JPH0366699A - タンパク質の分離精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、所要のタンパク質を変性させることなく可溶
化し、生体機能をそこなわずに純度よく分離精製する方
法に関するものである。

従来の技術 高純度タンパク質は単にタンパク質の機能と構造を研究
する上で重要であるばかりでなく、薬学、工学の分野に
おいても広く用いられている。特に生体膜タンパク質は
生体機能を維持するのに不可欠のもので、極性脂質、中
でもその大部分を占めるリン脂質の二重膜中に挿入され
た状態で生体膜を主に構成している。

生体膜タンパク質、例えば赤血球膜グリコホリン、大腸
菌外膜ポリン、チトクロムｂ　ｓ　（Ｎａ”、Ｋ“）Ａ
ＴＰａｓｅ、　（Ｃａ”）ＡＴＰａｓｅ、　（Ｈ”）Ａ
ＴＰａｓｅなどの多くはそれ自体難水溶性であり、水溶
性球状生体膜タンパク質とは異なり分離精製の第一段階
として生体膜タンパク質を可溶化する必要があり、その
ため脂質二重層と類似の環境性を有する媒質、例えばア
セトン、ブタノール、エタノール、ピリジン等の各種有
機溶媒や、ドデシル硫酸ナトリウムのようなアニオン性
界面活性剤、トリメチルドデシルアンモニウムクロリド
のようなカチオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンド
デシルエーテルのような非イオン性界面活性剤等の界面
活性剤の水溶液が用いられている。

しかしながら、有機溶媒の多くは生体膜タンパク質に対
し強力な変性剤として働くため、生体機能をそこなうこ
となく生体膜タンパク質を分離精製することが困難な場
合が多い。

また、従来生化学分野で用いられる非イオン性界面活性
剤は臨界ミセル濃度が低く、分離生成後生体膜タンパク
質に結合した界面活性剤を透析によって除去することが
困難である。

また、アニオン性界面活性剤としてアルキル硫酸塩を用
いたものが知られているが（特開昭６１３６２９６号公
報、特開昭６２−２２７９６号公報）、このものは加水
分解の影響を受けやすく、条件が制約されるのを免れな
いし、また、アルキルベンゼンスルホン酸塩、σ−オレ
フィンスルホン酸塩などのスルホン酸塩を用いたものも
知られているが（特開昭６１−７６５００号公報）、こ
れは加水分解の影響は受けにくいものの、鋭敏な生体膜
タンパク質によっては、生体膜タンパク質変性を起こし
てしまうなどの欠点がある。タンパク変性能の低いアニ
オン性界面活性剤として胆汁酸塩を用いることは可能で
あるが、これは生体界面活性剤に属し、工業的に量産で
きないという欠点がある。

また、カチオン性界面活性剤は、むしろ生体膜を構成す
る脂質との結合が他の界面活性剤より強く生体膜タンパ
ク質に対する変性作用も弱くはないので、殺菌剤として
用いられることは多いが、生体膜タンパク質の分離精製
に用いた例は少なく適用範囲が制限されるのを免れない
。

他方、生体膜タンパク質自身の物理化学的特性に着目し
た分離精製法としては、熱あるいはｐＨ処理法、分画沈
でん法、吸脱着法、イオン交換体によるクロマトグラフ
ィー法、等電点分画法、密度勾配遠心法、電気泳動法、
アフィニティークロマトグラフィー法、分子ふるい法、
二相分配法、結晶化法などがあるが、これらはいずれも
一長一短があって必ずしも十分満足しうるものとはいえ
ない。

発明が解決しようとする課題 本発明は、このような従来のタンパク質分離精製法のも
つ欠点を克服し、所要の生体膜タンパク質及び水溶性タ
ンパク質などのタンパク質を変性させることなく可溶化
し、生体機能をそこなわずに再現性よく高純度に分離精
製しうる方法を提供することを目的としてなされＩこも
のである。

課題を解決するための手段 本発明者らは、前記の好ましい特徴を有するタン、＜り
質の分離精製法を開発するために種々研究を重ねた結果
、特定のアニオン性界面活性剤の単独か、あるいはこれ
と、イオン種の異なるカチオン性界面活性剤及び両性界
面活性剤の中から選ばれた少なくとも１種又は２種の界
面活性剤との混合物を用いることにより、その目的を達
威しうろことを見出し、この知見に基づいて本発明を完
成するに至った。

すなわち、本発明は、−数式 ％式％（１） （式中、Ｒは炭素数６〜２２のアルキル基又はア（１）
（式中、Ｒは炭素数１〜４の炭化水素基、Ｑ及びｍはそ
れぞれ０〜２０．１２＋ｍは１〜４０．ｎは２〜４であ
り、Ｍはアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウ
ム又は第４級アンモニウムである） で表わされるスルホン酸系界面活性剤の単独系、で表わ
されるスルホン酸系界面活性剤と、カチオン性界面活性
剤及び両性界面活性剤の中から選ばれた界面活性剤の少
なくとも１種との混合系の存在下に、タンパク質をゲル
電気泳動処理することを特徴とするタンパク質の分離精
製法を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明方法により分離精製されるタンパク質は、動物臓
器、培養細胞、微生物細胞、植物細胞等から抽出、可溶
化されるタンパク質であれば特に制限されず、例えばＡ
ＴＰａｇｅ、ラクトグロブリンなどが挙げられる。

本発明に用いるアニオン性界面活性剤を表わす式（１）
中のＲは炭素数１０〜１４、Ｑ及びｍは０〜１Ｏ１Ｑ＋
ｍは３〜１５、ｎは２〜３が好ましく、Ｍはアルカリ金
属、アルカリ土類金属、アンモニウムなどが好ましく、
特にナトリウム、アンモニウムが好ましい。

本発明に用いるカチオン性界面活性剤としては、例えば
それぞれ炭素数が８〜２２の長鎖アルキル基を有する長
鎖アルキルトリ短鎖アルキル第４級アンモニウム塩、長
鎖アルキルジ短鎖アルキルベンジル第４級アンモニウム
塩などの第４級アンモニウム塩類、長鎖アルキルアミン
塩、長鎖アミンオキシドなどを挙げることができ、中で
も、短鎖アルキル基の炭素数が１〜３のモノ長鎖アルキ
ルトリ短鎖アルキル第４級アンモニウム塩、長鎖アルキ
ル基の炭素数がｔｏ−１８のアミンオキシドが好ましい
。

これらの第４級アンモニウム基の対イオンとしては、ハ
ロゲンイオン、モノアルキル硫酸根が好ましく、特に塩
素イオン、臭素イオンが好ましい。

これらの界面活性剤として、具体的には、ドデシルトリ
メチルアンモニウム塩（クロリド塩、モノメチル硫酸塩
）、ドデシルジメチルアミンオキシド、ヘキサデシルジ
ェタノールアミンオキシドなどが例示される。

本発明に用いる両性界面活性剤としては、例えば長鎖ア
ルキルジアルキルベタイン、２−長鎖アルキルイミダゾ
リン誘導体、長鎖アルキルジアルキルスルホベタインな
どを挙げることができ、中でも長鎖アルキル基の炭素数
が１０〜１４の長鎖アルキルジアルキルベタインが好ま
しく、具体的には、ドデシルジメチルベタイン、テトラ
デシルジメチルスルホベタインが挙げられる。

本発明においては、前記式（Ｉ）の特定のアニオン性界
面活性剤単独でも差し支えないが、好ましくは該アニオ
ン性界面活性剤と、カチオン性界面活性剤及び両性界面
活性剤の中から選ばれた少なくとも１種の界面活性剤と
を併用し、混合系とするのが望ましい。

本発明のこのような界面活性剤を用いることにより、初
めてドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略称する
）などのアニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤
や両性界面活性剤の単独使用によって生じるタンパク質
の変性等の不利益が解消されるのである。その作用機構
の詳細は不明であるが、前記特定のアニオン性界面活性
剤の蝉性又は前記混合系界面活性剤のイオンコンプレッ
クスが何らかの形で関与しているものと推定される。

本発明において、前記アニオン性界面活性剤とカチオン
性界面活性剤との混合系を用いる場合は、それらの混合
比は、好ましくはモル比で９５１５〜５０１５０、特に
９０／ｌｏ〜７０／　３０の範囲で選ばれる。

特に、ポリオキシエチレン（平均付加モル数８）ラウリ
ルエーテルプロピオスルホン酸ナトリウムに対してドデ
シルトリメチルアンモニウム塩を混合して用いる場合は
、それらの混合比はモル比で９０／１０が極めて好まし
い。

本発明において、前記アニオン性界面活性剤と両性界面
活性剤との混合系を用いる場合は、それらの混合比は、
好ましくはモル比で９５１５〜５０１５０、特に９０／
１０〜６０／４Ｑの範囲で選ばれる。特に、ポリオキシ
エチレン（平均付加モル数８）ラウリルエーテルプロピ
オスルホン酸ナトリウムに対して長鎖アルキルジメチル
アミンオキシドを混合して用いる場合は、それらの混合
比はモル比で７０／３０が極めて好ましい。

本発明においては、上記の界面活性剤の存在下にタンパ
ク質をゲル電気泳動処理に付すことＩこより、タンパク
質が分離精製される。

このゲル電気泳動処理に代えて液体クロマトグラフィー
処理を適用することもできる。

このゲル電気泳動法としては、タンパク質の分離精製に
通常用いられている方法であれば特に制限されない。ゲ
ル電気泳動法の支持体としては、例えばポリアクリルア
ミドゲル、セルロースアセテート、セファデックス、塩
化ビニル−酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、デン
プン粒、デンブンゲル、アガロースゲルなどが用いられ
るが、中でもポリアクリルアミドゲルが化学的に安定で
あり、ゲル濃度、架橋度を自由にコントロールすること
ができるので孔径等を自由に変えられ、電気浸透性がな
く、ｐＨ及び温度変化による変化も少なく、自由な型に
成形でき、しかも再現性が非常によいなど多くの利点を
有しているので特に好ましい。

このポリアクリルアミドゲルを調製するには、好ましく
はアクリルアミドを１〜３０重量％、Ｎ、Ｎ”メチレン
ビスアクリルアミドをアクリルアミドに対し０．０５〜
１０重量％及び本発明の界面活性剤を０．０１〜１％重
量％含有する水溶液を調製したのち、重合反応により上
記水溶液をゲル化させるなどの方法が用いられる。この
好ましいゲルにおいては、アクリルアミドとＮ、Ｎ’−
メチレンビスアクリルアミドがアクリルアミドの総量が
３〜１５重量％（以下、％と略称する）で、しかもＮ、
Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドがアクリルアミドに
対して１〜５％の範囲の割合で選ばれる。また、前記界
面活性剤濃度は０．０５〜０．２％が特に好ましい。な
お、上記水溶液に重合用触媒、重合促進剤、ｐＨ緩衝剤
、防腐剤等を混合してゲル化することも可能である。

重合用触媒としては、例えば蛍光灯などの光によって重
合を開始させる場合には、リボフラビンなどが、また室
温で重合を開始させる場合には、過硫酸アンモニウムな
どが任意の量で、好ましくは０．０４〜０．１２％の範
囲で用いられる。重合促進剤としては、例えばＮ、Ｎ、
Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンが任意の
量で、好ましくは０．１−０．５％の範囲で用いられる
。溶存酸素がゲル化を阻害する場合があるので、脱気あ
るいはゲル化時に水溶液の上層部をさらに水で覆い、空
気と水溶液が接触しないようにするのが望ましい。ｐＨ
緩衝剤としては、例えばリン酸二水素ナトリウム−リン
酸水素二ナトリウム系、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナト
リウム系などが用いられ、その濃度は１０〜５００ｍＭ
。

好ましくは５０〜２００ｍＭに調整される。

電気泳動処理は、通常１〜４０℃、好ましくは４〜２０
℃の温度で、４〜９、好ましくは６〜８のｐｔ＋下に行
われる。この温度が０℃以下になるとゲル中の水分が凍
る場合があり、また４０℃を超えるとタンパク質が熱変
性し機能をそこなう場合があるので好ましくない。また
、ｐＨが４未満や９を超えると、酸・アルカリ変性が起
きる場合があり、やはり好ましくない。

また、前記ポリアクリルアミドゲルなどの支持体の両端
を緩衝液で満たすのがよい。この緩衝液は、通常ポリア
クリルアミドゲル製造用の水溶液に含まれる緩衝剤、界
面活性剤及び水から構成される。緩衝剤及び界面活性剤
の濃度は、ポリアクリルアミドゲル製造用水溶液におけ
るものと同様であるのが望ましい。

次に、処理されるタンパク質は、通常水溶液の形態で用
いられる。この水溶液中には、本発明の界面活性剤が通
常０．１〜１０％、好ましくは０．２〜３％、より好ま
しくは０．５〜２％の範囲で含有されている。また、こ
の水溶液には、ゲル及び緩衝液中の緩衝剤を含有させる
こともでき、その濃度は通常５００ｍＭ以下で、しかも
緩衝液中の緩衝剤濃度以下であるのが好ましく、特に緩
衝液中の緩衝剤濃度の１／２〜１／２０の割合であるの
が好ましい。

発明の作用、効果 本発明方法によれば、タンパク質変性能の極めて低い特
定の界面活性剤を用いているので、変性しやすいタンパ
ク質にも適用でき、従来の非イオン性界面活性剤を用い
るゲルろ適法の場合のように大量の溶媒を必要とするこ
とがない上に、本発明の界面活性剤は、非イオン性界面
活性剤に比べ臨界ミセル濃度が高いので透析や電気透析
により界面活性剤を容易に除去できるとともに、アニオ
ン部がスルホネート構造であるので水溶液状態でのｐＨ
が中性域からはずれてもサルフェート構造などを有する
界面活性剤と比べて加水分解されにくいなどの顕著な効
果を奏する。

特に、本発明において、混合系の界面活性剤を用いた場
合は、該界面活性剤のタンパク質変性能は非イオン性界
面活性剤と同等で極めて低い上に、可溶化されたタンパ
ク質にはそれぞれ固有量の界面活性剤が結合しており、
それぞれ異なる陰電荷数を有するタンパク質−界面活性
剤複合体となっているので、これらが電気泳動支持体中
を陽極に向ってそれぞれ固有の速度で移動し、その際該
支持体による分子ふるい効果が加わるので、従来の非イ
オン性界面活性剤によって可溶化されたタンパク質のゲ
ルろ適法に比べてはるかに分離精製能が向上するという
利点がある。

実施例 次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

以下にポリアクリルアミドゲルを用いてゲル電気泳動に
よりイヌ腎（Ｎａ”、Ｋ”）ＡＴＰａｓｅあるいはβ−
ラクトグロプリンの分離精製を行った。

なお、分離精製後のＡＴＰａｓｅ活性及び分離精製の度
合は以下のようにして求めた。

ＡＴＰａｇｅ活性の判定 ４ｍＭＡＴＰ、　１００ｍＭＮａＣｌ２．２５ｍＭＫＣ
ｌ２１３．９ｒａＭＭｇＣＱｓ及び０．２＋＋＋ＭＥＤ
ＴＡを含む３０ｍＭイミダゾール／３０ｍＭグリシルグ
リシン緩衝液（ｐＨ７，２，２０℃）中に、適量の大豆
由来リン脂質を加え、３７℃、２．５〜４分間処理し、
次いで高濃度のＳＤＳ水溶液を加えることによって反応
を終了させた。しかる後、無機リン酸の生成の有無をＨ
ｅｇｙｖａｒｙらの方法［Ａｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　。

９４、　ｐ、３９７〜４０１（１９７９）］に準じて判
定した。

分離精製の度合 ゲル電気泳動終了後、ゲルを取り出し、スラブ式二次元
電気泳動装置を用いて、従来行われている５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行うことにより判定した
。すなわち、（Ｎａ”、Ｋ”）ＡＴＰａｓｅはａとβの
分子量の異なるサブユニットからなり、これらが数個集
合してオリゴマーを形成しているとか知られており　［
Ｙ、Ｈａｙａｓｈｉ　ｅｔａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、、　７４８．　ｐ、１５３
〜１６７（１９８３）］　、純粋な（Ｎａ”、につＡＴ
Ｐａｓｅに対して５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行うとσとβに対応する２本のバンドが得られ、
それ以外のバンドは得られない。したがって、第３のバ
ンドの有無を測定することにより、分離精製の度合を判
定した。

なお、次の略号を用いた。

ＰＯＥ　：ポリオキシエチレン Ｐ：平均付加モル数 ｐｏｐ　：ポリオキシプロピレン 実施例１ ヨルゲンセン（ＪＩｒｇｅｎｓｅｎ）の方法［Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、、　３５６．　ｐ３６〜５
２（１９７４）］で精製した（Ｎａ”、Ｋ”）ＡＴＰａ
ｓｅを用い、ＰＯＥ（Ｐ８）ラウリルエーテルプロピオ
スルホン酸ナトリウム／ドデシルトリメチルアンモニウ
ムクロリド（モル比９０／　１０）の存在下で一次元目
の、従来行われているＳＯＳ存在下で二次見目のポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行った。−次元及び二次元
のポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したゲル組成、
緩衝液組成をそれぞれ下記の第１表及び第２表に示す。

第　　　１　　　表 アクリルアミド Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド過硫酸アンモニ
ウム Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチレンジアミンリン酸
緩衝液（ｐＨ７） 界面活性剤 水 第　　　２　　　表 リン酸緩衝液（ｐＨ７） 界面活性剤 水 ５％ ２．７％ ０．０７％ ０．１５％ ００ｍＭ ０．１％ バランス ００ｍＭ ０．１％ バランス ゲル電気泳動は、以下のとおり行った。

前記ＡＴＰａｓｅを次の諸条件を満たす水溶液に調整し
て試料溶液とした。

前記条件は、ＡＴＰａｓｅ濃度０．１ｍｅ以上、緩衝液
濃度０．１Ｍ以下で、かつ前記界面活性剤重量濃度がタ
ンパク質の数倍であるものとする。

この試料溶液を前記ゲルの上端に重層したのち、７ｍＡ
の電流を９０分間流した。〔例えば、Ｊ、Ｖ、Ｍａｉｚ
ｅｌ。

Ｊｒ、、　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

（１９７１）、　Ｐ、１０９　、　　日本化学会編、高
木俊夫、三宅淳、′新実験化学講座２０巻生物科学Ｉ”
、丸善（１９７８）、　ｐ、１０９など参照、ただし、
本発明による混合系界面活性剤を用いる場合には、Ｓ−
Ｓ結合解裂剤は加えず、ＳＤＳを本発明における界面活
性剤に読み替える必要がある。］ その結果、明瞭な２本のバンドが得られた。同時にゲル
電気泳動を行い、明瞭な２本のバンドに相当する部位に
含まれるタンパク質（染色処理施さず）をゲル外に泳動
させたのち、ＡＴＰａｓｅ活性の有無を判定したところ
、陽性であった。また、同様の操作を行ったゲルを取り
出し、スラブ式二次元電気泳動装置を用いて、従来前わ
れているＳＤＳ　−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行ったところ、２本のバンドからそれぞれにσとβに対
応する２つのスポットが得られ、それ以外のスポットは
認められなかった。この場合、−次元と二次元ゲル電気
泳動においてバンドの移動度に差が認められた。また、
このものについて、ＡＴＰａｓｅ活性の有無を判定した
ところ活性は陰性であった。これは本発明による混合系
界面活性剤とＳＤＳとではａ１βのサブユニットの流体
力学的性質に及ぼす効果に差があることを示すものであ
る。すなわち、本発明によるポリアクリルアミドゲル電
気泳動で得られた２本のバンドは、σとβであり、再構
成することにより生体機能を回復することが分る。

実施例２ 実施例１における界面活性剤に代えてＰＯＥ（Ｐ　７　
）ラウリルエーテルプロピオスルホン酸ナトリウム／ド
デシルジメチルアミンオキシド（モル比７０／３０）を
用いたこと以外は実施例と同様の操作を行った。

ただし、本発明によるポリアクリルアミドゲル電気泳動
において（Ｎａ”　、　Ｋ”　）ＡＴＰａｓｅの泳動速
度は用いる界面活性剤によって異なるため、あらかじめ
予備試験を行い、目的とする膜タンパク質の泳動位置を
求めておいた。その結果、（Ｎａ“、Ｋ”）ＡＴＰａｓ
ｅ活性は陽性であり、純度も極めて良好であった。

実施例３ 実施例１における界面活性剤に代えてＰＯＥ（Ｐ３）Ｐ
ＯＰ（Ｐ　３　）ラウリルエーテルプロピオスルホン酸
ナトリウム／ドデシルジメチルアミンオキシド（モル比
６５／３５）を用いたこと以外は実施例１及び２と同様
の操作を行った結果、（Ｎａ”、Ｋ”）ＡＴＰａｓｅ活
性は陽性であり、純度も極めて良好であった。

実施例４ 実施例１における界面活性剤に代えてｐｏＥ（Ｐ　３　
）ラウリルエーテルプロピオスルホン酸ナトリウム／ド
デシルジメチルベタイン（モル比６５／３５）を用いた
こと以外は実施例１及び２と同様の操作を行った結果、
（Ｎａ”、につＡＴＰａｓｅ活性は陽性であり、純度も
極めて良好であった。

実施例５ 実施例１における（Ｎａ”、Ｋ”）ＡＴＰａｓｅ及び界
面活性剤に代えて精製したβ−ラクトグロブリン及びＰ
ＯＥ（Ｐ７）ラウリルエーテルプロピオスルホン酸ナト
リウム／ドデシルジメチルアミンオキシド（モル比７０
／３０）をそれぞれ用いたこと以外は実施例１と同様の
操作を行った結果、泳動後のタンパク質のバンドは１本
のみであった。この泳動条件下におけるβ−ラクトグロ
ブリンの分子量を光散乱法［高木俊夫、「生化学Ｊ、　
５７．　ｐ、２０２（１９８５）］により求めたところ
、約３７　、２００となり、サブユニットに解離するこ
となく良好に泳動されることを確認した。

実施例６ 実施例５における界面活性剤に代えてＰＯＥ（Ｐ　３　
）ｐｏｐ（Ｐ　３　）ラウリルエーテルプロピオスルホ
ン酸ナトリウム／ドデシルジメチルアミンオキシド（モ
ル比６５／３５）を用いたこと以外は実施例５と同様の
操作を行った結果、実施例５の結果と同様、サブユニッ
トに解離することなく良好に泳動されることを確認した
。

実施例７ 実施例５における界面活性剤に代えてＰＯＥ（Ｐ　８　
’）ラウリルエーテルプロピオスルホン酸ナトリウム／
ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド（モル比９０
／１０）を用ｌ；）たこと以外は実施例５と同様の操作
を行った結果、実施例５の結果と同様、サブユニットに
解離することなく良好に泳動されることを確認した。

実施例８ 実施例５における界面活性剤に代えてＰＯＥ（Ｐ８）ラ
ウリルエーテルグロビオスルホン酸ナトリウム／ドデシ
ルジメチルベタイン（モル比６５／３５）を用いたこと
以外は実施例５と同様の操作を行った結果、実施例５の
結果と同様、サブユニットに解離することなく良好に泳
動されることを確認した。

比較例１ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）を用いて実施例と同
様の操作を行ったところ、２本のバンドが得られた。こ
れらを切り出したのち、再構成してＡＴＰａｓｅ活性の
有無を判定したところ活性は陰性であった。また、スラ
ブ式二次元ゲル電気泳動により純度を確認した結果、明
瞭な２本のバンドのうち移動度の大きなものは二次元電
気泳動においても移動度が大きな単一のスポットになり
、もう−方の移動度の比較的小さな明瞭なバンドは二次
元電気泳動においても比較的小さな単一のスポットにな
り、いずれも−次元ゲル電気泳動で得られた移動度とは
ほとんど差がなかった。すなわち、ｓＤｓを用いると、
（Ｎａ”、Ｋ”）ＡＴＰａｓｅのαとβのサブユニット
の流体力学的体積を変化させ、結果として生体機能の回
復が不可能になるまで変化しているということができる
。

比較例２ ＰＯＥ（Ｐ３）ラウリルエーテル硫酸ナトリウム水溶液
（１０重量％）を１０〜２０時間煮沸し、これをドデシ
ルトリメチルアンモニウムクロリドとモル比９０／１０
になるように調製しｔ；ものを用い、実施例１と同様に
操作した結果、（Ｎａ”、Ｋ”）ＡＴＰａｓｅはゲル中
に泳動しなかった。これはアニオン性活性剤が加水分解
したためである。

比較例３ Ｃ１，〜、α−才しフィンスルホン酸ナトリウムを用い
、実施例５と同様の操作を行った結果、β−ラクトグロ
ブリンはサブユニットに解離し、変性し　ｔこ。

比較例４ ＣＩ！リニアアルキルベンゼンスルホン酸ナトナトリウ
ム／ドデシルジメチルアミンオキシドル比９０／１０）
を用い、比較例３と同様の操作を行った結果、β−ラク
トグロブリンはサブユニットに解離し、変性した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　一般式 ＲＯ−（ＸＯ）＿ｌ−（ＹＯ）＿ｍ−（ＣＨ＿２）＿ｎ
   −ＳＯ＿３Ｍ（１）（式中、Ｒは炭素数６〜２２のアル
   キル基又はアルキルフェニル基、Ｘ及びＹは炭素数１〜
   ４の炭化水素基、ｌ及びｍはそれぞれ０〜２０、ｌ＋ｍ
   は１〜４０、ｎは２〜４であり、Ｍはアルカリ金属、ア
   ルカリ土類金属、アンモニウム又は第４級アンモニウム
   である） で表わされるスルホン酸系界面活性剤の単独系、あるい
   は該スルホン酸系界面活性剤と、カチオン性界面活性剤
   及び両性界面活性剤の中から選ばれた界面活性剤の少な
   くとも１種との混合系の存在下に、タンパク質をゲル電
   気泳動処理することを特徴とするタンパク質の分離精製
   法。