JPH10510984A

JPH10510984A - 無細胞性抗ボルデテラワクチン

Info

Publication number: JPH10510984A
Application number: JP8518382A
Authority: JP
Inventors: パスカルゲーラール、; ニコルギーソ、
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1994-12-15
Filing date: 1995-12-15
Publication date: 1998-10-27
Also published as: US5985286A; EP1386616A1; FR2728170A1; US20060073169A1; US6582705B1; US7465443B2; AU715243B2; AU4393596A; ATE244017T1; CA2165393A1; WO1996018414A1; US7105317B2; ES2202345T3; DE69531186T2; DK0719560T3; US20030215461A1; US6387377B1; DE69531186D1; EP0719560B1; FR2728170B1

Abstract

(57)【要約】百日咳菌、パラ百日咳菌および気管支肺血症菌から選ばれるボルデテラ菌株由来のアデニールシクラーゼ溶血素（ＡＣ―Ｈｌｙ）蛋白、またはその免疫原性蛋白、および、更に、百日咳菌、パラ百日咳菌および気管支肺血症菌から選ばれるボルデテラ菌株のｖｒｇ遺伝子の発現生成物を含有するバクテリア抽出物、または該抽出物が投与され得るホスト中で、免疫反応を誘発するために十分なそのような発現生成物の一部を含有するバクテリア抽出物を含むことを特徴とする免疫原性組成物。

Description

【発明の詳細な説明】無細胞性抗ボルデテラワクチンボルデテラ(Bordetella)属には、百日咳菌（Bordetella pertussis）、パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）、気管支肺血症菌（Bordetella bronchise ptica ）およびボルデテラ・アビウム（Bordetella avium）の４種が含まれる。ボルデテラは、呼吸器感染に関わるグラム陰性ココバシリ（coccobacilli）菌である。百日咳菌およびパラ百日咳菌は、百日咳の作用因子で、厳密にヒトの病原菌である。気管支肺血症菌は、種々の哺乳類（人間に対してはやや稀）に対して病原性であり、また、百日咳菌およびパラ百日咳菌とは異なり、ホストの外でも生存可能である。ボルデテラ・アビウムは、鳥に対してのみ病原性である。ワクチン接種の普及が８０％を超える国々においては、百日咳ワクチン接種を導入して以来、罹患率および死亡率において劇的な低下が観られた。この低下は、真にワクチン接種のおかげである。というのは、幾つかの国々（イギリス、スエーデン、日本等）では、ワクチン接種を中断た後の何年か、致死性百日咳の流行が起こったからである。本発明は、百日咳ワクチンの製造に関与し得る免疫学的組成物を提供する。これらの組成物は、少なくとも部分的に「無細胞性(acellular)」型であり、少なくとも、既知ワクチンと同一の効能を示すものである。本発明は一方では、家畜用薬剤に使用するワクチンに関し、また他方では、ヒト薬剤に使用できるワクチンに関する。現在使用されている百日咳ワクチンは、熱失活させた百日咳菌のバクテリア懸濁液（凝集源の発現に違いがある二つの菌株の混合物）からなる細胞性ワクチンである。このワクチンは通常、精製されたジフテリア分画および破傷風菌分画を組み合せた形、ヘモフィールスおよび失活させたポリオウイルス成分とを組み合わせた形で使用される。ワクチン接種は、月齢二ヶ月から１ヶ月間隔で、三回の注入および１８ヶ月目に注入一回という構成で行う。その後追加免疫注入は、一切行なわれない。このワクチンは、時折、局所的にも全身的にも低い寛容性を示す。特に、急性脳炎型の重篤な神経病との合併症を惹起する欠点を持つ。しかしながら、極く最近の研究では、細胞性ワクチンと重篤な神経病との合併症との間の関係には、統計学的証拠は何もないと結論されたようである（Griffiths AH．Vaccine 1989;7 :199-210）。それにもかかわらず、細胞性ワクチンが寛容性に乏しく、可逆的ではあるが望ましくない作用を示すことに関与しているのは、依然として事実である。こうした理由から、このような作用のない新規ワクチンが所望されている。新規ワクチンを規定(define)するもくろみにおいては、バクテリアのビルレンス(virulence )、適切な場合には、ビルレンスの調節に関わるいくつかの因子の特徴を解明することが必要と思われる。これら種々の因子全ては各々精製すれば、伝統的ワクチンとは反対の「無細胞性」と呼ばれる百日咳ワクチンを作ることは、理論的には可能である。この新型ワクチンは、寛容性が改良されると共に、伝統的ワクチンと少なくとも同等の効能を提供することが要求される。百日咳菌のビルレンスに関与する因子は、次のように確認されている。百日咳は、広い意味では、ホスト体への侵入または藩種を伴わずに、目標細胞（呼吸器の繊毛細胞）に対してバクテリアが付着することを包含する感染性症候群並びに繊毛性呼吸上皮に対して選択的である局所的細胞毒性作用（繊毛細胞の破壊および除去、粘膜の蓄積、炎症反応）および全身的作用(そのうち最も顕著なものとして、リンパ球増加による白血球増加があげられる)を包含する二次毒素(toxin) 誘発性症候群が関連しているものと規定され得る。分子生物学における最近のテクニックの成果として、百日咳菌のビルレンスに関与する多くの因子の特徴が明らかになり、その発現の調節作用がわかってきた。これらの因子は、前記感染性症候群（付着因子(adhesion)）に関与するものおよび前記毒素誘発性症候群（毒素因子(toxin)）に関与するもの、の二つのカテゴリーに分類され得る。付着因子には、次のものがある。繊維状赤血球凝集素すなわちＦＨＡは、繊毛性上皮に対してのバクテリアの付着に主要な働きを果たすと考えられている(Locht C.，Bertin P．Menozzi F.D.a nd Renaud G．Mol．Microbiol．1993，9:653-66)。ＦＨＡは、ビルレントな菌株によって、常に発現され分泌される。その構造遺伝子は、クローン化され、シークエンス化されている（Relman D．et al.．1989，Proc Natl．Acad．Sci.USA， 86:2637-2641）。その構造遺伝子は、３６０ｋＤａの蛋白をコードしているが、２２０ｋＤａ断片だけを精製することができる。この蛋白は、繊毛細胞の糖蛋白に結合し、リンパ球およびマクロファージのインテグリンに対する結合部位を有する。ＦＨＡは、ホスト内皮細胞のある蛋白と相同性を示すことが最近解明されたところである（Tuomanen E.，Prasad S.M.，George J.S.，HoePelman A.I.M. ，Ibsen P.，Heron I.，and Starzyk R.M．1993．Proc Natl．Sci．USA．90:782 4-7828）。百日咳菌の二つの赤血球凝集素すなわちＡＧＧによって、菌株は、血細型に分類することができる。二つのＡＧＧは、特徴が解明されている。これらの蛋白は分泌されて上皮細胞とバクテリアの付着に作用する(Mooi F．Van der Heide H.G .D.，Ter Avest A．R.，Welinder K．G.，Livey I.，Van der Zeijst B.A.M.，a nd Gaastra，W．1987．Microb．Pathog．2:473-484)。パートアクチン(pertactin)すなわちＰＲＮは、９３ｋＤａ蛋白であるが、６９ｋＤａ断片のみ精製することができる。この蛋白は、マクロファージおよびリンパ球のインテグリンに対して、二つの結合部位を有する（Charles I．Dougan G.，Pickard D.，Chattfield S．Smith M．Novotny P.，Morissey P．and Fairw eather N.F．1989，Proc Natl Acad Sci．86: 3554-3558）。百日咳毒素因子すなわちＰＴＸは、分泌型Ａ−Ｂ毒素因子であり、細胞変性作用に関与する他に、そのＢサブユニットを経由した付着に関与する。該Ｂオリゴマーは、繊毛細胞の受容体に結合することができるが、その受容体は、ＦＨＡに対する受容体と必ずしも同じ受容体である必要はない。ＰＴＸが白血球に対して結合すると、炎症反応の部位への白血球の移動が妨げられるようである。この結合が、白血球に対する作用性インテグリン分子の数を増加させるようであり、これによってＦＨＡを介したバクテリアの結合が促進される（Rozindski E.，Burn ette W.N.，Jones T.，Mar V.，and Tuomanen E.1993 J．Exp．Med．178: 917-924）。毒素因子には次のものがある。百日咳毒素因子すなわちＰＴＸは、分泌され、百日咳菌の主要な毒素因子であると考えらている。そのＡサブユニットは、ＡＤＰリボシル・トランスフェラーゼ活性を有する。毒素因子のＢ蛋白が目標細胞に結合すると、このＡサブユニットは、目標細胞内に入ることができ、調節Ｇ蛋白を失活化させ、それによってすべての細胞機能の妨害を引き起こすことができる。リンパ球増加症、インスリン増加症、対ヒスタミン過敏症等の疾患の間に観察される身体全体に及ぶ生物学的作用に関与するようであるのは、この因子である。まだ十分に特徴が解明されていない皮膚壊死性毒素因子すなわちＤＮＴ、およびバクテリアのペプチドグルカン起源のムラミルペプチド族の分泌性小糖蛋白である気管毒素因子すなわちＴＣＴは、協力して作用し、ホストの呼吸器の繊毛細胞を破壊するようである。ＴＣＴは、これに加え、呼吸上皮の再生を妨げる（Lu ker K．Collier J.K.，Kolodziej E.W.，Marshall G．R.，and Goldman W.E．19 93．Proc.Natl．Acd．Sci USA．90: 2365-2369）。アデニール・シクラーゼ溶血素すなわちＡｃ−Ｈｌｙは、アデニール・シクラーゼ活性および溶血活性を持つ二機能性蛋白である。Ａｃ−Ｈｌｙは、バクテリアによって分泌される。その構造遺伝子は、クローン化され、シークエンス化されている（Glaser P．et al.，1988，Molec．Microb．2，19-20）。前記蛋白は、「毒素因子の繰り返し」を略してＲＴＸと呼ばれる毒素因子族に属すことがわかっており、大腸菌の溶血素およびアクチノバチルス・プレウロニューモニア（ Actinobatillus pleuropneumoniae）の溶血素との相同性、および、パステレウラ・ヘモリテイカ(pasteurella haemolytica)の白血球毒素因子およびアクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomi tans）の白血球毒素因子と相同性を示す。前記蛋白は、ＰＴＸのように、マクロファージ等の真核細胞中に入ることができ、カルモデユリンによって活性化されることができ、また、多量のｃＡＭＰを合成でき、細胞機能を妨害することができる(Coote J．1992．FEMS Microbiol．Rev．88: 137-162)。同様に、パラ百日咳菌、気管支肺血症菌のビルレンスに関連する因子が、同定されている。百日咳菌、パラ百日咳菌および気管支肺血症菌の感染は、臨床学的観点からは区別できない。これらのバクテリアは、ＤＮＡに関しては７５％を超える相同性を持つ。これらの菌は、表現型および生物化学的特徴のみを基盤に、種の分類がなされてきた。パラ百日咳および気管支肺血症菌は、ＰＴＸを除いて、機能的に免疫学的に百日咳菌に非常に近い。不活化された百日咳菌のバクテリア懸濁液からなるワクチンは、マウスモデルにおいて百日咳菌感染に対して予防を行なうばかりでなく、パラ百日咳および気管支肺血症菌の感染に対しても予防を行なう。百日咳ワクチンの接種を２５年間行なってきた本国フランスにおいては、パラ百日咳の疫学的データはないけれども、パラ百日咳菌の菌株が殆ど単離されていない一方で、パラ百日咳菌は、ワクチン接種が行われていない国、ワクチン接種が不十分な国では単離されていることに注目すべきである。これらの種々の付着因子および毒素因子が存在することの他に、ボルデテラは、そのビルレンスに関わる因子の発現を調節する特徴がある。言い換えるとボレデテラは、フェーズ変異およびフェーズ変調を行なう。ボルデテラは、そのおかれる環境に依って、「無発病性」つまり、呼吸器感染のマウスモデルにおいて、致死、炎症性反応および肺病巣を誘発することができないものになる。ボルデテラは、フェーズ変異またはフェーズ変調のどちらかを経ている。フェーズ変異は、１０^-3から１０^-6の範囲の頻度で観られ、殆ど不可逆である。フェーズ変異は、上記毒素因子および付着因子の発現休止中、およびまだ十分に特徴が解明されていない他の因子の発現中に現れる（フェーズＩ「ビルレントな」バクテリアからフェーズＩＶ「無発病性」バクテリアへの変異）。フェーズＩおよびフェーズＩＶバクテリアは、Lacey B．1960，J．Hyg．58: 57- 93によって記載されている。フェーズ変調は、表現型上は、フェーズ変異と同じであるが、これは、完全に可逆性であり、環境変化（培地の組成、温度等）が生じて、上記毒素因子および付着因子の合成が中断している最中に現れる。ボルデテラ中に観察されるフェーズ変異およびフェーズ変調は、二つの調節遺伝子ｂｖｇＡおよびｂｖｇＳの制御下におかれている（Arico B．et al．1989， Proc．Natl．Acad．Sci USA，86: 6671-6675）。ｂｖｇＳ遺伝子は、外的条件に対して感受性のある蛋白をコードする。この蛋白は、燐酸化によって、ｂｖｇＡ遺伝子によってコードされる蛋白の活性を変調する。すなわち、一方では、上記ビルレンス因子（vir活性化遺伝子を意味するｖａｇ遺伝子）をコードする遺伝子の転写の陽性アクテイベータであり（Uhl M. A．and Miller J．1994．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:1163-1167）また、他方では、ある遺伝子の転写の抑制因子である（Beattie D.T．et al.，J．of Bac teriology，Jan 93，p159-527）。その発現が抑制される遺伝子は、vir抑制遺伝子を略してｖｒｇ遺伝子と呼ばれるが、まだ特徴は十分に解明されていない。しかしながら百日咳菌ｖｒｇ６遺伝子は、ホスト中でバクテリアを存続させる役割を果たす蛋白をコードしていることがわかっている（Beatties D．et al.，1992 ，Infect．Imm．60: 571-577）。気管支肺血症菌において、ｖｒｇ遺伝子によってコードされる二つの蛋白質の特徴が解明されている。それらは、鞭毛タイプのバクテリアの蛋白である（フェーズＩ気管支肺血症菌は、鞭毛を合成しないが付着因子および毒素因子を合成する非運動性バクテリアであり、フェーズＩＶ、気管支肺血症菌は、鞭毛を合成する運動性バクテリアである）。バクテリアのビルレンスを測定するために、また、局所的かつ全身的毒性作用を評価するために、呼吸器系感染のマウスモデルが開発されている（Guiso N．e t al.，1991，Microb．Pathogen 11，423-431）。このマウスモデルを使用して、化学的または遺伝学的に不活化されたＰＴＸが良好な免疫原であることを示すことが可能となった。このアナトキシン(anatoxin)は、致死的な百日咳菌感染に対して、防御的な活性を有する。しかし、バクテリアの存続性(persistance)に対して効果的な抗体合成を誘発するようには見えない（Khelef．N．Danve B．Qu entin-Millet M．J．and Guiso N．1993 Infect Immun．64: 486-490）。ボルデテラのビルレンスおよびこのビルレンスの調節に関するこれらの結果から、百日咳が、多要素性疾病であり、ワクチンが致死的感染に対する防御のみでなく、バクテリアの持続性に対する防御もしなくてはならないことが分かる。同様の結論が、パラ百日咳または気管支肺血症菌に起因する感染にも当てはまる。付着因子または毒素因子族の単離成分から無細胞性ワクチンを開発する試みがなされてきた。つまり、精製された百日咳菌毒素因子（ＰＴＸ）、または精製された繊維状血液凝集素（ＦＨＡ）と組み合わされたこの毒素因子を含有する無細胞性組成物が製造されている。無細胞組成物（ＰＴＸまたはＰＴＸ−ＦＨＡ）の寛容性を人間において初めて試したところ、伝統的細胞性ワクチンと比較して、局所的合併症（痛み、腫れ）および全身的合併症（発熱、痙攣等）の両者が著しく減少することがわかった（ Edward K.，J．Infect．Dis．1993，168，15-20）。これらの新規調製物（ＰＴＸまたはＰＴＸ−ＦＨＡ）は、良好な免疫原性を持ち、高レベルの抗体を誘発する。しかしながら、ワクチン性抗体のテストは、不完全な方法である。というのは、疾病に対する防御力とセロコンバージョンとは同義的ではなく、得られた抗体の防御的性格または可能な防御性のレベルは、実証されてはいないからである。種々の細胞性および無細胞性ワクチンの臨床試験の結果が公表されている（百日咳ワクチン試験の国際シンポジウム、ローマ、30.10.95-1.11.95）。これらの結果から、すべての細胞性ワクチンが、同じであるとは限らず、あるものは大変効果的で副作用をほとんど誘発せず、あるものは効果が低く、副作用を多く誘発することがわかる。前記公表結果によって、テストされた、一価（ＰＴＸ）、二価（ＰＴＸ，ＦＨＡ）、三価（ＰＴＸ，ＦＨＡ，ＰＲＮ）または五価（ＰＴＸ，ＦＨＡ，ＰＲＮ，ＡＧＧ２，ＡＧＧ３）無細胞性ワクチンは、副作用誘発が非常にほとんどみられず、全てが免疫原性であり、全てが疾病に対して（ＷＨＯ規定によれば）有効すなわち、７０％以上の効果があることがわかる。しかしながら、使用される得るで特定の規定とは無関係に、無細胞性ＰＴＸ―ＦＨＡワクチンの効能は、有効な細胞性ワクチンの効能よりも常に低い。百日咳菌の付着因子および毒素因子の両者を含有する種々の組成物の免疫原性についての奨励する結果にもかかわらず、本発明者らは、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支肺血症菌感染に起因する疾病に対する防御を効果的に行なうためには、付着因子および毒素因子についての付加的な因子、特に、バクテリアの持続性に関与する因子について配慮しなければならないと考えた。そのような見解により、本発明者らはモデル(実験部分で詳しく述べらている) を定めた。そのモデルからワクチンを規定する前の新しい基準が規定された。このように、本願発明によると、ボルデテラ百日咳菌、パラ百日咳菌または気管支肺血症菌の少なくとも一つに対して、効果的で実質的に無毒なワクチンを規定するために、これらのバクテリアの付着因子および／または毒素因子を一つ以上使用するばかりでなく、バクテリアの毒素因子および付着因子が発現されている時に、その合成が抑圧される因子一つ以上を使用することが適切である。これらの因子には、特に、上述したようなｖｒｇ遺伝子の発現生成物がある。本願発明の主題である免疫組成物は、副作用がなく、また百日咳菌および／またはパラ百日咳菌および／または気管支肺血症菌によって合成される毒素因子に起因する局所的、全身的な影響に対して防御的であり、ホストにおいてもこれらの菌の存続性にして対して防御的である百日咳ワクチンを製造する目的でなされたものであり、百日咳菌、パラ百日咳菌または気管支肺血症菌から選ばれるボルデテラの菌株特有のアデニール・シクラーゼ溶血素（ＡＣ―Ｈｌｙ）蛋白またはこのＡＣ―Ｈｌｙの免疫原性部分を含むことを特徴とし、また、加えて、百日咳菌、パラ百日咳菌または、気管支肺血症菌から選ばれるボルデテラの菌株のｖｒｇ遺伝子生成物を含有するバクテリア抽出物、またはバクテリア抽出物が投与され得るホストにおいて免疫反応を誘発するに十分なこれら発現生成物の一部を含有することを特徴とするものである。今までに製造された無細胞性ワクチンはどれも、ＡＣ−Ｈｌｙを含んでいない。発明者らによると、この蛋白は、下記理由により、ボルデテラのビルレンスに重要な役割を果たすので、ワクチン構成物中に入れるべきである。＊ＡＣ―Ｈｌｙは、被感染のヒトおよび動物の両方で、感染初期から特異的な抗体が合成され、検出されていることから、感染後極初期に発現される(Khele f N，Sakamoto H.，and Guiso N，1992．Microbiol，Pathogen．12:227-235 and Gueira P．and Guiso N．1993 Infect．Immun．61:4072-4078)。＊ＡＣ―Ｈｌｙは、バクテリアが感染を開始するために必要である（Khelef N．Sakamoto H．and Guiso N．1992 Microbiol．Pathogen 12:227-235）。＊呼吸器感染のマウス・モデルにおいて精製型ＡＣ―Ｈｌｙを抗原として使用すると、呼吸器官への転移増殖からマウスを保護する（Guiso，Szatanik and Rocancourt．1989 Microb．Pathogen．11:423-431）。＊ＡＣ―Ｈｌｙは、細胞消滅による肺胞腔マクロファージのインビトロでの死滅に関与する(Khelef，Zyglinski and Guiso Infect．Immun．61:4064-4071) 。その他の付着因子または毒素因子は、細胞消滅プロセスに関与しない。更に、ｖｒｇ遺伝子の発現生成物を含有するバクテリア抽出物の免疫学的組成物中にＡＣ−Ｈｌｙが存在すると、感染後に得られる体液性および／または細胞性免疫反応が、被ワクチン接種者において改善され、また、バクテリア存続性に対する防御にも貢献する。上述したような「ｖｒｇバクテリア抽出物」と名付けられるバクテリア抽出物は、フェーズＩＶバクテリア、つまりｖａｇ遺伝子を発現しないバクテリアの外郭膜の構成物の全て（ＬＰＳエンド毒素因子を含む）を含有する。ＬＰＳエンド毒素因子は、除去されるか、または、無毒化されていても良い。この抽出物は、懸濁型で存在していても良い。本発明の第一の好ましい免疫原性組成物は、更に、ＦＨＡ、前記ＡＧＧまたはＰＲＮおよびＰＴＸから選ばれる、百日咳、パラ百日咳または気管支肺血症菌各々の付着因子または毒素因子を一つ以上含むことを特徴とする免疫原性組成物である。ボルデテラの付着因子は、ＡＣ−Ｈｌｙおよびｖｒｇバクテリア抽出物を含む組成物の免疫原性特質を高める。本発明の第一の態様によれば、免疫原性組成物は、百日咳菌のＰＴＸ毒素因子、百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子、ＦＨＡおよびＲＰＮ付着因子、並びに百日咳菌のｖｇ遺伝子によってコードされる蛋白類を含有するバクテリア抽出物、またはバクテリア抽出物を投与され得るホストにおいて免疫反応を誘発するために十分なこれらの蛋白の一部を含むバクテリア抽出物を含有することを特徴とする。このような組成物は、人間における百日咳菌の致死的かつ全身的作用に対して防御的であり、またバクテリアの持続性に対して防御的であるワクチンを製造するために使用され得る。本発明の好ましい態様によると、百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子は、百日咳菌の付着因子または毒素因子群のビルレンス因子の全てまたは一部を含有するバクテリア抽出物中にも含まれる。本発明を実施するにあたり使用される「ｖａｇ」または「ｖｒｇ」バクテリア抽出物は、「尿素抽出物」と言われる抽出物であることが好ましい。「尿素抽出物」は、バクテリアの表面で発現される蛋白の混合物からなり、蛋白は、５Ｍの尿素を用いてインキュベーションした後、バクテリアから分離される。例えば、気管支肺血症菌「ｖａｇ尿素抽出物」は、蛋白の中でも、ＡＣ−Ｈｌｙ、ＦＨＡ、ＰＲＮおよびＬＰＳ（リポポリサッカライド・エンド毒素因子）を含み、その「ｖｒｇ尿素抽出物」は、まだ特徴が解明されていない幾つかの蛋白、鞭毛およびＬＰＳを含有する。尿素抽出物を使用することによって、特に、抽出物中に含まれる、精製された形の蛋白から得られるであろうワクチンと比較して、より安価なワクチンを生産することが可能になる。更に、発明者らは、使用された尿素抽出物がＴタイプ細胞性免疫反応（リンパ球増殖）を誘発することができ、今までに使用されてきた細胞性ワクチンのような挙動を示すことを見出した。反対に、無細胞性のみの組成物は、Ｔ反応を誘発しない。しかしながら、Ｔ反応は、感染の場合は起こる。ｖａｇまたはｖｒｇ尿素抽出物は、フェーズＩまたはフェーズＩＶバクテリアから各々製造される。適切な場合には、フェーズＩＶバクテリアの代わりに、そのｂｖｇＳ遺伝子を、ｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白のみを発現するように変異されたバクテリアを使用してもよい。これらの抽出物の製造は、実験部分で詳細に記載されている。このように、本発明は、特に、百日咳菌のｖａｇ尿素抽出物および百日咳菌のｖｒｇ尿素抽出物の両方を含有する免疫原性組成物に関する。これらの抽出物を製造するために適した百日咳菌の菌株は、本発明の範疇に入り、ＣＮＣＭ（Collection nationale de Cultures de Microorganismes[国立微生物培養物コレクション] パリ）に、１９９４年１０月１９日に、番号Ｉ−１４８５の下に寄託されている菌株ＨＡＶである。菌株ＨＡＶはフェーズＩ菌株であるので、ｖａｇ尿素抽出物を製造するために、直接使用することができる。これに対して、ｖｒｇ尿素抽出物は、フェーズＩ菌株起源のフェーズＩＶ菌株より、例えば、バクテリアのｂｖｇＳ遺伝子を変異させることによって得られるか、または、百日咳菌のｖｒｇ遺伝子のみの発現が得られるように、該フェーズＩ菌株を硫酸マグネシウムのみを含有する培地中で培養することによって得られる。本発明は、更に、百日咳菌について上記原理に従って、パラ百日咳菌または気管支肺血症菌族のボルデテラから製造される免疫原性組成物を提供する。市場で入手可能な細胞性ワクチン接種、すなわち、不活化されたフェースＩ百日咳菌のバクテリア懸濁物からなるワクチンを接種すると、マウスモデルにおいて、百日咳およびパラ百日咳菌感染に対する予防が行なわれることが、実際上知られている。しかしながら、近年、精製された百日咳菌因子（ＰＴＸまたはＦＨＡまたはＰＲＮ）を投与しても、パラ百日咳菌に起因する疾患および感染に対する防御が行われないことが実証された。同様に、パラ百日咳菌の精製されたＡＣ ―Ｈｌｙを投与しても、マウスモデルにおいて百日咳菌感染に対する予防は行われない。これらの結果によって、二つの種の間の相同性が非常に高いにもかかわらず、防御は、種特異的であることが示唆される。よって、百日咳菌の菌株のみのＰＴＸ，ＰＲＮおよびＦＨＡからなる無細胞性ワクチンを、百日咳のワクチンとしてこれから何年間か使用すると、パラ百日咳菌感染を増加させる危険性を招くことになろう（Khelef Danve Quentin-Millet and Guiso 1993，Infect．Immun．61: 46-490 and Gueirad P.，Guiso 1993 Infect．Immun 61:4072-4078）。従って、本発明は、パラ百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子、およびパラ百日咳菌のｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白の全てまたは一部を含有するバクテリア抽出物を含有することを特徴とする免疫原性組成物をも提供する。有利には、パラ百日咳菌のＡＣ―Ｈｌｙ毒素因子が、パラ百日咳菌の付着因子または毒素因子群のビルレンス因子の全てまたは一部を含むバクテリア抽出物中に含まれるる。このような抽出物は、例えばＣＮＣＭに１９９４年１２月２日に番号Ｉ−１４９８の下に寄託されているパラ百日咳菌の菌株Ｎｏ．１から得られるようなｖａｇ尿素抽出物であることが好ましい。パラ百日咳菌の菌株番号Ｉ− １４９８は、本発明の範疇に入る。同様に、ｖｒｇバクテリア抽出物は、例えば、ＣＮＣＭに、１９９４年１２月２日に番号Ｉ−１４９８の下に寄託されたパラ百日咳菌の菌株Ｎｏ．１から、百日咳菌菌株について記載されている手法と同じ手法によって得られるようなｖｒｇ尿素抽出物であることが好ましい。もう一つの態様によると、本発明は、特に獣医学ワクチンを生産する目的をもって、気管支肺血症菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子および気管支肺血症菌のｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白の全てまたは一部を含むバクテリア抽出物を含有することを特徴とする免疫原性組成物を提供する。百日咳菌およびパラ百日咳菌に関して上述したように、気管支肺血症菌のＡＣ ―Ｈｌｙ毒素因子は、気管支肺血症菌のビルレンス因子（付着因子および／または毒素因子）の全てまたは一部を含むバクテリア抽出物中に含まれる。当の抽出物は、例えば、ＣＮＣＭに、１９８９年５月１２日番号Ｉ−８５８の下に寄託されている気管支肺血症菌の菌株９７３Ｓから得られるｖａｇ尿素抽出物であることが有利である。同様に、ｖｒｇ尿素抽出物は、好ましくは、ＣＮＣＭに、１９８９年５月１２日に番号Ｉ−８５８の下に寄託された気管支肺血症菌株９７３Ｓから、百日咳菌について上述したような手法によって得られる。本願発明のもう一つの具体的態様によると、気管支肺血症菌に対する抗体の産生を誘発することができる上述の免疫原性組成物は、気管支肺血症菌の鞭毛に特徴的なポリペプチド成分を包含する。これらの組成物は、Akerley B.J．et al.( J.of Bact．Feb 1992，p.980-990)に記載されている。抗ボルデテラ体液性免疫は、長い間唯一の重要な免疫であるとみなされていた。実際、感染後、抗ＰＴＸおよび抗ＦＨＡ抗体が患者の血清中で検出され得ることは長い間周知されてきた。更に、マウスモデルにおいては、抗ＰＴＸ抗体によって受動的に疾病を予防することが可能である。従って、循環する抗体は、ＰＴＸの中和およびバクテリアの固定阻止に役割を果たす。しかしながら、ワクチン接種されたかまたは感染した個人の血清中におけるこれらの抗原に特異的な抗体のレベルと疾病に対する防御性の間に相関性があることは、今までに実証されていない。それ以外の因子、特に、ＡＣ−Ｈｌｙ、ＰＲＮおよびＬＰＳの免疫性に関しては、極めてほとんど知られていない。しかしながら、次のことが示されている。＊抗ＡＣ−Ｈｌｙ抗体による百日咳感染に対してマウスを受動的に防御することが可能であること、＊未ワクチン接種の被感染児童（血清学の解釈を歪めてしまう母性抗体の存在を避けるために、月齢８ヶ月児より上、病歴を知るために２歳以下の児童）の血清中または臨床的隔離の下に百日咳菌または気管支肺血症菌により感染したマウスの血清中では、抗ＡＣ−Ｈｌｙ抗体を、極く初期に検出することが可能であり、このことはこの蛋白がインビボでかつ感染の初期から発現されることを示唆し、さらに、抗ＦＨＡ抗体、抗ＰＴＸ抗体および抗ＬＰＳ抗体を検出することが可能である。抗ＰＲＮ抗体は、もっと後に現れ、そう長くは存続しない（Guiso，G rimprel，Anjak and Begue 1993，Eur．J．Clin．Microbiol．Infect．Dis．12: 596-600）。細胞性ワクチンによるワクチン接種は、これらの因子に対する抗体の合成をも誘発するのに対して、今日までにテストされた無細胞性ワクチンは、それらを構成する因子のみに対する抗体を誘発する。更に、種々の研究によって、細胞性免疫は、感染に対する予防用にも必要とされることが示唆される。いくつかの研究チームによって、ボルデテラが種々の細胞型、上皮細胞、リンパ球および単核球中に入ることが可能であり、またインビトロで存続できることが実証されている。更に、下記の疫学的研究では、気管支肺血症菌が人間の中で、非常に長期にわたり存続できることが観察されている。最後に、感染後４０日を超えたバクテリアを、マウスの肺で単離することは不可能であるけれども、ＰＣＲによってＤＮＡを検出することは可能である。これらの結果をまとめると、ボルデテラが、感染中のある一時点で、ホスト細胞内存続し得ること、また、ホストの免疫防御をバクテリアが回避できるように細胞内状態を制御するために、細胞性免疫が必要となることが示唆される。Ｔ細胞が感染に関与していることが、最近実証された（Redhead，Watkins， Barnard and Mills 1993，Infect．Immun．61:3190-3198）。実際に、亜致死量で、正常のマウスから３０日から４０日でバクテリアが排除される。しかるに、Ｔ細胞欠損マウス（「ヌード」マウス）はバクテリアを排除することができず、慢性感染に至る。Ｔ細胞を回復期にあるマウスから「ヌードマウス」に移植すると、ヌードマウスは、バクテリアを排除することができるようになる。更に、回復期マウスの脾臓細胞は、高レベルのＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦを産生するが、ＩＬ−４およびＩＬ−５は、産生しない。このプロフィルは、Ｔｈ１型細胞であるＴ細胞サブ細胞集団に特徴的である。完全な(whole)ワクチンによってマウスの免疫感作を行なっても、Ｔｈ１型反応および中程度の抗体反応が誘発される。しかるに、ＰＴＸ、ＦＨＡおよびＰＲＮからなる無細胞性ワクチンによる免疫感作では、Ｔｈ２型反応および非常に高レベルの抗体が誘発される。百日咳菌抗原に特異的な高レベルの血清ＩｇＧとバクテリアの肺からの排除との間には強い相関があるが、バクテリアを完全に排除するためには、直接的細胞性反応が必要である。無細胞性ワクチンにより免疫感作されたマウスにおいては、完全なワクチンによって免疫感作されたマウスよりも、バクテリアの排除は遅いという観察から、無細胞ワクチンが、Ｔｈ１細胞の誘発を促進しないという事実に起因するものと思われる。Ｔｈ１の作用メカニズムとは無関係に、Ｔ細胞が、間接的に抗体の合成を刺激するばかりでなく、マクロファージおよび中性好性多核細胞のような食細胞の動員、刺激、活性化を介して、抗百日咳菌免疫に直接的に重要な役割をも果たすことが明らかになった。更に、ボルデテラ、特に気管支肺血症菌は、人間において存続可能であることが観察されている。ある場合には、バクテリアは数週間存続するし、また別の場合には、数ヶ月存続する。いくつかの感染期において単離物は、異なる外観を呈する。この異なる外観は、ＡＣ−Ｈｌｙの合成またはｖａｇ遺伝子によってコードされるすべての因子の合成の休止期と対応する。ボルデテラに起因する感染によって引き起こされる疾病およびこれらのバクテリアがホストにおいて存続することに対抗する有効な防御法を探索する文脈において、本発明者らは、非常に好都合なことに、本発明によるバクテリアの抽出物が、体液性免疫反応および細胞性免疫反応を引き起こすことを見出した。本発明者らは、気管支肺血症菌による感染の後では、百日咳菌感染の場合のように、体液性免疫および細胞性免疫が誘発されることを示した。更に、精製されたＡＣ−Ｈｌｙによってワクチン接種した後では、感染または再感染後に誘発される免疫誘発と同様の体液性および細胞性型免疫が誘発される。本発明の主題はまた、先の頁で規定した規定の一つに対応する免疫原性組成物を活性成分として含有するワクチン組成物であって、薬学的に許容可能なビヒクル(vehicle)、適切な場合には、アジュバントと組み合わされたワクチン組成物でもある。現在市場で入手可能な百日咳ワクチンのように、本発明によるワクチンは、例えば、ジフテリア、ポリオ、またはヘモフィールスによって引き起こされる疾病、に対する他のワクチン成分のようなワクチン活性成分、または一般的には、例えば、特定の不活化された病原性作用剤または毒素因子のようないずれもの免疫原性構成物と組み合わせることができる。本発明によるワクチン組成物は種特異的であり、よって、百日咳菌、パラ百日咳菌または気管支肺血症菌に対する防御を誘発できる。反対に、本発明のワクチン組成物は、活性成分として、上に規定したような百日咳菌に対する免疫原性構成物およびパラ百日咳菌に対する免疫原性組成物を含有する混合物でああり得る。本発明のもう一つの態様によると、ワクチン組成物は、本発明に従い製造される百日咳菌、パラ百日咳菌および気管支肺血症菌に対する免疫原性組成物を含有する。特に好ましい百日咳菌に対するワクチンは、活性成分として、百日咳菌の「ｖａｇ尿素抽出物」および百日咳菌の「ｖｒｇ尿素抽出物」を包含することを特徴とするものであり、これらの抽出物を製造するために使用される百日咳菌の菌株は、好ましくは、ＣＮＣＭにＩ−１４８５の番号で寄託されている菌株ＨＡＶである。特に好ましいパラ百日咳菌に対するワクチンは、活性成分として、パラ百日咳菌の「ｖａｇ尿素抽出物」およびパラ百日咳菌の「ｖｒｇ尿素抽出物」を包含することを特徴とするものであり、これらの抽出物を製造するために使用されるパラ百日咳菌の菌株は、好ましくは、ＣＮＣＭにＩ−１４９８の番号で寄託されている菌株Ｎｏ．１である。特に好ましい気管支肺血症菌に対するワクチンは、活性成分として、気管支肺血症菌の「ｖａｇ尿素抽出物」および気管支肺血症菌の「ｖｒｇ尿素抽出物」を包含することを特徴とするものであり、これらの抽出物を製造するために使用される気管支肺血症菌の菌株は、好ましくは、ＣＮＣＭにＩ−８５８の番号で寄託されている菌株９７３Ｓである。百日咳菌および／またはパラ百日咳菌および／または気管支肺血症菌のｖａｇ尿素抽出物とｖｒｇ尿素抽出物の混合物を含有するいずれものワクチン構成物もまた、本発明の範疇に入る。ｖａｇおよびｖｒｇ抽出物は、適切な場合には、使用されるボルデテラ種の数個の単離物から製造される。本発明はまた、活性成分として、ｖａｇ遺伝子を発現する百日咳菌の菌株およびｖｒｇ遺伝子を発現する百日咳菌株、および／またはｖａｇ遺伝子を発現するパラ百日咳菌の菌株およびｖｒｇ遺伝子を発現するパラ百日咳菌株、および／またはｖａｇ遺伝子を発現する気管支肺血症菌の菌株およびｖｒｇ遺伝子を発現する気管支肺血症菌菌株を含有するワクチンを提供する。本発明は、実験部分で詳細に記載されてる方法で実施されることによって得られるような「尿素抽出物」型のバクテリア抽出物にも関する。免疫原性組成物またはワクチン組成物であって、その中にＡＣ−Ｈｌｙが純粋な型で存在するかまたは、ＡＣ−Ｈｌｙの代わりに、そのＣ末端部分を有するポリペプチドおよび／またはその内部部分を有するポリペプチドが存在するものもまた、本発明の範疇に入る。ＡＣ−Ｈｌｙは、ボルデテラから単離されるかまたは、例えば、遺伝子工学技術によって製造され得る。本発明の主題は、上述したような免疫原性組成物若くはワクチン組成物またはバクテリア抽出物があらかじめ接種されたホストにおいて産生されるような抗体でもある。図図１：不活化された、またはそうでない気管支肺血症菌ｖａｇ尿素抽出物により免疫感作した後の特異的血清抗体を測定したものである。図２：リンパ球増殖：気管支肺血症菌ｖａｇ尿素抽出ワクチンを表す。図３：気管支肺血症菌による呼吸器系感染を表す。図４：気管支肺血症菌により一次感染させたかまたはこれらのバクテリア若くは精製されたＡＣ−Ｈｌｙにより免疫感作させたマウスにおける、気管支肺血症菌感染および再感染のコースを表す。図５：気管支肺血症菌９７３Ｓおよび無鞭毛気管支肺血症菌変異菌（９７３Ｓｆｌａ―）のビルレンスの比較を表す。実験部分上記一般的な結果に基づいて、ホスト中でのボルデテラがたどる運命を説明するために、下記モデルを提案する。工程１：感染を開始するために、バクテリアはｖａｇ遺伝子、ＦＨＡ、２種のＡＧＧおよびＰＲＮのような付着因子を発現するようである。これによって、バクテリアは、目標細胞への付着が可能になり、また、バクテリアは、ＡＣ―ＨｌｙおよびＰＴＸのような毒素因子を発現し、これによってホストの第一防御ラインの破壊が可能となる。工程２：バクテリアの目標は、存続することにあり、ホストを死滅させることではないので、バクテリアは、ホストの防御因子、特にマクロファージまたはリンパ球を破壊するＡｃ−ＨｌｙまたはＰＴＸのような毒素因子を継続的に合成することができない。それゆえ、毒素因子の合成は停止するように見えるが、付着因子の合成は続くようである。工程３：存続するために、また付着因子に対して現れたホストの免疫防御因子を避けるために、バクテリアは、付着因子の合成を停止させ、次いで、ｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白を発現させるようである。このモデルを支持する論理として次のものがある。 ― すべてのｖａｇ遺伝子若くは付着因子のみをコードするｖａｇ遺伝子のいずれか、またはいずれものｖａｇ遺伝子を発現するボルデテラ菌株が、疾病の間に単離される。 ― 気管支肺血症菌の種々の臨床単離物による致死性を誘発する能力は、発現され、分泌されるＡＣ−Ｈｌｙの量に従って変化する。 ― ｖａｇ遺伝子を発現する気管支肺血症菌の培養物により、モルモット(gui nia pig)を感染させた後、鞭毛に対する抗体、つまりｖｒｇ遺伝子生成物であって、バクテリアが感染中に種々の因子の合成を変更することを示唆するものを検出することができる。 ― すべてのｖａｇ遺伝子を発現するがフラジェリン(flagellin)は発現しない気管支肺血症菌変異菌（ｖｒｇ生成物、B.J．Akerley，D.M．Monack，A..Falkow ，J.H.Miller．J．Bacteriol．1992．174，980-990）は、それゆえ不動であり、挿入変異によって実験室で構築可能であり、本発明者らの予備実験結果によると、呼吸器系感染のマウスモデルにおいてはビルレンスが弱い。すなわち、親株気管支肺血症菌９７３ＳのＬＤ₅₀（平均致死量）は、約１０⁷バクテリアであり、ｆｌａ変異菌のＬＤ₅₀は、約５×１０⁷バクテリアである。更に、この変異菌は、呼吸器系器官から、親株より早く排除されるようである。このことは、ホストにおける気管支肺血症菌が存続するために鞭毛が重要であることを示唆している（図５）。気管支肺血症菌によって誘発される疾病および感染に対して効果的な無細胞性ワクチン本発明による無細胞性ワクチンは、上記モデルに適合させ、種々の因子に対する毒性効果に対する防御のためのみならず、バクテリアの存続性に対する防御のためのものと規定された。このワクチンは、実際、バクテリアが付着し、増殖するためばかりでなく、細胞外または細胞内で存続するために必要な因子を含有し、従って、ｖａｇ遺伝子生成物のみならず、ｖｒｇ遺伝子生成物の両方を含有する。精製されたこれらすべての因子を含有するワクチンを製造することから生ずるコストを削減するために、より安価に得られる無細胞性ワクチンとしては、ｖａｇ遺伝子を発現するバクテリアおよびｖｒｇ遺伝子を発現するバクテリアから得られる「尿素抽出物」の混合物を含有するものものがあげられる。「尿素抽出物」は、バクテリアの表面に発現される蛋白の混合物を含有し、５Ｍの尿素を用いてバクテリアをインキュベートした後、バクテリアから分離される。気管支肺血症菌の「ｖａｇ尿素抽出物」は、蛋白の中でも、特にＡＣ−Ｈｌｙ、ＦＨＡ、ＰＲＮおよびＬＰＳ（エンド毒素因子）を含有し、「ｖｒｇ尿素抽出物」は、いまだ特徴が解明されていない幾つかの蛋白、鞭毛およびＬＰＳを含有する。動物のボルデテラの場合は、疾病の唯一の作用因子は、気管支肺血症菌であり、もし、気管支肺血症菌の菌株間に、これら尿素抽出物を構成する蛋白の多様性がある場合には、ワクチンは、一種または数種の気管支肺血症菌単離物から製造される「ｖａｇ尿素抽出物」および「ｖｒｇ尿素抽出物」の混合物を含有する。蛋白の多様性は、パルス・フィールド電気泳動技法を使用して検出される。これらの抽出物を構成する蛋白、特にＡＣ−Ｈｌｙを不活化する必要性をテストすることは重要となろう。更に、これらの抽出物にＬＰＳが残留する必要性をテストする必要があるであろう。百日咳菌及びパラ百日咳菌によって誘発される疾病および感染に対して有効な無細胞性ワクチンヒト・ボルデテラ菌の場合、百日咳菌、パラ百日咳菌および気管支肺血症菌が疾病の作用因子であり得る。従って、ワクチンは、３種のボルデテラ菌代表物のｖａｇ遺伝子を発現するバクテリア懸濁液およびｖｒｇ遺伝子を発現するバクテリア懸濁物を含有する(すなわち、ワクチンは、６バクテリア懸濁物を含有する) 。これらのバクテリア懸濁物は、完全なバクテリアを用いるワクチン接種による副作用を減らすように、遺伝子工学によってその毒素因子が不活化されたバクテリアから得られる。１．ｖａｇおよびｖｒｇ尿素抽出物の調製１．１．ｖａｇ尿素抽出物ｖａｇ尿素抽出物は、ボルデテラ属（百日咳菌、パラ百日咳菌または気管支肺血症菌）のフェーズＩバクテリア、つまりｖａｇ遺伝子を発現するバクテリアから調製される。ｖａｇ遺伝子から発現される蛋白には、とりわけ、アデニールシクラーゼ（ＡＣ―Ｈｌｙ）、百日咳毒素因子（ＰＴＸ）および前記凝集素（ＡＧＧ）がある。これらの尿素抽出物の調製プロトコールは、全３種バクテリアについて同じである。１．２．ｖｒｇ尿素抽出物ｖｒｇ尿素抽出物は、同じ３種のフェーズＩＶバクテリア、つまり、いずれものｖａｇ遺伝子をもはや発現しないがｖｒｇ遺伝子は発現するバクテリアから調製される。これらの遺伝子生成物は、気管支肺血症菌の鞭毛を除いて、まだ十分に特徴が解明されていない。ｖｒｇ尿素抽出物は、ｖａｇ尿素抽出物のように製造される。２．結果２．１．フェーズ１気管支肺血症菌９７３から抽出されるｖａｇ尿素抽出物の調製２．１．１フェーズ１気管支肺血症菌の培養 ― 固体血液ボルデ・ジャング培地（ＢＢＧ;後述する）上で、単離溶血コロニーを得られるように、フェーズ１バクテリアを４８時間培養する。 ― 次に、液体スタイナー培地（後述する）に数コロニーを再懸濁し、この懸濁液１００μlを固体スタイナー培地（ＣＳＭ；後述する）上にプレートする。 ― ３６℃で、２４〜３６時間培養した後、液体スタイナー培地にバクテリアを再懸濁し、６５０ｎｍにおける光学密度が０．０５となるように、液体スタイナー培地２００ml含む２リットルのフラスコに接種する。 ― 接種後、３６℃で、静かに攪拌しながら、６５０ｎｍにおける光学密度が１〜１．２となるように１８〜２０時間培養する。 ― このようにして得られたバクテリア懸濁液のアデニール・シクラーゼ活性を、懸濁物を希釈せずに分析する（後述する）。もし、この活性が３０と１００ U／mlの間にあったならば、尿素抽出物は製造され得る。ｖｒｇ尿素抽出物の製造用に、フェーズＩＶボルデテラ菌株が使用され、上述したスタイナー培地に、５０mMの硫酸マグネシウムを補給すること以外は、フェースＩ菌株と同様にして培養される。適切な場合には、硫酸マグネシウムの代わりに、Melton A.，Weiss A.，Inf．Imm．1993，61:807-815の刊行物中に記載されているような他のレギュレーターを使用する。２．１．２．ｖａｇ尿素抽出物の調製 ― バクテリア懸濁液を３０分、５０００ｇ、４℃で、遠心分離する。 ― バクテリアのペレットを、バクテリアペレットの湿重量の５倍に等価である容量比率でＰＢＳ緩衝液（後述）中に製造された５Ｍ尿素中に再懸濁する。 ― ４℃、１時間攪拌放置した後、４０分、４０００ｇ、４℃で、遠心分離する。 ― 抽出物中のアデニール・シクラーゼ・ヘモリシンおよびパートアクチンの存在していることを、これらの因子に特異的な抗体を使用して確認した後、上澄み液を使用時まで―８０℃に貯蔵する。２．１．３．ｖａｇ尿素抽出物の不活化 ― Ｇ２５カラムを通して、尿素を除去した後、300μｇ／mlの蛋白濃度を得るように、ｖａｇ尿素抽出物をＰＢＳで希釈する。 ― ０．０５％の最終濃度を得るように、２．５％のグルタルアルデヒド量を滴下する。 ― 室温にて、規則的に混ぜ併せながら、２時間放置する。 ― 反応をリジン（最終濃度０．０２Ｍ）を加えて停止させる。 ― 室温にて２時間後、尿素抽出物を、ＰＢＳ中に準備された水酸化アルミニウム（１mg／ml）上に、４℃で一晩静かに攪拌しながら吸着させる。動物の免疫感作用に、ワクチンが１０ないし２０μg／注入（後述する）をベースに、準備される。２．２呼吸器系感染のマウスモデルにおける気管支肺血症菌ｖａｇ尿素抽出物の防御効能２．２．１免疫感作 ― ２群のマウスを、１４日の間隔をおいて濃度１mg／mlで、２５０μlの水酸化アルミニウム、または水酸化アルミニウム上に吸着されたｖａｇ尿素抽出物２５０μlを用いて免疫感作する。２．２．２．体液反応第二回目の免疫感作の後７日目に、ｖａｇ尿素抽出物中の蛋白について、マウスの血清中に、抗体が存在していることを、ウエスタンブロット技法(図１)で確認する。産生された抗体は、ＩｇＧ２ａタイプ及びＩｇＭ、ＩｇＡタイプの特異的なイムノグロブリンを含むＩｇＧタイプである。２．２．３．細胞性反応完全なバクテリアにより免疫感作された後誘発された反応は、不活化された、またはそうでないｖａｇ尿素抽出物により免疫感作された後に得られた反応、または、精製されたｖａｇ生成物であるＡＣ−Ｈｌｙにより免疫感作された後に得られた反応と比較された。細胞性反応は、マウスの一部分において第二次免疫感作がなされた後７日目に研究される。図２において、非不活化ｖａｇ尿素抽出物により免疫感作されたマウスの脾臓細胞（２×１０⁶細胞／ml）は、ｖａｇ尿素抽出物（ｖａｇＵＥ）またはｖｒｇ尿素抽出物（ｖｒｇＵＥ）またはＡＣ−Ｈｌｙと共に、最終蛋白濃度１μg／ml （Redhead et al.のプロトコールによる）で培養される。ｖａｇ尿素抽出物およびＶｒｇ尿素抽出物によって、増殖反応が得られた。Ｔｈ１またはＴｈ２に特徴的なサイトカインが合成される。２．２．４．抗原投与残りのマウスに、亜致死量のバクテリアによる感染が行われる。 ― 第二次免疫感作後１４日目に、上述したスタイナー培地で培養されたフェーズＩの気管支肺血症菌バクテリア懸濁物５０μlによる、両グループのマウスの鼻腔内感染を行なう。 ― 各グループから、０、３、６、１０、１２、１５、３０および４０日目に、３または４匹のマウスが犠牲にされ、その肺のバクテリアの計測がなされた。 ― 得られた結果は、完全なバクテリアからなるワクチンにより免疫感作された後に得られた結果と同様である(図３)。図１：不活化されたまたはそうでない気管支肺血症菌ｖａｇ尿素抽出物により免疫感作した後の特異的血清抗体の検出を表す。８〜２５％ポリアクリルアミド・ゲル抗原：セファデックスＧ−２５カラムを通した後の気管支肺血症菌尿素抽出物。血清Ａ：非不活化気管支肺血症菌ｖａｇ尿素抽出物２×２５μｇで、免疫感作したマウスの免疫血清である。血清Ｂ：グルタルアルデヒドを用いて不活化した気管支肺血症菌ｖａｇ尿素抽出物２×２５μｇにより免疫感作したマウスの免疫血清である。培養培地の記載乾燥ボルデ・ジャング培地組成物：ｐＨは、７．４に調製 ― 加熱 ― １５分１２０℃のオートクレーブに供す ― ４℃に貯蔵使用時に、ボルデ・ジャンク培地は、１５ないし２０％の羊または馬の血液により富化される。チューブを溶かし、５４℃で溶解を維持する。２．５mlの羊の血液を、滅菌状態で各チューブに添加する。チューブの内容物を滅菌したペトリ皿に注ぐ。注記：鼻咽頭の検体において百日咳菌をテストするために、新しい皿を使用する（４ ℃で、７日以下）こと。ＣＳＭ寒天培地１０倍濃縮溶液２リットルを製造するために：種々の構成成分を最終容量の水の一部に溶解する。塩酸を使用してpHを７．４に調整する。最終量に調製し、−２０℃に貯蔵する。 ― 使用時には： ― １０倍濃度の溶液１００ml ― ９００mlの熱分解水９００ml ― １gの（２、６―di-O-メチル）シクロデキストリン、（参照 Aldrich No ．51166-71-3） ― １５ｇのバクトアガー（参照 Difco No．0140-01）、を混合し、ガラス管に、２０ml分画づつ分配し、滅菌しおよび滅菌補給物を添加する。 ― 補給溶液は： ― １０倍濃縮の補給溶液１ml ― １００mgのグルタチオン、参照Merck No．4090 ― ９mlの熱分解水を混合する。この溶液を、０．２２μmのミレックス（Millex）フィルターを通し、本溶液２００μlを２０mlの培地の入ったチューブ１本に入れる。スタイナー培養培地Ａ．ベース培地１０倍濃縮溶液２リットルを製造するために、種々の構成成分を最終容量の水の一部に溶解する。塩酸を使用してpHを７．６に調整する。最終量に調製し、この濃縮溶液を分配し、数週間−２０℃で貯蔵することができる。使用時には、培地を希釈し、それを１２０℃で１５分間滅菌し、ろ過によって滅菌された補給物を添加する。Ｂ．補給溶液１０倍濃縮溶液２００mlを調製するために、この溶液に、あらかじめ溶解させておいた下記混合物を注ぐ。熱分解水で、２００mlに調製し、この溶液を１、２、３、４ml分画に分配し、 −２０℃で凍結する。使用時に、熱分解水中に溶液を１０倍に希釈し、グルタチオン（参照 Merck No．4090）...．100 mgを希釈補給物10 ml中に加え、この溶液をろ過（Millex使い捨て０．２２μmフィルター）によって滅菌し、滅菌溶液１mlを滅菌ベース培地１００mlに添加する。シクラーゼ活性分析溶液の調製：を混合し２×１０⁴ｃｐｍ/６０μlとなるように、[³Ｈ]ｃＡＭＰ^*を２００μlを加える。溶液をホモジナイズした後に、チューブに４mlづつ分配し、−２０℃で貯蔵する。１）ＢＳＡ−カルモジュリン混合物：ＢＳＡを上記水中に希釈し、カルモジュリンをＴｒｉｓ中に希釈する。ＡＴＰ^*：２０mM コールドＡＴＰと［³²Ｐ］ＡＴＰ^*を、約８×１０⁵ ｃｐｍ／１０μｌ（０日目）となるように加え、５×１０⁵ｃｐｍ／１０μlまで使用することができる。２）分析の実施・重要：コントロールを含めてすべての分析は、二重に行う。・ガラス管の各々に、あらかじめラベルをして、６０μlのＭｉｘ^*、２０μlのＢＳＡ―ＣａＭ―水、１０μlのサンプル（例：バクテリア懸濁物ＯＤ＝１、または５０mM、Ｔｒｉｓ、ｐＨ８で希釈したもの）を混合する。・チューブを３０℃浴に入れ、次に１０μlのＡＴＰ^*を添加し、正確に１０分放置する。・０．５ＭＨＣｌを２００μl添加して、反応を停止させる。・チューブを沸騰浴中に５分間漬け、次に、２００μlの１．５Ｍイミダゾールを添加する（必ずしも必要な工程ではない）。・冷却し、アルミナ・カラム（１ｇ／カラム）に入れ、３mlの１０mMイミダゾールで、溶出する。・溶出物を１０mlのシンチレーター中に採集し、³Ｈｃｐｍを計数し、カラム収量を計算し、また、³²Ｐｃｐｍを計数し、シクラーゼ活性を計算する。（クエンチングを忘れずに）。・「ブランク」を調製する：１０μlのサンプルに代えて、１０μlの水を使用する・二つの「全活性」：１）³Ｈ：３mlのイミダゾールをカラムより溶出し、１０mlのシンチレータと６０μlのＭｉｘを含むバイアルに採集する。２）³²Ｐ：同上、しかし、バイアルは、１０mlのシンチレータおよび１０μlの［³²Ｐ］ＡＴＰを含む。３）計算１）各カラムの収量の計算２）ブランクの計算：上記に同じ＝Ｙｃｐｍ３）Ｚ＝各サンプルの全ｃｐｍＸｃｐｍ − Ｙｃｐｍ＝Ｚｃｐｍ....．Ｚ′、Ｚ″、Ｚ″′.... ４）全³²Ｐｃｐｍ −−−−−−→ ２００nmolのＡＴＰＺｃｐｍ −−−−−−→ Ｗ nmol ｖμl酵素に対してＷnmol Ｔ＝回／分とすると、もし、サンプルが分析の前に希釈されていれば、サンプルに希釈因子を掛ける。ＡＴＰおよびｃＡＭＰの調製コールドＡＴＰ：懸濁物中に入れたら、すぐに使用するかまたは、−２０℃で、凍結する。何回も解凍凍結をしてはならない。非常に不安定！長期間貯蔵してはならない。２０mMのＡＴＰを５ml調製：約７０mgを計量し、５０mMトリスｐＨ７を５ml添加する。このＡＴＰを１／１０００に希釈するや否やＯＤを非常に正確に２６０ｎｍにおいて測定する。正確な濃度は、１mM → ＯＤ₂₆₀＝１５．４または、１０^-5M → ＯＤ₂₆₀＝０．１５４というように計算される。コールドｃＡＭＰ：ＡＴＰと同様に調製される。わずかに３２．９ mg／１０ ml溶解させる必要がある（溶解させるためにわずかに加熱することができる）。このように、ＯＤを２６０ｎｍで測定することによって正確な濃度を測定する。溶液は、１／５００に希釈される。１０^-5Ｍ → ＯＤ₂₆₀ ＝０．１５４使用された薬剤参照トリス：参照８３８２、Merckより、ＢＳＡ、牛アルブミン：参照Ａ−４５０３、シグマより、カルモジュリンまたはホスホジエステラーゼ３’：５’サイクリック・ヌクレオチド・アクチベータ：参照Ｐ２２７７、シグマより、イミダゾール：参照Ｉ−０１５２、シグマより、シンチレータ：オプチファーゼ（Optiphase）〈HiSafe３〉、ＬＫＢファルマシアより、コールドＡＴＰ：参照A−２３８３（分子量＝５５１．１）、シグマより、［³²Ｐ］ＡＴＰ：アマーシャム（Amersham），５００μＣｉ，参照ＰＢ２００＝アルファー³²Ｐ、コールドｃＡＭＰ：Ａ−９５０１，シグマより、［³Ｈ］ＡＭＰ：アマーシャム（Amersham）［最小投与量（１０μＣｉ）］。無細胞性ワクチンの調製気管支肺血症菌水酸化アルミニウム上への吸着・参照水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）₃：２％Ａｌ₂Ｏ₃と等価であるアルヒドロゲル３％のＡｌ（ＯＨ）₃（Superfos Biosector als Denmark）・希釈緩衝液：燐酸―ＮａＣｌ緩衝液０．１５Ｍ、ｐＨ＝６．８組成（１０倍濃度）：０．１ＭＰＯ₄（または、０.０７ＭＮａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏおよび０．０３ＭＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ）１．５M ＮａＣｌｐＨ＝６．８使用時に、熱分解水で１０倍に希釈する。・水酸化アルミニウムの洗浄：５mlの濃縮Ａｌ（ＯＨ）₃を、緩衝液５０mlで１ないし２回洗浄する。２回目の洗浄後、５mlの洗浄Ａｌ（ＯＨ）₃を、全容量５０ml中に取り、結局、２倍濃縮Ａｌ（ＯＨ）₃と等価になる（最終濃度：２mg／ml）。このように調製されたアジュバントは、ワクチン分画と等量に混合され、一晩、４℃で、撹拌しながら吸着させる。Ａｌ（ＯＨ）₃の最終濃度は、動物に投与するために準備されたワクチンにおいて１mg／mlである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ０７Ｋ 14/235 // Ａ６１Ｋ 38/00 16/12 Ｃ０７Ｋ 14/235 Ａ６１Ｋ 37/48 16/12 37/02 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】１．百日咳菌、パラ百日咳菌もしくは気管支肺血症菌から選ばれるボルデテラ菌株のアデニールシクラーゼ溶血素（ＡＣ−Ｈｌｙ）蛋白またはこのＡＣ−Ｈｌｙの免疫原性部分を含有し、および更に、百日咳菌、パラ百日咳菌もしくは気管支肺血症菌から選ばれるボルデテラ菌株のｖｒｇ遺伝子の発現生成物を含有するバクテリア抽出物、または該抽出物が投与され得るホストにおいて免疫反応を誘発するために十分なこれらの発現生成物の一部を含有するバクテリア抽出物を含有することを特徴とする免疫原性組成物。２．ＦＨＡ、ＡＧＧまたはＰＲＮおよびＰＴＸより選ばれる、百日咳菌、パラ百日咳菌または気管支肺血症菌の付着因子または毒素因子一つ以上を更に含有することを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。３．百日咳菌のＰＴＸ毒素因子、百日咳菌のＡＣ―Ｈｌｙ毒素因子、および百日咳菌のｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白を含有するバクテリア抽出物、または該抽出物が投与され得るホストにおいて、免疫反応を誘発するために十分なこれらの蛋白の一部を有するバクテリア抽出物を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の免疫原性組成物。４．該百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子が、百日咳菌の付着因子または毒素因子群のビルレンス因子の全てまたは一部を有するバクテリア抽出物中に含有されることを特徴とする請求項３に記載の免疫原性組成物。５．該百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子が「ｖａｇ尿素抽出物」と呼ばれる尿素抽出物の形態で存在することを特徴とする請求項３に記載の免疫原性組成物。６．該百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子が「ｖａｇ尿素抽出物」と呼ばれる尿素抽出物の形態で存在し、および百日咳菌のｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白の全てまたは一部を含有するバクテリア抽出物もまた「ｖｒｇ尿素抽出物」と呼ばれる尿素抽出物であることを特徴とする請求項１ないし４のいづれか１項に記載の免疫原性組成物。７．パラ百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子、およびパラ百日咳菌のｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白の全てまたは一部を含有するバクテリア抽出物を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の免疫原性組成物。８．パラ百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子が、パラ百日咳菌の付着因子または毒素因子群のビルレンス因子の全てまたは一部を含有するバクテリア抽出物中に含まれることを特徴とする請求項３に記載の免疫原性組成物。９．該パラ百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子が「ｖａｇ尿素抽出物」と呼ばれる尿素抽出物の形態で存在することを特徴とする請求項３に記載の免疫原性組成物。１０．該パラ百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子が「ｖａｇ尿素抽出物」と呼ばれる尿素抽出物の形態で存在し、およびパラ百日咳菌のｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白の全てまたは一部を含有するバクテリア抽出物もまた「ｖｒｇ尿素抽出物」と呼ばれる尿素抽出物であることを特徴とする請求項１ないし４のいづれか１項に記載の免疫原性組成物。１１．該気管支肺血症菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子および気管支肺血症菌のｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白の全てまたは一部を有するバクテリア抽出物を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の免疫原性組成物。１２．該気管支肺血症菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子が、気管支肺血症菌の付着因子または毒素因子群のビルレンス因子の全てまたは一部を有するバクテリア抽出物中に含有されることを特徴とする請求項３に記載の免疫原性組成物。１３．該気管支肺血症菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子が「ｖａｇ尿素抽出物」と呼ばれる尿素抽出物の形態で存在することを特徴とする請求項３に記載の免疫原性組成物。１４．該気管支肺血症菌のＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子が「ｖａｇ尿素抽出物」と呼ばれる尿素抽出物の形態で存在し、および該気管支肺血症菌のｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白の全てまたは一部を含有するバクテリア抽出物もまた「ｖｒｇ尿素抽出物」と呼ばれる尿素抽出物であることを特徴とする請求項１ないし４のいづれか１項に記載の免疫原性組成物。１５．気管支肺血症菌の鞭毛に特徴的なポリペプチド成分を更に含有することを特徴とする請求項１または１１ないし１４のいづれか１項に記載の免疫原性組成物。１６．該ＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子が、純粋な形態にあることを特徴とする請求項１または２に記載の免疫原性組成物。１７．該毒素因子が、少なくとも該毒素因子のＣ末端部分および／または少なくとも一つのＡＣ−Ｈｌｙの内部ドメインを有するＡＣ−Ｈｌｙ断片により置換されることを特徴とする請求項１６に記載の免疫原性組成物。１８．該ＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子およびｖｒｇ遺伝子によって発現される蛋白が得られる該百日咳菌の菌株がＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ―１４８５の下に奇託されている菌株ＨＡＶであることを特徴とする請求項１ないし８のいづれか１項に記載の免疫原性組成物。１９．該ＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子およびｖｒｇ遺伝子によって発現される蛋白が得られる該パラ百日咳菌の菌株がＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ―１４９８の下に奇託されている菌株No.１であることを特徴とする請求項1ないし８のいづれか１項に記載の免疫原性組成物。２０．該ＡＣ−Ｈｌｙ毒素因子およびｖｒｇ遺伝子によって発現される蛋白が得られる該気管支肺血症菌の菌株がＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ―８５８の下に寄託されている菌株９７３Ｓであることを特徴とする請求項１ないし８のいづれか１項に記載の免疫原性組成物。２１．活性成分として、請求項１ないし２０のいづれか１項に記載の免疫原性組成物を、薬学的に許容し得るビヒクルと、適切な場合には、アジュバントと組み合わせて含有することを特徴とするワクチン組成物。２２．活性成分として、更に、請求項３ないし６のいづれか１項に記載の免疫組成物および請求項７ないし１０のいづれか１項に記載の組成物を含有することを特徴とする請求項２１に記載のワクチン組成物。２３．請求項１１ないし１４のいづれか１項に記載の組成物を含有することを特徴とする請求項２１または２２に記載のワクチン組成物。２４．活性成分として、百日咳菌の「ｖａｇ尿素抽出物」、および百日咳菌の「ｖｒｇ尿素抽出物」であって、該百日咳菌の菌株が、好ましくは、ＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ―１４８５の下に寄託されている菌株ＨＡＶであるものを含有することを特徴とする請求項２１に記載のワクチン組成物。２５．活性成分として、パラ百日咳菌の「ｖａｇ尿素抽出物」、およびパラ百日咳菌の「ｖｒｇ尿素抽出物」であって、該パラ百日咳菌の菌株が、好ましくは、ＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ―１４９８の下に寄託されている菌株No.１であるものを含有することを特徴とする請求項２１に記載のワクチン組成物。２６．活性成分として、気管支肺血症菌の「ｖａｇ尿素抽出物」、および気管支肺血症菌の「ｖｒｇ尿素抽出物」であって、該気管支肺血症菌の菌株が、好ましくは、ＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ―８５８の下に寄託されている菌株９７３Ｓであるものを含有することを特徴とする請求項２１に記載のワクチン組成物。２７．活性成分として、百日咳菌の「ｖａｇ尿素抽出物」、および百日咳菌の「ｖｒｇ尿素抽出物」であって、該百日咳菌の菌株が、好ましくは、ＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ―１４８５の下に寄託されている菌株ＨＡＶであるもの、およびパラ百日咳菌の「ｖａｇ尿素抽出物」であって、該パラ百日咳菌の菌株が、好ましくは、ＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ―１４９８の下に寄託されている菌株No.１であるものを含有することを特徴とする請求項２１に記載のワクチン組成物。２８．気管支肺血症菌の「ｖａｇ尿素抽出物」であって、該気管支肺血症菌の菌株が、好ましくは、ＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ―８５８の下に寄託されている菌株９７３Ｓであるものを更に含有することを特徴とする請求項２７に記載のワクチン組成物。２９．活性成分として、ｖｒｇ遺伝子を発現する百日咳菌株および／またはパラ百日咳菌株および／または気管支肺血症菌株の混合物を含有することを特徴とするワクチン組成物。３０．活性成分として、例えば、不活化された病原性作用剤または毒素因子のような別の免疫原性成分を更に含有することを特徴とする請求項２１ないし２９のいづれか１項に記載のワクチン組成物。３１．ボルデテラのビルレンス因子を含有するバクテリア抽出物であって、下記工程を実施することによって、百日咳菌、パラ百日咳菌または気管支肺血症菌のフェーズＩ菌株から得られるもののような、ワクチン組成物中に加えることができるバクテリア抽出物。単離溶血コロニーを得るように、固体血液ボルデ・ジャング培地（ＢＢＧ）上においてバクテリアを４８時間培養する工程、液体スタイナー培地中に数コロニーを再懸濁し、この懸濁液１００mlを固体スタイナー培地（ＣＳＭ）上にプレーティングする工程、３６℃で、２４〜３６時間培養した後、液体スタイナー培地に該バクテリアを再懸濁し、６５０ｎｍにおける光学密度が０．０５となるように、液体スタイナー培地２００mlを含有する２リットルのフラスコに接種する工程、接種後、３６℃で、静かに攪拌しながら、６５０ｎｍにおける光学密度が１〜１．２となるように１８〜２０時間培養する工程、バクテリア懸濁液を３０分、５０００ｇ、４℃で遠心分離する工程、バクテリアのペレットを、該バクテリアペレットの湿重量の５倍に等しい量比率にＰＢＳ緩衝液（後述）中に調製された５Ｍ尿素中に再懸濁する工程、４℃、１時間攪拌放置した後、４０分、４００００ｇ、４℃で遠心分離する工程、使用時まで、−８０℃で上澄み液を貯蔵する工程、このように得られたバクテリア懸濁液のアデニールシクラーゼ活性を希釈せずに分析する工程、もし、この活性が、３０ないし１００Ｕ／mlであったならば、該尿素抽出物が製造され得る。３２．ｖｒｇ遺伝子の発現生成物を含むバクテリア抽出物であって、下記工程を実施することによって、百日咳菌、パラ百日咳菌または気管支肺血症菌のフェーズＩＶ菌株から得られるもののような、ワクチン組成物に加えることができるバクテリア抽出物。単離溶血コロニーを得るように、固体血液ボルデ・ジャング培地（ＢＢＧ）上においてバクテリアを４８時間培養する工程、液体スタイナー培地中に数コロニーを再懸濁し、この懸濁液１００mlを固体スタイナー培地（ＣＳＭ）上にプレーティングする工程、３６℃で、２４〜３６時間培養した後、液体スタイナー培地に該バクテリアを再懸濁し、６５０ｎｍにおける光学密度が０．０５となるように、液体スタイナー培地２００mlを含有する２リットルのフラスコに接種する工程、接種後、３６℃で、静かに攪拌しながら、６５０ｎｍにおける光学密度が１〜１．２となるように１８〜２０時間培養する工程、このように得られたバクテリア懸濁液のアデニールシクラーゼ活性を希釈せずに分析する工程、もし、この活性が、３０ないし１００Ｕ／mlであったならば、該尿素抽出物が製造され得る。３３．百日咳菌、パラ百日咳菌もしくは気管支肺血症菌から選ばれるボルデテラ菌株のｖｒｇ遺伝子によってコードされるビルレンス抑制蛋白を発現するバクテリア抽出物、または該抽出物が投与され得るホストにおいて免疫反応を誘発するために十分なこれらの蛋白の一部を発現するバクテリア抽出物が、バクテリアのｂｖｇＳ遺伝子においてそのｖａｇ遺伝子の障害に対してｖｒｇ遺伝子を本質的に発現するように変異された百日咳菌、パラ百日咳菌または気管支肺血症菌菌株により置換されることを特徴とする請求項１ないし２１のいづれか１項に記載の免疫原性組成物。３４．ＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ―１４８５の下に寄託されている百日咳菌の菌株ＨＡＶ、またはＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ―１４９８の下に寄託されているパラ百日咳菌の菌株No.１であることを特徴とするボルデテラ菌株。３５．請求項１ないし２０または３３のいづれか１項に記載の免疫原性組成物、請求項２１ないし３０のいづれか１項に記載のワクチン組成物、または請求項３１又は２１に記載のバクテリア抽出物が予め投与されたホストから得られる抗体。