該アナログにおけるその等価な残基の欠失を含むシスタチン。２．対応するプロテイナーゼの効果に対抗するための、請求項１に記載のプロテイナーゼインヒビターの使用。３．前記インヒビターが殺虫剤として使用される、請求項２に記載の使用。４．薬剤中で使用するための、請求項１に記載のプロテイナーゼインヒビター。５．対応するプロテイナーゼの効果に対抗するための薬剤の調製における、請求項１に記載のプロテイナーゼインヒビターの使用。６．請求項１に記載のプロテイナーゼインヒビターを少なくとも１つを含有する、プロテイナーゼの効果に対抗するための組成物。７．適切なキャリアをさらに含有する、請求項６の記載の組成物。８．請求項１に記載のプロテイナーゼインヒビターをコードするDNA分子。９．請求項８に記載のDNA配列構造を包含する構築物。１０．請求項９に記載の構築物を用いて形質転換された非ヒト生物。１１．植物である、請求項１０に記載の生物。１２．請求項１に記載のインヒビターを発現するために、非ヒト生物を改変する工程または形質転換する工程を包含する、タンパク質分解の損傷に対する耐性を付与する方法。１３．前記発現が、一時的または局部的のいずれかで発現し得るために、適切な遺伝子から単離されたかまたは改変された選択されたプロモーターによって支配され、その結果、前記インヒビターが、前記生物の生理学および／または解剖学に関して所定の選択された時期、または所定の位置のいずれかで発現する、請求項１２に記載の方法。１４．前記生物が植物である、請求項１２または請求項１３に記載の方法。１５．前記植物が穀物作物である、請求項１４に記載の方法。１６．請求項１に記載のプロテイナーゼインヒビターを生産する方法であって、非ヒト宿主生物を、その遺伝物質が請求項１に記載のプロテイナーゼインヒビターをコードするDNAを含有するように形質転換し、そして次いで、該プロテイナーゼインヒビターを収穫するために、該形質転換生物を、それが発現される条件下で培養および／または栽培する、方法。１７．病原体、寄生体、または害虫を制御する方法であって、該病原体、該寄生体、または該害虫を請求項１に記載のプロテイナーゼインヒビターに曝す工程を包含する、方法。１８．請求項１に記載のプロテイナーゼインヒビターを生産する方法であって、表２に示すプライマー、あるいは、それに対する付加、欠失、または改変を有するプライマーの任意の１つまたはそれ以上の使用を包含し、該プライマーが該プロテイナーゼインヒビターの生産を可能にする、方法。１９．以下を含有する、ハイブリッドプロテイナーゼインヒビター：ｉ．シスタチンまたはそのフラグメントからなる第一の部分； ii．プロテイナーゼインヒビターまたはそのフラグメントからなる第２の部分； iii．必要に応じて、プロテイナーゼインヒビターまたはそのフラグメントからなる１つまたはそれ以上のさらなる部分。２０．前記第２の部分がシスタチンまたはそのフラグメントからなる、請求項１９に記載のハイブリッドプロテイナーゼインヒビター。２１．前記第１の部分が、植物シスタチンまたはそのフラグメントからなり、そして前記第２の部分が、動物シスタチンまたはそのフラグメントからなる、請求項２０に記載のハイブリッドプロテイナーゼインヒビター。２２．Ｎ末端、Ｃ末端、および活性部位の少なくとも１つが、完全にまたは部分的に動物シスタチン由来の等価な領域で置換されている、改変された植物シスタチンからなるハイブリッドプロテイナーゼインヒビター。２３．前記動物シスタチンが、ニワトリ卵白シスタチンである、請求項２１または２２に記載のハイブリッドプロテイナーゼインヒビター。２４．前記植物シスタチンがオリザシスタチンである、請求項２１または２２に記載のハイブリッドプロテイナーゼインヒビター。２５．前記植物シスタチンが請求項１に記載のシスタチンである、請求項２１、２２、または請求項２４に記載のハイブリッドプロテイナーゼインヒビター。２６．請求項１９から２５のいずれか１つに記載のプロテイナーゼインヒビターをコードするDNA分子。２７．請求項２６に記載のDNA配列構造を含有する構築物。２８．請求項２７に記載の前記DNA、および／または請求項２８に記載の構築物により形質転換された非ヒト宿主細胞。２９．対応するプロテイナーゼの効果に対抗するための、請求項１９から２５のいずれか１つに記載のプロテイナーゼインヒビターの使用。３０．前記インヒビターが殺虫剤として使用される、請求項２９に記載の使用。３１．薬剤中で使用される、請求項１９から２５のいずれか１つに記載のプロテイナーゼインヒビター。３２．対応するプロテイナーゼの効果に対抗するため薬剤の調製における、請求項１９から２５のいずれか１つに記載のプロテイナーゼインヒビターの使用。３３．請求項１９から２５のいずれか１つに記載のプロテイナーゼインヒビターを少なくとも１つを含有する、プロテイナーゼの効果に対抗する組成物。３４．適切なキャリアをさらに包含する、請求項３３に記載の組成物。３５．請求項１９から２５のいずれか１つに記載のインヒビターを発現するために、非ヒト生物を改変する工程または形質転換する工程を包含する、タンパク質分解の損傷に対する耐性を付与する方法。３６．前記発現が、一時的または局部的のいずれかで発現し得るために、適切な遺伝子から単離されたかまたは改変された選択されたプロモーターによって支配され、その結果、前記インヒビターが、前記生物の生理学および／または解剖学に関して所定の選択された時期、または所定の位置のいずれかで発現する、請求項３５に記載の方法。３７．前記生物が植物である、請求項３５または３６に記載の方法。３８．請求項１９から２５のいずれか１つに記載のプロテイナーゼインヒビターを生産する方法であって、非ヒト宿主生物を、その遺伝物質が請求項１９から２５のいずれか１つに記載のプロテイナーゼインヒビターをコードするDNA分子を含有するように形質転換し、そして次いで該プロテイナーゼインヒビターを収穫するために、該形質転換生物を、それが発現される条件下で培養および／または栽培する、方法。３９．病原体、寄生体、または害虫を制御する方法であって、該病原体、該寄生体、または該害虫を請求項１９から２５のいずれか１つに記載のプロテイナーゼインヒビターに曝す工程を包含する、方法。４０．請求項１９から２５のいずれか１つに記載のプロテアーゼインヒビターを生産する方法であって、表２ａに示すプライマー、あるいは、それに対する付加欠失、または改変を有する該プライマーの任意の１つまたはそれ以上の使用を包含し、該プライマーが該プロテイナーゼインヒビターの生産を可能にする、方法。