JPH10510363A

JPH10510363A - 電気泳動のための新しい緩衝系およびその使用

Info

Publication number: JPH10510363A
Application number: JP8518676A
Authority: JP
Inventors: ビュエルクヴィスト，ベンクト
Original assignee: ファルマシア・バイオテック・アクチボラグ
Priority date: 1994-11-30
Filing date: 1995-11-29
Publication date: 1998-10-06
Anticipated expiration: 2015-11-29
Also published as: EP0794827B1; DE69527367T2; JP3553604B2; US6090252A; WO1996016724A1; DE69527367D1; EP0794827A1; SE9404141D0

Abstract

(57)【要約】分離ゲル緩衝液、陽極溶液および陰極溶液からなる不連続ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うための緩衝系。本発明により、分離ゲルは、８.８またはそれ以上のｐＫを有する塩基、ゲル緩衝液のｐＨを８以下のｐＨに滴定する酸からなり、陰極溶液が９.４またはそれ以上のｐＫ値を有する両性電解質または弱酸を含む。

Description

【発明の詳細な説明】電気泳動のための新しい緩衝系およびその使用発明の分野本発明は蛋白質、ペプチドおよび核酸を分離する方法としてのポリアクリルアミドゲル電気泳動に関するものであり、第一にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に関する。発明の背景電気泳動は、電場中での分子の移動度に基いて蛋白質、ペプチド、アミノ酸、核酸および他のマクロ分子のごとき荷電した分子を分離する広く使用される方法である。電気泳動分離は、支持媒体としてのゲル中でほとんど常に行われ、後者は、分離を増強させる分子ふるいとして供される。ポリアクリルアミドゲルは、その高い化学的および機械的安定性により頻繁に用いられる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動はしばしばＰＡＧＥと呼ばれる。蛋白質およびペプチドは普通変性させ、いわゆるＳＤＳ電気泳動と呼ばれる泳動の前にアニオン系界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウムで処理する。ほとんどのペプチドは、それらを実質的に等しい電荷密度にする一定の重量比でＳＤＳに結合し、適当な多孔度のポリアクリルアミドゲル中での移動速度は、それらの分子量に関連する結果である。したがって、ＳＤＳ電気泳動でのポリアクリルアミドゲルへの適用に先立ち、過剰のＳＤＳおよび、通常２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールであるチオール試薬の存在下で加熱することによって試料を変性させる。ＳＤＳ電気泳動を記載した最も早い出版物において、連続的なリン酸緩衝液が使用された［シャピロ，エイ・エル、ビヌエラ，イーおよびマイゼル，ジェイ・ブイ(Shapiro，A.L.，Vinuela，E.，and Maizel，J.V.)（１９６７）バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem． Biophys．Res．Commun.)２８、８１５；ウェーバー，ケイおよびオスボーン，エム(Weber，K.and Osborne，M.)（１９６９）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J．Biol．Chem.)２４４、４４０６］。連続的緩衝系において、選択されたｐＨおよびイオン強度の同じ緩衝液がゲル中および電極チャンバー中で使用される。今日、しかしながら、該技術は、ほとんどラエムリ,ユー・ケイ（Laemmli，U. K.)（１９７０）ネイチャー(Nature)ロンドン(London)２７７、６８０に記載された不連続緩衝系でのみ用いられる。不連続系において、分離ゲルのｐＨは通常緩衝液のそれと異なる。試料のゾーンのシャープさは、分離用ゲル頂部上の「スタッキングゲル」に高い多孔度(低いポリマー濃度)および異なるｐＨを供することにより改良される。ラエムリ(Laemmli)によって使用されたもとの説明では、高い多孔度のスタッキングゲルは、０.１２５Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６.８を含み、低い多孔度の分離ゲルは０.３７５Ｍのトリス−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８.８を含む。電極槽は、０.０２５Ｍトリス、０.１９２Ｍグリシン（ｐＨ約８.３）および１グラムのＳＤＳ／リットルを含む。電圧がこの系に印加された場合に、グリシンは、スタッキングゲルに入り始め、鋭い境界（フロント）が、塩素を含むリーディングゾーンと、グリシン含有トレイリングゾーンの間に形成される。後者のゾーン（終濃度ｐＨ８.９）におけるグリシンの低いイオン化のために、フロントの通過に伴い、電圧が激烈に増加し、スタッキングゲルの頂部に適用されたペプチドは、フロントの後ろの狭く、非常に鋭いゾーン中に濃縮されるであろう。トレイリングゾーンが分離ゲルに入ると、ｐＨおよびグリシンの移動度は増加し、同時に、蛋白質の移動度は、分離ゲルの低い多孔度により減少するであろう。分離ゲルの正しく選択された多孔度において、興味のあるペプチドは、グリシンより低い移動度を得、「デスタック(destack)し」、主にそれらの大きさによって決定される相対速度によって分離ゲルにおいて移動するであろう。今日の慣例として、ラエムリ(Laemmli)の緩衝系の単純化した型を使用するのはありふれていなくはない。分離ゲル緩衝液は、スタッキングゲルにおける緩衝液としても用いられるが、これは、大部分の適用はフロントの後ろの鋭いスタックされたペプチドゾーンを与えるのに十分だからである。多くの場合において、スタッキングゲルを完全に省き、試料において、およびゲルへの試料の入り口と関連してゾーンが鋭くなることのみに頼ることもできる。ラエムリの不連続緩衝系の使用の論議は、電気泳動的技術に関するテキストブック中に見い出される［アンドリューズ，エー・ティー(Andrews，A.T.)、電気泳動(Electrophoresis)、クラレドン・プレス(C1aredon Press)、オックスフォード（Oxford）１９８７；ダン，エム・ジェイ(Dunn，M.J.)、ゲル電気泳動：蛋白質(Gel electrophoresis：Proteins)、ビオス・サイエンティフィック・パブリッシャー(Bios Scientific Publisher) 、オックスフォード(Oxford)１９９３]、詳細な実験プロトコルは、例えば、オースベル,エフ・エム(Ausubel，F.M.)ら、分子生物学における最近のプロトコル(C urrent Protocols in Molecular Biology)、第２巻、第１０．２章、ジョン・ウィレー・アンド・ソンズ(John Wiley & Sons)、(New York)ニューヨーク州、１９９３。スタッキングと分離に用いられるゲルは、それぞれ、通常、架橋剤としてのＮ ,Ｎ−メチレン−ビスアクリルアミド（ＢＩＳ）とアクリルアミドから作られ、ＢＩＳ濃度は、通常、全モノマー濃度の２ないし５％の範囲にある。実際用いられる全モノマー濃度は、１００ｍｌのゲル溶液あたり４ないし２０グラムで変化する。Ｎ,Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアクリルアミドおよびＮ−ヒドロキシアルコキシアルキルアクリルアミドのごとき多くの代替アクリルアミド誘導体が、アクリルアミドの代わりに用いられることが提案され、Ｎ,Ｎ’−ジアリルジタルタルジアミドまたはＮ,Ｎ'−ジアクリロイルピペラジンのごとき代わりの水可溶性ジビニル化合物もまた存在し、これはＢＩＳの代わりに用いることができる。（ＵＳ−Ａ−７,１５９,８４７）。ゲルの重合は、通常、過硫酸アンモニウムおよびＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチレンエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）からなる触媒系で行う。ラジカル重合のレドックス開始剤の他の形は、ＵＶ開始剤としても用いられる。ポリアクリルアミドおよびほとんどのアクリルアミド誘導体のアミド基は、ラエムリのゲル緩衝液処方において用いられるｐＨ８.８でゆっくり加水分解される。加水分解は、低温度でも進行し、形成されたカルボキシル基は、ポリマーに取り込まれ、電気泳動と関連する電気浸透を生じる。電気泳動前の２−３週間の冷蔵庫でのゲルの保存後、目に見える効果は、蛋白質が移動する距離の顕著な減少である。冷蔵庫での３−４か月の保存により、蛋白質分離の完全な悪化が起こる。ラエムリの緩衝系は、調製のすぐ後にゲルが使用される限りは素晴らしい結果を与えるが、既製のゲルを用いた場合には、使用者に、再現性のある、高い品質の結果を与えないであろう。加水分解の速度は、ヒドロキシルイオン濃度と共に減少し、ＳＤＳ−電気泳動のための既製のゲルと組み合わせるのに適した不連続緩衝系においては、ゲルの本来のｐＨは、８を越えさせてはならず、好ましくは、ゲルのｐＨ値は、＜７.５とすべきである。不連続緩衝系での電気泳動によって生じる移動境界に現れる濃度、ｐＨおよび電導度の変化を記載する理論的なモデルが存在する［ジョビン，ティ・エム(Jov in，T.M.)、１９７３、バイオケミストリー(Biochemistry)１２、８７１−８９８：エバラエツ，エフ・エム(Everaets，F.M.)、ベッカーズ，ジェイ・エル(Becke rs，J.L.)およびフェルヘゲン，ティー・ピー・イー・エム(Verheggen, T.P.E.M .)、イソタコフォレシス(Isotachophoresis)、エルズビアー(Elsevier)、アムステルダム(Amsterdam)、１９７６]。不連続緩衝系を構成する化合物の電気泳動移動度およびｐＫ値から移動境界の前または後の状態の計算を可能とするコンピュータープログラムも入手できる。利用できる情報から、多くの不連続緩衝系を定義でき、分離ゲルにおける初期ｐＨは十分に８以下であり、同時に境界の前のリーディングイオンの移動度および電導度は、トレイリングイオンの移動度と結合し、境界の後ろの電導度は、ペプチドを鋭く、狭いゾーンに濃縮する条件を決定し、分離ゲルにおいて、ラエムリ(Laemmli)の緩衝系[(クラムバッハ,エイ(Crambach ，A.)およびジョビン，ティ・エム(Jovin，T.M.)、１９８３、電気泳動（electr ophoresis）４、１９０−２０４］で得られたものと類似のＲ_f値（Ｒ_f＝移動境界によって移動される距離によって分けられるペプチドによって移動される距離）が得られる。０.１１２Ｍトリス−酢酸、ｐＨ約６.５をゲル緩衝液として用い、トリシンをトレイリングイオンとして用いるそのような系の１つは、ＳＤＳ−電気泳動のための商業的なゲルにおいて用いられる。これらのゲルは、天然の蛋白質電気泳動のためにもまた用いられ、この場合、アラニンがトレイリングイオンとして用いられる（ファースト・システム・セパレーション・テクニーク・ファイル・ナンバー１１０(Phast System Separation Technique File no 110)、ファルマシア・バイオテック・アクチボラグ(Pharmacia Biotech AB)、ウプサラ(Uppsala) 、スウェーデン(Sweden)。ＵＳ−Ａ−４,４８１,０９４には、トレイリングイオンとしてのタウリンと組み合わせたゲル緩衝液としての、ｐＨ６.４−７.３での２−アミノ−２−メチル −１,３−プロパン−ジオールの使用が提案されている。ＤＥ−Ａ−４１２７５４６には、ゲル緩衝液としてのトリス−ギ酸塩、ｐＨ７.０−８.５およびトレイリングイオンとしてのタウリンを用いた緩衝系が記載されており、一方、ＥＰ−Ａ−０５０９３８８には、ギ酸が、酢酸、塩素、硫酸、リン酸よりなる群のうちのアニオンによって置換され、ゲル緩衝液のための有用なｐＨ範囲が７.０−８.０として与えられるところでのみ異なるほとんど同じ緩衝系が開示されている。ＥＰ−Ａ−０５６６７８４には、ゲル緩衝液が、ｐＫが５より少ない酸、ｐＫ値が８および８.５の間であるアミン、ｐＫ₂が７および１１の間の両性電解質を含み、ここに、アミンの酸に対する比がグラム当量により１：０.６および１：１であるべきであり、酸の両性電解質に対する比が、グラム当量により、１：０.５ないし１：４の割合である緩衝系を記載する。トリスは、電極溶液におけると同様に、ゲル緩衝液においても好ましい塩基として与えられる。ゲル緩衝液における好ましい両性電解質は、グリシン、セリン、アスパラギン、α−アラニン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、トリシンおよびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸よりなる群から選択され、一方で、陰極溶液における好ましい両性電解質は、グリシンまたはトリシンである。これらの公知のアプローチは、ＳＤＳ−電気泳動のための保存安定なポリアクリルアミドゲルを与え、トリス−酢酸／トリス−トリシンまたはトリス−Ｃｌ− グリシン／トリス−グリシン（ＥＰ−Ａ−０５６６７８４）系において、ラエムリ(Laemmli)の緩衝系によって得られるのと類似のＲ_f値を与えるが、得られたバンドパターンの間には、顕著な相違がなおある。純粋な蛋白質または標準混合物がラエムリ系を泳動した場合、結果は鋭く、境界がはっきりしたバンドであり、染色されたバンドの数は、通常、期待されるものと一致する。他の記載緩衝系を用いた場合、多くの蛋白質が広がり、さらに／あるいはバンドを拡散させ、かなりの数の蛋白質が、電気泳動の泳動と連結して生じる過剰なバンドを与える。発明の要約本発明の目的は、電気泳動分離の間の人工的な過剰なバンドの生成を防ぎ、分離した成分の、鋭く、境界がはっきりしたバンドを生じ、同時に、ＳＤＳ電気泳動で使用可能な保存安定ゲルの生成を可能とする不連続的緩衝系を定義することである。上述の目的を達成するため、分離ゲル緩衝溶液は、ｐＫ＞８.８の塩基および、ｐＨを滴定して８より低い値とする酸を含み、同時に、陰極溶液は、ｐＫ＞９ .４である両性電解質あるいは弱酸を含む。本発明の他の目的および利点は、以下の記述から明らかである。図面の簡単な説明図１ａないし１ｈは、以下の表１に与えられる緩衝系での電気泳動分離後の分離ゲルの写真である。図１ａ−１ｇの試料：レーン１および６、エージングした部分的に酸化された分子量マーカー；レーン２および５、ヨードアセトアミドでアルキル化した分子量マーカー；レーン３および４、新たに調製した分子量マーカー；レーン７および８、ヒト・成長ホルモン。図１ｈにおける試料：レーン１および６、エージングした部分的に酸化した分子量マーカー；レーン２および３、１.５％ジチオスレイトールで還元した分子量マーカー；レーン４および５、５％メルカプトエタノールで還元した分子量マーカー；レーン７、ヒト・成長ホルモン。発明の詳細な記述上述したように、本発明の重要な特性は、ゲル緩衝液がｐＫ＞８.８であることである。ｐＫ＞８.８である全ての塩基は、電気泳動分離で用いられる、はっきりしたゲルの形成を、深刻に妨害しなければ、適当に提供される。適当な塩基の例は、アンモニア、所望によりアルキル基で置換されていてもよい第一級、第二級および第三級アミン、ジエタノールアミン、エチルジエタノールアミン、Ｎ ,Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ,Ｎ−ジエチルエタノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１,３−プロパンジオール、Ｎ,Ｎ−ジエチルアミノ−２,３− プロパンジオール、２−メチル−２−アミノプロパノールのごとき、１または２のヒドロキシルまたはエーテル基を含むアミン、および、Ｎ−ピペリジノプロピオンアミド、Ｎ−ピロリジノ−プロピオンアミドまたはＮ,Ｎ−ジエチルアミノプロピオンアミドのごとき、１のアミド基を含むアミンを含む。特に適当な塩基は、１のアミド基を含むアミンである。ゲル緩衝溶液中で使用される酸は、ゲル緩衝液のｐＨにて、分離されるべき最も早く移動する試料成分のそれよりも高い電気泳動移動度を有し、かつ、アクリルアミドと反応せず、あるいは重合反応を妨害しないいずれの酸であってもよい。適当な酸の例は、塩酸、リン酸、硫酸、ギ酸および酢酸である。アミド基の加水分解を防ぐために、ゲル緩衝液のｐＨは８より低くあるべきで、より好ましくは、７.５より低くあるべきである。非プロトン化第一級および第二級アミンは、アクリルアミドおよびアクリルアミド誘導体と反応し、非プロトン化第三級アミンは、ラジカル重合反応を妨害する[ゲイストハート，ディ(Geisthardt，D.)およびクルッパ，ジェイ(Kruppa，J. )(１９８７)、アナル・バイオケム(Anal．Biochem.)、１６０、１８４−１９０]。電気泳動分離用の再現性のある、よく機能するゲルを得るためには、ゲル緩衝液のｐＨが、ゲル緩衝液において使用される塩基のｐＫ値よりも少なくとも１のｐＨ単位、好ましくは、１．５ｐＨ単位だけ低いという用件を満たすことが必要である。必要な注意をおこたると、アクリルアミドの５−１０％もとかなりのものが、重合したゲルで変換されずに存在するであろう。パターソン，エス・ディ（Patt erson，S.D.）（１９９４）アナル・バイオケム(Anal．Biochem.)２２１、１−１５に記載されるごとく、蛋白質は、ＳＤＳ電気泳動と関連して変換されないアクリルアミドと反応するが、メルカプトエタノールおよびジチオスレイトールもアクリルアミドと反応する。かなりの量のアクリルアミドが存在する場合には、還元剤は、電気泳動分離の初期の段階で消費されるであろう。以下に明白にされるように、ペプチドの通過に先立ち、還元剤がゲルを通り抜けることが、ＳＤＳ−電気泳動と関連して必要である。本発明の適当な実行のために、かくして、重合したゲルにおけるアクリルアミドの量を最小とする重合条件が用いられることが必要である。重合に先立ち溶液から酸素を十分に除去することは、この見地から非常に好ましい。過硫酸−ＴＥＭＥＤ系が、重合開始剤として用いられる場合には、室温重合が用いられてよいが、一般的に、高い温度（４０−５０℃）が有利である。ＵＶ−開始剤またはγ−照射での重合は、重合反応におけるモノマーの高い変換を確実とする他の手段である。トレイリングイオンは、ｐＫ＞９.４の弱酸または、分離ゾーンにおいて展開されるｐＨにおいてより少ない負の電荷を有し、部分的に中和された塩基部分のｐＫが９.４−１１.０の範囲にある両性電解質に対応する。適当な両性電解質の例は、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ヒスチジン、リジン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸である。各場合にどの酸または両性電解質を選択するかは、分離されるべき成分の電気泳動移動度および、ゲル緩衝液に含まれる塩基のｐＫ値に依存する。高い電気泳動移動度の蛋白質およびペプチドに関しては、または、特にＳＤＳ電気泳動については、分子量が１０ ,０００ダルトン以下のペプチドに関しては、酸または両性電解質のイオン化の程度は、高くあるべきであり、弱酸または両性電解質のｐＫ値は、塩基のｐＫ値と比較して、低いかいくらか匹敵するものである。ラエムリ(Laemmli)の緩衝系は、約１０,０００ダルトンないし約３００,０００ダルトンの分子量の範囲にあるペプチドの分離に適当であり、このタイプの分離のためには、弱酸または両性電解質は、塩基のｐＫ値よりも、０.４ないし１.７ｐＨ単位高いｐＫ値を有するべきである。天然の蛋白質は、ＳＤＳペプチドコンプレックスよりも低い電気泳動移動度を有し、天然の分離のためには、酸または両性電解質と、塩基の間のｐＫの相違が、１−２ｐＨ単位の間にあることが通常適当である。分離によってカバーされるＲ_f値および分子量の範囲は、ゲル緩衝液の陰極溶液に酸または両性電解質を含ませることによりまた影響される。この含有の効果は、Ｒ_f値を減少させ、分離ゲルにおける所与のポリアクリルアミド濃度で選択された両性電解質および塩基によって可能であろうものよりも、低い分子量のペプチドが分離されることを可能とする。陰極溶液は、トレイリングイオンの源として働き、ＳＤＳ電気泳動の場合には、硫酸ドデシルイオンの源としても働く。ｐＫ＞９.４である酸または両性電解質および硫酸ドデシルに加えて、陰極溶液は塩基を含むべきである。塩基の主たる目的は、電気泳動の泳動の間に、ポリアクリルアミドゲルに適用される硫酸ドデシルに対するトレイリング成分の比の激しい変化を防ぐために陰極溶液のｐＨにおいて緩衝能力を提供することである。ゲル緩衝溶液に含まれる塩基は、１の適当な選択を示すが、実際には、ｐＫ＞７のいかなる塩基を用いてもよい。多くの場合、トリスは非常に適当な選択である。陽極溶液は、ゲル緩衝液に存在するｐＫ＞８.８の塩基の源として役立つ。塩基以外に、陽極溶液は、塩基が緩衝能に関して貢献するｐＨ値に、または、代わりに、５ないし７の範囲のｐＨ値に溶液を滴定する成分を含むべきである。塩基が、緩衝能に貢献するｐＨにおいて、滴定する成分は、陰極溶液で使用される酸または両性電解質であるがゲル緩衝液に含まれる酸のいずれかである。滴定が低いｐＨ値をもたらす場合、滴定成分が陽極溶液のｐＨよりも低いｐＨ値で緩衝能を有することが必要で、適当な滴定剤は、例えば、ギ酸または酢酸である。ポリアクリルアミドゲルは常に酸化し、これは、過硫酸−ＴＥＭＥＤが重合触媒として用いられる場合だけでなく、徹底的に脱気した溶液がＵＶ開始剤によって重合する場合もそうである。ＳＤＳ電気泳動において、蛋白質を、試料の適用に先立ち、−Ｓ−Ｓ−架橋を破壊するように還元する。ペプチド−ＳＨ基は、当然払われるべき注意をおこたると、電気泳動分離間に酸化され、内部−Ｓ−Ｓ− 架橋が形成されるであろう。どちらの場合にも、結果は、関与するペプチドの変化した電気泳動移動度となる。使用する場合、スタッキングゲル内で起こる酸化は、得られたペプチドパターンに過剰な人工的バンドを与え、一方、分離ゲル中の酸化は、分離したペプチドバンド間におけるバックグラウンドを増加させる。大量のチオールを、ＳＤＳ電気泳動で用いられるべきゲルの頂部に、試料とともに添加する。標準的な処方で用いられるメルカプトエタノール濃度は５％であり、一方、ラエムリ(Laemmli)の緩衝系と組み合わせて用いることが通常推奨されるジチオスレイトール濃度は１.５％である。見逃されるが、多分重要なラエムリの緩衝系の特徴は、トレイリングゾーンの高いｐＨである。ジチオスレイトールと同様メルカプトエタノールは、グリシンよりも高い電気泳動移動度を有し、塩素を含むゾーンの後ろの境界の後ろでスタックするであろう。還元剤は、スタッキングゲル中において、おそらくＳＤＳペプチドコンプレックスより速いであろうし、ペプチドの前にポリアクリルアミドゲルを通り抜け、ゲルに含まれる酸化基を減少させ、この作用を通じ、ペプチドのチオール基の再酸化を最小とするであろう。本発明の緩衝系によって達成されるよい品質の結果のもっともらしい説明は、トレイリングゾーンにおける高いｐＨであり、これは、ジチオスレイトールと同様メルカプトエタノールが、スタッキングおよび分離ゲルにおけるペプチドの前にゲルを通る移動を確実とする。これは、ＳＤＳ電気泳動のための保存安定ゲルにおいて得られる従来記載されたアプローチのいずれにも当てはまらない。本発明で用いられるゲルは、文献記載の通常の方法によって製造される。本発明は、電気泳動で用いられる特別な幾何学的形のいずれにも限定されないが、キャピラリーの幾何学的形と同様に、垂直スラブゲル、水平スラブゲル、垂直ロッドに適合させ、これらと共に用いることができる。電気泳動を平行して多くの試料についてスラブゲルで泳動させる場合、試料における高い塩濃度を避けることが一般的に推奨される。試料と共に適用される塩の量の変化は、分離の間の電場のゆがみという結果になる。通常、高濃度のメルカプトエタノールが、ＳＤＳ電気泳動の試料において用いられる。メルカプトエタノールの移動度は、グリシンの移動度よりわずかに高く、ラエムリ(Laemmli)の緩衝系において、メルカプトエタノールゾーンとトレイリンググリシンゾーン間には、あまり重要でない電導度の相違しかない。この系およびメルカプトエタノールの移動度がトレイリング成分の移動度より低い緩衝系においては、メルカプトエタノールの負荷の変化は、スラブゲルを用いた場合にはたいして影響しない。本発明による緩衝系では、トレイリング成分の移動度が、メルカプトエタノールの移動度に匹敵するか、あるいはそれより高い場合には問題は生じない。低い移動度のトレイリング成分、場のゆがみを避けたければ、例えば、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸については、匹敵する量のメルカプトエタノールを、スラブゲルの異なる試料レーンに適用するべきである。アミド基の加水分解がゆっくりであり、溶液に含まれるアミンまたは可能な両性電解質のいずれもアクリルアミドまたはアクリルアミド誘導体と反応しないであろうｐＨ値にまで滴定されるので、ゲルの重合のために用いられる溶液は、重合触媒の添加に先立ち、保存安定である。既製ゲルに代わるものは、電気泳動分離のために使用される幾何学的形へ溶液を注ぎ込むに先立ち使用者が添加する触媒以外は、ゲルを生産するための全ての成分を含む溶液を提供することにある。ＵＶ開始が用いられる場合には、ＵＶ開始剤もまた溶液に含ませることができる。以下の実施例において、本発明の緩衝系によって達成される結果は、ラエムリ (Laemmli)の緩衝系の結果と同様の保存安定ゲルを与える従来記載の緩衝系で達成された結果と比較される。実施例の目的は、得られた利点を明らかに例示することであり、本発明の見地を制限する意図では決してない。実施例１以下に記載される実験のためには、垂直スラブゲル電気泳動のための小さい通常のユニットを用いた。該装置は、２つのゲルを平行して泳動させることができる。使用したスペーサーは０.７５ｍｍの厚さであり、ゲルは、１０５ｍｍ×１００ｍｍの大きさの、くぼみのある平たいガラスのプレートの間に作られた。８０ｍｍの高さの分離ゲルは、１２.１２５ｇアクリルアミド／１００ｍｌ、０.３７５ｇＢＩＳ／１００ｍｌを含む溶液および表１に示される緩衝組成物から作られた。ＤＥ−Ａ−４１２７５４６およびＥＰ−Ａ−０５０９３８８に記載されるトリスおよびタウリンを組み合わせた緩衝系では、ラエムリ(Laemmli)の緩衝系で得られるものに匹敵するパターンが得られない。タウリンは、この相違を補うために、図１ｂで説明される系のゲル緩衝液に含められてきた。２−アミノ− ２−メチル−１,３−プロパン−ジオールおよびタウリンを組み合わせた緩衝系は、ラエムリ(Laemmli)の緩衝系に匹敵する結果を与えるように調整することができず、上述のＵＳ−Ａ−４,４８１,０９４に記載される緩衝系との比較は、この理由のために省略した。図１ｆで示されるゲルは、水可溶性ＵＶ開始剤の助けによって重合した；全ての他のゲルに対し化学重合を用いた。重合に先立ち、溶液から、窒素気泡によって酸素を徹底的に除去した。２５０ｐｐｍの過硫酸アンモニウムおよび２５０ｐｐｍのＴＥＭＥＤを重合触媒として添加した。分離ゲルを窒素保護下で作り、３０−６０分室温にて重合させた。２０ｍｍ高のスタッキングゲルを、分離ゲルの頂部に次いで作った。スタッキングゲルは３.８８ｇのアクリルアミドおよび０. １２ｇビス／１００ｍｌ溶液を含み、対応する分離ゲルにおいても同じ緩衝液組成であった。５００ｐｐｍの過硫酸アンモニウムおよび５００ｐｐｍのＴＥＭＥＤを触媒として用いた。１０ｍｍの深さで６ｍｍの幅の試料適用スロットを、ゲル形成の着手に先立ち位置に挿入したプラスチックコームの助けを借り、作った。用いた試料は、商業的な分子量マーカー混合物（表２）およびヒト・成長ホルモンであった。新たに調整した試料を、５％ β−メルカプトエタノール、１０％ＳＤＳ、５％グリセロールおよび０.０５％ブロモフェノールブルーを含む０. ３７５Ｍトリス−Ｃｌ溶液ｐＨ８.８中に可溶化した。試料溶液を９５℃に４分かけてした。試料は、メルカプトエタノールを１.５％ジチオスレイトールに置き換えても作られた。新たな試料に加え、２つの以前に調整した値試料を使用した。還元に先立ち９５℃にて添加した溶液は、１％のジチオスレイトールを含み、還元を、５倍高い蛋白質濃度において行った。還元後、試料の一部を、試料緩衝液、ＳＤＳ、グリセロールおよびブロモフェノールブルーを含むが、還元剤を含まない溶液で５倍に希釈した。還元された溶液の他の部分を、試料、ＳＤＳ、グリセロール、ブロモフェノールブルーおよび１％ヨードアセトアミドを含む溶液で５倍に希釈した。これらの試料を、冷凍庫（−１６℃）で保存し、繰り返し用いた。ヨードアセトアミドは蛋白質の−ＳＨ基をアルキル化し、この方法で、−Ｓ−Ｓ−架橋から保護する。アルキル化されたペプチドの電気泳動移動度は、対応する還元されたペプチドの移動度と同一かまたはわずかに低い。電気泳動に先立ち、プラスチックのコームをゲルから取り、ゲルを装置に据え付けた。陽極および陰極の電極チャンバーを、表１に明示する溶液で満たした。４μｌの試料を、上部の陰極溶液を通し、試料スロットに添加した。実験を、３０ｍＡの定電流（２つのゲル）で泳動し、ブロモフェノールブルーがゲルの底部の端に達したところで終了した。蛋白質を、４０％エタノール、１０％酢酸溶液中で固定した（３０分）。ゲルを次いで３０％エタノール、酢酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウムおよびグルタールアルデヒドを含む溶液内で６０分間インキュベートし、水中で３×５分洗浄し、硝酸銀溶液中でインキュベート（４０分間）し、０.１％ホルムアルデヒドを含む炭酸ナトリウム溶液中で現像した。得られた現像ゲルを図１ａ−１ｇに示す。図は、トレイリングゾーンの、得られたｐＨ値が図１ａから図１ｇの順に増加するように並べられている。トレイリングゾーンがｐＨ約８.１であるトリス−酢酸／トリス−トリシン系（図１ａ）において、ヒト・成長ホルモンは過剰なバンドを与え、ウシ・血清アルブミン、オブアルブミンおよびダイズ・トリプシン阻害剤もまた徹底的に影響を受けている。影響を受けないペプチドのうち、ウシ・炭酸脱水酵素は−ＳＨ基を含まないことが公知である。トリス−酢酸−タウリン／トリス−タウリン系（図１ｂ）において、血清アルブミンおよびオブアルブミンの効果はまだ存在しているが、あまり明確でない。トリプシン阻害剤は完全に酸化された。トリス−塩素−グリシン／トリス−グリシン系(図１ｃ)においては、トリプシン阻害剤が酸化された。ジチオスレイトールはトリス−塩素−グリシン／トリス−グリシン系におけるよりも高い電気泳動移動度を有し、図１ｈは、抗トリプシン阻害剤の移動度より高い電気移動度を有する還元剤とともに現れる相違を図示するように包含される。本発明の緩衝系（図１ｅ−１ｇ）と同様ラエムリ(Laemmli)の緩衝系（図１ｄ）についても、全てのペプチドが還元した形で維持されている。トレイリング成分としてのβ−アラニンと共に、試料と共に適用されたメルカプトエタノールの相違は、図１ｇに示されるような顕著な電場のゆがみを作り出した。

Claims

【特許請求の範囲】１．分離ゲル緩衝液が８.８またはそれ以上のｐＫを有する塩基およびゲル緩衝液のｐＨを８より低いｐＨ値に滴定する酸を含み、陰極溶液がｐＫ値が９.４またはそれ以上の両性電解質または弱酸を含むことを特徴とする、不連続ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うための緩衝系。２．分離ゲル緩衝液のｐＨ値が、該塩基のｐＫ値より少なくとも１のｐＨ単位、好ましくは少なくとも１.５ｐＨ単位低い値である請求項１記載の緩衝系。３．分離ゲル緩衝液のｐＨ値が７.５以下である請求項１または２記載の緩衝系。４．陽極溶液が、８.８またはそれ以上のｐＫ値の該塩基を含む請求項１、２または３記載の緩衝系。５．陽極溶液が、さらに、存在する塩基が緩衝能に貢献するｐＨ値に、または、約５ないし約７の範囲のｐＨ値に滴定する成分を含む請求項４記載の緩衝系。６．陰極溶液が７またはそれ以上のｐＫ値を有する塩基を含む請求項１ないし５のいずれか一項記載の緩衝系。７．分離ゲル緩衝液に、陰極溶液に存在する弱酸または両性電解質を含めた請求項１ないし６いずれか一項記載の緩衝系。８．陰極の該弱酸または両性電解質が、分離ゲル緩衝液の該塩基のｐＫ値より低いか、またはほぼ等しいｐＫ値を有する、分子量が１０，０００ダルトンより少ない蛋白質およびペプチドの分離のための請求項１ないし７いずれか一項記載の緩衝系。９．陰極溶液の該弱酸または両性電解質が、分離ゲル緩衝液における該塩基のｐＫ値よりも約０.４ないし約１.７ｐＨ単位高いｐＫ値を有する、約１０,０００ないし約３００,０００ダルトンの範囲の分子量の蛋白質およびペプチドの分離のための請求項１ないし７いずれか一項記載の緩衝系。１０．該電気泳動がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）電気泳動である請求項１ないし９いずれか一項記載の緩衝系。１１．陰極溶液の該弱酸または両性電解質のｐＫ値が、分離ゲル緩衝液の該塩基のｐＫ値より約１ないし約２ｐＨ単位高い、天然の蛋白質およびペプチドの分離のための請求項１ないし９のいずれか一項記載の緩衝系。１２．分離ゲル緩衝液中の該塩基が、アンモニア、所望によりアルキル基で置換された第一級、第二級および第三級アミン、１または２のヒドロキシル基を含むアミン、およびアミド基を含むアミンより選択される、請求項１ないし１１のいずれか一項記載の緩衝系。１３．分離ゲル緩衝液における該塩基が、ジエタノールアミン、エチルジエタノールアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ,Ｎ−ジエチルエタノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、Ｎ,Ｎ−ジエチルアミノ−２,３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチルプロパノール、Ｎ−ピペリジノプロピオンアミド、Ｎ−ピロリジノプロピオンアミドおよびＮ, Ｎ−ジエチルアミノプロピオンアミドから選択される請求項１２記載の緩衝系。１４．陰極溶液の該両性電解質が、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ヒスチジン、リジン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択される請求項１ないし１３のいずれか一項記載の緩衝系。１５．陰極溶液の該酸が、塩酸、リン酸、硫酸、ギ酸および酢酸から選択される請求項１ないし１３いずれか１項記載の緩衝系。１６．請求項１ないし１５のいずれか一項の緩衝系を用いることからなる、不連続ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う方法。