JPH10510428A

JPH10510428A - アデノウイルスベクターが仲介する髄性運動ニューロンへの遺伝子導入

Info

Publication number: JPH10510428A
Application number: JP8518369A
Authority: JP
Inventors: フイニエル，フランソワーズ; ジムネ−リボタ，ミネルバ; マレ，ジヤツク; プリバ，アラン; ルバ，フレデリツク
Original assignee: ローヌ−プーラン・ロレ・エス・アー; アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル
Priority date: 1994-12-13
Filing date: 1995-12-12
Publication date: 1998-10-13
Also published as: FR2727867A1; FI972491A0; AU4350296A; AU712775B2; WO1996018740A1; EP0797677A1; HUT77258A; FI972491L; FI972491A7; CZ180697A3; FR2727867B1; US6632427B1; BR9510090A; SK74597A3; NO972712L; CA2208224A1; MX9704102A; NO972712D0

Abstract

(57)【要約】髄性運動ニューロンに核酸を導入させるための、組換えアデノウイルスの使用。

Description

【発明の詳細な説明】アデノウイルスベクターが仲介する髄性運動ニューロンへの遺伝子導入本発明は、遺伝子治療分野に関する。より詳しくは、アデノウイルスベクターが仲介する髄性運動ニューロン（medullary motorneurons）への遺伝子導入によって、神経系の疾患を治療する新規方法に関する。神経変性疾患に対する遺伝子治療およびベクターとしての改変ウイルスの使用は、特に有望な新規治療法を構成する。先行技術においてこの目的のために使用されるウイルスとして、特に、アデノウイルス（ＬｅＧａｌＬａＳａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９，９８８−９９０）、ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルスを挙げることができる。先行文献に開示されている研究によると、これらのベクター、特にアデノウイルスが、非常に高い効率で、中枢神経系の細胞を感染させることができることを示している。従って、これらの結果により、治療遺伝子を含む組換えアデノウイルスの中枢神経系への直接注入によって（特に、走触性（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｓ）によって）、中枢神経系の疾患を治療する方法を開発することが可能である。脊髄に関して、ある種の神経変性疾患または損傷との関連において、例えば成長因子をコードするある種の遺伝子を供給することにより、遺伝子治療によって、運動ニューロン（ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ）の変性を治療することも可能である。しかし、遺伝子を髄（marrow）に特異的に導入する簡単な方法がないために、これらの用途は未だに制限されている。本発明は、この問題を克服することを可能にするものである。本発明は、髄への遺伝子の選択的導入の、特に有効な方法を開示する。本発明は特に、遺伝子を組み込んでいるアデノウイルスベクターの筋肉への投与によって、遺伝子を運動ニューロンへ特異的に導入することができるということの確証に由来するものである。事実、本出願人は、特に有益な方法においてアデノウイルスが、神経筋接合部（運動終板）のレベルで吸収され、運動ニューロン軸索に沿った逆行性輸送によって運動ニューロンの細胞体（脊髄の腹側角）に輸送されることを示す。従って、本発明によるアデノウイルスベクターの筋肉内投与は、逆行性輸送による運動ニューロンの感染の、新規な、非常に特異的な方法を構成し、この方法は、外傷および／または変性の位置に従って作用するのが望ましい髄段階を正確に標的にすることを可能にする。本発明の方法は、神経筋接合部の正確なマップに従って、異なる髄機能段階の運動ニューロンを特異的および一方的に感染させることを可能にするので、特に有益である。さらに、髄実質組織への走触性注射よりも外傷がかなり少ないことが見い出され、どのような場合においても、より広汎性であり、運動ニューロンに限定されない。従って、本発明の第一の目的は、筋肉内投与によって髄性運動ニューロンに核酸を導入させる医薬組成物の製造に、ゲノムに目的とする核酸を有する組換えアデノウイルスを使用することである。前記に示すように、本発明の方法は、各髄機能段階の運動ニューロンを正確に標的にすることができるので、非常に有益である。従って、治療すべき障害の部位により、その部位と神経結合を有する筋肉への投与がなされる。本発明によれば、種々の注射の賢明な選択によって、種々のレベルに分布する多数の髄性運動ニューロンを特異的および一方的に感染させることが可能である。好ましい実施態様によれば、上肢筋肉内（二頭筋、三頭筋）への投与によって、頸部レベルの運動ニューロンに遺伝子を導入することができ；胸郭筋肉内（胸筋）への投与によって、胸部レベルの運動ニューロンに遺伝子を導入することができ；または、下肢筋肉内（腓腹筋）への投与によって、腰部レベルおよび仙骨部レベルの運動ニューロンに遺伝子を導入することができる。これらの運動ニューロンへの投与のために、当然、他の筋肉も使用することができ、他の運動ニューロンも標的にすることができる。この目的のために、標的にされる髄段階に依存して、投与のための最も適切な筋肉を決めるために、神経筋接合部の正確なマップを使用することができる。当業者は、そのようなマップを利用することができる（特に、Ｎｉｃｈｏｌｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２１７，７８−８５；ＰｅｙｒｏｎｎａｒｄｅｔＣｈａｒｏｎ，Ｅｘｐ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．５０，１２５−１３２を参照）。感染させることが有益であることが証明される髄段階に依存して、問題とする段階によって神経刺激されることが知られている１つまたはそれ以上の筋肉を選択することができる。アデノウイルスの筋肉内投与は幾つかの方法により実施できる。第一の実施態様は、極めて多数の運動終板に作用することができるよう同一筋肉のいくつかの箇所に注射するものである。本実施態様は特に問題となる筋肉への神経の進入箇所を特定することができない場合に効果的である。神経の進入箇所が限定できる場合には、当該箇所、またはその近傍に１回以上の注射をもって実施することが有益である。本実施様態によれば、投与されたベクターの多くが神経筋接合部のレベルで吸収されることから遺伝子導入の効率はより大きくなる。本発明の第一の好ましい実施態様は、同一筋肉の数箇所での注射により筋肉内投与を行うものである。本発明の他の好ましい実施様態は、神経進入部あるいはその近傍に注射をもって筋肉内投与を行うものである。その特定の目的によれば、本発明は、上肢筋肉内（例：二頭筋、三頭筋）への投与により頸部髄性運動ニューロン内に該核酸を導入するための医薬組成物の製造への、目的の核酸をゲノム内に含む組み換え体アデノウイルスの使用に関するものである。別の特定の目的によれば、本発明は胸郭筋肉内（例：胸筋）への投与により胸部髄性運動ニューロン内に該核酸を導入するための医薬組成物の製造への、目的の核酸をゲノム内に含む組み換え体アデノウイルスの使用に関するものである。さらに特定の目的によれば、本発明は下肢筋肉内（例：腓腹筋）への投与により腰部ないし／あるいは仙骨部の髄性運動ニューロン内に該核酸を導入するための医薬組成物の製造への、目的の核酸をゲノム内に含む組み換え体アデノウイルスの使用に関するものである。本発明の方法は多様な起源のアデノウイウルスを用いて実施できる。これまでに、その構造や性質が幾分異なる様々なアデノウイルスの血清型の特徴付けがなされてきた。本発明の範囲では、これら血清型のなかのタイプ２あるいは５ヒトアデノウイルス（Ａｄ２あるいはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルス（出願ＦＲ９３０５９５４参照）を使用することが好ましい。本発明の範囲で使用可能な動物起源のアデノウイルスとしては、ネコ、ウシ、ネズミ（例：Ｍａｖｌ，Ｂｅａｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、トリ、あるいは類人猿（例：ＳＡＶ）起源の既知アデノウイルスがある。好ましくは、動物起源アデノウイルスはネコアデノウイルスであり、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルスである［例えば、Ｍａｎｈａｔｔａｎ株あるいはＡ２６／６１（ＡＴＣＣＶＲ−８００）］。本発明の特に好ましい実施態様では、使用するアデノウイルスはヒト起源のアデノウイルスである。他の有益な態様では、使用するアデノウイルスは動物起源である。アデノウイルスのゲノムは、特にその両端に逆位の繰り返し配列（ＩＴＲ）を、そしてエンカプシデーション配列（Ｐｓｉ）、初期遺伝子ならびに後期遺伝子を含む。主な初期遺伝子はＥ１、Ｅ２、Ｅ３ならびにＥ４領域に含まれている。この中にあってＥ１領域（特にＥ１ａとＥ１ｂ）に含まれる遺伝子はウイルスの複製に必要である。例えば、Ｅ４とＬ５領域は、その働きとして、ウイルスの増殖に関係している。主な後期遺伝子はＥ１からＬ５の領域に含まれている。Ａｄ５アデノウイルスのゲノムの配列は完全に決定されておりデータベース上で利用可能である（特にＧｅｎｅｂａｎｋＭ７３２６０を参照）。同様に、別の血清型アデノウイルス（Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２等）のゲノムの一部あるいは全部の配列もまた決定されている。本発明を実施するために使用したアデノウイルスベクターにはエンカプシデーションと所望の核酸を許容する配列であるＩＴＲｓを含む。本発明の好ましい実施様態では、使用するアデノウイルスのゲノムはＥ１領域の全てあるいは一部を欠くものである。Ｅ１領域はウイルス複製に実際必須であり、その不活性化によって、感染細胞内で自律複製ができないいわゆる複製欠陥ウイルスの形成を誘導する。Ｅ１領域、あるいは他の特定のウイルス領域は、当業者に公知の技術、特に特定遺伝子内の１個以上の塩基を付加、置換、部分欠失、又は全体抑制することにより機能させないようにできる。この様な改変は、例えば遺伝子工学技術、あるいは突然変異誘発剤処理によってｉｎｖｉｔｒｏ（あるいは分離したＤＮＡ上）あるいはｉｎｓｉｔｕで得ることができる。使用するアデノウイルスのゲノムが残基４５４から３３２８（ＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片）あるいは３８２から３４４６（ＨｉｎｆＩＩ−Ｓａｕ３Ａ断片）に相当するＥ１領域部分を欠くことが有益である。特に有益な実施様態は、使用するアデノウイルスのゲノムがさらにＥ３および／またはＥ４領域の全てあるいは一部を欠くものである。本出願人は、これら異なるタイプの欠失を持つベクターが構築できることを示している。これらの欠失を加えることでベクターの安全性を増すことができ、またその能力を高めることができる。所望の核酸はアデノウイルスゲノムの様々な部位に挿入される。Ｅ１、Ｅ３あるいはＥ４領域に挿入することが有益である。しかし、その他の部位も利用できることは明確である。特に、ゲノムのヌクレオチド配列が判かれば、当業者であれば本目的に使用できる制限部位を特定あるいは作成できる。本発明の欠陥組み換え体アデノウイルスは当業者に公知の技術により調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ１０１（１９９１）１９５、ＥＰ１８５５７３；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯＪ．（１９８４）２９１７）。特に上記組み換え体アデノウルイスは、アデノウイルスと、特に所望のＤＮＡ配列を持つプラスミドとの間で相同組換えさせることで調製することができる。相同組換は該アデノウイルスとプラスミドを適当な細胞系に同時トランスフェクションさせると起こる。好ましくは細胞系は（ｉ）該エレメントにより形質転換可能なものを使用し、また（ｉｉ）欠陥アデノウイルスゲノム部分を補完することができる配列を、好ましくは組換えのリスクを回避するため組み込まれた形で、含むものを使用する。系の１例としては、そのゲノム中に組み込まれた形で、特にＡｄ５アデノウイルスのゲノムの左側（１２％）を含むヒト胚性腎細胞系２９３（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）を挙げることができる。第一の方法は、ｉｎｖｉｔｒｏで組換体（欠陥）ウイルスのＤＮＡを、いわゆる欠陥ウイルスを補完するのに必要な機能を全てトランスで持っているコンピテント細胞系にトランフェクションさせるものである。これらの機能は細胞のゲノム中に組み込まれることが好ましく、これにより組換えのリスクが低減し、また細胞系の安定性増加が得られる。Ｅ１領域のみに欠陥のあるアデノウイルスの場合、好ましい系は２９３系である。第二の方法は適当な細胞系に、ｉｎｖｉｔｒｏで調製した欠陥組換体ウイルスより得たＤＮＡと１種類以上のヘルパープラスミドあるいはウイルスから得たＤＮＡを同時トランスフェクションするものである。この方法では、組換体アデノウイルスの欠陥機能を全て補完することのできるコンピテント細胞系を使用する必要がない。これらの機能の一部はヘルパーウイルスにより補完される。このあるいはこれらのヘルパーウイルスは、それ自体は欠陥体である。アデノウイルス由来のベクターの構築方法の体系については出願番号ＦＲ９３／０５９５４ならびにＦＲ９３／０８５９６にも記載されている。次に、増殖したアデノウイルスを、実施例に示した様な従来の分子生物学的手法を用いて回収、精製した。本発明により使用するためには、アデノウイルスを注射可能な製剤とするよう医薬上許容される１つ以上の賦形剤と組み合わせることが好ましい。これらは、特に、等張の、無菌の生理食塩水溶液（１ナトリウム−あるいは２ナトリウム− リン酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、あるいは塩化マグネシウム等あるいはこれら塩の混合体）、あるいは場合により滅菌水あるいは生理食塩水を加えると注射可能な溶液となる、乾燥した、特に凍結乾燥した組成物である。投与に用いられるウイルス量は、様々なパラメーター機能、特に想定される投与部位（筋肉）の機能、注射回数、発現遺伝子あるいは望まれる治療期間に依存する。一般的には、本発明による組換体アデノウイルスは、１０⁴から１０¹⁴ｐｆｕの間、好ましくは１０⁶から１０¹⁰ｐｆｕの間の投与量にて処方され投与される。ｐｆｕ（プラーク形成単位）という用語はウイルス溶液の感染性を表しており、適当な細胞培養に感染させ、通常１５日後に感染した細胞のプラーク数を測り求める。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を測定する技術については文献中に詳しく記載されている。本発明の方法は、髄損傷あるいは運動ニューロン変性疾患の治療に特に有益である。より詳しくは、髄損傷とは運動ニューロンのレベルでの切断によりニューロンがより高位の中枢からの求心性を遮断され、変性したものである。本発明により、成長因子をコードする遺伝子を損傷を受けている運動ニューロン内に逆行性に輸送することで、上記変性を減じさせる可能性、あるいは阻止する可能性さえある。運動ニューロンが原因の神経疾患としては、筋萎縮性側索硬化症、Ｉ型脊髄性筋萎縮症（ウエルドニッヒホフマン病）、IIあるいはIII型脊髄性筋萎縮症（キューゲルベルグ−ベランダー病）、延髄性脊髄筋萎縮症（ケネディー病等）などが例として挙げられる。本発明の方法により成長因子をコードする遺伝子、あるいは変性しつつある運動ニューロンに対して神経栄養的に作用することが知られている他の分子、を導入することは、上記のタイプの疾患に対する新しい治療方法も提供する。本発明の方法の効果は特に動物モデルで示すことができる：すなわち、脊髄を部分あるいは完全切断したモデル、ウブラーマウス（筋萎縮性側索硬化症を研究するための動物モデル（ＬｅｅｓｔｍａＪ．Ｅ.、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１００，８２１−８２４））；ｍｎｄマウス（ｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（運動ニューロン変性）：筋萎縮性側索硬化症研究用動物モデル（Ｍｅｓｓｅｒら、１９９２，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１８，７９７−８０２））あるいはｐｍｎマウス（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ（進行性運動ニューロン病）：発生中の運動ニューロン変性の研究用動物モデル）を実施例に示した。人間への取り込みや寛容性、ならびに安全性についてはヒト胚性髄神経の培養体を用いたｉｎｖｉｔｒｏモデルで試験できる。上記観点より、本発明によりアデノウイルスベクターに取り込ませる所望の核酸は、神経活性物質、即ち神経細胞に有益な作用を及ぼすことのできる物質をコードしていることが好ましい。この物質は、内因性の物質の不足あるいは過剰を補正し、あるいは細胞に新たな特質を与えることができる物質であってもよい。特に、成長因子、神経栄養因子、サイトカイン、神経伝達物質あるいは酵素、あるいは神経伝達物質受容体あるいはホルモン受容体である。好ましくは、成長因子の中では、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ等）、あるいは繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦａ，ＦＧＦｂ）あるいは血管細胞（ＶＥＧＦ）である。神経栄養因子の中では、好ましい因子は毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞成熟因子（ＧＭＦａ，ｂ）、ＧＤＮＦ，ＢＤＮＦ、ＮＴ３，ＮＴ５等である。好ましいサイトカインはインターロイキン類とインターフェロン類であり、酵素では、神経伝達物質の生合成に関連するもの（チロシン水酸化酵素、アセチルコリン転移酵素、グルタミン酸デカルボキシラーゼ）、ライソゾーム酵素（ヘキソサミニダーゼ、アリールスルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ、ＨＧＰＲＴ）、フリーラジカルの解毒化に関連した酵素（スーパーオキサイドジスムターゼＩ、IIあるいはIII、カタラーゼ、グルタチオンパーオキシダーゼ）の使用が好ましい。レセプターでは、とりわけ、アンドロゲン受容体（ケネディー病に関連している）を利用できる。これら多様な因子は天然形、あるいは天然型の活性を有する変異体あるいは断片の形で利用できる。さらにアンチセンス配列を導入することも可能である。核酸は天然起源でもあるいは人工的起源のものでもよい。特にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ハイブリッド配列、または合成もしくは半合成配列が利用できる。ヒト、動物、植物、細菌、あるいはウイルス起源のもの等が利用できる。これらは当業者に公知の技術、特にライブラリースクリーニング、化学合成、あるいはライブラリーのスクリーニングで得た配列を化学的あるいは酵素的に改変することを含む複合方法により得ることができる。ｃＤＮＡあるいはｇＤＮＡが好ましい。通常、核酸は運動ニューロンの機能的転写のためのプロモーター領域、ならびに所望遺伝子の３’の領域、すなわち転写の停止シグナルとポリアデニレーション部位を規定する領域からなる。これらのエレメント全てで発現カセットを構成する。プロモーター領域に関しては、該領域が感染細胞中で機能できる場合には、目的の遺伝子の発現を当然引き起こすものである。さらに、（他のタンパク質の発現あるいは合成物の場合にも関係する）異なる起源の領域を使用することができる。特に、真核生物遺伝子あるいはウイルス遺伝子のプロモーターである。例えば、感染を望む細胞のゲノムより得たプロモーター配列である。同様に、使用するアデノウイルスを含むウイルスのゲノム由来のプロモーター配列も利用できる。これに関し、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶおよびＲＳＶ遺伝子等のプロモーターを挙げることができる。さらに、これらプロモーター領域は、活性化配列、制御配列、あるいは組織特異的発現または優先発現させる配列（エノラーゼやＧＦＡＰプロモーター等）を付加して改変することができる。さらに異種の核酸がプロモーター配列を含まない場合には、そのような配列をウイルスゲノムの下流に挿入することができる。本発明の主題はまた、核酸をゲノム内に組み込んだアデノウイルスベクターを筋肉内投与することを含む、運動ニューロンへの核酸導入のための方法である。好ましくは、本発明の方法は、同一筋肉の数箇所の部位に注射すること、あるいは神経進入部位が限定される場合には該部位のレベルあるいはその近傍に１回以上の注射により実施される。本発明について、以下の実施例により詳細に説明するが、これらは例示であり何ら限定するものではない。図面の説明図１（写真Ａ）：アデノウイルス−β−ガラクトシダーゼを腓腹筋に筋内注射後の、腰部レベルのラット脊髄の縦方向切片（５０μｍ）のβ−ガラクトシダーゼ標識、 −多数の運動ニューロン細胞体の拡散標識（△） −運動ニューロンの典型形態を表す、細胞体および神経突起レベルの幾つかの運動ニューロンのより強度の標識（▲）。図２（写真Ｂ）：Ａと同一、より高い倍率。アデノウイルス−β−ガラクトシダーゼを腓腹筋に筋内注射後の、腰部レベルのラット脊髄の縦方向切片（５０μｍ）のβ−ガラクトシダーゼ標識。図３（写真Ｃ）：アデノウイルス−β−ガラクトシダーゼを腓腹筋に筋内注射後の、腰部レベルのラット脊髄の縦方向切片（５０μｍ）のβ−ガラクトシダーゼ−免疫細胞化学共標識（カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ））。実施例１．無傷ラット、または脊髄の胸部片側切断を受けたラット、におけるアデノウイルス−ｂ−ガラクトシダーゼの腓腹筋への注射。この実施例は、ｂ−ｇａｌ遺伝子を組み込んでいるアデノウイルスを腓腹筋に投与することによる、腰部運動ニューロンのレベルにおけるｂ−ｇａｌ遺伝子の導入を説明する。より詳しくは、下肢の一方または両方において動物を麻痺させる効果を有する、低い胸部レベルにおいて行われたラット脊髄の部分または完全切断のモデルに関して試験を行った。そのような切断は、上部中枢から来る求心性を運動ニューロンから奪い、それらの変性を引き起こす。逆行性輸送によって病巣下の運動ニューロンを感染させるように投与を行った。この実施例で使用するアデノウイルスベクターは、Ａｄ．ＲＳＶ．βｇａｌベクターである。このベタターは、その複製に必要な配列を欠いているが、それにもかかわらず、そのベクターによって感染される細胞を貫通するのに必要な配列、およびこのアデノウイルスのエンカプシデーションに必要な必須の配列を全て含んでいる。それはまた、ＲＳＶプロモーターの制御下に、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をも有している。欠陥組換えアデノウイルスＡｄ．ＲＳＶβｇａｌの構築は、文献（ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６）に開示されている。簡単に述べると、アデノウイルスＡｄ．ＲＳＶｂｇａｌは、変異体アデノウイルスＡｄ−ｄ１３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅｌｌ３１（１９８２）５４３）とプラスミドｐＡｄ．ＲＳＶｂｇａｌ（Ａｋｌｉら、１９９３）との間のｉｎｖｉｖｏ相同的組換えによって得られる欠陥組換えアデノウイルスである（Ｅ１およびＥ３領域が欠陥している）。プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶｂｇａｌは、５’→３’方向に、 −ＩＴＲ配列、複製起点、エンカプシデーションシグナル、およびエンハンサーＥ１Ａを含有する、Ａｄ５アデノウイルスの左端に対応するＰｖｕIIフラグメント； −ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）の制御下にある、ｂ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子； −プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶｂｇａｌとアデノウイルスｄ１３２４との間の相同的組換えを可能にするＡｄ５アデノウイルスゲノムの第二フラグメント；を有する。ＣｌａＩ酵素での直線化の後、相同的組換えを行うために、プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶｂｇａｌとアデノウイルスｄ１３２４が、リン酸カルシウムの存在下に系２９３中に同時にトランスフェクトされる。このようにして生成する組換えアデノウイルスは、プラーク精製によって選択される。単離後、組換えアデノウイルスＤＮＡが細胞系２９３中で増幅され、これによって約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌのタイターを有する未精製組換え欠陥アデノウイルスを含有する培養上澄み液を生じる。次に、ウイルス粒子が既知の方法に従って、塩化セシウム勾配遠心分離によって精製される（特に、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６を参照）。次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、アデノウイルスを精製形態で使用した。動物が脊髄の片側切断（低い胸部レベル；動物の下肢の一方を麻痺させる作用を有する）を受けた（または受けない）直後に、Ａｄ−ＲＳＶ−ｂ−ｇａｌアデノウイルスを、腓腹筋に３回注射した（１回の注射につき１０⁷ｐｆｕ）。１部位の注射毎にアデノウイルス９μｌを、ハミルトン注射器で注射する。筋肉から脊髄への逆向性輸送が起こるための最少限の期間である、注射後４日で動物を殺した（灌流、４％パラホルムアルデヒド）。脊髄の３つのブロックを、頸部、胸部、および腰部レベルで縦に切り、５０ｍＭ厚の切片にした。β−ガラクトシダーゼを顕現するために切片を処理し、これによって、ウイルスによって感染した細胞を視覚化することができる。いくつかの切片はさらに、アンチ− カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）免疫細胞化学にかけられ、これによって、運動ニューロンを特異的に標識することができる。基質であるＸ−ｇａｌを用いてβガラクトシダーゼが顕現され、反応生成物は青色を示す。カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ＣＧＲＰは、神経伝達物質であり、運動ニューロンの特異的マーカーである。それは、ペルオキシダーゼと結合した二次抗体および酵素基質ジアミノベンジジンを用いて免疫細胞化学によって顕現され、反応生成物は栗色を示す。ｂ−ガラクトシダーゼの顕現化は、専ら、片側切断ラットの場合の病巣下の腰部レベルにおいて、および注射に対応する側において、感染した運動ニューロンの存在を視覚化することを可能にした。２種類の標識が得られ、１つは多数の運動ニューロンの細胞体の拡散標識であり、もう１つは、より制限された数の運動ニューロンの細胞体および神経突起のより強度の標識であった（写真ＡおよびＢ）。標識強度におけるこの違いは、おそらく、注射部位に非常に近い少しの運動ニューロンだけがウイルスを強く吸収するという事実によるものであろう。ｂ−ガラクトシダーゼの顕現化と組み合わせたアンチ−ＣＧＲＰ免疫細胞化学は、二重染色によって、事実上、全てのＣＧＲＰ陽性細胞体（即ち、運動ニューロン）がウイルスによって感染されたことを示すことができた（写真Ｃ）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１２月３１日【補正内容】請求の範囲１．上肢筋肉（例えば、二頭筋、三頭筋）内への投与によって頸部髄性運動ニューロンに核酸を導入させる医薬組成物の製造のための、目的とする核酸をゲノムに含む組換えアデノウイルスの使用。２．胸郭筋肉（例えば、胸筋）内への投与によって胸部髄性運動ニューロンに核酸を導入させる医薬組成物の製造のための、目的とする核酸をゲノムに含む組換えアデノウイルスの使用。３．下肢筋肉（例えば、腓腹筋）内への投与によって腰部髄性および／または仙骨部髄性運動ニューロンに核酸を導入させる医薬組成物の製造のための、目的とする核酸をゲノムに含む組換えアデノウイルスの使用。４．筋肉内投与によって髄性運動ニューロンに核酸を導入させる医薬組成物の製造のための、ゲノムが、Ｅ１領域の全てまたは一部ならびにＥ３および／またはＥ４領域の全てまたは一部を欠失し、目的とする核酸を含む組換えアデノウイルスの使用。５．筋肉内投与によって髄性運動ニューロンに核酸を導入させる医薬組成物の製造のための、ＮＴ３をコードする核酸をゲノムに含む組換えアデノウイルスの使用。６．アデノウイルスがヒト起源のアデノウイルスであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。７．アデノウイルスが動物起源のアデノウイルスであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。８．目的とする核酸が、Ｅ１、Ｅ３、またはＥ４領域のレベルで、アデノウイルスのゲノムに挿入されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。９．目的とする核酸が、神経細胞に有益な作用を及ぼすことができる物質をコードすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。１０．目的とする核酸が、成長因子、神経栄養因子、サイトカイン、神経伝達物質または酵素、あるいはレセプターをコードすることを特徴とする請求項９に記載の使用。１１．目的とする核酸が、運動ニューロン中で物質を発現させるシグナルをさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の使用。１２．筋肉内投与が、同じ筋肉の数箇所の部位における注射によって行われることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。１３．筋肉内投与によって髄性運動ニューロンに核酸を導入させることによって、筋萎縮性側索硬化症を治療する医薬組成物の製造のための、神経栄養因子をコードする核酸をゲノムに含む組換えアデノウイルスの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジムネ−リボタ，ミネルバフランス国、エフ−34000・モンペリエ、アブニユ・ドウ・ラ・ジユステイス−ドウ −カストウノー、474 (72)発明者マレ，ジヤツクフランス国、エフ−75013・パリ、リユ・シヤルコ、18 (72)発明者プリバ，アランフランス国、エフ−34980・サン−クレマン−ドウ−リビエール、リユ・デ・グラーブ、300 (72)発明者ルバ，フレデリツクフランス国、エフ−92160・アントニー、リユ・ドウ・シヤトウネ、49

Claims

【特許請求の範囲】１．上肢筋肉（例えば、二頭筋、三頭筋）内への投与によって頸部髄性運動ニューロンに核酸を導入させる医薬組成物の製造のための、目的とする核酸をゲノムに有する組換えアデノウイルスの使用。２．胸郭筋肉（例えば、胸筋）内への投与によって胸部髄性運動ニューロンに核酸を導入させる医薬組成物の製造のための、目的とする核酸をゲノムに有する組換えアデノウイルスの使用。３．下肢筋肉（例えば、腓腹筋）内への投与によって腰部髄性および／または仙骨部髄性運動ニューロンに核酸を導入させる医薬組成物の製造のための、目的とする核酸をゲノムに有する組換えアデノウイルスの使用。４．筋肉内投与によって髄性運動ニューロンに核酸を導入させる医薬組成物の製造のための、ゲノムが、Ｅ１領域の全てまたは一部ならびにＥ３および／またはＥ４領域の全てまたは一部を欠失し、目的とする核酸を含む組換えアデノウイルスの使用。５．アデノウイルスがヒト起源のアデノウイルスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。６．アデノウイルスが動物起源のアデノウイルスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。７．目的とする核酸が、Ｅ１、Ｅ３、またはＥ４領域のレベルで、アデノウイルスのゲノムに挿入されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。８．目的とする核酸が神経活性物質をコードすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。９．目的とする核酸が、成長因子、神経栄養因子、サイトカイン、神経伝達物質または酵素、あるいはレセプターをコードすることを特徴とする請求項８に記載の使用。１０．目的とする核酸が、運動ニューロン中で神経活性物質を発現させるシグナルをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の使用。１１．筋肉内投与が、同じ筋肉の数箇所の部位における注射によって行われることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。