ES2202345T3

ES2202345T3 - Vacuna de tipo antibordetella acelular.

Info

Publication number: ES2202345T3
Application number: ES95402838T
Authority: ES
Inventors: Pascale Gueirard; Nicole Guiso
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1994-12-15
Filing date: 1995-12-15
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2015-12-15
Also published as: US20030215461A1; US6387377B1; US20060073169A1; EP0719560B1; DE69531186D1; DK0719560T3; WO1996018414A1; FR2728170A1; AU715243B2; CA2165393A1; US7465443B2; US6582705B1; US5985286A; EP1386616A1; FR2728170B1; JPH10510984A; AU4393596A; US7105317B2; DE69531186T2; EP0719560A1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA COMPOSICION INMUNOGENA, CARACTERIZADO EN QUE COMPRENDE UNA PROTEINA ADENILCICLASAHEMOLISINA (AC-HLY) O UNA PARTE INMUNOGENA DE ESTA AC-HLY, DE UNA CEPA DE BORDETELLA ELEGIDA ENTRE B. PERTUSSIS, B. PARAPERTUSSIS O B. BRONCHISEPTICA Y EN QUE COMPRENDE ADEMAS UN EXTRACTO BACTERIANO QUE CONTIENE LOS PRODUCTOS DE EXPRESION DE LOS GENES RG. DE UNA CEPA DE BORDETELLA ELEGIDA ENTRE B.PERTUSSIS, B. PARAPERTUSIS O B. BRONCHISEPTICA O UNA PARTE DE ESTOS PRODUCTOS DE EXPRESION, SUFICIENTE PARA INDUCIR UNA RESPUESTA INMUNITARIA EN UN HUESPED AL QUE EL EXTRACTO SERA ADMINISTRADO.

Description

Vacuna de tipo antibordetella acelular.

El género Bordetella comprende cuatro especies Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica y Bordetella avium.

Las Bordetellae son cocobacilos gram-negativos responsables de infecciones respiratorias. Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis, los agentes del coqueluche (tos ferina), son patógenos estrictamente humanos. Bordetella bronchiseptica es patógeno para diversos mamíferos y, con menos frecuencia, para el hombre y, a diferencia de B. pertussis y B. parapertussis, puede sobrevivir fuera del huésped. B. avium sólo es patógeno para las aves.

Desde la introducción de la vacunación contra la tos ferina en los países en los que la cobertura de la vacunación es superior al 80%, se ha podido observar una disminución espectacular de la morbilidad y mortalidad. Esta disminución es atribuible a la vacunación ya que en muchos países (Gran Bretaña. Suecia, Japón etc.) se han producido epidemias mortíferas de tos ferina en los años siguientes a la interrupción de la misma.

La invención propone composiciones inmunógenas que pueden entrar en la constitución de las vacunas de la tos ferina, siendo estas composiciones de tipo "acelular" y presentando una eficacia al menos idéntica a la de la vacuna conocida.

La invención se refiere, por una parte, a las vacunas utilizables en Veterinaria y, por otra parte, a las vacunas de uso en Medicina.

La vacuna contra la tos ferina utilizada actualmente es una vacuna celular, constituida por suspensiones bacterianas de B. pertussis (mezcla de dos cepas diferentes con respecto a la expresión de aglutinógenos) inactivadas por el calor. Esta vacuna generalmente se utiliza en combinación con fracciones purificadas de vacuna antidiftérica y antitetánica, estando los componentes hemófilus y del virus de la poliomielitis inactivados. La vacunación consiste en tres inyecciones, separadas entre sí un mes, realizadas a partir de la edad de dos meses y una inyección adicional a los 18 meses. No se suele aplicar otra inyección de recuerdo.

Esta vacuna a veces es mal tolerada tanto localmente como generalmente. En particular, ha sido acusada de producir complicaciones neurológicas graves del tipo de encefalitis aguda; sin embargo, estudios recientes parecen concluir en la ausencia de demostración estadística de la existencia de ninguna relación entre la vacuna celular y las complicaciones neurológicas graves (Griffiths AH. Vaccine 1989; 7:199-210).

No es menos cierto que la vacuna celular es mal tolerada y es responsable de efectos reversibles, pero indeseables. Por estas razones, es deseable una vacuna nueva que carezca de estos efectos. Para enfocar la definición de una nueva vacuna, parece necesario caracterizar ciertos factores implicados en la virulencia de la bacteria y, en su caso, en la regulación de la virulencia. Purificados, estos diferentes factores son eventuales candidatos teóricos para la constitución de una vacuna contra la tos ferina, denominada "acelular" en contraposición con la vacuna clásica. Este nuevo tipo de vacuna debe proporcionar, además de una mejor tolerancia, una eficacia al menos igual a la de la vacuna clásica.

Los factores implicados en la virulencia de B. pertussis han sido identificados como sigue: la tos ferina puede ser definida por la asociación de un síndrome infeccioso, que implica la adherencia de las bacterias a las células objetivas (células ciliadas del aparato respiratorio), sin invasión ni diseminación en el organismo del huésped, y un síndrome toxínico secundario que comprende efectos citopáticos locales, selectivos en el epitelio respiratorio ciliado (destrucción y eliminación de las células ciliadas, acumulación de moco, reacción inflamatoria) y efectos generales de los cuales el más evidente es la hiperleucocitosis con hiperlinfocitosis.

Gracias a las técnicas recientes de biología molecular, se han caracterizado cierto número de factores implicados en la virulencia de B. pertussis y se ha podido conocer la regulación de su expresión. Estos factores pueden clasificarse en dos categorías, los que participan en el síndrome infeccioso (adhesinas) y los que juegan un papel en el síndrome toxínico (toxinas).

Las adhesinas:

-: La hemaglutinina filamentosa o FHA se considera que tiene un papel mayor en la adherencia de la bacteria al epitelio ciliado (Locht C., Bertin P., Menozzi F.D. y Renaud G. Mol. Microbiol. 1993, 9:653-66). La FHA se expresa siempre en las cepas virulentas y es segregada. Se ha clonado y secuenciado su gen estructural (Relman D. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2637-2641). Codifica una proteína de 360 kDa aunque sólo se puede purificar un fragmento de 220 kDa. Esta proteína se fija a las glucoproteínas de las células ciliadas y posee sitios de fijación para las integrinas de los linfocitos y macrófagos. Recientemente se ha demostrado que la FHA presenta homología con ciertas proteínas de las células endoteliales del huésped (Tuomanen E., Prasad S.M., George J.S., Hoepelman A.I.M., Ibsen P., Heron I., and Starzyk R.M. 1993. Proc. Natl. Sci. USA. 90:7824-7828).

-: Los dos aglutinógenos, o AGG, de B. pertussis permiten clasificar las cepas en serotipos. Se han caracterizado dos AGG. Estas proteínas son segregadas y juegan un papel en la adherencia de la bacteria a las células epiteliales (Mooi F., Van der Heide H.G.D., Ter Avest A.R., Welinder K.G., Livey I., Van der Zeijst B.A.M. and Gaastra W., 1987. Microb. Pathog. 2:473-484).

-: La pertactina o PRN es una proteína de 93 kDa pero sólo se puede purificar un fragmento de 69 kDa. Esta proteína posee dos sitios de fijación para las integrinas de los macrófagos y de los linfocitos (Charles I., Dougan G., Pickard D., Chattfield S., Smith M., Novotny P., Morissey P., and Fairweather N.F. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3554-3558).

-: La toxina de pertussis o PTX, toxina de tipo A-B, es segregada y, además de efectos citopatogénicos, participa en la adherencia por medio de su subunidad B. El oligómero B es capaz de fijarse a los receptores de las células ciliadas aunque no necesariamente a los mismos receptores que la FHA. La fijación de la PTX a los leucocitos impediría su migración al sitio de la reacción inflamatoria. Esta fijación induciría un incremento del número de moléculas de integrinas funcionales sobre los leucocitos, lo que favorecería la fijación de la bacteria por medio de la FHA (Rozindski E., Burnette W.N., Jones T., Mar V. and Tuomanen E. 1993 J. Exp. Med. 178:917-924).

Las toxinas

-: La toxina de pertussis o PTX es segregada y se considera la toxina principal de B. pertussis. Su subunidad A posee actividad ADP-ribosil transferasa. Tras la fijación de la parte B de la toxina a la célula objetiva, esta subunidad A es capaz de penetrar en la célula, inactivar las proteínas reguladoras G y dar lugar así a la perturbación de todas las funciones celulares. Éste es un factor que sería responsable de los efectos biológicos generalizados observados durante la enfermedad, como la linfocitosis, la hiperinsulinemia y la sensibilidad a la histamina.

-: La toxina dermonecrótica o TDN, todavía no bien caracterizada, y la toxina citotraqueal o TCT, pequeña glucoproteína segregada de la familia de los péptidos muramil, derivada del proteoglicano de la bacteria, actuarían de forma concertada en la destrucción de las células ciliadas del aparato respiratorio del huésped. La TCT impide la regeneración del epitelio respiratorio (Luker K., Collier J.L., Kolodziej E.W., Marshall G.R., and Goldman W.E. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:2365-2369)

-: La adenil ciclasa hemolisina, o AC-Hly, es una proteína bifuncional, que posee actividad adenil ciclasa y actividad hemolítica. Es segregada por la bacteria. Su gen estructural ha sido clonado y secuenciado (Glaser P., et al, 1988. Molec. Microb. 2, 19-20). Se sabe que esta proteína forma parte de la familia de las toxinas denominadas "RTX", que significa "repeats in toxins" y presenta homologías con la hemolisina de Escherichia coli y de Actinobacillus pleuropneumoniae y las leucotoxinas de Pasteurella haemolytica y de Actinobacillus actinomycetemcomitans. Esta proteína, como la PTX, puede penetrar en las células eucariotas como los macrófagos, ser activada por la calmodulina, sintetizar grandes cantidades de AMPc y perturbar las funciones celulares (Coote J. 1992. FEMS Microbiol. Rev. 88:137-162).

También se han identificado los factores implicados en la virulencia B. parapertussis y B. bronchiseptica.

Gueirard et al. han mostrado que la adenil ciclasa hemolisina de B. bronchiseptica tiene un importante papel en la virulencia de esta bacteria y constituye un antígeno protector importante contra las infecciones por B. bronchiseptica (Inf. Immun. 1993, vol. 61, nº 10, p. 4072-4078).

Las infecciones por B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica son indistinguibles desde el punto de vista clínico. Estas bacterias tienen más del 75% de homología en el ADN. No se clasifican en especies más que sobre la base de los caracteres fenotípicos y bioquímicos. B. parapertussis y B. bronchiseptica sintetizan factores de virulencia muy próximos funcional e inmunogénicamente a los de B. pertussis, con excepción de la PTX.

En el modelo murino, una vacuna consistente en suspensiones bacterianas inactivadas de B. pertussis protege contra la infección por B. pertussis y también contra la infección por B. parapertussis y B. bronchiseptica. Aunque en Francia no hay datos epidemiológicos sobre las infecciones por B. parapertussis, hay que señalar que en nuestro país, un país vacunado desde hace 25 años con una "vacuna pertussis", se aíslan pocas cepas de esta especie, en tanto que dichas cepas son aisladas en los países poco o mal vacunados.

Además de la presencia de estas diferentes adhesinas y toxinas, las Bordetellas se caracterizan por la regulación de la expresión de factores implicados en su virulencia. Dicho de otra forma. las Bordetellas experimentan variaciones y modulaciones de fase.

Las Bordetellas, dependiendo de su ambiente, pueden hacerse "no virulentas", es decir, incapaces de inducir letalidad, reacción inflamatoria y lesiones pulmonares en el modelo murino de infección respiratoria. Experimentan una modulación de fase o una variación de fase. La variación de fase se observa con una frecuencia que oscila entre 10^{-3} a 10^{-6} y es casi irreversible. Esta variación de fase se traduce por ausencia de la expresión de las toxinas y adhesinas descritas previamente y por la expresión de otros factores todavía no bien caracterizados (cambio de bacterias "virulentas" en Fase I en bacterias "no virulentas" en Fase IV). Las bacterias en fase I y fase IV han sido descritas por Lacey B. 1960, J. Hyg. 58:57-93. La modulación de fase, fenotípicamente similar a la variación de fase, es totalmente reversible y se traduce por interrupción de la síntesis de las adhesinas y toxinas durante los cambios ambientales (composición del medio de cultivo, temperatura etc.).

Knapp et al. han determinado dos series de genes cuya expresión durante la fase de virulencia puede estar activada (genes de activación de la virulencia o vag) o reprimida (genes de represión de la virulencia o vrg) (J. Bacteriol. 1988, vol. 170, nº 11: p. 5059-5066).

La variación de fase y la modulación de fase observadas en las Bordetella están sometidas al control de dos genes reguladores, bvg A y bvg S (Arico B. et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6671-6675).

El gen bvg S codifica una proteína sensible a las condiciones externas. Esta proteína modula por fosforilación la actividad de la proteína codificada por el gen bvg A, que es, por una parte, un activador positivo de la transcripción de los genes que codifican los factores de virulencia (genes vag, o "vir activated genes"), citados previamente (Uhl M.A. and Miller J. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1163-1167) y, por otra parte un represor de la transcripción de ciertos genes (Beattie D.T. et al., J. of Bacteriology, enero 93, p. 159-527). Los genes cuya expresión está inhibida se denominan genes vrg, de "vir repressed genes" y todavía no están bien caracterizados. No obstante, se ha demostrado que el gen vrg 6 de B. pertussis codifica una proteína que juega un papel en la persistencia de la bacteria en el huésped (Beatties D. et al., 1992, Infect. Imm. 60:571-577). En B. bronchiseptica se han caracterizado dos proteínas codificadas por los genes vrg: son las proteínas de tipo flagelar (B. bronchiseptica en fase I es una bacteria inmóvil que no sintetiza flagelos pero sintetiza adhesinas y toxinas y B. bronchiseptica en Fase IV es una bacteria móvil que sintetiza flagelos).

Con el fin de medir la virulencia de las bacterias y de evaluar los efectos toxínicos locales y generales, se ha puesto a punto un modelo de infección respiratoria en el ratón (Guiso N. et al., 1991. Microb. Pathogen 11, 423-431). En este modelo murino se ha podido demostrar que la PTX inactivada química o genéticamente, es un buen inmunógeno. Esta anatoxina tiene actividad protectora frente a las infecciones letales por B. pertussis pero no parece inducir la síntesis de anticuerpos eficaces contra la persistencia de la bacteria (Khelef N., Danve B., Quentin-Millet M.J. and Guiso N. 1993, Infect Immun. 64:486-490).

Estos resultados relativos a la virulencia de las Bordetellas y a la regulación de la misma, muestran que la tos ferina es una enfermedad multifactorial y que la vacuna debe, no sólo proteger contra las infecciones letales, sino también contra la persistencia de la bacteria. Conclusiones similares son aplicables con respecto a las infecciones causadas por B. parapertussis y B. bronchiseptica.

Se han realizado tentativas de desarrollo de una vacuna acelular, a partir de los componentes aislados de la familia de las adhesinas o de las toxinas. Así, se han preparado composiciones acelulares que contienen la toxina de B. pertussis (PTX) purificada o esta toxina asociada a la hemaglutinina filamentosa (FHA) purificada.

Los primeros ensayos de tolerancia en el hombre de estas composiciones acelulares (PTX o PTX-FHA) muestran una disminución neta de las complicaciones tanto locales (dolor, tumefacción) como generales (fiebre, convulsiones) en comparación con la vacuna celular clásica (Edward K., J. Infect. Dis. 1993, 168, 15-20).

Estas nuevas preparaciones (PTX o PTX-FHA) tienen una buena inmunogenicidad e inducen una elevada tasa de anticuerpos. Sin embargo, la investigación de los anticuerpos vacunales es un método imperfecto porque la seroconversión no es sinónimo de protección contra la enfermedad y no ha habido ninguna demostración del carácter protector de los anticuerpos obtenidos ni de la tasa eventual de protección.

Se han publicado los resultados de ensayos clínicos de diferentes vacunas celulares y acelulares (International Symposium on Pertussis Vaccine trials, Roma 30.10.95-1.11.95). Estos resultados muestran que todas las vacunas celulares no son equivalentes; algunas son muy eficaces e inducen pocos efectos secundarios y otras son muy poco eficaces e inducen efectos secundarios más importantes.

Los resultados publicados muestran que las vacunas acelulares analizadas, monovalente (PTX), bivalente (PTX-FHA), trivalente (FTX, FHA, PRN) o pentavalente (PTX, FHA, PRN, AGG2, AGG3) inducen muy pocos efectos secundarios, son todas inmunogénicas y todas tienen una eficacia contra la enfermedad (según la definición de la OMS) igual o superior al 70%. No obstante, la eficacia de una vacuna acelular PTX-FHA es siempre inferior, sea cual sea la definición de caso, a la de una vacuna celular eficaz.

A pesar de los resultados prometedores obtenidos sobre la inmunogenicidad de las diferentes composiciones que contienen simultáneamente adhesinas y toxinas de B. pertussis, los inventores han estimado que la protección eficaz contra la enfermedad producida por la infección por B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica requiere la consideración de factores complementarios en relación con las adhesinas y toxinas y, en particular, de los factores que intervienen en la persistencia de la bacteria.

Sus observaciones les han conducido a definir un modelo descrito con detalle en la parte experimental, a partir del cual se han definido nuevos criterios previos a la definición de vacuna.

Así, según la presente demanda, para definir las vacunas eficaces y sustancialmente no tóxicas al menos contra una de las Bordetellas, B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica, es conveniente considerar no sólo una o varias adhesinas, toxinas, o ambas, de estas bacterias, sino también uno o más factores cuya síntesis está inhibida cuando se expresan las toxinas y adhesinas de la bacteria. Estos factores son principalmente productos de la expresión de genes vrg, tratados previamente.

Con el fin de preparar una vacuna contra la tos ferina desprovista de efectos secundarios y protectora contra los efectos locales o generales debidos a las toxinas sintetizadas por B. pertussis y/o B. parapertussis y/o B. bronchiseptica, y contra la persistencia de la bacteria en el huésped, la invención tiene como objeto una composición inmunogénica caracterizada porque comprende una proteína adenil ciclasa hemolisina (AC-Hly), o una parte inmunógena de esta AC-Hly, característica de una cepa de Bordetella elegida entre B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica y que comprenda además, un extracto bacteriano que contenga los productos de los genes vrg de una cepa de Bordetella elegida entre B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica, o una parte de estos productos de expresión, suficientes para inducir una respuesta inmunitaria en el huésped al que se administre el extracto.

La demanda de la patente internacional WO 90/13312 describe la utilización de una preparación de vacuna elaborada a partir de una adenil ciclasa purificada de una bacteria determinada perteneciente al género Bordetella, para la preparación de un antígeno protector para el hombre o el animal contra las infecciones y los efectos tóxicos producidos por una bacteria del género Bordetella.

Según los inventores, esta proteína debería ser incorporada en una composición vacunal ya que juega un papel importante en la virulencia de las Bordetellas por las siguientes razones:

\bullet: se expresa muy precozmente tras la infección, sintetizándose y detectándose los anticuerpos, tanto en el hombre como en los animales infectados desde el comienzo de la misma (Khelef N., Sakamoto H., and Guiso N. 1992. Microbiol. Pathogen. 12:227-235 y Gueirad P. and Guiso N. 1993 Infect. Immun. 61:4072-4078).

\bullet: es necesaria para la bacteria, para iniciar la infección (Khelef N., Sakamoto H., and Guiso N. 1992. Microbiol. Pathogen. 12:227-235).

\bullet: su utilización en forma purificada como antígeno en el modelo murino de infección respiratoria protege a los ratones frente a la colonización del aparato respiratorio (Guiso, Szatanik y Rocancourt. 1989 Microb. Pathogen. 11:423-431).

\bullet: es responsable, in vitro, de la muerte por apoptosis de los macrófagos alveolares (Khelef, Zyglinski y Guiso. Infect. Immun. 61:4064-4071). Las otras adhesinas o toxinas no intervienen en el proceso de apoptosis.

Por otra parte, la presencia en la composición inmunógena de un extracto bacteriano que contenga los productos de expresión de los genes vrg permitiría mejorar la respuesta inmunitaria humoral, celular, o ambas, obtenida tras la infección en los individuos vacunados y contribuiría igualmente a la protección contra la persistencia de la bacteria.

El extracto bacteriano, denominado "extracto bacteriano vrg", mencionado más arriba, contiene todos los constituyentes de la membrana externa, incluyendo la endotoxina LPS, de una bacteria en fase IV, es decir, de una bacteria que no expresa los genes vag. La endotoxina LPS puede ser, alternativamente, eliminada o destoxificada.

Este extracto puede estar en forma de suspensión.

Una primera composición inmunogénica de la invención es una composición inmunogénica caracterizada por comprender una o varias adhesinas o toxinas de B. pertussis, B.parapertussis o B. bronchiseptica, elegida (o elegidas) entre la FHA, las AGG o la PRN y la PTX.

Las adhesinas de las Bordetellas refuerzan el carácter inmunógeno de la composición que contiene la AC-Hly y el extracto bacteriano vrg.

Según un primer modo de realización de la invención, la composición inmunógena se caracteriza por comprender la toxina PTX de B. pertussis, la toxina AC-Hly de B. pertussis y las adhesinas FHA y PRN, y un extracto bacteriano que contiene las proteínas codificadas por los genes vrg de B. pertussis, o una parte de estas proteínas suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en el huésped al que se administra dicho extracto.

Tal composición puede confeccionarse para preparar vacunas protectoras contra los efectos letales y sistémicos de B. pertussis en el hombre y contra la persistencia de la bacteria.

Según un modo de realización preferente de la invención, la toxina AC-Hly de B. pertussis está igualmente contenida en un extracto bacteriano que contiene, en su totalidad o en parte, los factores de virulencia del grupo de las adhesinas o de las toxinas de B. pertussis.

Los extractos "vag" o "vrg" a los que hay que recurrir para realizar la invención, son preferentemente extractos denominados "ureicos".

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Un extracto "ureico" está compuesto de una mezcla de proteínas expresadas en la superficie de la bacteria y que se separan de la misma tras incubación de ésta con urea 5M. Por ejemplo, el "extracto ureico vag" de B. bronchiseptica, contiene, entre otras proteínas, la AC-Hly, la FHA, la PRN y la LPS (endotoxina lipopolisacárido), y el "extracto ureico vrg" contiene múltiples proteínas todavía no caracterizadas, los flagelos y la LPS.

La utilización de extractos ureicos permite principalmente la preparación de una vacuna de menos coste en comparación con una vacuna obtenida a partir de las proteínas contenidas en los extractos en forma purificada.

Por otra parte, los inventores han constatado que los extractos ureicos utilizados pueden inducir una respuesta inmunitaria celular de tipo T (linfoproliferación) comportándose, por lo tanto, como la vacuna celular utilizada hasta la actualidad.

Por el contrario, las composiciones exclusivamente acelulares no inducirían respuesta T, reacción que se produce, sin embargo, en caso de infección.

Los extractos ureicos vag o vrg se preparan a partir de bacterias en fase I o IV, respectivamente. En su caso, las bacterias en fase IV son sustituidas por bacterias en las que el gen bvg S está mutado de tal forma que las bacterias no expresan más que las proteínas codificadas por los genes vrg.

La preparación de estos extractos se describe detalladamente en la parte experimental.

Así pues, la invención concierne de forma preferente a una composición inmunógena que comprende a la vez un extracto ureico vag de B. pertussis y un extracto ureico vrg de B. pertussis.

Una cepa de B. pertussis apropiada para la preparación de estos extractos es la cepa HAV que entra en el marco de la invención y fue registrada en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, en París) el 19 de octubre de 1994, con el nºI-1485. Para preparar el extracto ureico vag se puede utilizar la cepa directamente ya que se trata de una cepa de fase I.

Por el contrario, el extracto ureico vrg se obtiene a partir de una cepa en fase IV derivada de la cepa en fase I, por ejemplo, por mutación del gen bvgS de la bacteria o por cultivo de la mencionada cepa en fase I en un medio que contiene únicamente sulfato de magnesio, de tal forma que sólo se expresan los genes vrg de B. pertussis.

La invención propone, además, las composiciones inmunógenas elaboradas según los principios descritos más arriba para B. pertussis, a partir de las Bordetellas de la familia B. parapertussis o de B. bronchiseptica.

De hecho, se sabe que la vacunación con la vacuna celular existente en el mercado, es decir, compuesta de suspensiones bacterianas de bacterias en fase I de B.pertussis inactivadas, protege frente a las infecciones por B. pertussis y B.parapertussis en el modelo murino. Sin embargo, se ha demostrado recientemente que la administración de factores purificados de B. pertussis (PTX o FHA o PRN) no protege contra la enfermedad ni las infecciones producidas por B. parapertussis. Del mismo modo, la administración de AC-Hly purificada de B. parapertussis no protege de la infección por B. pertussis en el modelo murino.

Estos resultados sugieren que, a pesar de la alta homología entre las dos especies, la protección es específica de cada especie. La utilización de vacunas acelulares, compuestas de PTX, PRN y FHA sólo de cepas de B. pertussis como vacuna contra la tos ferina en los años próximos, tiene el riesgo de seguirse de un aumento de las infecciones por B. parapertussis (Khelef N., Danve B., Quentin-Miller y Guiso 1993, Infect. Immun. 61:46-490 y Gueirad P., y Guiso 1993 Infect. Immun. 61:4072-4078)

La invención propone igualmente composiciones inmunógenas caracterizadas por contener la toxina AC-Hly de B. parapertussis y un extracto bacteriano que contiene, en su totalidad o en parte, proteínas codificadas por los genes vrg de B. parapertussis. Tal extracto es preferentemente un extracto ureico vag obtenido, por ejemplo, a partir de la cepa de B. parapertussis nº 1 registrada en la CNCM el 2 de diciembre de 1994, con el nº I-1498. La cepa nº I-1498 entra en el marco de la presente invención.

Igualmente, el extracto bacteriano vrg es preferentemente un extracto ureico obtenido, por ejemplo, a partir de la cepa nº 1 de B. parapertussis, registrada en la CNCM el 2 de diciembre de 1994, con el nº I-1498, según modalidades análogas a las descritas para la cepa de B. pertussis.

Según otro aspecto, y en particular con el fin de realizar una vacuna veterinaria, la presente demanda propone composiciones inmunógenas caracterizadas por contener la toxina AC-Hly de B. bronchiseptica y un extracto bacteriano que contiene en su totalidad o en parte, proteínas codificadas por los genes vrg de B. bronchiseptica.

Como se ha indicado previamente, con respecto a B. pertussis y B. parapertussis, la toxina AC-Hly de B. bronchiseptica está contenida en un extracto bacteriano que contiene, en su totalidad o en parte, factores de virulencia (adhesinas, toxinas o ambas) de B. bronchiseptica.

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Se trata, ventajosamente, de un extracto ureico vag, obtenido, por ejemplo, a partir de la cepa de B. bronchiseptica 973S registrada en la CNCM el 12 de mayo de 1989, con el nº I-858.

De forma análoga, el extracto ureico vrg se obtiene de preferencia a partir de la cepa de B. bronchiseptica 973S, registrado en la CNCM el 12 de mayo de 1989 con el nºI-858, según la modalidad descrita más arriba con respecto a B. pertussis.

Según otro modo de realización particular de la invención, una composición inmunógena capaz de inducir la producción de anticuerpos contra B. bronchiseptica, como la descrita más arriba, comprende los componentes polipeptídicos característicos de los flagelos de B. bronchiseptica. Estos componentes han sido descritos por Akerley B.J. et al (J. Bact. Feb 1992, p. 980-990).

Durante mucho tiempo se ha considerado que la inmunidad humoral anti Bordetella era la única importante. De hecho, se sabe desde hace tiempo que tras la infección se pueden detectar anticuerpos anti PTX y anti FHA en el suero de los pacientes. Además, en el modelo murino, es posible proteger pasivamente contra la enfermedad con anticuerpos anti PTX. Los anticuerpos circulantes juegan por lo tanto, un papel en la neutralización de la PTX y en la inhibición de la adherencia de la bacteria.

Sin embargo, no se ha demostrado nunca la existencia de correlación entre la tasa de anticuerpos específicos de estos antígenos en el suero de los individuos vacunados o infectados y la protección contra la enfermedad. Se sabe muy poco sobre la inmunidad de otros factores, en particular de la AC-Hly, la PRN y las LPS. No obstante se ha demostrado:

\bullet: que es posible proteger pasivamente a los ratones contra la infección por B. pertussis con anticuerpos anti AC-Hly.

\bullet: que en el suero de los niños infectados, no vacunados, (de edad superior a 8 meses, con el fin de evitar la presencia de anticuerpos maternos que pudieran falsear la interpretación de la serología, y menores de dos años para conocer su historia clínica) o en el suero de los ratones infectados con aislados clínicos de B.pertussis o B. bronchiseptica, se pueden detectar anticuerpos anti AC-Hly muy precozmente (lo que indica que esta proteína se expresa in vivo y desde el comienzo de la infección), anticuerpos anti FHA, anticuerpos anti PTX y anticuerpos anti LPS. Los anticuerpos anti PRN aparecen mucho más tardíamente y no persisten durante mucho tiempo (Guiso, Grimpel, Anjak y Bégué, 1993, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12:596-600).

La vacunación con la vacuna celular induce también la síntesis de anticuerpos contra estos factores en tanto que las vacunas acelulares analizadas hasta la actualidad no inducen anticuerpos más que contra los factores que las constituyen.

Diversos estudios sugieren, además, que la inmunidad celular también es necesaria para la protección contra la infección. Muchos equipos han demostrado que las Bordetellas pueden, in vitro, penetrar y persistir en diferentes tipos de células, como células epiteliales, linfocitos, monocitos, etc. Por otra parte, los estudios epidemiológicos han mostrado que B. bronchiseptica puede persistir en el hombre durante mucho tiempo. Finalmente, aunque en el ratón no es posible aislar del pulmón las bacterias después de 40 días de haber pasado la infección, siempre es posible detectar el ADN mediante PCR. El conjunto de estos resultados sugiere que las Bordetellas podrían persistir intracelularmente en el huésped en un momento dado de la infección y que la inmunidad celular podría ser necesaria para controlar un estado intracelular que permitiría a las bacterias escapar de las defensas inmunitarias del huésped.

Recientemente se ha obtenido la demostración de la implicación de las células T en el curso de la infección (Redhead, Watkins, Barnard y Mills 1993, Infect. Immun. 61:3190-3198). Con dosis subletales, los ratones normales eliminan las bacterias en 30-40 días en tanto que los ratones deficitarios en células T (ratones "nude") son incapaces de eliminar las bacterias y desarrollan una infección crónica. La transferencia de células T de ratones convalecientes a los ratones "nude" les confiere capacidad para eliminar las bacterias. Además, las células del bazo de los ratones convalecientes producen tasas elevadas de IL-2, IFN-\gamma y TNF pero no producen IL-4 e IL-5. Este perfil es característico de la subpoblación de células T denominadas células Th1. La inmunización de los ratones con la vacuna completa induce también una respuesta de tipo Th1 y una moderada respuesta de anticuerpos, en tanto que la inmunización con una vacuna acelular compuesta de PTX, FHA y PRN induce una respuesta de tipo Th2 y una muy alta tasa de anticuerpos. Aunque existe una estrecha correlación entre las tasas séricas elevadas de anticuerpos IgG específicos de antígenos de B. pertussis y la eliminación de las bacterias del pulmón, son sin embargo necesarias respuestas celulares directas para una completa eliminación de las bacterias. La menos rápida eliminación de las bacterias observada en los ratones inmunizados con vacunas acelulares en comparación con las vacunas completas sería, por lo tanto, debida a que la vacuna acelular no favorecería la inducción de células Th1. Sea cual sea el mecanismo de acción de las células Th1, es hoy día claro que las células T juegan un papel importante, no sólo indirecto, estimulando la síntesis de anticuerpos, sino también directo, en la inmunidad anti B. pertussis, vía el reclutamiento, la estimulación y la activación de células fagocíticas, como los macrófagos y los polinucleares neutrófilos.

Además, se ha observado que las Bordetellas pueden persistir en el hombre, en particular B. bronchiseptica. En ciertos casos, la bacteria persiste varias semanas, en otros varios meses. En el curso de ciertas infecciones, los aislados tienen un aspecto diferente. Estos aspectos diferentes corresponden o bien al cese de la síntesis de AC-Hly o al cese de la síntesis de todos los factores codificados por los genes vag.

Es interesante el hecho de que, en el marco de la investigación de una protección eficaz contra la enfermedad causada por infección por Bordetellas y contra la persistencia de estas bacterias en el huésped, los inventores han observado que los extractos bacterianos de la invención provocan una respuesta inmunitaria humoral y una respuesta inmunitaria celular.

Los inventores han demostrado que tras la infección por B. bronchiseptica se produce la inducción de inmunidad humoral e inmunidad celular, como en el caso de la infección por B. pertussis. Además, tras la vacunación con AC-Hly purificada se produce la inducción de inmunidad de tipo humoral y celular similar a la inducida tras la infección o reinfección.

La invención también tiene como objetivo composiciones vacunales que contienen como principio activo una composición inmunógena que responde a una de las definiciones dadas en las páginas precedentes, en asociación con un vehículo farmacéutico aceptable y, en su caso, con un adyuvante.

Como las vacunas contra la tos ferina actualmente existentes en el mercado, la vacuna de la invención puede asociarse a otros principios activos de vacunación, por ejemplo, a los de la vacuna contra la difteria, la polio o las enfermedades por Hemófilos o, de forma general, con cualquier constituyente inmunógeno, por ejemplo, una toxina o un agente patógeno inactivado determinado.

Una composición vacunal según la invención puede ser específica de la especie y, en consecuencia, capaz de inducir protección contra B. pertussis o B. parapertussis o B. bronchiseptica. Por el contrario, puede tratarse de una mezcla que comprenda como principio activo una composición inmunógena contra B. pertussis, según se ha definido previamente, y una composición inmunógena contra B. parapertussis.

Según otro modo de realización de la invención, la composición vacunal contiene las composiciones inmunógenas, elaboradas según la invención, contra B. pertussis, contra B. parapertussis y contra B. bronchiseptica.

Una vacuna particularmente preferida contra B. pertussis se caracteriza porque comprende como principio activo un "extracto ureico vag" de B. pertussis y un "extracto ureico vrg" de B. pertussis en la que la cepa de B. pertussis utilizada para preparar los extractos ha sido de preferencia la cepa HAV registrada en la CNCM con el nº I-1485.

Una vacuna particularmente preferida contra B. parapertussis se caracteriza por comprender como principio activo un "extracto ureico vag" de B. parapertussis y un "extracto ureico vrg" de B. parapertussis en la que la cepa de B. parapertussis utilizada para preparar los extractos ha sido de preferencia la cepa nº 1 registrada en la CNCM con el nº I-1498.

Una vacuna particularmente preferida contra B. parapertussis se caracteriza por comprender como principio activo un "extracto ureico vag" de B. bronchiseptica y un "extracto ureico vrg" de B. bronchiseptica en la que la cepa de B. bronchiseptica utilizada para preparar los extractos ha sido de preferencia la cepa 973S, registrada en la CNCM con el nº I-858.

Entra igualmente en el marco de la invención toda composición vacunal que comprenda una mezcla de extractos ureicos vag y extractos ureicos vrg de B. pertussis y/o B. parapertussis y/o B. bronchiseptica.

En cada caso, los extractos ureicos vag y vrg utilizados se preparan a partir de varios aislados de las Bordetellas utilizadas.

La invención se refiere también a los extractos bacterianos de tipo "extracto ureico" como los obtenidos para la ejecución del procedimiento descrito con detalle en la parte experimental.

Entran igualmente en el marco de la invención las composiciones inmunógenas o vacunales en las que está presente la AC-Hly, en forma pura o sustituida por un polipéptido que comprenda su parte c-terminal y/o un polipéptido que comprenda su parte interna.

La AC-Hly puede ser aislada a partir de Bordetellas o preparada, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética.

La invención también tiene como objetivo los anticuerpos producidos en un huésped al que previamente se le ha administrado una composición inmunógena o vacunal como las descritas anteriormente, o un extracto bacteriano.

Figuras

Figura 1: Detección de anticuerpos séricos específicos tras la inmunización con un extracto ureico vag de Bordetella bronchiseptica, inactivado o no.

Figura 2: Linfoproliferación: Vacuna de extracto ureico vag de Bordetella bronchiseptica.

Figura 3: Infección respiratoria por Bordetella bronchiseptica.

Figura 4: Evolución de la infección y de la reinfección por B. bronchiseptica en los ratones primoinfectados con estas bacterias o vacunados con estas bacterias o con la AC-Hly purificada.

Figura 5: Virulencia comparada de B. bronchiseptica 973S y de un mutante aflagelado de B. bronchiseptica (973S fla-).

Parte experimental

Dado el conjunto de resultados expuestos más arriba, se propone el siguiente modelo para explicar el devenir de la Bordetella en el huésped:

Etapa 1

Para iniciar la infección, la bacteria expresaría los genes vag, adhesinas tales como la FHA, las AGG y la PRN que permitirían así la adherencia de la bacteria a las células objetivas, y toxinas como AC-Hly y PTX que permitirían la destrucción de la primera línea de defensa del huésped.

Etapa 2

Como la finalidad de la bacteria es persistir en el huésped, no destruirlo, no puede continuar sintetizando de forma continuada toxinas como la AC-Hly o PTX, que destruyen las defensas del huésped, en particular los macrófagos y linfocitos. Por lo tanto, interrumpirían la síntesis de toxinas pero continuarían sintetizando las adhesinas.

Etapa 3

Con el fin de persistir y escapar de las defensas inmunitarias del huésped que se desarrollarían frente a las adhesinas, la bacteria interrumpiría la síntesis de las adhesinas y expresaría entonces las proteínas codificadas por los genes vrg. Los argumentos a favor de este modelo son los siguientes:

-: en el curso de la enfermedad se aíslan cepas de Bordetellas que expresan todos los genes vag, o los genes vag que codifican sólo las adhesinas, o ningún gen vag,

-: la capacidad de inducir letalidad de los diferentes aislados clínicos de B. bronchiseptica varía en función de la cantidad de AC-Hly expresada y segregada

-: tras la infección de cobayas con un cultivo de B. bronchiseptica que exprese los genes vag, se pueden detectar anticuerpos dirigidos contra los flagelos, productos de los genes vrg, que sugieren que la bacteria varía la síntesis de sus diferentes factores durante el curso de la infección.

-: una mutante de B. bronchiseptica que expresa todos los genes vag y no expresa la flagelina (producto vrg, B.J. Akerley, D.M. Monack, A. Falkow, J.H. Miller, J. Bacteriol. 1992. 174, 980-990), y que por lo tanto es inmóvil, construido en el laboratorio por mutagénesis de inserción es, según nuestros resultados preliminares, menos virulento que el modelo murino de infección respiratoria: la DL 50 (dosis letal 50) de la cepa de origen, B. bronchiseptica 973S, es alrededor de 10^{7} bacterias y la de la cepa mutada fla- es aproximadamente 5 x 10^{7} bacterias. Por otra parte, parece que esta mutante es eliminada más rápidamente del aparato respiratorio que la cepa de origen, lo que sugiere la importancia del flagelo para la persistencia de B. bronchiseptica en el huésped (Figura 5).

Vacuna acelular eficaz contra la enfermedad y la infección inducidas por Bordetella bronchiseptica

Según el modelo precedente, la vacuna acelular de la invención queda definida, por lo tanto, por proteger no sólo contra el efecto tóxico debido a diferentes factores sino también contra la persistencia de la bacteria. Para ser eficaz, esta vacuna está constituida por los factores que necesita la bacteria para su adherencia y multiplicación y también para su persistencia, extra o intracelularmente, y, por tanto, está constituida a la vez por productos de los genes vag y también de los genes vrg.

Para limitar el coste resultante de la preparación de una vacuna constituida por todos estos factores purificados, se constituye una vacuna acelular con menor coste con una mezcla de "extractos ureicos" obtenidos a partir de bacterias que expresan los genes vag y a partir de bacterias que expresan los genes vrg.

Un "extracto ureico" consiste en una mezcla de proteínas expresadas en la superficie de la bacteria tras la incubación de ésta con urea 5M. El "extracto ureico vag" de B. bronchiseptica contiene, entre otras, las proteínas AC-Hly, La FHA, la PRN y la LPS (endotoxina) y el "extracto ureico vrg" contiene muchas proteínas todavía no caracterizadas, los flagelos y la LPS.

En el caso de las Bordetellosis animales, el único agente de la enfermedad es B. bronchiseptica y la vacuna está constituida por una mezcla de "extracto ureico vag" y "extracto ureico vrg" preparados a partir de uno o varios aislados de B. bronchiseptica, si la diversidad entre las cepas de B. bronchiseptica, demostrada gracias a la utilización de la técnica de electroforesis en campo pulsado, se sitúa al nivel de las proteínas que constituyen los extractos ureicos. Es importante analizar la necesidad de inactivar los proteínas constituyentes de estos extractos, en particular la AC-Hly. Por otra parte, hay que probar la necesidad de conservar la LPS en estos extractos.

Vacuna acelular eficaz contra la enfermedad y la infección inducidas por Bordetella pertussis y Bordetella parapertussis

En el caso de las Bordetellas humanas, pueden ser causa de enfermedad B.pertussis, B.parapertussis y B. bronchiseptica. La vacuna podría, por lo tanto, estar constituida por suspensiones de bacterias que expresan los genes vag y suspensiones bacterianas que expresan los genes vrg de representantes de las tres especies de Bordetellas (esta vacuna estaría, pues, constituida por seis suspensiones bacterianas).

Con el fin de disminuir los efectos secundarios debidos a la vacunación con bacterias completas, estas suspensiones podrían ser obtenidas a partir de bacterias cuyas toxinas hayan sido inactivadas por técnicas de ingeniería genética.

1. Preparación del extracto ureico vag y vrg 1.1. Extracto ureico vag

Los extractos ureicos vag se preparan a partir de bacterias del género Bordetella (especies pertussis, parapertussis o bronchiseptica) en fase I, es decir, de bacterias que expresan los genes vag. Las proteínas expresadas por los genes vag son, entre otras, la adenil ciclasa hemolisina (AC-Hly), la toxina de pertussis (PTX) y los aglutinógenos (AGG).

El protocolo de la preparación de estos extractos es el mismo para las 3 especies bacterianas.

1.2. Extracto ureico vrg

Los extractos ureicos vrg se preparan a partir de las 3 mismas especies bacterianas en fase IV, es decir, a partir de bacterias que no expresan ningún gen vag pero expresan los genes vrg. Los productos de estos genes no están todavía bien caracterizados, con la excepción de los flagelos de B. bronchiseptica. Los extractos ureicos vrg se preparan como los extractos ureicos vag.

2. Resultados 2.1. Preparación del extracto ureico vag a partir de B. bronchiseptica 973 en fase I 2.1.1. Cultivo de B. bronchiseptica en fase I

-: Cultivar las bacterias en fase I en medio sólido de Bordet Gengou con sangre (BGS, descrito más adelante) durante 48 horas, para obtener colonias aisladas hemolíticas.

-: Resuspender a continuación algunas colonias en medio líquido de Stainer (descrito más adelante) y extender 100 \mul de esta suspensión sobre medio de Stainer sólido (CSM, descrito más adelante).

-: Tras 24-36 horas de cultivo a 36ºC, resuspender las bacterias en medio de Stainer líquido y sembrar un frasco de 2 l conteniendo 200 ml de medio de Stainer líquido de tal forma que la densidad óptica a 650 nm sea de 0,05.

-: Tras la siembra, cultivar 18-20 horas a 36ºC bajo agitación suave hasta obtener una densidad óptica a 650 nm de 1-1,2.

-: Dosificar la actividad adenil ciclasa de la suspensión bacteriana obtenida sin diluir (descrito más adelante). Si ésta está comprendida entre 30 y 100 U/ml, puede prepararse el extracto ureico.

Para la preparación de los extractos ureicos vrg se utilizan cepas de Bordetella en fase IV de la misma forma que las cepas en fase I, con la excepción de que el medio de Stainer mencionado más arriba se completa con sulfato de magnesio 50 mM. Llegado el caso, el sulfato de magnesio se sustituye por otros reguladores, como los descritos en la publicación de Melton A., Weiss A., Inf. Imm. 1993, 61:807-815.

2.1.2. Preparación del extracto ureico vag

-: Centrifugar la suspensión bacteriana durante 30 minutos a 5.000 g, a 4ºC.

-: Resuspender el "pellet" bacteriano en la urea 5M preparada en tampón PBS (descrito más adelante) a razón de un volumen igual a 5 veces el peso húmedo del "pellet" bacteriano.

-: Agitar durante 1 hora a 4ºC y centrifugar a continuación durante 40 minutos a 40.000 g, a 4ºC.

-: Conservar el sobrenadante a -80ºC hasta su utilización tras haber verificado la presencia de adenil ciclasa hemolisina, hemaglutinina filamentosa y pertactina en el extracto, utilizando anticuerpos específicos contra estos factores.

2.1.3. Inactivación del extracto ureico vag

-: Tras la eliminación de la urea, mediante el paso a través de una columna G25, se diluye el extracto ureico vag en PBS hasta obtener una concentración proteica de 300 \mug/ml.

-: Añadir gota a gota un volumen de glutaraldehido al 2,5% para obtener una concentración final de 0,05%.

-: Dejar 2 horas a la temperatura ambiente, mezclando regularmente.

-: Parar la reacción mediante la adición de lisina (concentración final 0,02M).

-: Tras 2 horas a la temperatura ambiente, se adsorbe el extracto ureico con hidróxido de aluminio preparado en PBS (1 mg/ml) durante una noche, a 4ºC, bajo suave agitación.

-: La vacuna está entonces lista para la inmunización del animal, a razón de 10 a 20\mug/inyección (descrito más adelante).

2.2. Eficacia protectora del extracto ureico vag de B. bronchiseptica en el modelo murino de infección respiratoria 2.2.1. Inmunización

-: Inmunizar dos grupos de ratones con 14 días de intervalo, con 250 \mul de hidróxido de aluminio a 1 mg/ml, o 250 \mul de extracto ureico vag adsorbido en hidróxido de aluminio.

2.2.2. Respuesta humoral

-: 7 días después de la 2ª inmunización, verificar la presencia de anticuerpos en el suero de los ratones en comparación con las proteínas del extracto ureico vag, mediante la técnica de Western Blot (figura 1). Los anticuerpos producidos son del tipo IgG, incluyendo inmunoglobulinas específicas de tipo IgG2a, IgM a IgA.

2.2.3. Respuesta celular

La respuesta inducida tras la inmunización con la bacteria completa ha sido comparada con la obtenida tras la inmunización con el extracto ureico vag, inactivado o no, o con un producto vag purificado, la AC-Hly.

La respuesta celular ha sido estudiada en una parte de los ratones, a los 7 días de la segunda inmunización.

En la figura 2, los esplenocitos de los ratones inmunizados con el extracto ureico vag no inactivado (2 x 10^{6} células por ml) son cultivados con el extracto ureico vag (EU vag) o con el extracto ureico vrg (EU vrg), o con la AC-Hly en una concentración proteica final de 1 \mug/ml (según el protocolo de Redhead et al.).

Se obtiene respuesta proliferativa con el extracto ureico vag y con el extracto ureico vrg. Se sintetizan las citocinas características de las células Th1 o Th2.

La figura 4 representa el análisis de la inmunidad celular en respuesta a los productos de expresión de los genes vag, a los productos de expresión de los genes vrg y a la AC-Hly, tras la infección (fig 4A), tras vacunación e infección (vacunación con AC-Hly, fig. 4B, y vacunación con vacuna completa, fig. 4C), o tras infección y reinfección (fig. 4D).

En el curso de la primoinfección se observa una respuesta importante inducida contra diferentes antígenos. Esta respuesta es más débil en los ratones vacunados o reinfectados porque se trata, en este caso, de una respuesta secundaria en la que intervienen los linfocitos T inmunes específicamente sensibilizados por la vacunación o la primoinfección.

2.2.4. Demostración

El resto de los ratones se infecta con una dosis subletal de bacterias.

-: 14 días después de la 2ª inmunización, los 2 grupos de ratones son infectados por vía intranasal con 50 \mul de una suspensión bacteriana de Bordetella bronchiseptica en fase I cultivada en medio de Stainer, como se ha descrito previamente.

-: En los días 0, 3, 6, 10, 12, 15, 30, 40, se sacrifican 3 ó 4 de los ratones de cada grupo y se realiza un recuento de las bacterias presentes en el pulmón.

-: Los resultados obtenidos son similares a los que se obtienen tras la vacunación con una vacuna compuesta por bacterias completas (figura 3).

Figura 1: Detección de anticuerpos séricos específicos tras la inmunización con un extracto ureico vag de Bordetella bronchiseptica, inactivado o no inactivado.

gel de poliacrilamida 8-25%

antígeno: extracto ureico de Bordetella bronchiseptica tras paso por columna de sephadex G25

suero A: suero inmune de ratones inmunizados con 2 x 25 \mug de extracto ureico vag de Bordetella bronchiseptica no inactivado.

suero B: suero inmune de ratones inmunizados con 2 x 25 \mug de extracto ureico vag de Bordetella bronchiseptica inactivado con glutaraldehido.

Descripción de los medios de cultivo Medio de Bordet Gengou deshidratado

Composición
	1 litro	5 litros
Medio de Bordet Gengou	30 g	150 g
Glicerol	10 ml	50 ml
Agua pirolizada	1 litro	5 litros
Ajustar el pH a 7,4

- Calentar

- Poner en el autoclave 15 minutos a 120ºC

- Conservar a 4ºC

En el momento de su empleo:

El medio de Bordet Gengou se enriquece con 15 a 20% de sangre de cordero o de caballo. Fundir los tubos y mantenerlos fundidos a 54ºC. Añadir 2,5 ml de sangre de cordero en cada tubo, en condiciones de esterilidad. Verter el contenido del tubo en una placa de petri estéril.

Nota

Para la investigación de Bordetella pertussis a partir de una muestra nasofaríngea, hay que utilizar frascos frescos (máximo de 7 días a 4ºC).

Medio Gelosa CSM

Para preparar 2 litros de una solución concentrada 10 veces:

Hidrogenoglutamato sódico

\hskip3,25cm

(Ref. Prolabo nº 27872.298)

\dotl

107 g

L-prolina

\hskip5,85cm

(Ref. Merck nº 7434)

\dotl

2,4 g

NaCl

\hskip6,45cm

(Ref. Prolabo nº 27810.295)

\dotl

25 g

H_{2}PO_{4}

\hskip6,25cm

(Ref. Prolabo nº 26926.298)

\dotl

5 g

KCl

\hskip6,60cm

(Ref. Prolabo nº 26759.291)

\dotl

2 g

MgCl_{2}

\hskip6,25cm

(Ref. Prolabo nº 25108.295)

\dotl

1 g

Tris Base

\hskip5,85cm

(Ref. Merck nº 8382.2500)

\dotl

15,2 g

Ácidos casamino

\hskip4,75cm

(Ref. Difco nº 0288-01-2)

\dotl

5 g

Solución de CaCl_{2} al 1% en agua pirolizada

\hskip1cm

(Ref Prolabo nº 22317.297)

\dotl

20ml

Agua pirolizada

\hskip4,75cm

QSP

\dotl

1 litro

Disolver los diferentes constituyentes en una parte del volumen final de agua. Ajustar el pH a 7,4, mediante la adición de ácido clorhídrico. Completar hasta el volumen final y conservar a -20ºC.

En el momento del empleo, mezclar:

- 100 ml de la solución concentrada 10 veces

- 900 ml de agua pirolizada

- 1 g de (2, 6-0-dimetil) ciclodextrina, referencia Aldrich nº 51166-71-3.

- 15 g de Bacto agar, referencia Difco nº 0140-01

Distribuir en fracciones de 20 ml en tubos de vidrio.

Esterilizar y añadir el complemento estéril.

Solución de complemento:

- Mezclar:

: - 1 ml de la solución de complemento concentrada 10 veces

: - 100 mg de glutatión, referencia Merck nº 4090

: - 9 ml de agua pirolizada

Filtrar esta solución con filtro Millex de 0,22 \mum.

Añadir 200 \mul de esta solución a 1 tubo con 20 ml de medio.

Medio de cultivo de Stainer A. Medio Base

Para preparar 2 litros de una solución concentrada 10 veces:

Hidrogenoglutamato sódico

\hskip3,25cm

(Ref. Prolabo nº 27872.298)

\dotl

214,0 g

L-prolina

\hskip5,85cm

(Ref. Merck nº 7434)

\dotl

4,8 g

NaCl

\hskip6,45cm

(Ref. Prolabo nº 27810.295)

\dotl

50,0 g

H_{2}PO_{4}

\hskip6,25cm

(Ref. Prolabo nº 26926.298)

\dotl

10,0 g

KCl

\hskip6,60cm

(Ref. Prolabo nº 26759.291)

\dotl

4,0 g

MgCl_{2}

\hskip6,25cm

(Ref. Prolabo nº 25108.295)

\dotl

2,0 g

Tris base

\hskip5,95cm

(Ref. Merck nº 8382.2500)

\dotl

30,5 g

Solución de CaCl_{2} al 1%en agua pirolizada

\hskip1,1cm

(Ref Prolabo nº 22317.297)

\dotl

40 ml

Agua pirolizada

\hskip4,95cm

QSP

\dotl

2 litros

Disolver los diferentes constituyentes en una parte del volumen final de agua. Ajustar el pH a 7,6 con ácido clorhídrico. Completar hasta el volumen final y fraccionar esta solución concentrada que puede ser conservada durante varias semanas a -20ºC.

En el momento de su uso, diluir el medio, esterilizarlo a 120ºC durante 15 minutos y añadir el complemento esterilizado por filtración.

\newpage

B. Solución de complemento

Para preparar 200 ml de una solución concentrada 10 veces:

L-cistina

\hskip6,6cm

(Ref Prolabo nº 23260.184)

\dotl

8 g

HCl concentrado

\hskip5,3cm

\dotl

20 ml

Disolver. Verter sobre esta preparación la siguiente mezcla previamente disuelta:

Fe SO_{4}, 7H_{2}O

\hskip5,85cm

(Ref. Prolabo nº 24244.232)

\dotl

2 g

Ácido L(+) ascórbico

\hskip4,8cm

(Ref. Prolabo nº 20155.237)

\dotl

4 g

Ácido nicotínico

\hskip5,5cm

(Ref. Merck nº 6817)

\dotl

0,8 g

Agua pirolizada

\hskip5,3cm

\dotl

120 ml

Completar hasta 200 ml con el agua pirolizada, distribuir la solución en fracciones de 1, 2, 3 ó 4 ml y congelar a -20ºC.

En el momento de su empleo, diluir la solución 10 veces con agua pirolizada y añadir:

glutatión

\hskip6,6cm

(Ref. Merck nº 4090)

\dotl

100 mg/10 ml

de complemento diluido, esterilizar esta solución mediante filtración (filtro Millex 0,22 \mum, de uso único) y añadir 1 ml de solución estéril a 100 ml del medio base estéril.

Dosificación de la actividad ciclasa

Preparación de las soluciones:

Mezclar *

Tris 1M, pH 8:	4,15 ml	(83,3 mM final)
MgCl_{2} 0,1M:	5 ml	(10 mM final)
AMPc 0,34 M:	29 \mul	(0,2 mM final)
agua:	40,5 ml
+ 200 \mul AMPC* H^{3}, para obtener 2,14^{4} cpm/60 \mul

Tras homogenizar la solución, repartirla en tubos de 4 ml y conservar a -20ºC.

1) Mezcla de BSA-Calmodulina

BSA 10 mg/ml	1 x \mul
Calmodulina 2\mul	1 x \mul
agua	2 x \mul

El BSA se diluye en agua y la calmodulina en Tris.

ATP*:

ATP frío 20 mM

+ ATP* P^{32}

de forma que se obtenga aproximadamente 8 x 10^{5} cpm/10\mul (Día 0)

se puede utilizar hasta 5 x 10^{5} cpm/10 \mul

\newpage

2) Realización de la dosificación

\bullet: Es importante hacer todas las dosificaciones en duplicado incluyendo los controles.

\bullet: Mezclar en cada tubo de vidrio previamente etiquetado:

: 60 \mul de Mix*

: 20 \mul de BSA-CaM-agua

: 10 \mul de muestra (por ejemplo: suspensión bacteriana DO = 1, o diluir con Tris 50mM, pH 8).

\bullet: Colocar los tubos en un baño a 30ºC, añadir a continuación 10 \mul de ATP* y dejar exactamente durante 10 minutos.

\bullet: Añadir 200 \mul de HCl, 0,5M, para parar la reacción.

\bullet: Sumergir los tubos al baño maría hirviendo durante 5 minutos y añadir 200 \mul de imidazol 1,5M (paso no necesario).

\bullet: Dejar enfriar y poner en columna de alúmina (1 g por columna). Eluir con 3 ml de imidazol 10 mM.

\bullet: Recoger el eluido en 10 ml de líquido de centelleo y contar el número de cpm H^{3} para calcular el rendimiento de la columna y el número de cpm P^{32} para calcular la actividad ciclasa. (Atención al "quenching").

\bullet: Hacer un "blanco": se sustituyen los 10 \mul de la muestra por 10 \mul de agua.

\bullet: Dos "actividades totales":

: 1) H^{3}: se eluyen de una columna 3 ml de imidazol, recogidos en frascos que contienen 10 ml de líquido de centelleo y 60 \mul de Mix.

: 2) P^{32}: Hacer lo mismo pero los frascos contienen 10 ml de líquido de centelleo y 10 \mul de ATP-P^{32}.

: 3) Cálculos

1): Cálculo del rendimiento de cada columna:

\frac{cpm \ P^{32} \ x \ cpm \ H^{3} \ totales}{cpm \ H^{3} \ de \ la \ muestra} = X \ cpm.....X',X'',X'''

2): Cálculo del blanco:

Idéntico = Y cpm

3): Z = número de cpm totales de cada muestra

X cpm - Y cpm = Z cpm ...............Z', Z'', Z'''......

4): cpm P^{32} totales - - - - - - - - - - > 200 nmoles de ATP

: Z cpm - - - - - - - - - - - - - - - > W nmoles

: W nmoles por v \mul de enzima

: T = tiempo, en minutos

N nmoles/minuto/ml = \frac{W \ x \ factor \ de \ dilución (100 \ si \ 10 \mu l)}{10 \ (tiempo)}

Si la muestra ha sido diluida antes de la dosificación, multiplicar por el factor de dilución.

G nmoles/minuto/mg = \frac{N}{mg}

Preparación del ATP y AMPc

ATP frío: una vez en suspensión, utilizarlo enseguida o congelar a -20ºC. No descongelar y congelar repetidamente... !es muy frágil!. No conservar durante largo tiempo.

Preparar 5 ml de ATP 20 mM: pesar aproximadamente 70 mg y añadir 5 ml de Tris 50 mM, pH 7. De este ATP diluido a 1/1.000ésima, medir la D.O. con mucha precisión, a 260nm. calcular la concentración exacta sabiendo que:

1 mM \rightarrow DO_{260} = 15,4

o

10^{-5} m \rightarrow DO_{260} = 0,154

AMPc frío: prepararlo como el ATP, sólo es necesario disolver 32,9 mg/10 ml (se puede calentar un poco para disolverlo). Igualmente, determinar la concentración exacta, midiendo la DO a 260 nm, estando la solución diluida al 1/500ésima.

10^{-5} M \rightarrow DO_{260} = 0,154

Referencias de los productos utilizados:

: Tris: ref 8382 de Merck

: BSA, albúmina bovina: ref. A-4503, de Sigma

: Calmodulina o fosfodiesterasa 3':5'-activador nucleótido cíclico: ref. P 2277 de Sigma

: Imidazol: ref. I-0152 de Sigma.

: Líquido de centelleo: Optiphase "HiSafe 3", de LKB-Pharmacia

: ATP frío: ref. A-2383 (PM = 551,1) de Sigma

: ATP P^{32}: Amersham, 500 \muCi. PB 200 = alfa P^{32}

: AMPc frío: A-9501 de Sigma

: AMP H^{3}: Amersham [la dosis más baja (10\muCi)]

Preparación de una vacuna acelular Bordetella bronchiseptica

: Adsorción en hidróxido de aluminio

\bullet: Referencia del hidróxido de aluminio Al(OH)_{3}: Alhidrogel 3% Al(OH)_{3}, equivalente a 2% de Al_{2}O_{3} (Superfos Biosector als, Dinamarca).

\bullet: Tampón de dilución: tampón fosfato-NaCl 0,15M, pH = 6,8

Fórmula (concentrada 10 veces)

: PO_{4} 0,1M (es decir, Na_{2}HPO_{4}, _{2}H_{2}O 0,07M y NaH_{2} PO_{4}, H_{2}O, 0,03M)

: NaCl 1,5M

: pH = 6,8

diluir 10 veces en agua pirolizada en el momento de su utilización.

\bullet: Lavado del hidróxido de aluminio:

Se lavan, de 1 a 2 veces, 5 ml de Al(OH)_{3} concentrado en 50 ml de tampón.

Tras el segundo lavado, los 5 ml de Al(OH)_{3} lavados se llevan a un volumen total de 50 ml, es decir Al(OH)_{3} concentrado 2 veces con respecto a la concentración final (concentración final: 2 mg/ml).

El adyuvante así preparado se mezcla, volumen a volumen, con la fracción vacunal y se adsorbe durante una noche, a 4ºC, bajo agitación. La concentración final del Al(OH)_{3} en la vacuna lista para ser inyectada al animal es 1 mg/ml.

Claims

1. Composición inmunógena, caracterizada porque comprende una proteína adenil ciclasa-hemolisina (AC-Hly) o una parte inmunógena de esta AC-Hly, de una cepa de Bordetella elegida entre B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica y porque comprende además un extracto bacteriano que contiene los productos de la expresión de los genes vrg de una cepa de Bordetella elegida entre B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica, o una parte de estos productos de expresión, suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en el huésped al que se administra.

2. Composición inmunógena según la reivindicación 1, caracterizada porque comprende, además, una o varias adhesinas o toxinas de B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica, elegidas entre la FHA, los AGG o la PRN y la PTX.

3. Composición inmunógena según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque comprende la toxina PTX de B. pertussis, la toxina AC-Hly de B. pertussis y un extracto bacteriano que contiene las proteínas codificadas por los genes vrg de B. pertussis, o una parte de estas proteínas, suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en el huésped al que se administra.

4. Composición inmunógena según la reivindicación 3, caracterizada porque la toxina AC-Hly de B. pertussis está contenida en un extracto bacteriano que contiene todos o parte de los factores de virulencia del grupo de las adhesinas o toxinas de B. pertussis.

5. Composición inmunógena según la reivindicación 4, caracterizada porque la toxina AC-Hly de B. pertussis está presente en forma de extracto ureico denominado "extracto ureico vag".

6. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la toxina AC-Hly de B. pertussis está presente en forma de extracto ureico denominado "extracto ureico vrg" y porque el extracto bacteriano que contiene todas o parte de las proteínas codificadas por los genes vrg de B. pertussis es igualmente un extracto ureico denominado "extracto ureico vrg".

7. Composición inmunógena según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque contiene la toxina AC-Hly de B. parapertussis y un extracto bacteriano que contiene todas o parte de las proteínas codificadas por los genes vrg de B. parapertussis.

8. Composición inmunógena según la reivindicación 7, caracterizada porque la toxina AC-Hly de B. parapertussis está contenida en un extracto bacteriano que contiene todos o parte de los factores de virulencia del grupo de las adhesinas o toxinas de B. parapertussis.

9. Composición inmunógena según la reivindicación 8, caracterizada porque la toxina AC-Hly de B. parapertussis está presente en forma de extracto ureico denominado "extracto ureico vag".

10. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 7 u 8, caracterizada porque la toxina AC-Hly de B. parapertussis está presente en forma de extracto ureico denominado "extracto ureico vag" y porque el extracto bacteriano que contiene todas o parte de las proteínas codificadas por los genes vrg de B. parapertussis es igualmente un extracto ureico denominado "extracto ureico vrg".

11. Composición inmunógena según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque contiene la toxina AC-Hly de B. bronchiseptica y un extracto bacteriano que contiene todas o parte de las proteínas codificadas por los genes vrg de B. bronchiseptica.

12. Composición inmunógena según la reivindicación 11, caracterizada porque la toxina AC-Hly de B. bronchiseptica está contenida en un extracto bacteriano que contiene todos o parte de los factores de virulencia del grupo de las adhesinas o toxinas de B. bronchiseptica

13. Composición inmunógena según la reivindicación 12, caracterizada porque la toxina AC-Hly de B. bronchiseptica está presente en forma de extracto ureico denominado "extracto ureico vag".

14. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 11 ó 12, caracterizada porque la toxina AC-Hly de B. bronchiseptica está presente en forma de extracto ureico denominado "extracto ureico vag" y en la que el extracto bacteriano que contiene todas o parte de las proteínas codificadas por los genes vrg de B. bronchiseptica es igualmente un extracto ureico denominado "extracto ureico vrg".

15. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 11 a 14, caracterizada porque comprende además los componentes polipeptídicos característicos de los flagelos de B. bronchiseptica.

16. Composición inmunógena según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la toxina AC-Hly está en forma pura.

17. Composición inmunógena según la reivindicación 16, caracterizada porque la toxina ha sido reemplazada por fragmentos de AC-Hly que contienen al menos la parte C-terminal de la toxina y/o al menos un dominio interno de AC-Hly.

18. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la cepa de B. pertussis a partir de la cual se obtienen la toxina AC-Hly y las proteínas expresadas por los genes vrg es la cepa HAV registrada en la CNCM con el nº I-1485.

19. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 7 a 10, caracterizada porque la cepa de B. parapertussis a partir de la cual se obtienen la toxina AC-Hly y las proteínas expresadas por los genes vrg es la cepa nº 1 registrada en la CNCM con el nº I-1498.

20. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 11 a 15, caracterizada porque la cepa de B. bronchiseptica a partir de la cual se obtienen la toxina AC-Hly y las proteínas expresadas por los genes vrg es la cepa 973S registrada en la CNCM con el nº I-858.

21. Composición vacunal caracterizada porque comprende como principio activo una composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, asociada a un vehículo parafarmacéuticamente aceptable y llegado el caso, un adyuvante.

22. Composición vacunal según la reivindicación 21, caracterizada porque comprende como principio activo, una composición según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 y una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.

23. Composición vacunal según la reivindicación 22, caracterizada porque comprende, además, una composición según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

24. Composición vacunal según la reivindicación 21, caracterizada porque comprende, como principio activo, un "extracto ureico vag" de B. pertussis y un "extracto ureico vrg" de B. pertussis, siendo la cepa de B. pertussis preferentemente la cepa HAV registrada en la CNCM con el nº I-1485.

25. Composición vacunal según la reivindicación 21, caracterizada porque comprende, como principio activo, un "extracto ureico vag" de B. parapertussis y un "extracto ureico vrg" de B. parapertussis, siendo la cepa de B. parapertussis preferentemente la cepa nº 1 registrada en la CNCM con el nº I-1498.

26. Composición vacunal según la reivindicación 21, caracterizada porque comprende, como principio activo, un "extracto ureico vag" de B. bronchiseptica y un "extracto ureico vrg" de B. bronchiseptica, siendo la cepa de B. bronchiseptica preferentemente la cepa 973S registrada en la CNCM con el nº I-858.

27. Composición vacunal según la reivindicación 21, caracterizada porque comprende, como principio activo, un "extracto ureico vag" de B. pertussis y un "extracto ureico vrg" de B. pertussis, siendo la cepa de B. pertussis preferentemente la cepa HAV registrada en la CNCM con el nº I-1485 y un "extracto ureico vag" de B. parapertussis, siendo la cepa de B. parapertussis la cepa nº 1 registrada en la CNCM con el nº I-1498.

28. Composición vacunal según la reivindicación 27, caracterizada porque comprende además un "extracto ureico vag" de B. bronchiseptica, siendo la cepa de B. bronchiseptica preferentemente la cepa 973S registrada en la CNCM con el nº I-858.

29. Composición vacunal caracterizada porque comprende como principio activo una mezcla de extractos ureicos vag y vrg de cepas de B. pertussis y/o B. parapertussis y/o B. bronchiseptica.

30. Composición vacunal según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, caracterizada porque contiene además, a título de principio activo, otro componente inmunógeno, por ejemplo, una toxina o un agente patógeno inactivado.

31. Extracto bacteriano que contiene los factores de virulencia de Bordetella susceptibles de formar parte de las composiciones vacunales, como el obtenido a partir de cepas en fase I de B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica a través de las siguientes etapas:

-: Cultivo de las bacterias en medio sólido de Bordet Gengou con sangre (BGS) durante 48 horas para obtener colonias hemolíticas aisladas;

-: Resuspensión de algunas colonias en medio de Stainer líquido y extensión de 100\mul de esta suspensión en medio sólido de Stainer (CSM);

-: Tras 24-36 horas de cultivo a 36ºC, resuspensión de las bacterias en el medio de Stainer líquido y siembra en un frasco de 2 l que contenga 200 ml de medio de Stainer líquido, de tal forma que la densidad óptica a 650 nm sea 0,05;

-: Tras la siembra, cultivo durante 18-20 horas a 360ºC bajo agitación suave hasta obtener una densidad óptica a 650 nm de 1-1,2;

-: Dosificación de la actividad adenil ciclasa de la suspensión bacteriana así obtenida, sin diluir. Si ésta está comprendida entre 30 y 100 U/ml, el extracto ureico puede ser preparado;

-: Centrifugación de la suspensión bacteriana durante 30 minutos, a 5.000 g, a 4ºC;

-: Resuspensión del "pellet" bacteriano en la urea 5M preparada en el tampón PBS a razón de un volumen igual a 5 veces el peso húmedo del "pellet" bacteriano;

-: Agitación durante 1 hora a 4ºC y centrifugación posterior durante 40 minutos, a 40.000 g a 4ºC;

-: Conservación del sobrenadante a -80ºC hasta su utilización.

32. Extracto bacteriano que contiene los productos de la expresión de los genes vrg susceptibles de formar parte de las composiciones vacunales, como el obtenido a partir de cepas en fase IV de B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica a través de las siguientes etapas:

-: Cultivo de las bacterias en medio sólido de Bordet Gengou con sangre (BHS) durante 48 horas para obtener colonias hemolíticas aisladas;

-: Tras la siembra, cultivo durante 18-20 horas a 36ºC bajo agitación suave hasta obtener una densidad óptica a 650 nm de 1-1,2;

-: Centrifugación de la suspensión bacteriana durante 30 minutos, a 5.000 g a 4ºC;

-: Agitación durante 1 hora a 4ºC y centrifugar luego durante 40 minutos a 40.000 g a 4ºC;

-: Conservación del sobrenadante a -80ºC hasta su utilización.

33. Composición inmunógena según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizada porque el extracto bacteriano que contiene los productos de expresión de los genes vrg de una cepa de Bordetella elegida entre B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica, o una parte de estos productos de expresión, suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en el huésped al que se administre, esté sustituido por el extracto bacteriano de una cepa de B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica en la que el gen bvgS haya sido mutado de tal forma que la bacteria exprese esencialmente los genes vrg en detrimento de los genes vag.

34. Cepa de Bordetella caracterizada porque se trata de la cepa de B. pertussis HAV, registrada en la CNCM con el nº I-1485 o la cepa nº 1 de B. parapertussis, registrada en la CNCM con el nº I-1498.