JPH10510997A

JPH10510997A - キシラナーゼを含有する物動飼料添加剤

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Publication number: JPH10510997A
Application number: JP8522560A
Authority: JP
Inventors: カンプハンセン，ペーター; ワグナー，ペーター; ミュラーツ，アネッテ; ヘルマークナップ，インゲ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1995-01-26
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 1998-10-27
Anticipated expiration: 2016-01-26
Also published as: ES2169219T5; EP0805856B1; EP0805856B2; DE69617641T3; CA2209617A1; US7217433B2; CN1165614C; AU4431696A; DE69617641T2; JP3307947B2; US20020160080A1; CN1169752A; US5817500A; AU710547B2; EP0805856A1; BR9606935A; WO1996023062A1; US6245546B1; DE69617641D1; ES2169219T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、Humicolaの一菌株、Thermoascus の一菌株、Chaetomiumの一菌株、ケカビ Mucorの一菌株、アオカビ Talaromycesの一菌株、Malbranchea の一菌株、Myceliophthoraの一菌株、Thielavia の一菌株、Byssochlamusの一菌株又はPaecilomycesの一菌株由来の一成分キシラナーゼを包含する動物飼料添加剤に関する。別の局面において、本発明は、一成分キシラナーゼ製剤、ＤＮＡ構築物、組換え体発現ベクター、宿主細胞及び一成分キシラナーゼ製剤の製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】キシラナーゼを含有する動物飼料添加剤産業上の利用分野本発明は、Humicolaの一菌株、Thermoascus の一菌株、Chaetomiumの一菌株、ケカビ Mucorの一菌株、アオカビ Talaromycesの一菌株、Malbranchea の一菌株、Myceliophthoraの一菌株、Thielavia の一菌株、Byssochlamusの一菌株又はPa ecilomycesの一菌株由来の一成分キシラナーゼを包含する動物飼料添加剤に関する。他の局面では、本発明は一成分キシラナーゼ製剤、ＤＮＡ構築物、組換え体発現ベクター、宿主細胞及び一成分キシラナーゼ製剤の製造方法に関する。発明の背景動物飼料中の成分として用い得る植物原料の種類及び量は、それらを消化する動物の能力によりしばしば限定される。飼料増強酵素は、飼料消化性を改良することによりその利用効率を増大し得る、通常は微生物起源の酵素である。キシラン分解酵素（ＥＣ３．２．１．８）は、飼料増強酵素として十分公知である。バチルス属、アスペルギルス属、トリコデルマ属、アクレモニウム属の菌株から得られたキシラナーゼが報告されれいる。さらに、Humicola insolens の水中発酵により得られた酵素製剤が市販されている（Bio-Feed^TMPlus（Novo Nor disk A/S，Denmark から販売））。真菌 Thermomyces lanuginosus（別名 Humicola lanuginosa）の菌株から得られるキシラナーゼ製剤が記載されている（Lischnig T ，Purkarthofer H and Steiner W; Biotechnology Letters 1993,15(4)411-414; Gomes J，Purkarthofer H，Hayn M，Kapplmuller J，Sinner M，and Steiner W ，Appl．Microbiol．Biotechnol，1993，39 700-707）。しかしながら、飼料増強酵素としてのThermomyces lanuginosus の使用は開示されたことがない。さらに、従来技術に記載されたキシラナーゼ製剤はすべて、多数の酵素成分を包含する複合酵素製剤に関する。組換えＤＮＡ技術の使用によるThermomyces 由来の一成分キシラナーゼ製剤は開示されたことがない。多数の用途に関しては、多成分の協同的作用から生じる相乗効果のために、複合酵素製剤の使用が有益であると考えられる。いくつかの用途、例えばリグノセルロースの液体飼料原料又は燃料への変換、食物の処理加工に関しては、特に動物飼料の消化性の増大に関しては、キシラン分解及びセルロース分解酵素の混合物が最適性能を有すると考えられる（Alam M，Gomes I，Mohiuddin G，& Hoq MM ; Enzyme Microb．Technol，1994 16 298-302）。発明の要約本発明によれば、慣用的飼料増強酵素と比較した場合、Thermomyces lanugino sus 由来のキシラナーゼは動物飼料に付加した場合に飼料利用の有意の改良を示す優れた飼料増強酵素であることが判明した。さらに、優れた熱安定性のために、Thermomyces lanuginosus 由来のキシラナーゼは、微生物感染、特にサルモネラ属Salmonella感染を防止する条件下で飼料添加剤中に加工処理するのに特によく適している。Thermomyces lanuginosus由来のキシラナーゼは、消化物粘度の有意の低減を及ぼすということも判明したが、このことはニワトリ飼料転化効率の有意の改良を示す。最後に、組換えにより産生されるThermomyces キシラナーゼは元のキシラナーゼよりも有意により熱安定性であり、このことが組換えにより産生されるキシラナーゼを、微生物感染特にサルモネラ属Salmonella感染を防止する条件下で飼料添加剤中に加工処理するのに特によく適するようにする、ということが以外にも判明した。それゆえ、本発明の目的は、キシラナーゼ成分がThermomyces のある菌株又は関連する属から組換えＤＮＡ法により得られる一成分キシラナーゼ製剤を提供することである。したがって、その第一の局面において、本発明は、Humicolaの菌株、Thermoas cus の菌株、Chaetomiumの菌株、Mucor の菌株、Talaromyces の菌株、Malbranc hea の菌株、Myceliophthoraの菌株、Thielavia の菌株、Byssochlamusの菌株、 Paecilomycesの菌株由来の一成分キシラナーゼを包含する動物飼料添加剤を提供する。別の局面では、本発明は、製剤中のキシラナーゼ成分がHumicolaの菌株、Ther moascus の菌株、Chaetomiumの菌株、Mucor の菌株、Talaromyces の菌株、Malb ranchea の菌株、Myceliophthoraの菌株、Thielavia の菌株、Byssochlamusの菌株、Paecilomycesの菌株由来である一成分キシラナーゼ製剤を提供する。さらに別の局面では、本発明は、キシラナーゼ成分をコードするＤＮＡ配列であって、以下の：ａ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列又はビール酵母菌Saccharomyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分；又はｂ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分に類似したＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列に類似したＤＮＡ配列であって、ｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomy ces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と相同であるか；あるいはｉｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharo myces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と同一のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするか；あるいはｉｉｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccha romyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと少なくとも70％相同であるポリペプチドをコードするか；あるいはｉｖ）Thermomyces lanuginosus，DSM 4109 由来の精製キシラナーゼに対して生じる抗体と免疫学的に反応するか、もしくは配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドをコードする類似ＤＮＡ配列を包含するＤＮＡ配列から成るＤＮＡ構築物に関する。さらに別の局面において、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を保有する発現ベクター、ＤＮＡ構築物又は発現ベクターを包含する宿主細胞、及び本発明の一成分キシラナーゼ製剤の製造方法であって、酵素の産生を可能にする条件下で上記宿主細胞を培養し、培養から酵素を回収する工程から成る方法に関する。図面の簡単な説明添付の図面を参照しながら、本発明をさらに説明する。図１は、pH 2.5〜9 の範囲で、30℃で測定した本発明の一成分キシラナーゼの相対的キシラン分解活性（％）を示す。酵素は4.5 〜7.5 の範囲の、特に5.0 〜 6.5 の範囲の、およそ6 のpH最適値を有すると思われる。図２は、30〜80℃の範囲で、pH5.5 で測定した本発明の一成分キシラナーゼの相対的キシラン分解活性（％）を示す。酵素は、50〜70℃の範囲の、およそ60℃ の温度最適値を有すると思われる。図３は、本発明の一成分キシラナーゼ製剤（Ｉ）の、元のThermomyces lanugi nosus キシラナーゼ製剤（ＩＩ）と比較した場合の相対残留活性（％）を示す。残留活性は、それぞれ60、65、70及び75℃で60分間インキュベーション後にpH 6 .0で測定した。図４は、元のThermomyces lanuginosus キシラナーゼ（●）及びHumicola ins olens の培養により得られた多成分酵素製剤（×）間のコムギ粘度低減効率（標本中の用量（FXU/コムギ1 g））の比較の結果を示す。図５は、組換え的産生一成分Thermomyces lanuginosus キシラナーゼ（Ｉ）及び元のThermomyces lanuginosus キシラナーゼ（ＩＩ）間のコムギ粘度低減効率（標本中の用量（FXU/コムギ1g））の比較の結果を示す。図６は、キシラナーゼ付加（FXU/飼料1Kg）の一関数としてのコムギのAMEn値（MJ/kg）を示す；（Ａ）Thermomyces lanuginosus 一成分キシラナーゼ製剤；（Ｂ）元のThermomyces lanuginosus 一成分キシラナーゼ製剤；（Ｃ）参照（Bi o-Feed Plus CT，Novo Nordisk A/S，Denmark の製品；Humicola insolens の培養により得られる多成分酵素製剤）。図７は、キシラナーゼ付加（FXU/飼料1Kg）の一関数としての実験餌中の脂肪消化（％）を示す；（Ａ）Thermomyces lanuginosus 一成分キシラナーゼ製剤；（Ｂ）元のThermomyces lanuginosus 一成分キシラナーゼ製剤；（Ｃ）参照（Bio-Feed Plus CT，Novo Nordisk A/S，Denmark の製品；Humicola insolens の培養により得られる多成分酵素製剤）。本発明の詳細な開示動物飼料添加剤動物飼料に付加した場合、一つには腸粘度の低減のために、飼料増強酵素は植物細胞壁物質のin vivo 破壊を改良し（Bedford et al.，Proceedings of the 1 st Symposium on Enzymes in Animal Nutrition，1993，pp.73-77）、それにより動物が植物栄養素をより良好に利用できるようになる。そのため、動物の成長率及び／又は飼料転換率（即ち体重増分に対する摂取飼料重量）が改良される。本発明の情況では、動物飼料添加剤は、１つ又はそれ以上の飼料増強酵素及び適切な担体及び／又は賦形剤を包含し、動物飼料に付加するのに適した形態で提供される酵素製剤である。本発明の動物飼料添加剤は当業者に公知の方法により調製し得るし、乾燥又は液体製剤の形態をとり得る。製剤に含まれる酵素は、当業者に公知の方法により任意に安定化し得る。本発明の情況では、一成分キシラナーゼを包含する動物飼料添加剤は動物飼料に付加するのに適した形態で提供される酵素製剤であり、製剤中では、本質的にすべてのキシラン分解活性が単一キシラナーゼ成分に依っている。本発明の動物飼料添加剤は、飼料成分と用意に混合し得る粒状酵素物質であり得るし、さらに好ましくはプレミックスの一成分を構成し得る。粒状酵素物質は被覆されることもある。酵素粒子の粒子サイズは、好ましくは飼料及びプレミックス成分のサイズと相容性である。これは、酵素の飼料中への混入の安全且つ便利な手段を提供する。さらに、本発明の動物飼料添加剤は安定化液体組成物であって、水性又は油ベースのスラリーである。本発明の動物飼料添加剤は、in vitro（飼料の成分を改質することにより）又はin vivo でその効力を発揮する。本発明の飼料添加剤は、多量のアラビノキシラン及びグルクロノキシランを含有する動物飼料組成物、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ又はカラスムギ、あるいはトウモロコシのような穀物を含有する飼料に付加するのに特に適している。一成分キシラナーゼ製剤本発明は、Humicolaの菌株、Thermoascus の菌株、Chaetomiumの菌株、Mucor の菌株、Talaromyces の菌株、Malbranchea の菌株、Myceliophthoraの菌株、Th ielavia の菌株、Byssochlamusの菌株、又はPaecilomycesの菌株由来の一成分キシラナーゼを包含する動物飼料添加剤を提供する。好ましい実施態様では、本発明の動物飼料添加剤はThermomyces の菌株、特に Thermomyces lanuginosus 、最も好ましくはThermomyces lanuginosus，DSM 410 9、あるいはその突然変異体又は変種由来の一成分キシラナーゼを包含する。さらに特定の実施態様では、キシラナーゼは、以下の：ａ）Thermomyces lanuginosus，DSM 4109 由来の；又はｂ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分によりコードされるか；又はｃ）ビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされる精製キシラナーゼと同一の又は部分的に同一の（即ち少なくとも部分的に同一である）免疫化学的特性を有する。好ましくは、一成分キシラナーゼは、キシラナーゼ成分をコードする遺伝子を保有する宿主細胞に由来する。特に、一成分キシラナーゼは、ａ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列により、又はビール酵母菌 Sacc haromycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるか；あるいはｂ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分に、又はビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列に類似したＤＮＡ配列によりコードされ、類似ＤＮＡ配列は、ｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomy ces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と相同であるか；あるいはｉｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharo myces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と同一のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするか；あるいはｉｉｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccha romyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと少なくとも70％相同であるポリペプチドをコードするか；あるいはｉｖ）Thermomyces lanuginosus，DSM 4109 由来の精製キシラナーゼに対して生じる抗体と免疫学的に反応するか、もしくは配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドをコードする。さらに好ましい実施態様では、一成分キシラナーゼはさらに、ａ）pH6.0 で60℃で60分インキュベーション後に96％以上の残留酵素活性を有するか；ｂ）pH6.0 で65℃で60分インキュベーション後に83％以上の残留酵素活性を有するか；ｃ）pH6.0 で70℃で60分インキュベーション後に20％以上の残留酵素活性を有するか；及び／又はｄ）pH6.0 で75℃で60分インキュベーション後に10％以上の残留酵素活性を有することを特徴とする。類似ＤＮＡ配列本明細書中に記載したように、配列番号：１として示されるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と類似のＤＮＡ配列は、上記の（ｉ）〜（ｉｖ）に挙げた１つ又はそれ以上の特性を有するキシラン分解酵素をコードするあらゆるＤＮＡ配列を示すよう意図される。類似ＤＮＡ配列は、好ましくは、例えば本明細書中に記載した手法を用いて、配列番号：１で示されるＤＮＡ配列の、又はその適切な部分列（例えば20〜500 bp）のキシラナーゼコード部分を基礎にして、キシラナーゼ成分を産生する別の又は関連した（例えば同一の）生物から単離し得るので、したがって、例えば本明細書に示したＤＮＡ配列を包含するＤＮＡ配列の対立又は種変異体であり得る。あるいは類似配列は、例えばＤＮＡ配列によりコードされるキシラン分解酵素の別のアミノ酸配列を生じないが、しかし酵素の産生を意図された宿主のコドン使用法に相応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なるアミノ酸配列を生じ得るヌクレオチド置換の導入により、配列番号：１で示されるＤＮＡ配列の又はその適切な部分列のキシラナーゼコード部分を基礎にして構築し得る。ヌクレオチド置換を実施する場合、アミノ酸変化は好ましくは重要でない性質のもの、即ちタンパク質の折り畳み又は活性に有意に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換、典型的には１〜約30のアミノ酸の小欠失；例えばアミノ末端メチオニン残基のようなアミノ又はカルボキシル末端小伸長、約20〜25残基までの小リンカーペプチド、あるいはポリヒスチジン域、抗原エピトープ又は結合ドメインのような精製を促す小伸長である。保存的置換の例としては、塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リシン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えばグルタミン酸及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）及び小アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）群に属するものが挙げられる。ヌクレオチド置換の一般的説明に関しては、例えばFord et al.，Pro tein Expression and Purification，21991 95-97 参照。このような置換は分子の機能に決定的な領域外でなされ得るし、以前として活性キシラン分解酵素を生じるということは、当業者には明らかである。本発明のＤＮＡ構築物によりコードされるキシラナーゼの活性に不可欠な、したがって好ましくは置換を受けないアミノ酸は、当業者に公知の手法により、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−スキャニング突然変異誘発により同定し得る（例えば、Cunningham and Wells，Science 1989，244 1081-1085と比較）。後者の技法では、突然変異は分子中の残基毎に導入され、その結果生じる突然変異分子は、分子の活性に決定的なアミノ酸残基を同定するために生物学的（即ち、タンパク質分解）活性に関して試験される。核磁気共鳴分析、クリスタログラフィー又は光親和性標識のような技術により、基質−酵素相互作用の部位も確定し得る（例えば、de Vos et al.，Science， 1992，255 306-312; Smith et al.，J．Mol．Biol．1992，224，899-904; Wloda ver et al.，FEBSLett.,1992,309,59-54と比較）。配列番号：１として示されるＤＮＡ配列又はその任意の部分列のキシラナーゼコード部分は、キシラン分解酵素をコードする全ＤＮＡ配列、例えば配列番号：１として示されるＤＮＡ配列を単離するためのプローブとして用い得る、と理解される。上記の（ｉ）に示した相同性は、２つの配列間の同一性の程度として測定され、第二の配列から第一の配列が誘導されたことを示す。相同性は、GCG プログラムパッケージで提供されるGAP のような当業者に公知のコンピュータープログラムにより適切に確定し得る（Needleman S B & Wunsch C D; J．Mol．Bil．1970 ，48，443-453）。ＤＮＡ配列比較に関して以下の設定：GAP 創作ペナルティー 5.0及びGAP 延長ペナルティー 0.3でGAP を用いた場合、ＤＮＡ配列のコード領域は、配列番号：１で示されるＤＮＡ配列又はビール酵母菌 Saccharomycescer evisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分のコード領域と、好ましくは少なくとも70％、特に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、又は少なくとも95％もの同一性度を示す。上記の（ｉｉ）に示したハイブリダイゼーションは、類似ＤＮＡ配列が、以下の材料及び方法の項に詳述するある特定の条件下でキシラナーゼ成分をコードするＤＮＡ配列と同一のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることを示すよう意図される。使用するプローブは、酵素の少なくとも６〜７個のアミノ酸をコードする配列番号：１として示されるＤＮＡ配列又はその部分列のキシラナーゼコード部分を基礎にして、あるいは配列番号：２で示される推定アミノ酸配列を基礎にして構築するのが便利である。後者の場合、プローブは多数の低変性コドンに対応するアミノ酸配列から調製される。普通は、類似ＤＮＡ配列は、ＤＮＡはれと高度に相同性であり、例えば本発明のキシラナーゼ成分をコードする配列番号：１で示される配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも85％、少なくとも90％、又は少なくとも95％も相同である。上記の（ｉｉｉ）に示した相同性の程度は、２つの配列間の同一性の程度として測定され、これは一次配列の二次配列からの誘導を示す。相同性は、GCG プログラムパッケージで提供されるGAP のような当業者に公知のコンピュータープログラムにより適切に確定し得る（Needleman S B & Wunsch C D; J．Mol．Bil．1 970，48，443-453）。ポリペプチド配列比較に関して以下の設定：GAP 創作ペナルティー 5.0及びGAP 延長ペナルティー 0.3でGAP を用いた場合、類似ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドは、配列番号：１で示されるＤＮＡ配列又はビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分を包含するＤＮＡ構築物によりコードされる酵素と、好ましくは少なくとも70％、特に少なくとも80％、少なくとも 85％、少なくとも90％、又は少なくとも95％もの同一性度を示す。上記の方法にしたがって、ほとんどの従来技術のキシラナーゼに対する本発明のキシラナーゼのＤＮＡ相同性を、コンピュータープログラムGAP を用いて確定した。本発明のキシラナーゼは、Trichoderma reesei（Torronen A et al.，Bio technology，1992，10，11，1461-1465）からのキシラナーゼＩと63％のＤＮＡ相同性を、Co chliobolus carbonum（Apel P C et al.，Mol．Plant Microb．Interact.1993， 6，467-473）からのキシラナーゼとの63％のＤＮＡ相同性を示しただけであった。上記の（ｉｖ）の特性と関連した「由来」という用語は、Thermomyces lanugi nosus，DSM 4109 株により産生されるキシラナーゼ成分を示すだけでなく、この菌株から単離されたＤＮＡ配列によりコードされる、そして上記のＤＮＡ配列で形質転換される宿主細胞中で産生されるキシラナーゼ成分をも示すものとする。免疫学的反応性は、下記の材料と方法の項に記載する方法により確定し得る。飼料増強酵素さらに好ましい実施態様において、本発明の飼料添加剤はさらに別の飼料増強酵素を包含し得る。本発明の情況では、飼料増強酵素としては、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、特にラクターゼ、フィターゼ、β−グルカナーゼ、特にエンド− β−１，４−グルカナーゼ及びエンド−β−１，３（４）−グルカナーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼ、特にアラビノガラクタンエンド− １，４−β−ガラクトシダーゼ及びアラビノガラクタンエンド−１，３−β−ガラクトシダーゼ、エンドグルカナーゼ、特にエンド−１，２−β−グルカナーゼ、エンド−１，３−α−グルカナーゼ、及びエンド−１，３−β−グルカナーゼ、ペクチン分解酵素、特にペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、アラビナナーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナン−α−ラムノシダーゼ、ペクターゼリアーゼ、及びα−ガラクツロニシダーゼ、マンナナーゼ、β−マンノシダーゼ、マンナンアセチルエステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ及び脂肪分解酵素、例えばリパーゼ及びクチナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。微生物源本発明は、高温真菌類、即ちThermomyces 又は関連する属の群に属する菌株に由来するキシラナーゼを包含する動物飼料添加剤に関する。いくつかの種〔Appinis & Eggins，1966〕、特にThermomyces lanuginosus 種（別名Humicola lanuginosa）を含めたThermomyces 属は、古典的には高温真菌類〔Cooney & Emerson; 1964〕の群に関連していた。この群が属するいくつかの属、例えばHumicola,，Thermoascus 、Chaetomium、Mucor 、Talaromyces 、Mal branchea 、Myceliophthora、Thielavia の種[Cooney & Emerson; 1964]は、非常に有力な酵素生産者であることを経験している。さらに、Byssochlamus及びPa ecilomycesもこの群に関連していた。 Thermomyces の分類学的関係は、一般にあやふやであると認識されている。しかしながら、National Institute of Health database Entrez（1996年1 月更新）は、Thermomyces を有糸分裂胞子性Pyrenomycete（十分な情報が与えられないため特定の目にも特定の族にも関連しない不完全に特性表示されただけのPyreno myceteの略）と分類する。この属の系統発生学的関係をさらに明白にするためにこの情報を使用するために、最近の分子的研究はほとんどが、Thermomyces の１８Ｓ−ＲＮＡ配列の解明を試みてきた。利用可能なデータの試験的解釈は、Thermomyces がPlectomyces に、特にErotiales に属する真菌により密接に関係があることを示唆する。データベースにおける相同性探究を通して、Byssochlamusの１８Ｓ−ＲＮＡの配列は、Thermomyces lanuginosus の記載された配列（Novo Nordisk 1996,未発表データ）に最も関係のある配列である。Thermomyces 属に属するさらに多くの単離体の症例試験が予備的知見を支持している場合には、それはThermomyces 属のPlectomyces 目への移動を支持し得る。したがって、本発明はさらに、Plectomyces 、特にErotiales 由来のキシラナーゼ製剤に関する。ヌクレオチド及びタンパク質データベースに対する本発明のキシラナーゼを用いた相同性探究を実施した。相同性探究は、ほとんどの関連するキシラナーゼが Trichoderma reeseiからのキシラナーゼＩ及びCochliobolus carbonum からのキシラナーゼＩであることを示した。どちらのキシラナーゼもグリコシルヒドロラーゼのＩＩ族に属し（Henrissat B; Biochem．J．1991，280，309-316）、このことは本発明のキシラナーゼもこの族に属することを示す。 Thermomyces lanuginosus のいくつかの標本を委託されており、ブダペスト条約で認められた国際的委託機関、例えばアメリカ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ）（12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USA）から公的に利用できる。Thermomyces lanuginosus の菌株の一つは、International Recognit ion of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedur e at Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Cellkulturen(DSM),Mascher oder Weg 1b，DE-3300 Braunschweig，Germanyに、委託番号No．DSM 4109として、1987年 5月 4日にブダペスト条約にしたがって委託されてた。酵母菌ベクターｐＹＥＳ２．０中の本発明のエンドグルカナーゼをコードする配列番号：１として示される全長ＤＮＡ配列を包含するプラスミドＤＮＡを含有するビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 の菌株は、Internat ional Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of P atent Procedure at Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Cellkulture n(DSM),Mascheroder Weg 1b，DE-3300 Braunschweig，Germanyに、委託番号No． DSM 10133 として、1995年 7月19日にブダペスト条約にしたがって委託されてた。ＤＮＡ構築物さらに別の局面において、本発明は、キシラナーゼ成分をコードし、以下の：ａ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列又はビール酵母菌Saccharomyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分；又はｂ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分に類似したＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列に類似したＤＮＡ配列であって、ｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomy ces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と相同であるか；あるいはｉｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharo myces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と同一のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするか；あるいはｉｉｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccha romyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと少なくとも70％相同であるポリペプチドをコードするか；あるいはｉｖ）Thermomyces lanuginosus，DSM 4109 由来の精製キシラナーゼに対して生じる抗体と免疫学的に反応するか、もしくは配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomycescerevisia e DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドをコードする類似ＤＮＡ配列を包含するＤＮＡ配列から成るＤＮＡ構築物を提供する。本明細書中で記載する場合、「ＤＮＡ構築物」という用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はＲＮＡオリジンのあらゆる核酸分子を示すものとする。「構築物」という用語は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、当該キシラナーゼをコードする全又は部分天然ヌクレオチド配列を基礎にした核酸セグメントを示すものとする。構築物は任意にその他の核酸セグメントを含有し得る。キシラン分解酵素をコードする本発明のＤＮＡ構築物は、例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準技法にしたがって合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションによりキシラン分解酵素の全部又は一部をコードするＤＮＡ配列に関してスクリーニングすることにより得られるゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡオリジンであると都合がよい（例えば、Sambrook et al.，Molecular Cloning．A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，198 9 と比較）。キシラン分解酵素をコードする本発明の核酸構築物はさらに、確立された標準的方法、例えばBeaucageとCaruthers （TetrahedronLetters 1981，22，1859-1 869 ）が記載したホスホアミダイト法、又はMatthes 等（EMBO Journal，1984， 3，801-805）が記載した方法により合成的に調製し得る。ホスホアミダイト法によれば、例えば自動ＤＮＡ合成機でオリゴヌクレオチドを合成し、精製し、アニーリングし、結紮して適切なベクター中でクローニングする。さらに、核酸構築物は、標準技法にしたがって合成、ゲノム又はｃＤＮＡオリジン（適切な場合に）の断片を結紮することにより調製した合成及びゲノムＤＮＡの混合物、合成及びｃＤＮＡの混合物、又はゲノム及びｃＤＮＡオリジンの混合物で、断片は、完全核酸構築物の種々の部分に対応する。核酸構築物はさらに、例えば米国特許第4,683,202 号に、又はSaiki et al.， Science 1988，239，487-491に記載されているように、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により調製し得る。キシラナーゼ成分をコードするＤＮＡ配列は、Humicolaの菌株、Thermoascus の菌株、Chaetomiumの菌株、Mucor の菌株、Talaromyces の菌株、Malbranchea の菌株、Myceliophthoraの菌株、Thielavia の菌株、Byssochlamusの菌株、又は Paecilomycesの菌株に由来する。好ましい実施態様では、キシラナーゼ成分をコードするＤＮＡ配列は、Thermo myces の菌株、特にThermomyces lanuginosus の菌株に由来する。最も好ましい実施態様では、ＤＮＡ配列はThermomyces lanuginosus，DSM 4109、あるいはその突然変異体又は変異株のＤＮＡライブラリーに由来するか、又はそれを基礎にして産生される。キシラン分解酵素をコードするＤＮＡ配列は、慣用的方法により単離し得る。その方法の典型的例を以下に示す： −例えばThermomyces lanuginosus，DSM 4109株からの、又はビール酵母菌 S accharomyces cerevisiae DSM 10133中のプラスミドからのｃＤＮＡライブラリーを適切なベクター中でクローニングする。 −上記のベクターで適切な宿主細胞を形質転換する。 −ｃＤＮＡライブラリー中の１つ又はそれ以上のクローンによりコードされた所望のキシラン分解酵素を発現させるのに適した条件下で宿主細胞を培養する。 −このようなクローンにより産生される酵素のあらゆるキシラン分解活性を確定することにより陽性クローンをスクリーニングする。そして −このようなクローンから所望のキシラン分解酵素をコードするＤＮＡを単離する。一般的方法は、WO 93/11249 に開示されている（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。スクリーニング方法のさらに詳細な説明は、以下の実施例１で示す。キシラナーゼ成分をコードするＤＮＡ配列は、例えばThermomyces lanuginosu s の菌株のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、キシラン分解酵素を発現するクローンを選択する（例えば、１，４−βキシラン中の１，４−β−xylosi dic 結合を加水分解する酵素の能力により限定される）ことにより単離し得る。次いで、多トン実施例１したような標準手法により、クローンから適切なＤＮＡ配列を単離し得る。一般に好ましい実施態様では、本発明の核酸構築物は、配列番号：１で示されるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分を、遺伝暗号の縮重により、配列番号：１で示されるＤＮＡ配列とは異なるその任意の部分列上に包含する。本発明はさらに、下記の条件下で、配列番号：２で示されるアミノ酸配列又はその部分列をコードする核酸分子（ゲノム、合成又はｃＤＮＡ、あるいはＲＮＡ）とハイブリダイズする核酸配列を包含する。組換え体発現ベクター別の局面において、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を包含する組換え体発現ベクターを提供する。本発明の組換え体発現ベクターは、組換えＤＮＡ法を施されると便利であるあらゆるベクターであって、ベクターの選択は、しばしば、導入される宿主細胞に依っている。したがって、ベクターは、自律的複製ベクター、即ちその複製が染色体複製とは無関係である染色体外存在物として存在するベクター、例えばプラスミドである。あるいはベクターは、宿主細胞に導入した場合に宿主細胞ゲノムに一体化されて、それが一体化された染色体（単数又は複数）と一緒に複製されるものである。本発明のベクターの発現に際しては、キシラン分解酵素をコードするＤＮＡ配列は、好ましくはＤＮＡの転写に必要な別のセグメントに操作可能的に結合される。概して、発現ベクターはプラスミド又はウイルスＤＮＡに由来し、あるいは両方の要素を含有する。「操作可能的に結合される」という用語は、その意図される目的のために共同して機能するようにセグメントが配置される、例えばプロモーターで転写が開始し、キシラン分解酵素をコードするＤＮＡ配列を通じて進行することを示す。したがって、本発明の発現ベクターでは、キシラン分解酵素をコードするＤＮＡ配列は適切なプロモーター及びターミネーター配列と操作可能的に結合される必要がある。プロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示すあらゆるＤＮＡ配列であり、宿主細胞と同種の又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来する。細菌宿主細胞中で本発明のキシラン分解酵素をコードするＤＮＡの転写を指図するのに適したプロモーターの例としては、バチルス属 Bacillus stearothermo philus麦芽原性アミラーゼ遺伝子、バチルス属 Bacillus licheniformis α−アミラーゼ遺伝子、デンプン液化バチルス Bacillus amyloliquefaciens BAN アミラーゼ遺伝子、バチルス属 Bacillus subtilis アルカリ性プロテアーゼ遺伝子、又はバチルス属 Bacillus pumilus キシラナーゼ又はキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはラムダファージＰ_RあるいはＰ_Lプロモーター、又は大腸菌 E．coli lac 、trp 又はtac プロモーターが挙げられる。酵母菌宿主細胞で用いるのに適したプロモーターの例としては、酵母菌解糖遺伝子（Hitzeman et al.，J．Biol．Chem．255(1980),12073-12080; Alber and K awasaki，J．Mol．Appl．Gen．1(1982),419-434）、又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Young et al.，Genetic Engineering of Microorganisms for Ch emicals(Hollaender et al，eds.)，Plenum Press，New York，1982）からのプロモーター、あるいはＴＰ１１（米国特許第4,599,311 号）又はＡＤＨ２−４ｃ（Russell et al.，Nature 304(1983),652-654）プロモーターが挙げられる。糸状菌宿主細胞で用いるのに適したプロモーターの例としては、例えばＡＤＨ３プロモーター（McKnight et al.，The EMBO J．4(1985)，2093-2099）又はｔｐｉＡプロモーターがある。その他の有用なプロモーターの例としては、アスペルギルス属の Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Rhizomucor miehei アスパラギン酸プロテイナーゼ、黒色アスペルギルス Aspergillus niger又はAspergil lus awamori グルコアミラーゼ（ｇｌｕＡ）、Rhizomucor miehei リパーゼ、As pergillus oryzae アルカリ性プロテアーゼ、Aspergillus oryzae三炭糖ホスフェートイソメラーゼ又はAspergillus nidulansアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものが挙げられる。TAKAアミラーゼ及びgluAプロモーターが好ましい。本発明の発現ベクターはさらに、当該の宿主細胞中でベクターを複製させるＤＮＡ配列を包含する。発現ベクターは、選択性マーカー、例えばその生成物が宿主細胞中で欠損を補足する遺伝子、例えばジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子、又はSchizosaccharomy ces pombe TPI 遺伝子（Russell，P.R.,Gene 1985，40,125-130）、あるいは薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートに対する耐性を付与するものを包含し得る。糸状菌に関しては、選択性マーカーとしては、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｑＢ、ｎｉａＤ及びｓＣが挙げられる。宿主細胞の分泌経路にキシラン分解酵素を向けるためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても公知である）が発現ベクター中に提供される。分泌シグナル配列を正しい読取り枠でキシラン分解酵素をコードするＤＮＡ配列と連結する。分泌シグナル配列は、一般にキシラン分解酵素をコードするＤＮＡ配列の５’に位置する。分泌シグナル配列は、普通はキシラン分解酵素に関連するものであるか、又は別の分泌タンパク質をコードする遺伝子からのものである。好ましい実施態様では、本発明の発現ベクターは、例えばWO 86/05812 に記載されているような Bacillus licheniformis α−アミラーゼ遺伝子の分泌シグナルコード配列と実質的に同一の分泌シグナル配列を包含し得る。さらに、発現の増幅に関する測定を、例えば単一又は二重交差を含めた双頭増幅法により、あるいは、例えば米国特許第4,959,316 号又はWO 91/09129 に記載されているようなマルチコピー法により実施し得る。あるいは発現ベクターは、例えば欧州特許第283,075 号に記載されているような複製の感温性オリジンを含み得る。キシラン分解酵素をコードするＤＮＡ配列、プロモーター及び任意にターミネーター及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれ結紮し、複製に必要な情報を含有する適切なベクター中に挿入する手法は、当業者には十分公知である（例えばSambrook et al.，Molecular Cloning．A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY,1989と比較）。宿主細胞さらに別の局面において、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物及び／又は本発明の組換え体発現ベクターを包含する宿主細胞を提供する。本発明のＤＮＡ構築物は、当該の宿主と同種又は異種である。宿主と同種である場合、即ち宿主により自然に産生される場合は、それは典型的には別のプロモーター配列と、あるいは適用可能な場合には、その自然環境と違う別の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列と操作可能的に連結される。この情況では、「同種の」という用語は、当該の宿主生物に生得のキシラン分解酵素をコードするｃＤＮＡ配列を含むものとする。「異種の」という用語は、自然に宿主細胞が発現しないＤＮＡ配列を含むものとする。したがって、ＤＮＡ配列は別の生物からのものであるか、又は合成配列である。本発明のＤＮＡ構築物又は組換え体発現ベクターが導入される本発明の宿主細胞は、キシラン分解酵素を産生し得るあらゆる細胞であり得る。その例としては、細菌、酵母菌、真菌及び高等真核細胞が挙げられる。培養時に本発明のキシラン分解酵素を産生し得る細菌宿主細胞の例としては、グラム陽性細菌、例えばバチルス属 Bacillus の菌株、特に枯草菌 Bacillus su btilis、Bacillus lichniformis 、 Bacilluslentus 、短バチルス Bacillus b revis 、Bacillus stearot hermophilus 、Bacillus alkalophilus 、デンプン液化バチルス Bacillus amyl oliquefaciens 、 Bacillus coagulans 、 Bacillus circulans 、 Bacillus la utus、巨大菌 Bacillus megatherium 、 Bacillus pumilus 、 Bacillus thurin giensis 又は Bacillus agaradherensの菌株、あるいはストレプトミセス属 Str eptomyces の菌株、特に Streptomyces lividans又は Streptomyces murinus の菌株、もしくはグラム陰性細菌、例えば大腸菌 Echerichia coliが挙げられる。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換により、又はそれ自体公知である方法でコンピテント細胞を用いて実行し得る（Sambrook et al.，Molecular Cloni ng．A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY,1989と比較）。大腸菌のような細菌中でキシラン分解酵素を発現させる場合、キシラナーゼは典型的には不溶性粒子（封入体として公知である）として細胞質中に保持されるか、又は細菌分泌配列により細胞周辺腔に向けられる。前者の場合、細胞を溶解し、粒子を回収して、変性した後、変性剤を希釈してキシラン分解酵素を再生する。後者の場合、細胞を破裂させることにより、例えば音波処理又は浸透圧ショックにより、細胞周辺腔の内容物を放出させて、キシラン分解酵素を回収し得る。適切な酵母菌細胞の例としては、サッカロミセス属 Saccharomyces種、特にビール酵母菌 Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces kluyveri及びSaccharo myces uvarumの菌株の細胞、シゾサッカロミセス属 Schizosaccharomyces種、例えば Schizosaccharomyces pombeのの細胞、クルイベロミセス属 Kluyveromyces 、例えばKluyveromyces lactisの細胞、ハンセヌラ属Hansenula 、例えばHansen ula polymorphaの細胞、Pichia、例えばPichia pastoris の細胞（Gleeson et a l.，J．Gen．Microbiol．132，1986，pp.3459-3465; 米国特許第4,882,279 号を比較）、並びにYarrowia種、例えばYarrowia lipolyt ica の細胞が挙げられる。異種ＤＮＡで酵母菌細胞を形質転換し、そこから異種ポリペプチドを産生するための方法は、例えば米国特許第4,599,311 号、米国特許第4,931,373 号、米国特許第4,870,008 号、米国特許第5,037,743 号及び米国特許第4,845,075 号に記載されている（これらの記載内容はすべて参照により本明細書中に含まれる）。選択性マーカーにより確定される表現型、一般に薬物耐性又は特定の栄養素、例えばロイシンの非存在下で成長する能力により、形質転換細胞を選択する。酵母菌中で使用するのに好ましいベクターは、米国特許第4, 931,373 号に開示されているＰＯＴＩベクターである。本発明のキシラン分解酵素をコードするＤＮＡ配列は、例えば上記のようなシグナル配列に、任意にリーダー配列に先行され得る。その他の真菌細胞の例としては、糸状菌、例えばアスペルギルス属 Aspergill us種、特に Aspergillus japonicus、Aspergillus oryzae、Aspergillus nidula ns又は黒色アスペルギルス Aspergillus niger、Neurospora種、Fusarium種、特にFusarium oxysporum 又はFusarium graminearum、あるいはTrichoderma 種の細胞が挙げられる。それ自体公知である方法でのプロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換とその後の細胞壁の再生を含めた工程により真菌細胞を形質転換する。タンパク質の発現のためのアスペルギルス属 Aspergillus種の使用は、例えば欧州特許第272,277 号及び欧州特許第230,923 号に記載されている。例えばF．oxysporumの形質転換は、Malardier et al.，Gene，1989，78，147-156 に記載されているように実施し得る。宿主微生物としてのアスペルギルス属Aspe rgillus の使用は、例えば欧州特許第280,023 号に記載されている（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。好ましい実施態様では、宿主細胞はAspergillus oryzaeの菌株である。一成分製剤の製造方法さらに別の局面において、本発明は、キシラン分解酵素をコードするＤＮＡ配列で形質転換された適切な宿主細胞が酵素の産生を可能にする条件下で培養され、その結果生じる酵素が培養から回収される本発明のキシラン分解酵素の製造方法を提供する。さらに別の局面において、本発明は、酵素をコードするＤＮＡ配列で形質転換された適切な宿主細胞がキシラナーゼ成分の産生を可能にする条件下で培養され、その後培養からキシラナーゼ成分が回収される一成分キシラナーゼ製剤の製造方法に関する。好ましい実施態様では、酵素をコードするＤＮＡ配列は上記の様にして得られるＤＮＡ構築物である。別の好ましい実施態様では、ＤＮＡ構築物は、上記のような発現ベクター中で適切な発現シグナルと結び付けられる。さらに別の好ましい実施態様では、宿主細胞は上記のものである。形質転換宿主細胞を培養するために用いる培地は、当該宿主細胞を成長させるのに適したあらゆる慣用的培地である。発現されたキシラン分解酵素は、培地中に分泌され、精製によりそこから回収されると便利である。十分公知の精製手順としては、遠心分離又は濾過により培地から細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩を用いて培地のタンパク質様成分を沈殿させ、クロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。実施例以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。材料及び方法ドナー生物十分な通気を確保するために攪拌しながら、キシラン含有発酵培地中で増殖させたThermomyces lanuginosus DSM 4109から、ｍＲＮＡを単離した。増殖３〜５日後に菌糸体を収穫し、直ちに液体窒素中で凍結させて、−80℃で保存した。酵母菌株以下で使用したビール酵母菌 Saccharomyces cerevisiae株はJG 169（MAT α ；ura 3-52; leu 2-3，112; his 3-D200; pep 4-113; prb1:: LEU2; cir+）である。プラスミド発現のために市販の酵母菌プラスミドｐＹＥＳ２．０（Invitrogen）を用いた。 Aspergillus 発現ベクターｐＨＤ４１４は、欧州特許第238 023 号に記載されたプラスミドｐ７７５の誘導体である。ｐＨＤ４１４の構築は、WO 93/11249 にさらに詳しく記載されている。全ＲＮＡの抽出グアニジニウムチオシアネートを用い、その後5.7 M CｓＣｌを通して超遠心分離して全ＲＮＡの抽出を実施し、WO 93/11249 に記載された手法を用いてオリゴ（ｄＴ）−セルロースアフィニティークロマトグラフィーによりポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成及び修飾ヘアピン修飾を用いて、ＲＮアーゼＨ法（Gubler U，Hoffman B J，Gene 1983 ，25，263-269; Sambrook et al.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY，1989）によりポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ 5μg から二本鎖ｃＤＮＡを合成した。本手法はさらに詳しくWO 93/11249 に記載されている。緑豆ヌクレアーゼで処理した後、ｄｓｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Invitorgen）で盲端化して、メーカーの使用説明書にしたがって、ｃＤＮＡを非パリンドローム性ＢｓｔＸＩアダプター（1 μg ／μ1 ，Invitrogen）に結紮した。ｃＤＮＡライブラリーの構築適用ｄｓｃＤＮＡを遠心分離により回収し、70％ＥｔＯＨ中で洗浄し、Ｈ₂ Ｏ 25 ml中に再懸濁した。大規模ライブラリー結紮前に、各々ｄｓｃＤＮＡ（反応試験管＃１〜＃３）１μl 、Ｔ４リガーゼ（Invitrogen）2単位、並びにＢｓｔＸＩ切断酵母菌発現ベクター（ｐＹＥＳ２．０ベクター，Invitrogen、又はｙＨＤ１３）50ng（試験管＃１）、100ng（試験管＃２）及び200 ng（試験管＃３及び＃４）を含有する結紮緩衝液（上記と同様）10μl 中で４回の試験結紮を実施した。最適条件を用いて、結紮緩衝液 40μl 中で大規模結紮を開始した。アリコート1 μl をエレクトロコンピテント大腸菌1061細胞中で形質転換し、形質転換細胞を滴定して、ライブラリーをＬＢ＋アンピシリンプレート上に5000〜7000 c.f .u./プレートで平板化した。各プレートに、培地 3 ml を付加した。細菌を掻き取り、グリセロール 1mlを付加して、プールとして−80℃で保存した。残りの2 mlをＤＮＡ単離用に用いた。この方法のさらなる詳細に関しては、WO 94/14952 を参照されたい。酵母菌ライブラリーの構築全細菌クローンが酵母菌で確実に試験されるようにするために、元のプールの細菌クローン数の５倍の数の酵母菌形質転換株を限度として設定した。個々のプールからの精製プラスミドＤＮＡ（100 ng／μｌ）のアリコート 1μ l をコンピテントビール酵母菌 Saccharomyces cerevisiae JG169細胞（YPD 50 0 ml中に OD₆₀₀=1.5。冷DIW で2 回、冷 1 M ソルビトール中で1 回洗浄。1 M ソルビトール 0.5mlに再懸濁（Becker D.M.，Guarante L，Methods Enzymol． 1991，194，182-187））40μl 中で電気泳動処理（200 Ω，1.5kV,25μF）した。1 M 冷ソルビトール 1mlを付加後、アリコート80μl をＳＣ＋グルコース−ウラシル上に置いて、250 〜400 c.f.u.／プレートを得て、30℃で3 〜5 日間インキュベートした。陽性コロニーの同定 3 〜5 日間増殖後、寒天プレートを、0.2 ％アズリン−架橋樺キシラン（AZCL^TM 樺キシラン，Megazyme^TM，Australia）及び2 ％ガラクトースを含有するＳＣ −ウラシルプレート上でレプリカ平板化し、その後キシラン分解活性の検出のために30℃で2 〜4 日間インキュベートした。インキュベーション後、キシラン分解酵素陽性コロニーを周囲に青色暈を有するコロニーとして同定した。酵素陽性コロニーからの細胞を単一コロニーのために寒天上に広げ、酵素産生単一コロニーを、同定されたキシラン分解酵素産生コロニーの各々に関して選択した。陽性コロニーの特性表示陽性コロニーを単一コロニーとして得た。２つの陽性酵母菌コロニーから調製した細胞培養から、プラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡを大腸菌中に導入（形質転換）し、単離して、チェーンターミネーション法（Sanger et al .，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．1977，74，5463-5467）及びシーケナーゼSe quenase ^TM系（United States Biochemical )を用いて各ｃＤＮＡクローンの5' 末端をシーケンシングすることにより、別々に特性表示した。アスペルギルス属中での発現のためのｃＤＮＡ遺伝子の単離１つ又はそれ以上のキシラン分解酵素産生酵母菌コロニーを50mlガラス試験管中のＹＮＢ−１ブロス 20ml中に接種した。試験管を30℃で2 日間振盪した。30 00 rpmで10分間遠心分離して細胞を収穫した。 WO 94/14952 にしたがって単離したＤＮＡを水50 μl 中に溶解させた。ＤＮＡのアリコートをWO 94/14952 に記載されたように大腸菌で形質転換させた。標準手法を用いて大腸菌からプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析により分析した。適切な制限酵素を用いてｃＤＮＡ挿入物を切り取り、アスペルギルス属発現ベクターに結紮した。 Aspergillus oryzae又は黒色アスペルギルスAspergillus niger の形質転換一般的手法ＹＰＤ（Sherman et al.，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，1981）100ml にAspergillus oryzae又は黒色アスペルギルスAsperg illus niger を植えつけて、振盪しながら37℃で約 2日間インキュベートした。濾過により菌糸体を収穫し、0.6 M ＭｇＳＯ₄ 200mlで洗浄した。菌糸体を15ml の1.2 M ＭｇＳＯ₄及び10mM ＮａＨ₂ＰＯ₄，pH5.8 中に懸濁した。懸濁液を氷上で冷却し、120 mgのNovozym ^TM 234，バッチ1687を含有する緩衝液 1mlを付加した。５分後、12mg／mlＢＳＡ（Sigma，H25型）1 mlを付加し、顕微鏡下で検査される標本中に多数のプロトプラストが目に見えるようになるまで、37℃で1.5 〜2.5 時間、静かに攪拌しながらインキュベーションを継続した。懸濁液をミラクロスmiracloth を通して濾過し、濾液を滅菌試験管に移して、その上を5 mlの0.6 M ソルビトール，100 mM Tris-HCl，pH7.0 の層で覆った。100 g で15分間遠心分離し、ＭｇＳＯ₄クッションの上部からプロトプラストを収集した。ＳＴＣ（1.2 M ソルビトール、10 mM Tris-HCl，pH7.5 、10mM ＣａＣｌ₂）2 容量をプロトプラスト懸濁液に付加し、混合物を1000 g で5 分間遠心分離した。プロトプラストペレットをＳＴＣ 3 ml 中に再懸濁して、再ペレット化した。これを繰り返した。最後に、プロトプラストを0.2 〜1ml のＳＴＣ中に再懸濁した。プロトプラスト 100μl をＳＴＣ 10μl 中の適切なＤＮＡ 5〜25μg と混合した。プロトプラストをｐ３ＳＲ２（Aspergillus nidulans amdS 遺伝子保有プラスミド）と混合した。混合物を室温で25分間放置し、0.2 mlの60％ＰＥＧ4000 （ＢＤＨ 29576）、10 mM ＣａＣｌ₂及び10 mM Tris-HCl，pH7.5 を付加し、注意深く混合して（２回）、最後に同一溶液 0.85 mlを付加して、注意深く混合した。混合物を室温に25分間放置し、2500 gで15分間回転させて、ペレットを1.2 M ソルビトール 2 ml 中に再懸濁した。もう一度沈殿させた後、プロトプラストを適切なプレート上に広げた。プロトプラストを、1.0 M スクロース，pH7.0 、窒素源として10 mM アセトアミド及び20 mM ＣｓＣｌを含有する最少プレート（Cove，Biochem．Biophys．Acta 1966，113，51-56）上に広げて、バックグラウンド増殖を阻止した。37℃で4 〜7 日間インキュベーション後、胞子を摘み取って単一コロニー用に広げた。この操作を繰り返し、二次再単離後の単一コロニーの胞子を限定形質転換株として保存した。 Aspergillus oryzae形質転換株の試験各々の形質転換株をＹＰＭ（以下と比較）10ml中に接種し、繁殖させた。30℃ で2 〜5 日間インキュベーション後、上清を取り出した。上清 10μl を直径 4 mmの孔を開けた、0.2 ％ＡＺＣＬ^TM樺キシラン（Mega zyme^TM，Australia）を含有する寒天プレートに塗布して、キシラン分解活性を確かめた。その場合、キシラン分解活性は青色暈として同定された。ハイブリダイゼーション条件本発明のオリゴヌクレオチドプローブ及び「類似」ＤＮＡ配列間のハイブリダイゼーションを確定するための適切なハイブリダイゼーション条件を以下に記載する。ハイブリダイゼーションに用いられる適切なオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号：１で示されるＤＮＡ配列又はその任意の部分列のキシラナーゼコード部分を基礎にして、あるいは配列番号：２で示される推定アミノ配列を基礎にして調製し得る。適切なプローブの例は、配列番号：１のキシラナーゼコード部分に対応するＤＮＡ配列、即ち配列番号：１中の位置37〜705 のヌクレオチドである。ハイブリダイズするためのＤＮＡ断片を含有するフィルターを5 x ＳＳＣ中に予備浸漬し、5 x ＳＳＣ、5 x Denhardt 溶液、50mMリン酸ナトリウム，pH 6.8 、及び50μg の変性音波処理仔ウシ胸腺ＤＮＡの溶液中で約50℃で１時間、予備ハイブリダイズした。50μCi３２−Ｐ−ｄＣＴＰ標識化プローブを補充した同一溶液中で、〜45℃で18時間ハイブリダイゼーション後、好ましくは55℃以下で、特に60℃以下、65℃以下、70℃以下、75℃以下、好ましくは80℃以下で30分間、生成物を 2 xＳＳＣ,0.2％ＳＤＳ中で３回洗浄した。この条件下でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子を、Ｘ線フィルムを用いて検出した。免疫学的交差反応性免疫学的交差反応性を確定する場合に用いられる抗体は、精製キシラン分解酵素の使用により調製し得る。さらに、本発明の酵素に対する抗血清は、Axelsen et al.,; A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Bla ckwell Scientific Publications，1973（特に第23章）に記載の、又はJoheston e and Thorpe; Immunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publicat ions，1982（特にpp.27-31）に記載の手法にしたがって、免疫化ウサギ（又はその他の齧歯類）により生じさせ得る。精製イムノグロブリンは、例えば塩沈殿（（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄）と、その後の透析、及び例えばＤＥＡＥ−Sephadex上でのイオン交換クロマトグラフィーにより、抗血清から得られる。タンパク質の免疫化学的特性表示は、オクテルロニー二重拡散分析（Ouchterlony，O.；Handbook of Experimental Immunology(D.M．We ir，Ed.),Blackwell Scientific Publications，1967，pp.655-706;又はRoitt， I.；Essential Immunology，Blackwell Scientific Publications，1984，pp.14 5-147）によるか、交差免疫電気泳動（Axelsen et al.，上記。第３及び４章）により、又はロケット免疫電気泳動（Axelsen et al.，上記。第２章）により実行し得る。培地ＹＰＭ培地：酵母菌抽出物 10 g、ペプトン 10g 、Ｈ₂Ｏで810 mlにする。オートクレーブ処理し、滅菌濾過した20％マルトデキストリン 90ml を付加する。ＹＰＤ培地：酵母菌抽出物 10 g、ペプトン 10 g 、Ｈ₂Ｏで810 mlにする。オートクレーブ処理し、滅菌濾過した20％グルコース 90ml を付加する。 10 x 基礎塩培地：酵母菌窒素基剤 66.8 g 、コハク酸 100 g、ＮａＯＨ 6 0g 、Ｈ₂Ｏを加えて1000mlとし、滅菌、濾過する。ＳＣ−ＵＲＡ： 10 x 基礎塩90 ml、20％カザミノ酸 22.5 ml 、１％トリプトファン 9 ml 、Ｈ₂Ｏを加えて806 mlとし、オートクレーブ処理して、５％トレオニン 3.6 ml 及び20％グルコース又は20％ガラクトース 90 ml を付加する。ＳＣ−Ｈブロス：アミノ酸を含まない酵母菌窒素基剤 7.5 g/l、コハク酸 1 1.3 g/l、ＮａＯＨ 6.8 g/l、ビタミンを含まないカザミノ酸 5.6 g/l、トリプトファン0.1 g/l。121 ℃で20分間オートクレーブ処理。オートクレーブ処理後、30％ガラクトース溶液 10ml、30％グルコース溶液 5 ml 及び5 ％トレオニン溶液 0.4 mlを培地 100ml当たりで付加した。ＳＣ−Ｈ寒天：アミノ酸を含まない酵母菌窒素基剤7.5 g/l、コハク酸 11.3 g/l、ＮａＯＨ 6.8 g/l、ビタミンを含まないカザミノ酸 5.6 g/l、トリプトファン0.1 g/l、及び寒天（Bacto^TM） 20 g/l。121 ℃で20分間オートクレーブ処理。オートクレーブ処理後、22％ガラクトース溶液 55ml 及び5 ％トレオニン溶液 1.8mlを寒天 450ml当たりで付加した。ＹＮＢ−１寒天：ＫＨ₂ＰＯ₄ 3.3 g/l、寒天 16.7 g/l、pHを７に調整。1 21 ℃で20分間オートクレーブ処理。オートクレーブ処理後、アミノ酸を含まない13.6％酵母菌窒素基剤 25 ml、40％グルコース溶液25 ml、1 ％Ｌ−ロイシン溶液 1.5 ml及び1 ％ヒスチジン溶液 25mlを寒天450 ml当たりで付加した。ＹＮＢ−１ブロス：ＹＮＢ−１寒天と同じ組成物。但し寒天を含まない。キシラン分解活性基質としてレマゾール−キシラン（レマゾールブリリアントブルーＲ，Fluka で染色した４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロノ−Ｄ−キシラン）を用いて、pH6.0 で測定したキシラン分解酵素活性は、FXU-単位で表される。キシラナーゼ標本をレマゾール−キシラン基質とともにインキュベートした。非分解染色基質のバックグラウンドをエタノールで沈殿させた。上清中の残りの青色（585 nmで分光測光法で測定した場合）は、キシラナーゼ活性に比例し、その場合、キシラナーゼ単位を、標準反応条件、即ち50.0℃、pH6.0 で反応時間30 分での酵素基準に対して相対的に確定した。より詳細にこの分析法を記載するペーパーファイルＡＦ293.6/1は、Novo Nord isk A/S、Denmark に要請すれば利用可能である（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。実施例１遺伝子の単離 150のプール中に約1.5 x 10⁸個の個々のクローンから成るThermomyces lanugi nosus からのライブラリーを構築した。ライブラリーからの20個の個々のクローンからＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡ挿入に関して分析を施した。挿入頻度は＞90％であることが判明し、平均挿入サイズは約1400 bp であった。いくつかのプールからのＤＮＡを酵母菌中で形質転換し、200 〜500 個の酵母菌コロニーを含有する50〜100 個のプレートを各プールから得た。3 〜5 日間増殖させた後、寒天プレートを数組の寒天プレート上でレプリカ平板化した。次いで、0.1 ％ＡＺＣＬ^TMキシラン（Megazyme^TM，Australia）を含有する１組のプレートを30℃で3 〜5 日間インキュベートして、キシラナーゼ活性を検出した。陽性コロニーを、青色暈に取り囲まれたコロニーとして確認した。あるいは、１組のプレートを30℃で3 〜5 日間インキュベートした後、適切なpHを有する緩衝液中に0.1 ％ＡＺＣＬ^TMキシラン及び1 ％アガロースを含有するキシランオーバーレイゲルでオーバーレイした。30℃で1 〜2 日間インキュベーション後、陽性コロニーを青色暈に取り囲まれたコロニーとして確認した。酵素陽性コロニーからの細胞を寒天上に単一コロニー単離のために広げ、酵素産生単一コロニーを、確認されたキシラナーゼ産生コロニーの各々に関して選択した。陽性コロニーの特性表示陽性コロニーを単一コロニーとして得た。ビオチニル化ポリ輪禍プライマーを用いてｃＤＮＡ挿入物を酵母菌コロニーから直接増幅させ、磁気ビーズ（Dynabe ad^TM M-280，Dynal ）系により精製して、チェーンターミネーション法（Sanger et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.U.S.A.1977,74,5463-5467）及びシーケナーゼ Sequenase^TM系（United States Biochemical）を用いて各ｃＤＮＡクローンの5' 末端をシーケンシングすることにより、別々に特性表示した。ＤＮＡ配列は配列番号：１として示され、これは配列番号：２として示されるアミノ酸配列に対応する。酵母菌ＤＮＡの単離クローン化される遺伝子のＰＣＲエラーを避けるために、例えばWO 93/11249 （この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）の実施例１に記載されたような標準手法により、酵母菌プラスミドからｃＤＮＡを単離した。酵母菌ＤＮＡを水 50 μl に溶解して、最終濃度を約100μl ／mlとした。標準手法により、ＤＮＡを大腸菌中で形質転換させた。２つの大腸菌コロニーを各形質転換から単離し、ＤＮＡ挿入物を切り取る制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩを用いて分析した。これらのクローンの１つからのＤＮＡを酵母菌JG 1 69中で再形質転換させた。いくつかの陽性コロニーのＤＮＡ配列を部分的に確定した。本発明のキシラナーゼのＤＮＡ配列は配列番号：１で示され、これは配列番号：２として示されるアミノ酸配列に対応する。実施例２アスペルギルス属における発現アスペルギルス中で遺伝子を発現させるために、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ又はその他の適切な制限酵素で消化して上記のクローンの１つからｃＤＮＡを単離し、ゲル上でサイズ分別し、精製して、次いでｐＨＤ４１４に結紮し、プラスミドｐＡ２ＸＩＴＩを生じた。大腸菌中で増幅後、上記の材料と方法の項に記載の一般的手法にしたがって、プラスミドをAspergillus oryzaeの菌株中で形質転換した。 Aspergillus oryzae形質転換株の試験各々の形質転換株をＹＰＭ培地 10 ml中に接種した。30℃で3 〜5 日間インキュベーション後、250 rpm で回転させて、上清を取り出した。上清 10 μl を直径 4 mmの孔を開けた、適切なpHの緩衝液中に0.2 ％ＡＺＣＬ^TMキシラン（Megaz yme^TM，Australia）を含有する寒天プレートに塗布して、40℃で一夜インキュベートして、キシラン分解活性を確定した。キシラナーゼ活性を上記と同様に確かめた。形質転換株のいくつかは、Aspergillus oryzaeバックグラウンドより有意に大きい暈を有した。これは、Aspergillus oryzaeにおけるキシラナーゼの有効な発現を立証する。最高キシラナーゼ活性を示す８個の形質転換株を選択し、ＹＰＧ−寒天上に接種して、保持した。８個の選択された形質転換株の各々を、ＹＰＧ−寒天斜面培養基からＦＧ−４及びＭＤＵ−２培地を入れた500 ml振盪フラスコ上に接種した。良好な通気を確保するために十分攪拌しながら 3〜5 日間発酵させた後、培養ブロスを2000 gで 10分間遠心分離し、上清を分析した。各上清の15μl の容量を、0.1 ％ＡＺＣＬ^TMキシランオーバーレイゲルに開けた直径4 mm の孔に適用した（直径13cmのペトリ皿中に25ml）。キシラナーゼ活性を、インキュベーション時の青色暈の形成により確かめた。次いで、炭素供給源としてのマルトデキストリン、窒素供給源としての尿素及び酵母菌抽出物を包含する培地中で、キシラナーゼを発酵させた。Aspergillus oryzae宿主細胞の振盪フラスコ培養を、炭素供給源3.5 ％及び窒素供給源0.5 ％を包含する培地中に接種して発酵を実行した。pH 5.0で34℃で24時間培養後、さらなる炭素及び窒素供給源の連続供給を開始した。炭素供給源を制限因子として保持し、酸素が余分に存在することを保証した。培養を4 日間継続し、その後遠心分離、限外濾過、透明濾過及び細菌濾過により酵素を回収した。実施例３精製例組換え対酵素を発現する実施例２に記載のAspergillus oryzaeの発酵からの培養上清を遠心分離し、0.2 μm フィルターを通して濾過して、菌糸体を取り出した。濾過した上清 100 ml をFiltron ^TM ultracette 又は3 kDa 膜を有するAmicon ^TM 限外濾過装置で限外濾過して、濃度を10倍にした。同一装置で連続２ラウンド、この濃縮物を20mM Tris，pH 8.0中で100 倍に希釈した。この限外濾過標本をPharmacia XK 26/20 Fast Flow Q Spharose ^TM陰イオン交換機上に2 ml／分で入れて、20mM Tris-HCl，pH8.0 中で平衡させた。標本適用後、カラムを2 容量の25mM Tris ，pH8.0 で洗浄し、結合タンパク質を、25mM Tris ，pH8.0 中の0 〜0.5 M ＮａＣｌの線状漸増ＮａＣｌ勾配で溶離した。分画を収集し、分画中のキシラナーゼ活性を上記と同様に測定した。キシラナーゼ含有分画をプールし、ＵＦを10mMクエン酸ナトリウム，pH4.0 中に濃縮した。この物質を1.5 ml／分でXK 26/20 Fast Flow S Spharose^TMカラムに入れた。酵素を0 〜0.4 M ＮａＣｌ線状勾配で溶離し、キシラナーゼ含有分画をプールして、濃縮し、特性表示に用い、さらに下記の実験に用いた。実施例４酵素特性表示実施例３により得られたキシラナーゼに、以下の酵素特性表示を施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳動）をMini-Leak 4 電気泳動単位（Kem-En-Tec，Copenhagen）中で、Laemmli 法（Laemmli，U.K.；Nature，1970，227，680-685; Christgau et al.，1991，J． Biol．Chem．1991 266,p.21157-212664）の変法として実施した。約26 kDaの分子量（MW）を確定した。等電点電気泳動メーカーの使用説明書にしたがって、Multiphor ^TM電気泳動ユニットのAmphol ine ^TMＰＡＧプレート，pH 3.5〜9.5 上で、等電点電気泳動を実施した。電気泳動処理後、当業界で公知の標準法にしたがって、ゲルをクーマシー染色した。約4.5 の等電点（pI）を確定した。 pH及び温度最適値 AZCL^TM樺キシラン（Megazyme，Australia）からの青色の放出により、酵素活性を測定した。 0.4 ％ AZCL ^TM基質懸濁液 0.5 mlを最適pHの0.1 M クエン酸／リン酸緩衝液 0.5 mlと混合し、及び適切に希釈した酵素溶液 10 μl を付加した。Eppendorph Thermomixers 中で30℃で15分間インキュベーションを実施し、その後95℃で20分間熱不活性化した。酵素インキュベーションを３回実施した。酵素は付加するが不活性であるブランクを作った。遠心分離後、上清の吸光度を620 nmで微小力価プレートで測定し、ブランクを差し引いた。種々のpHの0.1 M クエン酸／リン酸緩衝液をpH最適値の確定用に用いた。温度最適値を確定するために、種々の温度で15分間のインキュベーション用に0.1 M クエン酸／リン酸緩衝液，pH 5.5を用いた。結果を図１〜２に示す。図１は、pH 2.5〜9 の範囲で30℃で測定した相対キシラン分解活性（％）を示す。酵素は、4.5 〜7.5 の範囲の、特に5.0 〜6.5 の範囲、およそpH 6のpH最適値を有すると思われる。図２は、30〜80℃の範囲でpH5.5 で測定した相対キシラン分解活性（％）を示す。酵素は、50〜70℃の範囲の、およそ60℃の温度最適値を有すると思われる。実施例５熱安定性比較本実施例では、実施例１〜３により得られた一成分キシラナーゼ製剤の熱安定性を、元のThermomyces lanuginosus キシラナーゼ製剤のものと比較した。元のThermomyces lanuginosus キシラナーゼは、以下のように調製した。 Thermomyces lanuginosus DSM 4109株を、下記の組成（ g/1）を有するＹＰＧ培地 200リットル中に24時間接種した。酵母菌抽出物，50％ 10 グルコース 5 ＫＨ₂ＰＯ₄ 3 Ｎａ₂ ＨＰＯ₄，２Ｈ₂ Ｏ 2 ＦｅＳＯ₄ 0.25 ＭｇＳＯ₄，７Ｈ₂Ｏ 2 プルロニック 0.7 pHを6.0 に調整接種後、接種物を2000リットルの以下の培地に付加し（ g/l）、さらに3 日間発酵させた：ナトリウムカゼイナト 10 ダイズミール 20 Ｎａ₂ＨＰＯ₄，２Ｈ₂Ｏ 2 キシラン 3 キシロース 500 pHを7.5 に調整遠心分離により細胞を除去し、限外濾過（10,000切断膜を使用）により上清を濃縮し、凍結乾燥によりＵＦ濃縮物を粗製粉末に変換した。下記の酵素活性に関する検定に適用する場合に、線状分析範囲内に酵素活性をもってくるために、調製物を100mM クエン酸−リン酸緩衝液，pH6.0 で希釈した。希釈標本を、60、65、70及び75℃の温度で２mlのアリコートで水浴中に入れた。対照を氷水中で保持した。インキュベート標本を60分後に取り出して、氷水中に入れた。基質として、ブナノキ材からのレマゾール−キシランを用いた（レマゾールブリリアントブルーＲ，Fluka で染色した４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロノ−Ｄ− キシラン）。基質を溶解して、100mM クエン酸−リン酸緩衝液，pH6.0 で0.5 ％（w/v）溶液を作った。残留酵素活性を確定するために、基質0.9 ml を４本の試験管（２本は有価物、２本はブランク）に付加し、水浴中で50℃で5 分間予熱した。ｔ＝0 で、酵素標本 0.1mlを有価物を構成する全試験管に付加し、混合した。60分後、エタノール試薬（99.9％エタノール150 ml及び2 N ＨＣｌ 1m lの混合物）5 ml を付加してインキュベーションを終結させ、その後10秒間、Wh irlimixer で振盪した。ブランクを構成する全試験管に、エタノール試薬 5mlを先ず付加し、その後酵素標本 0.1 ml を付加して、Whirlimixer で10秒間振盪した。全試験管を約15分間周囲温度に放置し、その後4000g で10分間遠心分離を施した。最後に、585 nmで光学密度を測定し、２回の測定値を平均して、ブランクを差し引いた。インキュベーション温度及び時間の関数として確定される相対残留酵素活性を、対照値（対照値は「100 ％」と定義される）のパーセンテージとして算出した。結果を図３に示す。図では、本発明の一成分キシラナーゼ製剤の残留活性（白棒）と元のThermomy ces lanuginosus キシラナーゼ製剤（斜線棒）との比較を示す。pH 6.0で、それぞれ60、65、70及び75℃で30及び60分間のインキュベーション後に確定された残留活性を示す。図から、本発明のキシラナーゼ成分は、pH 6.0で60℃で60分間インキュベーション後の残留酵素活性が96％以上、特に97％以上、本質的には100 ％を示すと思われる。 pH 6.0で65℃で60分間インキュベーション後、本発明のキシラナーゼ成分は83 ％以上、特に85％以上、さらに90％以上、本質的には100 ％の残留酵素活性を有する。 pH 6.0で70℃で60分間インキュベーション後、本発明のキシラナーゼ成分は20 ％以上、特に30％以上、さらに40％以上、さらには50％以上、約63％の残留酵素活性を有する。 pH 6.0で75℃で60分間インキュベーション後、本発明のキシラナーゼ成分は 9 ％以上、特に10％以上、さらに20％以上、さらには30 ％以上、約48％の残留酵素活性を有する。図から、さらに、本発明の一成分キシラナーゼ製剤は、元のThermomyces lanu ginosus キシラナーゼ製剤と比較して、熱安定性の有意の改良を示すと思われる。優れた飼料増強酵素であることに加えて、熱安定性のこの予期せぬ改良は、本発明の一成分キシラナーゼ製剤を動物飼料添加剤中に混入するのに特に十分適するものにする。動物飼料添加剤中に混入する間、酵素の熱安定性はかいばの微生物感染を防止するのに重要な役割を演じる。実施例６ In vitro粘度の低減前腸消化物粘度は、コムギ及びオオムギベースのブロイラー用餌の消化性に影響を及ぼす主要栄養摂取抑制として確認されている。消化物粘度結果の低減とニワトリ飼料変換効率の改善との密接な相関が認められている（例えばGraham H. ，Bedford M and Choc M; Feedstuffs 1993，65(5)14-15）。本実験では、（ｉ）実施例１〜３により得られた組換え的産生一成分Thermomy ces lanuginosus キシラナーゼ製剤、（ｉｉ）実施例５に記載の培養により得られる元のThermomyces lanuginosus キシラナーゼ製剤、並びに（ｉｉｉ）Humico la insolens の培養により得られる市販多成分酵素製剤（Bio-Feed Plus CT，No vo Nordisk A/S，Denmark の製品）の使用により得られるコムギ粘度低減を、それぞれ調べた。ｔ=０で、粉砕乾燥コムギ（"Statens Husdyrbrugsforsog"，Foulum，Denmark ）（1 mmメッシュ）12 g を38 ml の抽出緩衝液、0.5 M ＨＣｌ−ＫＣｌ，pH 1. 5と混合し、絶えず攪拌しながら40℃に保持した。インキュベーション中、標本をスズ箔で覆った。ｔ= 89分で、1 M ＮａＯＨで pH を6.0（±0.15）に調製した。ｔ= 90 分で、酵素溶液を付加して全量を40mlとした。上記の酵素製剤（ｉ）〜（ｉｉｉ）を希釈して、0.16〜5.19 FXU/ コムギ1 g の範囲の最終酵素濃度を得た。実験はすべて２回ずつ行い、標本、即ち酵素を付加市内溶液を常に２通り含めた。 30分インキュベーション後、粘度確定のために標本を取り出した。小標本アダプター及びスピンドルＮｏ．ＳＣ４−３１を装備したBrookfield LVDV-III 粘度計を、85 s^-1の剪断率に対応する250 rpm で用いた。各確定に関しては、約13 mlの懸濁液をすばやく小標本アダプター中に注ぎ入れ、これを絶えず40℃に水を加熱しながら、ウォータージャケット中に入れた。３つの別々のｃＰ読み取り（各々15秒当たりの）をおこなって、平均値を出した。全症例において、付加酵素を用いて得られる結果的データは、相対粘度、即ち対照標本で測定される粘度に対しての粘度として表され、これを「１」と定義した。図４では、（ｉｉ）0.16、0.32、0.65、1.29及び2.58 FXU/ コムギ 1 gで投与した元のThermomyces lanuginosus キシラナーゼ（●）、並びに（ｉｉｉ）0.32 、0.65、1.29、2.58及び5.19 FXU/ コムギ 1 gで投与したHumicola insolens の培養により得られた多成分酵素製剤（×）の間のコムギ粘度低減効率の比較の結果を示す。図から、（ｉｉｉ）Humicola insolens の培養により得られた多成分酵素製剤と比較した場合、元のThermomyces lanuginosus キシラナーゼ（ｉｉ）は、FXU を基礎にして算出して、コムギ懸濁液の粘度を有意に低減する、と思われる。さらに図５では、（ｉ）組換え的に産生された一成分Thermomyces lanuginosu s キシラナーゼ（Ｉ）と（ｉｉ）元のThermomyces lanuginosus キシラナーゼ（ＩＩ）との間のコムギ粘度低減効率の比較結果を示す。結果は、２つの同様の用量 0.65 及び2.58 FXU/ コムギ 1 gを基礎にしている。図から、コムギ懸濁液の粘度に及ぼす影響は全く同様であると思われる。要するに、本実施例は、現状の当業界飼料添加剤と比較した場合、Thermomyce s lanuginosus 由来のキシラナーゼはコムギ懸濁液の粘度低減の点で優れており、したがって飼料増強酵素としての使用に大きな可能性を有することを明らかに立証した。実施例７飼料増強酵素としてのThermomyces lanuginosus キシラナーゼ本実施例では、Thermomyces lanuginosus 一成分キシラナーゼ製剤を動物飼料に付加し、慣用的消化性増進酵素製剤と比較した。一成分キシラナーゼ製剤は、実施例１〜３にしたがって得た。参照製剤は、当業界飼料添加剤、即ち Humicola insolensの培養により得られる現状の多成分酵素製剤（Bio-Feed Plus CT，Novo Nordisk A/S，Denmark の製品）である。ブロイラーニワトリに、酵素を含む場合と含まない場合の実験餌で 3週間摂食させた。餌の組成物を下記の表１に示す。動物を５つの主群に分けて、５種類の異なる処置を施した。各主群を、ブロイラー30羽（雌雄各15羽）で構成される８つの亜群（ケージ）に分けた。各亜群（ケージ）を別々に計量した。５種類の異なる処置とは、酵素を含まない対照処置と、以下の酵素添加処置であった：400 及び800 FXU/餌 1 kg の参照製剤（Ref.）、並びに200 及び400 FX U/餌 1 kg の本発明の一成分キシラナーゼ製剤（Inv.）。１日齢ヒヨコで処置を開始した。3 週間処置後、体重増加量及餌消費量を測定し、飼料変換率（ＦＣＲ）を算出した。下記の表2（3 週齢でのヒヨコ体重及び飼料摂取量を示す）で比較されたい。表２から、ＦＣＲは、200 FXU/飼料 1 kg の本発明の酵素製剤（Inv.）摂取群では、対照群及び400 FXU 参照製剤（Ref.）摂取群と比較して低いと思われる。しかしながら、200 FXU の本発明の酵素製剤使用後に算出したＦＣＲは、800 FX U 参照製剤の使用後と同じレベルであり、これは参照製剤と比較して、本発明の酵素製剤が、1/4 FXU 投与レベルで同一の効果を有することを示す。したがって、本発明の酵素は、食物の消化性の改良の点で、参照製剤より良好であると考えられる。一成分製剤ではあるが、本発明の製剤は、多数の酵素成分の作用を提供する現状の当業界飼料添加剤と比較して、消化性の増進の点で優れている。実施例８ブロイラー餌におけるコムギの代謝性エネルギーの改良本実施例は、コムギの見掛けの代謝性エネルギー（ＡＭＥ）に及ぼす効果に関して、本発明の２種類の動物飼料添加剤と現状の当業界飼料添加剤の比較を示す。本発明の２種類の動物飼料添加剤とは、（Ａ）実施例１〜３にしたがって組換えＤＮＡ技術により得られるThermomyces lanuginosus 一成分キシラナーゼ製剤、及び（Ｂ）実施例５に記載された方法により得られる元のThermomyces lanugi nosus キシラナーゼ製剤である。現状の当業界の飼料添加剤は、Humicola insol ens の培養により得られる現状の多成分酵素製剤（Ｃ）（Bio-Feed Plus CT，No vo Nordisk A/S，Denmark の製品）である。商業的孵化場から供給される１日齢雄 Ross ブロイラーニワトリを用いた。１日目から16日目まで、市販の発育促進餌を与えた。16日目に、ニワトリを別々に計量した。体重が軽すぎたり重すぎるものは除外し、残りをバタリーケージに振り分けた。16日目から23日目まで、ケージに順応させた。 24日目から28日目までは、代謝性エネルギーＡＭＥのin vivo 測定のために、 European Reference Method にしたがって、平衡試験を実施した（Bourdillon e t al.,；Br．Pouly．Sci．1990，31，557-565）。試験は、１回に 4羽のブロイラーニワトリを用いて5 回繰り返して９種類の処置を実施した。基礎食餌は、モロコシ 56 % 、ダイズ粉 32.5 % 、動物性脂肪 6% 、ダイズ油 1 %及び無機質、ビタミン、微量元素及びアミノ酸 5 %を含有した。実験餌では、基礎食餌の半分をコムギに置き換えた。ヒヨコには、90% レベルのマッシュとして餌を自由に食べさせた。排泄物を毎日定量的に収集した。飼料及び凍結乾燥排泄物の標本を、脂肪、全エネルギー（ＧＥ）及び窒素に関して分析した。食餌のＡＭＥ含量をそれぞれの排泄物／飼料比並びにそれらの対応するＧＥ含量から算出した。34.36 kJ/ 保持Ｎ1gのエネルギー当量を用いて、Ｎ保持−ゼロ（ＡＭＥｎ）修正を実施した。食餌及び凍結乾燥排泄物を脂肪抽出し、排泄物／食餌比を考慮して、脂肪消化性を確定した。 Statgraphicsバージョン5 を用いて、ＬＳＤ−多範囲試験により確認される有意の差を有する分散の一因子分析により、結果を分析した。その結果を下記の表３及び図６〜７に示す。図６は、キシラナーゼ付加（FXU/食餌 1 kg）の一関数としてのコムギのＡＭＥｎ（MJ/kg）を示す；（Ａ）Thermomyces lanuginosus 一成分キシラナーゼ製剤；（Ｂ）元のThermomyces lanuginosu_s キシラナーゼ製剤；（Ｃ）参照（Bio- Feed Plus CT，Novo Nordisk A/S，Denmark の製品；Humicola insolens の培養から得られる多成分酵素製剤）。図７は、キシラナーゼ付加（FXU/食餌 1 kg）の一関数としての実験食餌の脂肪消化（%）を示す；（Ａ）Thermomyces lanuginosus 一成分キシラナーゼ製剤；（Ｂ）元のThermomyces lanuginosus キシラナーゼ製剤；（Ｃ）参照（Bio-Fe ed Plus CT，Novo Nordisk A/S，Denmark の製品；Humicola insolens の培養から得られる多成分酵素製剤）。基礎食餌に200 FXU/食餌 1 kg の（Ａ）又は（Ｂ）を補充すると、ＡＭＥｎ平均値並びに脂肪消化率のの相対的に小さく且つ非有意の増大が生じた（表３）。したがって、コムギのＡＭＥｎ値を算出する場合、基礎成分に及ぼすキシラナーゼの活性に関しては、修正はなされない。実験食餌では、（Ａ）及び（Ｂ）はともに100 及び200 FXU/食餌 1 kg として投与し、一方（Ｃ）は400 FXU/食餌 1 kg として投与した。表３から分かるように、本発明の動物飼料添加剤の投与はどちらも、実験食餌単独よりも有意に良好なＡＭＥｎを生じた。コムギのＡＭＥｎは、酵素付加後に 4.9 〜8.6 % の改良を示した。参照添加剤（Ｃ）は、4.9 % のコムギのＡＭＥｎに関する改良を示した。本発明の動物飼料添加剤と現状の当業界添加剤を比較すると、本発明の動物飼料添加剤は、FXU を基礎にして投与した場合、参照添加剤より良好に役割を果たすことは明らかである。200 FXU/食餌 1 kg の（Ｂ）は、400 FXU/食餌 1 kg の（Ｃ）より有意に良好である。実験食えさの脂肪消化率は、ＡＭＥｎ値と同一のパターンをたどる。

【手続補正書】【提出日】１９９８年３月１３日【補正内容】 (1) 明細書ド配列」を『全又は部分ヌクレオチド配列』に変更する。出願当初の明細書第32頁第14行「37〜705」を、『31〜705』に変更する。出願当初の明細書第32頁第20〜22行の記載「好ましくは55℃以下で、特に60℃以下、65℃以下、70℃以下、75℃以下、好ましくは80℃以下で」を『好ましくは少なくとも55℃で、特に少なくとも60℃で、少なくとも65℃で、少なくとも70℃で、少なくとも75℃で、好ましくは少なくとも80℃で』に変更する。 (2) 請求の範囲請求の範囲を別紙のとおりに変更する。請求の範囲１．キシラナーゼ活性を示すポリペプチドをコードする DNA構築物であって：ｉ）配列番号：１の DNA配列；又は ii）配列番号：１のキシラナーゼ・コーディング部分；又は iii）配列番号：１のヌクレオチド番号31〜705 ；又は iv）サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)DSM 10133株内のプラスミドから得られることができる DNA配列のキシラナーゼ・コーディング部分；又はｖ）その遺伝子コードの縮重のために上記ｉ）〜iv）の配列と相違する DNA配列；又は vi）上記ｉ）〜ｖ）の配列のいずれかに少なくとも95％相同である DNA配列；又は vii）少なくとも75℃の洗浄温度及び２×SSC におけるハイブリダイゼーションを用いて、上記ｉ）〜ｖ）の配列の中のいずれかとハイブリダイズする DNA配列；を含む、DNA構築物。２．請求項１に記載の DNA構築物を含む発現ベクター。３．請求項１に記載の DNA構築物、又は請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。４．キシラナーゼ活性を示すポリペプチドの製造方法であって、そのポリペプチドの製造を許容する条件下、請求項３に記載の宿主細胞を培養し、その後その培養物から上記ポリペプチドを回収することを含む、前記方法。５．請求項４に記載の方法により得られたポリペプチド。６．請求項５に記載のポリペプチドを含む酵素調製物。７．担体及び／又は賦形剤をさらに含む、請求項６に記載の酵素調製物。８．安定剤をさらに含む、請求項６又は７に記載の酵素調製物。９．１以上の追加の飼料増強酵素を含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の酵素調製物。 10．１以上の追加の飼料増強酵素が、アルファーガラクトシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、フィターゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、及びプロテアーゼから成る群から選ばれる、請求項９に記載の酵素調製物。 11．動物飼料添加物剤である、請求項６〜10のいずれか１項に記載の酵素調製物。 12．請求項５に記載のポリペプチド又は請求項６〜11のいずれか１項に記載の酵素調製物を含む動物飼料のためのプレーミックス。 13．請求項５に記載のポリペプチド又は請求項６〜11のいずれか１項に記載の調製物又は請求項12に記載のプレーミックスを含む動物飼料。 14．動物飼料の製造方法であって、飼料成分が、ｉ）請求項５に記載のポリペプチド；又は ii）請求項６〜11のいずれか１項に記載の酵素調製物；又は iii）請求項12に記載のプレーミックス；と混合されることを特徴とする、前記方法。 15．担体及び／又は賦形剤及び／又は安定剤が、前記ポリペプチドに添加される、請求項７〜８のいずれか１項に記載の酵素調製物の製造方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ミュラーツ，アネッテデンマーク国，デーコー−2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ (72)発明者クナップ，インゲヘルマーデンマーク国，デーコー−2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ

Claims

【特許請求の範囲】１．Humicolaの一菌株、Thermoascus の一菌株、Chaetomiumの一菌株、ケカビ Mucorの一菌株、アオカビ Talaromycesの一菌株、Malbranchea の一菌株、Myce liophthoraの一菌株、Thielavia の一菌株、Byssochlamusの一菌株又はPaecilom ycesの一菌株由来の一成分キシラナーゼを包含する動物飼料添加剤。２．一成分キシラナーゼがThermomyces の菌株に由来する請求項１記載の動物飼料添加剤。３．一成分キシラナーゼがThermomyces lanuginosus の菌株に由来する請求項２記載の動物飼料添加剤。４．一成分キシラナーゼがThermomyces lanuginosus，DSM 4109株、あるいはその突然変異株又は変異株に由来する請求項３記載の飼料添加剤。５．一成分キシラナーゼが精製キシラナーゼと同一又は部分的に同一の免疫化学的特性を有し、ａ）Thermomyces lanuginosus，DSM 4109 株に由来するか、；又はｂ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列によりコードされるか；又はｃ）ビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 株のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされる請求項１〜４記載の飼料添加剤。６．一成分キシラナーゼがキシラナーゼ成分をコードする遺伝子を保有する宿主に由来する請求項１〜５のいずれかに記載の飼料添加剤。７．一成分キシラナーゼがａ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列により、又はビール酵母菌 Sa ccharomycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるか；あるいはｂ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分に、又はビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列に類似したＤＮＡ配列によりコードされ、類似ＤＮＡ配列は、ｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Sacc haromyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と相同であるか；あるいはｉｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Sa ccharomyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と同一のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするか；あるいはｉｉｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと少なくとも70％相同であるポリペプチドをコードするか；あるいはｉｖ）Thermomyces lanuginosus，DSM 4109 由来の精製キシラナーゼに対して生じる抗体と免疫学的に反応するか、もしくは配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドをコードする請求項１〜６のいずれかに記載の飼料添加剤。８．一成分キシラナーゼがさらに、pH6.0 で60℃で60分インキュベーション後に96％以上の残留酵素活性を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の飼料添加剤。９．一成分キシラナーゼがさらに、pH6.0 65℃で60分インキュベーション後に 83％以上の残留酵素活性を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の飼料添加剤。１０．一成分キシラナーゼがさらに、pH6.0 で70℃で60分インキュベーション後に20％以上の残留酵素活性を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の飼料添加剤。１１．一成分キシラナーゼがさらに、pH6.0 で75℃で60分インキュベーション後に10％以上の残留酵素活性を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の飼料添加剤。１２．１つ又はそれ以上のさらに別の飼料増強酵素を包含する請求項１〜１１のいずれかに記載の飼料添加剤。１３． α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ及びプロテアーゼから成る群から選択されるさらに別の飼料増強酵素を包含する請求項１２記載の飼料添加剤。１４．乾燥組成物、好ましくは被覆又は非被覆粒子の形態で提供されるか、又は安定化液体組成物、好ましくは水性又は油ベースの組成物の形態で提供される請求項１〜１３のいずれかに記載の飼料添加剤。１５．キシラナーゼ成分が、Humicolaの一菌株、Thermoascus の一菌株、Chae tomiumの一菌株、ケカビ Mucorの一菌株、アオカビ Talaromycesの一菌株、Malb ranchea の一菌株、Myceliophthoraの一菌株、Thielavia の一菌株、Byssochlam usの一菌株又はPaecilomycesの一菌株に由来する一成分キシラナーゼ製剤。１６．キシラナーゼ成分がThermomyces の菌株に由来する請求項１５記載の一成分キシラナーゼ製剤。１７．キシラナーゼ成分がThermomyces lanuginosus の菌株に由来する請求項１６記載の一成分キシラナーゼ製剤。１８．キシラナーゼ成分ががThermomyces lanuginosus，DSM 4109 株、あるいはその突然変異株又は変異株に由来する請求項１７記載の一成分キシラナーゼ製剤。１９．キシラナーゼ成分が精製キシラナーゼと同一又は部分的に同一の免疫化学的特性を有し、ａ）Thermomyces lanuginosus，DSM 4109 株に由来するか、；又はｂ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列によりコードされるか；又はｃ）ビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 株のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされる請求項１５〜１８のいずれかに記載の一成分キシラナーゼ製剤。２０．キシラナーゼ成分がキシラナーゼ成分をコードする遺伝子を保有する宿主細胞に由来する請求項１５〜１９のいずれかに記載の一成分キシラナーゼ製剤。２１．キシラナーゼ成分がａ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列により、又はビール酵母菌 Sa ccharomycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるか；あるいはｂ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分に、又はビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列に類似したＤＮＡ配列によりコードされ、類似ＤＮＡ配列は、ｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Sacc haromyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と相同であるか；あるいはｉｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Sa ccharomyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と同一のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするか；あるいはｉｉｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと少なくとも70％相同であるポリペプチドをコードするか；あるいはｉｖ）Thermomyces lanuginosus，DSM 4109 由来の精製キシラナーゼに対して生じる抗体と免疫学的に反応するか、もしくは配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドをコードする請求項２２に記載の一成分製剤。２２．キシラナーゼ成分がpH6.0 で60℃で60分インキュベーション後に96％以上の残留酵素活性を有する請求項１５〜２１のいずれかに記載の一成分キシラナーゼ製剤。２３．キシラナーゼ成分がpH6.0 で65℃で60分インキュベーション後に83％以上の残留酵素活性を有する請求項１５〜２１のいずれかに記載の一成分キシラナーゼ製剤。２４．キシラナーゼ成分がpH6.0 で70℃で60分インキュベーション後に20％以上の残留活性を有する請求項１５〜２１のいずれかに記載の一成分キシラナーゼ製剤。２５．キシラナーゼ成分がpH6.0 で75℃で60分インキュベーション後に10％以上の残留活性を有する請求項１５〜２１のいずれかに記載の一成分キシラナーゼ製剤。２６．キシラナーゼ成分をコードするＤＮＡ配列を包含するＤＮＡ構築物であって、ＤＮＡ配列がａ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列又はビール酵母菌Saccharomyce s cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分；又はｂ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分に類似したＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列に類似したＤＮＡ配列であって、ｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharo myces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と相同であるか；あるいはｉｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccha romyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列のキシラナーゼコード部分と同一のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするか；あるいはｉｉｉ）配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Sacc haromyces cerevisiae DSM 10133菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと少なくとも70％相同であるポリペプチドをコードするか；あるいはｉｖ）Thermomyces lanuginosus，DSM 4109 由来の精製キシラナーゼに対して生じる抗体と免疫学的に反応するか、もしくは配列番号：１として示されるＤＮＡ配列、又はビール酵母菌 Saccharomycescerevisiae DSM 10133 菌株中のプラスミドから得られるＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドをコードする類似ＤＮＡ配列を包含するＤＮＡ構築物。２７．キシラナーゼ成分をコードするＤＮＡ配列がHumicolaの一菌株、Thermo ascus の一菌株、Chaetomiumの一菌株、ケカビ Mucorの一菌株、アオカビ Talar omycesの一菌株、Malbranchea の一菌株、Myceliophthoraの一菌株、Thielavia の一菌株、Byssochlamusの一菌株又はPaecilomycesの一菌株に由来する請求項２６記載のＤＮＡ構築物。２８．キシラナーゼ成分をコードするＤＮＡ配列がThermomyces の菌株に由来する請求項２７記載のＤＮＡ構築物。２９．キシラナーゼ成分をコードするＤＮＡ配列がThermomyces lanuginosus の菌株に由来する請求項２８記載のＤＮＡ構築物。３０．ＤＮＡ配列がThermomyces lanuginosus,DSM 4109のＤＮＡライブラリー、あるいはその突然変異株又は変異株に由来するか、又はそれを基礎にして産生される請求項２９記載のＤＮＡ構築物。３１．請求項２６〜３０のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を包含する組換え体発現ベクター。３２．請求項２６〜３０のいずれかに記載のＤＮＡ構築物、又は請求項３１記載の組換え体発現ベクターを包含する宿主細胞。３３．真核細胞、特に真菌細胞、好ましくは酵母菌細胞又は糸状菌細胞である請求項３２記載の宿主細胞。３４．アスペルギルス属、特に黒色アスペルギルス Aspergillus niger又はAs pergillus oryzaeの菌株に属する請求項３２記載の宿主細胞。３５．キシラナーゼ成分の産生を可能にする条件下で請求項３２〜３４のいずれかに記載の宿主細胞を培養し、その後培養からキシラナーゼ成分を回収する工程から成る請求項１５〜２５記載の一成分キシラナーゼ製剤の製造方法。