JPH10511402A

JPH10511402A - 凍結保存溶液

Info

Publication number: JPH10511402A
Application number: JP8527053A
Authority: JP
Inventors: ポロヴィナ，ミロ，アール．
Original assignee: セロックスラボラトリーズ，インコーポレーテッド
Priority date: 1995-03-08
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 1998-11-04
Anticipated expiration: 2016-03-07
Also published as: NO974108L; AU5186996A; CA2214280A1; EP0813361A4; EP0813361B1; DE69630679T2; NZ304628A; ATE253818T1; NO974108D0; AU693339B2; RU2146088C1; DE69630679D1; ES2210352T3; WO1996027287A1; CA2214280C; BR9607147A; EP0813361A1; US5759764A; MX9706843A; JP3165863B2

Abstract

(57)【要約】（ｉ）グリセリン、（ii）アルカリ金属塩化物、（iii）単糖類及び（iv）血漿アルブミンの無毒成分を含有する、簡単な、経費の掛からない、生理学的に適合する凍結保存溶液。

Description

【発明の詳細な説明】凍結保存溶液発明の分野本発明は凍結保存溶液に関する。更に特定すると、本発明は血液中に又は造血幹細胞又は前駆（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞のような骨髄中に見出されるいろいろの型の細胞を凍結保存するために使用されるのに特に適している凍結保存溶液に関する。本発明は又細胞を凍結保存する方法又は凍結保存した細胞を回収する方法にも関する。本発明の背景血液血液中を循環する形態学的に認識でき、機能的に作用できる細胞は、赤血球、好中球、好酸球及び好塩基球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、非Ｂリンパ球、非Ｔリンパ球及び血小板を包含する。これらの成熟細胞は、必要に応じて、赤血球系のための赤血芽球、顆粒系のための骨髄芽球、前骨髄球と骨髄球、及び血小板のための巨核球のような各々の系列のための形態学的に認識可能な分化する前駆細胞から派生するか又はそれらにより置換される。造血幹細胞と前駆細胞二つの主要な亜群：前駆細胞は、幹細胞と前駆細胞に簡単に分類できる、より原始的細胞から分化する。幹細胞と前駆細胞の定義は、作用的であり、形態学的な範疇に依存するよりむしろ機能的な範疇に依存する。幹細胞は広範な自己更新的又は自己保存的な能力を持つ。ある種の幹細胞は必要上分化するが、ある種の幹細胞又はそれらの娘細胞は他の種類の幹細胞を生産してこれら細胞の貴重なプールを維持する。斯くしてそれら自身の種を維持するのに加えて、多能的幹細胞は更に限定された能力又は自己更新能力のない前駆細胞の幾つかの亜群に分化できる。これらの前駆細胞は最終的には、形態学的に認識できる前駆細胞に立ち上がる。前駆細胞は骨髄系の分化経路の一つ又は二つ以上に沿って増殖又は分化することができる。幹細胞と前駆細胞は骨髄、脾臓と血液内の核化した細胞の非常に僅かの％になる。これらの細胞は、成人血液にはさらに少なく存在するにも係わらず骨髄に対比して約１０分の１が脾臓に存在する。例えば、１０００個の核化した骨髄細胞中の約１個が前駆細胞であり；幹細胞はより低い頻度で存在する。造血系の再構成は、骨髄移植により実施されてきた。ローレンツとその協同研究者は、マウスが致死的照射に対して骨髄の静脈注射により防護されることを示した（Ｌｏｒｅｎｚ，２０Ｅ．，ｅｔａｌ．，１９５１，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．１２：１９７−２０１）。その後の研究は、その防護は、注入細胞によるレシピエントの骨髄の転移増殖によるものであることが示された（Ｌｉｎｄｓｌｅｙ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，１９５５，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．９０：５１２−５１５；Ｎｏｗｅｌｌ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，１９５６，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１６：２５８ −２６１；Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｎ．Ａ．，１９５６，Ｂｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．３７：２３９−２４７；Ｔｈｏｍａｓ，Ｅ．Ｄ．，ｅｔａｌ．，１９５７，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２５７：４９１−４９６）。かくして、供与された骨髄中の幹細胞と前駆細胞は防護免疫、組織修復、凝固及び他の血液の機能に関与する血液細胞を増殖しそして交換することができる。成功した骨髄移植例では、血液、骨髄、脾臓、胸腺と免疫に関する他の器官はドナーから供給される細胞により元通りになる。下記のような或る型の貧血症と症状を含むいろいろの致死的又は重大な症状を治療するのに骨髄は使用されて成功例が増加している：形成不全貧血症（Ｔｈｏｍａｓ，Ｅ．Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｆｅｂ．５，１９７２，Ｌａｎｃｅｔ，ｐｐ．２８４−２８９），Ｆａｎｃｏｎｉ’ｓａｎｅｍｉａ（Ｇｌｕｃｋｍａｎ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，１９８０，ＢｒｉｔＪ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．４５：５５７−５６４；Ｇｌｕｃｋｍａｎ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，１９８３，ＢｒｉｔＪ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．５４：４３１−４４０；Ｇｌｕｃｋｍａｎ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，１９８４，ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ：２１（１）：２０−２６），免疫不全（Ｇｏｏｄ，Ｒ．Ａ．，ｅｔａｌ．，１９８５，ＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌ．８２：３６−５４），リンパ種又は白血病のようなガン（Ｃａｈｎ，Ｊ．Ｙ．，ｅｔａｌ．，１９８６，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．６３：４５７−４７０；Ｂｌｕｍｅ，Ｋ．Ｊ．ａｎｄＦｏｒｍａｎＳ．Ｊ．，１９８２，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｕｐｐ．１：９９−１０２；Ｃｈｅｅｖｅｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔａｌ．，１９８２，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０７（８）：４７９ −４８１），癌腫（Ｂｌｉｊｈａｎ，Ｇ．，ｅｔａｌ．，１９８１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１７（４）：４３３−４４１），いろいろの固形腫瘍（Ｅｋｅｒｔ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，１９８２，Ｃａｎｃｅｒ４９：６０３−６０９；Ｓｐｉｔｚｅｒ，Ｇ．，ｅｔａｌ．，１９８０，Ｃａｎｃｅｒ４５：３０７５−３０８５）及び造血の遺伝的欠陥。骨髄移植は、近年下記の症状にも適用されて来ている：遺伝性貯蔵症（Ｈｏｂｂｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｌａｎｃｅｔ２：７３５−７３９），サラセミアメジャー（Ｔｈｏｍａｓ，Ｅ．Ｄ．，ｅｔａｌ．，１９８２，Ｌａｎｃｅｔ２：２２７ −２２９），鎌状赤血病（Ｊｏｈｓｏｎ，Ｆ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，１９８４，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１１：７８０−７８３）及び骨石化症（Ｃｏｓｓｉａ，Ｐ．Ｆ．，ｅｔｌ．，１９８０，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０２：７０１−７０８）（一般議論については、Ｓｔｏｒｂ，Ｒ．ａｎｄＴｈｏｍａｓ，Ｅ．Ｄ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．７１：７７−１０２；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，１９８４，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２１（３）：１８８−２２１；１９６９，Ｂｏｎｅ−ＭａｒｒｏｗＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ＣｕｌｔｕｒｅａｎｄＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆａＰａｎｅｌ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｊｕｌｙ２２−２６，１９６８，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｔｏｍｉｃＥｎｅｒｇｙＡｇｅｎｃｙ，Ｖｉｅｎｎａ；ＭｃＧｌａｖｅ，Ｐ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，１９８５，ｉｎＲｅｃｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｈｏｆｆｂｒａｎｄ，Ａ．Ｖ．，ｅｄ．，ＣｈｕｒｃｈｉｌｌＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．１７１− １９７を参照）。現在骨髄移植の利用は、厳密に制限されている；というのは完全に合致している（遺伝的に同一）ドナーを得ることは、同じ双子である場合又は緩和すべき患者の骨髄細胞が生存した凍結状態で入手できる場合を除き、非常に稀であるからである。そのような自系的なシステムにおいてすら悪性細胞による検出できない汚染による危険、そして患者を骨髄獲得を実施するのに十分に健康にすることの必要性が深刻な制限を招いている。そのような自系的な場合を除くと、ある程度の回避できない非適合が存在し、それが重大なそしてある場合には致死的な合併症の危険を残す。このような合併症は二重にある。第一に、患者は通常は、外来の骨髄細胞の免疫拒否（移植片対宿主症候）を回避するために、予め免疫学的に不能にされる。第二番目に、供与された骨髄細胞が生着した時、それらは患者を外敵として認識して攻撃し得るからである。非常に近い家族ドナーの場合ですら、部分的ミスマッチの合併症は実質的な死亡の原因になりそして遺伝的に異なる個人からの骨髄移植は病的状態の直接的な原因になっている。末梢血液も造血再構成のための幹細胞源として研究されてきている（Ｎｏｔｈｄｕｒｔｔ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，１９７７，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９：４７０−４７１；Ｓａｒｐｅｌ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，１９７９，Ｅｘｐ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．７：１１３−１２０；Ｒａｇｈａｒａｃｈａｒ，Ａ．，ｅｔａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．７Ａ：７８；Ｊｕｔｔｎｅｒ，Ｃ．Ａ．，ｅｔａｌ．，１９８５，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．６１：７３９−７４５；Ａｂｒａｍｓ，Ｒ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．７Ａ：５３，Ｐｒｕｍｍｅｒ，ｏ．，ｅｔａｌ．，１９８５，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１３：８９１−８９８）．或る研究では、下記の病気の患者のために将来有望な結果が得られている：いろいろの白血病（Ｒｅｉｆｆｅｒｓ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，１９８６，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１４：３１２−３１５（凍結保存した細胞を使用する）；Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，１９８０，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．４５：２２３−２３１；Ｔｉｌｌｙｅｔａｌ．，Ｊｕｌ．１９，１９８６，ＴｈｅＬａｎｃｅｔ，ｐｐ．１５４−１５５；Ｔｏ，Ｌ．Ｂ．ａｎｄＪｕｔｔｎｅｒ，Ｃ．Ａ．，１９８７，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．６６：２８５−２８８とその中の引用文献も参照）；リンパ腫（Ｋｏｒｂｌｉｎｇ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，１９８６，Ｂｌｏｏｄ６７：５２９−５３２）。ある種の癌患者に観察されるように、自系の末梢成人血液の造血系を再構成する能力は、強い化学療法及び／又は照射による細胞減少の後に生成される末梢血液中の更に多数の循環前駆細胞に伴うことが暗示されている（リバウンド現象）（Ｔｏ，Ｌ．Ｂ．ａｎｄＪｕｔｔｎｅｒ，Ｃ．Ａ．，１９８７，Ａｎｎｏｔ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．６６：２８５−２８８；Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．６７：２５２−０２５３とそれに引用されている文献を参照）。末梢血液を使用する他の研究は再構成を実現できなかった（Ｈｅｒｓｈｋｏ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，１９７９，ＴｈｅＬａｎｃｅｔ１：９４５−９４７；Ｏｃｈｓ，Ｈ．Ｄ．，ｅｔａｌ．，１９８１，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１５（４Ｐａｒｔ２）：６０１）。下記の細胞移植を造血再構成のための幹細胞源として使用する研究が成されている：胎児肝細胞移植（Ｃａｉｎ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，１９８６，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ４１（１）：３２−３５；Ｏｃｈｓ，Ｈ．Ｄ．，ｅｔａｌ．，１９８１，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１５（４ｐａｒｔ２）：６０１；Ｐａｉｇｅ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３：１５４−１６５；Ｔｏｕｒａｉｎｅ，Ｊ．Ｌ．，１９８０，ＥｘｃｅｒｐｔａＭｅｄ．５１４：２７７；Ｔｏｕｒａｉｎｅ，Ｊ．Ｌ．，１９８３，ＢｉｒｔｈＤｅｆｅｃｔｓ１９：１３９；Ｇｏｏｄ，Ｒ．Ａ．，ｅｔａｌ．，１９８３，ＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌ．８２：４４−４５とその中で引用されている参考文献も参照）；又は新生児の脾臓細胞の移植（Ｙｕｎｉｓ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，１９７４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：４１００）。新生児の胸腺細胞も造血再構成実験で移植されている（Ｖｉｃｋｅｒｙ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ６９（３）：４７８ −４８５；Ｈｉｒｏｋａｗａ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，１９８２，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２２：２９７−３０４）。凍結保存溶液と技術凍結は、血液細胞のような生存細胞をそのドナー生体から取り出し又は分離した後、保存するために長い間使用されてきた。とはいうものの、生存細胞の凍結保存と回収は非常に厄介なものであることが判明している。細胞は、凍結保存の間に含まれる凍結と解凍の間の周期の間の比較的苛酷な条件に曝され、その結果生き残りの率が低い。凍結は殆どの生存細胞に破壊的である。外側の媒体が凍結するに従って、細胞は平行を維持しようとして水分を喪失し、かくして細胞内凍結が約−１０〜−１５℃で起きるまでに、細胞内溶質濃度が増加する。細胞内凍結と溶液効果は細胞損傷の原因であると一般に信じられている。例えば、細胞外にある氷が原因の凍結破壊は、実質的には、細胞の浸透脱水により起こるプラズマ膜（ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ）損傷であると提案されている。解凍した細胞の生存率を最大にするための時間と努力が費やされた。そのような努力は主に凍結保護剤の開発と最適冷却速度の確立に集中された。溶質添加による凍結保存は二つの潜在機構によると考えられている；（ｉ）細胞内；細胞内で形成される氷の量を減らす；及び／又は（ii）細胞外；細胞を囲む溶質内の氷の形成が原因になる減少した蒸気圧に応答する細胞からでる水流を減少する。いろいろの最適の冷却速度がいろいろの細胞について記載されている。いろいろの研究グループが、凍結した骨髄細胞と赤血球の生き残り又は移植効率について注目してきている（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄＢｉｓｈｏｐ，Ｍ．Ｗ．Ｈ．，１９５９，Ｎａｔｕｒｅ１８３：１３９４−１３９５；Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｊ．，１９６１，Ｎａｔｕｒｅ１９０：１２０４− １２０５；Ｒｏｗｅ，Ａ．Ｗ．ａｎｄＲｉｎｆｒｅｔ，Ａ．Ｐ．，１９６２，Ｂｌｏｏｄ２０：６３６；Ｒｏｗｅ，Ａ．Ｗ．ａｎｄＦｅｌｌｉｇ，Ｊ．，１９６２，ＦｅｄＰｒｏｃ．２１：１５７；Ｒｏｗｅ，Ａ．Ｗ．，１９６６，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ５（１）：１２−１８；Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，１９６７，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ７（１）：１７−３２；Ｒａｐａｚ，Ｇ．，ｅｔａｌ．，１９６８，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ５(1)：１８−２５；Ｍａｚｕｒ，ｐ．，１９７０，Ｓｃｉｅｎｃｅ１６８：９３９−９４９；Ｍａｚｕｒ，Ｐ．，１９７７，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ１４：２５１− ２７２；Ｒｏｗｅ，Ａ．Ｗ．，ａｎｄＬｅｎｎｙ，Ｌ．Ｌ．，１９８３，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ２０：７１７；Ｓｔｉｆｆ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，１９８３，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ２０：１７−２４；Ｇｏｒｉｎ，Ｎ．Ｃ．，１９８６，ＣｌｉｎｉｃｓｉｎＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙ１５（１）：１９ −４８）。概して、造血幹細胞と前駆細胞のための最適の結果は最終貯蔵温度が−７０ないし約−１９６℃の場合、分当り約１−２℃の冷却速度であり、他の血液細胞に就いても概してこれらと同じ温度範囲内である。液体窒素中での長期貯蔵後のヒト骨髄細胞の成功裏の回収が記載されている（１９８３，ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＱｕａｒｔｅｒｌｙＮｅｗｓｌｅｔｔｔｅｒ３（４）：１）。更に、骨髄中の幹細胞は凍結保存と解凍に耐え得ることが示されている（Ｆａｂｉａｎ，Ｉ．，ｅｔａｌ．，１９８２，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ，１０（１）：１１９ −１２２）。全血、臍帯の血液、骨髄、顆粒球、好中球、血小板及び造血幹細胞と前駆細胞を含む殆どの細胞の凍結保存に使用するための広く容認されている工業的標準凍結剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。これは、ＤＭＳＯをベースとする凍結保存溶液の広範囲の経験と知識とＤＭＳＯが優れた保護力と最大の細胞生存性を付与するという認識とに概して依ることができる。ＤＭＳＯがこれらの目的のために概して効果的であるというものの、ＤＭＳＯが特に高い濃度では生理学的に有毒でありそしてそれにより、凍結保存工程に関与した人々と凍結保存された細胞が注入された患者の両方を刺戟する傾向がある結果、高血圧、嘔吐と悪心を起こすことも知られている。ＤＭＳＯの有害な性質は、凍結保存した細胞の in vitroでの生存率を低下する結果にもなると考えられてもいる。従って、in vivo とin vitroの両方の細胞の生存性を対比できるレベルまであげることのできる、簡単な、生理学的に適合できる、別の凍結保存溶液に対する大きい需要がある。発明の概要本発明者は、簡単な、経費の低い、生理学的に適合できる凍結保存溶液であって、（ｉ）グリセリン、（ii）アルカリ金属塩化物、（iii）単糖類及び（iv）血漿アルブミンの無毒な成分を含有する凍結保存溶液を開発した。凍結保存溶液の主要な成分は、凍結保存性のグリセリン（グリセロールともいう）である。アルカリ金属塩化物は凍結−解凍周期を通じて細胞生存度を高める。単糖類は細胞のための炭素栄養源として機能する。血漿アルブミンは、凍結細胞の凍結−解凍周期と貯蔵の間、細胞膜を保護することができるように、標的細胞の膜の周辺の被膜を提供するためのタンパク質として機能する。血漿アルブミンは、標的細胞例えば上述の赤血球、好中球、好酸顆粒球及び好塩基顆粒球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、非Ｂリンパ球、非Ｔリンパ球及び血小板のような細胞の生存性に悪影響を与えることで知られている酸素遊離ラジカルのスカベンジャーとして機能するとも信じられている。血漿アルブミン源は、好ましくは、保護される標的細胞が導入されるだろうと意図される対象の種と合致している。凍結保存溶液は、濃厚型の又は十分に希釈された形態のどちらで供給されてもよい。濃厚型は、使用強度に、単に注射のために適切に処理される水のような希釈剤を溶液に添加することにより希釈されてよい。希釈剤は、好ましくは、生理食塩水のように生理学的にバランスがとれている塩溶液である。標的細胞、例えばＣＤ34+ 細胞として同定される細胞を包含する、全血、臍帯の血液、骨髄、顆粒球、好中球、血小板及び造血幹細胞と前駆細胞のような細胞の保存とその後の医療的使用における凍結保存溶液の使用は、下記のステップを含む：（ｉ）必要に応じて濃厚凍結保存溶液を希釈する、（ii）標的細胞を希釈した溶液に導入する、（iii）保護した標的細胞の凍結、（iv）凍結した溶液の環境条件への解凍及び（ｖ）解凍した標的細胞の、そのような標的細胞を必要とする対象への導入。解凍した細胞と同伴する凍結保存溶液は対象に導入される前に好ましくは体温（即ち約３７℃）に温められる。凍結保存溶液の生理学的適合性は、解凍された標的細胞が標的細胞と凍結保存溶液とを分離しないで対象中へ導入されるようにする。最良の実施態様を含む本発明の詳細な説明本発明者は、簡単な、経費の低い、生理学的に適合できる凍結保存溶液であって、（ｉ）グリセリン、（ii）アルカリ金属塩化物、（ iii）単糖類及び（iv）血漿アルブミンの無毒な成分からなる凍結保存溶液を開発した。請求の範囲を除く明細書で使用され、凍結保存溶液との関係で使用される場合の「重量％」は、他に記述の無い限り濃厚凍結保存溶液の全重量を基準にしている。グリセリン（Ｃ₃Ｈ₈Ｏ₃）は、アメリカ合衆国で市販されている、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒを含む多数の供給者からの食品グレードのポリオールである。濃厚凍結保存溶液は約６０ないし約８０重量％のグリセリンを含有する。約６０重量％より低いグリセリン濃度は細胞生存率を下げ、他方約８０重量％より多いグリセリンを含有する溶液は受容できない高い重量オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）（即ち約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇより大きい）を持つ溶液になる。本発明の使用に適しているアルカリ金属塩化物は、塩化ナトリウムと塩化カリウムを包含する。アルカリ金属塩化物は凍結保存溶液の重量オスモル濃度を約５００と２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇの間に調節することにより凍結−解凍周期を通しての細胞生存率を高めると信じられる（上記の重量オスモル濃度はウエスコーア５５００型蒸気圧浸透圧計（Ｗｅｓｃｏｒ５５００ＭｏｄｅｌＶａｐｏｒＰｒｅｓｓｕｒｅＯｓｍｏｍｅｔｅｒ）を、この機器のための指導／サービス・マニュアルに記載されている指針に従って、使用して測定した。）。参照によると、血液の生理浸透圧は概して約２６０と３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの間にある。この一般的範囲内の最適重量オスモル濃度は、特定の標的細胞、凍結保存溶液の特定組成と凍結−解凍速度を含む幾つかの要因に依存する。例えば、約７００と約１，７００の間の重量オスモル濃度は概して造血幹細胞と前駆細胞の凍結保存のために通常要求される。濃厚凍結保存溶液は約５重量％ないし約１０重量％のアルカリ金属塩化物を含有する。約５重量％よりすくないアルカリ金属塩化物濃度と約１０重量％より多いアルカリ金属塩化物濃度は凍結−解凍周期の間の細胞生存度を下げそして約１０重量％より多いアルカリ金属塩化物濃度は、損傷を与える結晶化を受ける。グルコースのような単糖類は、細胞のための炭素栄養源として機能する。単糖類が利用できることは、凍結細胞の凍結−解凍と貯蔵の保存を、細胞内の十分な栄養の存在を保証することにより促進する。血漿アルブミンは、凍結細胞の凍結−解凍周期と貯蔵の間、細胞膜を保護することができるように、標的細胞の膜の周辺の被膜を提供するためのタンパク質として機能する。血漿アルブミンは、標的細胞例えば上述の赤血球、好中球、好酸顆粒球及び好塩基顆粒球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、非Ｂリンパ球、非Ｔリンパ球及び血小板のような細胞の生存性に悪影響を与えることで知られている酸素遊離ラジカルのスカベンジャーとして機能するとも信じられている。血漿アルブミン源は、好ましくは、保護される標的細胞が導入されるだろう意図される対象の種と合致している。有効濃度は、濃厚凍結保存溶液に約０．２ないし約１重量％の単糖類を配合することにより達成される。約０．２重量％より少ない添加は、不十分な濃度となり凍結−解凍周期の間の細胞生存度を下げるが、他方約１重量％より多い濃度は細胞の生存度を濃度に比例して上げるものではなく他の成分の濃度に悪影響を与える。血漿アルブミンは、凍結細胞の凍結−解凍周期と貯蔵の間、細胞膜を保護することができるように、標的細胞の膜の周辺の被膜を提供するためのタンパク質として機能する。有効濃度は、約２０ないし３０重量％の血漿アルブミンき配合により達成され得る。約２０重量％より低いアルブミン濃度は不十分な濃度となるが、他方約３０重量％より高い濃度は細胞生存度を比例的には上げることにはならず溶液の重量オスモル濃度を約２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇの所望上限より上の重量オスモル濃度に増やす傾向がある。濃厚凍結保存溶液は適当な希釈剤（例えば限外ろ過した水からの０．９％食塩水、注射用水及び自系血漿）の、濃厚凍結保存溶液１部に対して約１ないし１０部、典型的には１ないし２部の率での添加により、使用濃度まで希釈され得る。概して、希釈した凍結保存溶液は実質的には、希釈した凍結保存溶液に基づいて、（ｉ）約２０ないし４０重量％のグリセリン、（ii）約１．５ないし約５重量％のアルカリ金属塩化物、（iii）約０．１ないし約０．５重量％の単糖類及び（iv）約６ないし約１５重量％の血漿アルブミンである。残部は希釈剤である。凍結保存溶液は、約７と７．５の間のｐＨになるように調節されるべきである。標的細胞を、希釈した凍結保存溶液を使用して単に（ｉ）標的細胞を希釈した凍結保存溶液に導入しそして（ii）保護された標的細胞を凍結又は凍結保存することにより、好都合に凍結保存してもよい。標的細胞に添加されなければならない希釈した凍結保存溶液の体積は、標的細胞を含む溶液の凍結保存溶液に対する体積比率と標的細胞の凍結保存溶液に対する体積比率の両方に依存する。標的細胞を含む溶液の凍結保存溶液に対する体積比率は概して約１：１ないし１：１０の間であるべきであり、標的細胞の凍結保存溶液に対する比率は約１×１０⁵細胞／ｍｌないし約１：１×１０⁹／ｍｌ、好ましくは概して約２×１０⁸細胞／ｍｌないし３×１０⁸細胞／ｍｌの間の比率である。上述より大きい比率は、不十分な凍結保存溶液による生存細胞の濃度の減少になる傾向があり、他方上述より小さい比率は単に凍結保存溶液の非効率な使用を招きそして標的細胞の有効量を導入するために対象に過剰の凍結保存溶液を導入する必要があるのみである。標的細胞は、頻繁に、生理学的液体中の組成としての希釈型でのみ保存のために入手できる（例えば末梢血液から濃縮された幹細胞は、血漿と血小板のような他の成分を含有する残部（ｂａｌａｎｃｅ）を使用して普通は約１×１０⁶細胞／ｍｌないし約３×１０⁸細胞／ｍｌの濃度で幹細胞を含有する。）。これらの生理学的に希釈した試料は、標的細胞の凍結保存溶液に対する最適比率を実現するためには、概して約２：１ないし１：４の体積比（凍結保存溶液の特定製剤、生理学的に希釈した試料中の標的細胞の濃度、標的細胞の型等を含む幾つかの要因に勿論依存する）で凍結保存溶液と配合されなければならない。最後の標的細胞を含む溶液は概して約４ないし１２重量％のグリセリンと約２ないし１０重量％のアルブミン（これらの一般的範囲外の変法も或る種の適用には考慮される）を含有する。凍結保存により保護された標的細胞は、対象中への標的細胞の導入に先立って解凍されなければならない。凍結保存溶液の生理学的適合性により、解凍された標的細胞は標的細胞と凍結保存溶液を分離しないで対象中に導入させることができる。解凍した標的細胞は、細胞生存性の認識できる程度の損失なしに室温に数時間置くことができる。解凍した溶液を生理食塩水又は他の適当なイオン性溶液で薄めて、重量オスモル濃度の急激な変化が原因になる細胞膜への衝撃を減少できる程度に所望の凍結保存範囲：５００ないし２，０００ｍＯｓｍ／ｋｇから２６０ないし３２０ｍＯｓｍ／ｋｇへ溶液の重量オスモル濃度を低下させる。制御された遅い冷却速度は、最適の細胞生存度を実現するのにしばしば有効であり得る。異なる細胞型は異なる最適冷却速度を持つことは一般に信じられている（（骨髄幹細胞の生存度とそれらの移植潜在力に与える冷却速度の影響について）参照：例えば、Ｒｏｗｅ，Ａ．Ｗ．ａｎｄＲｉｎｆｒｅｔ，Ａ．Ｐ．，１９６２，Ｂｌｏｏｄ２０：６３６；ＲｏＷｅ，Ａ．Ｗ．，１９６６，ＣｒｙｏＢｉｏｌｏｇｙ３（１）：１２−１８，Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，１９６７，ｔｒａｎｆｕｓｉｏｎ７（１）：１７−３２；及びＭａｚｕｒ，Ｐ．，１９７０Ｓｃｉｅｎｃｅ１６８：９３９−９４９）。凍結保存溶液は使用前に室温に維持することができそして混和した標的細胞は凍結を開始する前に３０分間は細胞生存度の認識できる喪失なしに室温に保つことができる。これは毒性のある凍結保護材ＤＭＳＯを使用する場合とは対照的であり、その場合はＤＭＳＯを標的細胞の添加前に凍結工程を容易にするために約４℃に冷却しなければならずそしてＤＭＳＯの存在により誘導される細胞死を最小にするために、ＤＭＳＯを添加した直後凍結工程を開始することを要求される。制御冷却はプログラム化できる凍結装置の使用により実施できる。プログラム化できる凍結装置は最適の冷却速度を決定しそして標準的再現性冷却を容易にする。細胞を保持する容器は凍結温度において安定でなければならずそして凍結と解凍の両方の効果的制御のための迅速な熱伝導をしなければならない。密封プラスチック製小ビン（例えば、ＮｕｎｃａｎｄＷｈｅａｔｏｎｃｒｙｕｌｅｓ）又はガラスアンプルは多数の少量（１ないし２ml）のために使用できるが、１００ないし２００mlの大容量はＦｅｎｗａｌから得られるような金属板の間に支持したポリオレフィンバッグ中で凍結できる。次いで凍結した細胞した細胞は長期凍結貯蔵容器に移される。好ましい実施態様では、試料は液化窒素（−１９６℃）又は液体窒素蒸気（−１０５℃）中に凍結的に貯蔵される。そのような貯蔵は高効率液体窒素凍結機の購入が可能であることにより多いに容易になる。必要とする場合は、凍結した細胞は好ましくは急速に解凍されそして使用されるまで約３７℃で維持される。凍結保護溶液は生理学的に適合性であるので、対象への導入に先立って除く必要がない。凍結保存して解凍した臍帯細胞、血小板及び造血幹細胞又は前駆細胞は、適当な患者の造血系の再構成のために医療的に使用できる。細胞は、当業技術ではよく知られている一般に好ましい全身導入法のいずれかにより導入できる。造血系（又は免疫システム）の再構成は、多数の病気と障害のために医療的に価値があり得る。凍結保存した造血−幹細胞と前駆細胞の造血再構成のための導入は、現在自系骨髄移植により治療できると知られているそれらの疾患に対して有益に使用できる。幹細胞の導入により治療できる疾患は、五つの広いカテゴリーを含むが、それらに限定されるものではない。第１は、正常赤血球増殖と成熟の不全又は機能疾患からくる疾患である（即ち、形成不全貧血症と増殖不全幹細胞疾患）。第二群は、造血器官における悪性腫瘍疾患（例えば、白血病とリンパ腫）である。第三の疾患群は、非造血器官の悪性固形腫瘍の広範囲のスペクトルの患者を含む。これらの患者の幹細胞導入は骨髄救済方法として機能し、その方法は悪性腫瘍の他の方法である致死的治療又は照射に次いで患者に提供される。第四の疾患群は、自家免疫状態からなり、その状態では幹細胞は異常免疫系の置換源として機能する。第五の疾患群は、多数の遺伝疾患からなり、それらは造血幹細胞好ましくは同系のそれの導入により補正され得て、それらは移植の前に遺伝治療を受けている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に、(a)グリセリン： (b)細胞生存度を高めるのに十分な量のアルカリ金属塩化物； (c)環境条件下で細胞維持を支持するのに有効な量の生理学的に代謝し得る単糖類；及び (d)プラズマ膜（ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ）構造完全性を維持するために有効な量の血漿アルブミンからなる濃厚凍結保存溶液。２．更に希釈剤を含有している請求項１記載の凍結保存溶液。３．溶液のｐＨが約７と７．５の間である請求項１記載の凍結保存溶液。４．濃厚液が実質的に(a)約６０ないし８０重量％のグリセリン、(b)約５ないし約１０重量％のアルカリ金属塩化物、(c)約０．２ないし約１重量％の単糖類；及び(d)約２０ないし３０重量％の血漿アルブミンからなる請求項１記載の凍結保存溶液。５．溶液が実質的に(a)約２０ないし４０重量％のグリセリン、(b)約１．５ないし約５重量％のアルカリ金属塩化物、(c)約０．１ないし約０．５重量％の単糖類；(d)約６ないし１５重量％の血漿アルブミン及び(e)残部希釈剤（ｂａｌａｎｃｅｄｉｌｕｅｎｔ）からなる請求項２記載の凍結保存溶液。６．アルカリ金属塩化物が塩化ナトリウムである請求項１記載の濃厚凍結保存溶液。７．アルカリ金属塩化物が塩化ナトリウムである請求項２記載の凍結保存溶液。８．単糖類がグルコースである請求項１記載の濃厚凍結保存溶液。９．単糖類がグルコースである請求項２記載の凍結保存溶液。１０．血漿アルブミンがヒト血漿アルブミンである請求項１記載の濃厚凍結保存溶液。１１．血漿アルブミンがヒト血漿アルブミンである請求項２記載の凍結保存溶液。１２．実質的に、 (a)約６０ないし８０重量％のグリセリン； (b)約５ないし約１０重量％のアルカリ金属塩化物； (c)約０．２ないし約１重量％のグルコース；及び (d)約２０ないし３０重量％の血漿アルブミンからなる濃厚凍結保存溶液。１３．実質的に、 (a)約２０ないし４０重量％のグリセリン； (b)約１．５ないし約５重量％のアルカリ金属塩化物； (c)約０．１ないし約０．５重量％のグルコース； (d)約６ないし１５重量％の血漿アルブミン；及び (e)残部の希釈剤（ｂａｌａｎｃｅｏｆｄｉｌｕｅｎｔ）からなる凍結保存溶液。１４．（ｉ）請求項２に記載の凍結保存溶液に標的細胞を導入し、そして（ii）保護された標的細胞を凍結保存することからなる細胞を凍結保存する方法。１５．標的細胞を含む溶液の、凍結保存溶液に対する体積比が約１：１ないし約１：１０でありそして標的細胞の、凍結保存溶液に対する比率が約１×１０⁵ 細胞／ｍｌないし約１×１０⁹細胞／ｍｌである請求項１４記載の方法。１６．標的細胞が造血幹細胞又は前駆細胞である請求項１４記載の方法。１７．標的細胞が血液の血小板である請求項１４記載の方法。１８．標的細胞がＣＤ34+ 細胞であると同定されている細胞である請求項１４記載の方法。１９．標的細胞が臍帯の血液から採取される請求項１４記載の方法。２０．（ｉ）請求項１３に記載の凍結保存溶液に標的細胞を導入し、そして（ii）保護された標的細胞を凍結保存することからなる細胞を凍結保存する方法。２１．標的細胞を含む溶液の、凍結保存溶液に対する体積比が約１：１ないし約１：１０でありそして標的細胞の、凍結保存溶液に対する比率が約１×１０⁵ 細胞／ｍｌないし約１×１０⁹細胞／ｍｌである請求項２０記載の方法。２２．保護された標的細胞が分当り１−２℃の速度で約−７０と約−１９６℃ の間の温度まで冷却される請求項２０記載の方法。２３．（ｉ）請求項２記載の凍結保存溶液に標的細胞を導入し、（ii）保護された標的細胞を凍結保存し、そして（iii）保護された標的細胞を解凍することからなる生存細胞を凍結保存しそして回収するための方法。２４．標的細胞を含む溶液の、凍結保存溶液に対する体積比が約１：１ないし１：１０の間であり標的細胞に対する凍結保存溶液の比が約１×１０⁵細胞／ｍｌないし約１×１０⁹細胞／ｍｌの間にある請求項２３記載の方法。２５．標的細胞が造血幹細胞又は前駆細胞である請求項２３記載の方法。２６．（ｉ）標的細胞を請求項２記載の凍結保存溶液に導入し、（ii）保護された標的細胞を凍結保存し、（iii）保護された標的細胞を解凍し、そして（iv）解凍した保護された標的細胞を、標的細胞と凍結保存溶液の分離をしないで、その標的細胞を必要としている対象に導入することからなる細胞の凍結保存、回収と医療的使用のための方法。２７．標的細胞を含む溶液の、凍結保存溶液に対する体積比が約１：１ないし１：１０の間であり標的細胞に対する凍結保存溶液の比が約１×１０⁵細胞／ｍｌないし約１×１０⁹細胞／ｍｌの間にある請求項２６記載の方法。２８．標的細胞が造血幹細胞又は前駆細胞である請求項２６記載の方法。２９．標的細胞が血液の血小板である請求項２６記載の方法。３０．標的細胞がＣＤ34+ 細胞であると同定されている細胞である請求項２６記載の方法。３１．標的細胞が臍帯の血液から得られる請求項２６記載の方法。３２．対象がヒトである請求項２６記載の方法。