JPH10510848A

JPH10510848A - ホスファターゼ酵素で化学発光を生成させるための化合物、組成物および方法

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Publication number: JPH10510848A
Application number: JP9526021A
Authority: JP
Inventors: アクハヴァン−タフティ，ハシェム; アルガヴァニ，ザラ; デシルヴァ，レヌカ
Original assignee: ルミゲンインク
Priority date: 1996-01-16
Filing date: 1997-01-15
Publication date: 1998-10-20
Anticipated expiration: 2017-01-15
Also published as: AU1744697A; US6218137B1; DE69720332D1; KR100259144B1; US6045991A; US6270695B1; EP0819119B1; CN1180349A; AU716233B2; US6296787B1; US20030023089A1; DE69720332T2; US6045727A; US6635437B2; ATE236177T1; EP0819119A4; CA2213317A1; KR19980703068A; CN1173954C; US6139782A

Abstract

(57)【要約】ホスファターゼ酵素との反応に際して化学発光を生じる新規複素環化合物ならびにそれらの製法およびそこで有用な中間体を提供する。該化合物は環外炭素−炭素二重結合を担持する窒素、酸素または硫黄−含有複素環系を含有する。該二重結合はさらに末端炭素においてホスフェート基および酸素または硫黄含有基で置換されている。該複素環ホスフェート化合物に加えて、さらにカチオン性芳香族化合物（ＣＡＣ）を含有する新規組成物を提供する。該ＣＡＣの組成物への添加は化学発光の生成を大いに増加させ、改良された検出感度を提供する。さらにアニオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤を含有する組成物は検出感度のさらなる改良を供する。新規化学発光化合物および組成物は光を生じる方法およびホスファターゼ酵素および酵素阻害剤についてのアッセイおよび酵素−標識特異的結合対を使用するアッセイで有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ホスファターゼ酵素で化学発光を生成させるための化合物、組成物および方法発明の分野本発明は、ホスファターゼ酵素と反応して光を生じる化学発光化合物に関する。特に、本発明は、ホスファターゼ酵素でホスフェート基を除去するに際して、酸素と反応して、エノラートを生じ、これを反応させて化学発光およびカルボニル化合物を生じる複素環基およびエノールホスフェート基を含有する化学発光化合物に関する。本発明は、さらに、ホスファターゼ酵素との反応によって化学発光を生じる組成物に関する。化学発光組成物は、複素環基およびエノールホスフェート基を含有する第１の化合物およびホスフェート化合物とホスファターゼ酵素との反応からの光生成を増大させる第２の化合物を含有する。本発明は、ホスファターゼ酵素と化学発光組成物との反応によって光または化学発光を生じさせる方法に関する。特に、本発明は、実質的に光放射を増大させるかかる方法の改良に関する。本発明は、さらに、ホスファターゼ酵素を検出する検定法、および免疫アッセイ、核酸プローブアッセイ等におけるホスファターゼ−標識特異的結合パートナーを検出する検定法における、化学発光反応および組成物の使用に関する。本発明は、ホスファターゼ酵素と反応して化学発光を生じる化学発光化合物の製法に関する。本発明は、かかる製法で有用な新規中間体に関する。特に、本発明は、ホスフェート保護基の除去に際して酸素と反応して化学発光およびカルボニル化合物を生じる複素環基およびエノールホスフェート基を含有する化学発光化合物を調製するための方法および中間体に関する。発明の背景ａ．ホスファターゼ酵素の化学発光検出アルカリ性ホスファターゼのごとき加水分解酵素は、しばしば、薬物、ホルモン、ステロイドおよび癌マーカーのごとき注目する生物学的分子および他の分析物のための酵素結合検定法においてマーカーまたは標識として使用される。加えて、ホスファターゼ酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）および酸性ホスファターゼ（ＡｃＰ）は、ヒトおよび獣医学診断におけるそれ自体の資格において臨床的に重要である。これらの酵素の化学発光検出は、試料中の酵素の量または酵素標識分析物もしくは分析物に対する標識された特異的結合パートナーの量の定量的測定を供するための、安全で、便宜かつ感受性の手段を提供する。特定の加水分解酵素のレベルを定量するために、多数の化学発光反応スキームが開発されている。これらのスキームのうちのほとんどは複雑でかつ出費がかさみ、多数の酵素またはいくつかの試薬を必要とする。大容量テストのためのかかる方法のほとんどの商業的許容性はゆっくりであった。ここに引用して本明細書の一部とみなす出願人の同時係属米国特許出願第０８／５８５，０９０号は、エノールホスフェート基を担持するある種の複素環化合物とホスファターゼ酵素との化学発光反応を開示する。ホスファターゼが１０^-1 ⁸ ないし１０^-19モルのレベルで検出されるようにするカチオン性界面括性剤の存在下で、光放出は増強される。ここに引用して本明細書の一部とみなす出願人の同時係属米国特許出願第０８／６８３，９２７号は、エノールホスフェート基を担持するある種の複素環化合物とホスファターゼ酵素との化学発光反応と組み合わせた、カチオン性芳香族化合物（ＣＡＣ）の、放射される光の量を実質的に増大させるための使用を開示する。ホスファターゼ酵素の検出限界はそれにより劇的に低下する。ｂ．化学的および酵素的にトリガー可能なジオキセタン保護されたフェノール基をトリガーできる基を担持する安定な１，２−ジオキセタンは保護基の除去に際して化学発光分解を受ける(A．P．Schaap，T.S.Chen ，R.S．Handley，R．DeSilva，およびB．P．Giri，Tetrahedron Lett.，1155(19 87);A．P．Schaap，R.S．Handley，およびB.P.Giri,Tetrahedron Lett.,935(198 7);A.P.Schaap,M．D．Sandison，およびR．S．Handley，Tetrahedron Lett.，11 59(1987); およびA．P．Schaap，Photochem．Photobiol.，47S，50S(1988))。酵素によりトリガーできるジオキセタンは、酵素により除去可能な保護基によってブロックされたアリールオキシド置換基を担持する。水性緩衝液中における加水分解酵素との反応は、大きさのオーダーによって、ジオキセタンの化学発光分解速度を加速するアリールオキシドアニオンを明らかにする。化学的にトリガーできるジオキセタンは、簡単な化学剤によって除去される保護基によってブロックされたアリールオキシド置換基を担持する。その例はヒドロキシドでのアセトキシジオキセタンの、またはフルオリドでのシリルオキシジオキセタンの脱保護である。かかるトリガー可能なジオキセタンの多数の例は、例えば、米国特許第４，８５７，６５２号、第５，０６８，３３９号、第４，９５２，７０７号、第５，１１２，９６０号、第５，２２０，００５号、第５，３２６，８８２号、およびＰＣＴ出願ＷＯ９６／２４８４９、ＷＯ９４／１０２５８およびＷＯ９４／２６７２６に開示されている。しかしながら、いくつかのトリガー可能なジオキセタンの固有の不利は、ゆっくりとした熱分解または非酵素的加水分解を介する酵素の不存在下でのバックグラウンド化学発光を生じるそれらの傾向である。ｃ．ルミノール誘導体ルミノールのホスフェートおよびＮＡＧ誘導体が知られている(K．Sasamoto， Y．Ohkura，Chem．Pharm．Bull.，38，1323-5(1991);M．Nakazono，H．Nohta，K ．Sasamoto，Y．Ohkura，Anal．Sci.，8，779-83(1992))。ルミノール誘導体を適当な酵素で処理するとルミノールが遊離され、これはフェリシアニドと引き続いての過程で反応して光を生じる。ｄ．ルシフェリン誘導体ホタル・ルシフェリンのホスフェートおよびガラクトシド誘導体が知られている(N．Ugarova，Y．Vosny，G．Kutuzova，I．Dementieva，Biolum．and Chemilu m．New Perspectives，P．StanleyおよびL．J．Kricka編，Wiley Chichester，5 11-4(1981);W．Miska，R．Geiger，J．Biolumin．Chemilumin.，4，119-28(1989 ))。ホタル・ルシフェリン誘導体を適当な酵素で処理するとホタル・ルシフェリンが遊離され、これは第２の過程でルシフェラーゼおよびＡＴＰと反応して光を生じる。ｅ．還元剤の生成に関与する反応アルカリ性ホスファターゼによって触媒されるホスフェートエステルからの還元剤の生成に関与する化学発光方法が報告されている(M．Maeda，A．Tsuji，K． H．Yang，S．Kamada，Biolum.and Chemilum．Current Status，119-22(1991)；M ．Kitamura，M．Maeda，A．Tsuji，J．Biolumin．Chemilumin.，10，1-7(1995); H．Sasamoto．M．Meda， A．Tsuji，Anal．Chim．Acta，306，161-6(1995))。還元剤は酸素とルシゲニンとの間の反応を引き起こして、ルシゲニンから生起する光を生じる。代表的な還元剤はアスコルビン酸、グリセロール、ＮＡＤＨ、ジヒドロキシアセトン、コルチゾールおよびフェナシルアルコールを含む。これらの方法は、ルシゲニンからではなく、脱保護された蛍光性化合物からの光の生成を含む本発明とは区別される。ルシゲニンとの反応のための還元剤を酵素的に生じさせる公知の方法は、全て、酵素とホスフェート化合物との間の別の予備的インキュベーション工程を要する。これはさらなる複雑性およびアッセイ時間を付け加える。 Mahantによる米国特許第５，５８９，３２８号は化学発光反応を開示しており、それにより、インドキシルエステル、チオインドキシルエステルおよびベンゾフランエステルが酵素によって加水分解され、それによりスーパーオキシドを生じる。発光はルシゲニンのごとき化学発光発生剤を添加することによって増幅される。ルシゲニンはスーパーオキシドとの反応によって化学発光を生じる。ｆ．結合酵素方法結合酵素反応を介してホスファターゼ酵素のごとき加水分解酵素を測定する多数の他の化学発光方法およびアッセイが知られている。かかる方法の蓄積がA.Ts uji，M．Maeda，H．Arakawa，Anal．Sci.，5，497-506(1989)にリストされている。デュアル酵素化学発光反応の他の例が米国特許第５，３０６，６２１号および通常に譲渡された出願第０８／３００，３６７号に記載されている。前者はルミノールのペルオキシターゼでの化学発光酸化を増強するペルオキシターゼ増強剤の酵素的生成を記載し；後者はアクリダンカルボン酸誘導体のペルオキシターゼでの化学発光酸化を増強するペルオキシターゼ増強剤の酵素的生成を記載する。酵素でトリガーされるジオキセタンの例外として、前記方法は各々は、発光シグナルを生じさせるためには多数の酵素剤を要するという欠点に悩んでいる。付加される出費または操作の複雑性は、それらの前記した例外的検出感度にも拘わらず、これらの方法の商業的許容性を妨害する。これらの感受性レベルを達成するが、酵素基質に加えてさちなる酵素または補助剤を必要としない加水分解酵素を検出し定量する化学発光方法が有利であろう。本発明はかかる方法および化合物を提供する。発明の概要本発明の目的は、延長された時間の間、室温にて熱的におよび加水分解的に安定であって、ホスフェート部位を切断するホスファターゼ酵素によって切断されるホスファターゼ酵素の化学発光検出用の化合物を提供することにある。また、本発明の目的は、二重結合の１の末端が窒素、酸素または硫黄を含有する複素環基で置換された、およびさらに二重結合の他の末端が、光の生成で分解するようにトリガー可能な酵素的切断可能なホスフェート基（Ｏ−ＰＯ₃ ^2-）で置換された新規化合物を提供することにある。本発明のさらなる目的は、ホスファターゼ酵素によってトリガーされ得るかかる新規化合物を含有する化学発光を生成させるための方法および組成物を提供することにある。本発明のさらなる目的は、優れた光生成能を有する化合物を提供することにあり、また、ホスファターゼ酵素の検出に使用した場合、および分析物の検出用ホスファターゼ標識を使用する一般に知られている方法により酵素結合核酸、抗体、ハプテンおよび抗原のイムノアッセイおよび検出で使用した場合に優れた利点を提供することにある。本発明の前記および他の目的ならびに利点は式Ｉ：［式中、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１個の五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］を有する化合物によって達成される。さらに、本発明の前記および他の目的ならびに利点は、水性溶液中に、式Ｉの化合物および化学発光を増強するのに有効な量の少なくとも１種の界面活性剤増強剤を含有する、ホスファターゼ酵素の存在下で化学発光を生じる試薬組成物によって達成される。さらに、本発明の前記および他の目的ならびに利点は、ホスファターゼ酵素を式Ｉの少なくとも１種の化合物と反応させることを含有する、化学発光を生じさせる方法によって達成される。さらに、本発明の前記および他の目的ならびに利点は、ホスファターゼ酵素を式Ｉの少なくとも１種の化合物と反応させて分析物を検出するための化学発光を生成させ；化学発光を検出し；化学発光の量を分析物の量と関連づけることを含有する、化学発光アッセイによって試料中の分析物を検出する方法によって達成される。さらに、本発明の前記および他の目的ならびに利点は、水性溶液中の、ホスファターゼ酵素と反応する式Ｉの少なくとも１種の化合物(式Ｉの化合物において) 、および化学発光を増強するのに有効な量の界面活性剤増強剤を含有するホスファターゼ酵素の存在下で化学発光を生じる試薬組成物を供し；ホスファターゼ酵素を該組成物と反応させて分析物を検出するための化学発光を生じさせ；化学発光の量を分析物の量と関連付けることを含有する、化学発光反応によるアッセイ法において分析物を検出する方法によって達成される。また、本発明の目的は、カチオン性芳香族化合物および光の生成で分解するようにトリガーされ得る式Ｉの化合物を含有する組成物を提供することにある。本発明のさらなる目的は、試薬組成物とホスファターゼ酵素との反応によって化学発光を生成する改良された方法を提供することにある。なおさらに、本発明の目的は、ホスファターゼ酵素との反応に際して効果的な化学発光を迅速に生成する組成物および方法を提供することにある。本発明の前記および他の目的ならびに利点は、カチオン性芳香族化合物および式Ｉの化合物を含有する試薬組成物によって達成される。さらに、本発明の前記および他の目的ならびに利点は、水性溶液中の、効果的な化学発光の迅速な生成を供するのに有効な量の少なくとも１種のアニオン性界面活性剤および少なくとも１種の非イオン性界面活性剤と組み合わせ、カチオン性芳香族化合物、ホスファターゼ酵素と反応する式Ｉの化合物を含有する、ホスファターゼ酵素の存在下で化学発光を生じる試薬組成物によって達成される。本発明のさらなる目的は、ホスファターゼ酵素と反応して光を生じる化学発光化合物の調製のために有用な合成方法および中間体を提供することにある。本発明のさらなる目的は、ホスフェート保護基の除去に際して酸素と反応して光およびカルボニル化合物を生じる複素環基およびエノールホスフェート基を含有する式Ｉの化学発光化合物を調製するための方法および中間体を提供することにある。本発明のさらなる目的は、エステルまたはチオエステル化合物のエノラートをリン酸化してホスホジエステルまたはトリエステル中間体化合物を得、これを脱保護してホスフェートモノエステル塩とすることを含有する方法を提供することにある。図面の簡単な記載図１は、８×１０^-16モルのアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）の添加によって２５℃でトリガーされる、０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．５中のアクリダンホスフェート１（９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリジン、二ナトリウム塩）の０．３３ｍＭ溶液および０．０１ｍｇ／ｍＬの増強剤ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリドコ−ポリビニルベンジルトリオクチルホスホニウムクロリド（３：１のトリブチル：トリオクチル基を含有）（増強剤Ａ）よりなる試薬１００μＬによって放射された化学発光強度の時間プロフィールを示すグラフである。また、該図は比較のために１の代わりにエステルを含有する同様の試薬組成物中のエステルフェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシレートの化学発光プロフィールも示す。図２は、２．４×１０^-12モルのＡＰと共に１を含有する試薬組成物３ｍＬを含有する反応混合物の室温における紫外線−可視光線吸収スペクトルのプロットである。Ａ−Ｆと標識した曲線は酵素添加の０、５、１０、２０、４０および６０分後に採ったスキャンを表す。図３は、室温にて１を含有する試薬組成物２００μＬと８×１０^-13モルのＡＰとの反応によって生じた化学発光スペクトルのプロットである。図４は、室温でトリガーされるアクリダンホスフェート１を含有する試薬１００μＬによって放射された最大化学発光強度にＡＰの量を関連付けるグラフである。化学発光放射は、８×１０^-15モルおよび８×１０^-20モルの間の酵素を含有するＡＰの溶液１０μＬの、白色マイクロプレートのウェル中に０．８８ｍＭＭｇ⁺²および０．０１ｍｇ／ｍＬ増強剤Ａを含有するトリス緩衝液０．１Ｍ（ｐＨ８．５）中のアクリダンホスフェート１の０．３３ｍＭ溶液１００μＬへの添加によって室温で開始された。Ｓ−Ｂなる語はＡＰの不存在下でバックグラウンド化学発光（Ｂ）に対して補正したＡＰ存在下における相対光単位（ＲＬＵ）での化学発光シグナル（Ｓ）をいう。該グラフは、アルカリ性ホスファターゼの直線的検出を示す。計算された検出限界（バックグラウンドの標準偏差の２倍）はこれらの条件下で８×１０^-19モルと決定された。図５は、０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ９中の０．３３ｍＭアクリダンホスフェート１を含有する試薬組成物１００μＬによって放射された全化学発光強度に対してＡＰの量を関連付けるグラフである。黒色マイクロプレートのウェル中、該組成物を、８×１０^-15および８×１０^-20モルの間の酵素を含有するＡＰの溶液１０μＬまたは試薬ブランクとしての水１０μＬと雰囲気温度で４分間反応させた。１ＮＮａＯＨ（１００μＬ）中の０．５ｍｇ／ｍＬの増強剤Ａを含有する溶液を注入し、光強度を１０秒間積分した。該グラフはアルカリ性ホスファターゼの直線的検出を示す。図６は、化学発光試薬組成物で、ＰＶＤＦ膜上のＡＰ−標識抗体を介してヒト・トランスフェリンを検出するウェスタンブロット実験からのＸ−線フィルムのデジタル的にスキャンしたイメージである。蛋白質の、各々、５０００、１０００、１８０、３０および５ｐｇから含有トランスフェリンの希釈物を電気泳動し、膜に移した。０．５ｍｇ／ｍＬの増強剤Ａを含有する試薬組成物と共にブロットを０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂および０．６６ｍＭアクリダンホスフェート１を含有する０．２Ｍ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液ｐＨ９．６に軽く浸漬し、次いで、１０分間のインキュベーション時間の後にｘ−線フィルムに１分間さらすことによって蛋白質を検出した。図７は、ルシゲニンを反応溶液に添加することによる５とアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）との反応からの化学発光生成に対する効果を示すグラフである。緩衝液中に５を含有する等容量の２つの溶液を８×１０^-16モルのアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）と反応させた。１つの溶液は６．４μＭのルシゲニンも含有するものであった。図８は、８×１０^-16モルのＡＰの添加によつて室温でトリガーされる、０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．８、６．４μＭルシゲニン、０．６６ｍＭアクリダンホスフェート５（０．０６６Ｍメタノール溶液の１：１００希釈からのもの）、１ｍｇ／ｍＬドデシル硫酸ナトリウム、０．０１ｍｇ／ｍＬＮａ₂ＳＯ₃、０．０３３％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０および０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂よりなる試薬Ａの１００μＬによって放射された化学発光強度の時間プロフィールを示すグラフである。また、該図は５およびカチオン性ポリマー界面括性剤増強剤（０．２５ＴＢ／ＴＯ）を含有する試薬組成物からの化学発光プロフィールも比較のために示す。図９は、２５℃でトリガーされる、アクリダンホスフェート５、ルシゲニン、ＳＤＳおよびＴＷＥＥＮ２０を含有する本発明の試薬組成杓（試薬Ａ）の１００ μＬによって放射された最大化学発光強度に対してＡＰの濃度を関連付けるグラフである。比較のために、同一アクリダンホスフェートを含有するが（０．２５ＴＢ／ＴＯ）、３７℃でトリガーされるルシゲニンを含有しない試薬組成物（試薬Ｂ）を用いる実験セットからの同様のグラフを供する。化学発光の放射は、８ ×１０^-13および８×１０^-22モルの間の酵素を含有するＡＰの溶液１０μＬを、白色マイクロプレートのウェル中の各試薬組成物１００μＬに添加することによって開始させた。Ｓ−Ｂなる語は、ＡＰの不存在下におけるバックグラウンド化学発光（Ｂ）に対して補正したＡＰ存在下における相対的光単位（ＲＬＵ）での化学発光シグナル（Ｓ）をいう。該グラフは、ルシゲニンを含む試薬Ａが１００倍低いＡＰについての検出限界を達成することを示す。図１０は、６．４μＭルシゲニン、１ｍｇ／ｍＬドテシル硫酸ナトリウム、０．０１ｍｇ／ｍＬＮａ₂ＳＯ₃、０．０３３％(ｗ／ｖ)ＴＷＥＥＮ２０、０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．８、中の０．６６ｍＭアクリダンホスフェート７を含有する試薬組成物１００μＬによって放射された最大化学発光強度に対してＡＰの量を関連付けるグラフである。該組成物を８×１０^-1 ⁵ および８×１０^-22モルの間の酵素を含有するＡＰの溶液１０μＬまたは試薬ブランクとしての水１０μＬと反応させ、黒色マイクロプレートのウェル中、雰囲気温度にて７５秒後に測定した。図１１は、６．４μＭルシゲニン、１ｍｇ／ｍＬドテシル硫酸ナトリウム、０．０１ｍｇ／ｍＬＮａ₂ＳＯ₃、０．０３３％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０、０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．８、中の０．６６ｍＭアクリダンホスフェート８を含有する試薬組成物１００μＬによって放射された最大化学発光強度に対してＡＰの量を関連付けるグラフである。該組成物を８×１０^-15および８×１０^-22モルの間の酵素を含有するＡＰの溶液１０μＬまたは試薬ブランクとしての水１０μＬと反応させ、黒色マイクロプレートのウェル中、雰囲気温度にて７５秒後に測定した。図１２は、８×１０^-16モルのＡＰの添加によって室温でトリガーされる、０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．８、６．４μＭルシゲニン、０．６６ｍＭアクリダンホスフェート７（０．０６６Ｍメタノール溶液の１：１００希釈からのもの）、１ｍｇ／ｍＬドデシル硫酸ナトリウム、０．０１ｍｇ／ｍＬＮａ₂ＳＯ₃、０．０３３％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０および０．８８ＭｇＣｌ₂よりなる試薬１００μＬによって放射された化学発光の迅速生成を示すグラフである。図１３は、本発明の検出試薬を用いるヒト絨毛性ゴナドトロピン用の化学発光イムノアッセイの結果を示すグラフである。図１４は、本発明の検出試薬を用いる甲状腺刺激ホルモン用の迅速な化学発光イムノアッセイの結果を示すグラフである。図１５は、本発明の検出試薬を用いる甲状腺刺激ホルモン用の化学発光イムノアッセイの結果を示すグラフである。図１６は、本発明の検出試薬を用いるエストラジオール用の化学発光イムノアッセイの結果を示すグラフである。図１７は、１つの試料中の酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼを同時に検出する能力を示すプロットである。上方のトレースは両酵素を含有する試料から放射された光であり、下方トレースは酸性ホスファターゼのみを含有する試料から放射された光であり、中央のトレースはアルカリ性ホスファターゼに帰属される差異を表す。図１８は、６．４μＭルシゲニン、１ｍｇ／ｍＬドデシル硫酸ナトリウム、０．０１ｍｇ／ｍＬＮａ₂ＳＯ₃、０．０３３％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０、１０ μＭＭｇＣｌ₂、０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．８、中の０．６６Ｍアクリダンホスフェート１２を含有する試薬組成物１００μＬによって放射された最大化学発光強度に対してＡＰの量を関連付けるグラフである。該組成物を、８×１０^-15 および８×１０^-22モルの間の酵素を含有するＡＰの溶液１０μＬまたは試薬ブランクとしての水１０μＬと反応させ、黒色マイクロプレートのウェル中、雰囲気温度にて７５秒後に測定した。図１９は、３．２μＭルシゲニン、０．５ｍｇ／ｍＬドデシル硫酸ナトリウム、０．００５ｍｇ／ｍＬＮａ₂ＳＯ₃、０．０１６％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０、５μＭＭｇＣｌ₂、０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．８、中の０．３３ｍＭアクリダンホスフェート１３よりなる試薬組成物１００μＬによって放射される最大化学発光強度に対してＡＰの量を関連付けるグラフである。該組成物を、８× １０^-15および８×１０^-22モルの間の酵素を含有するＡＰの溶液１０μＬまたは試薬ブランクとしての水１０μＬと反応させ、黒色マイクロプレートのウェル中、雰囲気温度にて７５秒後に測定した。好ましい実施態様の記載出願人の同時係属米国特許出願０８／５８５，０９０号に記載されているごとく、ある種の新規化合物がホスファターゼ酵素と反応して容易に検出される化学発光を生じることが予期せぬことに発見された。ホスファターゼ酵素の存在下で化学発光を生じる本発明の化合物は、式：［式中、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１個の五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯまたはＳ原子であり、Ｒ₆は光が生成されることを可能とする有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］を有する。酸素の存在下におけるホスファターゼとＩとの反応は、電子的に励起された状態（ＶＩ^*）のカルボニル含有化合物ＶＩおよび脱リン酸化生成物ＶＩＩの形成に導く。ＶＩ^*の放射崩壊は光放射に導く。Ｉの複素環系はＮ、ＯおよびＳ原子から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有し、環外二重結合を担持する環炭素と連結する。好ましい複素環化合物は以下に示す式ＩＩおよびＩＩＩの化合物およびそれらの二重結合異性体または該異性体の混合物を含む。［式中、Ｚ、Ｍ、ｎおよびＲ₆は前記定義に同じであって、Ｒ₁−Ｒ₅は後記にて定義する］式Ｉに戻りそれを参照し、基Ｈｅｔを含むことができる環構造の例は、星印が環外二重結合の位置を示す後記構造を含む。すべての可能な置換パターンを明示的に示すことなく、各環位置は水素以外の置換基を含有し得ることが理解されるべきである。当業者ならば、後記にて特にリストしなかったが式Ｉの範囲内にある他の複素環化合物が思い浮かぶであろう。前記化合物の全てにおいて、基Ｒ₁は、当該基における原子価を満足するのに要するＨ原子の必要数を除外して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基である。該有機基は、好ましくは、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される。より好ましくは、Ｒ₁に対する基はＣ₁−Ｃ₄アルキル基およびベンジル基を含む。前記化合物の全てにおいて、同一または異なり、各々がＨまたは光が生成されるのを可能とする置換基である基Ｒ₂−Ｒ₅は、一般に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する。存在可能なる代表的な置換基は、限定されるものではないが、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換アミノ基、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノ、およびスルホネート基を含む。隣接基の一方または双方の対、すなわち、Ｒ₂−Ｒ₃またはＲ₄−Ｒ₅は、環外二重結合を担持する環に縮合した少なくとも１つの五員または六員環を含有する炭素環または複素環系として一緒に結合し得る。かかる縮合複素環は１以上のＮ、ＯまたはＳ原子を含有でき、環炭素が、前記したごとき水素以外の基で置換できる。化合物の特性を変性し、最終ホスフェート化合物の合成の便宜を供するために、種々の量で選択された環位置に置換基を取り込むことができる。かかる特性は、例えば、化学発光量子収率、酵素との反応速度、光放射の最大強度、光放射の持続、光放射の波長および反応媒体への溶解性を含む。特定の置換基およびそれらの効果は後記する特定の実施例で説明するが、断じて本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。基Ｍの各々は、独立して、水素原子またはカチオン性中心を含む。カチオン性中心は、ナトリウム原子Ｎａ⁺のごとき正に荷電した原子、アンモニウムイオンＮＨ₄ ⁺のごとき原子群または正電荷の１以上の部位を持つ分子の一部を意味する。後者の例は、出願人による米国特許第５，４５１，３４７号に記載されたジカチオン性化合物および出願人の米国特許第５，３９３，４６９号に記載された複数カチオン性基を持つポリマー化合物を含む。カチオン性中心の正電荷はいずれの単位の値、すなわち、１、２、３等を採ることもできる。カチオン性中心の例は、限定されるものではないが、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、第四級アンモニウムイオンおよび第四級ホスホニウムイオンを含み、それらの原子価によって要求される数で存在させる。もし電気的中性のために式Ｉの化合物に２つの基が存在することが必要ならば、それらは同一または異なってもよい。好ましい対イオンはアルカリ金属イオンである。前記したごとく、有機基Ｒ₆は、光生成を可能とし、あるいはそれに干渉しないいずれの基であってもよく、好ましくは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子ならびに該基における原子価を満足するのに必要なＨ原子の必要数を含有する。Ｒ₆基として機能し得る基は、限定されるものではないが、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基を含む。イオン性基または極性基のごときＨ原子以外の置換基を種々の数にて炭素鎖またはＲ₆環の選択された位置に取り込んで、化合物の特性を変性したり、最終ホスフェート化合物の合成の便宜を供することができる。かかる特性は、例えば、化学発光量子収率、酵素との反応速度、光放射の最大強度、光放射の持続、光放射の波長および反応媒体への溶解性を含む。特定の置換基およびそれらの効果は後記する特定の実施例にて説明するが、断じて本発明の範囲を限定するものとは解釈されるべきではない。好ましいクラスの化合物は後記式ＩＶを有し、式中、各々、Ａｒは少なくとも１つの炭素環または複素芳香族環を含有するアリール環基であり、これはさらに置換可能であり、ＺはＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ₁は前記定着に同じであり、ＭはＨまたは前記した一価または二価のカチオン対イオンであり、ｎは２または１である。同一または異なってもよく、各々、ＨあるいはＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、かつ光が生成を可能とする基Ｒ₇ないしＲ₁₄は、限定されるものではないが、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換アミノ基、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノ、およびスルホネート基を含み得る。隣接する基、すなわち、Ｒ₇−Ｒ₈またはＲ₈−Ｒ₉は、少なくとも１つの五員または六員環を含む炭素環または複素環系として一緒に連結できる。好ましくはＲ₇ないしＲ₁₄は水素ならびにメトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ等のごときアルコキシ基から選択される。特に好ましい化合物は式Ｖを有し、ここに、ＺはＯまたはＳであり、Ａｒはフェニル基、置換フェニル基、ナフチル基または置換ナフチル基であって、Ｍおよびｎは前記定義に同じである。本発明のもう１つの態様は、ホスファターゼ酵素との反応によって可視化学発光を生じさせる方法における、式Ｉ−Ｖのうちいずれかの化合物の使用である。水性緩衝溶液中での式Ｉ−Ｖの化合物とホスファターゼ酵素との反応は容易に検出される化学発光を生じる。反応がアルカリ性のｐＨで行われる場合、光強度は室温にて数分内に最大レベルに到達する。反応は所望により増強剤の存在下で行うこともできる。この点の発見につきいずれの特定のメカニズム説明に拘束されるつもりもないが、分子酸素が必要な反応体であって、反応生成物はケトンＶＩ、エステルまたはチオエステルＶＩＩ、式Ｒ₆ＺＨの化合物およびホスフェートイオンである。光はＶＩの電子的に励起された状態から放射される。光の生成に必要な条件は、反応がＶＩの励起状態を形成するのに十分なエネルギーを生じることである。もしＶＩが蛍光であれば、化学発光はＶＩの励起状態からの放射を介して反応から直接生じる。特に驚くべき発見は、中程度の塩基性ｐＨにおける式Ｉの化合物とホスファターゼ酵素との反応は、ホスフェート基の切断に際して形成されることが予測し得るエノラート中間体（ＶＩＩのアニオン）の自動酸化によって生成するものよりもはるかに強い光放射を生じるということである。化学発光を生成させる好ましい方法において、約８および１０の間のｐＨを持つアルカリ性緩衝液中にて、アクリダン環を含有する化合物をアルカリ性ホスファターゼと反応させて、連続的化学発光シグナルを生じるが、これは該酵素とホスフェート化合物の反応に際して開始する。いずれの時点の光強度も、後記にてより詳細に記載するごとく、少なくとも１種の界面活性剤増強剤の取り込みによって少なくとも４０倍まで増大させることができる。化合物ＩＶとホスファターゼ酵素との反応から光を生成させる好ましい方法において、７および１０．５、好ましくは８．５および１０の間のｐＨの水性緩衝液中、５℃および５０℃、好ましくは２０℃および４０℃の間の温度にて反応を行う。化合物ＩＶは１μＭおよび２０ｍＭ、好ましくは１０μＭおよび１ｍＭの間の濃度で用いる。該酵素は、好ましくは、アルカリ性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートである。光はＶＩＩＩの励起された状態から放射される。本発明の化合物は、典型的には、放射の１００−２００ｎｍの広いバンドにわたって光を生じ、これは電磁波スペクトルの可視光線領域に対し近紫外線における波長の最大強度を示す。最大強度λ_maxの典型的な波長は３５０−５００ｎｍの範囲である。リン酸ビニル部位の二重結合と共役していない共有結合発蛍光団を担持する式Ｉのホスフェート化合物は、励起生成物ＶＩ^*の形成に際して、分子内エネルギー移動を受け、その結果、発蛍光団の励起状態からより長い波長で放射が起こると考えられる。ホスファターゼ酵素の作用により光を生成させる方法では、１を超える式Ｉの化合物を同時に使用することができる。ある場合には、２以上の式Ｉの化合物をホスファターゼ酵素と同時に反応させるのが有利であろう。２以上の化合物が異なる発光または物理的特性を有する場合、いずれか１つの化合物の使用を通じては容易に達成されない特徴を持つ光放射反応を生じさせるには、２つのものの組合せが望ましいであろう。化合物Ｉの間で異なり得る発光および物理的特性の例は、放射スペクトル、光放射の持続、酵素代謝回転、最大を生じる放射の生起速度、疎水性／親水性および溶解性を含む。特定の発光特性は本発明の方法における式Ｉの化合物の間で異なり得るが、特性の変動は化合物の基本的有用性を減じない：所望の特性を持つ特定の化合物の選択は、本明細書における教示および方法によってなすことができる。本発明の方法によって放射される光は、ルミノメーター、ｘ−線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンター、化学アクチノメーターのごときいずれの適当な公知の方法によっても検出でき、あるいは目視によっても検出できる。各検出手段は異なるスペクトル感度を有する。ヒトの目は緑色に対して最適に感受し、ＣＣＤカメラは赤色に対して最大感度を呈し、ＵＶないし青色または緑色いずれかに対して最大応答を持つｘ−線フィルムが入手できる。検出デバイスの選択は、適用ならびにコスト、便利さ、および永久的記録の生成が要求されるか否かによって支配されるであろう。蛍光エネルギーアクセプターを使用してより長い波長に対する最大放射をシフトさせることができる（赤色−シフティング）。赤色−シフティング放射のための種々の技術は化学発光反応およびアッセイの分野で知られている。前記した共有結合発蛍光団は１つの例である。蛍光体を別の種として反応溶液に添加することができる。蛍光体はカチオン性ポリマーのごとき増強剤物質に連結させることができるか、あるいはミセルまたはポリマーのごとき増強剤物質と組み合わせて、蛍光体を化合物と密に接触させることができる。別法として、蛍光体は非蛍光形態で供し、これを酵素反応の間にホスフェート基の除去によって蛍光形態に変換し得る。後者のタイプの化合物の例はフルオレセインジホスフェート、４−メチルウンベリフェロンホスフェートのごときクマリンホスフェート、ＡＴＴＯＰＨＯＳ（JBL Scientific，San Luis Obispo，カリフォルニア州）のごときベンゾチアゾールホスフェートを含む。また、少なくとも１種の増強剤化合物を本発明の化学発光反応で使用して、放射される光の量を増加させることができる。本発明の方法で効果的な増強剤は、光を放射する励起状態生成物分子の分率を増加させることによって、励起状態で形成される生成物分子の分率を増加させることによって、反応速度または酵素の代謝回転を増加させることによって、引き続いての化学反応過程の速度を増加させることによって、酵素の安定性を改良することによって、酵素と式Ｉの化合物の会合を促進することによって、競合非発光副反応を阻害または防止することによって、あるいはこれらのメカニズムのいずれの組合せによって機能させることができる。増強剤は化学発光を増強するのに効果的な量にて、好ましくは、最終反応溶液中、０．００１および５ｍｇ／ｍＬの間、より好ましくは０．０１および２．５ｍｇ／ｍＬの間で使用される。本発明の実施で効果的である増強剤化合物は典型的には界面活性剤化合物、すなわち、界面活性特性、例えば、表面張力降下、表面湿潤まなは洗浄性を呈する化合物である。界面活性剤は極性および／またはイオン性基を含有する親水性領域および主として炭水化物基またはアルキレンオキシ基あるいは双方を含有する疎水性領域を含有する。界面活性剤はカチオン性、アニオン性、非イオン性および両性イオン性として分類され、モノマーまたはポリマー性である得る。本発明の実施で有用であることが判明したカチオン性界面活性剤増強剤は、出典明示してその開示を本明細書の一部とみなす米国特許第５，３９３，４６９号に開示された、ペンダント第四級ホスホニウム基を持つポリビニル型のポリマーを含む。この型のポリマーの例は塩化ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムと塩化ポリビニルベンジルトリオクチルホスホニウムおよび（塩化ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウム）とのコポリマーを含む。また、ペンダント第四級アンモニウム基を持つポリビニルタイプのポリマーも本発明における増強剤として有用である。かかるポリマーの例は、出典明示してその開示を本明細書の一部とみなす米国特許第５，１１２，９６０号に開示されており、塩化ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムおよび塩化ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムを含む。本発明の実施で有用なことが判明しているカチオン性界面活性剤増強剤のもう１つのカテゴリーは、出典明示してその開示を本明細書の一部とみなす米国特許第５，４５１，３４７号に開示されている２つの第四級アンモニウムまたはホスホニウム基を担持するジカチオン性化合物である。化合物（二塩化１−トリオクチルホスホニウムメチル−４−トリブチルホスホニウムメチルベンゼン）は、例えば、本発明の光を生じる方法で用いると、増強された化学発光を供する。本発明の実施で有用なさらなるカチオン性界面活性剤増強剤はモノ第四級アンモニウム塩、例えば、塩化もしくは臭化セチルトリメチルアンモニウムおよび臭化セチルトリメチルアンモニウムのごときモノ第四級ホウホニウム塩である。アニオン性界面活性剤増強剤は硫酸アルキルおよびスルホン酸アルキルを含む。非イオン性界面活性剤増強剤はポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテルおよびポリオキシエチレン化ソルビトールエステルを含む。両性イオン界面活性剤増強剤はホスホン酸およびスルホン酸第四級アンモニウムアルキルを含む。各カテゴリーの界面活性剤の構造の例の広範なリストは界面活性剤についてのいずれの標準的な論文にも見い出すことができる。多数の代表的なメンバーの界面活性剤がテストされ、その不存在下で生じた量と比較して、生じた光の量または強度を増大させることにおいて種々の程度効果的であることが判明している。カチオン性界面活性剤、特に、第四級アンモニウムおよび第四級ホスホニウム塩はとりわけ最も効果的な増強剤であることが判明している。前記したごとく、界面活性剤増強剤は静電的もしくは疎水性相互作用を介して共有結合したまたは会合した蛍光基を有し得る。本発明の化学発光反応を行う別の態様において、該発光化合物を増強剤の不存在下で、数秒間ないし約１０分未満の範囲の第１の時間に、範囲５．０ないし９．５の第１ｐＨの緩衝液中でホスファターゼ酵素と反応させる。この第１期間に生じたいずれの光も無視される。次いで、増強剤を含有する強塩基性のトリガー溶液を一度に添加し、ピーク強度を測定することによって光のバーストを測定し、あるいは第２の固定時間の間、または光放射が止むまで積分する。全ての光が短時間、好ましくは、約１分以内に放射されるように、ｐＨおよび増強剤の量を選択するのが望ましい。トリガー溶液のｐＨは＞１１であるべきで、好ましくは約１２を超えるべきである。好ましい塩基は水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムである。この態様の反応で有用な増強剤は前記議論で同定され、化学発光を増強するのに効果的な量、好ましくは、最終反応溶液中０．００１および１ｍｇ／ｍＬの間で使用されることとなろう。化学発光を生じるこの態様は、大量の試料を後の測定のために同時に加工するアッセイで有利であり得る。また、酸性ホスファターゼの検出もこのようにして行うことができる。かかる化学発光反応またはアッセイに取り入れることもできる任意の工程は、全てのさらなる酵素作用を停止させる第１の期間後において酵素阻害剤を反応系に添加することである。反応はホスファターゼ酵素によって触媒されるので、光の検出可能な量を生じるのにはかなり少量の酵素で十分である。１アットモル（１×１０^-18モル）の感度が達成された。かかる少量のホスファターゼ酵素を検出する能力は、本発明の化学発光技術を、酵素結合アッセイを用いる多くのタイプの分析物の分析に適したものとする。本発明の化学発光反応は、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ナイロン膜上の、およびニトロセルロースフィルターおよび膜上のＡＰコンジュゲートの検出用の特に効果的な試薬を提供する。驚くべきことに、ＰＶＤＦ膜上の抗体− ＡＰ−コンジュゲートと化合物１：を含有する試薬組成物との反応は、ほとんど瞬時に最大レベルまで生起し、少なくとも２日間実質的に一定の強度を維持する強い発光を生じることが判明した。フィルム上の検出およびイメージ強度の最適化はかくして特に便利である。驚くべきことに、ＰＶＤＦ膜上で生じた光放射は１ヶ月を超える非常に長い間、有用なレベルで持続することが判明した。迅速な崩壊を示す（例えば、３−４時間内に崩壊するペルオキシダーゼを用いるルミノール）、または酵素−トリガージデキセタンの場合のようにゆっくりとした生起および暫時の崩壊を示す、膜をベースとする検出スキームで使用される当診分野で公知の化学発光試薬は経時的に発光シグナルを生じる。もう１つの態様において、本発明は、約７および約１０．５の間のｐＨを持つ水性緩衝液、０．０１−１０ｍＭの濃度の式Ｉの化合物および所望により化学発光を増強するのに効果的な量の、好ましくは０．００１および１０ｍｇ／ｍＬの間の少なくとも１種の増強剤を含有する、ホスファターゼ酵素との反応によって化学発光を生じさせるための試薬組成物に関する。アルカリ性ホスファターゼとの化学発光反応用の処方は、さらに、該酵素の活性を増大させるための０．０１ −１０ｍＭの濃度のマグネシウムまたは亜鉛塩を含む。ホスファターゼ酵素との反応によって化学発光を生じるさせるための好ましい試薬組成物は、約７および約１０．５の間のｐＨを持つ水性緩衝液、０．０１− １０ｍＭの濃度の式ＩＶまたはＶのアクリダンホスフェートおよび化学発光を増強するために効果的な量の、好ましくは０．００１および１０ｍｇ／ｍＬの間の界面活性剤増強剤を含有する。該処方は、さらに、０．０１−１０ｍＭの濃度のマグネシウム塩を含む。試薬組成物中の界面活性剤増強剤は、アンモニウムまたはホスホニウム基を含有するポリマーカチオン性増強剤およびアンモニウムまたはホスホニウム基を含有するジカチオン性増強剤よりなる群から選択されるのが好ましい。特に好ましいのは、各モノマー単位上にペンダントトリアルキルホスホニウム基を担持するポリビニルポリマーおよび各モノマー単位上にペンダントトリアルキルアンモニウム基またはベンジルジアルキルアンモニウム基を担持するポリビニルポリマーである。増強剤の量および選択は、ルーチンの実験で所与の適用において最適な性能を示すよう選択できる。溶液中におけるＡＰまたはコンジュゲートの検出用の好ましい組成物は、アミン緩衝液（ｐＨ８．５）、化合物９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン二ナトリウム塩（０．１ −１ｍＭ）、マグネシウム塩（０．１−１ｍＭ）、および増強剤Ａ（約３：１の比のトリブチル：トリオクチル基を含有するポリビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩化物コ−ポリビニルベンジルトリオクチルホスホニウム塩化物）（０．０１−０．１ｍＭ）を含有する。膜上のＡＰまたはコンジュゲートの検出用の好ましい組成物は、アミン緩衝液（ｐＨ９．６）、化合物９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン二ナトリウム塩（０．１− １ｍＭ）、マグネシウム塩（０．１−１ｍＭ）、および増強剤Ａ（０．１−１ｍＭ）を含有する。出願人の同時係属米国特許出願第０８／６８３，９２７号は、カチオン性芳香族化合物（ＣＡＣ）の前記反応系への添加が生じる光の量および／または強度を大いに増加させることを開示する。さらに、ホスファターゼ酵素の不存在下での式Ｉの化合物へのＣＡＣの添加は、自然発生（バックグラウンド）化学発光における対応する増加には導かない。というのは、ＣＡＣは化合物Ｉに由来する脱リン酸化中間体に対してはその効果を発揮し、化合物Ｉ自体に対しては発揮しないと考えられるからである。増大したシグナル／バックグラウンドによって、ホスファターゼ酵素の検出の大いに増大した感度が得られる。光放射はＶＩの励起状態から連続的に生起するが、ＣＡＣからは生起しないことは重要である。種々のＣＡＣが、生じる光の量および／または強度を増加させるように機能することが判明している。ＣＡＣは芳香族環または環系上に少なくとも１の正電荷を担持する、あるいは環の１つ上の置換基に存在する芳香族化合物である。但し、該置換基は不飽和環原子と共投している。本発明のＣＡＣは、本発明の反応において化学発光の増加を引き起こすのに適した酸化／還元能を有する化合物である。ＣＡＣとしての化合物の適切性は後記する特定の実施例に記載された方法によって容易に決定される。特定のメカニズム解釈に拘泥するものではないが、式Ｉの脱リン酸化の中間体生成物は、可逆的または不可逆的であり得るレドックス反応を受けるようである。分子酸素は、ＣＡＣ、ＣＡＣの還元形態または化合物Ｉの脱リン酸化中間体もしくはその酸化もしくは還元形態から選択される反応における反応種の１種以上と反応して、化合物Ｉから誘導された酸素化反応生成物を最終的に形成する。酸素化反応生成物は化学発光反応を受け、これはＯ−Ｏ結合分解反応であるようである。本発明のＣＡＣは、炭素以外の少なくとも１個の原子（ヘテロ原子）、好ましくは正電荷が１以上のヘテロ原子上に実質的に局在する１個以上の窒素原子を含有する１以上の分離したまたは縮合した芳香族環を含むヘテロ芳香族環化合物であり得る。ＣＡＣのこのクラスの例はシアニン色素、チアシアニン色素、カルボシアニン色素、チアカルボシアニン色素、セレナカルボシアニン色素、アゾ色素および式：［式中、Ｑは電子吸引基、Ｘ−は非干渉性アニオン対イオンであって、Ｒはアルキルまたはアラルキル基であり、その各々は所望により非干渉性置換基を含有していてもよい］のアクリジニウム誘導体である。環水素のいくつかが他の置換基によって置き換えられたアクリジニウム誘導体も機能的ＣＡＣの範囲内のものである。電子吸引基Ｑは、例えば、Ｃｌのごときハロゲン原子、シアノ基、またはエステル基−ＣＯＯＲ、チオエステル基−ＣＯＳＲ、アミド基−ＣＯＮＲ¹Ｒ²またはスルホンイミド基−ＣＯＮ（Ｒ）ＳＯ₂Ｒ’のごときカルボニル基であり得る。同様に、ＣＡＣはフェナントリジニウムまたはフェナントロリニウム化合物の誘導体であり得る。本発明のＣＡＣは、少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１のカチオン性置換基を担持する１以上の分離したまたは縮合した炭素環芳香族環を含む芳香族環化合物であり得る。但し、カチオン部位は芳香族環と共役しているものとする。ＣＡＣの後者のクラスにおいて、ヘテロ原子が窒素または硫黄原子であるのが好ましい。その例はメチレンブルーおよびナイルブルーを含む。本発明のＣＡＣは、１を超える正電荷を担持し得る；例えば、ジカチオン化合物は本発明の範囲内のものである。このタイプの化合物の例は、通常はルシゲニンとして知られているＮ，Ｎ’−ジメチルビアクリジニウム二硝酸塩および通常はメチルバイオレット二塩化物またはパラクアット二塩化物として知られている１，１’−ジメチル−４，４’−ビピリジニウム二塩化物を含む。本発明のＣＡＣ化合物として有用であるさらなる化合物は、その例として、表１の化合物を含む。表１、ＣＡＣアルシャンイエロー、ベーシックブルー４１、ベーシックブルー６６、ベーシックレッド２９、塩化３−ベンジル−５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾリウム、［２−［２−［２−クロロ−３−［（１，３−ジヒドロ−１，３，３−トリメチル−２Ｈ−インドール−２−イリデン）エチリデン］−１−シクロヘキセン− １−イル］エテニル］１，３，３−トリメチルインドリウム過塩素酸塩、｛ＩＲ −７８６過塩素酸塩｝ヨウ化トランス−４−［４−（ジブチルアミノ）スチリル］−１−メチルピリジニウム、５，５’−ジクロロ−１１−ジフェニルアミノ−３，３’−ジエチル−１０，１２−エチレンチアトリカルボシアニン過塩素酸塩、｛ＩＲ−１４０｝、ヨウ化３，３’−ジエチル−９−メチルチアカルボシアニン、ヨウ化１，１’−ジエチル−２，２’−キノトリカルボシアニン、ヨウ化３，３’−ジエチルセレナカルボシアニン、ヨウ化３，３’−ジエチルチアシアニン、ヨウ化３，３’−ジエチルチアジカルボシアニン、ヨウ化２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−エチルベンゾチアゾリウム、臭化３，６−ジメル−２−（４−ジメチルアミノフェニル）−ベンゾチアゾリウム、ヨウ化３，４−ジメチル−５−（２−ヒドロキシエチル）チアゾリウム、テトラフルオロホウ酸４−［２−［３−［（２，６−ジフェニル−４Ｈ−チオピラン−４−イリデン）エチリデン］−２−フェニル−１−シクロ−ヘキセン− １−イル］エテニル］−２，６−ジフェニル−チオピリリウム｛ＩＲ−１０４０｝、ヨウ化５−［３−エトキシ−４−（３−エチル−５−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−ブテニリデン］−３−エチル−２−［（３−エチル −４，５−ジフェニル−２（３Ｈ）−チアゾリリデン）メチル］−４，５−ジヒドロ−４−オキソチアゾリウム、塩化３−エチル−２−（２−ヒドロキシ−１−プロペニル）ベンゾチアゾリウム、ヨウ化３−エチル−２−メチルベンゾチアゾリウム、ヨウ化３−エチル−２−メチルベンゾオキサゾリウム、塩化１−エチル−３−メチル−１Ｈ−イミダゾリウム、メチレンブルー、ナイルブルーＡ、およびトリホスホピリジンヌクレオチド、ナトリウム塩水和物従って、本発明のもう１つの態様は、ホスファターゼ酵素との反応によって検出可能な化学発光を生じさせる方法における、式Ｉ−Ｖのうちいずれかの化合物およびＣＡＣの使用である。水性緩衝溶液中でのＣＡＣの存在下における式Ｉ− Ｖの化合物とホスファターゼ酵素との反応は、ＶＩの励起状態から容易に検出される化学発光を生じる。反応をアルカリ性ｐＨで行う場合、光強度は室温にて数秒ないし数分間内に最大レベルに到達する。化学発光を生じさせる好ましい方法において、アクリダン環を含有する式ＩＶの化合物をＣＡＣの存在下で約７および１０．５の間のｐＨを持つアルカリ性緩衝液中のアルカリ性ホスファターゼと反応させて、連続的化学発光シグナルを生じさせ、これは酵素の反応に際して開始され、迅速にピーク強度に達する。光生成反応におけるさらなる修飾および改良が、後記にてより詳細に記載されるごとく、アニオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤を組み合わせて取り入れることによって実現できる。化合物ＩＶとホスファターゼ酵素およびＣＡＣとの反応から光を生成する好ましい方法において、反応は、７および１０．５、好ましくは約８および１０の間のｐＨの水性緩衝液中、５℃および５０℃、通常は２０℃および４０℃の間の温度で行う。雰囲気温度近くの光強度に対する比較的小さな温度の影響のため、温度を正確に調節する必要なくして、雰囲気温度で反応を行うのが特に便利である。化合物IVは１μＭおよび２０ｍＭ、好ましくは１０μＭおよび１ｍＭの間の濃度で用いる。該酵素は好ましくはアルカリ性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートである。ＣＡＣの存在下でのホスファターゼ酵素の作用により光を生成させる方法において、１を超える式Ｉ−Ｖの化合物を同時に使用することができる。ある場合には、２以上の式Ｉ−Ｖの化合物をホスファターゼ酵素およびＣＡＣと同時に反応させるのが有利である。２以上の化合物が異なる発光もしくは物理的特性を有する場合、この２つの組合せは、いずれか１つの化合物の使用を通じて容易に達成されない特徴をもつ光放射反応を生じさせるのに望ましい。化合物Ｉ−Ｖの間で異なり得る発光および物理的特性の例は、放射スペクトル、光放射の持続、酵素代謝回転、放射を最大とする生起速度、疎水性／親水性および溶解性を含む。同様に、ホスファターゼ酵素の作用により光を生じさせる方法において、１を超えるＣＡＣを同時に使用することができる。ＣＡＣは１０^-2Ｍおよび１０^-9Ｍ、好ましくは約１０^-4Ｍおよび１０^-7Ｍの間の濃度で使用する。本発明の方法で使用する特定のＣＡＣの望ましい濃度は、後記する特定の実施例に記載した方法によって容易に決定することができる。もう１つの態様において、本発明は、約７および約１０．５の間のｐＨをもつ水性緩衝液、式Ｉ−Ｖの化合物および化学発光の増大したレベルを供するのに効果的な量のＣＡＣを含有するホスファターゼ酵素との反応によって化学発光を生じさせるための試薬組成物に関する。加えて、式Ｉ−Ｖの化合物およびＣＡＣとホスファターゼ酵素との反応にある種の添加剤を配合する結果、光生成反応においてさらに望ましい改良が得られることが判明した。従って、本発明のさらにもう１つの態様は、式Ｉ−Ｖの化合物、ＣＡＣ、有効量のアニオン性界面活性剤および有効量の非イオン性界面活性剤を含有する試薬組成物である。アニオン性界面活性剤は、最大化学発光強度に到達する速度を実質的に増大させるよう働く。非イオン性界面活性剤は、生じる化学発光の量または強度を実質的に増大させるように働く。後者の組成物の使用は、ピーク光強度に迅速に到達し、それを維持させる増大した光放射を供する場合において特に有利である。カチオン性界面活性剤が化学発光の生成を増強させる出願人の同時係属米国特許出願第０８／５８５，０９０号の方法とは対照的に、モノマーおよびポリマー双方のカチオン性界面活性剤の配合は、ＣＡＣの存在を要する化学発光反応を促進するのに効果的でない。ある場合には、カチオン性界面活性剤を含めると光生成を実質的に消滅させてしまう。本発明の方法および組成物におけるカチオン性界面活性剤の反対の効果は、ＣＡＣを利用することに起因する化学発光反応プロセスにおける差異を強調する。ＣＡＣを含有する組成物に有用なアニオン性界面活性剤は少なくとも１０個の炭素のアルキル基を有する硫酸アルキルおよびスルホン酸アルキルを含む。好ましい化合物はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。アニオン性界面活性剤は約１０ｍｇ／ｍＬないし１０μｇ／ｍＬの範囲の量で用いるのが好ましい。ＣＡＣを含有する組成物で有用な非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテルおよびポリオキシエチレン化ソルビトールエステルを含む。好ましい非イオン性界面活性剤はＴＷＥＥＮ２０およびＴＲＩＴＯＮＸ−１００を含む。非イオン性界面活性剤は、好ましくは、組成物の約１．０重量％ないし約０．００１重量％の量で使用される。各カテゴリーの界面活性剤の例示的構造のより広範なリストは界面活性剤に関するいずれの標準的な論文でも見受けられ、当業者に知られている。多数の代表的なメンバーの界面活性剤がテストされ、その不存在下で生じる量と比較して、生じる光の量または強度を増大させるのに種々の程度効果的であることが判明した。本発明のさらなる態様は、式Ｉ−Ｖの化合物、ＣＡＣ、有効量のアニオン性界面活性剤、有効量の非イオン性界面活性剤およびホスファターゼ酵素の不存在下で（バックグラウンド化学発光）当該組成物によって生じる化学発光を減少させる有効量のバックグラウンド低下剤を含有する試薬組成物である。バックグラウンド低下剤は、ホスファターゼ酵素の不存在下で組成物によって生成する化学発光を低下させる化合物である。また、これらの低下剤は、バックグラウンド化学発光の蓄積を長期間にわたって防止することによっても機能し得る。また、これらの低下剤は、バックグラウンド化学発光に対する、組成物とホスファターゼ酵素との反応によって生じる特定のシグナルの比率を改良することによっても機能し得る。バックグラウンド化学発光の量を低下させるのに効果的な好ましい化合物は、亜硫酸リチウム、亜硫酸ナトリウムおよび亜硫酸カリウムのごとき亜硫酸塩を含む。溶液中のＡＰまたはコンジュゲートの検出用の好ましい組成物は、アミン緩衝液（ｐＨ８．５−９、０．１−１０００μＭルシゲニン、０．１−１．０ｍＭ化合物５、０．１−５ｍｇ／ｍＬＳＤＳ、１−１００μｇ／ｍＬＮａ₂ＳＯ₃、０．０１−０．１％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０および０．１−１．０ｍＭＭｇ塩を含有する。膜上のＡＰまたはコンジュゲートの検出用の好ましい組成物は、アミン緩衝液ｐＨ８．５−９、０．１−１０００μＭルシゲニン、０．１−１．０ｍＭ化合物５、０．１−５ｍｇ／ｍＬＳＤＳ、１−１００μｇ／ｍＬＮａ₂ ＳＯ₃、０．０１−０．１％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０および０．１−１．０ｍｇＭｇ塩を含有する。本方法で効果的な組成物は、光を放射する励起状態生成物分子の分率を増大させることによって、励起状態で形成される生成物分子の分率を増大させることによって、酵素の反応または代謝回転の速度を増加させることによって、引き続いての化学反応過程の速度を増加させることによって、酵素の安定性を改善することによって、式Ｉの化合物と酵素との会合を促進することによって、競合する非発光副反応を阻害または防止することによって、あるいはまだ確認されていないメカニズムのごとき他のことによって機能し得る。蛍光エネルギーアクセプターを使用して最大放射を長波長にシフトさせることができると考えられる（赤色−シフティング）。赤色−シフティング放射のための種々の技術は化学発光反応およびアッセイの分野で知られている。蛍光体を式Ｉ−Ｖの化合物に共有結合させることができ、それにより、対応する化合物ＶＩの励起状態は分子内エネルギー移動を受け、その結果、より長波長での放射となる。蛍光体を別の種として反応溶液に添加することができる。蛍光体はミセルを形成できるアニオン性または非イオン性界面活性剤に連結させて、蛍光体を光放射体と密に接触させることができる。別法として、蛍光体を非蛍光形態で供し、これを酵素反応の間にホスフェート基の除去によって蛍光形態に変換することもできる。後者のタイプの化合物の例はフルオレセインジホスフェート、４−メチルウンベリフェロンホスフェートのごときクマリンホスフェートおよびＡＴＴＯＰＨＯＳ（JBL Scientific，San Luis Obispo，カリフォルニア州）のごときベンゾチアゾールホスフェートを含む。本化学発光方法の重要な使用は、化学発光反応によるアッセイ手法における分析物の存在または量を検出するためのものである。該方法は、分析物を含有することが考えられる試料を本発明の化学発光化合物およびホスファターゼ酵素と接触させ、生じた光を定性的方法で検出し、もし定量が望まれるならば、生じた光の量を分析物の量に関連付ける工程を含有する。光強度と分析物の量との間の関係は、既知量の分析物で検量曲線を作成することによって容易に認識することができる。化学発光化合物は、典型的には、約１０^-5Ｍないし約１０^-2Ｍ、好ましくは約１０^-4および約１０^-3Ｍの間の濃度で用いる。ホスファターゼ酵素は、好ましくは、溶液中で分析する場合は約１０^-9Ｍ未満である。化学発光反応方法によって分析される典型的な試料は血液、血漿、血清、尿および精液のごとき体液である。本明細書で用いる分析物は、その存在が試料中で検出でき、あるいは定量できる物質を意味する。本方法によってアッセイできる分析物はホスファターゼ酵素を含み、この場合、さらなるホスファターゼを添加する必要はないであろう。分析物はホスファターゼ酵素の阻害剤であり得る。分析物は当該分野で一般的に知られているリガンド−バインダーアッセイで検出できる有機および生物学的分子の種々のクラスのいずれであってもよく、免疫アッセイ、核酸プローブアッセイ、細胞レセプターアッセイ等を含む。これらのアッセイにおいて、分析物をホスファターゼ酵素で標識し、あるいはホスファターゼ−標識特異的結合パートナーを介して特異的に検出することができる。ホスファターゼは標識として分析物結合性化合物に直接取り込むことができる。別法として、分析物結合性化合物を分析物結合性化合物のための少なくとも１種のホスファターゼ−標識特異的結合性物質に結合させることができる。別法として、分析物結合性化合物は少なくとも１種の第２の特異的結合性物質で標識することができ、次いで、これを第２特異的結合性物質のためのホスファターゼ−標識結合性パートナーに結合させる。また、ホスファターゼ酵素は競合アッセイにおける酵素−ハプテンコンジュゲートのごときリガンドアナログ上の標識として供することもできる。化学発光反応を受け得るホスファターゼ酵素はイー・コリ(E．coli)のごとき細菌源からのアルカリ性ホスファターゼ、または植物または哺乳動物源からの哺乳動物アルカリ性ホスファターゼまたは酸性ホスファターゼを含む。また、ホスファターゼ酵素および生物学的分子のコンジュゲートを化学発光を生成させる方法で用いることもでき、但し、コンジュゲートはホスファターゼ活性、すなわち、ホスフェートモノエステルを加水分解する能力を示すものでありさえすればよい。ホスファターゼ酵素の１以上の分子にコンジュゲートさせ得る生物学的分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、蛋白質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチンを含む。生物学的分子への付着のために機能化されたリポソーム、ミセル、小胞およびポリマーのごとき、ホスファターゼ酵素を包括しまたは取り込む複合体も本発明の方法で用いることができる。化学発光を生じさせるための本発明の組成物とホスファターゼ酵素との反応は、ホスファターゼ酵素の存在または量を検出する迅速で高度に感受性の方法を構成する。従って、試料と式Ｉの化合物との反応によって生成した光の量または強度を測定することによって、試料中のホスファターゼ酵素の存在または量を測定する目的で本発明の方法を使用することができる。かかる測定は、例えば、患者の肝臓機能の状態の指標としてまたはある種の病気状態の指標として血清中のアルカリ性ホスファターゼのレベルを測定することに用いることができる。また、前立腺酸性ホスファターゼは前立腺癌の臨床的診断指標として有用である。本発明の組成物は、２−５秒内に最大強度に迅速に到達し、次いで、短時間内で崩壊する化学発光を生じる酸性ホスファターゼ（ＡｃＰ）の測定で有用である。組成物のｐＨがＡｃＰ活性の最適ｐＨよりもかなり高くても、この酵素を良好な感度で定量することが可能である。さらにＡｃＰはこの検出試薬の方法によってＡＰの存在下で測定できる。ＡｃＰおよびＡＰによって誘導された化学発光シグナルは異なる反応速度を示すので、１つの実験において、同一試料でＡｃＰおよびＡＰ活性双方を同時に測定することが可能である。ホスファターゼ活性の化学発光測定のための適用の第２の領域は酵素阻害剤の検出および測定におけるものである。阻害剤は、本発明の化合物のごとき第２の基質との競合における基質して作用することによって可逆的に作用し得る。自殺阻害として知られている阻害のもう１つの様式は酵素を脱活性化することによって不可逆的に作用する。アルカリ性ホスファターゼの阻害剤は無機ホスフェート、レバミソールおよびそのラセミ形態テトラミソールを含み、他のイミダゾ［１，２−ｂ］チアゾール、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−ホモアルキニンはR．B．McComb，G.N．Bowers，S．Posen in Alkaline Phosphatase. Plenum Press，New York 1979，頁 268-275，332-334，394-397，410-413中に確認される。酸性ホスフェートの阻害剤はフルオリド、モリブデート、オルトホスフェートイオン、タルトレート、４−（フルオロメチル）フェニルホスフェートおよび４−（フルオロメチル）フェニルホスフェートを含む(J．K．Myers，T. S．Widlanski，Science，262，1451-3(1993))。いくつかの物質はある濃度において阻害性であるに過ぎず、しかも部分的に阻害性であるに過ぎないことは理解される。阻害定数Ｋ_i、または阻害の半減期、ｔ_1/2のごとき阻害剤の量または特徴の測定は、検出可能な生成物を生じる基質の存在下における問題となる酵素を含有する試料の酵素活性および阻害剤の量を測定することによってなされる。本発明によるホスファターゼ阻害剤を検出する方法において、式Ｉの化合物は検出可能な生成物として光を生じる。ホスファターゼ酵素と化学発光化合物との反応は、阻害剤物質の存在下および不存在下で行い、結果を比較して、阻害剤の存在または量を決定する。阻害剤の効果は３つの効果、光強度の減少、光強度の生起のよりゆっくりとした速度または光放射が開始する前の崩壊のうちいずれかの１以上を有し得る。ホスファターゼ活性の化学発光測定のための適用の第３の領域は遺伝子発現アッセイである。アルカリ性ホスファターゼ、特に排泄される胎盤で生じた酵素はレポーター遺伝子として有用である(J．Alam.，J．Cook，Anal．Biochem．188， 245-54(1990))。このタイプのアッセイにおいて、レポーター酵素の発現の原因たる遺伝子をプラスミドを介して生物の遺伝物質に、プロモーターまたはエンハンサー配列の近くにてクローン化する。転写活性に対するプロモーターまたはエンハンサー配列の効果はレポーター酵素の生産のレベルを測定することにより推し量る。酵素アッセイを行う技術はよく知られている。本明細書で教示される例によって提供されるガイダイスに従い、試料を作成し、試薬の適量および比率、反応時間を測定し、検量曲線を作成する手法の変形は、ルーチン的実験の事項として考案する当業者の能力内のものである。反応はホスファターゼ酵素によって触媒されるので、かなり少量の酵素が検出可能量の光を生じるのに十分である。４ゼプトモル（４×１０^-21モル）の感度が達成される。かかる少量のホスファターゼ酵素を検出する能力は、本化学発光技術を、酵素−結合アッセイを用いる多くのタイプ分析物の分析に適したものとする。かかる分析およびアッセイは、分析すべき試料中の分析物の低量のため、または限定された試料量のため、少量のホスファターゼ酵素を検出する能力を要する。このタイプのアッセイにおいては、アルカリ性ホスファターゼは特異的結合対の１つのメンバーにコンジュゲートされる。その例は、いわゆる酵素−結合イムノソルベント検定法またはＥＬＩＳＡのごとき化学発光酵素−結合イムノアッセイである。かかるアッセイは、手動様式において、ならびに自動マルチテストイムノアッセイ系で通常に使用される。典型的なイムノアッセイにおいて、分析物ハプテン、抗原または抗体は、分析物に対する酵素−標識特異的結合性パートナーあるいは分析物の酵素−標識アナログの存在または量を測定することによってアッセイされる。免疫化学的工程を行うための種々のアッセイ様式およびプロトコルは当該分野でよく知られており、それ自体本発明の一部を構成しない。これらのアッセイは広く２つの範疇に入る。競合アッセイは、特異的抗体と分析物および分析物アナログ、例えば検出可能に標識された分析物分子との免疫学的結合を特徴とする。サンドイッチアッセイは、２つの抗体（そのうちの１つは検出可能に標識される）と分析物との順次のまたは同時の結合の結果である。このように形成された検出可能な酵素−標識結合対は本発明の化合物および方法でアッセイできる。測定は、当該分野で通常に使用されるビーズ、チューブ、マイクロウェル、磁性粒子、テスト片、膜およびフィルターを含めた固体表面または支持体に付着した酵素−標識種で行うことができる。また、検出可能な酵素−標識種を、溶液中で自由に存在させるか、あるいはリポソームのごとき組織されたアセンブリー内に包括することもでき、この場合、溶解剤を使用してリポソームを溶解させ検出可能に酵素を遊離させる。もう１つの例示的使用は、ウェスタンブロッティングの技術による蛋白質の検出である。分析物として注目する蛋白質を含有する試料が電気泳動分離に対する対象である。毛管作用によって、または電場の助けを借りて、分離された蛋白質をブロッティング膜に移す。かかる移された蛋白質は、典型的には、特異的一次抗体および一次抗体を認識しそれに結合する酵素−標識二次抗体で検出される。マーカー酵素活性の可視化は、分析物蛋白質の存在を反映する。本発明の方法をウェスタンブロッティングに適合させるには、ＡＰコンジュゲーテッド二次抗体を使用でき、化学発光剤として本発明の化合物を用い、化学発光でＡＰ活性を測定する。ビオチン化抗体およびアビジン−ＡＰを用いるごときこの技術に対する変形は、本発明方法を用いて行うことができるアッセイの範囲のものと考えられる。前記した抗原−抗体、ハプテン−抗体または抗体−抗体対に加え、特異的結合対は相補的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−レセプター、レクチン−炭水化物、ＩｇＧ−プロテインＡ、核酸−核酸結合蛋白質および核酸−抗−核酸抗体も含むことができる。本発明の検出方法の特に有用な適用は、酵素−標識核酸プローブの使用による核酸の検出である。酵素−標識を用いる核酸の分析および化学発光検出の方法、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、サザーンブロッティングにおけるＤＮＡ検出、ノーザンブロッティングによるＲＮＡ検出、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡフィンガープリンティング、コロニーハイブリダイゼーションおよびプラークリフトはすべてよく確立された技術である。酵素標識（例えば、ＡＰ）を、プローブオリゴヌクレオチドまたは捕獲オリゴヌクレオチドとの直接的コンジュゲートとして存在させることができるか、あるいは当該分野で公知の方法を用いてそれを間接的連結を介して取り込むこともできる。間接的連結手段の例は、ハプテン −標識オリゴヌクレオチドおよび抗−ハプテン−ＡＰコンジュゲートまたはビオチン化オリゴヌクレオチドおよびアビジン−ＡＰコンジュゲートの使用を含む。かかる核酸アッセイは、ブロッティング膜上、あるいは当該分野で知られているごときビーズ、チューブ、マイクロウェル、磁性粒子、テスト片を含めた固体表面に付着させたオリゴヌクレオチドを用いて溶液中で行うことができる。化合物Ｉ−ＩＶの調製方法本発明の化学発光ホスフェート化合物Ｉ−ＩＶの調製に有用なプロセスおよび中間体は同時係属出願５８５，０９０号に開示され、具体化されている。さらなる例示的方法および条件を案出する目的で、以下のさらなる説明的情報を掲げる。略言すれば、該プロセスは複素環エステルまたはチオエステル化合物ＶＩＩＩを塩基と反応させてＶＩＩＩのエノラートを形成させ；該エノラートをリン酸化剤と反応させてＶＩＩＩのエノラートをリン酸化して保護されたエノールホスフェートＩＸを形成させ、もしカチオン種が脱保護剤の一部でない場合にはカチオン種Ｍの存在下で少なくとも１種の脱保護剤とＩＸとを反応させることによって、該エノールホスフェートを脱保護してエノールホスフェート塩化合物を形成させることを含む。１つの具体例において、まず、化合物ＶＩＩＩのエノラートをオキシハロゲン化リン化合物ＰＯＷ₃（ＷはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択されるハロゲン原子である）と反応させてエノールジハロホスフェートＸを形成させることによって保護されたエノールホスフェートＩＸを形成させる。ヒドロキシリック化合物Ｙ−ＯＨの少なくとも２当量との反応によって、中間体エノールジハロホスフェートＸを保護されたエノールホスフェートＩＸに変換する。次いで、もしカチオン種が脱保護剤の一部でない場合はカチオン種Ｍの存在下で、少なくとも１種の脱保護剤との反応によって、ホスフェートトリエステルＩＸをホスフェート塩Ｉに変換する。好ましくは、ハロゲンＷはＣｌである、ヒドロキシリック化合物Ｙ−ＯＨとして働き得る化合物は、限定されるものではないが、メタノールおよびエタノールのごとき低級アルコール、３−ヒドロキシプロピオニトリル（ＨＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ）および２−トリメチルシリルエタノールのごとき置換された低級アルコール、フェノール、置換されたフェノール、ベンジルアルコールおよび一般的に知られているその他のものを含む。もう１つの具体例において、ＶＩＩＩのエノラートを保護基Ｙを含有し式Ｗ− ＰＯ（ＯＹ）₂を有するリン酸化剤と反応させることによって保護されたエノールホスフェートＩＸをＶＩＩＩから直接に調製することができる。このリン酸化剤中の基Ｏ−Ｙは、その例として、ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₃等のごときアルコキシ、シアノエトキシ（ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ）またはトリメチルシリルエトキシ（ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｓｉ（ＣＨ₃）₃）のごとき置換されたアルコキシ、フェノキシ、置換されたフェノキシ、ベンジルオキシおよび技量のある有機化学者に一般に知られている他のものを含むことができる。また、２つの基Ｏ−Ｙも試薬中で起こるごとく単一の基として一緒に合することもできる。エノラートは、−９０ないし２５℃の範囲の温度にて非反応性有機溶媒中、エステルまたはチオエステル化合物ＶＩＩＩを強塩基と反応させることによって形成される。好ましい態様において、該反応はドライアイス／アセトン浴の温度、名目上は−７８℃で一定時間行い、次いで、第２の時間で０ないし２５℃まで加温する。適当な溶媒は、エノラートを形成するのに要する強塩基に適合する非プロトン性溶媒であり、エーテルおよび炭化水素溶媒を含む。好ましい溶媒はテトラヒドロフランである。強塩基およびカルボニル化合物ＶＩＩＩをいずれかの順序で反応容器に添加できる。リン酸化工程は約−７８℃ないし約２５℃の範囲の温度で同溶媒中で行う。リン酸化剤、ＰＯＷ₃またはＷＰＯ（ＯＹ）₂は制御された方式で添加して、反応溶液が熱くならないようにする。リン酸化剤には、好ましくは、アミン塩基、好ましくはピリジンを伴わせる。脱保護工程は、もしカチオン種が脱保護剤の一部でないならば、カチオン種Ｍの存在下で、保護されたエノールホスフェートIXを、保護基の除去を引き起こすのに定量的に十分な脱保護剤と反応させることによって達成される。２当量の脱保護剤が典型的には必要で、しかしながら、便宜には、脱保護剤はモル過剰で用いることができる。ある場合には、保護基の除去は、ある時点で行うことができる。例えば、２つのＹ基が一緒に単一の基−ＣＨ₂ＣＨ₂−を構成し、それにより五員環を形成する式ＸＩ化合物において、シアニド塩での処理によって第１のＯ −ＣＨ₂結合を切断することができる。得られた化合物ＸＩＩをさらに塩基と反応させて、第２のＯ−ＣＨ₂結合を切断し、塩Ｉが生成する。脱保護剤の選択は、部分的には、除去すべき基Ｙの性質によって決定される。また、脱保護剤はビニルエーテルまたはビニルスルフィド基の加水分解のごとき望ましくない副反応または複素環基に対する望ましくない変化を引き起こしてもならない。好ましい脱保護剤は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシド、水酸化アンモニウムのごとき有機および無機塩基を含む。他の好ましい脱保護剤はシアニドイオン、フルオリドイオンのごとき求核剤を含む。出願人の知る限り、化合物ＩＸ、Ｘ、ＸＩおよびＸＩＩ（Ｈｅｔは窒素または硫黄含有複素環基）は調製されたことがない。酸素含有ラクトン環が二重結合にくっついたエノールホスフェートエステル化合物は米国特許第３，１３０，２０３号に開示されている。しかしながら、この化合杓は、エステルまたはチオエステルエノラートのリン酸化を含まない異なるプロセスによって調製された。実施例式Ｉの以下の化合物の調製および化学発光反応を、本発明をより詳細に説明する目的で以下に記載する。Ｒ₇−Ｒ₁₄は特に断りのない限りＨである。化合物１−１３の各々は以下の合成スキームによって調製した。反応条件に前記合成プロセスの制限内で変えて、式Ｉの化合物および他の化合物を調製することができる。スキーム１ａ．アクリジン−９−カルボン酸フェニルアクリジン−９−カルボン酸（１ｇ、４．１ミリモル）を塩化チオニル（５ｍＬ）に溶解させ、反応混合物を３時間還流させた。減圧下で溶媒を除去して黄色固体を遊離させ、これをアルゴン下でＣＨ₂Ｃｌ₂およびピリジン（３５０μＬ）に溶解させた。この溶液を氷浴中に冷却させ、ＣＨ₂Ｃｌ₂中のフェノール溶液（０．７８ｇ、８．２ミリモル）を滴下した。反応混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒の蒸発後、残渣を酢酸エチルに再溶解させ、水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮して粗生成物質が得られ、これをシリカゲル（３０％酢酸エチル／ヘキサン）上のクロマトグラフィーに付して純粋な生成物を黄色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ７．３５−７．５７（ｍ，５Ｈ），７．６３−８．３７（ｍ，８Ｈ）ｂ．１０−メチルアクリジニウム−９−カルボン酸フェニルトリフルオロメタンスルホン酸塩アクリジン−９−カルボン酸フェニル（５３０ｍｇ、１．７ミリモル）をＣＨ₂ Ｃ_l2（５ｍＬ）にアルゴン下で溶解させ、メチルトリフレート（１ｍＬ、８．８ミリモル）を添加した。溶液を室温で一晩攪拌して、濃厚な黄色沈殿を得た。この沈殿を濾過し、エーテルで洗浄し、乾燥して生成物を黄色結晶として得た。¹ ＨＮＭＲ（アセトン−ｄ₆） δ５．２２（ｓ，３Ｈ），７．４７−７．７１（ｍ，５Ｈ），８．２３−９．０７（ｍ，８Ｈ）ｃ．１０−メチルアクリダン−９−カルボン酸フェニル１０−メチルアクリジニウム−９−カルボン酸フェニルトリフロロメタンスルホン酸塩（１０ｍｇ、０．０２１６ミリモル）を無水エタノール（１０ｍＬ）に懸濁させ、混合物を１５分間還流して清澄な溶液を得た。塩化アンモニウム（８８ｍｇ、１．６ミリモル）を該溶液に少しずつ添加し、続いて亜鉛（１０８ｍｇ、１．６ミリモル）を添加した。亜鉛を添加すると溶液の黄色が直ちに消失した。無色溶液を２時間還流した。反応混合物のＴＬＣは、非極性物質への完全な変換を示した。溶液を濾過し、沈殿をエタノール（３×２０ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮して灰色がかった白色固体が得られ、これをＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させ、水（２×１５ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、濃縮して粗生成物が得られ、これを（３０％酢酸エチル：ヘキサン）を用いる分取ＴＬＣによって精製した。精製した生成物は、オフホワイト色の固体として得られた。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．３８（ｓ，３Ｈ），５．１６（ｓ，１Ｈ），６．８９−７．３７（ｍ，１３Ｈ）； ¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３３．２９，４９．７２，１１２．９３，１２０．１９，１２１．３６，１２５．７３，１２８．６７，１２９．１６，１２９．２６，１４２．３７，１５１．０４，１７０．２２ｄ．９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチル−アクリダン、ビス（シアノエチル）エステル三首フラスコにアルゴンをパージし、無水ＴＨＦ５ｍＬおよびジイソプロピルアミン（０．０４ｍＬ，０．２９ミリモル）を充填した。フラスコをドライアイス−アセトン浴中で冷却した。この溶液にｎ−ブチルリチウム（０．１１６ｍＬ，０．２９ミリモル）を添加した。２０分後、工程（ｃ）からのアクリダンエステル（７０ｍｇ，０．２２ミリモル）のＴＨＦ５ｍＬ中溶液をこの溶液に添加し、−７８℃で攪拌を３０分間継続した。最後に、ＴＨＦ３ｍＬ中のＰＯＣｌ₃（０．０２７ｍＬ、０．２９ミリモル）およびピリジン（０．０２３ｍＬ、０．２９ミリモル）の溶液を添加し、ドライアイス浴を取り除いた。４５分後、ピリジン（０．０３９ｍＬ、０．５８ミリモル）および３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．０９４ｍＬ、１．１６ミリモル）を添加し、攪拌を一晩維持した。次いで、それを濾過し、溶媒を濾液から除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（８０％酢酸エチル／ヘキサン）に付して純粋な生成物を得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ ２．３５−２．５４（ｍ，４Ｈ），３．４７（ｓ，３Ｈ），３．７９−３．９０（ｍ，２Ｈ），３．９８−４．０８（ｍ，２Ｈ），６．８２５−７．４５（ｍ，１２Ｈ），７．８０−７．８３（ｄｄ，１Ｈ）；¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ １９．１２，１９．２４，３３．６３，６２．１９，６２．４９，８８．７２，９２．８２，１１２．４０，１１２．５２，１１５．８３，１１６．０７，１１９．６８，１２０．４４，１２０．７１，１２３．８１，１２６．６９，１２８．０３，１２８．２７，１２８．５８，１３０．０９，１４２．３９，１４３．０６，１６５．７３，２０２．０９ｅ．９−（フェノキシホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、二ナトリウム塩（１）ビス（シアノエチル）ホスフェート化合物（２．８９７ｇ、５．７７ミリモル）のアセトン５０ｍＬ中溶液に３０分間Ａｒをパージした。水７．５ｍＬ中のＮａＯＨの４７９ｍｇ（１２ミリモル）のＡｒ−パージした溶液を滴下し、溶液を一晩攪拌した。形成された沈殿を濾過し、Ａｒをパージしたアセトン５０ｍＬで洗浄し、風乾した。収量はいくらかの水を含有する白色固体として１の３．４７３ｇであった。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ３．３２６（ｓ，３Ｈ），６．８２５−７．４５（ｍ，１１Ｈ），７．８０−７．８３（ｄ，１Ｈ）；¹³ＣＮＭＲ（Ｄ₂ Ｏ）δ３２．９５，１０２．８６，１０２．９２，１１２．３０，１１５．８５，１２０．６８，１２１．０１，１２２．３５，１２２．４１，１２２．６２，１２７．４８，１２７．６６，１２８．２３，１２９．６６，１４３．１７，１４３．３２，１４４．６６，１５６．０１；³¹ＰＮＭＲδ（Ｄ₂Ｏ）０．５８１（ｒｅｌ．ないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）実施例２アクリダン誘導体２の合成ａ．アクリジン−９−カルボン酸３’，５’−ジフルオロフェニルアクリジン−９−カルボン酸（０．２５ｇ）を塩化チオニル１０ｍＬに懸濁させ、反応混合物を３時間還流した。減圧下で溶媒を除去して黄色固体が得られ、これをアルゴン下でＣＨ₂Ｃｌ₂およびピリジン（０．２２ｇ）に溶解させた。ＣＨ₂Ｃｌ₂中の３，５−ジフルオロフェノール（０．１６ｇ）の溶液を滴下した。次いで溶液を室温で一晩攪拌し、より大量のＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍＬ）で希釈し、水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮して生成物が得られ、さらにこれをシリカゲル（３０％酢酸エチル／ヘキサン）上のクロマトグラフィーにより精製して純粋な生成物をクリーム状固体として得た。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ６．８４−７．０９（ｍ，３Ｈ），７．６７−８．３７（ｍ，８Ｈ）ｂ．１０−メチルアクリジニウム−９−カルボン酸３’，５’−ジフルオロフェニルトリフルオロメタンスルホン酸塩工程（ａ）からのアクリジンエステル（０．２０ｇ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍＬ）にアルゴン下で溶解させ、メチルトリフレート（０．４７２ｍＬ、７当量）を添加した。溶液を室温で一晩攪拌して、濃厚な黄色沈殿を得た。この沈殿を濾過し、エーテルで洗浄し、乾燥して生成物を黄色結晶として得た。¹ＨＮＭＲ（アセトン−ｄ₆） δ５．２５（ｓ，３Ｈ），７．２２−７．５９（ｍ，３Ｈ），８．２３−９．０９（ｍ，８Ｈ）ｃ．１０−メチルアクリンダン−９−カルボン３’，５’−ジフルオロフェニル工程（ｂ）からのアクリジニウムエステル（ｂ）（０．１０ｇ）を氷酢酸１０ｍＬに溶解させて黄色溶液が得られ、亜鉛（１．３０ｇ）の添加で溶液は直ちに脱色された。室温で５分間攪拌した後、反応混合物のＴＬＣは非極性物質を示した。酢酸をデカントし、固体をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。合した有機溶液を蒸発させて粗生成物固体が得られ、これをＣＨ₂Ｃｌ₂に再溶解させ、２または３回５０ｍＬずつの水で洗浄した。ＣＨ₂Ｃｌ₂の蒸発後に得られた粗生成物をシリカゲル（２０−３０％酢酸エチル／ヘキサン）上のクロマトグラフィーに付して純粋な生成物を白色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．４４（ｓ，３Ｈ），５．１６（ｓ，１Ｈ），６．４９−６．６５（ｍ，３Ｈ），６．９９−７．３６（ｍ，８Ｈ）ｄ．９−（３，５−ジチメルフェノキシ）ホスホリルオキシメチリデン））− １０−メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステル三首フラスコにアルゴンをパージし、無水ＴＨＦ４ｍＬおよびジイソプロピルアミン（０．０４９４ｍＬ，０．３５ミリモル）を充填した。フラスコをドライアイス−アセトン浴中で冷却した。この溶液にｎ−ブチルリチウム（０．１４１ｍＬ，０．３５ミリモル）を添加した。２０分後、工程（ｃ）からのアクリダンエステル（７５ｍｇ，０．２２ミリモル）のＴＨＦ４ｍＬ中溶液を該ＬＤＡに滴下した。漏斗をさらに４ｍＬのＡｒ−パージＴＨＦで洗浄し、これを反応溶液に添加した。−７８℃で攪拌を３０分間継続した。最後に、ＴＨＦ４ｍＬ中のＰＯＣｌ₃（０．０３４ｍＬ、０．３５ミリモル）およびピリジン（０．０５７ｍＬ、０．３５ミリモル）の溶液を添加し、茶色溶液を脱色した。ドライアイス浴を取り除き、攪拌を１５分間継続した。ＴＨＦ４ｍＬ中のピリジン（０．０９５ｍＬ、１．１７ミリモル）および３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．０８０ｍＬ、１．１７ミリモル）溶液を添加し、攪拌を一晩維持した。次いで、それを濾過し、溶媒を濾液から除去した。残渣を分取用ＴＬＣ（５５％酢酸エチル／ヘキサン）に付し、それから少量の純粋な生成物を単離した。¹ＨＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）δ２．８２（ｍ，４Ｈ），３．５１（ｓ，３Ｈ），４．１０−４．３１（ｍ，４Ｈ），６．７５−７．９３（ｍ，１１Ｈ）ｅ．９−（３，５−ジメチルフェノキシ）ホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、二ナトリウム塩（２）工程（ｄ）からのビス（シアノエチル）ホスフェート（５ｍｇ、５．７７ミリモル）のメタノール５ｍＬ中溶液に氷冷しつつ３０分間アルゴンをパージした。水０．５ｍＬ中のＮａ₂ＣＯ₃６ｍｇのＡｒ−パージした溶液を滴下し、溶液をアルゴン下で一週間にわたって攪拌した。溶媒を蒸発させ、固体化合物２を真空下で乾燥した。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ３．３４（ｓ，３Ｈ），６．６６−８．０９（ｍ，１１Ｈ）実施例３．アクリダン誘導体３の合成ａ．Ｎ−メチル−３−メトキシイサチンＣＨ₂Ｃｌ₂の９００ｍＬに溶解させた３−メトキシジフェニルアミン（２５０．２ｇ，１．２６モル）を、アルゴン雰囲気下、１ＬのＣＨ₂Ｃｌ₂中の塩化オキサリル１４０ｍＬ（１．６モル）の熱溶液に添加した。添加は２時間にわたって完了した。反応は還流を維持するのに十分な熱を生じたので、添加中の加熱は断続した。該アミンの添加後、攪拌を還流温度でさらに３０分間継続した。得られた茶色溶液を蒸発させて過剰の塩化オキサリルを除去した。茶色固体を１．８ＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に再溶解させ、これにアルゴンをパージさせた。混合物を機械攪拌しつつ、塩化アルミニウム（３５９ｇ、２．６９モル）を何回かで該溶液に４５分間にわたって添加した。混合物は添加の間に濃厚となり、還流を開始した。全てのＡｌＣｌ₃を添加した後、還流をさらに１時間維持した。冷却した混合物を真空中で蒸発させ、４ｋｇの氷、水約５００ｍＬおよび２４０ｍＬの濃塩酸でクエンチした。氷温度で２時間攪拌しつつ、暗色固体を注意深く小さい粒子に破砕した。次いで、固体を吸引濾過し、合計８Ｌの水で洗浄した。風乾によりオレンジ色の固体が得られ、これは＞９０％の１つの異性体を含有する異性体イサチンの混合物であった。ｂ．３−メトキジアクリジン−９−カルボン酸工程（ａ）からのイサチン混合物を水中の１０％ＫＯＨ溶液中で約４０時間還流した。溶液を＜６０℃まで冷却し、ガラスウールを通して濾過して、濃塩酸４８０ｍＬおよび氷水１０Ｌの混合液に入れ、次いでこれを激しく攪拌した。固体を１時間後に吸引濾過し、次いで、水８Ｌで洗浄した。固体を真空下で一晩風乾した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤ₃〇Ｄ／ＮａＯＨ）δ４．０６２（ｓ，３Ｈ），７．２５−８．１８（ｍ，７Ｈ）ｃ．３−メトキシアクリジン−９−カルボン酸フェニル３−メトキシアクリジン−９−カルボン酸（０．５０ｇ）を１０ｍＬ塩化チオニル（３−１０ｍＬ）に懸濁し、反応混合物を３時間還流した。溶媒を減圧下で除去して黄色固体が得られ、これをアルゴン下でＣＨ₂Ｃｌ₂およびピリジン（０．４４ｇ）に溶解させた。ＣＨ₂Ｃｌ₂中の２，６−ジフルオロフェノール（０．３２ｇ）溶液を滴下した。溶液を室温で一晩攪拌し、次いで、より多量のＣＨ₂ Ｃｌ₂（１００ｍＬ）で希釈し、水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ₂ ＳＯ₄上で乾燥し、濃縮して生成物が得られ、これをさらにシリカゲル（３０％酢酸エチル／ヘキサン）上のクロマトグラフィーによって精製して純粋な生成物をクリーム状固体として得た。¹ＨＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）δ４．０８（ｓ，３Ｈ），７．３９−８．２９（ｍ，１２Ｈ）ｄ．３−メトキシアクリダン−９−カルボン酸フェニル塩化アンモニウム（３．４５ｇ、６４ミリモル）および亜鉛４．２ｇ（６４ミリモル）を、エタノール５０ｍＬ中の工程（ｃ）からのエステル０．８５ｇ（２．５ミリモル）のＡｒ−パージ懸濁液に添加した。混合物を２時間攪拌し、濾過し固体をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。合した溶液を蒸発乾固して白色固体が得られ、これを酢酸エチルに溶解させ、水３×２５ｍＬで洗浄した。生成物をさらに精製することなく使用した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．７６（ｓ，３Ｈ），５．２９（ｓ，１Ｈ），６．４７−７．３６（ｍ，１２Ｈ），８．２１（ｂｒｓ，１Ｈ）ｅ．３−メトキシ−１０−メチルアクリダン−９−カルボン酸フェニル前記工程からのアクリダン化合物（０．７７ｇ、２．３ミリモル）をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させ、メチルトリフレート（３．８ｇ、２３ミリモル）を添加した。ＴＬＣは一晩攪拌した後に完全なメチル化を示した。揮発物を蒸発させ、残渣を１８％酢酸エチル／ヘキサンを用いてカラム溶出させるクロマトグラフィーによって精製した。生成物は粘着固体０．７５ｇを含有した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．４１（ｓ，３Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），５．１３（ｓ，１Ｈ），６．５２−７．３８（ｍ，１２Ｈ）ｆ．（Ｅ，Ｚ）−９−（フェノキシ）ホスホリルオキシメチリデン）−３−メトキシ−１０−メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステルＬＤＡの溶液を実施例２ｄに実質的に記載されているごとくに調製した。−７８℃で２５分間攪拌した後、ＴＨＦ４ｍＬ中の工程３ｅからのアクリダンエステル（９５ｍｇ、０．２６ミリモル）の溶液を滴下した。攪拌を−７８℃で３０分間継続した。最後に、ＴＨＦ４ｍｌ中のＰＯＣｌ₃（０．０４ｍＬ）およびピリジン（０．０５ｍＬ）の溶液を添加して黄色溶液を脱色させた。ドライアイス浴を取り除き、攪拌を１０５分間継続した。溶液を氷俗中で冷却し、ＴＨＦ４ｍＬ中のピリジン（０．１０６ｍＬ）および３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．０９０ｍＬ）で処理した。室温で２０時間攪拌した後、反応混合物を濾過し、黄色沈殿をＴＨＦで洗浄した。反応溶媒を真空中で蒸発させ、残渣を沈殿と合わせた。この物質を分取用ＴＬＣ（６０％酢酸エチル／ヘキサン）に付し、これから少量の生成物を二重結合異性体の混合物として単離した；¹ＨＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）δ２．７５−２．８２（ｍ，４Ｈ），３．５２（ｓ，３Ｈ），３．８２（ｓ），３．９１（ｓ），４．００−４．２６（ｍ，４Ｈ），６．４７−７．９６（ｍ，１２Ｈ）ｇ．（Ｅ，Ｚ）−９−（フェノキシ）ホスホリルオキシメチリデン）−３−メトキシ−１０−メチルアクリジン、二ナトリウム塩（３）工程３（ｆ）からのビス（シアノ−エチル）ホスフェートをＡｒパージしたＭｅＯＨ１０ｍＬに溶解させ、氷浴中で冷却した。水１ｍＬ中のＮａ₂ＣＯ₃ １１ｍｇのＡｒパージ溶液を滴下し、溶液を１９時間攪拌した。さらに３ｍＬのメタノールを添加し、攪拌をさらに２４時間継続して脱保護を完全に行った。溶媒を蒸発させ、固体化合物３をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄し、真空下で乾燥させた。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ３．２４（ｓ，３Ｈ），３．６６（ｓ），３．８３（ｓ），６．３５−８．０７（ｍ，１２Ｈ）実施例４アクリダン誘導体４の合成ａ．３−クロロイサチンアルゴン雰囲気下、２５０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させた３−クロロジフェニルアミン（２０ｇ、０．９８モル）を、１５０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂の塩化オキサリル１４．０ｇ（０．１１モル）の溶液に添加した。溶液を３０分間還流した。得られた溶液を蒸発させて、過剰の塩化オキサリルを除去した。固体をＣＨ₂Ｃｌ₂ に再溶解させ、これをアルゴンでパージした。混合物を機械攪拌しつつ、塩化アルミニウム（５４．４８ｇ）を何回かで該溶液に４５分間にわたって添加した。混合物は添加の間に濃厚となり、還流を開始した。ＡｌＣｌ₃の全てを添加した後、還流をさらに１時間維持した。冷却した混合物を真空中で蒸発させ、氷浴中で１ＭＨＣｌの９００ｍＬでクエンチした。次いで、固体を吸引濾過し、水で洗浄した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ６．８−７．８（ｍ，８Ｈ）ｂ．３−クロロアクリジンカルボン酸工程（ａ）からのイサチン生成物を水中の１０％ＫＯＨの３００ｍＬ中で約４８時間還流した。溶液を冷却し、ＨＣｌでｐＨ２−３に酸性化した。黄色固体を１時間後に吸引濾過し、次いで、水で洗浄した。固体を一晩風乾し、ＣＨ₂Ｃｌ₂ で洗浄し、次いで、風乾してアクリジン酸２３．７６ｇを得た。¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ７．７２−８．３０（ｍ，７Ｈ）ｃ．３−クロロアクリジンカルボン酸２’，６’−ジメチルフェニル室温にて窒素下、該酸（３．０ｇ）を、約１００ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂中の２，６ −ジメチルフェノール（２．２４ｇ、１．５当量）およびピリジン（１．９８ｍＬ、２当量）でエステル化した。溶媒を蒸発させ、残渣を１０−３０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製し、１−クロロ− （少量）および３−クロロ−異性体を分離した； ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ ２．４３０（ｓ，６Ｈ），７．２０−７．２８（ｍ，３Ｈ），７．６０−７．７５（ｍ，３Ｈ），８．２８−８．５０（ｍ，４Ｈ）ｄ．３−クロロ−１０−メチルアクリジニウムカルボン酸２’，６’−ジメチルフェニル、トリフルオロメタンスルホン酸塩前記工程からのアクリジン化合物（２．４７ｇ、６．７ミリモル）をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させ、トリフレート（３．８ｍＬ、５当量）を添加した。ＴＬＣは一晩の攪拌後に完全なメチル化を示した。揮発物を蒸発させ、残渣を５％酢酸エチル／ヘキサンを用いてカラムを溶出させるクロマトグラフィーによって精製した。精製物をＣＨ₂Ｃｌ₂／ヘキサンから再結晶して白色固体１．７ｇを得た。ｅ．３−クロロ−１０−メチルアクリダンカルボン酸２’，６’−ジメチルフェニル塩化アンモニウム（２．９１ｇ、６４ミリモル）および亜鉛３．５６ｇ（６４ミリモル）を、５０ｍＬのエタノール中の工程（ｃ）からのエステル２．００ｇ（５．４ミリモル）のＡｒ−パージ懸濁液に添加した。混合物を２時間攪拌し、濾過し、固体をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。合した溶液を蒸発乾固させて白色固体を得た。生成物をさらに精製することなく用いた。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１．７４６（ｓ，６Ｈ），３．４００（ｓ，３Ｈ），５．１５２（ｓ，１Ｈ），６．８８−７．０４（ｍ，７Ｈ），７．２６−７．３９（ｍ，３Ｈ）ｆ．（Ｅ，Ｚ）−９−（２，６−ジメチルフェノキシ）ホスホリルオキシメチリデン）−３−クロロ−１０−メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステル工程（ｅ）からのアクリダンエステル（０．１００ｇ、０．２９ミリモル）を１０ｍＬのＴＨＦ中のＬＤＡ（０．４４ミリモル）の溶液に添加した。−７８℃ で３０分間攪拌した後、４ｍＬのＴＨＦ中のＰＯＣｌ₃（４２μＬ）およびピリジン（４７μＬ）の溶液を添加した。ドライアイス浴を取り除き、攪拌を３０分間継続した。ＴＬＣ（３０％酢酸エチル／ヘキサン）は、出発物質が完全に反応したことを示した。溶液を氷浴中で冷却し、４ｍＬのＴＨＦ中のピリジン（１１７μＬ）および３−ヒドロキシプロピオニトリル（９４μＬ）で処理した。室温で一晩の攪拌の後、沈殿を濾過し、反応溶媒を蒸発させた。残渣を分取用ＴＬＣ（６０％酢酸エチル／ヘキサン）に付し、それから異性体生成物を単離した；¹ ＨＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）δ（１．９１（ｓ），１．９５（ｓ），合わせて３Ｈ），（２．０３（ｓ），２．０４（ｓ），合わせて３Ｈ），２．６９−２．７６（ｍ，４Ｈ），（３．５２（ｓ），３．５９（ｓ），合わせて３Ｈ），４．１６ −４．３４（ｍ，４Ｈ），６．９７−７．６５（ｍ，１０Ｈ）ｇ．（Ｅ，Ｚ）−９−（２，６−ジメチルフェノキシ）ホスホリルオキシメチリデン）−３−クロロ−１０−メチルアクリダン、二ナトリウム塩（４）前記工程からのビス（シアノエチル）ホスフェートをアルゴンをパージした１０ｍＬのメタノールに溶解させ、次いで、氷浴中で冷却した。水１ｍＬ中のＮａ₂ ＣＯ₃１１ｍｇのＡｒ−パージした溶液を滴下し、脱保護が完了するまでアルゴン下で溶液を攪拌した。溶媒を蒸発させ、固体をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄し、真空下で乾燥して４を得た。実施例５．アクリダン誘導体５の合成ａ．９−（フェニチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステル１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸フェニル（７０ｍｇ、０．２ミリモル）をＴＨＦ中のＬＤＡ（０．２４ミリモル）の溶液に添加した。−７８℃ での３０分間の攪拌の後、４ｍＬのＴＨＦ中のＰＯＣｌ₃（２５μＬ）およびピリジン（２１μＬ）の溶液を添加した。ドライアイス浴を取り除き、攪拌を３０分間継続したＴＬＣ（３０％酢酸エチル／ヘキサン）は、出発物質が完全に反応したことを示した。溶液を氷浴中で冷却し、４ｍＬ中のピリジン（２１０μＬ）および３−ヒドロキシプロピオニトリル（４４μＬ）で処理した。室温で一晩攪拌した後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過し、真空中で反応溶媒を蒸発させた。残渣を分取用ＴＬＣ（酢酸エチル）に付し、これより生成物を単離した。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．４−２．６（ｍ，４Ｈ），３．５２１（ｓ，３Ｈ），３．８−４（ｍ，２Ｈ），４．０−４．１（ｍ，２Ｈ），６．９−７．２（ｍ，４Ｈ），７．２２−７．５（ｍ，７Ｈ），７．７５−８（ｄｄ，２Ｈ）ｂ．９−（フェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチル−アクリダン、二ナトリウム塩（５）５０ｍＬのアセトン中のビス（シアノエチル）ホスフェート化合物（０．５９ｇ、１．２１ミリモル）の溶液にアルゴンを３０分間パージした。１０ｍＬの水中のＮａＯＨ１０４ｍｇ（２．６ミリモル）にＡｒ−パージ溶液を滴下し、溶液をアルゴン下で一晩攪拌した。形成された沈殿を吸引濾過し、５０ｍＬのＡｒ −パージしたアセトン５０ｍＬで洗浄し、風乾した。収量はわずかに黄色の固体として５の０．５０ｇであり、これはわずかな量のアセトンを含有した。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ３．３６（ｓ，３Ｈ），６．９−７．４（ｍ，１１Ｈ），７．７５−７．８（ｄ，１Ｈ），８．２−８．２２（ｄ，１Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ１．８５（ｒｅｌないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）実施例６．ベンズ［ｃ］アクリダン誘導体６の合成ａ．ベンズ［ｃ］アクリジン−７−カルボン酸２５ｍＬのＣＳ₂に溶解させた１−ナフチルフェニルアミン（１０ｇ、４６ミリモル）をアルゴン下で４．８ｍＬ（５５ミリモル）の塩化オキサリルで還流した。得られた茶色溶液を蒸発させて過剰の塩化オキサリルを除去した。茶色固体を６０ｍＬのＣＳ₂に溶解させ、これにアルゴンをパージした。混合物を攪拌しつつ、ＡｌＣｌ₃（２１．４７ｇ、１６０ミリモル）を何回かで該溶液に添加した。混合物は添加の間に濃厚となり、還流を開始した。全てのＡｌＣｌ₃を添加した後、還流を２時間以上維持した。冷却した混合物を真空中で蒸発させ、１ＭＨＣｌおよび氷でクエンチした。暗色固体を注意深く破砕して小さな粒子とし、固体を吸引濾過し、水で洗浄した。イサチン生成物を水中の１０％ＫＯＨ溶液中で一晩還流した。溶液を＜６０℃ まで冷却し、６ＭＨＣｌおよび氷で中和した。固体を吸引濾過し、水で洗浄し、風乾した。¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ７．８０−８．１３（ｍ，８Ｈ），８．３６−８．３９（ｄ，１Ｈ），９．３８−９．４０（ｍ，１Ｈ）ｂ．ベンズ［ｃ］アクリジン−７−カルボン酸フェニルベンズ［ｃ］アクリジン−７−カルボン酸（６．０ｇ）を７５ｍＬの塩化チオニル（３−１０ｍＬ）に懸濁させ、反応混合物を４時間還流した。溶媒を減圧下で除去し、生成物を７５ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させた。ピリジン（８．９ｍＬ）およびフェノール（２．２７ｇ）を添加し、溶液をＡｒ下で室温にて３日間攪拌した。シリカゲル（５０％ＣＨ₂Ｃｌ₂／ヘキサン）上のクロマトグラフィーによって精製を行い純粋な生成物３．０５ｇを淡茶色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ７．４０（ｔ，１Ｈ），７．４８−７．５９（ｍ，４Ｈ），７．７１−８．０１（ｍ，７Ｈ），８．２５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．４６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），９．５４−９．５７（ｍ，１Ｈ）ｃ．ベンズ［ｃ］アクリダン−７−カルボン酸フェニル塩化アンモニウム（１０ｇ）および亜鉛１０ｇをエタノール中の工程（ｂ）からのエステル１．０ｇのＡｒ−パージした懸濁液に添加した。混合物を２時間攪拌し、濾過し、固体をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。合わせた溶液を蒸発乾固させ、白色固体が得られ、これを酢酸エチルに溶解させ、水３×２５ｍＬで洗浄した。生成物を１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるクロマトグラフィーによって精製した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ５．４８（ｓ，１Ｈ），５．６９−７．２７（ｍ，９Ｈ），７．４１−７．５５（ｍ，５Ｈ），７．８３−７．８８（ｍ，２Ｈ）ｄ．１２−メチルベンズ［ｃ］アクリダン−７−カルボン酸フェニル前記工程からのアクリダン化合物（０．７０ｇ）をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させ、メチルトリフレート（２．３ｍＬ）を添加した。ＴＬＣは一晩の攪拌後に完全なメチル化を示した。揮発物を蒸発させ、残渣を５％酢酸エチル／ヘキサンを用いてカラムを溶出させるクロマトグラフィーによって精製した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．７５（ｓ，３Ｈ），５．２１（ｓ，１Ｈ），６．９２−６．９４（ｄ，２Ｈ），７．０９−７．６２（ｍ，１１Ｈ），７．８６−７．８９（ｄｄ，１Ｈ），８．２３−８．２６（ｄ，１Ｈ）；¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ４５．０７，４９．９９，１２０．０１，１２１．２３，１２２．６６，１２３．５１，１２４．６９，１２５．３０，１２５．４５，１２５．８４，１２６．３３，１２６．９７，１２８．３９，１２８．６４，１２９．３６，１３４．８９，１４１．２０，１４７．０９，１５１．００，１７０．８９ｅ．（Ｅ，Ｚ）−９−（フェノキシ）ホスホリルオキシメチリデン）−１２− メチルベンズ［ｃ］アクリダン、ビス（シアノエチル）エステルＬＤＡの溶液を前記したごとくに調製した。−７８℃で２５分間攪拌した後、ＴＨＦ中のベンズアクリダンエステル（０．３０ｇ）の溶液を滴下した。攪拌を −７８℃で３０分間継続した。最後に、ＴＨＦ中のＰＯＣｌ₃（０．１２３ｍＬ）およびピリジン（０．１０７ｍＬ）溶液を添加して、深赤色溶液をオレンジ色とした。ドライアイス浴を取り除き、攪拌を１時間継続した。溶液を氷浴中で冷却し、ＴＨＦ中のピリジン（０．２１３ｍＬ）および３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．１８０ｍＬ）で処理した。室温で一晩攪拌した後、反応混合物を濾過し、沈殿をＴＨＦで洗浄した。反応溶媒を真空中で蒸発させ、残渣を沈殿と合した。この物質を分取用ＴＬＣ（６０％酢酸エチル／ヘキサン）に付し、これから少量の生成物を二重結合異性体の混合物として単離した；¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．４４−２．５２（ｍ，４Ｈ），３．８１−４．１０（ｍ，７Ｈ），６．８９−８．２４（ｍ，１５Ｈ）ｆ．（Ｅ，Ｚ）−９−（フェノキシ）ホスホリルオキシメチリデン）−１２− メチルベンズ［ｃ］アクリダン、二ナトリウム塩（６）前記工程からのビス（シアノエチル）ホスフェートをアルゴンをパージしたアセトン１０ｍＬに溶解させ、次いで、氷浴中で冷却した。Ａｒ−パージした溶液（水中の２ＭＮａＯＨの０．１ｍＬ）を滴下し、溶液をＡｒ下で一晩攪拌した。固体を濾過し、生成物化合物６をアセトンで洗浄し、乾燥した。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ３．５２（Ｓ，３Ｈ），６．８５−６．９０（ｔ，１Ｈ），７．０３−７．０６（ｄ，２Ｈ），７．１５−７．２３（ｍ，３Ｈ），７．３３−７．４８（ｍ，５Ｈ），７．７２−７．７５（ｄ，１Ｈ），７．８７−７．８９（ｄ，１Ｈ），８．１０−８．１７（ｔ，２Ｈ）実施例７．アクリダン誘導体７の合成ａ．アクリジン−９−チオカルボン酸４’−フルオロフェニルアクリジン−９−チオカルボン酸（１０ｇ、４５ミリモル）を塩化チオニル（約１００ｍＬ）に懸濁し、反応混合物を２時間還流した。溶媒を減圧下で除去し、黄色固体が遊離し、これを１００ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂にアルゴン下で溶解させた。４−フルオロチオフェノール（５．２５ｍＬ、４９ミリモル）を添加し、続いて３０ｍＬのピリジンを添加した。反応混合物は赤味がかった茶色になり、ほとんど加温して還流した。混合物をアルゴン下、室温で２日間攪拌した。溶媒を蒸発させた後、残渣を８００ｍＬのヘキサンで洗浄し、次いで、合計１Ｌの水で洗浄した。残存する固体を３００ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させ、Ｎａ₂ＳＯ₄／シリカゲル／Ｎａ₂ＳＯ₄のプラグを通した。チオエステルが黄色固体として得られた（１１．５５ｇ）。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ７．２０（ｔ，２Ｈ），７．６０−７．６８（ｍ，４Ｈ），７．８０−７．８８（ｍ，２Ｈ），８．１２９（ｄ，２Ｈ），８．２７８（ｄ，２Ｈ）ｂ．１０−メチルアクリジニウム−９−チオカルボン酸４’−フルオロフェニル、トリフルオロメタンスルホン酸塩アクリジン−９−チオカルボン酸４’−フルオロフェニル（１１．３６ｇ、３４ミリモル）をアルゴン下でＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍＬ）に溶解させ、メチルトリフレート（２０ｍＬ）を添加した。溶液は茶色となり、黄色沈殿を生じた。２日後、沈殿を濾過し、５０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂および５００ｍＬのヘキサンで洗浄し、乾燥して生成物を黄色固体（１５．３ｇ）として得た。¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ −ｄ₆）δ４．９３（ｓ，３Ｈ），７．５３（ｔ，２Ｈ），７．９７−８．３７（ｍ，２Ｈ），８．１４（ｔ，２Ｈ），８．５４（ｔ，２Ｈ），８．６１（ｄ，２Ｈ），８．９２（ｄ，２Ｈ）ｃ．１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸４’−フルオロフェニル室内照明を消し、１０−メチル−アクリジニウム−９−チオカルボン酸４’− フルオロフェニル、トリフルオロメタンスルホン酸塩（１５．０５ｇ、３０ミリモル）を２−プロパノール（１５０ｍＬ）および２．１ｍＬの酢酸に懸濁させた。溶液をアルゴンで３０分間パージし、次いで、１０．０ｇの亜鉛粉末を添加した。亜鉛の添加は溶液の黄色を数分内で消失させた。混合物を一晩攪拌した。混合物を濾過し、固体を２−プロパノールで洗浄し、次いで、ヘキサンで洗浄した。残存する固体をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。ＴＬＣ分析から、生成物が両溶液に溶解したことが示されたので、濾液を濃縮し、合わせると茶色固体が得られ、これをＣＨ₂Ｃｌ₂に再溶解させ、Ｎａ₂ＳＯ₄／シリカゲル／Ｎａ₂ＳＯ₄のプラグに通し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で溶出させた。予期されたアクリダンチオエステルおよびトランスエステル化から得られたアクリダンイソプロピルエステルの混合物が得られた。２つの生成物をカラムクロマトグラフィー（５０％ＣＨ₂Ｃｌ₂：ヘキサン）により分離した。純粋なアクリダンチオエステル生成物の１の画分（２．５ｇ）が白色固体として得られた。第２の画分がイソプロピルエステルとの混合物として得られた。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．４５（ｓ，３Ｈ），５．０８（ｓ，１Ｈ），６．９４−７．０６（ｍ，６Ｈ），７．１７−７．２４（ｍ，２Ｈ），７．３１−７．３９（ｍ，４Ｈ）ｄ．９−（４−フルオロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０− メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステル室内の照明を消し、無水ＴＨＦ１０ｍＬ中の１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸４−フルオロフェニル（１．００ｇ、２．８７ミリモル）を−７８ ℃でＴＨＦ中のＬＤＡの溶液に滴下した。−７８℃で６０分間攪拌した後、黄色溶液を１０ｍＬのＴＨＦ中のＰＯＣｌ₃（０．７９ｇ）およびピリジン（３．０ｍＬ）の溶液で２５分間にわたって処理した。ドライアイス浴をさらに１時間後に取り除き、攪拌を２時間継続した。溶液を氷浴中で冷却し、３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．７１ｍＬ）で処理し、添加が完了した後に氷浴を取り除いた。室温で一晩攪拌した後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過し、５０ｍＬのＴＨＦで洗浄した。合わせた濾液を真空中で蒸発させた。残渣を５０−１００％酢酸エチル／ヘキサンを用いるカラムクロマトグラフィーによって分離し、これから生成物０．６５８ｇが単離された。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．４４−２．６４（ｍ，４Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），３．８６−４．１６（ｍ，４Ｈ），６．９２−７．１５（ｍ，６Ｈ），７．２６−７．４６（ｍ，４Ｈ），７．７８６（ｄ，１Ｈ），７．９０６（ｄ，１Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ− ９．４９（ｐ）（ｒｅｌないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）ｅ．９−（４−フルオロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０− メチルアクリダン、二ナトリウム塩（７）室内の照明を消し、２０ｍＬのアセトン中のビス（シアノエチル）ホスフェート化合物（０．６５８ｇ）の溶液をアルゴン雰囲気下で３０分間攪拌した。水４．０ｍＬ中のＮａＯＨの１１６．５ｍｇの溶液を添加し、溶液をアルゴン下で一晩攪拌した。形成された沈殿を吸引濾過し、１００ｍＬのアセトンで洗浄し、風乾した。濾液中に形成された固体の第２収量を第１収量と合わせた。収量はわずかに黄色の固体としての７の０．５４５ｇであった。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ３．１６（ｓ，３Ｈ），６．８０−６．９８（ｍ，４Ｈ），７．０６−７．１４（ｍ，４Ｈ），７．２１（ｔ，１Ｈ），７．３２（ｔ，１Ｈ），７．７８（ｄ，１Ｈ），８．１９（ｄ，１Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ１．２２（ｓ）（ｒｅｌ．ないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）実施例８．アクリダン誘導体８の合成ａ．アクリジン−９−チオカルボン酸４’−メトキシフェニル前記したごとくに調製した塩化アクリジン−９−カルボニル（２．０ｇ）を２０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させた。４−メトキジチオフェノール（１．２７ｇ）を滴下し、続いてピリジン１．９６ｇを滴下した。反応混合物を室温で３．５日間攪拌した。沈殿を収集し、水で洗浄し、乾燥して生成物の第１収量を得た。ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を３×５０ｍＬの水で洗浄し、乾燥し、蒸発させて粗生成物が得られ、これをシリカゲル（酢酸エチル）上のクロマトグラフィーに付して第２収量の純粋な生成物を得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．８６（ｓ，３Ｈ），７．０１（ｄ，１Ｈ），７．５６（ｄ，２Ｈ），７．６２−８．２８（ｍ，８Ｈ）ｂ．アクリダン−９−チオカルボン酸４’−メトキシフェニルアクリジン−９−チオカルボン酸メトキシフェニル（２．０ｇ）を２−プロパノール（１５０ｍＬ）に懸濁させた。ＮＨ₄Ｃｌ（７．３５ｇ）を何回かで溶液に添加し、続いて亜鉛（８．９ｇ）を添加した。溶液を室温で２時間攪拌し、次いで、３時間穏やかに加温した。反応混合物のＴＬＣは出発物質の完全な消費を示した。溶液を濾過し、沈殿をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。濾液および洗液を濃縮して粗生成物が得られ、これをＣＨ₂Ｃｌ₂に再溶解させ、水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥し、濃縮して生成物が得られ、これは少量のアクリダンイソプロピルエステルを含有していた。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．７４（ｓ，３Ｈ），５．１９（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｂｒｓ，１Ｈ），６．７５−７．３１（ｍ，１２Ｈ）ｃ．１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸４’−メトキシフェニルトリフルオロメタンスルホン酸塩アクリダン−９−チオカルボン酸４’−メトキシフェニル（１．８ｇ）をアルゴン下でＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させ、メチルトリフレート（６．３ｇ）を添加した。溶液を室温で一晩攪拌して完全なメチル化を行った。反応混合物を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル／ヘキサン）によって分離して生成物１．０８ｇを得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．４５（ｓ，３Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），５．０７（ｂｒｓ，１Ｈ），６．８１−７．３６（ｍ，１２Ｈ）ｄ．９−（４−メトキシフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０− メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステル１０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中の１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸メトキシフェニル（７００ｍｇ）を−７８℃に維持した乾燥ＴＨＦの１０ｍＬ中のＬＤＡ（１．４当量）の溶液に滴下した。−７８℃で１時間攪拌した後、４ｍＬのＴＨＦ中のＰＯＣｌ₃（５２０ｍｇ）およびピリジン（１．６４ｇ）の溶液を滴下した。攪拌は−７８℃で３０分間継続し、ドライアイス浴を取り除き、攪拌をさらに１時間継続した。溶液を再度氷浴中で冷却し、ピリジン（１ｍＬ）および３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．８６ｍＬ）を滴下した。室温で一晩攪拌した後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過し、反応溶媒を真空中で蒸発させた。残渣を酢酸エチル中に採り、水（３×２５ｍＬ）で洗浄した。有機溶媒を乾燥し、濃縮し、粗生成物をカラムクロマトグラフイー（３０−１００％酢酸エチル／ヘキサン）に付し、それから生成物が淡黄色固体として単離された；¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．４４−２．６２（ｍ，４Ｈ），３．５１（ｓ，３Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．８８−４．１１（ｍ，４Ｈ），６．５３−７．４１（ｍ，１０Ｈ），７．８４−７．９１（ｍ，２Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）δ９．６３（ｐ）（ｒｅｌ．ないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）ｅ．９−（４−メトキジフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０− メチリアクリダン、二ナトリウム塩（８）１１ｍＬのアセトン中のビス（シアノエチル）ホスフェート化合物（０．４２ｇ）をアルゴンでパージした。水中の２．５ＭＮａＯＨ溶液の６１４μＬ分を滴下し、溶液をアルゴン下で一晩攪拌した。形成された沈殿を吸引濾過し、風乾し、定量的収量の８をわずかに黄色の固体として得た。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ ３．３２（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），６．６９−７．３３（ｍ，１０Ｈ），７．８０（ｄ，１Ｈ），８．１８（ｄ，１Ｈ）実施例９．アクリダン誘導体９の合成ａ．アクリダン−９−チオカルボン酸２’，６’−ジメチルフェニルアクリジン−９−カルボン酸（２ｇ）を塩化チオニル（２５ｍＬ）に懸濁させ、反応混合物を２．５時間還流した。溶媒を減圧下で除去し、固体が得られ、これを５０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させた。この溶液を氷浴中で冷却し、２，６− ジメチルチオフェノール（１．２３ｇ）を滴下し、続いてピリジン３．６ｍＬを滴下した。赤色がかった茶色の反応混合物を室温で１．５時間攪拌した。反応混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、３×５０ｍＬの水で洗浄した。有機層を乾燥し、濃縮してオレンジ色の固体が得られ、これをシリカゲル（酢酸エチル）上のクロマトグラフィーに付して純粋な生成物２．５ｇを灰色がかった白色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．６８（ｓ，６Ｈ），７．３０−７．４１（ｍ，３Ｈ），７．６３−８．３１（ｍ，８Ｈ）ｂ．アクリダン−９−チオカルボン酸２’，６’−ジメチルフェニルアクリジン−９−チオカルボン酸２’，６’−ジメチルフェニル（２．４６ｇ）を２−プロパノール（２００ｍＬ）に懸濁させた。塩化アンモニウム（９．５ｇ）を何回かに分けて溶液に添加し、続いて亜鉛（１１．６５ｇ）を添加した。溶液を温和に２時間加温した。反応混合物のＴＬＣは出発物質の完全な消費を示した。溶液を濾過し、沈殿をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。濾液を濃縮して白色固体が得られ、これをＣＨ₂Ｃｌ₂に再溶解させ、水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、濃縮して生成物２．４６ｇを白色固体として得た。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．０８（ｓ，６Ｈ），５．２４（ｓ，１Ｈ），６．２７（ｂｒｓ，１Ｈ），６．７８−７．３１（ｍ，１１Ｈ）ｃ．１０−メチルアクリダンチオカルボン酸２’，６’−ジメチルフェニルアルゴン下、１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸２’，６’−ジメチルフェニル（２．０ｇ）を３０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させ、メチルトリフレート（６．６ｍＬ）を添加した。溶液を室温で３日間攪拌した。混合物を蒸発乾固させ、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂）によって精製して生成物１．８５ｇを白色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．０９（ｓ，６Ｈ），３．４６（ｓ，３Ｈ），５．０９（ｓ，１Ｈ），６．９７−７．３６（ｍ，１１Ｈ）ｄ．９−（２，６−ジメチルフェニルチオホスホリルオキシメチルデン）−１０−メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステル −７８℃にて、１２ｍＬの乾燥ＴＨＦ中の１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸２，６−ジメチルフェニル（７００ｍｇ）を１０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中のＬＤＡ（１．４当量）の溶液に添加した。オレンジ色溶液を−７８℃で６０分間攪拌した。４ｍＬのＴＨＦ中のＰＯＣｌ₃（２８０μＬ）およびピリジン（１．５７ｍＬ）の溶液を滴下した。ドライアイス浴を取り除く前に、反応混合物を１５分間攪拌した。攪拌を６０分間継続した。ＴＬＣ（３０％酢酸エチル／ヘキサン）はほとんどの出発物質が反応したことを示した。溶液を氷浴中で冷却し、ピリジン（１．０ｍＬ）および３−ヒドロキシプロピオニトリル（６６６μＬ）で処理した。室温で一晩攪拌した後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過し、ＴＨＦで洗浄した。合わせたオレンジ色溶液を真空中で蒸発させた。有機層を乾燥し、濃縮してオレンジ色固体が得られ、これをシリカゲル（酢酸エチル）上のクロマトグラフィーに付して黄色油として純粋な生成物８０ｍｇを得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．３４−２．４３（ｍ，４Ｈ），２．４７（ｓ，６Ｈ），３．４７（ｓ，３Ｈ），３．４２−３．７１（ｍ，４Ｈ），７．０１−８．０７（ｍ，１１Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ−１０．２０７（ｐ）（ｒｅｌ．ないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）ｅ．９−（２，６−ジメチルフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、二ナトリウム塩（９）アセトン６ｍＬ中のビス（シアノエチル）ホスフェート化合物（０．８０ｇ）の溶液をアルゴンでパージした。水（２９３μＬ）中の１ＭＮａＯＨの溶液を滴下し、続いてさらに水３００μＬを滴下し、溶液をアルゴン下で一晩攪拌した。形成された沈殿を吸引濾過し、アセトンで洗浄し、風乾した。収量は白色固体としての９の０．６０ｇであった。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ２．１３（ｓ，６Ｈ），３．１９（ｓ，３Ｈ），６．６０−８．１９（ｍ，１１Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ１．６５３（ｓ）（ｒｅｌ．ないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）実施例１０．アクリダン誘導体１０の合成ａ．４−フルオロアセトアニリド４−フルオロアニリン（２０ｇ）を２５ｍＬの酢酸に溶解させ、氷浴中で冷却した。無水酢酸（２５ｍＬ）を５ｍＬずつ攪拌溶液に添加した。得られた溶液を冷水２００ｍＬに注ぎ、沈殿した生成物を濾過した。固体を水で洗浄し、真空乾燥した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．１７５（ｓ，３Ｈ），７．０１４（ｔ，２Ｈ），７．１５（ｂｒｓ，１Ｈ），７．４３−７．４８（ｍ，２Ｈ）ｂ．４，４’−ジフルオロジフェニルアミン１９０℃にて、１１．０８ｇのＫ₂ＣＯ₃および１．６１ｇのＣｕＩの存在下、４−フルオロアセトアニリド（１２．０ｇ）を１−ブロモ−４−フルオロベンゼン（２１ｍＬ）と９０時間縮合させた。冷却した後、混合物を濾過し、固体をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。合わせた有機溶液を真空下で蒸発させ、約２０ｇの暗茶色溶液を得た。これを１００ｍＬのエタノールに溶解させ、９ｇのＫＯＨと共に２４時間還流した、エタノールを蒸発させ、暗色残渣をエーテル中に採り、水（３ ×１００ｍＬ）で洗浄した。エーテル溶液を乾燥し、濃縮し、粗生成物を１５％酢酸エチル／ヘキサンを用いるシリカ上のカラムクロマトグラフィーによって精製した；¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ５．４６（ｂｒｓ，１Ｈ），６．９４７（ｓ，４Ｈ），６．９７（ｓ，４Ｈ）；¹³ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１１５．８６、１１６．１６、１１９．３８、１１９．４７ｃ．２，７−ジフルオロアクリジン−９−カルボン酸アルゴン雰囲気下、５０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させた４，４’−ジフルオロジフェニルアミン（５．４ｇ）を３０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂中の塩化オキサリル２．５２ｍＬ（０．１１モル）の溶液に還流を維持する速度で添加した。混合物をさらに３５分間還流した。得られた溶液を蒸発させて過剰の塩化オキサリルを除去した。固体を７５ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に再溶解させ、氷浴中で冷却した。フラスコをアルゴンでパージし、混合物を攪拌しつつ、ＡｌＣｌ₃（１４．２８ｇ）を何回かに分けて添加した。添加の間に混合物は濃厚となり、還流を開始した。全てのＡｌＣｌ₃を添加した後、還流をさらに１時間維持した。冷却した混合物を真空中で濃縮し、３００ｍＬの３：１氷／５ＭＨＣｌでクエンチした。混合物を１時間攪拌し、オレンジ色の固体（イサチン）を吸引濾過し、水で洗浄した。¹ ＨＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）δ６．９２−６．９７（ｍ，１Ｈ），７．３５− ７．６１（ｍ，６Ｈ）イサチン生成物を水中の１１０ｍＬの１０％ＫＯＨ溶液を一晩還流した。暗緑色混合物を冷却し、４００ｍＬの１：１氷／５ＭＨＣｌで酸性化した。固体を水で洗浄し風乾し、アクリジン酸を得た。¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ７．８１−７．９４（ｍ，４Ｈ），８．３１−８．３６（ｍ，２Ｈ）ｄ．２，７−ジフルオロアクリジン−９−チオカルボン酸フェニル２，７−ジフルオロアクリジン−９−カルボン酸（１．０ｇ）をＳＯＣｌ₂（５ｍＬ）に懸濁させ、反応混合物を３時間還流した。溶媒を減圧下で除去して茶色固体が得られ、これをアルゴン下で２０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させた。チオフェノール（４６８ｍｇ）を添加し、続いてピリジン（２ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、濃縮して粗生成物が得られ、これをシリカゲル（４０％酢酸エチル／ヘキサン）上のクロマトグラフィーに付して１．２ｇの純粋な生成物を得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ７．５２−７．７５（ｍ，９Ｈ），８．２６−８．３０（ｍ，２Ｈ）ｅ．２，７−ジフルオロアクリダン−９−チオカルボン酸フェニル２，７−ジフルオロアクリジン−９−チオカルボン酸フェニル（１．２ｇ）をＮＨ₄Ｃｌ（４．５７ｇ）と共に２−プロパノール（１２５ｍＬ）に懸濁させた。亜鉛（５．５ｇ）を添加し、反応混合物を２．５時間加温し、続いて室温で１．５時間置いた。反応混合物のＴＬＣは新しい物質への完全な変換を示した。溶液を濾過し、沈殿をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。濾液を濃縮し、淡オレンジ色残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂に再溶解させ、水（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、濃縮して粗生成物が得られ、これをさらに精製することなく使用した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ５．１２（ｓ，１Ｈ），６．１９（ｂｒｓ，１Ｈ），６．７２−７．３５（ｍ，１１Ｈ）ｆ．２，７−ジフルオロ−１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸フェニル２，７−ジフルオロアクリダン−９−チオカルボン酸フェニル（１．４ｇ）をアルゴン下でＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロメタンスルホン酸メチル（５．２９ｇ）を添加した。溶液を室温で一晩攪拌した。ＴＬＣは変換が約５０％完了であることを示し、そこで、さらに２ｍＬのメチルトリフレートを添加し、攪拌をさらに４０時間継続した。この反応混合物を濃縮し、残渣を２０−５０％ＣＨ₂Ｃｌ₂／ヘキサンを用いるクロマトグラフィーで分離して、副生成物としての少量のアクリダンカルボン酸のイソプロピルエステルと共に生成物を得た。¹ＨＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）δ３．４１（ｓ，３Ｈ），４．９８（ｓ，１Ｈ），６．８９−７．３４（ｍ，１１Ｈ）ｇ．９−（フェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−２，７−ジフルオロ −１０−メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステル２，７−ジフルオロ−１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸フェニル（５００ｍｇ，１．３ミリモル）を−７８℃においてＴＨＦ中のＬＤＡ（１．４ミリモル）の溶液に添加した。１時間の攪拌の後、４ｍＬのＴＨＦ中のＰＯＣｌ₃ （３１３ｍｇ）およびピリジン（１．０７ｇ）の溶液を添加し、反応混合物を −７８℃に１時間維持した。ドライアイス浴を取り除き、攪拌を１時間継続した。溶液を氷浴中で冷却し、４ｍＬのＴＨＦ中のピリジンおよび３−ヒドロキシプロピオニトリル（４８４ｍｇ）で滴下処理した。室温にて一晩攪拌した後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過し、反応溶媒を真空中で蒸発させた。残渣を酢酸エチル中に採り、４×２５ｍＬの水で洗浄し、乾燥して酢酸エチルを蒸発させた後、残渣をクロマトグラフィー（７５−８０％酢酸エチル／ヘキサン）により分離して生成物を単離した；¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．４８−２．６５（ｍ，４Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），４．０２−４．１６（ｍ，４Ｈ），６．９１− ７．６６（ｍ，１１Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ９．８７４（ｐ）（ｒｅｌ．ないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）ｈ．９−（フェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−２，７−ジフルオロ −１０−メチルアクリダン、二ナトリウム塩（１０）アセトン１７ｍＬ中のビス（シアノエチル）ホスフェート化合物（０．２８ｇ）の溶液を氷浴中で冷却し、アルゴンをパージした。水１．０２ｍＬ中の１ＮＮａＯＨの溶液を滴下し、溶液をアルゴン下で１６時間攪拌した。形成された沈殿を吸引濾過し、アセトンで洗浄し、真空乾燥した。収量は灰色がかった白色固体として１０の０．２３６ｇであった。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ３．２８（ｓ，３Ｈ），６．７８−８．２１（ｍ，１１Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ１．００６（ｓ）（ｒｅｌ．ないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）実施例１１．アクリダン誘導体１１の合成ａ．アクリジン−９−チオカルボン酸２’，２’，２’−トリフルオロエチル前記したごとくに調製した塩化アクリジン−９−カルボニル（１．８９ｇ）をアルゴン下で３０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させた。この溶液を氷浴中で冷却し、２，２，２−トリフルオロエタンチオール（１．０）、続いて３．２３ｇのピリジンを滴下した。反応混合物を室温で３日間攪拌した。水（２０ｍＬ）を添加し、残存する沈殿を濾過し、捨てた。ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を３×２５ｍＬの水で洗浄し、乾燥し、蒸発させて、生成物をつぎの反応で採るのに十分に純粋な灰色がかった固体として得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ４．０２−４．１０（ｑ，２Ｈ），７．６１−８．３１（ｍ，８Ｈ）ｂ．アクリダン−９−チオカルボン酸２’，２’，２’−トリフルオロエチルアクリジン−９−チオカルボン酸２’，２’，２’−トリフルオロエチル（１．７ｇ）をＮＨ₄Ｃｌ（７．０８ｇ）と共に２−プロパノール（１５０ｍＬ）に懸濁した。亜鉛（８．６１ｇ）を添加し、反応混合物を室温で１．５時間攪拌した。反応混合物のＴＬＣは新しい物質への完全な変換を示した。溶液を濾過し、沈殿をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。濾液を濃縮し、淡オレンジ色残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂に再溶解させ、水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥し、濃縮して粗生成物を次の反応で採るのに十分に純粋に灰色がかった白色固体として得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．３７−３．４７（ｑ，２Ｈ），５．２０６（ｓ，１Ｈ），６．２７（ｂｒｓ，１Ｈ），６．７８−７．２７（ｍ，８Ｈ）ｃ．１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸２’，２’，２’−トリフルオロエチルアクリダン−９−チオカルボン酸２’，２’，２’２−トリフルオロエチル（１．６６ｇ）をアルゴン下でＣＨ₂Ｃｌ₂（２０ｍＬ）に溶解させ、メチルトリフレート（４．０６ｍＬ）を添加した。茶色溶液を室温で１．５日間攪拌した。ＣＨ₂Ｃｌ₂を濃縮した後、粗生成物を５０％ＣＨ₂Ｃｌ₂／ヘキサンを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．３９− ３．４３（ｑ，２Ｈ），３．４３（ｓ，３Ｈ），５．０４（ｓ，１Ｈ），６．９８−７．３８（ｍ，８Ｈ）ｄ．９−（２’，２’，２’−トリフルオロエチルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステル１０ｍＬのＴＨＦ中の１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸トリフルオロエチル（３００ｍｇ）を−７８℃にて１０ｍＬのＴＨＦ中のＬＤＡ（１．４当量）の溶液を滴下した。−７８℃で６０分間攪拌した後、４ｍＬのＴＨＦ中のＰＯＣｌ₃（２３９ｍｇ）およびピリジン（７０３ｍｇ）をゆっくりと添加した。３０分後、ドライアイス浴を取り除き、攪拌を６０分間継続した。溶液を氷浴中で冷却し、ピリジン（５００μＬ）および３−ヒドロキシプロピオニトリル（３９５μＬ）で処理した。茶色味の黄色沈殿が形成した。室温にて一晩攪拌した後、沈殿を濾過し、反応溶媒を真空中で蒸発させた。残渣を酢酸エチル中に採り、５×２５ｍＬの水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。粗生成物をＣＨ₂Ｃｌ₂を用いてカラムを溶出させ、次いで溶媒を６０−１００％酢酸エチル／ヘキサン勾配に切り替えるクロマトグラフイーにより分離した。２つの画分（各々、２つの接近して溶出する生成物の混合物、ゆっくりと溶出するものは少量成分）を分離した。各画分を２５％酢酸エチル／ヘキサンを用いる分取用ＴＬＣによって分離してさらに精製した。ゆっくりと溶出する生成物は予測されたビス（シアノエチル）ホスフェートエステルであることが判明した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．６９（ｔ，４Ｈ），３．４１−３．５４（ｑ，２Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），４．０４−４．２４（ｍ，４Ｈ），７．０４−７．９５（ｍ，８Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ−８．６６（ｐ）他の生成物は¹ＨＮＭＲ、¹³ＣＮＭＲ、¹⁹ＦＮＭＲおよび³¹ＰＮＭＲならびにホモ核およびヘテロ核脱カップリング実験によって、ＳＣＨ₂ＣＦ₃基からのＨＦの脱離およびエノラートのリン酸化から誘導された９−（２’，２’− ジフルオロエテニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステルであると決定された。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ２．６０−２．７６（ｍ，４Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），４．０２− ４．２６（ｍ，４Ｈ），５．１７（ｄ，１Ｈ），７．０３−７．８８（ｍ，８Ｈ）；¹⁹ＦＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ−７６．７６（ｄ，Ｊ＝Ｈｚ），−７８．８８（ｔ，Ｊ＝Ｈｚ）；³¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ−８．８３（ｐ）。δ５．１７におけるダブレットの放射は¹ＨＮＭＲスペクトルにおいて他のシグナルに影響しなかった。δ４．０２−４．２６におけるマルチプレットの放射はδ２．６０−２．７６におけるマルチプレットを崩壊させてシングレットとし、リンシグナルを崩壊させてシングレットとした。¹Ｈスペクトルにおけるδ５．１７のダブレットの放射は¹⁹Ｆスペクトルにおけるトリプレットを崩壊させてダブレットとした。ｅ．９−（２’，２’，２’−トリフルオロエチルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、二ナトリウム塩（１１）４ｍＬアセトン中のビス（シアノエチル）ホスフェート化合物（１５ｍｇ）の溶液をアルゴンでパージした。水（５８μＬ）中の１ＭＮａＯＨの溶液、続いてさらに１００μＬの水を滴下し、溶液をアルゴン下で一晩攪拌した。ＴＬＣは完全な脱保護を示した。混合物を濃縮乾固して灰色がかった白色固体が得られ、これを２０％ＣＨ₂Ｃｌ₂／アセトンで洗浄し、風乾した。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ） δ３．３９９（ｓ，３Ｈ），３．４５−３．６１（ｍ，２Ｈ），７．０４−８．１８（ｍ，８Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ１．４６５（ｓ）（ｒｅｌ．ないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）実施例１２．アクリダン誘導体１２の合成ａ．アクリジン−９−チオカルボン酸４’−クロロフェニル４−クロロ−チオフェノール（４．７５ｇ）および７．２２ｇの塩化アクリジン−９−カルボニル、続いて１２．１ｍＬのピリジンを１００ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂ に溶解させた。反応混合物はオレンジ色−茶色となった。混合物をアルゴン下に室温で一晩攪拌した。溶媒の蒸発後、固体を１００ｍＬのヘキサンで洗浄し、濾過し、さらに１００ｍＬのヘキサンで洗浄し、濾過、次いで、水５００ｍＬで洗浄し、濾過し、風乾した。チオエステルがわずかに茶色味黄色固体として得られた（８．７１ｇ）。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ７．４７−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．５８−７．６７（ｍ，４Ｈ），７．８１−７．８６（ｍ，２Ｈ），８．１２（ｄ，２Ｈ），８．２９（ｄ，２Ｈ）ｂ．アクリダン−９−チオカルボン酸４’−クロロフェニルアクリジン−９−チオカルボン酸クロロフェニル（２．０ｇ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（２５ｍＬ）に溶解させた。溶液をアルゴンでパージし、次いで、３．７２ｇの亜鉛粉末、続いて０．４５ｍＬの酢酸を添加した。ＴＬＣは出発物質が２０分内に消費されたことを示した。混合物を濾過し、固体をＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄した。合したＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を水（３×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥した。少量の生成物を分析特徴付けのために分取用ＴＬＣによって精製した。生成物の残りはさらに精製することなく使用した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ５．２２（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｓ，１Ｈ），６．７９−７．３１（ｍ，１２Ｈ）ｃ．１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸４’−クロロフェニルアクリダン−９−チオカルボン酸クロロフェニル（２．０ｇ）をアルゴン下でＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍＬ）に溶解させ、メチルトリフレート（６．５ｇ）を添加した。茶色溶液を蒸発させ、粗生成物を３０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物（１．８ｇ）がそれにより得られた。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．４７（ｓ，３Ｈ），５．０９（ｓ，１Ｈ），７．０２−７．３９（ｍ，１２Ｈ）ｄ．９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステル１０ｍＬの無水ＴＨＦ中の１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸４− クロロフェニル（０．７０ｇ）を−７８℃にてＴＨＦ中のＬＤＡ（１．４当量）の溶液に滴下した。−７８℃で６０分間攪拌した後、黄色溶液を４ｍＬのＴＨＦ中のＰＯＣｌ₃（０．５１７ｇ）およびピリジン（１．５２ｍＬ）の溶液でゆっくりと処理した。ドライアイス浴を３０分後に取り除き、攪拌を１時間継続した。溶液は黄色となり、沈殿が形成された。混合物を氷浴中で冷却し、３−ヒドロキシプロピオニトリル（０．８９ｇ）および１．０ｍＬのピリジンで処理した。添加が完了した後、氷浴を取り除いた。室温で一晩攪拌した後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過し、ＴＨＦで洗浄した。合わせた濾液を真空中で蒸発させ、得られた茶色物質を酢酸エチルに溶解させ、４×２５ｍＬの水で洗浄した。酢酸エチル溶液を乾燥し、濃縮した。残渣を８０ −１００％酢酸エチル／ヘキサンを用いるカラムクロマトグラフイーによって分離し、それから生成物０．３２５ｇが単離された。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ ２．４８−２．６４（ｍ，４Ｈ），３．５３（ｓ，３Ｈ），３．８６−４．１６（ｍ，４Ｈ），６．９４−７．９４（ｍ，１２Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ −９．４８（ｐ）（ｒｅｌ．ないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）ｅ．９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、二ナトリウム塩（１２）１０ｍＬのアセトン中のビス（シアノエチル）ホスフェート化合物（０．３２５ｇ）の溶液をアルゴンでパージした。２．５ＭＮａＯＨ（４７３μＬ）の溶液、続いてさらに５００μＬの水を添加した。溶液をアルゴン下で一晩攪拌した。形成された沈殿を吸引濾過し、風乾した。母液はモノ（シアノエチル）−保護化合物（１４０ｍｇ）を含有することが判明した。二ナトリウム塩の第２収量はＮａＯＨ脱保護を反復することによって得られた。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ３．３５（ｓ，３Ｈ），６．９２−７．３６（ｍ，１０Ｈ），７．７８（ｄ，１Ｈ），８．２０（ｄ，１Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ１．２２（ｓ）（ｒｅｌ．ないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）実施例１３．アクリダン誘導体１３の合成ａ．アクリジン−９−チオカルボン酸ナフチル２−ナフタレンチオール（４８．８１ｇ）およびアクリジン−９−カルボン酸６５．１７ｇから調製した塩化アクリジン−９−カルボニルを１００ｍＬのＣＨ₂ Ｃｌ₂に溶解させ、続いて１２０ｍＬのピリジンを添加した。混合物をアルゴン下、室温で一晩攪拌した。溶媒の蒸発接、固体を５００ｍＬのヘキサンで洗浄し、濾過し、さらに５００ｍＬのヘキサンで洗浄し、濾過し、次いで、６００ｍＬの水で洗浄し、濾過し、一晩風乾した。該チオエステルを１５００ｍＬのＣＨ₂ Ｃｌ₂に溶解させ、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空中で乾燥した。該チオエステルは茶色固体として得られた（９４．６７ｇ）。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）７．５４−８．００（ｍ，１１Ｈ），８．１７−８．３１（ｍ，４Ｈ）ｂ．１０−メチルアクリジニウム−９−チオカルボン酸ナフチルトリフレートアクリジン−９−チオカルボン酸ナフチル（２６．３８ｇ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（２００ｍＬ）に懸濁させた。トリフルオロメタンスルホン酸メチル（２４．５ｍｌ）を添加し、混合物を一晩攪拌した。混合物を濾過し、固体をＣＨ₂Ｃｌ₂（３００ｍｌ）およびヘキサン（５００ｍｌ）で洗浄した。風乾後、生成物（２８．８３ｇ）が黄色固体として得られた。¹ＨＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）５．２０（ｓ，３Ｈ），７．６６−７．７５（ｍ，２Ｈ），７．８８−７．９２（ｍ，１Ｈ），８．０３−８．０９（ｍ，２Ｈ），８．１５（ｄ，１Ｈ），８．２６（ｔ，２Ｈ），８．４８（ｓ，１Ｈ），８．６１−８．６８（ｍ，２Ｈ），８．８０（ｄ，２Ｈ），９．０３（ｄ，２Ｈ）ｃ．１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸ナフチル１０−メチルアクリジニウム−９−チオカルボン酸ナフチルトリフレート（６５．５０ｇ）をアルゴン下でＣＨ₂Ｃｌ₂（１０００ｍＬ）に懸濁させ、氷酢酸（２１．２ｍｌ）および亜鉛（４０．４３ｇ）を添加した。一晩攪拌した後、ＴＬＣは出発物質の消失と新しい生成物の形成を示した。反応混合物をシリカゲルのベッドを通して濾過し、ＣＨ₂Ｃｌ₂を真空中で除去した。得られたわずかに黄色の固体をイソプロパノール（５００ｍｌ）中で攪拌し、濾過し、さらに５００ｍｌのイソプロパノールで洗浄し、風乾した。純粋な生成物（４６．３６ｇ）がそれにより得られた。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ３．４７（ｓ，３Ｈ），５．１３（ｓ，１Ｈ）．７．００−７．０６（ｍ，４Ｈ），７．２５−７．４９（ｍ，７Ｈ），７．７０−７．７９（ｍ，４Ｈ）ｄ．９−（ナフチルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、ビス（シアノエチル）エステル無水ＴＨＦ６００ｍＬ中の１０−メチルアクリダン−９−チオカルボン酸ナフチル（１７．３２ｇ）を−７８℃にてＴＨＦ中のＬＤＡ（１．２５当量）の溶液に滴下した。−７８℃で９０分間攪拌した後、オレンジ色がかった茶色溶液を１５０ｍＬのＴＨＦ中のＰＯＣｌ₃（２０．８０ｇ）およびピリジン（５０ｍＬ）の溶液でゆっくりと処理した。ドライアイス浴を６０分後に取り除き、攪拌を１時間継続した。溶液は茶色となり、沈殿を形成した。混合物を３−ヒドロキシプロピオニトリル（２７．８ｍｌ）で処理した。室温で一晩攪拌した後、沈殿したピリジン−ＨＣｌを濾過し、ＴＨＦで洗浄した。合わせた濾液を真空中で蒸発させ、得られた茶色油を、５０−１００％酢酸エチル／ヘキサンを用いるカラムクロマトグラフィーによって分離し、それから生成物が単離された。黄色油をＣＨ₂Ｃｌ₂（３００ｍｌ）に溶解させ、水（４５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空中で乾燥した。これにより生成物（１７．７６ｇ）を黄色固体として得た。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ ２．３３−２．５３（ｍ，４Ｈ），３．５３（ｓ，３Ｈ），３．８２−４．０６（ｍ，４Ｈ），６．９３（ｔ，１Ｈ），７．０３（ｄ，１Ｈ），７．１０−７．１８（ｍ，２Ｈ），７．２５−７．５５（ｍ，５Ｈ），７．７９−７．９２（ｍ，５Ｈ），８．０２（ｄ，１Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ−９．６９（ｐ）（ｒｅｌ．ないしｅＸｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）ｅ．９−（ナフチルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン、二ナトリウム塩（１３）２００ｍＬのアセトン中のビス（シアノエチル）ホスフェート化合物（１７．２８ｇ）の溶液をアルゴン下でパージした。水５０ｍｌ中のＮａＯＨ（２．７６ｇ）の溶液を添加し、溶液をアルゴン下で一晩攪拌した。形成された沈殿を吸引濾過し、アセトン（３００ｍｌ）中の２０％水で洗浄し、真空下で乾燥した。生成物（１５．０７ｇ）が淡黄色固体として得られた。¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ３．２２（Ｓ，３Ｈ），６．６７（ｄ，１Ｈ），６．８７（ｔ，１Ｈ），７．０１（ｔ，１Ｈ），７．０８−７．１５（ｍ，２Ｈ），７．２３（ｄ，１Ｈ），７．３１−４４（ｍ，３Ｈ），７．５１（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｄ，２Ｈ），７．７３（ｄ，１Ｈ），７．８６（ｄ，１Ｈ），８．２５（ｄ，１Ｈ）；³¹ＰＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）δ１．３０（ｓ）（ｒｅｌ．ないしｅｘｔ．Ｈ₃ＰＯ₄）実施例１４．化合物１でのアルカリ性ホスファターゼの化学発光検出アルカリ性ホスファターゼの化学発光検出用の効果的な試薬組成物は、０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．５、０．８８ｍＭマグネシウム塩、０．３３ｍＭアクリジンホスフェート１（０．０３３Ｍメタノール溶液の１：１００希釈から）および０．０１ｍｇ／ｍＬの増強剤Ａ（ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリドコーポリビニルベンジルトリオクチルホスホニウムクロリド）（３：１の比のトリブチル：トリオクチル基を含有）を含有するものであった。Turner TD-20eルミノメーターに収容したテストチューブ中、２５℃における１００μ Ｌのこの組成物と１０^-13モルのＡＰとの反応は、２分以内に最大強度に到達する容易に測定できる青色化学発光を生じた。実施例１５．化合物２−１３での化学発光検出実施例１４の方法において、化合物２−１３の各々を含有する組成物を２５℃ でＡＰと反応させた。各々は、ＡＰの不存在下で測定されたバックグラウンドを超えて識別できる、容易に測定可能な化学発光を生じた。ここに特に説明したものに加えて、式Ｉの他の化合物は本方法と同様にして機能するであろうことは当業者に明白であろう。実施例１６．アルカリ性ホスファターゼの化合物５での化学発光検出アルカリ性ホスファターゼの化学発光検出に効果的な試薬組成物は、０．２Ｍ２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール緩衝液ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇ²⁺、０．６６ｍＭアクリダンホスフェート５（０．０３３Ｍメタノール溶液の１：１００希釈から）および０．５ｍｇ／ｍＬの増強剤Ａよりなるものであった。Turner TD-20eルミノメーターに収容したテストチューブ中、２５℃における１００μＬのこの化合物と１０^-13モルのＡＰとの反応は、２分以内に最大強度に到達する容易に測定できる青色化学発光を生じた。１および１０分の間に測定された光強度は、８×１０^-14モルないし８×１０^-18モルの範囲で酵素量と相関した。実施例１７．化学発光強度の動的プロフィールアクリダンホスフェート１を含有する組成物によって供される迅速な検出速度を図１のプロットによって示す。２５℃における実施例１４の試薬組成物１００ μＬと８×１０^-16モルのＡＰとの反応は、約２分以内に最大強度を達成した光放射のバーストを引き起こした。また、該図は、１のかわりに当該エステルを含有する以外は実施例１４に記載されたものと同様の試薬組成物中のエステルである１０−メチルアクリダン−９−カルボン酸フェニルの化学発光プロフィールを比較のために示す。該エステルの後者の溶液へのＡＰの添加は効果を生じなかった。該エステルの自然自動酸化からのかなり低い光強度およびより遅い生起時間は、１の反応からの放射が、単に、ＡＰ、続いて該エステルの自動酸化による（エノールホスフェートからのホスフェート保護基の除去を介する）該エステルの生成によるものであるスキームと適合しない。実施例１８．１とＡＰとの反応の分光学的研究雰囲気温度における３ｍＬの実施例１４の試薬組成物と２．４×１０^-12モルのＡＰとの反応の進行を、ダイオードアレイ検出器を用いるＵＶ−可視光線スペクトロスコピーによってモニターした。スペクトルは５分間隔で得た。図２で明らかとされたスペクトルの発生は、多数の中間体および生成物よりなる複雑なパターンを示した。Ａ−Ｆと示した曲線は酵素添加後０、５、１０、２０、４０および６０分に採取したスキャンを表す。実施例１９．化学発光スペクトル LumigenのBarry Schoenfelner博士によって構築されたデバイスを用い、化学発光スペクトルを得た。光の漏れないボックスの内部のテストチューブよりなる試料ホールダー中で、実施例１４の試薬組成物（２００μＬ）をＡＰ（８×１０^-13 モル）と反応させた。放射された光をレンズによって収集し、格子モノクロメーターによってＣＣＤカメラエレメントに分散させた。時間に伴う強度の変化に対する補正は必要なかった。というのは、この系は同時に可視光線の全ての波長をイメージするからである。図３に示される放射された光のスペクトルは、最大強度が約４３０ｎｍの広い放射を明らかとした。このスペクトルはＮ−メチルアクリドンの蛍光にマッチする。スペクトル中の見掛けの微細構造は装置ノイズの結果である。実施例２０．１とアルカリ性ホスファターゼとの化学発光反応に対するｐＨの影響本発明のアクリダンでのアルカリ性ホスファターゼの化学発光検出は広い範囲のｐＨにわたって行うことができる。０．１Ｍ緩衝液（トリスまたは２−メチル −２−アミノ−１−プロパノール、２２１）、ｐＨ７−１０．５、０．８８ｍＭＭｇ²⁺、０．３３ｍＭアクリダンホスフェート１（０．０３３Ｍメタノール溶液の１：１００希釈から）および０．０１ｍｇ／ｍＬの増強剤Ａを含有する溶液を調製し、バックグラウンド光放射を２５℃で１０分後に測定した。８×１０^-1 ⁶ モルの酵素を含有するＡＰ溶液のアリコットを注入し、最大強度に到達するまで光強度をモニターした。Ｓ／Ｂは酵素の不存在下における光強度に対する最大光強度の比率を表す。実施例２１．界面活性剤による化学発光の増強テスト物質の不存在下におけるレベルを超える光強度の増加と定義される、化学発光の増強は、種々の界面活性剤化合物の不存在下におけるアクリダン１とＡＰとの反応におけるテスト条件の標準的セット下で評価した。最大増強を生じる各界面活性剤の濃度を独立して測定した。Ｓ／Ｂで示した欄における値は１０^-1 ⁶ モルのＡＰでの光強度と酵素なしでのそれとの比率を表す。Ｒｅｌ．と示した欄は増強剤なしで得られた結果に対して正規化した同比率を表す（試行１１）。試行４−１１におけるＳ／Ｂ値は得られる最大増強を表していない。というのは、これらの光増強剤を用いると、光強度は１時間より長く上昇し続けるからである。実施例２２．アクリダンホスフェート１での光強度および反応速度に対する増強剤Ａの濃度の効果濃度依存性実験を行って、アクリダンホスフェート１とＡＰとの化学発光反応における最大シグナル／バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）レベルを生じた増強剤Ａの量を決定した。０．８８ｍＭＭｇ²⁺および０．５、０．２５、０．１、０．０５または０．０２５ｍｇ／ｍＬの増強剤Ａを含有する０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．５中の１の溶液を調製した。アリコット（１００μＬ）を２５℃で平衡化し、８×１０^-16モルのＡＰと反応させた。表４に報告するＳ／Ｂ値は、最大光増強が０．００５−０．０１ｇ／Ｌの増強剤で起こることを示す。実施例２３．アルカリ性ホスファターゼのアクリダンホスフェート１での検出の直線性および感度アクリダンホスフェート１を含有する本発明の試薬組成物を用い、ＡＰの検出の感度および直線性を測定した。９６−ウェルの白色マイクロプレート中の３ウェルの各々に、８×１０^-15モルおよび８×１０^-20モルの間の酵素を含有するＡＰの１０μＬ希釈を添加した。０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１ｍｇ／ｍＬの増強剤Ａ、１％メタノールおよび０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．５、中の０．３３ｍＭ溶液アクリダンホスフェート１を含有する検出試薬の１００μＬアリコットを注入した。光強度を２．５分後に測定した。図４はアルカリ性ホスファターゼの直線検出を示す。Ｓ−Ｂで示す項はＡＰの不存在下におけるバックグラウンド化学発光（Ｂ）に対して補正したＡＰ存在下でのＲＬＵにおける化学発光シグナル（Ｓ）をいう。計算された検出限界（バックグラウンドの標準偏差の２倍）はこれらの条件下で１．２×１０^-19モルであると決定された。１０分後に測定された光強度を用いて同様の結果が得られた。実施例２４．ｐＨ変化によるＡＰの化学発光検出ＡＰと１との反応によって放射される光を検出する別の方法は、増強剤の不存在下、第１のｐＨにてＡＰと共に１を含有する試薬組成物をインキュベートし、次いで、増強剤を含有する強塩基の溶液を注入することにより迅速にｐＨを上昇させて光放射のバーストを引き起こすことである。＜１０^-18モルのＡＰの検出を可能とする条件のセットを考案した。０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ９、０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂中の０．３３ｍＭアクリダンホスフェート１を含有する試薬組成物（１００μＬ）を１０μＬのＡＰ（８×１０^-15−８×１０^-20モル）または試薬ブランクとしての１０μＬの水とを黒色マイクロプレートのウェル中にて雰囲気温度で４分間反応させた。１ＮＮａＯＨ（１００μＬ）中に０．５ｍｇ／ｍＬの増強剤Ａを含有する溶液を注入し、１０秒間の光強度について積分した。光強度は図５に示すごとく、８×１０^-15および８×１０^-19モルの間のＡＰの量の直線関数であった。実施例２５．酸性ホスファターゼの化学発光検出およびタルトレートによる阻害酸性ホスファターゼ（ＡｃＰ）の化学発光検出用の試薬組成物は０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ７、０．３３ｍＭアクリダンホスフェート１（０．０３３Ｍメタノール溶液の１：１００希釈から）および０．０１−０．１％の増強剤Ａを含有するものであった。Turner TD-20eルミノメーターに収容したテストチューブ中、雰囲気温度にて、この組成物１００μＬとＡｃＰ（Sigma AcP LIN-TROL、２．０ｍＬ、８３Ｕ／Ｌへ復元）との反応は化学発光を生じ、これはほとんど瞬間的に最大強度に達し、数分間ほとんど一定のままであった。蛋白質ウシ血清アルブミンの０．１％の検出試薬への添加は、光放射の持続を有意に延長した。０．０４Ｍタルトレート５μＬのクエン酸塩緩衝液（０．０９Ｍ、ｐＨ４．８）への添加は、タルトレート（前立腺酸性ホスファターゼに対する特異的阻害剤）による酵素活性の阻害のため、光放射の完全な消光を引き起こした。放射の消滅はｐＨの低下によるものではなかった。というのは、１０μＬのクエン酸塩緩衝液の添加は光強度の２５％減少を引き起こしたに過ぎなかったからである。実施例２６．ｐＨ変化によるＡｃＰの化学発光検出ＡｃＰと１との反応によって放射された光を検出する別の方法は、１および増強剤を含有する試薬組成物を第１のｐＨにおいてＡｃＰと共にインキュベートし、次いで強塩基の溶液を注入することによりｐＨを迅速に上昇させて光放射のバーストを引き起こすことである。０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．０、０．１％ＢＳＡおよび０．０１％増強剤Ａ中の０．３３ｍＭアクリダンホスフェート１を含有する試薬組成物（１００μＬ）を３μＬのＡｃＰ（Sigma AcP LIN-TROL，２．０ｍＬ、８３Ｕ／Ｌに復元）とテストチューブ中で、雰囲気温度にて８分間反応させた。１ＮＮａＯＨ（５０μＬ）の溶液を注入し、４分間の光強度に対して積分した。光強度は試薬ブランクの３倍であった。実施例２７．ＰＶＤＦ膜を用いるウェスタンブロットアッセイ本発明の組成物を用いて、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜上のＡＰ−標識抗体を用いるウェスタンブロットにて蛋白質ヒト・トランスフェリンを検出し定量した。蛋白質の各々５０００、１０００、１８０、３０および５ｐｇを含有するトランスフェリンの希釈を電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に移した(Milli pore，Bedford，MA)。トランスフェリンバンドをブロックし、次いで順次ヤギ抗 −ヒト・トランスフェリンおよびウサギ抗−ヤギ−ＡＰコンジュゲートと反応させた。０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂、０．６６ｍＭアクリダンホスフェート１および０．１ないし１ｍｇ／ｍＬの増強剤Ａを含有する０．２Ｍ２２１緩衝液ｐＨ９．６を含有する試薬を用い、膜を軽く浸漬させた。膜を透明なブラスチックシートの間に置き、Ｘ−線フィルムに露出させた。図６は、０．１ｍｇ／ｍＬの増強剤を含有する試薬組成物を用いる、１分露出にて１５分後におけるヒト・トランスフェリンの検出を示す。種々の量の増強剤を含むこれらの組成物を用いて生じた光は、少なくとも２週間イメージできた強い放射に導いた。驚くべきことに、０．５ｍｇ／ｍＬの増強剤Ａを含有する組成物は、その強度が４日間ほぼ一定で、相対的バンド強度の変化が無い光放射を生じることが判明した。ＰＶＤＦ膜で生じた光放射は、１カ月を超える非常に長時間有用なレベルで止まった。５週間後、ただの２０分の露出にて、５ｐｇのバンドが依然としてイメージできた。有用なレベルでの放射のこの持続は前例が無い。実施例２８．ニトロセルロース膜を用いるウェスタンブロット固相としてニトロセルロース膜を用い、実施例２７における手法に従ったウェスタンブロットアッセイを行った。５０００−３０ｐｇの範囲のトランスフェリン標準を用いた。全てのレベルの蛋白質の検出を可能とする検出試薬は、０．２Ｍ２２緩衝液、ｐＨ９．６、０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂、０．３３ｍＭアクリダンホスフェート１および０．５ｍｇ／ｍＬの増強剤Ａを含有するものであった。検出は数時間にわたって行うことができた。実施例２９．化学発光検出を用いるサザーンブロットアッセイサザーンブロッティングの技術によるニトロセルロース膜上のＤＮＡの化学発光検出のための本発明の組成物の使用を以下の実施例で示す。アビジン−ＡＰコンジュゲートはCappel Products(Durham,NC)から入手した。ウシ血清アルブミン（熱ショック）はSigma Chemical Co．(St．Louis,MO)から購入した。ヒトゲノムＤＮＡおよびヒト・トランスフェリンレセプターｃＤＮＡはClontech(Palo Alto,CA)からのものであった。ビオチン化ラムダＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片、ビオチン−７−ｄＡＴＰおよびニックトランスレーションキットはLife Technologiesから、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩはBoehri nger-Mannheim (Indianapolis, IN)から、およびニトロセルロース膜はSchlei her & Schuell Inc.(Keene,NH)からのものであった。Ｘ−線フィルムはKodak (Rochester,NY)からのＸ−ＯＭＡＴＡＲであった。ヒトゲノムＤＮＡ（１９．５μｇ）をＨｉｎｄＩＩＩで完全に切断し、１３μ ｇおよび６．５μｇ分に分割した。制限したＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製した。精製したＤＮＡを溶出緩衝液として４０ミリモル／Ｌトリス−アセテート、２ミリモル／ＬＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を用いる０．７５％アガロースゲル上の電気泳動によって分離した。電気泳動に続き、該ゲルを水ですすぎ、０．２５モル／ＬＨＣｌで１２分間平衡化させ、再度水ですすぎ、０．５モル／ＬＮａＯＨ、１．５モル／ＬＮａＣｌ中で１５分間、次いで、同溶液の新鮮な交換液中で３０分間インキュベートし、水ですすぎ、１モル／Ｌトリス、１．５モル／ＬＮａＣｌ、ｐＨ７．５の３交換液中で各々１５分間インキュベートした。ニトロセルロース膜を順次水に２分間、１０×ＳＳＣに３０分間浸漬させた。１０×ＳＳＣ中で一晩キャピラリーブロッティングすることによってＤＮＡを膜に移した。室温にて１０×ＳＳＣ中で１０分間温和に攪拌することによって膜を洗浄し、Whatman ３ＭＭブロッティングペーパー上で３０分間風乾し、真空下で２時間８０℃にて加熱した。６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥは３モル／ＬＮａＣｌ、０．２モル／ＬＮａＨ₂ＰＯ₄、２０ミリモル／ＬＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）中に膜を浸漬し、続いて、プレ−ハイブリダイゼーション溶液：６×ＳＳＰＥ、５０％新鮮な脱イオン化ホルムアミド、濾過した５×Denhardt's溶液（５０×は１％Ficol ４００、１％ＰＶＰ、１％ＢＳＡ（熱ショックによる最初の画分）である）、濾過した１％ＳＤＳおよび２００μｇ／ｍＬの剪断した変性ニシン精子ＤＮＡ中、４２℃で３時間プレ−ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションプローブ、ヒト・トランスフェリンレセプターｃＤＮＡを、製造業者の指示に従ってニックトランスレーションによってビオチン−７−ｄＡＴＰで標識した。ゲノムＤＮＡを６×ＳＳＰＥ、４５％ホルムアミド、濾過した５×Denhardt's、１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ中、４２℃にて一晩３００μｇ／ｍＬ変性ビオチン化プローブとハイブリダイズさせた。ビオチン化プローブを４分間沸騰させ、０℃で１０分間冷却することによって変性させた。膜を２５℃にて０．５×ＳＳＣ、０．４％ＳＤＳで５分間２回、５５℃にて０．５×ＳＳＣ、０．４％ＳＤＳで１０分間３回、２５℃にて２×ＳＳＣで５分間１回、ＴＢＳ（５０ミリモル／Ｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５モル／ＬＮａＣｌ）で３分間２回洗浄した。洗浄工程の後、膜を濾過した３％ＢＳＡ、１００ミリモル／Ｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５モル／ＬＮａＣｌ中、６３℃で１時間ブロックし、Ｔ−ＴＢＳ（ＴＢＳ中、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で１分間洗浄した。ブロックした膜をＴ−ＴＢＳ中、アビジン−ＡＰの１：２０００希釈と共に１２分間、続いて、Ｔ−ＴＢＳの４回の新鮮な交換液と共に５、１０、１５および２０分間、続いて最後にＴＢＳと共に５分間インキュベートした。過剰の緩衝液を排出し、ブロットを実施例２７に記載した検出試薬中に３分間浸漬した。過剰の試薬を排出し、ブロットを透明なシート間に入れ、Ｘ−線フィルムに露出させた。膜を検出試薬で浸漬し、種々の時間Ｘ−線に露出させることによって、単一コピー遺伝子が１０．５および５．２ｋｂｐに検出された。１２分間のインキュベーションの後、両画分における単一コピー遺伝子に対応するバンドは、本発明の試薬を用いてフィルムに５分間露出させて目に見えた。また、より短いインキュベーション時間は過剰のイメージを生じた。多数回の露出は１日につき容易に行うことができた。実施例３０．化学発光プロフィールに対するルシゲニンの効果図７のプロットによって、アクリダンホスフェート５とＡＰとの反応にルシゲニンを添加することによってより高い光強度が示される。０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂を含有する０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．８中の５（０．６６ｍＭ）の溶液の１００μＬ分と、８×１０^-16モルのＡＰとの２５℃における反応を、６．４ μＭルシゲニンの存在下および不存在下で行った。図７は、ルシゲニンの溶液への取り込みに由来するはるかに高い光強度を示す。実施例３１．化合物５でのアルカリ性ホスファターゼの化学発光検出アルカリ性ホスファターゼの化学発光検出のための高度に効果的な試薬組成物は、０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．８、６．４μＭルシゲニン、０．６６ｍＭ化合物５、１ｍｇ／ｍＬＳＤＳ、０．０１ｍｇ／ｍＬＮａ₂ＳＯ₃、０．０３３％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０および０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂を含有するものであった。２５℃におけるこの組成物１００μＬと８×１０^-16モルのＡＰとの反応は化学発光を生じ、これは２分以内に最大強度に達した。図８は、３７℃でトリガーされる、５およびカチオン性ポリマー界面活性剤増強剤ポリ（ビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド）−コ−ポリ−（ビニルベンジルトリオクチルホスホニウムクロリド）（約３：１の比率のトリブチル：トリオクチル基を含有（０．２５ＴＢ／ＴＯ））を含有する試薬組成物との比較を示す。後者のポリマー界面活性剤を含有する組成物は従前にＣＡＣの不存在下で最高レベルの化学発光であることが判明している。実施例３２．アルカリ性ホスファターゼ検出の直線性および感度化合物５およびルシゲニンを含有する試薬組成物（試薬Ａ）を用い、ＡＰの検出の感度および直線性を決定し、化合物５および０．２５ＴＢ／ＴＯを含有する試薬組成物（試薬Ｂ）を用いて達成される結果と比較した。該試薬は以下の組成を有する。試薬Ａ試薬Ｂ化合物５、０．６６ｍＭ化合物５、０．６６ｍＭ０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．８０．２Ｍ２２１緩衝液、ｐＨ９．６０．０１または０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂ ０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂ ルシゲニン、６．４μＭ０．２５ＴＢ/ＴＯ、０．５ｍｇ/ｍＬＳＤＳ、１ｍｇ／ｍＬＮａ₂ＳＯ₃、０．０１ｍｇ／ｍＬＴＷＥＥＮ２０、０．０３３％（ｗ／ｖ）９６−ウェル白色マイクロプレート中の３ウェルの各々に、８×１０^-13モルおよび８×１０^-22モルの間の酵素を含有するＡＰの１０μＬ希釈、ならびに検出試薬ＡまたはＢの１００μＬアリコットを添加した。光強度を２．５分後に測定した。図９はアルカリ性ホスファターゼの直線的検出を示す。計算された検出限界（バックグラウンドを超える標準偏差の２倍）は試薬Ａにつき３．５×１０^-21 モルと、試薬Ｂにつき１．２×１０^-19モルであると決定された。実施例３３．化合物１−１３での化学発光検出実施例３０と同様にして、０および６．４μＭルシゲニンと共に化合物１−１３の各々０．６６ｍＭを含有する組成物を２５℃で８×１０^-16モルのＡＰと反応させた。各々は、ルシゲニンが反応溶液中にある場合、より強い化学発光を有意に示した。実施例３４．化合物７−１２を用いるＡＰの検出の直線性および感度実施例３２と同様にして、化合物５の代わりに化合物７−１２の各々０．６６ｍＭで置き換え、試薬Ａの組成物に従い、試薬を調製した。これらの試薬の各々１００μＬに、８×１０^-16モルおよび８×１０^-22モルの間の酵素を含有するＡＰの１０μＬ希釈または試薬ブランク用に水１０μＬを添加した。各々の場合、８×１０^-21モルの酵素を含有する反応溶液は約２分以内にピークシグナルを生じ、これはブランクよりも高かった。図１０および１１および１８は、各々、化合物７、８および１２についての結果を示す。実施例３５．化合物７を用いる化学発光の時間プロフィール化合物７を含有する試薬組成物によって放射される化学発光の迅速な生成を以下の実験で示す。０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．８、６．４μＭルシゲニン、０．６６ｍＭアクリダンホスフェート７、１ｍｇ／ｍＬドデジル硫酸ナトリウム、０．０１ｍｇ／ｍＬＮａ₂ＳＯ₃、０．０３３％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０および０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂よりなる試薬の１００μＬ分を室温にて８×１０^-16 モルのＡＰと反応させた。化学発光強度は図１２に示すごとく５秒以内に安定なプラトーに到達した。実施例３６．種々のＣＡＣでの化学発光強度の増加ＤＭＳＯ中の２１ｍＭＣＡＣｌ−１１を含有するテスト溶液を調製した。これらを０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂を含有する０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．８中のアクリダンホスフェート化合物５の溶液に１：１０００希釈した。各最終試薬組成物の三連の１００μＬ分を、白色マイクロプレート中、室温にて４×１０^-1 ⁶ モルのＡＰと反応させた。表５は３６分に測定したプラトー強度（Ｓ）および各ＣＡＣについてのシグナル／バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）に対する影響を示す。各々は、ＣＡＣなくしての対照よりも、より高いピークシグナルＳおよびＳ／Ｂを生じた。実施例３７．５とＡＰとの化学発光反応に対するＣＡＣの濃度の効果本発明の組成物でのＡＰの化学発光検出は、広範囲の濃度のＣＡＣにわたって行うことができる。ルシゲニン株溶液の１０−倍系列希釈によって、６．４ｍＭないし６．４ｎＭの範囲でルシゲニンの濃度を変化させて、０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂を含有する０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．８中の０．６６ｍＭ化合物５を含有する組成物を調製した。対照はルシゲニンを含有しなかった。６．４ｍＭおよび６．４ｎＭの間で含有するテスト溶液（１００μＬ、５連）を４×１０^-16 モルのＡＰと反応させ、室温での３．５分間のインキュベーションの後に対照よりも高いシグナル（Ｓ）を生じた。実施例３８．５とＡＰとの化学的発光反応に対するアニオン性界面活性剤の濃度の影響本発明の組成物でのＡＰの化学発光検出はアニオン性界面活性剤ＳＤＳの広範囲の濃度にわたって行うことができる。ＳＤＳ濃度を１０ｍｇ／ｍＬないし１０ μｇ／ｍＬの範囲で変化させ、０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．８中の０．６６ｍＭ化合物５および０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂を含有する組成物を調製した。対照はＳＤＳを含有しなかった。４×１０^-16モルのＡＰと反応したテスト溶液（１００μＬ、５連）は、対照よりも室温で速いピークシグナルへの上昇を生じた。実施例３９．５とＡＰの化学発光反応に対する非イオン性界面活性剤の濃度の影響本発明の組成物でのＡＰの化学発光検出は非イオン性界面活性剤ＴＷＥＥＮ２０の広範囲の濃度にわたって行うことができる。２１μＭのルシゲニンを用い、非イオン性界面活性剤の濃度を１．０％ないし０．００１％の範囲で変化させ、Ｎａ₂ＳＯ₃を欠く以外は実施例３２の試薬Ａに従って組成物を調製した。対照は非イオン性界面活性剤を含有しなかった。テスト溶液（１００μＬ、５連）および対照を室温にて４×１０^-16モルのＡＰと反応させた。各テスト溶液は最大強度においてまたはその近くで化学発光の持続を延長するのに効果的であった。実施例４０．５とＡＰとの化学発光反応に対する亜硫酸ナトリウムの濃度の影響本発明の組成物でのＡＰの化学発光検出は、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₃）の広範囲の濃度にわたって行うことができる。Ｎａ₂ＳＯ₃の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬないし１．０μｇ／ｍＬの範囲で変化させる以外は実施例３２の試薬Ａに従った組成物を調製した。対照はＮａ₂ＳＯ₃を含有しなかった。各テスト溶液（１００μＬ、５連）は、室温での３．５分のインキュベーションの後に４×１０^-1 ⁶ モルのＡＰと反応させると、対照よりもＡＰの不存在下におけるより低いバックグラウンドシグナル（Ｂ）およびより高いシグナル（Ｓ）を生じた。この実験において、最大シグナルは１．０μｇ／ｍＬを用いて得られ、他方、最大Ｓ／Ｂは１．０ｍｇ／ｍＬを用いて得られた。実施例４１．ウェスタンブロットアッセイ本発明の組成物を用いて、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上のＡＰ− 標識抗体を用いるウェスタンブロットにおいて蛋白質ヒト・トランスフェリンを検出し定量した。蛋白質の各々５０００、１０００、１８０、３０および５ｐｇを含有するトランスフェリンの希釈物を電気泳動し、ＰＶＤＦ膜(Millipore,Bed ford,MA)に移した。トランスフェリンバンドをブロックし、次いで、順次ヤギ抗 −ヒト・トランスフェリンおよびウサギ抗−ヤギ−ＡＰコンジュゲートと反応させた。０．８８ｍＭＭｇＣｌ₂、０．６６ｍＭ化合物５および６４μＭルシゲニンを含有する０．１Ｍトリス緩衝液ｐＨ８．８を含有する試薬を用い、膜を軽く浸漬した。膜を透明なプラスチックシート間に入れ、ｘ−線フィルムに露出させた。１０分後に２．５分露出でヒト・トランスフェリンのバンドを検出した。この組成物を用いて生じた光は強い放射に導き、これは数時間イメージすることができた。ＰＶＤＦ膜の代わりにニトロセルロースブロッティング膜を用いて同様の結果が得られた。実施例４２．サザーンブロットアッセイサザーンブロットアッセイにおける本発明の試薬の使用の代表的な例を以下の実施例で示す。アビジン−ＡＰコンジュゲートはCappel Products(Durham,NC)から入手した。（熱ショックした）ウシ血清アルブミンはSigma Chemical Co．(St．Louis,MO )から購入した。マウスゲノムＤＮＡはClontech(Palo Alto,CA)からのものであった。ビオチン化ラムダＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片、ビオチン−７−ｄＡＴＰおよびニックトランスレーションキットはLife Technologiesから、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩはBoehringer-Mannheim(Indianapolis，IN)から、およびナイロン膜はMicron Separation Inc.(Westborough，MA)からのものであった。Ｘ−線フィルムはKodak(Rochester,NY)からのＸ−ＯＭＡＴＡＲであった。マウスゲノムＤＮＡ（３０μｇ）をＥｃｏＲＩで完全に切断した。２および４ μｇ分を、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製した。精製したＤＮＡを溶出緩衝液として４０ミリモル／Ｌトリス−アセテート、２ミリモル／ＬＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を用いる０．７５％アガロースゲル上の電気泳動によって分離した。電気泳動に続き、該ゲルを水ですすぎ、０．２５モル／ＬＨＣｌで１２分間平衡化させ、再度水ですすぎ、０．５モル／ＬＮａＯＨ、１．５モル／ＬＮａＣｌ中で１５分間、次いで、同溶液の新鮮な交換液中で３０分間インキュベートし、水ですすぎ、１モル／Ｌトリス、１．５モル／ＬＮａＣｌ、ｐＨ７．５の３交換液中で各々１５分間インキュベートした。ナイロン膜を順次水で２分間、１０×ＳＳＣで３０分間浸漬させた。１０×ＳＳＣ中で一晩キャピラリーブロッティングすることによってＤＮＡを膜に移した。室温にて１０×ＳＳＣ中で１０分間温和に攪拌することによって膜を洗浄し、 Whatman ３ＭＭブロッティングペーパー上で３０分間風乾し、真空下で２時間８０℃にて加熱した。６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥは３モル／ＬＮａＣｌ、０．２モル／ＬＮａＨ₂ＰＯ₄、２０ミリモル／ＬＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）中に膜を浸漬し、続いて、プレ−ハイブリダイゼーション溶液：６×ＳＳＰＥ、５０％新鮮脱イオン化ホルムアミド、濾過した５×Denhardt's溶液（５０×は１％Fiooll ４００、１％ＰＶＡ、１％ＢＳＡ（熱ショックによる最初の画分）である）、濾過した１％ＳＤＳおよび２００μｇ／ｍＬの剪断した変性ニシン精子ＤＮＡ中、４２ ℃で３時間プレ−ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションプローブ、オンコジーンプローブｖ−ｍｏｓＤＮＡ(PanVera Corp.，Madison,WI)を、製造業者の指示に従ってニックトランスレーションによってビオチン−７−ｄＡＴＰで標識した。ゲノムＤＮＡを６×ＳＳＰＥ、４５％ホルムアミド、濾過した５×Denhardt's、１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ中、４２℃にて一晩５００ｎｇの変性ビオチン化プローブとハイブリダイズさせた。ビオチン化プローブを４分間沸騰させ、０℃で１０分間冷却することによって変性させた。膜を２５℃にて０．５×ＳＳＣ、０．４％ＳＤＳで１５分間および３５分間、それぞれ２回、５５℃にて０．５×ＳＳＣ、０．４％ＳＤＳで１０分間３回、２５℃にて２×ＳＳＣで５分間１回、ＴＢＳ（５０ミリモル／Ｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５モル／ＬＮａＣｌ）で３分間２回洗浄した。洗浄工程の後、膜を濾過した３％ＢＳＡ、１００ミリモル／Ｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５モル／ＬＮａＣｌ中、６５℃で１時間ブロックし、Ｔ−ＴＢＳ（ＴＢＳ中、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で１分間洗浄した。ブロックした膜をＴ−ＴＢＳ中、アビジン−ＡＰの１：２０００希釈と共に１２分間、続いて、Ｔ−ＴＢＳの４回の新鮮な交換液と共に５、１０、１５および２０分間、続いてＴＢＳでの最終洗液と共に５分間インキュベートした。過剰の緩衝液を捨て、ブロットを実施例４１に記載した検出試薬中に４分間浸漬した。過剰の試薬を捨て、ブロットを透明なシート間に入れ、ｘ−線フィルムに露出させた。膜を検出試薬で浸漬し、種々の時間ｘ−線フィルムに露出させることによって、単一コピー遺伝子が１４．５ｋｂｐに検出された。９分間のインキュベーションの後、両画分における単一コピー遺伝子に対応するバンドは、フィルムに５分間露出させて目に見えた。より長く露出させることによって、多数回の露出を１日に行うことができた。実施例４３．ｈＣＧの化学発光イムノアッセイ化学発光イムノアッセイによるｈＣＧの検出方法は、製造業者によって供されたプロトコルに従い、Diagnostic Products Corp．(Los Angeles，CA)により供給されたＩＭＭＵＬＩＴＥキットを用い、ＩＭＭＵＬＩＴＥ自動分析器で行った。実施例３２の試薬Ａで該キットで供される検出試薬を置き換えた。ソフトウェアを修飾してより短い基質インキュベーションを可能とした。全てのデータポイントは、試料希釈物の５テストの平均であったブランク読みを除き、三連のテストの平均である。該キットで供給された標準希釈剤で特別のキャリブレーターを系列希釈することによって分析物を調製した。化学発光測定は基質導入後１．５分に行った。注入メカニズムのわずかな修飾を行って、チュービングにおける化学発光試薬のデッドボリュームを最小化した。基質ヒーターを断続し、フレア末端を有する黒色電気テープ中に包んだ１８”×１／１６”ＯＤ清澄テフロンチュービングを基質ポンプと灰色の基質分配ノズルの間に直接連結した。同様の長さの同一テフロンチュービングを基質ポンプの流入ポートに付着させた。この流入口チュービングを基質を含有するボトルに入れた。基質を予備加熱したり温度制御することはしなかった。外部基質温度制御の不存在下においてさえ、密なＣＶによって、温度に対する非感受性が示された。迅速な読みのルミノメーターに対する独立したテストは、基質が１０秒のインキュベーション時間と同様、短い時間で読め、感度または精度の喪失を生じないことを示す。図１３および表６に示すアッセイ結果はサンドイッチタイプの免疫アッセイにおける本組成物の有用性を示す。実施例４４．ＴＳＨの迅速な化学発光イムノアッセイ実施例４３に記載したごとく修飾した製造業者のプロトコルに従い、Diagnost ic Products Corp.からのＩＭＭＵＬＩＴＥＲＴＨ迅速ＴＳＨアッセイキットを用い、化学発光イムノアッセイによるＴＨＳの検出方法をＩＭＭＵＬＩＴＥ自動分析器で行った。実施例３２の試薬Ａで該キットに供された検出試薬を置き換えた。試薬バックグラウンドは、Third Generation TSH テストウエッジから抗体コンジュゲートを除去し、注意深くウエッジを洗浄し、内容物をタイプ１の水で置き換えることによってテストした。観察された基質バックグラウンドはほぼ秒当たり５０００カウントであった。これは、非特異的結合バックグラウンドが試薬バックグラウンドの数倍であることを示す。従って、ウエッジにおける生化学の再最適化はアッセイのいくつかの感度を有意に拡大しおよび／または生化学インキュベーション時間の減少を可能とすることができる。化学発光測定は基質導入後１．５分で行った。図１４および表７に示すアッセイ結果は、迅速アッセイを供する点で、本組成物の有用性を示す。実施例４５．ＴＳＨの化学発光イムノアッセイ実施例４３に記載したごとく修飾した製造業者のプロトコルに従い、Diagnost ic Products Corp.からのＩＭＭＵＬＩＴＥＴＳＨＴｈｉｒｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎＴＳＨアッセイキットを用い、化学発光イムノアッセイによるＴＳＨの検出方法をＩＭＭＵＬＩＴＥ自動分析器で行った。実施例３２の試薬Ａでキットに供される検出試薬を置き換えた。化学発光測定は基質導入後１．５分に行った。図１５および表８に示したアッセイ結果は、高度な感受性のアッセイを供する点で本組成物の有用性を示す。実施例４６．エストラジオールの化学発光イムノアッセイ実施例４３に記載したごとく修飾した製造業者のプロトコルに従い、Diagnost ic Products Corp.から供給されたキットを用い、化学発光イムノアッセイによるエストラジオールの検出方法をＩＭＭＵＬＩＴＥ自動分析器で行った。実施例３２の試薬Ａでキットに供される検出試薬を置き換えた。化学発光測定は基質導入後１．５分に行った。図１６および表９に示したアッセイ結果は、競合タイプのイムノアッセイにおける本組成物の有用性を示す。実施例４７．酸性ホスファターゼ（ＡｃＰ）の化学発光検出実施例３２の試薬Ａを酸性ホスファターゼを検出する実験で用いた。Turner TD-20eルミノメーターに収容されたテストチューブ中での、雰囲気温度におけるこの組成物１００μＬとＡｃＰ（Sigma AcP LIN-TROL、２．０ｍＬ、８３Ｕ／Ｌに復元）との反応は化学発光を生じ、これは２−５秒内に最大強度に達し、１０ −１５秒内にゼロまで低下した。酸性ホスファターゼは、この検出試薬の方法によって、アルカリ性ホスファターゼの存在下で測定できた。ＡｃＰによって誘導された化学発光シグナルは何秒かのうちにほとんど完全に消滅するので、約１５−２０秒後の安定な光強度の測定は図１７に示したごとくＡＰ活性の識別を可能とする。この方法は、１つの実験において同一試料中のＡｃＰおよびＡＰ活性双方の同時定量を可能とした。ＡｃＰはヒト全血で容易に測定できた。実施例４８．化合物１３を用いるＡＰの検出の直線性および感度実施例３２と同様にして、以下の組成に従って試薬を調製した。各試薬の１００μＬ分に、８×１０^-16モルおよび８×１０^-22モルの間の酵素を含有するＡＰの１０μＬ希釈物または試薬ブランク用の水１０μＬを添加した。光強度を７５秒において測定した。図１９は結果を示す。試薬化合物１３、０．３３ｍＭ０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．８ＭｇＣｌ₂、５μＭルシゲニン、３．２μＭＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍＬＮａ₂ＳＯ₃、５μｇ／ｍＬＴＷＥＥＮ２０、０．１５ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）実施例４９．以下の化合物：［式中、Ｖはｔ−ブチル、ＣＨ₃、ＯＣＨ₃、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＯＣＨ₃、ＣＮおよびＮＯ₂である］ならびに式：［式中、Ｕはｐ−Ｉ、ｐ−ＣＨ₃、ｍ−ＯＣＨ₃、ｏ−Ｃｌ、ｍ−Ｃｌ、ｏ−Ｂｒ、ｍ−Ｂｒ、ｐ−Ｂｒおよびｐ−ＮＯ₂である］の化合物、ならびに３，４−ジクロロ−、２，５−ジクロロ−および２，６−ジクロロフェニル基を有するこの式の化合物も合成し、ＡＰと反応させた場合に化学発光を生じることが判明した。

【手続補正書】【提出日】１９９８年１月１４日【補正内容】特許請求の範囲１．式Ｉ：［式中、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子よりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］の化合物。２．Ｒ₆がＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有する請求項１に記載の化合物。３．Ｒ₆がアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される請求項２に記載の化合物。４．式ＩＩの化合物および式ＩＩＩの化合物：［式中、Ｒ₁はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環を含有する炭素環または複素環系を形成し得る］よりなる群から選択される請求項１に記載の化合物。５．Ｒ₁がＣ₁ないしＣ₄アルキル基およびベンジル基よりなる群から選択される請求項４に記載の化合物。６．式：［式中、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々が独立してＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有し、化学発光を生じさせる置換基であって、Ａｒはアリール環基である］を有する請求項４に記載の化合物。７．Ｒ₇ないしＲ₁₄のうちの少なくとも１つがアルコキシ基であって、Ｒ₇ないしＲ₁₄の残りが水素である請求項６に記載の化合物。８．式：［式中、Ａｒはフェニル基であり、Ｚはイオウまたは酸素原子から選択される］を有する請求項６に記載の化合物。９．式：［式中、Ｚはイオウ原子であり、Ａｒは、２，６−ジメチルフェニル、４−クロロフェニル、４−フルオロフェニル、２−ナフチルおよび４−メトキシフェニルからなる群から選択される］を有する請求項６に記載の化合物。１０．Ｚはイオウ原子であり、Ａｒはフェニル基であり、Ｒ₇、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂およびＲ₁₄は水素原子であり、Ｒ₈およびＲ₁₃はフッ素原子であり、Ｒ₁はＣＨ₃基である、請求項６に記載の化合物。１１．式：を有する請求項４に記載の化合物。１２．ａ）ホスファターゼ酵素と反応する、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の化合物、およびｂ）化学発光を増強または増大するのに有効な量の少なくとも１種の増強剤；を水性溶液中に含む、ホスファターゼ酵素の存在下で化学発光を生じさせる試薬組成物。１３．該増強剤が界面活性剤増強剤であり、好ましくはポリマー第四級アンモニウムおよびホスホニウム塩、モノマー第四級アンモニウムおよびホスホニウム塩ならびにジカチオン性第四級アンモニウムおよびホスホニウム塩、より好ましくはビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩およびビニルベンジルトリオクチルホスホニウム塩のコポリマーから選択される請求項１２に記載の組成物。１４．該増強剤が、約３：１の比率のビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩およびビニルベンジルトリオクチルホスホニウム塩基を含有するコポリマーである請求項１３に記載の組成物。１５．さらに反応を促進させるのに有効な量のマグネシウム塩を含有する請求項１３または１４に記載の組成物。１６．該増強剤が、カチオン性芳香族化合物の不存在下で生じるそれと比較して化学発光を増大させるのに有効な量の該カチオン性芳香族化合物である、請求項１２に記載の組成物。１７．該カチオン性芳香族化合物がシアニン色素、カルボシアニン色素、アゾ色素、アクリジニウム誘導体、メチレンブルー、ナイルブルー、ＩＲ−１０４０、ルシゲニンおよびパラコートジクロリドよりなる群から選択される請求項１６に記載の組成物。１８．さらに、最大化学発光強度が到達する速度を増大させるのに有効な量のアニオン性界面活性剤および化学発光の量を増加させるのに有効な量の非イオン性界面活性剤を含有する請求項１６に記載の組成物。１９．該アニオン性界面活性剤が、少なくとも１０個の炭素原子を含有するアルキルスルファートおよび少なくとも１０個の炭素原子を含有するアルキルスルホナート、好ましくはドデシル硫酸ナトリウムから選択され、該非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテルおよびポリオキシエチレン化ソルビトールエステルから選択される請求項１８に記載の組成物。２０．さらに、ホスファターゼ酵素の不存在下で組成物によって生じる化学発光を減少させるのに有効な量の亜硫酸塩、好ましくは亜硫酸ナトリウムを含有する請求項１８に記載の組成物。２１．ホスファターゼ酵素を、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の少なくとも１種の化合物と反応させることを含有する化学発光を生じさせる方法。２２．該ホスファターゼ酵素が細菌アルカリ性ホスファターゼ、哺乳動物アルカリ性ホスファターゼ、植物酸性ホスファターゼ、哺乳動物酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートよりなる群から選択される請求項２１に記載の方法。２３．該アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートがハプテン、抗体、蛋白質、核酸およびオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される生物学的分子に連結したアルカリ性ホスファターゼを含有する請求項２２に記載の方法。２４．ａ）該化学発光を検出し；次いで、ｂ）該化学発光の量を分析物の量と関連付けることをさらに含有する；化学発光アッセイ法によって試料中の分析物を検出する方法。２５．該化合物が、請求項１２に記載の試薬組成物中にある請求項２４に記載の方法。２６．該増強剤が、請求項１３に記載の界面活性剤増強剤である請求項２５に記載の方法。２７．さらに、（ａ）第１のｐＨで緩衝液中で式Ｉの化合物をホスファターゼ酵素と第１の時間反応させ；（ｂ）強塩基性トリガー溶液を該緩衝液に添加して、該緩衝液のｐＨを化学発光を誘導するための第２のｐＨまで上昇させ；次いで、（ｃ）化学発光を測定する；ことを含有する請求項２４に記載の方法。２８．該第１のｐＨが５.０−９.５であり、トリガー溶液のｐＨが約１１より大きく、かつ該第１の時間が約１秒ないし約１０分である請求項２７に記載の方法。２９．該塩基性トリガー溶液が界面活性剤増強剤、好ましくはビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩およびビニルベンジルトリオクチルホスホニウム塩のコポリマーを含有する請求項２７に記載の方法。３０．該増強剤が、カチオン性芳香族化合物の不存在下で生じるそれと比較して化学発光を増大させるのに有効な量の該カチオン性芳香族化合物である、請求項１２に記載の試薬組成物を提供することをさらに含む、請求項２１ないし２３のいずれか１項に記載の方法。３１．請求項１８ないし２０のいずれか１項に記載の試薬組成物を提供することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。３２．該試薬組成物が、請求項１６ないし２０のいずれか１項に記載の成分をさらに含有する請求項２５に記載の方法。３３．検出すべき分析物がホスファターゼ酵素である請求項２４または３２に記載の方法。３４．検出すべき分析物がホスファターゼ酵素の阻害剤である請求項２４または３２に記載の方法。３５．さらに、試料中の分析物を、該分析物と特異的に結合する標識された分析物結合性化合物と反応させることを含有し、分析物−結合性化合物をアルカリ性ホスファターゼで標識する請求項２４または３２に記載の方法。３６．該分析物−結合性化合物が抗体、抗原、ハプテンおよび核酸よりなる群から選択される請求項３５に記載の方法。３７．さらに、試料中の分析物を、該分析物と特異的に結合する分析物結合性化合物および該分析物結合性化合物用の少なくとも１種のホスファターゼ−標識特異的結合性物質と反応させることを含有する請求項２４または３２に記載の方法。３８．さらに、試料中の分析物を、（ａ）該分析物と特異的に結合する分析物結合性化合物および少なくとも１種の第２の特異的結合性物質を含有する標識された分析物結合性化合物；および（ｂ）第２の特異的結合性物質用のホスファターゼ−標識結合性パートナー；と反応させることを含有する請求項２４または３２に記載の方法。３９．検出を膜の上で行い、該膜が好ましくはニトロセルロース膜、二フッ化ポリビニリデン膜およびナイロン膜よりなる群から選択される請求項２４、および３２ないし３８のいずれか１項に記載の方法。４０．（ａ）初期の間の化学発光の量または強度を検出し；（ｂ）化学発光が一定レベルに到達するまで第２の時間待ち；（ｃ）第３の時間、化学発光の量または強度を検出し；（ｄ）初期の時間における化学発光を酸性ホスファターゼの量に関連付け；（ｅ）第３の時間における化学発光をアルカリ性ホスファターゼの量に関連付ける；ことをさらに含有する化学発光アッセイ法による酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼを共に含有すると考えられる試料中の酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼを検出する方法。４１．（ａ）式：［式中、Ｈｅｔ、ＺおよびＲ₆は化合物Ｉについての定義に同じ］を有する複素環エステルまたはチオエステル化合物ＶＩＩＩを塩基と反応させてＶＩＩＩのエノラートを形成させ；（ｂ）該エノラートをリン酸化剤と反応させて、式：［式中、Ｈｅｔ、ＺおよびＲ₆は前記定義に同じであって、Ｙは保護基である］を有する保護されたエノールホスフェートＩＸを形成させ；次いで、（ｃ）もしカチオン性種が脱保護剤の一部でなければ、カチオン種Ｍの存在下でＩＸを少なくとも１種の脱保護剤と反応させることによりエノールホスフェート塩化合物Ｉを形成させる；工程を含有する式Ｉ：［式中、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子よりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］の化合物の製法。４２．化合物ＶＩＩＩのエノラートをリン酸化剤と反応させて保護されたエノールホスフェートＩＸを形成させる工程が、（ａ）化合物ＶＩＩＩのエノラートをオキシハロゲン化リン化合物ＰＯＷ₃ （式中、ＷはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択されるハロゲン原子）と反応させて式：［式中、Ｈｅｔ、ＺおよびＲ₆は化合物ＶＩＩＩで定義したものと同じ］を有するエノールジハロホスフェートＸを形成させ；（ｂ）化合物Ｘを少なくとも２当量のヒドロキシル化合物Ｙ−ＯＨと反応させて保護されたエノールホスフェートＩＸを形成することを含有する請求項４１に記載の製法。４３．化合物ＶＩＩＩの該エノレートをリン酸化剤と反応させて保護されたエノールホスフェートＩＸを形成させる工程が、化合物ＶＩＩＩのエノラートを、保護基Ｙを含有し、式Ｗ−ＰＯ（ＯＹ）₂［式中、ＷはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択されるハロゲン原子である］を有するリン酸化剤と反応させることを含有する請求項４１に記載の製法。４４．該基Ｙが低級アルキル基、置換された低級アルキル基、フェニル、置換されたフェニルおよびベンジル基よりなる群から選択される請求項４１に記載の製法。４５．該基Ｙが連結して単一の基−ＣＨ₂ＣＨ₂−を形成する請求項４１に記載の製法。４６．該脱保護剤が水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシド、水酸化アンモニウムのごとき有機および無機塩基、シアニドイオン、フルオリドイオンのごとき求核剤よりなる群から選択される請求項４１に記載の製法。４７．ＹがＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ基であって、脱保護剤が水酸化ナトリウムおよび炭酸ナトリウムから選択される請求項４１に記載の製法。４８．ＹがＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ基であって、脱保護剤が水酸化ナトリウムおよび炭酸ナトリウムから選択される請求項４７に記載の製法。４９．式Ｉの化合物が式ＩＩの化合物および式ＩＩＩの化合物：［式中、Ｒ₁は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、およびアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環を含有する炭素環または複素環系を形成可能であり、Ｒ₆はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有し、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される］よりなる群から選択される請求項４１に記載の製法。５０．式Ｉの該化合物が式：［式中、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立してＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、これは化学発光を生じさせ、Ａｒはアリール環基である］を有する請求項４９に記載の製法。５１．式ＩＸ：［式中、Ｈｅｔは少なくとも１つのＮまたはＳ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、Ｙは除去できてホスフェート塩化合物を形成する保護基である］の化合物。５２．式：［式中、Ｒ₁は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環よりなる炭素環または複素環系を形成可能であり、Ｒ₆はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有し、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される］の化合物よりなる群から選択される請求項５１に記載の化合物。５３．式：［式中、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立してＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の置換基であり、これは化学発光を生じさせ、Ａｒはアリール環基である］を有する請求項５２に記載の化合物。５４．ＹがＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ基である請求項５１ないし５３のいずれか１項に記載の化合物。５５．式Ｘ：［式中、Ｈｅｔは少なくとも１つのＮまたはＳ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、ここに、ＷはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ原子から選択されるハロゲン原子である］の化合物。５６．式：［式中、Ｒ₁は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環を含有する炭素環または複素環系を形成可能であり、Ｒ₆はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有し、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される］の化合物よりなる群から選択される請求項５５に記載の化合物。５７．式：［式中、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立してＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であって、これは化学発光を生じさせ、Ａｒはアリール環基である］を有する請求項５６に記載の化合物。５８．ＷがＣｌ原子である請求項５５ないし５７のいずれか１項に記載の化合物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ，ＫＲ，ＵＳ (72)発明者デシルヴァ，レヌカアメリカ合衆国ミシガン 48167 ノースヴィルデルタドライヴ 40628

Claims

【特許請求の範囲】１．式Ｉ：［式中、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子よりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］の化合物。２．Ｒ₆がＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有する請求項１記載の化合物。３．Ｒ₆がアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される請求項２記載の化合物。４．式ＩＩの化合物および式ＩＩＩの化合物：［式中、Ｒ₁はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環を含有する炭素環または複素環系を形成し得る］よりなる群から選択される請求項１記載の化合物。５．Ｒ₁がＣ₁ないしＣ₄アルキル基およびベンジル基よりなる群から選択される請求項４記載の化合物。６．式：［式中、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々が独立してＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有し、化学発光を生じさせる置換基であって、Ａｒはアリール環基である］を有する請求項４記載の化合物。７．Ｒ₇ないしＲ₁₄のうちの少なくとも１つがアルコキシ基であって、Ｒ₇ないしＲ₁₄の残りが水素である請求項６記載の化合物。８．式：［式中、Ｐｈはフェニル基であり、各Ｍはアルカリ金属イオンであって、ｎは２である］を有する請求項６記載の化合物。９．ＭがＮａであってｎが２である請求項８記載の化合物。１０．式：［式中、Ｐｈはフェニル基であり、各Ｍはアルカリ金属イオンであって、ｎは２である］を有する請求項６記載の化合物。１１．ＭがＮａであって、ｎが２である請求項１０記載の化合物。１２．式：を有する化合物。１３．式：を有する化合物。１４．式：を有する化合物。１５．式：を有する化合物。１６．式：を有する化合物。１７．式：を有する化合物。１８．式：を有する化合物。１９．ａ）ホスファターゼ酵素と反応する式Ｉ：［式中、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子よりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］の化合物、およびｂ）化学発光を増強するのに有効な量の少なくとも１種の界面活性剤増強剤；を水性溶液中に含んでいるホスファターゼ酵素の存在下で化学発光を生じさせる試薬組成物。２０．式Ｉの化合物が、式ＩＩの化合物および式ＩＩＩの化合物：［式中、Ｒ₁はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環を含有する炭素環または複素環系を形成し得る］よりなる群から選択される請求項１９記載の組成物。２１．式Ｉの該化合物が式：［式中、Ｒ₁はアルキル、ヘテロアルキルおよびアラルキル基よりなる群から選択され、ここに、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立して化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、Ａｒはアリール環基である］を有する請求項２０記載の組成物。２２．Ｒ₇ないしＲ₁₄のうちの少なくとも１つがアルコキシ基であって、Ｒ₇ないしＲ₁₄のうちの残りが水素である請求項２１記載の組成物。２３．式Ｉの詰化合物が式：［式中、Ｐｈはフェニル基である］を有する請求項２１記載の組成物。２４．式Ｉの該化合物が式：［式中、Ｐｈはフェニル基である］を有する請求項２１記載の組成物。２５．式Ｉの該化合物が式：を有する請求項２１記載の組成物。２６．該界面活性剤増強剤がポリマー第四級アンモニウムおよびホスホニウム塩、モノマー第四級アンモニウムおよびホスホニウム塩ならびにジカチオン性第四級アンモニウムおよびホスホニウム塩から選択される請求項１９記載の組成物。２７．該界面活性剤増強剤がビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩およびビニルベンジルトリオクチルホスホニウム塩のコポリマーである請求項１９記載の組成物。２８．該コポリマーが約３：１の比率のビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩およびビニルベンジルトリオクチルホスホニウム塩基を含有する請求項１９記載の組成物。２９．さらに反応を促進させるのに有効な量のマグネシウム塩を含有する請求項１９記載の組成物。３０．ホスファターゼ酵素を式Ｉ：［式中、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子よりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］の少なくとも１種の化合物と反応させることを含有する化学発光を生じさせる方法。３１．式Ｉの化合物が、式ＩＩの化合物および式ＩＩＩの化合物：［式中、Ｒ₁はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であり、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環を含有する炭素環または複素環系を形成し得る］よりなる群から選択される請求項３０記載の方法。３２．式Ｉの該化合物が式：［式中、Ｒ₁はアルキル、ヘテロアルキルおよびアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立して化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有し得る置換基であり、Ａｒはアリール環基である］を有する請求項３０記載の方法。３３．Ｒ₇ないしＲ₁₄のうち少なくとも１つがアルコキシ基であって、Ｒ₇ないしＲ₁₄の残りが水素である請求項３２記載の方法。３４．式Ｉの化合物が式：［式中、Ｐｈはフェニル基である］を有する請求項３２記載の方法。３５．式Ｉの化合物が式：［式中、Ｐｈはフェニル基である］を有する請求項３２記載の方法。３６．式Ｉの化合物が式：を有する請求項３２記載の方法。３７．該ホスファターゼ酵素が細菌アルカリ性ホスファターゼ、哺乳動物アルカリ性ホスファターゼ、植物酸性ホスファターゼ、哺乳動物酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートよりなる群から選択される請求項３０記載の方法。３８．該アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートがハプテン、抗体、蛋白質、核酸およびオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される生物学的分子に連結したアルカリ性ホスファターゼを含有する請求項３７記載の方法。３９．該ホスファターゼ酵素が細菌アルカリ性ホスファターゼ、哺乳動物アルカリ性ホスファターゼ、植物酸性ホスファターゼ、哺乳動物酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートよりなる群から選択される請求項３２記載の方法。４０．該アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートがハプテン、抗体、蛋白質、核酸およびオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される生物学的分子に連結したアルカリ性ホスファターゼよりなる請求項３９記載の方法。４１．該ホスファターゼ酵素が細菌アルカリ性ホスファターゼ、哺乳動物アルカリ性ホスファターゼ、植物酸性ホスファターゼ、哺乳動物酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートよりなる群から選択される請求項３４、３５または３６いずれか１項記載の方法。４２．該アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートがハプテン、抗体、蛋白質、核酸およびオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される生物学的分子に連結したアルカリ性ホスファターゼよりなる請求項４１記載の方法。４３．ａ）ホスファターゼ酵素を式Ｉ：［式Ｉの化合物中、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子よりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子よりなる少なくとも１つの五員または六員環よりなる複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］の少なくとも１種の化合物と反応させて分析物を検出するための化学発光を生じさせ；ｂ）該化学発光を検出し；次いで、ｃ）該化学発光の量を分析物の量と関連付けることを含有する；化学発光アッセイ法によって試料中の分析物を検出する方法。４４．式Ｉの化合物が、式ＩＩの化合物および式ＩＩＩの化合物：［式中、Ｒ₁はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であり、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環よりなる炭素環または複素環系を形成し得る］よりなる群から選択される請求項４３記載の方法。４５．式Ｉの該化合物が式：［式中、Ｒ₁はアルキル、ヘテロアルキルおよびアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立して化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、Ａｒはアリール環基である］を有する請求項４３記載の方法。４６．Ｒ₇ないしＲ₁₄のうち少なくとも１つがアルコキシ基であって、Ｒ₇ないしＲ₁₄の残りが水素である請求項４５記載の方法。４７．式Ｉの化合物が式：［式中、Ｐｈはフェニル基である］を有する請求項４３記載の方法。４８．式Ｉの化合物が式：［式中、Ｐｈはフェニル基である］を有する請求項４３記載の方法。４９．式Ｉの化合物が式：を有する請求項４３記載の方法。５０．検出すべき分析物がホスファターゼ酵素である請求項４３記載の方法。５１．検出すべき分析物がホスファターゼ酵素の阻害剤である請求項４３記載の方法。５２．さらに、試料中の分析物を、該分析物に特異的に結合する分析物結合性化合物と反応させることを含有し、分析物−結合性化合物をアルカリ性ホスファターゼで標識される請求項４３記載の方法。５３．該分析物−結合性化合物が抗体、抗原、ハプテンおよび核酸よりなる群から選択される請求項５２記載の方法。５４．さらに、試料中の分析物を、該分析物に特異的に結合する分析物結合性化合物および該分析物結合性化合物用の少なくとも１種のホスファターゼ−標識特異的結合性物質と反応させることを含有する請求項４５記載の方法。５５．さらに、試料中の分析物を、該分析物に特異的に結合する分析物結合性化合物および該分析物結合性化合物用の少なくとも１種のホスファターゼ−標識特異的結合性物質と反応させることを含有する請求項４７、４８または４９いずれか１項記載の方法。５６．さらに、試料中の分析物を、（ａ）該分析物と特異的に結合する分析物結合性化合物および少なくとも１種の第２の特異的結合性物質を含有する標識した分析物結合性化合物；および（ｂ）該第２の特異的結合性物質用のホスファターゼ−標識結合性パートナーと反応させることを含有する請求項４３記載の方法。５７．検出を膜上で行う請求項４３記載の方法。５８．骸膜がニトロセルロース膜、二フッ化ポリビニリデン膜およびナイロン膜よりなる群から選択される請求項５７記載の方法。５９．さらに、水性溶液中の、式Ｉの化合物および化学発光を増強するのに有効な量の界面活性剤増強剤を含有する試薬組成物中に式Ｉの化合物を供することを含有する請求項４３記載の方法。６０．さらに、水性溶液中の式Ｉの化合物および化学発光を増強させるのに有効な量の界面活性剤増強剤を含有する試薬組成物中に式Ｉの化合物を供することを含有する請求項４５記載の方法。６１．さらに、水性溶液中の式Ｉの化合物および化学発光を増強させるのに有効な量の界面活性剤増強剤を含有する試薬組成物中に式Ｉの化合物を供することを含有する請求項４７、４８または４９いずれか１項記載の方法。６２．該界面活性剤増強剤がビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩およびビニルベンジルトリオクチルホスホニウム塩のコポリマーである請求項５９記載の方法。６３．さらに、（ａ）第１のｐＨで緩衝液中で式Ｉの化合物をホスファターゼ酵素と第１の時間反応させ；（ｂ）強塩基性トリガー溶液を該緩衝液に添加して、該緩衝液のｐＨを化学発光を誘導するための第２のｐＨまで上昇させ；次いで、（ｃ）化学発光を測定する；ことを含有する請求項４３記載の方法。６４．該第１のｐＨが５．０−９．５であり、トリガー溶液のｐＨが約１１より大きく、かつ該第１の時間が約１秒ないし約１０分である請求項６３記載の方法。６５．該塩基性トリガー溶液が界面活性剤増強剤を含有する請求項６３記載の方法。６６．該増強剤がビニルベンジルトリブチルホスホニウム塩およびビニルベンジルトリオクチルホスホニウム塩のコポリマーである請求項６５記載の方法。６７．水性溶液中の、ａ）ホスファターゼ酵素と反応する式Ｉ：［式中、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子よりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］の化合物；およびｂ）カチオン性芳香族化合物の不存在下で生じるそれと比較して化学発光を増大させるのに有効な量の該カチオン性芳香族化合物；を含有するホスファターゼ酵素の存在下で化学発光を生じさせるための試薬組成物。６８．Ｒ₆がＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有する請求項６７記載の組成物。６９．Ｒ₆がアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される請求項６８記載の組成物。７０．式Ｉの化合物が式：［式中、Ｒ₁は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環よりなる炭素環または複素環系を形成し得る］よりなる群から選択される請求項６７記載の組成物。７１．式Ｉの該化合物が式：［式中、Ｒ₁は置換および非置換のＣ₁ないしＣ₄アルキル基ならびに置換および非置換のアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立して化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基である］を有する請求項６７記載の組成物。７２．式Ｉの化合物が式：を有する請求項７１記載の組成物。７３．式Ｉの化合物が式：を有する請求項７２記載の組成物。７４．該カチオン性芳香族化合物がシアニン色素、カルボシアニン色素、アゾ色素、アクリジニウム誘導体、メチレンブルー、ナイルブルー、ＩＲ−１０４０、ルシゲニンおよびパラコートジクロリドよりなる群から選択される請求項６７、６８、６９、７０、７１、７２または７３いずれか１項記載の組成物。７５．さらに、最大化学発光強度が到達する速度を増大させるのに有効な量のアニオン性界面活性剤および化学発光の量を増加させるのに有効な量の非イオン性界面活性剤を含有する請求項６７記載の組成物。７６．該アニオン性界面活性剤が少なくとも１０個の炭素原子を含有する硫酸アルキルおよび少なくとも１０個の炭素原子を含有するスルホン酸アルキルから選択される請求項７５記載の組成物。７７．該非イオン性界面活性剤がポリオキジエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテルおよびポリオキシエチレン化ソルビトールエステルから選択される請求項７５記載の組成物。７８．さらに、ホスファターゼ酵素の不存在下で組成物によって生じる化学発光を減少させるのに有効な量の亜硫酸塩を含有する請求項７５記載の組成物。７９．該アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである請求項７６記載の組成物。８０．該亜硫酸塩が亜硫酸ナトリウムである請求項７８記載の組成物。８１．ホスファターゼ酵素を、ａ）式Ｉ：［式中、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子よりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］の少なくとも１種化合物；およびｂ）カチオン性芳香族化合物の不存在下で生じるそれと比較して化学発光を増大させるのに有効な量の該カチオン性芳香族化合物；と反応させることを含有する化学発光を生じさせる方法。８２．Ｒ₆がＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有する請求項８１記載の方法。８３．Ｒ₆がアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される請求項８２記載の方法。８４．式Ｉの化合物が式：［式中、Ｒ₁は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキルおよび置換アラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環を含有する炭素環または複素環系を形成し得る］よりなる群から選択される請求項８１記載の方法。８５．式Ｉの該化合物が式：［式中、Ｒ₁は置換および非置換のＣ₁ないしＣ₄アルキル基ならびに置換および非置換のアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立して化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有し得る置換基である］を有する請求項８４記載の方法。８６．式Ｉの化合物が式：を有する請求項８５記載の方法。８７．式Ｉの化合物が式：を有する請求項８６記載の方法。８８．該ホスファターゼ酵素が細菌アルカリ性ホスファターゼ、哺乳動物アルカリ性ホスファターゼ、植物酸性ホスファターゼ、哺乳動物酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートよりなる群から選択される請求項８１、８２、８３、８４、８５、８６または８７いずれか１項に記載の方法。８９．該アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートがハプテン、抗体、蛋白質、核酸およびオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される生物学的分子と連結させたアルカリ性ホスファターゼを含有する請求項８８記載の方法。９０．さらに、式Ｉの化合物およびカチオン性芳香族化合物を、さらに、水性溶液中の、最大化学発光強度に到達する速度を増大させるのに有効な量のアニオン性界面活性剤および化学発光を増大させるのに有効な量の非イオン性界面活性剤を含有する試薬組成物中に供することを含有する請求項８１、８２、８３、８４、８５、８６または８７いずれか１項記載の方法。９１．（ａ）分析物を検出するための化学発光を生じさせるカチオン性芳香族化合物の存在下で、ホスファターゼ酵素を、式Ｉ：［式Ｉの化合物において、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子よりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］の少なくとも１種の化合物と反応させ；（ｂ）化学発光を検出し；次いで、（ｃ）化学発光の量を分析物の量に関連付ける；ことを含有する化学発光アッセイ法により試料中の分析物を検出する方法。９２．Ｒ₆がＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有する請求項９１記載の方法。９３．Ｒ₆がアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される請求項９２記載の方法。９４．式Ｉの化合物が式：［式中、Ｒ₁は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキルおよび置換アラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環を含有する炭素環または複素環系を形成し得る］よりなる群から選択される請求項９１記載の方法。９５．式Ｉの該化合物が式：［式中、Ｒ₁は置換および非置換のＣ₁ないしＣ₄アルキル基ならびに置換および非置換のアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立して化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基である］を有する請求項９１記載の方法。９６．式Ｉの化合物が式：を有する請求項９５記載の方法。９７．式Ｉの化合物が式：を有する請求項９６記載の方法。９８．検出すべき分析物がホスファターゼ酵素である請求項９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７いずれか１項記載の方法。９９．検出すべき分析物がホスファターゼ酵素の阻害剤である請求項９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７いずれか１項記載の方法。１００．さらに、試料中の分析物を、該分析物と特異的に結合する標識された分析物結合性化合物と反応させることを含有し、分析物−結合性化合物をアルカリ性ホスファターゼで標識する請求項９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７いずれか１項記載の方法。１０１．該分析物−結合性化合物が抗体、抗原、ハプテンおよび核酸よりなる群から選択される請求項１００記載の方法。１０２．さらに、試料中の分析物を、該分析物と特異的に結合する分析物結合性化合物および該分析物結合性化合物用の少なくとも１種のホスファターゼ−標識特異的結合性物質と反応させることを含有する請求項９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７いずれか１項記載の方法。１０３．さらに、試料中の分析物を、（ａ）該分析物と特異的に結合する分析物結合性化合物および少なくとも１種の第２の特異的結合性物質を含有する標識された分析物結合性化合物：および（ｂ）第２の特異的結合性物質用のホスファターゼ−標識結合性パートナー；と反応させることを含有する請求項９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７いずれか１項記載の方法。１０４．検出を膜の上で行う請求項９１記載の方法。１０５．該膜がニトロセルロース膜、二フッ化ビニリデン膜およびナイロン膜よりなる群から選択される請求項１０４記載の方法。１０６．さらに、式Ｉの化合物およびカチオン性芳香族化合物を、水性溶液中の、最大化学発光強度に到達する速度を増大させるのに有効な量のアニオン性界面活性剤および化学発光を増大させるのに有効な量の非イオン性界面活性剤を含有する試薬組成物中にて供する請求項９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７いずれか１項記載の方法。１０７．（ａ）試料を、式Ｉ：［式Ｉの化合物において、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子よりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］の少なくとも１種の化合物、最大化学発光強度に到達する速度を増大させるのに有効な量のアニオン性界面活性剤、および化学発光を増大させるのに有効な量の非イオン性界面活性剤を含有する試薬組成物と反応させ；（ｂ）初期の間の化学発光の量または強度を検出し；（ｃ）化学発光が一定レベルに到達するまで第２の時間待ち；（ｄ）第３の時間、化学発光の量または強度を検出し；（ｅ）初期の時間における化学発光を酸性ホスファターゼの量に関連付け；（ｆ）第３の時間における化学発光をアルカリ性ホスファターゼの量に関連付ける；ことを含有する化学発光アッセイ法による酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼを共に含有すると考えられる試料中の酸性ホスファターゼおよびアルカリ性ホスファターゼを検出する方法。１０８．式Ｉの化合物が式：［式中、Ｒ₁は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキルおよび置換アラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環を含有する炭素環または複素環系を形成し得る］よりなる群から選択される請求項１０７記載の方法。１０９．式Ｉの該化合物が式：［式中、Ｒ₁は置換および非置換のＣ₁ないしＣ₄アルキル基ならびに置換および非置換のアラルキル基よりなる群から選択され、ここに、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立して化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基である］を有する請求項１０７記載の方法。１１０．式Ｉの化合物が式：を有する請求項１０９記載の方法。１１１．式Ｉの化合物が式：を有する請求項１０７記載の方法。１１２．（ａ）式：［式中、Ｈｅｔ、ＺおよびＲ₆は化合物Ｉについての定義に同じ］を有する複素環エステルまたはチオエステル化合物ＶＩＩＩを塩基と反応させてＶＩＩＩのエノラートを形成させ；（ｂ）該エノラートをリン酸化剤と反応させて、式：［式中、Ｈｅｔ、ＺおよびＲ₆は前記定義に同じであって、Ｙは保護基である］を有する保護されたエノールホスフェートＩＸを形成させ；次いで、（ｃ）もしカチオン性種が脱保護剤の一部でなければ、カチオン種Ｍの存在下でＩＸを少なくとも１種の脱保護剤と反応させることによりエノールホスフェートを脱保護してエノールホスフェート塩化合物を形成させる；工程を含有する式Ｉ：［式中、ＨｅｔはＮ、ＯおよびＳ原子よりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、各Ｍは独立してＨおよびカチオン中心から選択され、ｎは電気的中性を満足する数である］の化合物の製法。１１３．化合物ＶＩＩＩのエノラートをリン酸化剤と反応させて保護されたエノールホスフェートＩＸを形成させる工程が、（ａ）化合物ＶＩＩＩのエノラートをオキシハロゲン化リン化合物ＰＯＷ₃（式中、ＷはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択されるハロゲン原子）と反応させて式：［式中、Ｈｅｔ、ＺおよびＲ₆は化合物ＶＩＩＩで定義したものと同じ］を有するエノールジハロホスフェートＸを形成させ；（ｂ）化合物Ｘを少なくとも２当量のヒドロキシル化合物Ｙ−ＯＨと反応させて保護されたエノールホスフェートＩＸを形成することを含有する請求項１１２記載の製法。１１４．化合物ＶＩＩＩの該エノラートをリン酸化剤と反応させて保護されたエノールホスフェートＩＸを形成させる工程が、化合物ＶＩＩＩのエノラートを、保護基Ｙを含有し、式Ｗ−ＰＯ（ＯＹ）₂[式中、ＷはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択されるハロゲン原子である]を有するリン酸化剤と反応させることを含有する請求項１１２記載の製法。１１５．該基Ｙが低級アルキル基、置換された低級アルキル基、フェニル、置換されたフェニルおよびベンジル基よりなる群から選択される請求項１１２記載の製法。１１６．該基Ｙが連結して単一の基−ＣＨ₂ＣＨ₂−を形成する請求項１１２記載の製法。１１７．該脱保護剤が水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシド、水酸化アンモニウムのごとき有機および無機塩基、シアニドイオン、フルオリドイオンのごとき求核剤よりなる群から選択される請求項１１２記載の製法。１１８．ＹがＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ基であって、脱保護剤が水酸化ナトリウムおよび炭酸ナトリウムから選択される請求項１１２記載の製法。１１９．ＹがＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ基であって、脱保護剤が水酸化ナトリウムおよび炭酸ナトリウムから選択される請求項１１３記載の製法。１２０．式Ｉの化合物が式ＩＩの化合物および式ＩＩＩの化合物：［式中、Ｒ₁は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキルおよび置換アラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環を含有する炭素環または複素環系を形成可能であり、Ｒ₆はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有し、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される］よりなる群から選択される請求項１１２記載の製法。１２１．式Ｉの該化合物が式：［式中、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立してＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、これは化学発光を生じさせ、Ａｒはアリール環基である］を有する請求項１２０記載の製法。１２２．式IX：［式中、Ｈｅｔは少なくとも１つのＮまたはＳ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ここに、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、Ｙは除去できてホスフェート塩化合物を形成する保護基である］の化合物。１２３．式：［式中、Ｒ₁は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択され、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環よりなる炭素環または複素環系を形成可能であり、Ｒ₆はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有し、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される］の化合物よりなる群から選択される請求項１２２記載の化合物。１２４．式：［式中、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立してＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の置換基であり、これは化学発光を生じさせ、Ａｒはアリール環基である］を有する請求項１２３記載の化合物。１２５．ＹがＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ基である請求項１２２、１２３または１２４いずれか１項記載の化合物。１２６．式Ｘ：［式中、Ｈｅｔは少なくとも１つのＮまたはＳ原子を含有する少なくとも１つの五員または六員環を含有する複素環系であり、ＺはＯおよびＳ原子よりなる群から選択され、Ｒ₆は化学発光を生じさせる有機基であり、ここに、ＷはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ原子から選択されるハロゲン原子である］の化合物。１２７．式：［式中、Ｒ₁は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する有機基であって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択され、ここに、Ｒ₂ないしＲ₅の各々は化学発光を生じさせるＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であり、隣接する基の対は一緒に連結されて、少なくとも１つの五員または六員環を含有する炭素環または複素環系を形成可能であり、Ｒ₆はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子よりなる群から選択される１ないし５０個の原子を含有し、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールおよびアラルキル基よりなる群から選択される］の化合物よりなる群から選択される請求項１２６記載の化合物。１２８．式：［式中、Ｒ₇ないしＲ₁₄の各々は独立してＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン原子から選択される１ないし５０個の原子を含有する置換基であって、これは化学発光を生じさせ、Ａｒはアリール環基である］を有する請求項１２７記載の化合物。１２９．ＷがＣｌ原子である請求項１２６、１２７または１２８いずれか１項記載の化合物。